蛋白質の酸化的分解の予防のための組成物および方法
本発明は、蛋白質内の芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げることができる１以上の化合物と組合せて、蛋白質および遊離メチオニンを含む医薬製剤に関する。より具体的には、本発明は、酸化感受性治療剤の安定化された医薬的に効果的な製剤に関する。本発明は、更に、そのような治療剤の酸化を妨げる方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、蛋白質の酸化的分解を予防するための安定化剤としての芳香族化合物の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、酸化感受性治療剤の安定化された医薬的に効果的な製剤に関する。本発明は、さらに、そのような治療剤の酸化を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質は、精製および貯蔵の間に種々の程度の分解を受ける。酸化は蛋白質の主な分解経路の１つであって、蛋白質の安定性および力価に対して破壊的な作用を有する。酸化的反応はアミノ酸残基の破壊、ペプチド結合の加水分解を引き起こすため、蛋白質の三次構造の変化および蛋白質凝集による蛋白質不安定性を引き起こす（Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９８９５−９０１（１９８７））。蛋白質製剤の酸化は、Ｎｇｕｙｅｎ（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ （１９９４）中の第４章）、Ｈｏｖｏｒｋａ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９０：２５３６９（２００１））およびＬｉ（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４８：４９０−５００（１９９５））によってレビューされている。
【０００３】
蛋白質酸化の原因
酸化は多くのさまざまな相互に連続した経路を介して起こり、高温、酸素濃度、水素イオン濃度（ｐＨ）、および遷移金属、過酸化物および光への暴露を含めた種々の引き金となる条件によって触媒される。典型的には、蛋白質の酸化的分解を引き起こす重要な因子は酸素、活性酸素種および金属への暴露である。ある種の賦形剤は、蛋白質凝集に対する保護を供するために医薬組成物中に処方されるが、このような薬剤は活性酸素種を含有するゆえに、それらもまた酸化を増強し得る。例えば、（通常は、Ｔｗｅｅｎとして知られた）ポリソルベート８０のような通常用いられる界面活性剤には痕跡量の過酸化物が混入しており、これは、さらに、界面活性剤の酸化を引き起こして、低濃度の金属の存在下でより大量の活性酸素種（酸素ラジカル）を生じさせかねない（Ｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１：２２５２−２２６４（２００２）；Ｈａｒｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９５：２０１４−２０２８（２００６））。酸素ラジカルおよび金属の組合せは、それにより、酸化および、かくして、界面活性剤で処方された蛋白質の分解についての触媒的環境を供する。液体または凍結乾燥製剤の蛋白質の酸化もまた、ポリソルベート中の過酸化物、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような他の処方賦形剤、および鉄または銅のような痕跡量の金属が引き金となることが示されている。加えて、薬剤は、通常、便宜な貯蔵および適用のために低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）またはポリプロピレンで作成されたプラスチック容器中にパッケージされる。しかしながら、これらのプラスチック容器は容易に酸素に対して透過性を示す。酸素は活性酸素種を形成し、これは、メチオニンのメチオミンスルホキシドへの酸化のような、医薬品用蛋白質中の酸化感受性残基の迅速な酸化を引き起こす（Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１１（１９８９））。
【０００４】
感受性の順番において、酸化に対して特に弱いのはシステイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）残基の側鎖である。酸化に対するこれらのアミノ酸残基の感受性は、隣接する二重結合への非局在化によって安定化される芳香族環で形成されたアダクト種の結果である。Ｃｙｓ中のチオール基は最も反応性を示す官能基である。なぜならば、チオール基はラジカルによって容易な水素引抜きを供するからであり、その理由で、医薬品用蛋白質には遊離Ｃｙｓを含有するものはほとんどない。
【０００５】
メチオニン酸化はＭｅｔスルホキシド（Ｍｅｔ［Ｏ］）を形成する。
メチオニン酸化はＭｅｔスルホキシド（Ｍｅｔ［Ｏ］）および、苛酷な条件下では、スルホンを形成する。以下の例はＭｅｔ酸化を呈する医薬品用蛋白質を表し、各研究で用いられたオキシダントが確認されている：成長ホルモン（Ｈ２Ｏ２を用いるｈＧＨ，Ｔｅｈ，Ｌ−Ｃ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：６４７２−７（１９８７年），Ａｓｃ／Ｃｕ（ＩＩ）／Ｏ２を用いるＰｅａｒｌｍａｎ Ｒ，第１章，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第５巻（１９９３年），Ｚｈａｏ Ｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：９０１９−９０２９（１９９７年））、ＩＬ−２（１００倍のＨ２Ｏ２を用いるＳａｓａｏｋｉ Ｋ，Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ３７：２１６０−４（１９８９年），ペルオキソジスルフェートを用いるＣａｄｅ ＪＡ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１８：１４６１−７（２００１年），Ｔｗｅｅｎを用いるＨａ Ｅ，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１：２２５２−６４（２００２年））、小ペプチド（Ｌｉ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １２：３４８−５５（１９９５年））、レラキシン（２０００倍のＨ２Ｏ２を用いるＮｇｕｙｅｎ ＴＨ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１０：１５６３−７１（１９９３年）およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第９巻（１９９６年）中の第５章，Ａｓｃ／Ｃｕ（ＩＩ）／Ｏ２を用いるＬｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４：５７６２−７２（１９９５年））、ｒｈＧＣＳＦ（Ｈ２Ｏ２を用いるＬｕ ＨＳ，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３６２：１−１１（１９９９年），Ｈｅｒｍａｎ ＡＣ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第９巻（１９９６年）中の第７章，Ｙｉｎ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２１：２３７７−８３（２００４年）およびＰｈａｒｍ Ｒｅｓ ２２：１４１−７（２００５年））、ｒｈＶＥＧＦ（Ｈ２Ｏ２ ＆ ｔＢＨＰを用いるＤｕｅｎａｓ ＥＴ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１８：１４５５−６０（２００１年））、ＩＧＦ−１（溶存Ｏ２、Ｆｅ（ＩＩＩ）ＥＤＴＡを用いるＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １３：１２５２（１９９６年））、ｒｈＣＮＦおよびｒｈＮＧＦ（Ｈ２Ｏ２を用いるＫｎｅｐｐ Ｖ，ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ．５０：１６３−１７１（１９９６年））、ＢＤＮＦ（Ａｓｃ／Ｃｕ（ＩＩ）／Ｏ２を用いるＪｅｎｓｅｎ ＪＬ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１７：１９０−６（２０００年））、ｒｈＬｅｐｔｉｎ（ｔＢＨＰおよびＨ２Ｏ２を用いるＬｉｕ ＪＬ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１５：６３２−４０（１９９８年））、アクティミューンおよびアクチバーゼ（ｔＢＨＰを用いるＫｅｃｋ ＲＧ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６，５６−６２（１９９６年））ハーセプチン（ｔＢＨＰを用いるＳｈｅｎ ＦＪ，Ｔｅｃｈｎｉｑ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．ＶＩＩ．２７５−２８４（１９９６年），熱、光およびステンレス鋼を用いるＬａｍ ＸＭ，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ８６：１２５０−５（１９９７年））、およびＰＴＨ（Ｈ２Ｏ２を用いるＹｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２２：１４１−７（２００４年），Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ４３：１４１３９−４８（２００４年）およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９３：３０９６−１０２（２００４年））、およびモノクローナル抗体（ｔＢＨＰ、ＵＶ照射およびオゾンを用いるＷｅｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．７９：２７９７−８０５，２００７年）。過去２０年間において、かなり種々のオキシダントが蛋白質の酸化を研究するのに用いられてきた。ｔＢＨＰおよびＨ２Ｏ２が主に用いられてきた。アスコルベートを除いて、全ては無金属のオキシダントであった。
【０００６】
ヒスチジン酸化はオキソ−ヒスチジンを形成する。
Ｈｉｓの酸化は、主に、オキソ−ヒスチジンを形成するが、酸化の条件に依存して、種々の他の酸化生成物も形成する。Ａｓｃ／Ｃｕ（ＩＩ）／Ｏ２を用いることによって、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８５：８６８−７２，１９９６年）は、レラキシンにおけるＨｉｓ残基の酸化を観察した。ヒト成長ホルモンに関しては、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：９０１９−９０２９，１９９７年）は、同一酸化系を用いて金属−結合部位において金属−触媒酸化を刺激した場合、オキソ−ヒスチジンを観察した。Ｈｉｓの酸化生成物であるアスパラギン酸およびアスパラギンもまた、Ｃｕ（ＩＩ）／Ｈ２Ｏ２の存在下でβ−アミロイドペプチドにおいて検出された（Ｋｏｗａｌｉｋ−Ｊａｎｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｏｒｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ ９８（６）：９４０−９５０，２００４）。
【０００７】
トリプトファンの酸化
トリプトファンの酸化に関しては、多数の生成物が形成される。水性溶液中のトリプトファン（Ｌｅｅ，Ｊ Ｐａｒｅｎｔ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ ４２：２０−２（１９８８年））、および小ペプチドおよびリゾチウム（Ｓｉｍａｔ ＴＪ，Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ４６：４９０−８（１９９８年））中の、およびウシα−クリスタリン（Ｆｉｎｌｅｙ ＥＬ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ７：２３９１−７（１９９８年））中のトリプトファン残基の安定性の研究から、５−ヒドロキシ−トリプトファン、オキシ−インドールアラニン、キヌレニンおよびＮ−フォルミルキヌレニンである主な分解物が明らかに確認された。アミノ酸の酸化の他の形態と比較して、医薬品用蛋白質におけるＴｒｐの酸化については比較的少数の論文しかない。Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６２：９９０２−７；１９８７年）は、コバルト照射から生じた酸素ラジカルによってウシ血清アルブミンを酸化し、Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ５３：３２８５−９２，１９８９年）は、Ｆｅ（ＩＩ）／ＥＤＴＡ／Ａｓｃでアルブミンにストレスをかけ、ＴｒｐおよびＨｉｓの選択的酸化を検出した。最近、モノクローナル抗体中のＴｒｐ酸化が、オゾンおよびＵＶ照射によってストレスがかけられたＡｍｇｅｎ（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｈｒｏｍ．Ａ．１１５６：１７４−８２，２００７年）およびＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．７９：２７９７−８０５，２００７年）によって報告され。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにおいて、Ｔｒｐ酸化は抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ２２およびＡｐｏｍａｂ抗体において検出されている。Ａｐｏｍａｂに関しては、力価の低下はＴｒｐ酸化の程度に相関していた。
【０００８】
酸化のメカニズム
前記分析に基づくと、蛋白質は図１に示されるいずれかのまたは全ての３つの分解メカニズム、ならびに光誘導性の酸化を介する酸化的攻撃に感受性であり得る。Ｈ２Ｏ２との求核反応は、蛋白質生成物が、蛋白質アイソレーターにおける殺菌剤として用いられる、あるいはポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ）またはポリエチレングリコールのような通常用いられる分解からのＨ２Ｏ２蒸気に暴露した場合に観察される酸化反応であり得る。微量金属（鉄、銅、またはクロム）を、例えば、ステンレス鋼との接触から処方溶液にすると、Ｈ２Ｏ２とＦｅ（ＩＩ）とのフェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）反応は操作可能となる。もう１つの分解メカニズムは、前記したような、分解したＴｗｅｅｎに由来し得るアルキルペルオキシドを介する（Ｊａｅｇｅｒ Ｊ，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９：７７−８１，１９９４）。
【０００９】
酸化を受ける蛋白質製剤は、しばしば、蛋白質の修飾および力価の喪失をもたらす。モノクローナル抗体含有溶液のような蛋白質の酸化の結果、抗体の分解、凝集および断片化および、かくして、抗体活性の喪失をもたらし得る。他の場合においては、蛋白質製剤は酸化の後にも依然として生物学的に活性であるが、成長因子は、例えば、高レベルのメチオニンスルホキシドが存在する場合、ＦＤＡのような規制当局の標準に従った医薬使用には許容されないであろう。製剤の製造および包装時に酸素を排除するための現在の注意すべき手法は、医薬品用蛋白質の有意な酸化を予防するには効果的でないことが判明した。結果は、薬剤は、もし酸化反応が阻害できれば潜在的に有するものより有効期間が短いことである。かくして、蛋白質分解が加速しないような物理的および化学的条件を洗い出し、長時間にわたって酸化的条件に耐えることができる安定な蛋白質含有医薬組成物を提供する必要性が当該技術に存在する。従って、種々の引き金となる因子による酸化的損傷から蛋白質を保護する賦形剤を含むペプチドおよび抗体含有医薬組成物を処方することが望ましい。
【００１０】
当該技術における酸化安定化剤
