薬物の脂肪酸誘導体および類似体
本開示は、脂肪酸−薬物の結合体、その調製および使用、ならびに薬物の結合体の調製に有用な長鎖（Ｃ１０〜２５）の飽和および不飽和両方の脂肪酸および無水物を対象とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府の支援による研究または開発］
本発明は、米国国立衛生研究所の連邦政府補助金ＣＡ１２６８２５による政府助成によって行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
［発明の分野］
本開示は、薬物の脂肪酸誘導体および類似体、特に単一のＣ１０〜２５アルキル鎖を有したマロン酸、コハク酸、およびグルタル酸を含有するものを対象とする。
【背景技術】
【０００３】
分子量６６ｋＤａのアルブミンは、身体に最も豊富に存在するタンパク質であり、心臓からの静水圧に対して血管に浸透圧を与える。また、アルブミンは様々な生体異物ならびに脂肪酸などの不水溶性の内因性物質の天然担体としても働く。例えば、パクリタキセル（ＰＴＸ）は、約１０−５Ｍの解離定数Ｋｄでアルブミンと結合し（Ｐａａｌ、Ｍｕｌｌｅｒら、２００１年）、脂肪酸の総濃度によってμＭ〜ｎＭの範囲のＫｄでステアリン酸と結合する（Ｃｕｒｒｙ、Ｂｒｉｃｋら、１９９９年）。その血清中濃度は４０ｍｇ／ｍｌ（４％または０．６１ｍＭ）に近いが、間質組織中では約１６ｍｇ／ｍｌ（１．６％または０．２４ｍＭ）である。アルブミンは脂肪酸に６つのある程度特異的な結合部位を提供するため、脂肪酸結合部位に関する有効濃度は非常に高い。つまり、タンパク質は疎水性生体異物にとってスポンジとしての役割を果たし、血清中の全脂肪酸の９９．９％はアルブミンに結合した状態である。
【０００４】
分子量１５０ｋＤａの免疫グロブリンＩｇＧと構造上および機能的に全く異なるが、合成および異化の反応速度論において２つの主要タンパク質の間に多くの類似点がある。ＩｇＧは、約１２ｍｇ／ｍｌでアルブミンに次いで全身に豊富に存在する。これらのタンパク質のサイズによって、それらは、Ｍａｅｄａによって提案されたいわゆる透過性および滞留性の亢進（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）（ＥＰＲ）効果の候補となる（Ｍａｅｄａ ２００１年；Ｔａｎａｋａ、Ｓｈｉｒａｍｏｔｏら、２００４年）。簡潔に述べると、これらの分子は血流を通って主に溶媒牽引（つまり対流）によって移動する。腫瘍に近づくと、圧力勾配によってこれらの高分子は漏出性の血管系を通って腫瘍周辺に押しやられる。腫瘍の中心は液圧が高く、腫瘍深部への対流性浸透（ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を防ぐ（Ｊａｉｎ、２００５年）。循環に戻ることや、腫瘍の深部へ移動することができないこれらの高分子は、通常リンパ系に流出することになり、内部壊死腫瘍組織で機能不全となる。したがって、これらの高分子がマクロピノサイトーシスによって腫瘍周辺に取り込まれ、そこで高分子が分解されて腫瘍増殖の栄養となることがＳｔｅｈｌｅによって提案された（Ｓｔｅｈｌｅ、Ｗｕｎｄｅｒら、１９９９年）。血管系においてアルブミンの濃度が低下すると、肝臓はより多くのアルブミンを合成して、定常状態の全身濃度０．６ｍＭに維持する。したがって、腫瘍でアルブミン分解の大部分が生じることが観察されるのは当然のことである（Ｓｔｅｈｌｅ、Ｗｕｎｄｅｒら、１９９８年）。血管透過性の増加も通常様々な炎症性疾患で観察される。そのため、合成ナノ粒子で見られるように、病的部位においてＥＰＲの媒介によるアルブミンおよびＩｇＧの蓄積が予測される（Ｓａｎｄａｎａｒａｊ、Ｇｒｅｍｌｉｃｈら、２００９年）。
【０００５】
ヒトがいかにしてアルブミンとＩｇＧをそのような高濃度に維持するのかは、ＦｃＲｎまたはＢｒａｍｂｅｌｌ受容体がこれらの２つの主要タンパク質を保護するという最近の発見まで不可解なままであった（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃｈａｕｄｈｕｒｙら、２００６年；Ｋｉｍ、Ｂｒｏｎｓｏｎら、２００６年）。この受容体は、後期エンドソームの酸性条件下で両方のタンパク質を認識し、後期エンドソームで受容体がこれらのタンパク質と結合することで、エンドソームによる再利用によって表面に回帰される。中性ｐＨの血清では解離が生じ、無傷タンパク質は循環に戻る。この保護は、アルブミンとＩｇＧの半減期がそれぞれ１９日と２１日であるというこれらの高分子の驚くべき特性に明示されている。つまり、アルブミンは身体で最も豊富なタンパク質として肝臓で生成される。アルブミンは脂肪酸と非常に高い親和性および能力で結合し、比類のない時間循環し、増殖中の腫瘍を受動的に標的とする。
【０００６】
薬物担体としてアルブミンを開発するには少なくとも２つの方法がある。１つは、遊離薬物がなんらかの形で放出すると考えられる薬物分子とタンパク質の直接的な化学結合である（Ｋｒａｔｚ、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｄｒｉｖｅｒら、２０００年）。この場合、多数の薬物分子を備えたタンパク質はもはや天然アルブミンとして作用しないため、アルブミンの使用は合成高分子となんら変わりはない。第２のアプローチは、薬物のアルブミンへの親和性を増加させる分子で薬物を誘導体化することである。例えば、オリゴヌクレオチドのイブプロフェン結合体であり、オリゴヌクレオチドのＰＫはイブプロフェンがアルブミンと結合することによって劇的に変化する（Ｍａｎｏｈａｒａｎ、Ｉｎａｍａｔｉら、２００２年）。
【０００７】
パクリタキセル（ＰＴＸ）は、現在、乳癌、卵巣癌および肺癌を処置する最適な薬物である。ＰＴＸは極めて水に不溶性であるため、薬物を可溶性にし、少しでもその薬物動態（ＰＫ）を改善するために、多くの製剤が試みられてきた（ＳｉｎｇｈおよびＤａｓｈ、２００９年）。ＰＴＸが界面活性剤のポリオキシエチル化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ）と無水エタノールで可溶化されたＴａｘｏｌ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）には、まだ難溶性の問題があり（水で戻した後１．２ｍｇ／ｍＬ未満）、低速の３時間注入が必要とされ、多量のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬが存在することで過敏症を引き起こすことが多い。副作用として好中球減少症および末梢神経障害が挙げられる。これらの反応は、処置する前にステロイドを投与することで回避しなければならなかった。
【０００８】
第２世代製剤Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（Ａｂｒａｘｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＬＬＣ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）において、ＰＴＸはアルブミンとの複合体として存在する。処理にはＰＴＸを溶かす有機溶媒中で高圧下でアルブミンを変性させることが含まれる。その後、溶媒を除去して製品を得る。固体粉末を水で戻すと、約１３０ｎｍのサブミクロン粒子が２〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で生成される。製造業者は、ナノ粒子がｇｐ６０によって腫瘍周辺に経細胞輸送されることを提案しているが、この仮説は実験的に確立されていない（査読なしのジャーナル、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ Ｗｉｎｔｅｒ ０７／０８）。製剤でのアルブミンの変性により、ｇｐ６０および／またはＦｃＲｎによるアルブミンの認識には疑問の余地があり、確実にアルブミンの長い半減期は得られないであろう。
【０００９】
インスリン含有製品Ｄｅｔｅｍｉｒ（登録商標）はアシル化インスリンである。インスリンは、グルコースの血清濃度を調節する天然ペプチドホルモンである。糖尿病患者はインスリン抵抗性であるか、またはグルコースレベルを調節するのに十分なレベルのインスリンに欠けていることがある。これらの糖尿病患者はインスリン注射を一般的に１日当たり３回受けるであろう。長期循環性のインスリン分子の目的は、一日を通してペプチドの基礎濃度を維持することであり、したがって単回注射しか必要としない。このインスリン分子は、ペプチドがアルブミンに固着することができる鎖のうちの１つの末端に結合した脂肪酸を有する。（Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ Ｈａｖｅｌｕｎｄら、１９９５年）
【００１０】
核酸脂質結合体が知られている。この技術には、脂肪酸またはステロールによる新しいクラスのオリゴヌクレオチド薬物の修飾が含まれていた。これらの修飾核酸は活性を保持することが示され、修飾によっては、アルブミンと同様にリポタンパク質粒子とも結合することも示された。また、合成に関与する化学反応は薬物に合わせられ、通常、脂肪酸の負電荷を排除するアシル化である。カルボキシル化ステロールの電荷も同様に中和されるが、脂肪酸誘導体のみが明らかにアルブミンを結合することが示されている（Ｗｏｌｆｒｕｍ、Ｓｈｉら、２００７年）。
【００１１】
スクアレン酸（ｓｑｕａｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）で結合されたゲムシタビンが知られている（Ｃｏｕｖｒｅｕｒ、Ｓｔｅｌｌａら、２００６年）。これによって、ゲムシタビン分子が凝集し、ミセルまたはミセル様粒子を形成することができる。アルブミン結合についての言及はないが、脂肪酸の枝状の性質により、この結合体がアルブミンに対立してリポタンパク質結合により適したものとなる可能性がある。その結果、循環時間が著しく減少した結合体が得られるであろう。ゲムシタビンのステアリン酸（炭素数１８の脂肪酸）誘導体が知られている。結合体はリポソームへと処理された。後者は、リン脂質が水性溶媒の中で懸濁されると自然に形成されるミクロン未満の脂質小胞である。結合体がリポソームに取り込まれることで、結合アルブミンと比較して、半減期が不十分になるであろう。
【００１２】
疎水性薬物ＰＴＸをω−３ドコサヘキサエン酸で誘導体化することで薬物Ｔａｘｏｐｒｅｘｉｎ（登録商標）が得られる（Ｗｏｌｆｆ、Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら、２００３年）。この脂質は、一般的に腫瘍でよく吸収されると考えられる天然栄養素である。この薬物の製剤は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬとエタノールで調剤され、食塩水で希釈される点でＴａｘｏｌ（登録商標）様である。この製剤によって、製剤でのプロドラッグの溶解性が向上するが、好中球減少および過敏などのＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬの副作用は除去されない。この製剤は、さらにＴａｘｏｌ（登録商標）に類似した毒性を示し、ちょうどＴａｘｏｌ（登録商標）のように半減期が不十分であろう。脂質の構造のため、それは、アルブミンよりむしろ低比重リポタンパク質および高比重リポタンパク質（ＬＤＬ／ＨＤＬ）のバインダーであり、したがって、天然担体に調剤された場合、同様に半減期は依然として長くならない。
【００１３】
α−リノレン酸で結合されたドキソルビシンは、天然ω−３脂肪酸の消化に腫瘍を利用するという点でＴａｘｏｐｒｅｘｉｎ（登録商標）に類似している（Ｈｕａｎ、Ｚｈｏｕら、２００９年）。糖に対する親水性の性質、特にアンモニウムのカチオン電荷は、薬物の吸収を妨げる。これは結合によって克服される。なぜなら、結合によって電荷が中和され、薬物がより細胞膜に分配されやすくなり、単純拡散によって細胞に移動することが可能となるからである。他にも多数のドキソルビシン含有製剤がある。それらは、受動的にも能動的にも腫瘍を標的としないため、薬物の重篤な心臓毒性が持続すると予想される。さらに、担体なしでは、薬物のＰＫが明らかに変化することは期待できず、毒性の軽減または効能の増加が妨げられる。
【００１４】
特定の３−置換グルタル酸およびそれらの無水物が知られている（Ｐｏｌｄｙ Ｐｅａｋａｌｌ、およびＢａｒｒｏｗ、２００８年）。しかしながら、比較的短鎖の誘導体しかフェロモンの合成に開示されていない。本特許出願では、短鎖のグルタル酸無水物はフェロモンの合成での踏み台として以外いかなる方法にも使用されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
つまり、薬物のアルブミンに対する親和性を改変し、長い循環半減期の血清ＰＫおよび病的部位への標的送達などの望ましい生物薬剤学的特性を有する薬物の結合体を作成することが可能な分子が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
ポリカルボン脂肪酸（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）と薬物分子を共有結合させ、脂肪酸−薬物の結合体を形成する組成物および方法が記載されている。結合体は、薬物の溶解性を向上させるとともに、癌処置での固形腫瘍または関節炎での炎症を起こした関節の治療において薬物を標的とするのに有用である。１つの実施形態では、本開示は、２つ以上の近接した−ＣＯＯＨ基を有する長鎖脂肪酸を対象とする。薬物の結合体の−ＣＯＯＨ基は、硝酸、硫酸、スルホン酸、リン酸などの他の無機酸、およびそれらの誘導体であってもよい。これらの試薬の１つの−ＣＯＯＨ基は、薬物と共有結合していてもよい。脂肪酸分子は、このように薬物に結合する場合、遊離カルボン酸または（１つまたは複数の）他の無機酸アニオンを含んでいる。これらの長鎖脂肪酸−薬物の結合体は改善された生物薬剤学特性を有し得、その結果高い治療指数が実現される。
【００１７】
別の実施形態は、本明細書中に記載される長鎖脂肪酸分子−薬物の結合体を対象とする。
【００１８】
別の実施形態は、脂肪酸−薬物の結合体を調製するための長鎖脂肪酸分子の使用を対象とする。
【００１９】
別の実施形態は、薬物の溶解性を向上させるための長鎖脂肪酸−薬物の結合体の使用を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】血清アルブミン濃度の増加に伴う結合体の溶解性の向上を表す図である。この依存性は両者の相互作用を示唆している。この実験は結晶結合体を使用してＰＢＳ中で行い、その溶解には限度があり、平衡化するには長時間かかることが分かった。これを改善するために、ＰＤＧ−ＰＴＸ結合体をｔ−ＢｕＯＨに溶解させ、それを血清アルブミンの撹拌溶液にゆっくり添加することで、アルブミンを飽和させ、非常に高濃度（１％ＨＳＡ溶液中、約８２５μＭ ＰＤＧ−ＰＴＸ）を達成することが可能になった。
【図２】血清アルブミンと結合する際の結合体自体の向きの理論モデルを表す図である。なお、結合体は、結合ポケット周辺のカチオン性アミノ酸残基との静電的相互作用によってタンパク質への結合を促進させるカルボン酸アニオンを依然として保持している。この例におけるジカルボン酸はα炭素で酢酸を含むステアリン酸（Ｃ１８Ｈ３６Ｏ２）である。２つのカルボン酸のうちの１つはエステル結合によってＰＴＸと結合する（茶色）。このエステル結合が、腫瘍組織の近傍で、またはインターナリゼーションの後に腫瘍細胞の内部で切断され遊離ＰＴＸを放出すると予想される。誘導体自体がちょうどドセタキセルのようにＰＴＸと同じくらい薬理学的に活性である可能性があるが（Ｃｒｏｗｎ、Ｏ’Ｌｅａｒｙら、２００４年）、誘導体はまたプロドラッグとしても作用することもある。
【図３】未処理対照と比較して、ＰＴＸ、ＰＤＧ−ＰＴＸまたはＰＤＧを用いたＨ１２９９非小肺癌細胞のＭＴＴアッセイを表す図である。データは％生細胞として示されている。
【図４】未処理対照と比較して、ＰＴＸ、ＰＤＧ−ＰＴＸまたはＰＤＧを用いたＨ１１５５非小肺癌細胞のＭＴＴアッセイを表す図である。データは％生細胞として示されている。
【図５】未処理対照と比較して、ＰＴＸ、ＰＤＧ−ＰＴＸまたはＰＤＧを用いたＭＣＦ−７乳癌細胞のＭＴＴアッセイを表す図である。データは％生細胞として示されている。
【図６】アルブミンを担体として使用する場合の可能な結合体として脂質の結合親和性の傾向を表す図である。
【図７】ステアリン酸−フルオレセインアミンとヒト血清アルブミンの結合に関する等温滴定熱量測定のデータを表す図である。
【図８】ＰＤＧ−フルオレセインアミンとヒト血清アルブミンの結合に関する等温滴定熱量測定のデータを表す図である。
【図９】ＰＴＸ結合体の２つの構造異性体を表す図である。構造によって、カルボキシレートから数えて、化合物２がα位で分岐し、化合物３がβ位で分岐していることが分かる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
新薬製剤およびそれらの使用方法が本明細書中に提供される。本明細書中に記載された新規の製剤は、血清アルブミンの３つのインビボ特性および機能を利用すると仮定される。まず、アルブミンは、ヒトでは半減期が１９日という長い間循環する。第２に、アルブミンは強く結合した脂肪酸を運搬する。第３に、薬剤が癌治療である場合、および腫瘍が増殖している場合、タンパク質は主に腫瘍に蓄積し、腫瘍で分解される。したがって、例えば、パクリタキセルのステアリン酸誘導体はアルブミンと結合すると循環半減期が長くなり、固形腫瘍に薬物が著しく蓄積する可能性がある。
【００２２】
アルブミンとＩｇＧは魅力的な薬物担体である。なぜなら、これらのタンパク質に保持された薬物分子は長い循環半減期を有するだけでなく、これらのタンパク質に結合した薬物が固形腫瘍または炎症組織に送達される可能性が高いからである。脂肪酸の場合のアルブミンに対する結合親和性には２つ要因がある。１つは、脂肪酸の長いアルキル鎖と結合穴（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｖｉｔｙ）の間におけるエントロピー（ΔＳ）駆動の疎水性相互作用であり、もう１つは、カルボン酸アニオンと結合ポケット周辺のリシンおよびアルギニンからの正電荷の間におけるエンタルピー（ΔＨ）駆動の静電引力である。脂肪酸はアルブミンに対して親和性が高いため、種々の薬物が脂肪酸で修飾されてきた（Ｌａｍｂｅｒｔ、２０００年）。しかしながら、いずれの場合も、関与する化学反応が単純であることが多いため、−ＣＯＯＨ基は薬物分子に直接結合する。この単純なアプローチの重大な欠点は、結合体と脂肪酸結合部位の相互作用において静電気の寄与がほとんどないため、結合体が遊離脂肪酸より低い親和性でアルブミンと結合することである。本明細書中に記載された技術は、結合体のアルブミン結合に対するエントロピーとエンタルピーの両方の寄与に関与する。非結合のカルボン酸アニオンについての報告がある（Ｅｋｒａｍｉ、Ｋｅｎｎｅｙ、およびＳｈｅｎ、１９９５年；Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ、Ｈａｖｅｌｕｎｄ、Ｊｏｎａｓｓｅｎら、１９９５年）。
【００２３】
本製剤およびプロセスは、本明細書中に記載された結合化学反応を利用する。重要なことであるが、脂肪酸の−ＣＯＯＨ官能基は最終結合体において未反応のままである。好ましくは、脂肪酸分子には２つ以上のカルボン酸部分がある。脂肪酸分子が２つ以上のカルボン酸部分を含んでいる場合、分子の好ましい形態は無水物である。ジカルボン酸からの無水物の調製は当技術分野において周知である。
【００２４】
１つの実施形態では、本開示は、長鎖脂肪酸および薬物を備える結合体の組成物を対象とし、前記結合体は前記脂肪酸からの少なくとも１つの遊離カルボン酸またはカルボキシレート基を有する。好ましくは、脂肪酸はジカルボン酸である。より好ましくは、脂肪酸は無水物から誘導される。本明細書中に使用される用語「脂肪酸」は、Ｃ１０〜２５アルキル脂肪酸および誘導体、ならびにジカルボン酸の無水物も指す。好ましくは、アルキル鎖は１２〜２０個の炭素を有する。より好ましくは、アルキル鎖は１４〜１６個の炭素を有する。有用な脂肪酸には、遠位端にカルボキシレートを有する直鎖アルキル鎖である任意のアルキル二酸が含まれ、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸などが挙げられる。長鎖アルキル鎖を有するポリカルボン酸が薬物分子の誘導体化に使用される場合、得られる結合体は遊離−ＣＯＯＨ基を保持するであろう。マロン酸、コハク酸およびグルタル酸などのジカルボン酸は有用であり、炭素数が８〜２５、好ましくは８〜２０、１０〜２０、１２〜２０または１４〜１６である１つの長鎖アルキル鎖を含むそれらの単純な誘導体も有用である。これらのジカルボン酸誘導体に加えて、３つ以上の−ＣＯＯＨ基を含む任意の化合物も同じ目的に使用することができる。例えば、クエン酸、トリカルボン酸、ならびにβ−メチルトリカルボン酸および１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸などのその誘導体を挙げることができる。ショウノウ酸および環式１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸などの環式ジカルボン酸もまた同じ目的を果たすことができる。無機酸を含む混合二価酸または多価酸（ｍｕｌｔｉ−ａｃｉｄ）も含まれ、天然に存在する例はリン酸化Ｎ−アセチルチロシンであり、水酸基含有カルボキシ酸の硫酸エステルが合成由来の例である。
【００２５】
最も好ましくは、脂肪酸はグルタル酸であり、特に３−ペンタデシルグルタル酸無水物（ＰＤＧ）である。組成物は薬学的に許容される賦形剤または希釈剤をさらに備えることができる。
【００２６】
求核基を有するか、求核基を含むように修飾することができる薬物または化合物であれば、結合体に使用することができる。これらの薬物は、ＮＳＡＩＤ、例えばナプロキセン、アセトアミノフェン、イブプロフェンのような化学的性質を有し得る。それらは、手術後などに鎮痛剤の放出を遅らせるためにも使用することができる。典型的な鎮痛剤はコデイン、オキシコドンおよびモルヒネであり得る。しかしながら、本結合技術は低分子薬物に限定されない。その技術は、タンパク質またはペプチドを、長鎖脂肪酸と反応することができる多くのアミノ酸求核種を含むように修飾するために使用することができる。さらに、大部分の非環状ペプチドはカルボキシル末端とアミノ末端を有し、両者は長鎖脂肪酸と反応するため使用することができる。カルボキシル端部は、エタノールアミンリンカーなどのプロモイエティ（ｐｒｏｍｏｉｅｔｙ）の合成を必要とするであろう。形成されたエステルはプロドラッグを生成するように不安定であり、したがって、一級アミンは通常の条件下で長鎖脂肪酸と反応することができる。天然ペプチドの代表例は、ホルモン、例えばインスリンであり得る。他の有用な徐放性製剤には、抗生物質またはステロイドなどの短期の反復投与計画（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ ｒｅｇｉｍｅｎ）が含まれ得る。高親和性を有するものと、低親和性を有するものがある複数の様々な結合体を用いてこれらの薬物の放出速度を制御することができる。低親和性結合体は早く離れるため一気に放出され、一方、高親和性結合体はゆっくりと離れるため定常状態の濃度を維持することができるであろう。いくつかの可能な抗生物質には、セフレキシン、アモキシシリンおよびバンコマイシンと同様に当技術分野で公知の多数の他のものも含まれる。いくつかの可能なステロイドには、プレドニゾン、ヒドロコルチゾンおよびブデソニド、ならびにほとんどのコルチコステロイドが含まれる。好ましい実施形態では、薬物はパクリタキセルである。
【００２７】
一実施形態では、本開示は請求項１に記載の長鎖脂肪酸の結合体を調製する方法を対象とし、この方法は、前記薬物を前記長鎖脂肪酸と接触させることにより前記結合体を調製することを含む。この実施形態の一態様では、結合の方法は脂質によるものであり、薬物から結合体のワンポット合成（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を容易に行うことができる。特に、３−ペンタデシルグルタル酸無水物（ＰＤＧ）の化学反応によって、求核種を含むあらゆる薬剤が本明細書中に記載されるように結合される可能性がある。求核種とは、アルコール、チオール、一級アミンまたは二級アミンを意味する。これらの求核種は薬物上で合成することができる。例えば、アンチセンおよびｓｉＲＮＡなどの核酸は、薬物に遊離アミンを与えるＣ６アミノ修飾剤で合成される。この場合、薬物はここでＰＤＧと容易に反応することができるであろう。これらの修飾は可逆的であるため、ＰＤＧと容易に反応し、切断されて元の薬物に戻ることができるプロドラッグを生成する。例として、カルボン酸は非求核性であるが、多くの薬物に共通している。エタノールアミンを用いたエステルの形成によって、容易に切断できるエステルを介してプロドラッグが生成されるとともに、ＰＤＧと反応することができる遊離アミンを与えるであろう。
【００２８】
用語「アルケニル」および「アルキルエニル」は、単独でまたは組み合わせて使用した場合、２〜１０個の炭素原子を有する部分に少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖基または分岐基を包含する。例として、エテニル、プロペニル、アルキル、プロペニル、ブテニルおよび４−メチルブテニルが挙げられるが、これらに限定されない。用語「アルケニル」およびアルキルエニルは、当業者に理解されるように、「シス」および「トランス」配向、または「Ｅ」および「Ｚ」配向を有する基を包含する。
【００２９】
次のスキーム１〜５は、本明細書中に記載される脂肪酸分子または結合体を調製するための合成経路を表す。スキーム１は、ＰＤＧ（３−ペンタデシルグルタル酸無水物）を調製するための合成経路を表す。
【化１】
スキーム２は、ＰＤＧ−ＰＴＸ（パクリタキセル）の合成経路を表す。
【化２】
スキーム３は、パクリタキセル−脂肪酸結合体の一段階合成を表す。
【化３】
スキーム４は、ＰＤＧ−ＤＯＸ（ドキソルビシン）の合成経路を表す。
【化４】
スキーム５は、ＰＤＧ−ＧＥＭ（ゲムシタビン）の合成経路を表す。
【化５】
【００３０】
本発明の組成物および方法は、癌治療、特に固形腫瘍に対する薬剤を調製するために使用することができる。血清アルブミンが増殖中の腫瘍に凝集する自然な傾向は、長鎖脂肪酸の結合による有用な抗腫瘍性製剤の生成に利用することができる。本発明の薬剤で使用される好適な薬物として、有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、トポイソメラーゼｉｉ抑制剤（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン）および核酸類似体（例えば、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート）が挙げられる。急速に分裂する細胞を標的とし死滅させるように設計され、遊離求核種を有するか、遊離求核種を含むように修飾することができる任意の薬物を、効果向上のために長鎖脂肪酸を用いて調剤することができる。
【００３１】
非担癌状態では、アルブミンは約１９日の半減期で循環する。高親和性の脂質はアルブミンからゆっくり解離するが、低親和性脂質はより速く解離する。したがって、アルブミンに対する結合体の親和性を調整して薬物に特有の徐放性製剤を生成することができる。
【００３２】