ポリソルベートおよびポロキサマーなどのような界面活性剤と共に、ある種のアミノ酸およびその種々の組合せが、ペプチドおよび蛋白質組成物を安定化するのに用いられてきた。例えば、Ｙｕ−Ｃｈａｎｇ Ｊｏｈｎ Ｗａｎｇ および Ｍｕｓｅｔｔａ Ａ．Ｈａｎｓｅｎ，「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４２：Ｓ１４，１９８８年の文献参照。全ての注射可能な製品のための抗酸化剤の収集情報はＮｅｅｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ ５１：１６６−７１（１９９７年））によって編集されており、そこでは、亜硫酸水素塩、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシルアニソール、システイン等がリストされていた。しかしながら、リストされた剤のいずれも、蛋白質中のメチオニンのみならずトリプトファンおよび他の芳香族アミノ酸残基の酸化的分解メカニズムおよび同時酸化のあらゆる領域を取り扱うのに有効なようには見えない。抗酸化剤として、遊離メチオニンが最初に米国特許第５，２７２，１３５号（Ｔａｋｒｕｒｉ，１９９３）において、また、米国特許出願公開第２００３／０１０４９９６（Ａ１）（Ｌｉ，２００３）において引用された。遊離メチオニンは：デポ−ｓｕｂＱ Ｐｒｏｖｅｒａ、Ｆｏｌｌｉｓｔｉｍ ＡＱ、Ｇｏｎａｌ−ｆ ＲＦＦ、Ｌｕｔｒｏｐｉｎ−αのような多数の市販の非経口製剤において見出すことができる。また、ヒスチジンは、米国特許第５，８４９，７００号（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８年）において抗酸化剤の可能性があるとして開示されている。Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．は、添加剤または緩衝物質としての成長ホルモンおよびヒスチジンまたはヒスチジンの誘導体を含む薬剤が、脱アミド化、（スルホキシド濃度によって測定される）酸化、およびペプチド結合の切断に対して非常に高い安定性を示したことを開示している。蛋白質の酸化を制御することができる他の剤は金属キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）およびフリー・ラジカル・スカベンジャー（例えば、マンニトール）を含み、それらはテキストブックおよび総括論文において広く引用されてきた。例えば、Ｙｕ−Ｃｈａｎｇ Ｊｏｈｎ ＷａｎｇおよびＭｕｓｅｔｔａ Ａ．Ｈａｎｓｅｎ，「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４２：Ｓ１４，１９８８年の文献参照。Ｎ−アセチルトリプトファナートは、殺菌時にヒト血清アルブミンを安定化させるために特異的部位に結合するリガンドとしてのオクタノエートと共に用いられてきた（Ｐｅｔｅｒｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）。しかしながら、このアミノ酸も界面活性剤も、分解した界面活性剤に由来し得るアルキルペルオキシドを介する酸化を防止する目的には用いられていない。従って、酸化的攻撃に対して感受性のアミノ酸配列を有するポリペプチドの薬剤用賦形剤において酸化の多数のメカニズムを阻害する方法に対する要望が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、酸化による損傷に対して蛋白質を保護するための改良された組成物および方法を提供する。この組成物は、典型的には、トリプトファン、チロシンまたはヒスチジン残基を酸化させるフリーラジカルが媒介する酸化を効果的に軽減することができる１以上の化合物と共に処方された酸化に感受性の１以上の蛋白質を含有する。この組成物は酸化からの増大した抵抗性を呈し、例えば、より長い製品有効期間、室温貯蔵を可能とする安定性の増大、および／または製品パッケージングにおける柔軟性を広げる。従って、本発明は、抗体組成物のようなマルチ−ユニット蛋白質組成物さえを保護する（すなわち、安定化させる）ための重要な手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの実施態様において、前記蛋白質内の芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げることができる１以上の化合物と共に（例えば、実験室グレードまたは医薬組成物のような製剤において）処方された蛋白質を含む医薬製剤が提供される。好ましい実施態様は、一緒になって、蛋白質の酸化の最もよくみられるメカニズムの全てに対して全体に効果的に保護するメチオニンと組合せた、遊離芳香族アミノ酸、ヌクレオチドまたはビタミンおよびそれらの誘導体を利用する。
【００１３】
本発明のもう１つの実施態様において、以下に記載される前記蛋白質内の芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げることができる１以上の化合物と組合せた、メチオニンと共に蛋白質を処方することによって安定化された蛋白質組成物を調製する方法が提供される。
【００１４】
本発明のもう１つの実施態様において、蛋白質−ベースの治療剤およびこの剤内で芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げることができる１以上の化合物を含む製剤を、疾患または障害を予防または治療するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において疾患または障害を予防し、または治療する方法が提供される。
【００１５】
本発明のもう１つの実施態様において、蛋白質、およびこの蛋白質内で芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げることができる１以上の化合物を含む製剤を調製し、次いで、この製剤中の蛋白質の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性を評価することを含む、医薬製剤を製造する方法が提供される。
【００１６】
本発明のもう１つの実施態様において、メチオニン、および１以上の化合物を、蛋白質内で芳香族アミノ酸残基の酸化を阻害するのに十分な量で前記組成物に加えることを含む、蛋白質の医薬組成物を安定化させる方法が提供される。
【００１７】
本発明のもう１つの実施態様において、一定量の界面活性剤を蛋白質組成物およびこの界面活性剤の分解から生じる酸化剤種を無効にするのに十分な量の化合物を加えることを含む、医薬製剤を製造する方法が提供される。
【００１８】
本発明のもう１つの実施態様において、芳香族アミノ酸、ヌクレオチド、ビタミンおよびそれらの誘導体よりなる群から選択される１以上の化合物と組合せてメチオニンを加えることを含む、感受性蛋白質内で芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げる方法が提供される。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細の記載および限定的なものと解釈されるべきではない実施例から明らかとなるであろう。本出願を通じて引用された全ての文献、特許および公開された特許出願の内容は参照によって本願明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】メチオニン、トリプトファンおよびヒスチジンの酸化のための考えうる経路を示す図。
【図２】加熱に際してアルキルラジカルを生じ、酸素と組合せると、アルキルペルオキシド（丸印）を形成するアゾ化合物であるＡＩＢＮを示す図である。もう１つのアゾ化合物であるＡＡＰＨもまたその構造と共に示される。
【図３】Ｈ２Ｏ２によって分解されたＰＴＨのｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムの説明図。４０℃において反応させ、試料は２、４および６時間において除去した。ＰＴＨ一酸化物およびＰＴＨ二酸化物の高いピークが示される。
【図４】ＡＡＰＨで処理されたＰＴＨのクロマトグラム、圧倒的に高い、Ｔｒｐ［Ｏ］ＰＴＨピークが示される。４０℃にて反応させ、試料は２、４および６時間目に除去した。
【図５】分解した（酸化された）トリプトファンの化学構造。それらの質量は＋４、＋１６および＋３２として示される。
【図６】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料は遊離メチオニン２ｍｇ／ｍＬの添加が有りまたは無しいずれかであった。
【図７】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料は１５％マンニトールまたは６％スクロールの添加の有りまたは無しいずれかであった。
【図８】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料はＥＤＴＡ ｍｇ／ｍＬの添加の有りまたは無しのいずれかであった。
【図９】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料は２ｍｇ／ｍＬの遊離トリプトファンの添加の有りまたは無しのいずれかであった。
【図１０】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料は共に２ｍｇ／ｍＬの遊離トリプトファンおよびメチオニンの添加の有りまたは無しのいずれかであった。
【図１１】ＡＡＰＨによるＰＴＨの部位特異的酸化、および他の試薬と比較したＴｒｐおよびＭｅｔのさまざまな保護の役割を示すグラフ。個々のＴｒｐ２３、Ｍｅｔ８およびＭｅｔ１８残基の酸化の同定は、それらの対応するトリプシン分解ペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化スペクトルに基づいて割り当てられた。相対的酸化レベルは、酸化されたおよび酸化されていないペプチドの積分された抽出イオンクロマトグラムに基づいて定量した。
【図１２】Ｈ２Ｏ２／ＦｅによるＰＴＨの部位特異的酸化、および他の試薬と比較したＴｒｐおよびＭｅｔのさまざまな保護の役割を示すグラフ。個々のＴｒｐ２３、Ｍｅｔ８およびＭｅｔ１８残基の酸化の同定は、それらの対応するトリプシン分解ペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化のスペクトルに基づいて割り当てられた。相対的レベルは、酸化されたまたは酸化されていないペプチドの積分された抽出イオンクロマトグラムに基づいて定量した。
【図１３】種々の抗ＶＥＧＦ試料のＩＥＣクロマトグラム。Ｈ２Ｏ２は塩基性領域において酸化的種を生じず、ＡＡＰＨは生じた。塩基性ピークは、Ｔｗｅｅｎの不良ロットを用いた場合に、適格ロットにおいて顕著であった。
【図１４】ＡＡＰＨ（Ｔｒｐ無し）によって酸化し、次いで、２または１０ｍｇ／ｍＬ遊離Ｔｒｐを製剤に加えた場合の、抗ＶＥＧＦ抗体のＩＥＣ。酸化されたＭＡｂは塩基性領域において溶出した。これらの塩基性ピークは、Ｔｒｐの添加に際してベースラインまで降下した。
【図１５】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料は、２ｍｇ／ｍＬの遊離Ｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、水溶性ビタミン誘導体）の添加の有りまたは無しのいずれかであった。
【図１６】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＰＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。反応は４０℃にて６時間行った。試料は、２ｍｇ／ｍＬの（通常はビタミンＢ６として知られた）遊離ピリドキシンの添加の有りまたは無しのいずれかであった。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．定義
蛋白質の化学的不安定性は、蛋白質の一次構造との共有結合の切断または形成を含むことができる。蛋白質におけるいくつかの酸化反応が報告されている。アルカリ性または中性溶媒中では、アミノ酸のシステイン、ヒスチジン、メチオニン、トリプトファンおよびチロシンの残基は特に酸化しやすい。しかしながら、酸性条件においては、メチオニンは感受性である。酸化反応は、生物学的活性や免疫原性にも多大な喪失を引き起こすことが多い。本発明は、第一に、酸化による損傷に対して蛋白質を保護するための改良された組成物および方法に関する。この組成物は、典型的には、トリプトファン、チロシンまたはヒスチジン残基を酸化させるフリーラジカルが介する酸化を効果的に軽減させるための１以上の芳香族化合物と共に処方された酸化に対して感受性の１以上の蛋白質を含有する。
【００２２】
（ヌクレオチドにおけるプリンおよびピリミジンあるいは、具体的には、アミノ酸トリプトファンにおけるインドールの芳香族環において例示される）芳香族性は、芳香族化合物がフリーラジカルと反応する場合に過剰の電子を非局在化できるゆえに、生成物は電子非局在化によって安定化される。その結果、芳香族化合物とフリーラジカルとの反応は助長される。差し引きの結果は、フリーラジカルが芳香族化合物に吸収され、他の分子に対するさらなる損傷を及ぼすことができないことになる。この理由で、芳香族化合物は、製剤の賦形剤として加えた場合に、効果的な物質として作用し、フリーラジカルの酸化的損傷作用を中和する。
【００２３】
生理学的に適合する芳香族化合物の２つの主なクラスはヌクレオチドおよびアミノ酸である。これらの化合物は身体にある天然の成分であるので、それらは安全性プロフィールをもたらし、非経口製品のための賦形剤として用いるのに適切である。遊離メチオニンは抗酸化剤としてルーチン的に用いられており、多数の市販の非経口製品で見出すことができる。しかしながら、このアミノ酸は単独では酸化の全てのメカニズムに対して保護できず、メチオニンまたはシステイン残基の求核酸化を阻害する場合に最も有効である。また、ＤＮＡはフリーラジカルによって損傷を受けやすいこともよく知られており、フリーラジカルと好都合に反応する核酸誘導体の使用を裏付ける事実である。今日、製剤の賦形剤として核酸誘導体を用いることについてほとんど知られておらず、市場の製品は製剤の賦形剤として核酸を利用するものは無い。
【００２４】
本発明の１態様では、本発明の組成物は、典型的には、トリプトファン、ヒスチジン、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択される芳香族アミノ酸を含有する。分解された界面活性剤から生成することが多い、アルキルペルオキシドを介する酸化を緩和するための好ましい芳香族アミノ酸はトリプトファンまたはその誘導体、ナトリウムＮ−アセチルトリプトファナートである。メチオニンまたはメチオニン誘導体を製剤に加えると、メチオニンまたはシステインの求核酸化もまた阻害することができる。かくして、遊離トリプトファンおよびメチオニンの組合せは、酸化の多数のメカニズムを効果的にに阻害する。トリプトファンが製剤に存在する組成物は、典型的には、約２ないし１０ｍｇ／ｍＬの範囲の量を含有する。１つの実施態様において、本発明は、トリプトファン単独にて、あるいは１以上のさらなる芳香族アミノ酸およびメチオニンと組合せて、（例えば、実験室グレードまたは医薬組成物のような製剤において）処方された生物学的に活性な剤を含む医薬製剤に関する。アミノ酸の好ましい組合せはトリプトファンおよびメチオニンであり、これらは一緒になって、蛋白質酸化の最もよくみられるメカニズムの全てに対して有効に保護する。
【００２５】
本発明のもう１つの態様では、本発明の組成物は遊離ヌクレオチドまたはそのアナログを含むこともできる。核酸誘導体を、単独で、あるいはメチオニンと組合せて、蛋白質およびペプチドの非経口製剤に加えることができる。１以上の遊離ヌクレオチドが安定化剤として存在する製剤は、典型的には、約０．１ないし１０ｍｇ／ｍＬの範囲の量を含有する。特別な実施態様において、１以上の遊離ヌクレオチドが１以上の遊離芳香族アミノ酸と組合される。好ましい実施態様は、メチオニンと組合せた遊離ヌクレオチドを含むであろう。
【００２６】
本発明のもう１つの態様では、本発明の組成物はトロロックス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸；水溶性ビタミン誘導体）および（通常はビタミンＢ６として知られた）ピリドキシンのようなビタミン誘導体も含むこともできる。特別な実施態様において、１以上のビタミン誘導体を１以上の遊離芳香族アミノ酸と組合せる。好ましい実施態様はメチオニンと組合せたビタミン誘導体を含むであろう。
【００２７】
本発明の組成物は、さらに、酸素のフリーラジカルを中和する１以上の物質（すなわち、ＲＯＳスカベンジャー）を含有することができる。適切なＲＯＳスカベンジャーは、例えば、マンニトール、メチオニンおよび／またはヒスチジンを含む。従って、もう１つの実施態様において、本発明は、芳香族アミノ酸、およびマンニトール、メチオニンおよび／またはヒスチジンのような１以上のＲＯＳスカベンジャーと一緒に処方された１以上の蛋白質を含有する組成物を提供する。ＥＤＴＡのような金属キレート剤もまた用いることもできる。というのは、それはＲＯＳ生成の開始を阻害できるからである。
【００２８】
本発明の組成物は、蛋白質凝集を阻害する１以上の剤を含むこともできる。特別な実施態様において、この剤はＴＷＥＥＮ、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、グリセロールおよびポロキサマーポリマーから選択される。この組成物は、なおさらに、組成物のｐＨを、好ましくは、約５．０ないし約８．０に維持する緩衝液を含むことができる。適切な緩衝液は、例えば、ヒスチジン、Ｔｒｉｓ、アセテート、ＭＥＳ、コハク酸、ＰＩＰＥＳ、ビス−Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、エチレンジアミン、リン酸、およびマレイン酸を含む。組成物は塩化ナトリウム、アルギニン塩等のような等張剤を含有することもできる。
【００２９】
「界面活性剤」は、データによって十分明らかにされた極性および非極性領域を備えた分子であり、それらが溶液中で凝集してミセルを形成させるようにする。極性エリアの性質に依存して、界面活性剤は非−イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性であり得る。最も非経口的に許容される非イオン性界面活性剤はポリソルベートまたはポリエステル基いずれかから由来する。ポリソルベート２０および８０は、市販の蛋白質製剤における最新の界面活性剤安定化剤である。
【００３０】
ペルオキシドは非イオン性界面活性剤の不純物として知られている。ポリソルベート中のペルオキシドは、蛋白質の酸化的分解をもたらしかねない。配合者は、ペルオキシド混入についての蛋白質製剤中のポリソルベートおよび他のポリマー添加剤の原料を選別し、添加剤を用いるためのペルオキシドの規格を確立する傾向がある。別法として、抗酸化剤の取込みを用いて、非イオン性界面活性剤についての可能性を克服して、酸素−感受性蛋白質のための酸化的触媒として働くのを助ける。
【００３１】