製剤によって異なる親和性の結合体が必要とされ、親和性はいくつかの機構により調整することができる。脂肪酸の尾部長が短くなると親和性は低下し、尾部長が約２２個の炭素まで長くなると親和性は増大すると考えられる。なお、さらに長鎖の炭素尾部も有用であり得る。親和性はまた、恐らくアルブミンの結合ポケットの表面におけるリシンおよびアルギニンとの静電的相互作用のため、分子の頭部のアニオン電荷の存在によっても変化すると考えられる。すべての電荷を除去すると親和性が低下し、電荷数または電荷を保持するアームの柔軟性を上げると親和性が増大するであろう。分子の柔軟性は親和性に影響を及ぼすことがあり、例えば、３つの炭素の対称性の頭部基であるマロン酸の柔軟性は、さらに柔軟性のある５つの炭素の対称性の頭部基であるグルタル酸と異なることがある。しかしながら、これらはそれぞれ、１つのアニオン電荷を維持することができる。ポケットの表面で電荷を配向させる柔軟性が高いと親和性が増大する可能性がある。同様に、コハク酸などの４つの炭素の不斉の頭部基も有用である。コハク酸もまた無水物に環化され、求核種と容易に結合することができる。コハク酸に基づく脂質と同様に任意の他のアルキル二酸も、脂質薬物の結合体の製剤の頭部基として、アルブミン結合のために使用することができる。アルキル二酸とは、遠位端にカルボキシレートを有する直鎖アルキル鎖を意味し、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸などが挙げられる。
【００３３】
別の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載される長鎖脂肪酸−薬物の結合体を、前記結合体が可溶化される媒体と接触させることを含む、薬物を可溶化する方法を対象とする。媒体は任意の液体であってもよい。好ましくは、媒体は血清である。好ましい実施形態では、結合体は、特定の媒体において薬物単独の溶解性と比較して溶解性が１００倍増加している。より好ましくは、結合体は、溶解性が２００倍増加している。最も好ましくは、結合体は、溶解性が２５０倍増加している。
【００３４】
別の実施形態では、本開示は次式
【化６】
（式中、Ｒ’は置換または非置換のＣ１０〜２５アルキルまたはＣ１０〜２５アルキルエニルである）
の構造を有する化合物を対象とする。好ましくは、Ｒ’はＣ１２〜２０アルキルである。より好ましくは、Ｒ’はＣ１４〜１６アルキルである。最も好ましくは、化合物は３−ペンタデシルグルタル酸無水物である。
【００３５】
癌のための薬剤は、特に固形腫瘍の処置に使用することができる。本明細書中に使用される「腫瘍」は、悪性か良性かにかかわらず、すべての新生細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。用語「固形腫瘍」は、血液、骨髄およびリンパ系以外の体内組織の癌（ｃａｎｃｅｒ）または癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を指す。固形腫瘍に分類される癌として、例えば、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、胃癌、前立腺癌および皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、ＣＤ４０発現癌細胞を含む固形腫瘍を患う被験者を処置する方法を対象とし、固形腫瘍として、卵巣癌、肺癌（例えば、扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌型の非小細胞肺癌、ならびに小細胞肺癌）、乳癌、結腸癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌を含む）、膀胱癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌を含む）、胃癌、頚部癌、前立腺癌、鼻咽頭癌、甲状腺癌（例えば、甲状腺乳頭癌）、ならびに黒色腫および肉腫（例えば、骨肉腫およびユーイング肉腫を含む）などの皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
ここで本発明について次の非限定的な例によりさらに説明する。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］
ＰＤＧ−パクリタキセルの合成
５０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ、２当量）量の３−ペンタデシルグルタル酸無水物（ＰＤＧ）、６４ｍｇ（０．０７５ｍｍｏｌ、１当量）のパクリタキセルおよび０．９ｍｇ（０．００７５ｍｍｏｌ、０．１当量）の４−ジメチルアミノピリジンを、小型の撹拌子を備えた１ドラムバイアルに添加した。乾燥粉末に、新たに蒸留したピリジン１．３ｍＬを室温で撹拌しながら添加した。反応混合液をシリコーン／ＰＴＦＥセプタムでキャップし、雰囲気をアルゴンと置き換えた。反応混合液を室温で一晩（１８時間）反応させ、その地点で、ＥｔＯＡｃを溶離液として使用したＴＬＣによって、パクリタキセル（Ｒｆ＝０．９）が完全に消失し、小さなテーリング（Ｒｆ＝０．３〜０．５）を示す新たなＵＶ活性スポットが表れることが分かった。反応混合液を約２０ｍＬのジクロロメタンに加え、続いて約２０ｍＬの酸性塩水で３回洗浄してピリジンおよびＤＭＡＰを除去した。ＤＣＭ層をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過および濃縮し、次いでＥｔＯＡｃに加えた。その混合液をシリカカラムに吸着させ、定組成のＥｔＯＡｃで溶出した。濃縮して、７５ｍｇの生成物を白色結晶として回収した。（収率８５％）。
【００３８】
［実施例２］
パクリタキセルのステアリン酸誘導体の溶解度の測定
３７．５ｍｇ量のＰＤＧ−ＰＴＸを５ｍＬの無水ＥｔＯＨに溶解させ、７．５ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。その後、この溶液にＭｏｒａｖｅｋからの（３．１４μＬ／３．５ｘ１０６ＤＰＭ／１．４３ｘ１０−４μｍｏｌ／１６８ｎｇ）［３Ｈ−ＰＤＧ−ＰＴＸ］を加えた。少ない量から５０μＬ、５００μＬ、１０００μＬ、１５００μＬ、１９５０μＬの様々な量の溶液を５つのバイアルに添加された；その後、窒素によってすべてのバイアルからＥｔＯＨを蒸発させ、ＨＳＡを少ない濃度から０％、１％、２％、３％、４％で含有する５ｍＬのＰＢＳと置き換えた。高濃度のアルブミンほどより多くのＰＤＧ−ＰＴＸを含有するバイアルに添加した。懸濁液を２５℃で振動させ、２４時間、４８時間、７２時間、１９２時間（８日）、３３６時間（１４日）の様々な時点で１ｍＬの分量を取り出した。その分量を、０．１μｍの無機膜によってろ過し、液体シンチレーション測定によってＰＤＧ−ＰＴＸを定量し、さらにＢＣＡアッセイによってＨＳＡの濃度を定量することで分析した。
【００３９】
結晶の溶解がゆっくりであることが分かった。したがって、結晶をｔ−ＢｕＯＨに溶解させ、０．２５μＬ／分の速度でヒト血清アルブミンの１％撹拌溶液に添加した。その後、その懸濁液を一晩凍結乾燥させて水およびｔ−ＢｕＯＨを除去し、固形化物（ｃａｋｅ）をｄＨ２Ｏで戻して１％ヒト血清アルブミン溶液を再生した。溶液をろ過し、シンチレーション測定によって分析することで、約８２５μＭのＰＤＧ−ＰＴＸの溶解度が示された。これは、１％溶液において、アルブミン１分子当たり約５．５分子のＰＤＧ−ＰＴＸに概算される。アルブミンは、理論上の結合限界が６分子であるため、アルブミンは結合体でほぼ飽和されている。
【００４０】
［実施例３］
ＮＳＣＬＣ、胸および卵巣の癌細胞株におけるＰＤＧ−ＰＴＸとＰＴＸ単独のインビトロ細胞毒性の比較
ＰＤＧ、ＰＴＸおよびＰＤＧ−ＰＴＸの細胞毒性を、Ｈ１２９９（ＮＳＣＬＣ）、Ｈ１１５５（ＮＳＣＬＣ）、Ｅｓ２（卵巣）、ＭＣＦ７（胸）の４つの細胞株に対して検査した。文献により、ＰＴＸのＩＣ５０が約２５μＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫ−Ｂｒ３）であることが示されたため、０．２５μＭ、２．５μＭおよび２５μＭの濃度を使用した。２．５ｍＭ（１００倍）のＰＤＧ、ＰＴＸおよびＰＤＧ−ＰＴＸの保存溶液をＤＭＳＯで作成した。次いで、約６０〜７０％の培養密度で、細胞培地にＤＭＳＯの保存溶液を０．１μＬ、１μＬまたは１０μＬ添加した。すべて一定にするために、０．１μＬおよび１μＬ分量をＤＭＳＯで１０μＬの容量にした。対照細胞は１０μＬのＤＭＳＯのみで処理した。細胞を薬物と共に２４時間インキュベートし、洗浄してからＭＴＴと共に３０分間インキュベートし、ホルマザン結晶をＤＭＳＯに溶解させてＵＶによって定量した（λ＝５６０）。
【００４１】
［実施例４］
マウスモデルで薬物動態を測定することによる血流中のパクリタキセルの半減期の延長の測定
ＰＤＧ−ＰＴＸの製剤：等価用量の３ｍｇＰＴＸおよび２２５μＬ［３Ｈ−ＰＤＧ−ＰＴＸ］（０．５ｍＣｉ／ｍＬ、１１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を濃縮し、次いで２５０μＬのｔ−ＢｕＯＨに溶解させ、１０μＬ／分の速度で２．５ｍＬの４％脱脂ＨＳＡのＰＢＳ溶液に添加する。得られた溶液を一晩凍結乾燥し、２．５ｍＬのｄＨ２Ｏで戻す。その溶液を、０．１２ｍｇ／マウス（約６ｍｇＰＴＸ／ｋｇマウス）の用量でマウスの後部静脈に注入する。（０．１２ｍｇ／１ｘ１０７ＤＰＭ／０．１ｍＬ ＰＢＳ／２０ｇマウス）。
【００４２】
Ｔａｘｏｌ様ＰＴＸの製剤：等価用量の３ｍｇＰＴＸおよび１１４μＬ［３Ｈ−ＰＴＸ］（０．２５ｍＣｉ／０．２５ｍＬ、３６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を濃縮し、次いで３０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．１ｍＬ（１：１ｖ／ｖ）のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬおよび無水ＥｔＯＨに溶解する。この溶液を、注入直前にＰＢＳで６ｍｇ／ｍＬに５倍希釈する。後部静脈に投与する用量は２０μＬ（約６ｍｇＰＴＸ／ｋｇマウス）である。（０．１２ｍｇ／１ｘ１０７ＤＰＭ／０．０２ｍＬ ＰＢＳ／２０ｇマウス）。
【００４３】
薬物動態学実験：雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）の右脇腹の毛を剃り、１００μＬの培地中の２ｘ１０５ＣＴ−２６腫瘍細胞を、１ｍＬ注射器および２５Ｇ針を用いて皮下注入する。すべてのマウスが５０〜１００ｍｍ３（Ｌ２＊Ｗ）（Ｌは長期の測定（接種後約９日））の腫瘍を有すると薬物動態研究を始める。Ｔａｘｏｌ様、Ｃ１８−ＰＴＸ、ＰＤＧ−ＰＴＸの３つの処理のうちの１つをマウスに注入する。所定の時点でマウスを３重反復で屠殺する。Ｔａｘｏｌ様製剤は速く消失するため、時点は２４時間（０．２５、１、２、４、８、１２、２４時間）までしかない。Ｃ１８−ＰＴＸおよびＰＤＧ−ＰＴＸ製剤はより長い半減期を有すると予想され、収集したデータポイントは７２時間（０．２５、１、３、６、１８、３６、７２時間）までである。屠殺する数分前に、マウスにケタミン１０ｍｇ（１ｍＬ注射器２５Ｇ針）を腹腔内注入する。マウスの意識がなくなってから切開し、続いて最後に心臓穿刺（１ｍＬ注射器２５Ｇ針）することで血液を回収する。血液を、２００μＬずつ３重反復で取り出し、残りは−２０℃で保存する。死んだマウスから器官を採取し、水分を拭き取り、３重反復で小片（約１００ｍｇ）を切除し、秤量してからシンチレーションバイアルに保存した。残りの器官は、保証されれば、さらに使用するまで−２０℃で保存する。特に、器官として、肝臓、肺、心臓、腎臓、脾臓、腫瘍および注入部位が含まれる。
【００４４】
血液の処理：２００μＬ分量の全血を、１ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅ（登録商標）が入った３重反復のシンチレーションバイアルに添加する。試料が褐色を帯びた緑に変化するまで、５５℃で１時間インキュベートする。これに、１００μＬの０．１Ｍ ＥＤＴＡニナトリウム、続いて３００μＬの３０％Ｈ２Ｏ２を１００μＬずつ添加する。その反応は非常に激しいものであり、反応時間３０分で終了することになるであろう。その後、バイアルにキャップをし、さらに１時間５５℃で加熱すると透明から淡黄色の溶液が生成されるはずである。試料を室温まで冷却し、１５ｍＬのＵｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄを添加し、十分混合する。試料は、計測前に光および温度に適応させるため１時間ＬＳＣに静置する。
【００４５】
器官の処理：小さな塊の器官を３重反復（約１００ｍｇ）でシンチレーションバイアルに添加し、１ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅ（登録商標）を添加する。試料を時々かき混ぜたり通気させたりしながら２時間５５℃まで加熱する。試料が溶解すると（淡黄色）、室温まで冷却し、２００μＬの３０％Ｈ２Ｏ２を１００μＬずつ添加する。その後、試料を３０分間再び５５℃まで加熱する。試料を室温まで冷却し、各試料に１０ｍＬのＵｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄを十分混合しながら添加する。試料は、計測する前に光および温度に適応させるため１時間ＬＳＣに静置する。
【００４６】
クエンチ曲線補正：正常なマウスにケタミンで麻酔をかけ、心臓穿刺によってその血液を取り出す。マウスを屠殺し、主要な器官を採取する。１７５μＬ、２００μＬおよび２２５μＬの分量の血液に、公知の比活性のＰＤＧ−ＰＴＸ（約１ｘ１０４ＤＰＭ）を加える。さらに、約７５、１００および１２５ｍｇの器官の試料に、公知の比活性のＰＤＧ−ＰＴＸ（約１ｘ１０４ＤＰＭ）を加える。その後、試料を上記の分析法と同様に処理し、シンチレーション反応混液中のＰＤＧ−ＰＴＸの３重反復と比較する。（約１ｘ１０４ＤＰＭ）。計測効率は、器官ＤＰＭ／標準ＤＰＭの比率である。
【００４７】
［実施例５］
薬力学の測定による腫瘍へのパクリタキセルの送達の増加