酸化に対して感受性である注目するいずれの適切な蛋白質またはポリペプチドも保護することができ、かくして、本発明に従って安定化することができる（すなわち、本願明細書中に記載されたように酸化保護組成物に処方することができる）。蛋白質はその天然（例えば、天然の）形態の状態とすることができ、あるいは例えば、マイクロカプセル化またはコンジュゲーションによって修飾することができる。蛋白質は治療剤または診断剤とすることができる。そのような蛋白質は、例えば、免疫グロブリン、ペプチド、蛋白質、および酸化的損傷に対するそのアナログを含む。
【００３２】
加えて、当該蛋白質を診断的におよび治療的に非機能的とする、酸化的損傷、蛋白質凝集および分解に対して特に感受性である抗体のようなマルチ−サブユニット蛋白質は、本発明に従って保護することができる。特別な実施態様において、本発明は、十分にヒトの抗体、ならびにその断片および免疫コンジュゲート（すなわち、例えば、トキシン、ポリマー、造影剤または薬物などの治療剤にコンジュゲートした抗体）を含めた１以上のモノクローナル抗体を含むもののような、保護された（すなわち、安定化された）抗体組成物を提供する。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様は、酸化による損傷に対して蛋白質を保護するための組成物および方法に関するが、この生物学的に活性な剤はペプチド、小分子、炭水化物、核酸、脂質、蛋白質、抗体および／またはそのアナログよりなる群から選択することもできる。
【００３４】
ここに、用語「約」が頭に付く数値範囲または量は、明示的に、正確な範囲または正確な数値的量を含む。
【００３５】
用語「医薬製剤」とは、有効成分の生物学的活性を有効なものとするような形態である、かつ製剤が投与される対象に対して許容できないように毒性ではない更なる成分を含有しない製剤をいう。
【００３６】
もし所与の時間において抗体の生物学的活性が、イン・ビトロまたはイン・ビボにて抗原に結合する抗体の能力によって決定されるとき、医薬製剤が調製された時点で示した生物学的活性の約１０％以内（アッセイの誤差内）であり、測定可能な生物学的応答をもたらすならば、抗体は医薬製剤において「生物学的活性」を保有するという。
【００３７】
「安定な」製剤とは、その中の蛋白質が貯蔵に際してその物理的および／または化学的安定性を実質的に保持するものである。安定性は選択された温度において選択された期間測定することができる。好ましくは、製剤は、室温（〜３０℃）にて、または４０℃にて少なくとも１カ月安定であり、および／または約２ないし８℃において少なくとも１年、好ましくは、少なくとも２年の間安定である。例えば、貯蔵の間における凝集の程度は蛋白質安定性の指標として用いることができる。かくして、「安定な」製剤は、蛋白質の約１０％未満、好ましくは、約５％未満が製剤中において凝集物として存在するものであってよい。蛋白質安定性を測定するための種々の分析手技が当該技術で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）においてレビューされている。
【００３８】
用語「水性溶液」とは、水が溶解するための媒体または溶媒である溶液をいう。物質が液体に溶解する場合、混合物は溶液と言われる。溶解した物質は溶質であって、溶解を行う液体（この場合、水）は溶媒である。
【００３９】
酸化を［阻害する］とは、少なくとも１つの酸化阻害剤を含む蛋白質含有溶液に存在する酸化の量を、少なくとも１つの酸化阻害剤を含まない蛋白質含有溶液に存在する酸化の量と比較することによって測定された、酸化を妨げ、酸化の量を低下させ、または減少させることを意図する。
【００４０】
本願明細書中において、「酸化された」蛋白質または抗体は、１以上のそのアミノ酸残基が酸化されているものである。
【００４１】
「酸化に対して感受性である」蛋白質または抗体は、酸化される傾向があることが判明している１以上の残基を含むものである。
【００４２】
蛋白質の酸化を測定するための本発明で用途が見出すことができる方法は、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、毛細管電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー、ペプチドマッピング、オリゴ糖マッピング、質量分析、紫外線吸収分光法、蛍光分光法、円偏光二色性分光法、等温滴定熱量測定、示差走査熱量測定、分析用超遠心、動的光散乱、蛋白質分解、および架橋、濁度測定、フィルター遅延アッセイ、免疫学的アッセイ、蛍光色素結合アッセイ、蛋白質染色アッセイ、顕微鏡測定法、および他の結合アッセイを含む。
【００４３】
「ポリペプチド」または「蛋白質」は、鎖の長さが、さらに高次の第三次および／または第四次構造を生じさせるのに十分な長さのアミノ酸を意味する。かくして、蛋白質は、そのような構造を有しないアミノ酸を主体とする分子でもある「ペプチド」から区別される。
【００４４】
処方される蛋白質は好ましくは実質的には純粋であって、望ましくは実質的には均一である（すなわち、不純物を含まない蛋白質）。「実質的に純粋な蛋白質」は、組成物の全重量に基づいて少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％の蛋白質を含む組成物を意味する「実質的に均一な」蛋白質は、組成物の全重量に基づいて、少なくとも約９９重量％を含む組成物を意味する。
【００４５】
ある実施態様において、蛋白質は抗体である。本願明細書中において、この抗体は注目する「抗原」に対する抗体である。好ましくは、この抗原は生物学的に重要な蛋白質であって、疾患または障害に罹っている哺乳動物への抗体の投与の結果、その哺乳動物において治療的便益がもたらされ得る。しかしながら、（腫瘍関連糖脂質抗原のような（米国特許第５，０９１，１７８号参照））非蛋白抗原に対する抗体もまた対象になる。抗原が蛋白質である場合、それは膜貫通分子（例えば、受容体）または増殖因子のようなリガンドであってよい。例示的な抗原は先に議論した蛋白質を含む。本発明に含まれる抗体のための好ましい分子標的はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４およびＣＤ４０のようなＣＤポリペプチド；ＥＧＦ受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体のようなＨＥＲ受容体ファミリーのメンバー；ＬＦＡ１、ＭＡＣ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭおよびそのαまたはβサブユニットいずれかを含めたａｖ／ｂ３インテグリン（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８または抗ＣＤ１１ｂ抗体）のような細胞接着分子；ＣＲＩｇのようなマクロファージ受容体、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ−２のような腫瘍壊死因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のような増殖因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ４；ポリペプチドＣ等を含む。他の例示的な蛋白質はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）およびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）を含めた成長ホルモン（ＧＨ）；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポ蛋白質；α−１アンチトリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、因子、組織因子、およびフォンビルブラント因子のような凝固因子；プロテインＣのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；ウロキナーゼまたは組織タイプのプラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）のようなプラスミノーゲンアクチベータ；ボンバジン；トロンビン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；（活性に際して調節され、通常Ｔ−細胞発現され、分泌される）ＲＡＮＴＥＳ；ヒトマクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような血清アルブミン；ミュラー管−阻害物質；レラキシンＡ−鎖；レラキシンＢ−鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン−関連ペプチド；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；ホルモンまたは成長因子に対する受容体；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）のような神経栄養因子またはＮＧＦ−βのような神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦのような線維芽細胞成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含めた、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン−様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−１（脳ＩＧＦ−１）；インスリン−様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；トロンボポエチン（ＴＰ）；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、および−γのようなインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１ないしＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ−細胞受容体；表面膜蛋白質；崩壊促進因子（ＤＡＦ）；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部のようなウイルス抗原；輸送蛋白質；ホーミング受容体；アドレシン；調節蛋白質；イムノアドヘシン；抗体；および前記リストのポリペプチドのいずれかの生物学的に活性な断片または変種を含む。多くの他の抗体および／または他の蛋白質を本発明に従って用いてもよく、前記リストは限定するものとはならない。
【００４６】
所望により他の分子にコンジュゲートしていてもよい可溶性抗原またはその断片は、抗体を生じさせるための免疫原として用いることができる。受容体のような膜貫通分子については、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として用いることができる。別法として、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として用いることができる。そのような細胞は天然源（例えば、癌細胞株）に由来することができるか、あるいは膜貫通分子を発現するように組換え技術によって形質転換された細胞であってよい。
【００４７】
処方される抗体の例は、本願明細書中においては、限定されるものではないが：トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９；４２８５−４２８９（１９９２）、米国特許第５，７２５，８５６号）およびペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標））（国際公開第０１／００２４５号パンフレット）を含めたＨＥＲ２抗体；ＣＤ２０抗体（後記参照）；ＩＬ−８抗体（Ｓｔ Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｓｔ，１０３：９３２（１９９３）、および国際公開第９５／２３８６５号パンフレット）；ヒト化ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））およびラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，７：５３−６４（１９９２），国際公開第９６／３００４６号パンフレット、および１９９８年１０月１５日に公開された国際公開第９８／４５３３１号パンフレット）のようなヒト化および／または親和性成熟化ＶＥＧＦ抗体を含めたＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体抗体；ＰＳＣＡ抗体（国際公開第０１／４０３０９号パンフレット）；エファリズマズ（ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標））（米国特許第６，０３７４５４号、米国特許第５，６２２，７００号、国際公開第９８／２３７６１号パンフレット、Ｓｔｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｔｌ．４：３−７（１９９１）、およびＨｏｕｒｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５８：３７７−３８０（１９９４））を含めたＣＤ１１ａ抗体；オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２（１９９３）、および国際公開第９５／１９１８１号パンフレット；１９９８年２月３日に発行された米国特許第５，７１４，３３８号または１９９２年２月２５日に発行された米国特許第５，０９１，３１３号、１９９３年３月４日に公開された国際公開第９３／０４１７３号パンフレット、または１９９８年６月３０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４１０、米国特許第５，７１４，３３８号）を含めた、ＩｇＥに結合する抗体；ＣＤ１８抗体（１９９７年４月２２日に発行された米国特許第５，６２２，７００号、または１９９７年７月３１日に公開された国際公開第９７／２６９１２号パンフレット）；Ａｐｏ−２受容体抗体（１９９８年１１月１９日に公開された国際公開第９８／５１７９３号パンフレット）；組織因子（ＴＦ）抗体（１９９４年１１月９日に特許権が付与された欧州特許第０４２０９３７（Ｂ１）号）；α４−α７インテグリン抗体（１９９８年２月１９日に公開された国際公開第９８／０６２４８号パンフレット）；ＥＧＦＲ抗体（例えば、キメラ化またはヒト化２２５抗体、セツキシマブ、１９９６年１２月１９日に公開された国際公開第９６／４０２１０号パンフレットにおけるようなＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標））；ＯＫＴ３（１９８５年５月７日に発行された米国特許第４，５１５，８９３号）のようなＣＤ３抗体；ＣＨＩ−６２１（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））およびＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（１９９７年１２月２日に発行された米国特許第５，６９３，７６２号参照）のようなＣＤ２５またはＴａｃ抗体；ｃＭ−７４１２抗体（Ｃｈｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３９（１）：５２−５６（１９９６））のようなＣＤ４抗体；ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ＩＬＥＸ／Ｂｅｒｌｅｘ）（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３３７（１９８８））のようなＣＤ５２抗体；Ｆｃに対するＭ２２抗体（Ｇｒａｚｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２（１９９５）におけるようなＲＩ）のようなＦｃ受容体抗体；ｈＭＮ−１４（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ（１９９５））のような癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体；ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ３およびＣＨＬ６（Ｃｅｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３）：５８５２ｓ−５８５６ｓ（１９９５）；およびＲｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐ）：５９１６ｓ−５９２０ｓ（１９９５））を含めた乳房上皮細胞に対する抗体；Ｃ２４２（Ｌｉｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１−９（１９９６））のような結腸癌腫細胞に結合する抗体；ＣＤ３８抗体、例えば、ＡＴ １３／５（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：９２５−９３７（１９９５））；Ｈｕ Ｍ１９５（Ｊｕｒｃｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（２３ Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ−５９１０ｓ（１９９５））およびＣＭＡ−６７６またはＣＤＰ７７１のようなＣＤ３３抗体；１７−１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））のようなＥｐＣＡＭ抗体；アブシキマブまたはｃ７Ｅ３ Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））のようなＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；ＭＤＥＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））のようなＲＳＶ抗体；ＰＲＯＴＯＶＩＲ（登録商標））のようなＣＭＶ抗体；ＰＲＯ５４２のようなＨＩＶ抗体；Ｈｅｐ Ｂ抗体、ＯＳＴＡＶＩＲ（登録商標）のような肝炎抗体；抗ＭＵＣ１６（国際公開第２００７／００１８５１号パンフレット；Ｙｉｎ，ＢＷＴ ａｎｄ Ｌｌｏｙｄ，ＫＯ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６−２７３７１−２７３７５（２００１））およびＯｖａＲｒｅｘを含めたＣＡ１２５抗体；イディオタイプのＧＤ３エピト−プ抗体ＢＥＣ２；αｖβ３抗体（例えば、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）；ｃｈ−Ｇ２５０のようなヒト腎臓細胞癌腫抗体；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１ Ａｎ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト結直腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平細胞癌腫（ＳＦ２５）；Ｓｍａｒｔ ＩＤ１０および抗−ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）のようなヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体；ＴＲＵ０１６（Ｔｒｕｂｉｏｎ）のようなＣＤ３７抗体；ＩＬ−２１抗体（Ｚｙｍｏｚｅｎｅｔｉｃｓ／Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）；抗Ｂ細胞抗体（Ｉｍｐｈｅｒｏｎ）；Ｂ細胞標的化ＭＡｂ（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ）；１Ｄ０９Ｃ３（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ／ＧＰＣ）；ＬｙｍｐｈｏＲａｄ１３１（ＨＧＳ）；Ｌｙｍ−１Ｙ−９０（ＵＳＣ）または抗Ｌｙｍ−１ Ｏｎｃｏｌｙｍ（ＵＳＣ／Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）のようなＬｙｍ−１抗体；ＬＩＦ ２２６（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌｉｆｅｓｃｉ．）；ＢＡＦＦ抗体（例えば、国際公開第０３／３３６５８号パンフレット）；ＢＡＦＦ受容体抗体（例えば、国際公開第０２／２４９０９号パンフレット参照）；ＢＲ３抗体；べリムマブのようなＢｌｙｓ抗体；ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−Ｂ（商標）；ＩＳＦ １５４（ＵＣＳＤ／Ｒｏｃｈｅ／Ｔｒａｇｅｎ）；ゴミリキシマ（Ｉｄｅｃ １５２；Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）；アトリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（商標）；Ｃｈｕｇａｉ／Ｒｏｃｈｅ）のようなＩＬ−６受容体抗体；ＨｕＭａｘ−Ｉｌ−１５（Ｇｅｎｍａｂ／Ａｍｇｅｎ）のようなＩＬ−１５抗体；ＣＣＲ２抗体（例えば、ＭＬＮ１２０２；Ｍｉｌｌｉｅｎｅｕｍ）のようなケモカイン受容体抗体；Ｃ５抗体（例えば、エクリズマブ，５Ｇ１．１；Ａｌｅｘｉｏｌ）のような抗補体抗体；ヒト免疫ブロブリンの経口製剤（例えば、ＩｇＰＯ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；ＡＢＴ−８７４（ＣＡＴ／Ａｂｂｏｔｔ）のようなＩＬ−１２抗体；テネリキシマブ（ＢＭＳ−２２４８１８；ＢＭＳ）；Ｓ２Ｃ６およびそのヒト化変種国際公開第００／７５３４８号パンフレット）およびＴＮＸ１００（Ｃｈｉｒｏｎ／Ｔａｎｏｘ）を含めたＣＤ４０抗体；ｃＡ２またはインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ＣＤＰ５７１、ＭＡＫ−１９５、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（商標））、ＣＤＰ−８７０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）のようなＰＥＧ化ＴＮＦ−α抗体断片、Ｄ２Ｅ７（Ｋｎｏｌｌ）、抗−ＴＮＦ−αポリクローナル抗体（例えば、ＰａｓｓＴＮＦ；Ｖｅｒｉｇｅｎ）を含めたＴＮＦ−α抗体；ＬＬ２、またはエプラツズマブＹ−９０およびエプラツマブＩ−１３１を含めたエプラツズマブ（ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（登録商標）；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＡｂｉｏｇｅｎのＣＤ２２抗体（Ａｂｉｏｇｅｎ，Ｉｔａｌｙ）、ＣＭＣ５４４（Ｗｙｅｔｈ／Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、コムボトックス（ＵＴ Ｓｏｕｔｗｅｓｔｅｒｎ）、ＢＬ２２（ＮＩＨ），およびＬｙｍｐｏＳｃａｎ Ｔｃ９９（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ならびに抗−アミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）、抗−ＣＤ４（ＭＴＲＸ１０１１Ａ）、抗−ＥＧＦＬ７（ＥＧＦ−様−ドメイン７）、抗−ＩＬ１３、Ａｐｏｍａｂ（抗ＤＲ５−標的化プロ−アポトーシス受容体抗体アゴニスト（ＰＡＲＡ））、抗−ＢＲ３（ＣＤ２６８，ＢＬｙＳ受容体３，ＢＡＦＦ−Ｒ，ＢＡＦＦ受容体）、抗−ベータ７インテグリンサブユニット、ダセツズマブ（抗−ＣＤ４０）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）、ＭｅｔＭＡｂ（抗ＭＥＴ受容体チロシンキナーゼ）、抗−ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）、オクレリズマブ（抗ＣＤ２０抗体）、抗−ＯＸ４０リガンド、抗−酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）、ペルツズマブ（ＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）、およびｒｈｕＭＡｂ ＩＦＮアルファのようなＣＤ２２抗体を含む。
【００４８】
抗ＣＤ２０抗体の例は：今では「リツキシマブ」（「ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）」）（米国特許第５，７３６，１３７号）と呼ばれる「Ｃ２Ｂ８」；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能な「Ｙ２Ｂ８」または「Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ Ｔｉｕｘｅｔａｎ」（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））と命名されたイッテリウム−［９０］−標識２Ｂ８マウス抗体（米国特許第５，７３６，１３７号；１９９３年６月２２日に受託番号ＨＢ１１３８８下でＡＴＣＣに寄託された２Ｂ８）；Ｃｏｒｉｘａから商業的に入手可能な、「１３１Ｉ−Ｂ１」または「ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ」抗体（ＢＥＸＸＡＲ（商標））を生じさせるために所望により１３１Ｉで標識されていてもよい、「トシツモマブ」とも呼ばれるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」（また、米国特許第５，５９５，７２１号も参照）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」（Ｐｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ６９（２）：５８４−５９１（１９８７））および「フレームワークパッチ化」またはヒト化１Ｆ５（国際公開第２００３／００２６０７号パンフレット，Ｌｅｕｎｇ，Ｓ．；ＡＴＣＣ寄託ＨＢ−９６４５０）を含めたその変種；マウス２Ｈ７およびキメラ２Ｈ７抗体（米国特許第５，６７７，１８０号）；ヒト化２Ｈ７（国際公開第２００４／０５６３１２号パンフレット，Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，）；２Ｆ２（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０）、Ｂ細胞膜中のＣＤ２０分子に標的化された十分にヒトの高親和性抗体（Ｇｅｎｍａｂ，Ｄｅｎｍａｒｋ；例えば、Ｇｌｅｎｎｉｅ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ８：５０３−５１０（２００３）およびＣｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５−１０５２（２００３）；国際公開第２００４／０３５６０７号パンフレット；米国特許出願公開第２００４／０１６７３１９号参照）；国際公開第２００４／０３５６０７号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００４／０１６７３１９（Ｔｅｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）に記載されたヒトモノクローナル抗体；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｓｈｉｔａｒａ ｅｔ ａｌ．）に記載された、Ｆｃ領域に結合した複雑なＮ−グリコシド−結合糖鎖を有する抗体；ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−２５、およびＭＢ２０−１１のような、ＣＤ２０に結合するモノクローナル抗体および抗原結合断片（国際公開第２００５／０００９０１号パンフレット，Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）；抗体のＡＭＥシリーズのようなＣＤ２０結合分子、例えば、国際公開第２００４／１０３４０４号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００５／００２５７６４号（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ＡＭＥ）に記載されたＡＭＥ３３抗体；米国特許出願公開第２００５／００２５７６４号（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）に記載されたもののようなＣＤ２０結合分子；キメラまたはヒト化Ａ２０抗体（各々、ｃＡ２０，ｈＡ２０）またはＩＭＭＵ−１０６（米国特許出願公開第２００３／０２１９４３３号，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）のようなＡ２０抗体またはその変種；ＵＳ ２００５／００６９５４５Ａ１および国際公開第２００５／１６９６９号パンフレット（Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．）におけるような、所望によりＩＬ−２とコンジュゲートしていてもよいエピトープ−欠損Ｌｅｕ−１６、１Ｈ４、または２Ｂ８を含めたＣＤ２０−結合抗体；ＣＤ２２およびＣＤ２０に結合する二重特異性抗体、例えば、ｈＬＬ２ｘｈＡ２０（国際公開第２００５／１４６１８号パンフレット，Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．）；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｗｏｒｋｓｈｏｐから入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８−２、９３−１Ｂ３、Ｂ−ＣｌまたはＮＵ−Ｂ２（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ｅｄ．，ｐ．４４０，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８７））；１Ｈ４（Ｈａｉｓｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９２：１８４（１９９８））；抗ＣＤ２０アウリスタチンＥコンジュゲート（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；抗−ＣＤ２０−ＩＬ２（ＥＭＤ／Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ／Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ）；抗ＣＤ２０ ＭＡｂ療法（ＥｐｉＣｙｔｅ）；抗ＣＤ２０抗体ＴＲＵ ０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ）を含む。
【００４９】
本願明細書中で用いる用語「抗体」は、（免疫グロブリンＦｃ領域を有する抗体全体を含めた）モノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を持つ抗体組成物、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体，ダイヤボディー，および単一鎖分子）、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，およびＦｖ）を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本願明細書中においては、抗体と同じ意味で用いられる。
【００５０】
本願明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわちこの集団を含む個々の抗体は、微量で存在するかも知れない可能な天然に生じる突然変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性体化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一の抗原部位に対するものである。更に、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、他の免疫グロブリンが混合していないハイブリドーマ培養によって合成される点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５年）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成されてもよく、あるいは組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作成されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１年）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１年）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００５１】
モノクローナル抗体は、ここでは、具体的には、望まれる生物学的活性を呈する限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスまたはサブクラスの属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同であり、他方、この鎖の残りがもう１つの種に由来する、あるいはもう１つの抗体のクラスまたはサブクラスに属する対応する配列と同一であるか、または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。注目するキメラ抗体は、ここでは、ヒト以外の霊長類（例えば、旧世界サル、無尾猿など）に由来する可変ドメイン抗原−結合配列、およびヒト内容領域配列を含む「プリミタイズド（ｐｒｉｍｉｔｉｚｅｄ）」抗体を含む。
【００５２】
用語「治療抗体」とは、疾患の治療に用いる抗体をいう。治療用抗体は、種々の作用メカニズムを有することができる。治療用抗体は、抗原と会合した標的に結合し、この標的の正常な機能を中和することができる。例えば、癌細胞の生存に必要な蛋白質の活性をブロックするモノクローナル抗体は細胞死を引き起こす。もう１つの治療モノクローナル抗体は、抗原と会合した標的に結合し、この標的の正常な機能を活性化することができる。例えば、モノクローナル抗体は細胞上の蛋白質に結合し、アポトーシスシグナルを引き金とすることができる。なお、もう１つのモノクローナル抗体は、疾患のある組織上にのみ発現された標的抗原に結合することができ；化学治療剤または放射性剤のような毒性ペイロード（有効な剤）のモノクローナル抗体へのコンジュゲーションは、疾患のある組織への毒性ペイロードの特異的送達のための剤を作り出すことができ、健康な組織に対する有害性を低下させる。治療抗体の「生物学的に機能的な断片」は、無傷の抗体に帰属される生物学的機能のいくらかまたは全てではないにせよ少なくとも１つを呈し、この機能は標的抗原への少なくとも特異的結合を含む。
【００５３】