６〜８週齢の４頭の雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスの処理グループをランダムに分け、１００μＬの培地中の２ｘ１０５ＣＴ−２６細胞を右後脚に接種する。腫瘍が約５０〜１００ｍｍ３（Ｌ２＊Ｗ）に成長すると、マウスは、「Ｔａｘｏｌ様」として調剤されたパクリタキセルおよび血清アルブミンと複合体を形成したＰＤＧ−ＰＴＸとして調剤されたパクリタキセルを４ｍｇ／ｋｇ当量で処理する。また、ＰＤＧ−ＰＴＸの用量を増加させて試験し、Ｔａｘｏｌ様として調剤されたパクリタキセルより高いと予測される最大耐容線量（ＭＴＤ）を測定する。３回用量の製剤でマウスを処理し、毎日腫瘍のサイズをノギスで測定する。腫瘍がＩＡＣＵＣ基準（ＩＡＣＵＣ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）で大きすぎると実験は終了し、マウスを屠殺する。
【００４８】
［実施例６］
負電荷を有する結合体のアルブミンに対する結合親和性の向上
アルブミンへの脂質親和性は、関心のある脂質と代用薬として働く蛍光団であるフルオレセインアミンとの間に短いポリエチレングリコールリンカーを合成することにより試験する。その後、脂質−フルオレセインアミン結合体を血清アルブミンのＰＢＳ溶液に滴定し、相互作用の熱を等温滴定熱量計を用いて測定する。これから、生じている関連のエンタルピーが算出され、続いて結合親和性を計算することができる。
【００４９】
［実施例７］
ＰＴＸのα−カルボキシメチルステアリン酸結合体の合成
ＰＴＸのα−カルボキシメチルステアリン酸結合体の合成は、以前報告され一般的に使用されている、無水コハク酸を用いた合成に基づく。（Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｂ、Ｋｕｊａｗａ Ｐ、Ｔｋａｃｚｙｋ Ｃら、２００５年：ＰＭＩＤ １５７００９８２）。１００ｍｇ量のパクリタキセル（０．１１７ｍｍｏｌ）を秤量し、乾式反応の容器に添加した。これに、７６ｍｇのヘキサデシル無水コハク酸（０．２３４ｍｍｏｌ）を添加した。固形物を、１．４ｍｇの４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．０１２ｍｍｏｌ）を含む１．２ｍＬの乾燥ピリジンに溶解させた。反応容器を閉じ、窒素でパージし、室温で４８時間撹拌した。１００％酢酸エチルでのＴＬＣによって、パクリタキセルの消失が新しい生成物の出現で平衡状態に達することが確認された。生成物は、液体クロマトグラフィーによって７：３：１の石油エーテル：酢酸エチル：酢酸で溶出することにより精製した。この溶媒系を用いると、生成物のＲｆはＴＬＣで０．５である。純生成物は白色固形物（７２ｍｇ、収率５２％）として得られた；1H NMR 300MHz (CDCl3) δ 8.12 (2H, d), 7.75 (2H, t), 7.60 (1H, q), 7.54-7.26 (8H, m), 6.27 (1H, s), 6.17 (1H, t), 5.95 (1H, m), 5.67 (1H, d), 5.50 (1H, m), 4.94 (1H, d), 4.41 (1H, m), 4.83 および 4.16 (2H, dd), 3.77 (1H, d), 2.90-1.98 (8H, m), 2.20 (4H, d), 1.98-1.72 (4H, m), 1.72-1.62 (2H, s), 1.62-1.38 (2H, dm) 1.34-0.96 (25H, br m), 0.88 (3H, t).質量分析ＬＣ／ＭＳＤトラップＳＬ；（Ｍ＋Ｈ）＋＝１１７８．８、強度０．９ｘ１０９；（Ｍ＋Ｎａ）＋＝１２０１．１、強度４．７ｘ１０９。
【００５０】
［実施例８］
ＰＴＸのα−カルボキシメチルステアリン酸結合体の溶解度／アルブミン親和性
溶解度特性を作成するために、４０％脱脂ウシ血清アルブミン溶液を作り、２５℃と３７℃でＰＴＸのα−カルボキシメチルステアリン酸結合体で飽和させる。沈殿物をろ過し、吸光度をＰＢＳとアルブミンの吸光度を引いて２２７ｎｍで読み取る。４０％溶液を２０％、１０％、５％および２．５％に連続希釈し、各工程でろ過する。各温度で各溶液において吸光度を読み取りプロットする。結合体の標準曲線によって、結合が吸光度に影響しないことが示された。この反応では２つの構造異性体が生成される。１つの生成物は、パクリタキセルがカルボン酸に対してβ炭素でエステル化される炭素数１９の脂肪酸である。別の生成物は、分岐が脂肪酸のα位で生じる炭素数１８の脂肪酸である（図４）。このα生成物の方がアルブミンとわずかに優れた親和性で結合すると考えられる。なぜなら主鎖から外れた余分な炭素によってパクリタキセルがポケットから出たままになるためである。立体的に、アシル鎖に隣接したカルボキシル炭素での立体障害により、α生成物が主要生成物であると考えられる。両方の生成物を液体クロマトグラフィーを用いて分離し、各成分を別々に検査する。
【００５１】
アルブミン親和性を測定するにはいくつかの方法がある。アルブミンの４０％ＰＢＳ溶液を調製し、様々な量の結合体ＰＢＳ溶液をマイクロダイアリシスのチャンバの２つのウェルに添加する。３７℃での平衡後、アルブミンのないチャンバの結果をＵＶ吸収によって読み取ることができる。その後、結合および非結合のフラクションを計算することができ、スキャッチャード解析を用いてデータを分析した。（Ｃｈｏ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９７１年）。あるいは、溶解性が許せば、ｍｉｃｒｏｃａｌ ＶＰ−ＩＴＣ熱量計を用いて結合親和性を直接測定することができる。この技術の有効性はアルブミンに対する脂肪酸の親和性を測定する際に既に実証されている。（Ｆａｎｇ、Ｔｏｎｇ、Ｍｅａｎｓ ２００６年 ＰＭＩＤ：１６４１３８３７）。
【００５２】
［実施例９］
ＰＴＸのα−カルボキシメチルステアリン酸結合体の薬物動態研究
結合体の薬物動態研究は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（製品番号：Ｐ１５９８）製の１４Ｃ−パクリタキセルなどの定量化用タグを使用する必要がある。最初に、マウスの横腹に接種し、腫瘍を約１００ｍｍ３に成長させる。この地点で、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）第Ｉ相臨床試験と比較して、パクリタキセルに関して４．２ｍｇ／ｋｇの１回量をアルブミンとの複合体として投与する。（Ｄｅｓａｉ ２００１年）。好ましくは、試料は少なくとも１０６ｄｐｍ有するため、それらはバックグラウンドよりもおよそ１０００倍高い。血液試料は、注入０．５、２、１２、２４、４８および７２時間後に採取する。パクリタキセル濃度は直接液体シンチレーション測定によって定量する（ＰａｌｍａおよびＣｈｏ ２００７年）。薬物動態学の解析はＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）と同様にノンコンパートメントモデルを用いて行う（Ｄｅｓａｉ ２００１年）。体内分布を検討するために、肝臓、肺、心臓、脾臓および腫瘍をホモジナイズし、それらのＰＴＸ含有量を分析する。
【００５３】
処理の影響を観察するために、マウスの横腹に再度Ｂ１６Ｆ１０細胞を接種し、腫瘍を約１００ｍｍ３に進行させる。この地点で、パクリタキセルに関して４．２ｍｇ／ｋｇの１回量を、アルブミンとの複合体として投与する。腫瘍のサイズを２〜３日ごとに観察する。対照マウスは、ＰＢＳ中のアルブミンのみを受ける。（ＰａｌｍａおよびＣｈｏ、２００７年）。
【００５４】
ＦｃＲｎ再利用が結合体とアルブミンの結合に影響するかどうかを試験するために、文献で示されたように可溶性ＦｃＲｎを作成することができる。（Ｇａｓｔｉｎｅｌ Ｓｉｍｉｓｔｅｒ Ｂｊｏｒｋｍａｎ １９９２年 ＰＭＩＤ：１５３０９９１；Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ、Ｂｒｏｏｋｓら、ＰＭＩＤ：１６６０５２６６）。この可溶性ＦｃＲｎはエンドソームのｐＨが約５でアルブミンと結合する。したがって、結合体が結合した状態であるかどうかを判断するために、結合体の新たなＫＡを、ｐＨ５でｓｈＦｃＲｎ存在下で測定することができる。対照として、ｓｈＦｃＲｎなしでｐＨ５で同様に結合させるべきである。
【００５５】
本出願で引用された文献で引用または参照されたすべての文献、本明細書中で引用または参照されたすべての文献（「本明細書中の引用文献」）、本明細書中で引用された文献で引用または参照されたすべての文献、さらに本明細書中で言及されるか本明細書中に参照により組み込まれた文献におけるあらゆる製品のいかなる製造業者の指示、説明、製品仕様書および製品説明書も、参照により本明細書中に組み込まれ、本発明の実施で使用することができる。
【００５６】
このように詳細に記載された本発明の好ましい実施形態によって、上記のパラグラフに定義された本発明が、本発明の精神または範囲から逸脱することなくその多くの明らかな変形が可能なように、上記の説明に記載された特定の詳細に限定されるものではないことが理解されるべきである。
【００５７】
［参考文献一覧］
【表１Ａ】
【表１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府の支援による研究または開発］
本発明は、米国国立衛生研究所の連邦政府補助金ＣＡ１２６８２５による政府助成によって行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
［発明の分野］
本開示は、薬物の脂肪酸誘導体および類似体、特に単一のＣ１０〜２５アルキル鎖を有したマロン酸、コハク酸、およびグルタル酸を含有するものを対象とする。
【背景技術】
【０００３】
分子量６６ｋＤａのアルブミンは、身体に最も豊富に存在するタンパク質であり、心臓からの静水圧に対して血管に浸透圧を与える。また、アルブミンは様々な生体異物ならびに脂肪酸などの不水溶性の内因性物質の天然担体としても働く。例えば、パクリタキセル（ＰＴＸ）は、約１０−５Ｍの解離定数Ｋｄでアルブミンと結合し（Ｐａａｌ、Ｍｕｌｌｅｒら、２００１年）、脂肪酸の総濃度によってμＭ〜ｎＭの範囲のＫｄでステアリン酸と結合する（Ｃｕｒｒｙ、Ｂｒｉｃｋら、１９９９年）。その血清中濃度は４０ｍｇ／ｍｌ（４％または０．６１ｍＭ）に近いが、間質組織中では約１６ｍｇ／ｍｌ（１．６％または０．２４ｍＭ）である。アルブミンは脂肪酸に６つのある程度特異的な結合部位を提供するため、脂肪酸結合部位に関する有効濃度は非常に高い。つまり、タンパク質は疎水性生体異物にとってスポンジとしての役割を果たし、血清中の全脂肪酸の９９．９％はアルブミンに結合した状態である。
【０００４】
分子量１５０ｋＤａの免疫グロブリンＩｇＧと構造上および機能的に全く異なるが、合成および異化の反応速度論において２つの主要タンパク質の間に多くの類似点がある。ＩｇＧは、約１２ｍｇ／ｍｌでアルブミンに次いで全身に豊富に存在する。これらのタンパク質のサイズによって、それらは、Ｍａｅｄａによって提案されたいわゆる透過性および滞留性の亢進（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）（ＥＰＲ）効果の候補となる（Ｍａｅｄａ ２００１年；Ｔａｎａｋａ、Ｓｈｉｒａｍｏｔｏら、２００４年）。簡潔に述べると、これらの分子は血流を通って主に溶媒牽引（つまり対流）によって移動する。腫瘍に近づくと、圧力勾配によってこれらの高分子は漏出性の血管系を通って腫瘍周辺に押しやられる。腫瘍の中心は液圧が高く、腫瘍深部への対流性浸透（ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を防ぐ（Ｊａｉｎ、２００５年）。循環に戻ることや、腫瘍の深部へ移動することができないこれらの高分子は、通常リンパ系に流出することになり、内部壊死腫瘍組織で機能不全となる。したがって、これらの高分子がマクロピノサイトーシスによって腫瘍周辺に取り込まれ、そこで高分子が分解されて腫瘍増殖の栄養となることがＳｔｅｈｌｅによって提案された（Ｓｔｅｈｌｅ、Ｗｕｎｄｅｒら、１９９９年）。血管系においてアルブミンの濃度が低下すると、肝臓はより多くのアルブミンを合成して、定常状態の全身濃度０．６ｍＭに維持する。したがって、腫瘍でアルブミン分解の大部分が生じることが観察されるのは当然のことである（Ｓｔｅｈｌｅ、Ｗｕｎｄｅｒら、１９９８年）。血管透過性の増加も通常様々な炎症性疾患で観察される。そのため、合成ナノ粒子で見られるように、病的部位においてＥＰＲの媒介によるアルブミンおよびＩｇＧの蓄積が予測される（Ｓａｎｄａｎａｒａｊ、Ｇｒｅｍｌｉｃｈら、２００９年）。
【０００５】
ヒトがいかにしてアルブミンとＩｇＧをそのような高濃度に維持するのかは、ＦｃＲｎまたはＢｒａｍｂｅｌｌ受容体がこれらの２つの主要タンパク質を保護するという最近の発見まで不可解なままであった（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃｈａｕｄｈｕｒｙら、２００６年；Ｋｉｍ、Ｂｒｏｎｓｏｎら、２００６年）。この受容体は、後期エンドソームの酸性条件下で両方のタンパク質を認識し、後期エンドソームで受容体がこれらのタンパク質と結合することで、エンドソームによる再利用によって表面に回帰される。中性ｐＨの血清では解離が生じ、無傷タンパク質は循環に戻る。この保護は、アルブミンとＩｇＧの半減期がそれぞれ１９日と２１日であるというこれらの高分子の驚くべき特性に明示されている。つまり、アルブミンは身体で最も豊富なタンパク質として肝臓で生成される。アルブミンは脂肪酸と非常に高い親和性および能力で結合し、比類のない時間循環し、増殖中の腫瘍を受動的に標的とする。
【０００６】