「無傷の」抗体は、抗原結合部位、ならびにＣＬおよび少なくとも重鎖ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変種であってよい。好ましくは、無傷の抗体は１以上のエフェクター機能を有する。
【００５４】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。抗体断片の例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片；ダイヤボディー；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］参照）；単一鎖抗体分子および抗体断片から形成された多特異的抗体を含む。
【００５５】
抗体の「生物学的に機能的な断片」は、無傷抗体の一部のみを含み、ここに、この一部は、無傷抗体において存在する場合、その一部と通常は関連する機能の少なくとも１つ、およびほとんどまたは全てのように多くを保有する。１つの実施態様において、抗体の生物学的に機能的な断片は無傷抗体の抗原結合部位を含み、かくして、抗原に結合する能力を保有する。もう１つの実施態様において、抗体の生物学的に機能的な断片、例えば、Ｆｃ領域を含むものは、ＦｃＲｎ結合、抗体の半減期の調節、ＡＤＣＣ機能および補体結合のような、無傷抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常は関連する生物学的機能の少なくとも１つを保有する。１つの実施態様において、抗体の生物学的に機能的な断片は、無傷抗体に実質的に同様なイン・ビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、抗体のそのような生物学的に機能的な断片は、この断片にイン・ビボ安定性を与えることができるＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含むことができる。
【００５６】
ヒト以外の（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、ほとんどヒトの配列のキメラ免疫グロブリン免疫グロブリン鎖または（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原−結合サブ配列のような）その断片である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容体の超可変領域（また、ＣＤＲ）からの残基が、望まれる特異性、親和性、および力価を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非−ヒト残基によって置き換えられている。更に、本願明細書中で用いる「ヒト化抗体」は、受容体抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良し、最適化するためになされる。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれをやはり含むであろう。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）参照。
【００５７】
「単離された」とは、本願明細書中で開示された種々のポリペプチドおよび抗体を記載するのに用いる場合、その産生環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されたポリペプチドまたは抗体を意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドはその生成環境からの全ての他の成分と会合していない。組換えトランスフェクト細胞に由来するもののようなその生成環境の混入成分は、典型的には、ポリペプチドのための診断的または治療的使用に干渉するであろう材料であり、酵素、ホルモン、および他の蛋白質性または非−蛋白質性溶質を含んでもよい。好ましい実施態様において、ポリペプチドは（１）スピニングカップシーケネーターの使用によって、Ｎ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（２）クーマシーブルーまたは、好ましくは、銀染色を用いて非−還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドまたは抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されうる。
【００５８】
「治療」とは、治療的処置および予防的または予防手段の双方を含む。治療を必要とする者は、既に障害を持つ者ならびに障害を予防すべき者を含む。
【００５９】
治療の目的の「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および農場動物、およびイヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、白イタチ、ラット、ネコなどのような動物園、スポーツ用または愛玩動物を含めた、哺乳動物として分類されるいずれの動物もいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００６０】
「障害」は、当該蛋白質での処置から利益を受けるいずれの疾患である。これは、哺乳動物が問題とする障害に対して素因がある病理学的疾患を含めた、慢性および急性障害を含む。ここでは、治療すべき障害の非限定的例は癌腫および炎症を含む。
【００６１】
「治療有効量」とは、特定の障害の測定可能な改善または予防を行うのに必要な少なくとも最小の濃度である。既知の蛋白質の治療有効量は当該分野においてよく知られており、他方、今後発見される蛋白質のこの有効量は、十分に、通常の医師のような当業者の技量内にある標準的技術によって決定することができる。
【００６２】
ＩＩ．発明を実施するための形態
モノクローナル抗体候補についての最近の酸化事象が、我々が、Ｍｅｔ、ＴｒｐおよびＨｉｓ残基に対する酸化のメカニズムを調べ、および適切な安定化剤をサーチするよう駆り立てた。ｒｐ−ＨＰＬＣ、ペプチドマッピングおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって助けられた、モデル蛋白質である副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ，１−３４）を用いることによって、我々は、さまざまなオキシダントによって引き起こされたこれらの不安定な残基に対する酸化を確認し、定量することができた。
【００６３】
Ａ．酸化的損傷の特徴付け
酸化メチオニン（Ｍｅｔ［Ｏ］）は、多数の医薬品用蛋白質において容易に検出されるという事実が、Ｈ２Ｏ２単独に対するだけではなく酸化剤に対するその感受性に帰すことができる。光、ｔＢＨＰ、および／またはペルオキソジスルフェートは、Ｍｅｔ［Ｏ］を生じさせるのに種々の研究室によって用いられてきた。通常の貯蔵条件下での医薬品用蛋白質中のＴｒｐまたはＨｉｓの酸化は非常に遅い可能性がある。酸化を促進するためには、１以上のストレスモデルが共通して用いられている。
【００６４】
多くの蛋白質製剤はポリソルベート（２０および８０）を含有する。古くなったポリソルベート中に存在するオキシダントは圧倒的にＨ２Ｏ２よりなる（７５％まで）ことが報告されている（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９：７７−８１（１９９４年））。Ｈａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１：２２５２−２２６４（２００２年））は、古くなったポリソルベートによりインターロイキン−２突然変異体の酸化が高まっていることを報告した。ポリソルベートは蛋白質薬物製品におけるオキシダントの原因であるので、界面活性剤含有製剤における酸化的反応を刺激する方法としてＨ２Ｏ２を用いることが考えられる。加えて、滅菌製品の充填において用いられるアイソレーター用の防腐剤としてＨ２Ｏ２は用いられてきた。残存Ｈ２Ｏ２は薬物製品中に認められる可能性がある。この理由で、Ｈ２Ｏ２による酸化に対する蛋白質の感度を決定するのが重要である。
【００６５】
ＴｒｐおよびＨｉｓ酸化は、金属触媒またはフリーラジカル媒介による酸化であると考えられる（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．１９８７，Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ ２００１）。理論的には、金属−触媒酸化は有用なモデルになると考えられる。しかしながら、実験の設計においては、金属（例えば、鉄または銅）の選択、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を加えるか否かの決定は、実験結果の成果に対して多大のインパクトを有する。以下の例は金属が関連する酸化から達成された結果の複雑性を示す。アスコルベート／Ｃｕ（ＩＩ）／Ｏ２のような酸化系への金属の添加に関しては、レラキシン中の２つのＭｅｔおよび１つのＨｉｓ残基が酸化され、２つのトリプトファン残基のいずれも酸化されなかった。ウシ血清アルブミンに関しては、フリーラジカルはＦｅ（ＩＩ）／ＥＤＴＡ／アスコルビン酸系、好ましくはトリプトファンから生じ、他方、Ｃｕ（ＩＩ）／アスコルビン酸（ＥＤＴＡは除く）、好ましくはヒスチジンから生じた（Ｕｃｈｉｄａ Ｋ，Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ５３：３２８５−９２，１９８９）。Ｈ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）／ＥＤＴＡおよびＨ２Ｏ２／Ｃｕ（ＩＩ）はアルブミン分解の異なるパターンを生じた（Ｋｏｃｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３３７：３１９−２６（１９９７））。金属触媒された酸化を介し、α−クリスタリン中のトリプトファンおよびメチオニン残基はＨ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）／ＥＤＴＡによって酸化された（Ｆｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：２３９１−７（１９９８））。
【００６６】
医薬の生産の間に、組換え蛋白質は、必然的に、ステンレス鋼に暴露され；かくして、蛋白質溶液は痕跡量の鉄または他の金属を含有するだろう。従って、我々は、我々の薬物候補の酸化能力を評価するためのストレス条件としてＦｅ（ＩＩ）と共にＨ２Ｏ２を選択する−通常知られているＦｅｎｔｏｎ反応―。
【００６７】
先の段落で議論したように、金属の存在は酸化の研究の複雑性を増大させる。ＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩）は金属−イオン独立性の活性酸素種（ＲＯＳ）生成系である（Ｎｉｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１８６：１００−８，１９９０）。規定された速度にて、それは水性好気性溶液中で分解して、アルキルラジカルおよびアルキルペルオキシドを生じる。アルキルペルオキシドの化学的構造および生成は図２に示される。ＡＡＰＨでの処理は、肝臓蛋白質中のＭｅｔ、ＴｙｒおよびＴｒｂ残基の酸化に導いた（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４：２９６９−７４（１９９７））。同一の研究において、酸化から誘導されるもう１つのアミノ酸であるジチロシンも検出された。グルタミンシンターゼをＡＡＰＨに４時間暴露すると、双方のＴｒｐ残基、１６のＨｉｓの内の２、１７のＴｙｒの内の６、および１６のＭｅｔの内５は失われた（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３６３：１２９−１３４（１９９９））。これらの２つの報告は、ＡＡＰＨが、Ｍｅｔに加えて広い範囲のアミノ酸の酸化に導いたことを示した。より最近では、小分子薬物に関しては、共にＡＡＰＨと同様なアゾ化合物である、ＡＩＢＮ（２，２’−アゾビスイソブチロニトリル）およびＡＣＶＡ（４，４’−アゾ−ビス−４−シアノ吉草酸）を、酸化的強制分解実験で用いるために評価した（Ｎｅｌｓｏｎ ＥＤ，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９５：１５２７−３９（２００６））。アゾ化合物は再現可能な量のラジカルを金属から独立して生じさせることができるゆえに、ＡＡＰＨは、特異的にＴｒｐ酸化蛋白質を生じさせるその能力についてのモデルオキシダントである。
【００６８】
部位非特異的酸化では、副甲状腺ホルモン（１−３４）（ＰＴＨ）を、その最小三次構造（Ｂａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，３２：７１２６−３２（１９９３））および全ての３つの望ましいアミノ酸（１ Ｔｒｐ，２ Ｍｅｔおよび３ Ｈｉｓ）を含有するその配列、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐ−ＨＰＬＣ）によってそれをアッセイできる容易性、およびその利用可能性のためモデル蛋白質として選択した。Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＴｒｏｕｔのグループはＨ２Ｏ２によってのみストレスがかけられたＰＴＨにおけるＭｅｔ酸化を研究し、Ｍｅｔ８およびＭｅｔ１８の異なる酸化速度は２−シェル水配位数に相関することが見出された（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ４３：１４１３９−４８（２００４）およびＪ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９３：３０９６−１０２（２００４））の１．５倍未満の差は、我々が我々の研究から導いた結論に影響を与えるのに十分有意ではなかった。成長ホルモン（Ｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：６４７２−７（１９８７））およびｒｈＶＥＧＦ（Ｄｕｅｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １８：１４５５−６０（２００１））における異なるＭｅｔ残基の酸化速度は、第一に、異なる程度の溶媒暴露に帰属された。我々は、ＰＴＨ、成長ホルモンおよびｒｈＶＥＧＦ中の十分に溶媒に暴露されたＭｅｔの酸化速度が匹敵すると予測する。従って、ＰＴＨ上の２つのＭｅｔ残基は全ての蛋白質中の溶媒に暴露されたＭｅｔをシミュレートすることができる。ただ１つのＴｒｐによるＬＣ／ＭＳによる分析の容易性はＰＴＨを我々の研究のための良好なモデル蛋白質とする。
【００６９】
Ｆｅ（ＩＩ）の有りおよび無しでのＨ２Ｏ２、ｔＢＨＰは主として２つのＭｅｔ残基を酸化したが、ＡＡＰＨおよびＨ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）はＭｅｔおよびＴｒｐ残基を酸化し、前者は後者よりもＴｒｐ［Ｏ］種より生じさせることができる。金属独立性フリーラジカルジェネレーターであるＡＡＰＨはアルキルペルオキシドを生じさせ、これは、分解したＴｗｅｅｎから生じた反応性酸化種をシミュレートした。
【００７０】
他方、部位特異的金属触媒酸化は、Ｈ２Ｏ２でのみ生じた反応とはかなり異なるだろう。例えば、レラキシンにおいては、Ｍｅｔ−Ｂ（２５）はＭｅｔ−Ｂ（４）よりも速くＨ２Ｏ２と反応した。金属触媒反応によってレラキシンがＡｓｃ／Ｃｕ（ＩＩ）と反応した場合には、順序は逆となり、金属結合部位に近いＭｅｔ−Ｂ（４）はより速く酸化される傾向がある（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４：５７６２−７２（１９９５））。我々の研究において、我々は、部位特異的金属触媒酸化に感受性の蛋白質として、新生血管（湿潤）年齢関連黄斑変性の治療について示された、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体断片を用いた。なぜならば、我々はＴｒｐ５０（Ｈ２）酸化をＥＤＴＡの添加によって阻害することができ、さらに、隣接Ｈｉｓを突然変異させると、Ｔｒｐ５０（Ｈ２）が安定となることを見出したからである（製剤における原稿）。また、我々は、乾癬の発生に導くＴ細胞の活性化、再活性化およびトラフィッキングを選択的かつ可逆的にブロックするように設計されたＡｎ抗ＣＤ１１ａ抗体の酸化も研究した。なぜならば、それは、異なるＭｅｔ［Ｏ］生成物が観察された種々の条件において酸化されたからである。しかしながら、これらのストレスがかかった条件下で抗ＣＤ１１ａ抗体においてＴｒｐ酸化は見出されず、抗ＶＥＧＦ抗体とは非常に異なった挙動である。この理由で、抗ＣＤ１１ａ抗体を我々の研究において含めた。
【００７１】
Ｂ．酸化的分解の予防のための安定化剤のスクリーニング
この研究における鍵となる目的は安定化剤をスクリーニングすることであった。これらのストレス実験において生じた情報は、我々を、医薬上有効な製剤で用いるための新規な安定化剤に導くだろうと予測される。Ｈ２Ｏ２、Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）およびＡＡＰＨを用いることによって安定化剤をスクリーニングするのは賢明である。というのは、それらは、各々、防腐剤として通常は用いられるＨ２Ｏ２蒸気からの潜在的攻撃、分解したＴｗｅｅｎからのＨ２Ｏ２、およびステンレス鋼表面からの金属、および分解したＴｗｅｅｎからのアルキルペルオキシドを表すからである。我々のスクリーニング実験から、我々は、１）遊離メチオニンはＨ２Ｏ２およびＨ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）に対してＰＴＨ酸化を保護し、２）マンニトールおよびＥＤＴＨはＨ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）に対して有効であり、３）遊離トリプトファンはＡＡＰＨによる酸化に対してのみ効果的であり、他方、ＴｒｐおよびＭｅｔの組合せは全ての３つのオキシダント条件に対して有効であったと決定した。
【００７２】
抗ＶＥＧＦ抗体の酸化は部位−特異的金属−触媒酸化を表す。ＡＡＰＨは、トラブル適格ロットとしてのＩＥＣクロマトグラムにおける塩基性領域において過剰なピークを示した抗−ＶＥＧＦ抗体分解物を生じさせることができよう。遊離Ｔｒｐは、ＡＥＰＨによって酸化されると、抗ＶＥＧＦ抗体における酸化を緩和するにおいて有効であった。これらの結果は、遊離Ｔｒｐが部位−特異的金属−触媒酸化に対して有効であることを示唆する。メチオニン、トリプトファンおよび、恐らくは、ヒスチジンのような全ての不安定なアミノ酸残基が保護されるのを確実とするために、メチオニンおよびトリプトファンの組合せは有効な対策であろう。
【００７３】
メチオニンと組合せて良好な安定化剤であるトリプトファン以外に、我々は、ｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸；水溶性ビタミン誘導体）および（通常はビタミンＢ６として知られた）ピリドキシンが、共に、蛋白質中のトリプトファン残基の優れた保護を示したことも証明した（図１５および１６）。これらの安定化剤の各々は、ＰＴＨの０．１ｍｇ／ｍＬ蛋白質溶液、ｐＨ５．０への添加によって、２ｍｇ／ｍＬ濃度において別々にテストした。引き続いて、１ｍＭのＡＡＰＨの添加によって、蛋白質溶液にストレスをかけ、４０℃において６時間インキュベートした。ｔｒｏｌｏｘまたはピリドキシンの保護がなければ、ＰＴＨはそのトリプトファン残基における有意な量の酸化を呈し、他方、ｔｒｏｌｏｘまたはピリドキシンの存在下では、トリプトファン残基はよく保護された（図１５および１６）。これらの結果は、蛋白質中のトリプトファン残基を保護するためにフリーラジカルスカベンジャーを用いる利用性を肯定した。
【実施例】
【００７４】
実施例１
蛋白質酸化の実験：酸化的分解メカニズムに対する有効な安定化剤としてのメチオニンおよびトリプトファン
本実施例は、抗体および蛋白質の酸化を妨げるための、単独で、およびメチオニンと組合せたトリプトファンの使用を示す。
【００７５】
実験方法
材料：
ＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩）（ロット番号Ｄ０００２４２８７）はＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。副甲状腺ホルモン（１−３４）（ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ，ロット番号Ｕ０７０４６Ａ１）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から購入した。この報告においては、それは単にＰＴＨという。Ｌ−メチオニンおよびＥＤＴＡ二ナトリウム（ロット番号Ｅ０５６４３）はＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から購入した。酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、Ｈ２Ｏ２、ｔ−ＢＨＰ、Ｌ−トリプトファン（ロット番号１１５２３３３）、および塩化第二鉄六水和物（ロット番号５３Ｈ０６１９）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。塩化第一鉄五水和物（ロット番号ＮＡ１７５９）はＥＭＤ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。マンニトール（Ｇ１０３０３，ロット番号１３９４７６）およびスクロース（Ｇ２０２４４，ロット番号２９２４２６）はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．内で得られた。トリプシン、配列決定グレード（ＴＰＣＫ処理）はＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（ＡＣＮ）および水はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒｌａｗｎ，ＮＪ）から購入した。試料調製実験で用いた水はＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｐｌｕｓ精製系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から得られた。
【００７６】
試料の調製
ｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中で１：４２（蛋白質：オキシダント）のモル比率で、ＰＴＨ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、各々、Ｈ２Ｏ２、Ｈ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）、ｔ−ＢＨＰ、ｔ−ＢＨＰ／Ｆｅ（ＩＩ）、またはＡＡＰＨと混合した。Ｆｅ（ＩＩ）の濃度は０．２ｍＭであった。組成物の詳細は表１中に掲げる。括弧中に示すように、テスト試料、マンニトール（１５％）、スクロース（６％）、Ｍｅｔ（２ｍｇ／ｍＬ）、ＥＤＴＡ（０．０４％）、およびＴｒｐ（２ｍｇ／ｍＬ）中の最終濃度を各濃度にて安定化剤としてこれらの試料に加えた。抗ＶＥＧＦ抗体試料では、２および１０ｍｇ／ｍＬのＴｒｐ濃度をテストした。４０℃における６および２４時間のインキュベーションの後に、試料のアリコットをメタノールおよびＭｅｔと混合して、ｒｐ−ＨＰＬＣ分析、ペプチドマッピング、および液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に先立って反応をクエンチした。液体形態の、復元された抗ＣＤ１１ａ抗体凍結乾燥製剤を、３１ｍＭのＡＡＰＨにて９２ｍｇ／ｍＬでテストした。変性された条件において、６ＭグアニジンＨＣｌを用いて５ｍｇ／ｍＬ抗ＣＤ１１ａ抗体を変性し、１．７ｍＭ ＡＡＰＨを加えた。
【００７７】
逆相クロマトグラフィー（ｒｐ−ＨＰＬＣ）
実験は、Ｃ４（Ｖｙｄａｃ，２１４ＴＰ，５μ，２．１×２５０ｍｍ）を用いてＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ機器で行った。溶媒ＡはＨ２Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であって、溶媒Ｂはアセトニトリル中の０．０８％ＴＦＡであった。試料は、４５分以内で、０．２ｍＬ／分の流速にて２０％Ｂないし８０％Ｂの直線状グラジエントで分析した。カラムの温度は３０℃に設定した。ＵＶ検出は２１４ｎｍに設定した。
【００７８】
トリプシン消化
試料のｐＨは、１Ｍ炭酸水素アンモニウムを加えることによって＞７．５に調整した。５ミリリットルの０．５ｍｇ／ｍＬトリプシンを２００μＬの試料に加え、次いで、これを３７℃にて３ないし４時間インキュベートした。消化は０．１％ＴＦＡでクエンチした。
【００７９】
トリプシン分解ペプチドマップのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ特徴付け：
トリプシン消化後のＰＴＨ試料をＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズのＨＰＬＣシステムで分離し、ペプチドの質量および配列はオンライン−カップルドＬＴＱ直線状イオン−トラップ・マス・スペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で決定した。Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｏ １．０×１５０ｍｍカラム（粒子サイズ４μｍ，ポアサイズ９０Å；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を用いた；その温度は３０℃に制御し、カラム流出物を２１４ｎｍでモニターした。流速は１５０μＬ／分に制御し、用いた移動相は水中の０．１％ＴＦＡ（Ａ）およびアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ（Ｂ）であった。１００μＬ容量の試料を注入した。（％Ｂ当たりの分として表した）最適化されたグラジエントは０／２％、３／２％、１０／８％、１５／８％、６０／４０％、６１／９５％、６５／９５％、６６／２％、および７６／２％であった。ＨＰＬＣからの流出物は、直接、ＬＴＱ電子スプレイイオン化源に注入した。正イオンモードの電子スプレイイオン化は、４．５ｋＶの針スプレイ電圧および４４Ｖの毛細管電圧を用いることによって達成された。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ実験において、３００ないし２０００ｍ／ｚの範囲の全スキャンを含めた９つのスキャン事象を行い、続いて、４つの最も強いイオンについて４サイクルのズームスキャンおよびＭＳ／ＭＳスキャンを行った。
【００８０】
ＭＳ／ＭＳスペクトルの解釈およびペプチドの帰属は、ＢｉｏＷｏｒｋｓ Ｂｒｏｗｓｅｒバージョン３．２ソフトウエア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）および各マッチした生成物イオンスペクトルの手動による調査を用い、ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムにて自動データベースサーチで達成した。ＰＴＨのＦＡＳＴＡ単一蛋白質データベースを作成し、サーチング標的として用いた。酸化生成物の同定のために、酸化−関連修飾を可変なものとして定義した（Ｔｒｐについては＋４，＋１６，および＋３２Ｄａ；Ｍｅｔについては＋１６Ｄａ；およびＰＴＨに対する、Ｈｉｓについては＋１６，−２２，および−２３Ｄａ）。満足された相関−因子値（単一に荷電についてはＸｃ≧１．５，二重に荷電については≧２．０，および三重に荷電されたペプチドイオンについては≧２．５）を持つペプチドマッチを、酸化−修飾ペプチドについての潜在的に有意なマッチとして選択した。引き続いて、マッチしたペプチドイオンのズーム−スキャン・マス・スペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの手動による調査を行って、偽陽性同定を排除した。ズーム−スキャンＭＳプロフィールを調べて、マッチしたペプチドの電荷状態およびモノアイソトピック質量を確認した。各酸化部位についての酸化レベルを評価するために、対応するペプチドの抽出されたイオンのクロマトグラムを、Ｘｃａｌｉｂｕｒ Ｑｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて手動により積分した。引き続いて、酸化されたペプチドイオンのピーク面積を酸化されたおよび酸化されていないペプチドのピーク面積の総和で割ることによって、酸化の相対的パーセンテージを計算した。
【００８１】
結果および考察
部位非特異的酸化、ＰＴＨ：
金属結合部位を含有しないＰＴＨは、非−部位−特異的酸化を実験するためのモデル蛋白質である。反応は溶媒に暴露された残基に対して起こる。０．１ｍｇ／ｍＬのＰＴＨを４０℃にて全て１ｍＭのオキシダントと６および２４時間反応させた。ＰＴＨに対するオキシダントのモル比率は４１．２であった。合計５つのオキシダントを用いた、すなわち、Ｆｅ（ＩＩ）の有りまたは無しでのＡＥＰＨ、Ｈ２Ｏ２およびｔＢＨＰであった。反応体を表１にまとめる。試料は、ｒｐ−ＨＰＬＣおよびトリプシン分解ペプチドのマッピング、続いての、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ特徴付けによって分析した。
【００８２】
【表１】
【００８３】
図３は、Ｈ２Ｏ２と反応させたＰＴＨのｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、そこでは、Ｍｅｔ１８−修飾、Ｍｅｔ８−修飾、および二重に修飾されたＰＴＨ種が検出された。この傾向は、Ｍｅｔ８よりも酸化され、続いて、二重に酸化されたＭｅｔ１８でのｒｐ−ＨＰＬＣによって検出されたように３つのＭｅｔ−酸化種を報告したＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ４３：１４１３９−４８（２００４年）によって作成されたデータと合致する。図４はＡＡＰＨと反応したＰＴＨのｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、図３に示されたそれとは非常に異なるパターンを明らかにする。トリプレットピークの２つの組は、ＰＴＨおよびＭｅｔ［Ｏ］ピークの間の保持時間に出現した。個々のピークは十分に特徴付けされなかったが、これらの新しいピークはＴｒｐ［Ｏ］修飾ＰＴＨ種であったことが、トリプシン消化、続いての、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって後に確認された。ＰＴＨ消化物のトリプシン分解ペプチドマッピングにより、Ｍｅｔ酸化生成物に加えて、ＰＴＨがＡＡＰＨで処理された場合には、Ｍ＋４、Ｍ＋３２、Ｍ＋１６（ここに、ＭはＰＴＨのトリプシン分解ペプチドＶＧＷＬＲの質量である）の分子質量を持つ３つのトリプシン分解ペプチド種が生じたことが判明した。ペプチド種のＭＳ／ＭＳスペクトルの分析の結果、３つのＴｒｐ酸化誘導体、すなわち、クヌレニン（Ｍ＋４）、Ｌ−フォルミルクヌレニン（Ｍ＋３２）および５−ヒドロキシトリプトファンまたはＯＸ−インドールアラニン（Ｍ＋１６）としてのそれらの帰属がもたらされた。それらの化学構造は図５に示される。３つのモデルオキシダント（例えば、Ｈ２Ｏ２，Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ），およびＡＡＰＨ）によってＰＴＨをテストするための論理的根拠は先に議論した。ｔＢＨＰおよびｔＢＨＰ＋鉄もテストした。なぜならば、ｔＢＨＰは、現在、分解された試料の調製のためのプロトコルにおいて選択されたオキシダントだからである。
【００８４】
表２は、これらの分解された試料中でのＰＴＨのＭｅｔ８およびＴｒｐ２３の総じての酸化をまとめる。一緒にすると、各々、６時間および２４時間処理した場合、ＰＴＨのＴｒｐ残基の４３％および８４％がＡＡＰＨによって酸化された。よって、図２に示された新しいピークは、Ｔｒｐ［Ｏ］修飾ＰＴＨ種として同定された。実験ではＨｉｓの酸化は観察されなかった。トリプシン分解ペプチドを含有する酸化されたＭｅｔ１８は逆相カラムに保持されなかった。表２は、これらの分解された試料中でのＰＴＨのＭｅｔ８およびＴｒｐ２３の総じての酸化をまとめる。
【００８５】
【表２】
【００８６】
これらの結果からの鍵となる観察は以下の通りである：
ａ．３つの条件、鉄の有りまたは無しでのｔＢＨＰ、およびＨ２Ｏ２は最小量のＴｒｐ酸化を生じた。
ｂ．３つのＨｉｓ残基のいずれも影響されなかった。
ｃ．ＡＡＰＨおよびフェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）反応、Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）のみがＴｒｐ酸化を生じた。
ｄ．種（＋４および＋３２）以外のより多くの＋１６Ｔｒｐ［Ｏ］が生じた。
ｅ．匹敵する程度のレベルＴｒｐ酸化に到達するために、６時間のＡＡＰＨ処理は４３％Ｔｒｐ［Ｏ］、およびＭｅｔ８における２９％Ｍｅｔ［Ｏ］を生じ、他方、２４時間のＨ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）処理は、３５％Ｔｒｐ［Ｏ］を生じたが、Ｍｅｔ８においてかなりより多くの量（９１％）のＭｅｔ［Ｏ］を生じた。この比較は、ＡＡＰＨ処理が、フェントン反応よりもＴｒｐ酸化に向けてより特異的であることを示す。
【００８７】
ペルオキシド（Ｈ２Ｏ２，ｔＢＨＰ，または他のＲＯＯＨ種）によるチオエステル（メチオニン）の酸化のメカニズムは、ペルオキシド−プロトン性溶媒複合体上でのスルフィドの１−工程求核攻撃、続いての、一連の強調された電子置換であり、酸素のイオン原子への移動に導き、その結果、Ｍｅｔスルホキシド、Ｍｅｔ［Ｏ］がもたらされた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．４８：４９０−５００，１９９５）。この反応メカニズムは、ペルオキシドの酸素が電子親和性であることを示唆する。かくして、ｔ−ブチルのような電子−供与基が、酸素の電子親和性を減少させることによって反応を加速する。この理由で、ｔＢＨＰが表２においてより少ない量の酸化を生じたという事実は驚くべきことではない。Ｋｅｃｋ（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３６：５６（１９９６））が、組換えインターフェロンガンマ（ｒＩＦＮ−γ；Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）および組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｒｔＰＡ；アルテプラゼ（ａｌｔｅｐｌａｓｅ），ＡＣＴＩＶＡＳＥ（登録商標））を調べた場合に、最初に報告したように、ｔＢＨＰが暴露されたメチオニンのみを酸化する利点を提供することが指摘されるべきである。ＰＴＨにはほとんど三次構造がないので、我々は、ＰＴＨ中のいずれのＭｅｔもｔ−ＢＨＰによって選択的に酸化されると予測しない。
【００８８】