薬物担体としてアルブミンを開発するには少なくとも２つの方法がある。１つは、遊離薬物がなんらかの形で放出すると考えられる薬物分子とタンパク質の直接的な化学結合である（Ｋｒａｔｚ、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｄｒｉｖｅｒら、２０００年）。この場合、多数の薬物分子を備えたタンパク質はもはや天然アルブミンとして作用しないため、アルブミンの使用は合成高分子となんら変わりはない。第２のアプローチは、薬物のアルブミンへの親和性を増加させる分子で薬物を誘導体化することである。例えば、オリゴヌクレオチドのイブプロフェン結合体であり、オリゴヌクレオチドのＰＫはイブプロフェンがアルブミンと結合することによって劇的に変化する（Ｍａｎｏｈａｒａｎ、Ｉｎａｍａｔｉら、２００２年）。
【０００７】
パクリタキセル（ＰＴＸ）は、現在、乳癌、卵巣癌および肺癌を処置する最適な薬物である。ＰＴＸは極めて水に不溶性であるため、薬物を可溶性にし、少しでもその薬物動態（ＰＫ）を改善するために、多くの製剤が試みられてきた（ＳｉｎｇｈおよびＤａｓｈ、２００９年）。ＰＴＸが界面活性剤のポリオキシエチル化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ）と無水エタノールで可溶化されたＴａｘｏｌ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）には、まだ難溶性の問題があり（水で戻した後１．２ｍｇ／ｍＬ未満）、低速の３時間注入が必要とされ、多量のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬが存在することで過敏症を引き起こすことが多い。副作用として好中球減少症および末梢神経障害が挙げられる。これらの反応は、処置する前にステロイドを投与することで回避しなければならなかった。
【０００８】
第２世代製剤Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（Ａｂｒａｘｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＬＬＣ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）において、ＰＴＸはアルブミンとの複合体として存在する。処理にはＰＴＸを溶かす有機溶媒中で高圧下でアルブミンを変性させることが含まれる。その後、溶媒を除去して製品を得る。固体粉末を水で戻すと、約１３０ｎｍのサブミクロン粒子が２〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で生成される。製造業者は、ナノ粒子がｇｐ６０によって腫瘍周辺に経細胞輸送されることを提案しているが、この仮説は実験的に確立されていない（査読なしのジャーナル、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ Ｗｉｎｔｅｒ ０７／０８）。製剤でのアルブミンの変性により、ｇｐ６０および／またはＦｃＲｎによるアルブミンの認識には疑問の余地があり、確実にアルブミンの長い半減期は得られないであろう。
【０００９】
インスリン含有製品Ｄｅｔｅｍｉｒ（登録商標）はアシル化インスリンである。インスリンは、グルコースの血清濃度を調節する天然ペプチドホルモンである。糖尿病患者はインスリン抵抗性であるか、またはグルコースレベルを調節するのに十分なレベルのインスリンに欠けていることがある。これらの糖尿病患者はインスリン注射を一般的に１日当たり３回受けるであろう。長期循環性のインスリン分子の目的は、一日を通してペプチドの基礎濃度を維持することであり、したがって単回注射しか必要としない。このインスリン分子は、ペプチドがアルブミンに固着することができる鎖のうちの１つの末端に結合した脂肪酸を有する。（Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ Ｈａｖｅｌｕｎｄら、１９９５年）
【００１０】
核酸脂質結合体が知られている。この技術には、脂肪酸またはステロールによる新しいクラスのオリゴヌクレオチド薬物の修飾が含まれていた。これらの修飾核酸は活性を保持することが示され、修飾によっては、アルブミンと同様にリポタンパク質粒子とも結合することも示された。また、合成に関与する化学反応は薬物に合わせられ、通常、脂肪酸の負電荷を排除するアシル化である。カルボキシル化ステロールの電荷も同様に中和されるが、脂肪酸誘導体のみが明らかにアルブミンを結合することが示されている（Ｗｏｌｆｒｕｍ、Ｓｈｉら、２００７年）。
【００１１】
スクアレン酸（ｓｑｕａｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）で結合されたゲムシタビンが知られている（Ｃｏｕｖｒｅｕｒ、Ｓｔｅｌｌａら、２００６年）。これによって、ゲムシタビン分子が凝集し、ミセルまたはミセル様粒子を形成することができる。アルブミン結合についての言及はないが、脂肪酸の枝状の性質により、この結合体がアルブミンに対立してリポタンパク質結合により適したものとなる可能性がある。その結果、循環時間が著しく減少した結合体が得られるであろう。ゲムシタビンのステアリン酸（炭素数１８の脂肪酸）誘導体が知られている。結合体はリポソームへと処理された。後者は、リン脂質が水性溶媒の中で懸濁されると自然に形成されるミクロン未満の脂質小胞である。結合体がリポソームに取り込まれることで、結合アルブミンと比較して、半減期が不十分になるであろう。
【００１２】
疎水性薬物ＰＴＸをω−３ドコサヘキサエン酸で誘導体化することで薬物Ｔａｘｏｐｒｅｘｉｎ（登録商標）が得られる（Ｗｏｌｆｆ、Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら、２００３年）。この脂質は、一般的に腫瘍でよく吸収されると考えられる天然栄養素である。この薬物の製剤は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬとエタノールで調剤され、食塩水で希釈される点でＴａｘｏｌ（登録商標）様である。この製剤によって、製剤でのプロドラッグの溶解性が向上するが、好中球減少および過敏などのＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬの副作用は除去されない。この製剤は、さらにＴａｘｏｌ（登録商標）に類似した毒性を示し、ちょうどＴａｘｏｌ（登録商標）のように半減期が不十分であろう。脂質の構造のため、それは、アルブミンよりむしろ低比重リポタンパク質および高比重リポタンパク質（ＬＤＬ／ＨＤＬ）のバインダーであり、したがって、天然担体に調剤された場合、同様に半減期は依然として長くならない。
【００１３】
α−リノレン酸で結合されたドキソルビシンは、天然ω−３脂肪酸の消化に腫瘍を利用するという点でＴａｘｏｐｒｅｘｉｎ（登録商標）に類似している（Ｈｕａｎ、Ｚｈｏｕら、２００９年）。糖に対する親水性の性質、特にアンモニウムのカチオン電荷は、薬物の吸収を妨げる。これは結合によって克服される。なぜなら、結合によって電荷が中和され、薬物がより細胞膜に分配されやすくなり、単純拡散によって細胞に移動することが可能となるからである。他にも多数のドキソルビシン含有製剤がある。それらは、受動的にも能動的にも腫瘍を標的としないため、薬物の重篤な心臓毒性が持続すると予想される。さらに、担体なしでは、薬物のＰＫが明らかに変化することは期待できず、毒性の軽減または効能の増加が妨げられる。
【００１４】
特定の３−置換グルタル酸およびそれらの無水物が知られている（Ｐｏｌｄｙ Ｐｅａｋａｌｌ、およびＢａｒｒｏｗ、２００８年）。しかしながら、比較的短鎖の誘導体しかフェロモンの合成に開示されていない。本特許出願では、短鎖のグルタル酸無水物はフェロモンの合成での踏み台として以外いかなる方法にも使用されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
つまり、薬物のアルブミンに対する親和性を改変し、長い循環半減期の血清ＰＫおよび病的部位への標的送達などの望ましい生物薬剤学的特性を有する薬物の結合体を作成することが可能な分子が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
ポリカルボン脂肪酸（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）と薬物分子を共有結合させ、脂肪酸−薬物の結合体を形成する組成物および方法が記載されている。結合体は、薬物の溶解性を向上させるとともに、癌処置での固形腫瘍または関節炎での炎症を起こした関節の治療において薬物を標的とするのに有用である。１つの実施形態では、本開示は、２つ以上の近接した−ＣＯＯＨ基を有する長鎖脂肪酸を対象とする。薬物の結合体の−ＣＯＯＨ基は、硝酸、硫酸、スルホン酸、リン酸などの他の無機酸、およびそれらの誘導体であってもよい。これらの試薬の１つの−ＣＯＯＨ基は、薬物と共有結合していてもよい。脂肪酸分子は、このように薬物に結合する場合、遊離カルボン酸または（１つまたは複数の）他の無機酸アニオンを含んでいる。これらの長鎖脂肪酸−薬物の結合体は改善された生物薬剤学特性を有し得、その結果高い治療指数が実現される。
【００１７】
別の実施形態は、本明細書中に記載される長鎖脂肪酸分子−薬物の結合体を対象とする。
【００１８】
別の実施形態は、脂肪酸−薬物の結合体を調製するための長鎖脂肪酸分子の使用を対象とする。
【００１９】
別の実施形態は、薬物の溶解性を向上させるための長鎖脂肪酸−薬物の結合体の使用を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】血清アルブミン濃度の増加に伴う結合体の溶解性の向上を表す図である。この依存性は両者の相互作用を示唆している。この実験は結晶結合体を使用してＰＢＳ中で行い、その溶解には限度があり、平衡化するには長時間かかることが分かった。これを改善するために、ＰＤＧ−ＰＴＸ結合体をｔ−ＢｕＯＨに溶解させ、それを血清アルブミンの撹拌溶液にゆっくり添加することで、アルブミンを飽和させ、非常に高濃度（１％ＨＳＡ溶液中、約８２５μＭ ＰＤＧ−ＰＴＸ）を達成することが可能になった。
【図２】血清アルブミンと結合する際の結合体自体の向きの理論モデルを表す図である。なお、結合体は、結合ポケット周辺のカチオン性アミノ酸残基との静電的相互作用によってタンパク質への結合を促進させるカルボン酸アニオンを依然として保持している。この例におけるジカルボン酸はα炭素で酢酸を含むステアリン酸（Ｃ１８Ｈ３６Ｏ２）である。２つのカルボン酸のうちの１つはエステル結合によってＰＴＸと結合する（茶色）。このエステル結合が、腫瘍組織の近傍で、またはインターナリゼーションの後に腫瘍細胞の内部で切断され遊離ＰＴＸを放出すると予想される。誘導体自体がちょうどドセタキセルのようにＰＴＸと同じくらい薬理学的に活性である可能性があるが（Ｃｒｏｗｎ、Ｏ’Ｌｅａｒｙら、２００４年）、誘導体はまたプロドラッグとしても作用することもある。
【図３】未処理対照と比較して、ＰＴＸ、ＰＤＧ−ＰＴＸまたはＰＤＧを用いたＨ１２９９非小肺癌細胞のＭＴＴアッセイを表す図である。データは％生細胞として示されている。
【図４】未処理対照と比較して、ＰＴＸ、ＰＤＧ−ＰＴＸまたはＰＤＧを用いたＨ１１５５非小肺癌細胞のＭＴＴアッセイを表す図である。データは％生細胞として示されている。
【図５】未処理対照と比較して、ＰＴＸ、ＰＤＧ−ＰＴＸまたはＰＤＧを用いたＭＣＦ−７乳癌細胞のＭＴＴアッセイを表す図である。データは％生細胞として示されている。
【図６】アルブミンを担体として使用する場合の可能な結合体として脂質の結合親和性の傾向を表す図である。
【図７】ステアリン酸−フルオレセインアミンとヒト血清アルブミンの結合に関する等温滴定熱量測定のデータを表す図である。
【図８】ＰＤＧ−フルオレセインアミンとヒト血清アルブミンの結合に関する等温滴定熱量測定のデータを表す図である。
【図９】ＰＴＸ結合体の２つの構造異性体を表す図である。構造によって、カルボキシレートから数えて、化合物２がα位で分岐し、化合物３がβ位で分岐していることが分かる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
新薬製剤およびそれらの使用方法が本明細書中に提供される。本明細書中に記載された新規の製剤は、血清アルブミンの３つのインビボ特性および機能を利用すると仮定される。まず、アルブミンは、ヒトでは半減期が１９日という長い間循環する。第２に、アルブミンは強く結合した脂肪酸を運搬する。第３に、薬剤が癌治療である場合、および腫瘍が増殖している場合、タンパク質は主に腫瘍に蓄積し、腫瘍で分解される。したがって、例えば、パクリタキセルのステアリン酸誘導体はアルブミンと結合すると循環半減期が長くなり、固形腫瘍に薬物が著しく蓄積する可能性がある。
【００２２】
アルブミンとＩｇＧは魅力的な薬物担体である。なぜなら、これらのタンパク質に保持された薬物分子は長い循環半減期を有するだけでなく、これらのタンパク質に結合した薬物が固形腫瘍または炎症組織に送達される可能性が高いからである。脂肪酸の場合のアルブミンに対する結合親和性には２つ要因がある。１つは、脂肪酸の長いアルキル鎖と結合穴（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｖｉｔｙ）の間におけるエントロピー（ΔＳ）駆動の疎水性相互作用であり、もう１つは、カルボン酸アニオンと結合ポケット周辺のリシンおよびアルギニンからの正電荷の間におけるエンタルピー（ΔＨ）駆動の静電引力である。脂肪酸はアルブミンに対して親和性が高いため、種々の薬物が脂肪酸で修飾されてきた（Ｌａｍｂｅｒｔ、２０００年）。しかしながら、いずれの場合も、関与する化学反応が単純であることが多いため、−ＣＯＯＨ基は薬物分子に直接結合する。この単純なアプローチの重大な欠点は、結合体と脂肪酸結合部位の相互作用において静電気の寄与がほとんどないため、結合体が遊離脂肪酸より低い親和性でアルブミンと結合することである。本明細書中に記載された技術は、結合体のアルブミン結合に対するエントロピーとエンタルピーの両方の寄与に関与する。非結合のカルボン酸アニオンについての報告がある（Ｅｋｒａｍｉ、Ｋｅｎｎｅｙ、およびＳｈｅｎ、１９９５年；Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ、Ｈａｖｅｌｕｎｄ、Ｊｏｎａｓｓｅｎら、１９９５年）。