求核攻撃のメカニズムは特異的な酸触媒成分を予測させるが、反応速度は、ＰＴＨで示されたように、ｐＨ２ないし８の範囲においては有意に変化しない（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４：２９６９−７４（２００４））。この理由で、酢酸緩衝液中でｐＨ５を用いて得られたデータは、蛋白質製剤において見出された典型的なｐＨの範囲であるｐＨ５ないし７に適用できる。
【００８９】
ＡＡＰＨおよびフェントン反応のみがＴｒｐ酸化を生じた。この結果は、Ｈ２Ｏ２単独の求核反応がＴｒｐを酸化させることができないという考えを裏付ける。我々は、我々の実験においてＨｉｓ酸化を全く観察しなかったので驚いた。ウシ血清アルブミンがＦｅ（ＩＩ）／ＥＤＴＨ／アスコルベートまたはＣｕ（ＩＩ）／アスコルベートと反応した場合、前者はＴｒｐに対してより多くの酸化を引き起こし、他方、後者はより多くのＨｉｓ酸化を引き起こした（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．５３：３２８５−９２（１９８９））。もう１つの実験室において、ＡｓｃＡ／Ｃｕ（ＩＩ）によるレラキシン酸化の結果、同時に、有意な量のＨｉｓ酸化、および少量のＡｓｃＡ／Ｆｅ（ＩＩＩ）がもたらされ、ＴｒｐまたはＴｙｒ酸化はいずれも認められなかった（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４：５７６２−７２（１９９５））。双方の実験室からの結果は、Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）を用いた場合の、ＰＴＨにおけるＨｉｓ酸化の全くの不存在に矛盾する。Ｈｉｓ酸化は銅の存在に依存する可能性がある。
【００９０】
安定化剤ＰＴＨのスクリーニング：
前記分析に基づき、我々は、蛋白質が、図１に示されたいずれかまたは全ての３つの分解メカニズムならびに光誘導酸化を介して酸化的攻撃に感受性であろうと提唱する。Ｈ２Ｏ２（金属無し）との求核反応は、蛋白質生成物がアイソレーター中で防腐剤として用いられるＨ２Ｏ２蒸気に、またはＴｗｅｅｎの分解から得られたＨ２Ｏ２に暴露された場合に観察された酸化反応であり得る（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙ Ｍｅｔｈｏｄ ２９：７７−８１（１９９４））。微量金属（鉄、銅、またはクロム）を、ステンレス鋼との接触の結果として製剤の溶液に導入した場合、フェントン反応−Ｆｅ（ＩＩ）と共にＨ２Ｏ２−が働く。第三のメカニズムは、分解されたＴｗｅｅｎから来るであろうアルキルペルオキシドを介するものである（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙ Ｍｅｔｈｏｄ ２９：７７−８１（１９９４））。本研究において、ＡＡＰＨを用いて、アルキルペルオキシドから得られた活性酸素種をシミュレートした（図２）。
【００９１】
メチオニン：遊離Ｍｅｔは、鉄が存在するか否かに拘わらず、予測されたように、オキシダントＨ２Ｏ２の効果を中和した。遊離ＭｅｔはＰＴＨ中のＭｅｔ残基の酸化を有意に低下させた。というのは、Ｍｅｔ［Ｏ］ＰＴＨに対応するピークは出現しなかったからである（図６）。Ｔｒｐ［Ｏ］ピークは依然として存在したので、遊離ＭｅｔはＴｒｐの酸化に対しては効果を有しなかった。
【００９２】
マンニトール、スクロース：マンニトールはよく知られたヒドロキシルフリーラジカルスカベンジャーである。図７は、それにＨ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）でストレスをかけた場合の、いずれかのＭｅｔ［Ｏ］およびＴｒｐ［Ｏ］由来ＰＴＨの不存在によって証明されるように、マンニトールによるフェントン反応の完全な保護を示す。しかしながら、ＡＡＰＨによって、またはＨ２Ｏ２によってストレスをかけた場合、ＰＴＨはマンニトールによって全く保護されなかった。なぜならば、マンニトールはアルキルペルオキシドまたはＨ２Ｏ２と反応しないからである。スクロースは、ＰＴＨをヒドロキシル・フリー・ラジカルに対して保護する場合にマンニトールよりも有効でなかったことを除いて、同様な結果を生じた。ポリオールは、物理的および化学的双方の分解に対して普遍的な安定化剤と考えられた。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ ４８：４９０−５００（１９９５年））によるレビューにおいて認められているように、ヘモグロビンはある種の糖を使用して酸化なくして凍結乾燥することができる。ＡＡＰＨを用いる我々のモデルからの結果は、ポリオールと共に蛋白質はアルキルペルオキシドに直面した場合に保護されないままでいると示唆する。
【００９３】
ＥＤＴＡ：図８に示されるように、ＥＤＴＡは、それにＨ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）によってストレスをかけた場合に、ＰＴＨを完全に保護した。この場合、ＥＤＴＨはフリーラジカルの生成を緩和しないのみならず、Ｈ２Ｏ２の酸化的効果も緩和しなかった。ＥＤＴＨは、それにＨ２Ｏ２単独によってストレスがかけられた場合に、ＰＴＨを保護しなかった。豊富なＭｅｔ［Ｏ］−およびＴｒｐ［Ｏ］ＰＴＨピークがあったことを仮定すれば、ＥＤＴＡはＡＡＰＨ酸化を悪化させるように見えた。ＥＤＴＡまたは（ＥＧＴＡのような）他の金属キレーターの効果の報告は混合されてきた。金属キレーターは金属−触媒反応を増強または阻害し得る。一般化して、ＥＤＴＡは、それが銅を有効に隔離するゆえに、銅―触媒反応を阻害すると言うことができる。それは鉄についての全ての５つの原子価をカバーできないので、ＥＤＴＡ−鉄錯体は時々非常に反応性である。ＥＤＴＡをＰＴＨおよびＡＡＰＨの反応混合物に加えた場合に、何故より多くの酸化が観察されたかは分からないが、そのような調査は本研究の範囲を超えている。
【００９４】
文献に頻繁に記載されているように、イン・ビボでの、Ｍｅｔ、ＴｒｐまたはＨｉｓ残基の酸化は、金属触媒酸化（ＭＣＯ）に帰せられてきた。本実験においては、金属を加えないでＡＡＰＨによって酸化されたＰＴＨは有意な量のＭｅｔおよびＴｒｐを生じ、これは、ＭｅｔまたはＴｒｐ酸化のいずれも金属触媒のみに依存するのではないことを示唆する。
【００９５】
遊離トリプトファン：文献においては、多くの物質がフリーラジカル用のスカベンジャーとして引用されてきた。チオ尿素、メタノールおよび尿酸が例であるが、それらは蛋白質製剤で用いるのに適しない。加えて、ブチル化ヒドロキシル−アニソール（ＢＨＡ）および−トルエン（ＢＨＴ）は、脂質からラジカルをクエンチングするのにかなり有効なラジカル鎖反応ターミネーターである。それらの低い水溶性のため、それらは蛋白質の水性製剤で適しない。適切な量の界面活性剤と共に、ＢＨＡおよびＢＨＴを水性製剤に導入して、いくらかの酸化的保護を供することができる。
【００９６】
非経口製剤中での抗酸化剤としての遊離Ｔｒｐの使用は文献において言及されてこなかった。遊離Ｍｅｔの使用と同様に、それはＰＴＨを酸化に対して保護し得る。図９は、ＰＴＨにＡＡＰＨまたはフェントン反応によってストレスを与えた場合、遊離ＴｒｐがＰＴＨ中のＴｒｐ残基の酸化からの良好な保護を提供することを示す。Ｍｅｔ［Ｏ］ＰＴＨピークはＡＡＰＨストレスの場合に、顕著であり、フェントン反応の場合にはそうでなかった。遊離Ｔｒｐ単独は、Ｈ２Ｏ２による酸化的ストレスに対して保護を供しなかった。
【００９７】
トリプトファンおよびメチオニンの組合せ：この組合せは、全ての３つの酸化的条件下でＰＴＨのほとんど完全な保護を提供した（図１０）。遊離ＴｒｐおよびＭｅｔは、各々、アルキルペルオキシドおよびＨ２Ｏ２の効果を中和するだろうと推定することができる。ＴｒｐおよびＭｅｔが組合せて用いられる場合、蛋白質製剤は、図１に示される全ての３つのメカニズムによる攻撃、ならびに光誘導酸化に耐えることができるはずである。
【００９８】
前記した分析は、各ｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムでのピークの定性的調査から得られた。ＡＡＰＨおよびフェントン反応によって酸化された試料をトリプシン分解ペプチドマッピングおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ特徴付けによる更なる定量的および残基特異的分析に付した。質量シグナルの対応するＥＩＣ（抽出イオンクロマトグラム）を積分することによって得られた相対的定量の結果によると、遊離Ｍｅｔ単独はＭｅｔ酸化を有意に抑制し、遊離Ｔｒｐ単独はＴｒｐ酸化を有意に抑制した（図１１）。ＴｒｐおよびＭｅｔの組合せは、ＡＡＰＨ（図１１）またはフェントン反応（図１２）による酸化に対して最も有効な保護を提供した。
【００９９】
部位特異的金属触媒酸化：
抗ＶＥＧＦ抗体のＴｒｐ５０酸化は、適格なロットが、３０℃にて１ヶ月間貯蔵した時により高い程度の種ピークの喪失を示した場合に最初に認められた。Ｔｒｐ５０に対する自己触媒的酸化は、後に、貧弱に扱われたＴｗｅｅｎ２０によって引き起こされたことが示され、その結果、主ピークの喪失およびＩＥＣ分析における塩基性ピークの増大がもたらされた。更なる実験は、Ｈ２Ｏ２が抗ＶＥＧＦ抗体酸化を引き起こさず、かくして、ＩＥＣクロマトグラフィーパターンに対する変化をもたらさなかったことを示した。安定化剤としてのＥＤＴＡの添加、および近くのＨｉｓの突然変異の結果、Ｔｒｐ酸化に関して抗ＶＥＧＦ抗体の改良された安定性がもたらされた。これらのデータに基づくと、抗ＶＥＧＦ抗体の酸化は部位−特異的金属触媒反応である可能性がある。
【０１００】
抗ＶＥＧＦ抗体溶液へのＡＡＰＨの添加は、ＩＥＣクロマトグラムの塩基性領域において、更なるピークも生じさせ、問題がある適格ロットによって示されるように、これらのピークは、フリーラジカルにより生じた抗ＶＥＧＦ抗体分解体を表した（図１３）。分解した蛋白質のこれらのピークは適格ロットからの分解したピークの匹敵する位置にあるが、プロフィールは同一でない。更なる分析は、これらのピークがＴｒｐ酸化に関連するか否かを確認する必要がある。
【０１０１】
ＩＥＣクロマトグラムにおける塩基性ピークの不存在によって証明されるように、製剤への遊離トリプトファンの添加はＡＡＰＨに対する優れた保護を提供した（図１４）。抗ＶＥＧＦ抗体におけるＭｅｔ残基はＨ２Ｏ２によって酸化させることができないゆえに、遊離Ｍｅｔは抗ＶＥＧＦ抗体には必要でないであろうと予測するのは合理的である。
【０１０２】
Ｔｒｐ酸化が予測されない場合の抗ＣＤ１１ａ抗体：
抗ＣＤ１１ａ抗体中のＭｅｔ残基の酸化は広範に研究されてきた。抗ＣＤ１１ａ抗体は４つの反応性メチオニン−Ｍｅｔ２５６、Ｍｅｔ４３２、Ｍｅｔ３６２およびＭｅｔ５０を有する（重鎖）。表３は、Ｈ２Ｏ２、ｔＢＨＰ、および熱ストレスがＭｅｔ２５６および、程度はより低いが、Ｍｅｔ５０の酸化を引き起こしたことを示す。金属（恐らくは、ステンレス鋼タンクからの溶解した金属）の存在下においては、Ｍｅｔ５０における酸化はＭｅｔ２５６のそれと匹敵するレベルまで増大した。酸化はＬｙｓ−Ｃペプチドマッピングによって測定された。反応性の順序の差は、適用された酸化ストレスのタイプに依存した。
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
ＡＡＰＨを抗ＣＤ１１ａ抗体に加えると、Ｍｅｔ５０のレベルが増大し、ステンレス鋼タンクにおける反応およびＡＡＰＨとの反応が匹敵することを示唆し、共に、Ｍｅｔ５０における増大した酸化をもたらす（表４）。Ｍｅｔ５０は、金属またはフリーラジカルが関係する場合、酸化の部位であると推定することができる。これらの条件下では、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＴｙｒ残基は酸化されなかったのに注意するのは非常に重要である。しかしながら、変性剤を用いた場合には、Ｔｒｐは種々の場所において酸化することができる。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
蛋白質に対するオキシダントの比率が増大した場合、および蛋白質の三次構造がグアニジンの添加によって乱された場合、ＡＡＰＨによるＴｒｐ残基の酸化は豊富であった。更に、これらの条件下で、Ｍｅｔ５０の優先的な酸化は観察されなかった（データは示さず）。これらの結果は、更に、モデル酸化剤としてのＡＡＰＨの使用を裏付ける。適切なオキシダント／蛋白質比率を用いた場合、ＡＡＰＨは信頼性良くＴｒｐ酸化を引き起こす。抗ＣＤ１１ａ抗体であてはまるように、通常の取扱い条件がＴｒｐ酸化を生じさせない場合、ＡＡＰＨはＴｒｐ酸化を引き起こさない。
【０１０７】
結論
本報告において我々は、ＡＡＰＨが蛋白質中のＴｒｐ残基を酸化することができる良好なモデルオキシダントであることを示した。Ｈ２Ｏ２、Ｈ２Ｏ２＋鉄およびＡＡＰＨ（図１）を一緒に用いて、ＭｅｔおよびＴｒｐ残基の酸化に対する保護についての安定化剤をスクリーニングするのが賢明である。この系は、蛋白質製剤の製造および貯蔵の間に起こるかも知れない全ての可能な酸化的経路の改良されたシミュレーションを可能とする。抗−ＶＥＧＦ抗体の分解は、金属触媒酸化として別々に示された。
【０１０８】
また、我々は、遊離Ｔｒｐが、蛋白質含有製剤に加えられると、トリプトファン残基の酸化を有効にブロックしたことを最初に示した。ＡＡＰＨを用いることによってシミュレートされた酸化的ストレスの下では、トリプトファンはＴｈｅ抗ＶＥＧＦ抗体における酸化的反応を有効にブロックした。この結果は、遊離Ｔｒｐが部位−特異的金属−触媒酸化に対して有効であることを示唆する。Ｍｅｔ、Ｔｒｐおよび、可能性として、Ｈｉのような全ての不安定なアミノ酸残基が保護されることを確実とするためには、ＭｅｔおよびＴｒｐの組合せを考慮すべきである。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、蛋白質の酸化的分解を予防するための安定化剤としての芳香族化合物の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、酸化感受性治療剤の安定化された医薬的に効果的な製剤に関する。本発明は、さらに、そのような治療剤の酸化を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質は、精製および貯蔵の間に種々の程度の分解を受ける。酸化は蛋白質の主な分解経路の１つであって、蛋白質の安定性および力価に対して破壊的な作用を有する。酸化的反応はアミノ酸残基の破壊、ペプチド結合の加水分解を引き起こすため、蛋白質の三次構造の変化および蛋白質凝集による蛋白質不安定性を引き起こす（Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９８９５−９０１（１９８７））。蛋白質製剤の酸化は、Ｎｇｕｙｅｎ（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ （１９９４）中の第４章）、Ｈｏｖｏｒｋａ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９０：２５３６９（２００１））およびＬｉ（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４８：４９０−５００（１９９５））によってレビューされている。
【０００３】
蛋白質酸化の原因
酸化は多くのさまざまな相互に連続した経路を介して起こり、高温、酸素濃度、水素イオン濃度（ｐＨ）、および遷移金属、過酸化物および光への暴露を含めた種々の引き金となる条件によって触媒される。典型的には、蛋白質の酸化的分解を引き起こす重要な因子は酸素、活性酸素種および金属への暴露である。ある種の賦形剤は、蛋白質凝集に対する保護を供するために医薬組成物中に処方されるが、このような薬剤は活性酸素種を含有するゆえに、それらもまた酸化を増強し得る。例えば、（通常は、Ｔｗｅｅｎとして知られた）ポリソルベート８０のような通常用いられる界面活性剤には痕跡量の過酸化物が混入しており、これは、さらに、界面活性剤の酸化を引き起こして、低濃度の金属の存在下でより大量の活性酸素種（酸素ラジカル）を生じさせかねない（Ｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１：２２５２−２２６４（２００２）；Ｈａｒｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９５：２０１４−２０２８（２００６））。酸素ラジカルおよび金属の組合せは、それにより、酸化および、かくして、界面活性剤で処方された蛋白質の分解についての触媒的環境を供する。液体または凍結乾燥製剤の蛋白質の酸化もまた、ポリソルベート中の過酸化物、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような他の処方賦形剤、および鉄または銅のような痕跡量の金属が引き金となることが示されている。加えて、薬剤は、通常、便宜な貯蔵および適用のために低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）またはポリプロピレンで作成されたプラスチック容器中にパッケージされる。しかしながら、これらのプラスチック容器は容易に酸素に対して透過性を示す。酸素は活性酸素種を形成し、これは、メチオニンのメチオミンスルホキシドへの酸化のような、医薬品用蛋白質中の酸化感受性残基の迅速な酸化を引き起こす（Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１１（１９８９））。
【０００４】
感受性の順番において、酸化に対して特に弱いのはシステイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）残基の側鎖である。酸化に対するこれらのアミノ酸残基の感受性は、隣接する二重結合への非局在化によって安定化される芳香族環で形成されたアダクト種の結果である。Ｃｙｓ中のチオール基は最も反応性を示す官能基である。なぜならば、チオール基はラジカルによって容易な水素引抜きを供するからであり、その理由で、医薬品用蛋白質には遊離Ｃｙｓを含有するものはほとんどない。