【００２３】
本製剤およびプロセスは、本明細書中に記載された結合化学反応を利用する。重要なことであるが、脂肪酸の−ＣＯＯＨ官能基は最終結合体において未反応のままである。好ましくは、脂肪酸分子には２つ以上のカルボン酸部分がある。脂肪酸分子が２つ以上のカルボン酸部分を含んでいる場合、分子の好ましい形態は無水物である。ジカルボン酸からの無水物の調製は当技術分野において周知である。
【００２４】
１つの実施形態では、本開示は、長鎖脂肪酸および薬物を備える結合体の組成物を対象とし、前記結合体は前記脂肪酸からの少なくとも１つの遊離カルボン酸またはカルボキシレート基を有する。好ましくは、脂肪酸はジカルボン酸である。より好ましくは、脂肪酸は無水物から誘導される。本明細書中に使用される用語「脂肪酸」は、Ｃ１０〜２５アルキル脂肪酸および誘導体、ならびにジカルボン酸の無水物も指す。好ましくは、アルキル鎖は１２〜２０個の炭素を有する。より好ましくは、アルキル鎖は１４〜１６個の炭素を有する。有用な脂肪酸には、遠位端にカルボキシレートを有する直鎖アルキル鎖である任意のアルキル二酸が含まれ、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸などが挙げられる。長鎖アルキル鎖を有するポリカルボン酸が薬物分子の誘導体化に使用される場合、得られる結合体は遊離−ＣＯＯＨ基を保持するであろう。マロン酸、コハク酸およびグルタル酸などのジカルボン酸は有用であり、炭素数が８〜２５、好ましくは８〜２０、１０〜２０、１２〜２０または１４〜１６である１つの長鎖アルキル鎖を含むそれらの単純な誘導体も有用である。これらのジカルボン酸誘導体に加えて、３つ以上の−ＣＯＯＨ基を含む任意の化合物も同じ目的に使用することができる。例えば、クエン酸、トリカルボン酸、ならびにβ−メチルトリカルボン酸および１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸などのその誘導体を挙げることができる。ショウノウ酸および環式１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸などの環式ジカルボン酸もまた同じ目的を果たすことができる。無機酸を含む混合二価酸または多価酸（ｍｕｌｔｉ−ａｃｉｄ）も含まれ、天然に存在する例はリン酸化Ｎ−アセチルチロシンであり、水酸基含有カルボキシ酸の硫酸エステルが合成由来の例である。
【００２５】
最も好ましくは、脂肪酸はグルタル酸であり、特に３−ペンタデシルグルタル酸無水物（ＰＤＧ）である。組成物は薬学的に許容される賦形剤または希釈剤をさらに備えることができる。
【００２６】
求核基を有するか、求核基を含むように修飾することができる薬物または化合物であれば、結合体に使用することができる。これらの薬物は、ＮＳＡＩＤ、例えばナプロキセン、アセトアミノフェン、イブプロフェンのような化学的性質を有し得る。それらは、手術後などに鎮痛剤の放出を遅らせるためにも使用することができる。典型的な鎮痛剤はコデイン、オキシコドンおよびモルヒネであり得る。しかしながら、本結合技術は低分子薬物に限定されない。その技術は、タンパク質またはペプチドを、長鎖脂肪酸と反応することができる多くのアミノ酸求核種を含むように修飾するために使用することができる。さらに、大部分の非環状ペプチドはカルボキシル末端とアミノ末端を有し、両者は長鎖脂肪酸と反応するため使用することができる。カルボキシル端部は、エタノールアミンリンカーなどのプロモイエティ（ｐｒｏｍｏｉｅｔｙ）の合成を必要とするであろう。形成されたエステルはプロドラッグを生成するように不安定であり、したがって、一級アミンは通常の条件下で長鎖脂肪酸と反応することができる。天然ペプチドの代表例は、ホルモン、例えばインスリンであり得る。他の有用な徐放性製剤には、抗生物質またはステロイドなどの短期の反復投与計画（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ ｒｅｇｉｍｅｎ）が含まれ得る。高親和性を有するものと、低親和性を有するものがある複数の様々な結合体を用いてこれらの薬物の放出速度を制御することができる。低親和性結合体は早く離れるため一気に放出され、一方、高親和性結合体はゆっくりと離れるため定常状態の濃度を維持することができるであろう。いくつかの可能な抗生物質には、セフレキシン、アモキシシリンおよびバンコマイシンと同様に当技術分野で公知の多数の他のものも含まれる。いくつかの可能なステロイドには、プレドニゾン、ヒドロコルチゾンおよびブデソニド、ならびにほとんどのコルチコステロイドが含まれる。好ましい実施形態では、薬物はパクリタキセルである。
【００２７】
一実施形態では、本開示は請求項１に記載の長鎖脂肪酸の結合体を調製する方法を対象とし、この方法は、前記薬物を前記長鎖脂肪酸と接触させることにより前記結合体を調製することを含む。この実施形態の一態様では、結合の方法は脂質によるものであり、薬物から結合体のワンポット合成（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を容易に行うことができる。特に、３−ペンタデシルグルタル酸無水物（ＰＤＧ）の化学反応によって、求核種を含むあらゆる薬剤が本明細書中に記載されるように結合される可能性がある。求核種とは、アルコール、チオール、一級アミンまたは二級アミンを意味する。これらの求核種は薬物上で合成することができる。例えば、アンチセンおよびｓｉＲＮＡなどの核酸は、薬物に遊離アミンを与えるＣ６アミノ修飾剤で合成される。この場合、薬物はここでＰＤＧと容易に反応することができるであろう。これらの修飾は可逆的であるため、ＰＤＧと容易に反応し、切断されて元の薬物に戻ることができるプロドラッグを生成する。例として、カルボン酸は非求核性であるが、多くの薬物に共通している。エタノールアミンを用いたエステルの形成によって、容易に切断できるエステルを介してプロドラッグが生成されるとともに、ＰＤＧと反応することができる遊離アミンを与えるであろう。
【００２８】
用語「アルケニル」および「アルキルエニル」は、単独でまたは組み合わせて使用した場合、２〜１０個の炭素原子を有する部分に少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖基または分岐基を包含する。例として、エテニル、プロペニル、アルキル、プロペニル、ブテニルおよび４−メチルブテニルが挙げられるが、これらに限定されない。用語「アルケニル」およびアルキルエニルは、当業者に理解されるように、「シス」および「トランス」配向、または「Ｅ」および「Ｚ」配向を有する基を包含する。
【００２９】
次のスキーム１〜５は、本明細書中に記載される脂肪酸分子または結合体を調製するための合成経路を表す。スキーム１は、ＰＤＧ（３−ペンタデシルグルタル酸無水物）を調製するための合成経路を表す。
【化１】
スキーム２は、ＰＤＧ−ＰＴＸ（パクリタキセル）の合成経路を表す。
【化２】
スキーム３は、パクリタキセル−脂肪酸結合体の一段階合成を表す。
【化３】
スキーム４は、ＰＤＧ−ＤＯＸ（ドキソルビシン）の合成経路を表す。
【化４】
スキーム５は、ＰＤＧ−ＧＥＭ（ゲムシタビン）の合成経路を表す。
【化５】
【００３０】
本発明の組成物および方法は、癌治療、特に固形腫瘍に対する薬剤を調製するために使用することができる。血清アルブミンが増殖中の腫瘍に凝集する自然な傾向は、長鎖脂肪酸の結合による有用な抗腫瘍性製剤の生成に利用することができる。本発明の薬剤で使用される好適な薬物として、有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、トポイソメラーゼｉｉ抑制剤（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン）および核酸類似体（例えば、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート）が挙げられる。急速に分裂する細胞を標的とし死滅させるように設計され、遊離求核種を有するか、遊離求核種を含むように修飾することができる任意の薬物を、効果向上のために長鎖脂肪酸を用いて調剤することができる。
【００３１】
非担癌状態では、アルブミンは約１９日の半減期で循環する。高親和性の脂質はアルブミンからゆっくり解離するが、低親和性脂質はより速く解離する。したがって、アルブミンに対する結合体の親和性を調整して薬物に特有の徐放性製剤を生成することができる。
【００３２】
製剤によって異なる親和性の結合体が必要とされ、親和性はいくつかの機構により調整することができる。脂肪酸の尾部長が短くなると親和性は低下し、尾部長が約２２個の炭素まで長くなると親和性は増大すると考えられる。なお、さらに長鎖の炭素尾部も有用であり得る。親和性はまた、恐らくアルブミンの結合ポケットの表面におけるリシンおよびアルギニンとの静電的相互作用のため、分子の頭部のアニオン電荷の存在によっても変化すると考えられる。すべての電荷を除去すると親和性が低下し、電荷数または電荷を保持するアームの柔軟性を上げると親和性が増大するであろう。分子の柔軟性は親和性に影響を及ぼすことがあり、例えば、３つの炭素の対称性の頭部基であるマロン酸の柔軟性は、さらに柔軟性のある５つの炭素の対称性の頭部基であるグルタル酸と異なることがある。しかしながら、これらはそれぞれ、１つのアニオン電荷を維持することができる。ポケットの表面で電荷を配向させる柔軟性が高いと親和性が増大する可能性がある。同様に、コハク酸などの４つの炭素の不斉の頭部基も有用である。コハク酸もまた無水物に環化され、求核種と容易に結合することができる。コハク酸に基づく脂質と同様に任意の他のアルキル二酸も、脂質薬物の結合体の製剤の頭部基として、アルブミン結合のために使用することができる。アルキル二酸とは、遠位端にカルボキシレートを有する直鎖アルキル鎖を意味し、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸などが挙げられる。
【００３３】
別の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載される長鎖脂肪酸−薬物の結合体を、前記結合体が可溶化される媒体と接触させることを含む、薬物を可溶化する方法を対象とする。媒体は任意の液体であってもよい。好ましくは、媒体は血清である。好ましい実施形態では、結合体は、特定の媒体において薬物単独の溶解性と比較して溶解性が１００倍増加している。より好ましくは、結合体は、溶解性が２００倍増加している。最も好ましくは、結合体は、溶解性が２５０倍増加している。
【００３４】
別の実施形態では、本開示は次式
【化６】
（式中、Ｒ’は置換または非置換のＣ１０〜２５アルキルまたはＣ１０〜２５アルキルエニルである）
の構造を有する化合物を対象とする。好ましくは、Ｒ’はＣ１２〜２０アルキルである。より好ましくは、Ｒ’はＣ１４〜１６アルキルである。最も好ましくは、化合物は３−ペンタデシルグルタル酸無水物である。
【００３５】
癌のための薬剤は、特に固形腫瘍の処置に使用することができる。本明細書中に使用される「腫瘍」は、悪性か良性かにかかわらず、すべての新生細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。用語「固形腫瘍」は、血液、骨髄およびリンパ系以外の体内組織の癌（ｃａｎｃｅｒ）または癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を指す。固形腫瘍に分類される癌として、例えば、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、胃癌、前立腺癌および皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、ＣＤ４０発現癌細胞を含む固形腫瘍を患う被験者を処置する方法を対象とし、固形腫瘍として、卵巣癌、肺癌（例えば、扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌型の非小細胞肺癌、ならびに小細胞肺癌）、乳癌、結腸癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌を含む）、膀胱癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌を含む）、胃癌、頚部癌、前立腺癌、鼻咽頭癌、甲状腺癌（例えば、甲状腺乳頭癌）、ならびに黒色腫および肉腫（例えば、骨肉腫およびユーイング肉腫を含む）などの皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
ここで本発明について次の非限定的な例によりさらに説明する。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］
ＰＤＧ−パクリタキセルの合成
５０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ、２当量）量の３−ペンタデシルグルタル酸無水物（ＰＤＧ）、６４ｍｇ（０．０７５ｍｍｏｌ、１当量）のパクリタキセルおよび０．９ｍｇ（０．００７５ｍｍｏｌ、０．１当量）の４−ジメチルアミノピリジンを、小型の撹拌子を備えた１ドラムバイアルに添加した。乾燥粉末に、新たに蒸留したピリジン１．３ｍＬを室温で撹拌しながら添加した。反応混合液をシリコーン／ＰＴＦＥセプタムでキャップし、雰囲気をアルゴンと置き換えた。反応混合液を室温で一晩（１８時間）反応させ、その地点で、ＥｔＯＡｃを溶離液として使用したＴＬＣによって、パクリタキセル（Ｒｆ＝０．９）が完全に消失し、小さなテーリング（Ｒｆ＝０．３〜０．５）を示す新たなＵＶ活性スポットが表れることが分かった。反応混合液を約２０ｍＬのジクロロメタンに加え、続いて約２０ｍＬの酸性塩水で３回洗浄してピリジンおよびＤＭＡＰを除去した。ＤＣＭ層をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過および濃縮し、次いでＥｔＯＡｃに加えた。その混合液をシリカカラムに吸着させ、定組成のＥｔＯＡｃで溶出した。濃縮して、７５ｍｇの生成物を白色結晶として回収した。（収率８５％）。
【００３８】
［実施例２］
パクリタキセルのステアリン酸誘導体の溶解度の測定
３７．５ｍｇ量のＰＤＧ−ＰＴＸを５ｍＬの無水ＥｔＯＨに溶解させ、７．５ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。その後、この溶液にＭｏｒａｖｅｋからの（３．１４μＬ／３．５ｘ１０６ＤＰＭ／１．４３ｘ１０−４μｍｏｌ／１６８ｎｇ）［３Ｈ−ＰＤＧ−ＰＴＸ］を加えた。少ない量から５０μＬ、５００μＬ、１０００μＬ、１５００μＬ、１９５０μＬの様々な量の溶液を５つのバイアルに添加された；その後、窒素によってすべてのバイアルからＥｔＯＨを蒸発させ、ＨＳＡを少ない濃度から０％、１％、２％、３％、４％で含有する５ｍＬのＰＢＳと置き換えた。高濃度のアルブミンほどより多くのＰＤＧ−ＰＴＸを含有するバイアルに添加した。懸濁液を２５℃で振動させ、２４時間、４８時間、７２時間、１９２時間（８日）、３３６時間（１４日）の様々な時点で１ｍＬの分量を取り出した。その分量を、０．１μｍの無機膜によってろ過し、液体シンチレーション測定によってＰＤＧ−ＰＴＸを定量し、さらにＢＣＡアッセイによってＨＳＡの濃度を定量することで分析した。
【００３９】
結晶の溶解がゆっくりであることが分かった。したがって、結晶をｔ−ＢｕＯＨに溶解させ、０．２５μＬ／分の速度でヒト血清アルブミンの１％撹拌溶液に添加した。その後、その懸濁液を一晩凍結乾燥させて水およびｔ−ＢｕＯＨを除去し、固形化物（ｃａｋｅ）をｄＨ２Ｏで戻して１％ヒト血清アルブミン溶液を再生した。溶液をろ過し、シンチレーション測定によって分析することで、約８２５μＭのＰＤＧ−ＰＴＸの溶解度が示された。これは、１％溶液において、アルブミン１分子当たり約５．５分子のＰＤＧ−ＰＴＸに概算される。アルブミンは、理論上の結合限界が６分子であるため、アルブミンは結合体でほぼ飽和されている。
【００４０】
［実施例３］
ＮＳＣＬＣ、胸および卵巣の癌細胞株におけるＰＤＧ−ＰＴＸとＰＴＸ単独のインビトロ細胞毒性の比較
ＰＤＧ、ＰＴＸおよびＰＤＧ−ＰＴＸの細胞毒性を、Ｈ１２９９（ＮＳＣＬＣ）、Ｈ１１５５（ＮＳＣＬＣ）、Ｅｓ２（卵巣）、ＭＣＦ７（胸）の４つの細胞株に対して検査した。文献により、ＰＴＸのＩＣ５０が約２５μＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫ−Ｂｒ３）であることが示されたため、０．２５μＭ、２．５μＭおよび２５μＭの濃度を使用した。２．５ｍＭ（１００倍）のＰＤＧ、ＰＴＸおよびＰＤＧ−ＰＴＸの保存溶液をＤＭＳＯで作成した。次いで、約６０〜７０％の培養密度で、細胞培地にＤＭＳＯの保存溶液を０．１μＬ、１μＬまたは１０μＬ添加した。すべて一定にするために、０．１μＬおよび１μＬ分量をＤＭＳＯで１０μＬの容量にした。対照細胞は１０μＬのＤＭＳＯのみで処理した。細胞を薬物と共に２４時間インキュベートし、洗浄してからＭＴＴと共に３０分間インキュベートし、ホルマザン結晶をＤＭＳＯに溶解させてＵＶによって定量した（λ＝５６０）。
【００４１】
［実施例４］
マウスモデルで薬物動態を測定することによる血流中のパクリタキセルの半減期の延長の測定
ＰＤＧ−ＰＴＸの製剤：等価用量の３ｍｇＰＴＸおよび２２５μＬ［３Ｈ−ＰＤＧ−ＰＴＸ］（０．５ｍＣｉ／ｍＬ、１１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を濃縮し、次いで２５０μＬのｔ−ＢｕＯＨに溶解させ、１０μＬ／分の速度で２．５ｍＬの４％脱脂ＨＳＡのＰＢＳ溶液に添加する。得られた溶液を一晩凍結乾燥し、２．５ｍＬのｄＨ２Ｏで戻す。その溶液を、０．１２ｍｇ／マウス（約６ｍｇＰＴＸ／ｋｇマウス）の用量でマウスの後部静脈に注入する。（０．１２ｍｇ／１ｘ１０７ＤＰＭ／０．１ｍＬ ＰＢＳ／２０ｇマウス）。
【００４２】
Ｔａｘｏｌ様ＰＴＸの製剤：等価用量の３ｍｇＰＴＸおよび１１４μＬ［３Ｈ−ＰＴＸ］（０．２５ｍＣｉ／０．２５ｍＬ、３６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を濃縮し、次いで３０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．１ｍＬ（１：１ｖ／ｖ）のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬおよび無水ＥｔＯＨに溶解する。この溶液を、注入直前にＰＢＳで６ｍｇ／ｍＬに５倍希釈する。後部静脈に投与する用量は２０μＬ（約６ｍｇＰＴＸ／ｋｇマウス）である。（０．１２ｍｇ／１ｘ１０７ＤＰＭ／０．０２ｍＬ ＰＢＳ／２０ｇマウス）。
【００４３】
薬物動態学実験：雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）の右脇腹の毛を剃り、１００μＬの培地中の２ｘ１０５ＣＴ−２６腫瘍細胞を、１ｍＬ注射器および２５Ｇ針を用いて皮下注入する。すべてのマウスが５０〜１００ｍｍ３（Ｌ２＊Ｗ）（Ｌは長期の測定（接種後約９日））の腫瘍を有すると薬物動態研究を始める。Ｔａｘｏｌ様、Ｃ１８−ＰＴＸ、ＰＤＧ−ＰＴＸの３つの処理のうちの１つをマウスに注入する。所定の時点でマウスを３重反復で屠殺する。Ｔａｘｏｌ様製剤は速く消失するため、時点は２４時間（０．２５、１、２、４、８、１２、２４時間）までしかない。Ｃ１８−ＰＴＸおよびＰＤＧ−ＰＴＸ製剤はより長い半減期を有すると予想され、収集したデータポイントは７２時間（０．２５、１、３、６、１８、３６、７２時間）までである。屠殺する数分前に、マウスにケタミン１０ｍｇ（１ｍＬ注射器２５Ｇ針）を腹腔内注入する。マウスの意識がなくなってから切開し、続いて最後に心臓穿刺（１ｍＬ注射器２５Ｇ針）することで血液を回収する。血液を、２００μＬずつ３重反復で取り出し、残りは−２０℃で保存する。死んだマウスから器官を採取し、水分を拭き取り、３重反復で小片（約１００ｍｇ）を切除し、秤量してからシンチレーションバイアルに保存した。残りの器官は、保証されれば、さらに使用するまで−２０℃で保存する。特に、器官として、肝臓、肺、心臓、腎臓、脾臓、腫瘍および注入部位が含まれる。
【００４４】
血液の処理：２００μＬ分量の全血を、１ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅ（登録商標）が入った３重反復のシンチレーションバイアルに添加する。試料が褐色を帯びた緑に変化するまで、５５℃で１時間インキュベートする。これに、１００μＬの０．１Ｍ ＥＤＴＡニナトリウム、続いて３００μＬの３０％Ｈ２Ｏ２を１００μＬずつ添加する。その反応は非常に激しいものであり、反応時間３０分で終了することになるであろう。その後、バイアルにキャップをし、さらに１時間５５℃で加熱すると透明から淡黄色の溶液が生成されるはずである。試料を室温まで冷却し、１５ｍＬのＵｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄを添加し、十分混合する。試料は、計測前に光および温度に適応させるため１時間ＬＳＣに静置する。
【００４５】
器官の処理：小さな塊の器官を３重反復（約１００ｍｇ）でシンチレーションバイアルに添加し、１ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅ（登録商標）を添加する。試料を時々かき混ぜたり通気させたりしながら２時間５５℃まで加熱する。試料が溶解すると（淡黄色）、室温まで冷却し、２００μＬの３０％Ｈ２Ｏ２を１００μＬずつ添加する。その後、試料を３０分間再び５５℃まで加熱する。試料を室温まで冷却し、各試料に１０ｍＬのＵｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄを十分混合しながら添加する。試料は、計測する前に光および温度に適応させるため１時間ＬＳＣに静置する。
【００４６】
クエンチ曲線補正：正常なマウスにケタミンで麻酔をかけ、心臓穿刺によってその血液を取り出す。マウスを屠殺し、主要な器官を採取する。１７５μＬ、２００μＬおよび２２５μＬの分量の血液に、公知の比活性のＰＤＧ−ＰＴＸ（約１ｘ１０４ＤＰＭ）を加える。さらに、約７５、１００および１２５ｍｇの器官の試料に、公知の比活性のＰＤＧ−ＰＴＸ（約１ｘ１０４ＤＰＭ）を加える。その後、試料を上記の分析法と同様に処理し、シンチレーション反応混液中のＰＤＧ−ＰＴＸの３重反復と比較する。（約１ｘ１０４ＤＰＭ）。計測効率は、器官ＤＰＭ／標準ＤＰＭの比率である。
【００４７】
［実施例５］
薬力学の測定による腫瘍へのパクリタキセルの送達の増加
６〜８週齢の４頭の雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスの処理グループをランダムに分け、１００μＬの培地中の２ｘ１０５ＣＴ−２６細胞を右後脚に接種する。腫瘍が約５０〜１００ｍｍ３（Ｌ２＊Ｗ）に成長すると、マウスは、「Ｔａｘｏｌ様」として調剤されたパクリタキセルおよび血清アルブミンと複合体を形成したＰＤＧ−ＰＴＸとして調剤されたパクリタキセルを４ｍｇ／ｋｇ当量で処理する。また、ＰＤＧ−ＰＴＸの用量を増加させて試験し、Ｔａｘｏｌ様として調剤されたパクリタキセルより高いと予測される最大耐容線量（ＭＴＤ）を測定する。３回用量の製剤でマウスを処理し、毎日腫瘍のサイズをノギスで測定する。腫瘍がＩＡＣＵＣ基準（ＩＡＣＵＣ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）で大きすぎると実験は終了し、マウスを屠殺する。
【００４８】
［実施例６］
負電荷を有する結合体のアルブミンに対する結合親和性の向上
アルブミンへの脂質親和性は、関心のある脂質と代用薬として働く蛍光団であるフルオレセインアミンとの間に短いポリエチレングリコールリンカーを合成することにより試験する。その後、脂質−フルオレセインアミン結合体を血清アルブミンのＰＢＳ溶液に滴定し、相互作用の熱を等温滴定熱量計を用いて測定する。これから、生じている関連のエンタルピーが算出され、続いて結合親和性を計算することができる。
【００４９】
［実施例７］
ＰＴＸのα−カルボキシメチルステアリン酸結合体の合成
ＰＴＸのα−カルボキシメチルステアリン酸結合体の合成は、以前報告され一般的に使用されている、無水コハク酸を用いた合成に基づく。（Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｂ、Ｋｕｊａｗａ Ｐ、Ｔｋａｃｚｙｋ Ｃら、２００５年：ＰＭＩＤ １５７００９８２）。１００ｍｇ量のパクリタキセル（０．１１７ｍｍｏｌ）を秤量し、乾式反応の容器に添加した。これに、７６ｍｇのヘキサデシル無水コハク酸（０．２３４ｍｍｏｌ）を添加した。固形物を、１．４ｍｇの４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．０１２ｍｍｏｌ）を含む１．２ｍＬの乾燥ピリジンに溶解させた。反応容器を閉じ、窒素でパージし、室温で４８時間撹拌した。１００％酢酸エチルでのＴＬＣによって、パクリタキセルの消失が新しい生成物の出現で平衡状態に達することが確認された。生成物は、液体クロマトグラフィーによって７：３：１の石油エーテル：酢酸エチル：酢酸で溶出することにより精製した。この溶媒系を用いると、生成物のＲｆはＴＬＣで０．５である。純生成物は白色固形物（７２ｍｇ、収率５２％）として得られた；1H NMR 300MHz (CDCl3) δ 8.12 (2H, d), 7.75 (2H, t), 7.60 (1H, q), 7.54-7.26 (8H, m), 6.27 (1H, s), 6.17 (1H, t), 5.95 (1H, m), 5.67 (1H, d), 5.50 (1H, m), 4.94 (1H, d), 4.41 (1H, m), 4.83 および 4.16 (2H, dd), 3.77 (1H, d), 2.90-1.98 (8H, m), 2.20 (4H, d), 1.98-1.72 (4H, m), 1.72-1.62 (2H, s), 1.62-1.38 (2H, dm) 1.34-0.96 (25H, br m), 0.88 (3H, t).質量分析ＬＣ／ＭＳＤトラップＳＬ；（Ｍ＋Ｈ）＋＝１１７８．８、強度０．９ｘ１０９；（Ｍ＋Ｎａ）＋＝１２０１．１、強度４．７ｘ１０９。
【００５０】
［実施例８］
ＰＴＸのα−カルボキシメチルステアリン酸結合体の溶解度／アルブミン親和性
溶解度特性を作成するために、４０％脱脂ウシ血清アルブミン溶液を作り、２５℃と３７℃でＰＴＸのα−カルボキシメチルステアリン酸結合体で飽和させる。沈殿物をろ過し、吸光度をＰＢＳとアルブミンの吸光度を引いて２２７ｎｍで読み取る。４０％溶液を２０％、１０％、５％および２．５％に連続希釈し、各工程でろ過する。各温度で各溶液において吸光度を読み取りプロットする。結合体の標準曲線によって、結合が吸光度に影響しないことが示された。この反応では２つの構造異性体が生成される。１つの生成物は、パクリタキセルがカルボン酸に対してβ炭素でエステル化される炭素数１９の脂肪酸である。別の生成物は、分岐が脂肪酸のα位で生じる炭素数１８の脂肪酸である（図４）。このα生成物の方がアルブミンとわずかに優れた親和性で結合すると考えられる。なぜなら主鎖から外れた余分な炭素によってパクリタキセルがポケットから出たままになるためである。立体的に、アシル鎖に隣接したカルボキシル炭素での立体障害により、α生成物が主要生成物であると考えられる。両方の生成物を液体クロマトグラフィーを用いて分離し、各成分を別々に検査する。
【００５１】
アルブミン親和性を測定するにはいくつかの方法がある。アルブミンの４０％ＰＢＳ溶液を調製し、様々な量の結合体ＰＢＳ溶液をマイクロダイアリシスのチャンバの２つのウェルに添加する。３７℃での平衡後、アルブミンのないチャンバの結果をＵＶ吸収によって読み取ることができる。その後、結合および非結合のフラクションを計算することができ、スキャッチャード解析を用いてデータを分析した。（Ｃｈｏ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９７１年）。あるいは、溶解性が許せば、ｍｉｃｒｏｃａｌ ＶＰ−ＩＴＣ熱量計を用いて結合親和性を直接測定することができる。この技術の有効性はアルブミンに対する脂肪酸の親和性を測定する際に既に実証されている。（Ｆａｎｇ、Ｔｏｎｇ、Ｍｅａｎｓ ２００６年 ＰＭＩＤ：１６４１３８３７）。
【００５２】
［実施例９］
ＰＴＸのα−カルボキシメチルステアリン酸結合体の薬物動態研究
結合体の薬物動態研究は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（製品番号：Ｐ１５９８）製の１４Ｃ−パクリタキセルなどの定量化用タグを使用する必要がある。最初に、マウスの横腹に接種し、腫瘍を約１００ｍｍ３に成長させる。この地点で、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）第Ｉ相臨床試験と比較して、パクリタキセルに関して４．２ｍｇ／ｋｇの１回量をアルブミンとの複合体として投与する。（Ｄｅｓａｉ ２００１年）。好ましくは、試料は少なくとも１０６ｄｐｍ有するため、それらはバックグラウンドよりもおよそ１０００倍高い。血液試料は、注入０．５、２、１２、２４、４８および７２時間後に採取する。パクリタキセル濃度は直接液体シンチレーション測定によって定量する（ＰａｌｍａおよびＣｈｏ ２００７年）。薬物動態学の解析はＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）と同様にノンコンパートメントモデルを用いて行う（Ｄｅｓａｉ ２００１年）。体内分布を検討するために、肝臓、肺、心臓、脾臓および腫瘍をホモジナイズし、それらのＰＴＸ含有量を分析する。
【００５３】
処理の影響を観察するために、マウスの横腹に再度Ｂ１６Ｆ１０細胞を接種し、腫瘍を約１００ｍｍ３に進行させる。この地点で、パクリタキセルに関して４．２ｍｇ／ｋｇの１回量を、アルブミンとの複合体として投与する。腫瘍のサイズを２〜３日ごとに観察する。対照マウスは、ＰＢＳ中のアルブミンのみを受ける。（ＰａｌｍａおよびＣｈｏ、２００７年）。
【００５４】
ＦｃＲｎ再利用が結合体とアルブミンの結合に影響するかどうかを試験するために、文献で示されたように可溶性ＦｃＲｎを作成することができる。（Ｇａｓｔｉｎｅｌ Ｓｉｍｉｓｔｅｒ Ｂｊｏｒｋｍａｎ １９９２年 ＰＭＩＤ：１５３０９９１；Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ、Ｂｒｏｏｋｓら、ＰＭＩＤ：１６６０５２６６）。この可溶性ＦｃＲｎはエンドソームのｐＨが約５でアルブミンと結合する。したがって、結合体が結合した状態であるかどうかを判断するために、結合体の新たなＫＡを、ｐＨ５でｓｈＦｃＲｎ存在下で測定することができる。対照として、ｓｈＦｃＲｎなしでｐＨ５で同様に結合させるべきである。
【００５５】
本出願で引用された文献で引用または参照されたすべての文献、本明細書中で引用または参照されたすべての文献（「本明細書中の引用文献」）、本明細書中で引用された文献で引用または参照されたすべての文献、さらに本明細書中で言及されるか本明細書中に参照により組み込まれた文献におけるあらゆる製品のいかなる製造業者の指示、説明、製品仕様書および製品説明書も、参照により本明細書中に組み込まれ、本発明の実施で使用することができる。
【００５６】
このように詳細に記載された本発明の好ましい実施形態によって、上記のパラグラフに定義された本発明が、本発明の精神または範囲から逸脱することなくその多くの明らかな変形が可能なように、上記の説明に記載された特定の詳細に限定されるものではないことが理解されるべきである。
【００５７】
［参考文献一覧］
【表１Ａ】
【表１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖脂肪酸および薬物を備える結合体の組成物であって、前記結合体が前記脂肪酸からの少なくとも１つの遊離カルボン酸またはカルボキシレート基を有する、組成物。
【請求項２】
前記脂肪酸がジカルボン酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脂肪酸が無水物から誘導される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記薬物が、低分子量有機化合物、（ポリ）ペプチドまたはオリゴヌクレオチド類である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記脂肪酸が、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、および炭素数が８〜２０の１つの長鎖アルキル鎖を含むそれらの単純な誘導体、クエン酸、トリカルボン酸およびその誘導体、β−メチルトリカルボン酸、および１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸、環式ジカルボン酸、ショウノウ酸および環式１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸、無機酸を含む混合二価酸または多価酸、およびリン酸化Ｎ−アセチルチロシンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記脂肪酸がグルタル酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記脂肪酸が３−ペンタデシルグルタル酸無水物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記アルキル鎖がＣ１０〜２５アルキル鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記アルキル鎖がＣ１２〜２０アルキル鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アルキル鎖がＣ１４〜１６アルキル鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記薬物が求核基を含むか、求核基を含むように修飾することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記薬物がＰＴＸ（パクリタキセル）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の長鎖脂肪酸の結合体を調製する方法であって、前記薬物を前記長鎖脂肪酸と接触させることにより前記結合体を調製することを含む方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の長鎖脂肪酸−薬物の結合体を、前記結合体が可溶化される媒体と接触させることを含む、薬物を可溶化する方法。
【請求項１５】
前記媒体が血清またはアルブミンを含有する水溶液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬物単独と比較して前記結合体の溶解性が１００倍増加している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
次式
【化１】
（式中、Ｒ’は置換または非置換のＣ１０〜２５アルキルまたはＣ１０〜２５アルキルエニルである）
の構造を有する化合物。
【請求項１８】
Ｒ’がＣ１２〜２０アルキルである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ’がＣ１４〜１６アルキルである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
３−ペンタデシルグルタル酸無水物である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２１】
薬学的に許容される賦形剤または希釈剤をさらに備える、請求項１に記載の組成物。
【請求項１】
長鎖脂肪酸および薬物を備える結合体の組成物であって、前記結合体が前記脂肪酸からの少なくとも１つの遊離カルボン酸またはカルボキシレート基を有する、組成物。
【請求項２】
前記脂肪酸がジカルボン酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脂肪酸が無水物から誘導される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記薬物が、低分子量有機化合物、（ポリ）ペプチドまたはオリゴヌクレオチド類である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記脂肪酸が、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、および炭素数が８〜２０の１つの長鎖アルキル鎖を含むそれらの単純な誘導体、クエン酸、トリカルボン酸およびその誘導体、β−メチルトリカルボン酸、および１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸、環式ジカルボン酸、ショウノウ酸および環式１，３，５−シクロヘキサントリカルボン酸、無機酸を含む混合二価酸または多価酸、およびリン酸化Ｎ−アセチルチロシンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記脂肪酸がグルタル酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記脂肪酸が３−ペンタデシルグルタル酸無水物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記アルキル鎖がＣ１０〜２５アルキル鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記アルキル鎖がＣ１２〜２０アルキル鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アルキル鎖がＣ１４〜１６アルキル鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記薬物が求核基を含むか、求核基を含むように修飾することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記薬物がＰＴＸ（パクリタキセル）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の長鎖脂肪酸の結合体を調製する方法であって、前記薬物を前記長鎖脂肪酸と接触させることにより前記結合体を調製することを含む方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の長鎖脂肪酸−薬物の結合体を、前記結合体が可溶化される媒体と接触させることを含む、薬物を可溶化する方法。
【請求項１５】
前記媒体が血清またはアルブミンを含有する水溶液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬物単独と比較して前記結合体の溶解性が１００倍増加している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
次式
【化１】
（式中、Ｒ’は置換または非置換のＣ１０〜２５アルキルまたはＣ１０〜２５アルキルエニルである）
の構造を有する化合物。
【請求項１８】
Ｒ’がＣ１２〜２０アルキルである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ’がＣ１４〜１６アルキルである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
３−ペンタデシルグルタル酸無水物である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２１】
薬学的に許容される賦形剤または希釈剤をさらに備える、請求項１に記載の組成物。
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５１６４７１（Ｐ２０１３−５１６４７１Ａ）
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４８０８９（Ｐ２０１２−５４８０８９）
【出願日】平成２３年１月５日（２０１１．１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２０２２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８５０００
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５０００９３８３４）ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月５日（２０１１．１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２０２２１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８５０００
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５０００９３８３４）ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル (14)
【Ｆターム（参考）】
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