【０００５】
メチオニン酸化はＭｅｔスルホキシド（Ｍｅｔ［Ｏ］）を形成する。
メチオニン酸化はＭｅｔスルホキシド（Ｍｅｔ［Ｏ］）および、苛酷な条件下では、スルホンを形成する。以下の例はＭｅｔ酸化を呈する医薬品用蛋白質を表し、各研究で用いられたオキシダントが確認されている：成長ホルモン（Ｈ２Ｏ２を用いるｈＧＨ，Ｔｅｈ，Ｌ−Ｃ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：６４７２−７（１９８７年），Ａｓｃ／Ｃｕ（ＩＩ）／Ｏ２を用いるＰｅａｒｌｍａｎ Ｒ，第１章，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第５巻（１９９３年），Ｚｈａｏ Ｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：９０１９−９０２９（１９９７年））、ＩＬ−２（１００倍のＨ２Ｏ２を用いるＳａｓａｏｋｉ Ｋ，Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ３７：２１６０−４（１９８９年），ペルオキソジスルフェートを用いるＣａｄｅ ＪＡ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１８：１４６１−７（２００１年），Ｔｗｅｅｎを用いるＨａ Ｅ，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１：２２５２−６４（２００２年））、小ペプチド（Ｌｉ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １２：３４８−５５（１９９５年））、レラキシン（２０００倍のＨ２Ｏ２を用いるＮｇｕｙｅｎ ＴＨ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１０：１５６３−７１（１９９３年）およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第９巻（１９９６年）中の第５章，Ａｓｃ／Ｃｕ（ＩＩ）／Ｏ２を用いるＬｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４：５７６２−７２（１９９５年））、ｒｈＧＣＳＦ（Ｈ２Ｏ２を用いるＬｕ ＨＳ，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３６２：１−１１（１９９９年），Ｈｅｒｍａｎ ＡＣ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第９巻（１９９６年）中の第７章，Ｙｉｎ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２１：２３７７−８３（２００４年）およびＰｈａｒｍ Ｒｅｓ ２２：１４１−７（２００５年））、ｒｈＶＥＧＦ（Ｈ２Ｏ２ ＆ ｔＢＨＰを用いるＤｕｅｎａｓ ＥＴ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１８：１４５５−６０（２００１年））、ＩＧＦ−１（溶存Ｏ２、Ｆｅ（ＩＩＩ）ＥＤＴＡを用いるＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １３：１２５２（１９９６年））、ｒｈＣＮＦおよびｒｈＮＧＦ（Ｈ２Ｏ２を用いるＫｎｅｐｐ Ｖ，ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ．５０：１６３−１７１（１９９６年））、ＢＤＮＦ（Ａｓｃ／Ｃｕ（ＩＩ）／Ｏ２を用いるＪｅｎｓｅｎ ＪＬ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１７：１９０−６（２０００年））、ｒｈＬｅｐｔｉｎ（ｔＢＨＰおよびＨ２Ｏ２を用いるＬｉｕ ＪＬ，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１５：６３２−４０（１９９８年））、アクティミューンおよびアクチバーゼ（ｔＢＨＰを用いるＫｅｃｋ ＲＧ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６，５６−６２（１９９６年））ハーセプチン（ｔＢＨＰを用いるＳｈｅｎ ＦＪ，Ｔｅｃｈｎｉｑ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．ＶＩＩ．２７５−２８４（１９９６年），熱、光およびステンレス鋼を用いるＬａｍ ＸＭ，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ８６：１２５０−５（１９９７年））、およびＰＴＨ（Ｈ２Ｏ２を用いるＹｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２２：１４１−７（２００４年），Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ４３：１４１３９−４８（２００４年）およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９３：３０９６−１０２（２００４年））、およびモノクローナル抗体（ｔＢＨＰ、ＵＶ照射およびオゾンを用いるＷｅｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．７９：２７９７−８０５，２００７年）。過去２０年間において、かなり種々のオキシダントが蛋白質の酸化を研究するのに用いられてきた。ｔＢＨＰおよびＨ２Ｏ２が主に用いられてきた。アスコルベートを除いて、全ては無金属のオキシダントであった。
【０００６】
ヒスチジン酸化はオキソ−ヒスチジンを形成する。
Ｈｉｓの酸化は、主に、オキソ−ヒスチジンを形成するが、酸化の条件に依存して、種々の他の酸化生成物も形成する。Ａｓｃ／Ｃｕ（ＩＩ）／Ｏ２を用いることによって、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８５：８６８−７２，１９９６年）は、レラキシンにおけるＨｉｓ残基の酸化を観察した。ヒト成長ホルモンに関しては、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：９０１９−９０２９，１９９７年）は、同一酸化系を用いて金属−結合部位において金属−触媒酸化を刺激した場合、オキソ−ヒスチジンを観察した。Ｈｉｓの酸化生成物であるアスパラギン酸およびアスパラギンもまた、Ｃｕ（ＩＩ）／Ｈ２Ｏ２の存在下でβ−アミロイドペプチドにおいて検出された（Ｋｏｗａｌｉｋ−Ｊａｎｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｏｒｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ ９８（６）：９４０−９５０，２００４）。
【０００７】
トリプトファンの酸化
トリプトファンの酸化に関しては、多数の生成物が形成される。水性溶液中のトリプトファン（Ｌｅｅ，Ｊ Ｐａｒｅｎｔ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ ４２：２０−２（１９８８年））、および小ペプチドおよびリゾチウム（Ｓｉｍａｔ ＴＪ，Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ４６：４９０−８（１９９８年））中の、およびウシα−クリスタリン（Ｆｉｎｌｅｙ ＥＬ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ７：２３９１−７（１９９８年））中のトリプトファン残基の安定性の研究から、５−ヒドロキシ−トリプトファン、オキシ−インドールアラニン、キヌレニンおよびＮ−フォルミルキヌレニンである主な分解物が明らかに確認された。アミノ酸の酸化の他の形態と比較して、医薬品用蛋白質におけるＴｒｐの酸化については比較的少数の論文しかない。Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６２：９９０２−７；１９８７年）は、コバルト照射から生じた酸素ラジカルによってウシ血清アルブミンを酸化し、Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ５３：３２８５−９２，１９８９年）は、Ｆｅ（ＩＩ）／ＥＤＴＡ／Ａｓｃでアルブミンにストレスをかけ、ＴｒｐおよびＨｉｓの選択的酸化を検出した。最近、モノクローナル抗体中のＴｒｐ酸化が、オゾンおよびＵＶ照射によってストレスがかけられたＡｍｇｅｎ（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｈｒｏｍ．Ａ．１１５６：１７４−８２，２００７年）およびＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．７９：２７９７−８０５，２００７年）によって報告され。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにおいて、Ｔｒｐ酸化は抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ２２およびＡｐｏｍａｂ抗体において検出されている。Ａｐｏｍａｂに関しては、力価の低下はＴｒｐ酸化の程度に相関していた。
【０００８】
酸化のメカニズム
前記分析に基づくと、蛋白質は図１に示されるいずれかのまたは全ての３つの分解メカニズム、ならびに光誘導性の酸化を介する酸化的攻撃に感受性であり得る。Ｈ２Ｏ２との求核反応は、蛋白質生成物が、蛋白質アイソレーターにおける殺菌剤として用いられる、あるいはポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ）またはポリエチレングリコールのような通常用いられる分解からのＨ２Ｏ２蒸気に暴露した場合に観察される酸化反応であり得る。微量金属（鉄、銅、またはクロム）を、例えば、ステンレス鋼との接触から処方溶液にすると、Ｈ２Ｏ２とＦｅ（ＩＩ）とのフェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）反応は操作可能となる。もう１つの分解メカニズムは、前記したような、分解したＴｗｅｅｎに由来し得るアルキルペルオキシドを介する（Ｊａｅｇｅｒ Ｊ，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９：７７−８１，１９９４）。
【０００９】
酸化を受ける蛋白質製剤は、しばしば、蛋白質の修飾および力価の喪失をもたらす。モノクローナル抗体含有溶液のような蛋白質の酸化の結果、抗体の分解、凝集および断片化および、かくして、抗体活性の喪失をもたらし得る。他の場合においては、蛋白質製剤は酸化の後にも依然として生物学的に活性であるが、成長因子は、例えば、高レベルのメチオニンスルホキシドが存在する場合、ＦＤＡのような規制当局の標準に従った医薬使用には許容されないであろう。製剤の製造および包装時に酸素を排除するための現在の注意すべき手法は、医薬品用蛋白質の有意な酸化を予防するには効果的でないことが判明した。結果は、薬剤は、もし酸化反応が阻害できれば潜在的に有するものより有効期間が短いことである。かくして、蛋白質分解が加速しないような物理的および化学的条件を洗い出し、長時間にわたって酸化的条件に耐えることができる安定な蛋白質含有医薬組成物を提供する必要性が当該技術に存在する。従って、種々の引き金となる因子による酸化的損傷から蛋白質を保護する賦形剤を含むペプチドおよび抗体含有医薬組成物を処方することが望ましい。
【００１０】
当該技術における酸化安定化剤
ポリソルベートおよびポロキサマーなどのような界面活性剤と共に、ある種のアミノ酸およびその種々の組合せが、ペプチドおよび蛋白質組成物を安定化するのに用いられてきた。例えば、Ｙｕ−Ｃｈａｎｇ Ｊｏｈｎ Ｗａｎｇ および Ｍｕｓｅｔｔａ Ａ．Ｈａｎｓｅｎ，「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４２：Ｓ１４，１９８８年の文献参照。全ての注射可能な製品のための抗酸化剤の収集情報はＮｅｅｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ ５１：１６６−７１（１９９７年））によって編集されており、そこでは、亜硫酸水素塩、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシルアニソール、システイン等がリストされていた。しかしながら、リストされた剤のいずれも、蛋白質中のメチオニンのみならずトリプトファンおよび他の芳香族アミノ酸残基の酸化的分解メカニズムおよび同時酸化のあらゆる領域を取り扱うのに有効なようには見えない。抗酸化剤として、遊離メチオニンが最初に米国特許第５，２７２，１３５号（Ｔａｋｒｕｒｉ，１９９３）において、また、米国特許出願公開第２００３／０１０４９９６（Ａ１）（Ｌｉ，２００３）において引用された。遊離メチオニンは：デポ−ｓｕｂＱ Ｐｒｏｖｅｒａ、Ｆｏｌｌｉｓｔｉｍ ＡＱ、Ｇｏｎａｌ−ｆ ＲＦＦ、Ｌｕｔｒｏｐｉｎ−αのような多数の市販の非経口製剤において見出すことができる。また、ヒスチジンは、米国特許第５，８４９，７００号（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８年）において抗酸化剤の可能性があるとして開示されている。Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．は、添加剤または緩衝物質としての成長ホルモンおよびヒスチジンまたはヒスチジンの誘導体を含む薬剤が、脱アミド化、（スルホキシド濃度によって測定される）酸化、およびペプチド結合の切断に対して非常に高い安定性を示したことを開示している。蛋白質の酸化を制御することができる他の剤は金属キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）およびフリー・ラジカル・スカベンジャー（例えば、マンニトール）を含み、それらはテキストブックおよび総括論文において広く引用されてきた。例えば、Ｙｕ−Ｃｈａｎｇ Ｊｏｈｎ ＷａｎｇおよびＭｕｓｅｔｔａ Ａ．Ｈａｎｓｅｎ，「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４２：Ｓ１４，１９８８年の文献参照。Ｎ−アセチルトリプトファナートは、殺菌時にヒト血清アルブミンを安定化させるために特異的部位に結合するリガンドとしてのオクタノエートと共に用いられてきた（Ｐｅｔｅｒｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）。しかしながら、このアミノ酸も界面活性剤も、分解した界面活性剤に由来し得るアルキルペルオキシドを介する酸化を防止する目的には用いられていない。従って、酸化的攻撃に対して感受性のアミノ酸配列を有するポリペプチドの薬剤用賦形剤において酸化の多数のメカニズムを阻害する方法に対する要望が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、酸化による損傷に対して蛋白質を保護するための改良された組成物および方法を提供する。この組成物は、典型的には、トリプトファン、チロシンまたはヒスチジン残基を酸化させるフリーラジカルが媒介する酸化を効果的に軽減することができる１以上の化合物と共に処方された酸化に感受性の１以上の蛋白質を含有する。この組成物は酸化からの増大した抵抗性を呈し、例えば、より長い製品有効期間、室温貯蔵を可能とする安定性の増大、および／または製品パッケージングにおける柔軟性を広げる。従って、本発明は、抗体組成物のようなマルチ−ユニット蛋白質組成物さえを保護する（すなわち、安定化させる）ための重要な手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの実施態様において、前記蛋白質内の芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げることができる１以上の化合物と共に（例えば、実験室グレードまたは医薬組成物のような製剤において）処方された蛋白質を含む医薬製剤が提供される。好ましい実施態様は、一緒になって、蛋白質の酸化の最もよくみられるメカニズムの全てに対して全体に効果的に保護するメチオニンと組合せた、遊離芳香族アミノ酸、ヌクレオチドまたはビタミンおよびそれらの誘導体を利用する。
【００１３】
本発明のもう１つの実施態様において、以下に記載される前記蛋白質内の芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げることができる１以上の化合物と組合せた、メチオニンと共に蛋白質を処方することによって安定化された蛋白質組成物を調製する方法が提供される。
【００１４】
本発明のもう１つの実施態様において、蛋白質−ベースの治療剤およびこの剤内で芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げることができる１以上の化合物を含む製剤を、疾患または障害を予防または治療するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において疾患または障害を予防し、または治療する方法が提供される。
【００１５】
本発明のもう１つの実施態様において、蛋白質、およびこの蛋白質内で芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げることができる１以上の化合物を含む製剤を調製し、次いで、この製剤中の蛋白質の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性を評価することを含む、医薬製剤を製造する方法が提供される。
【００１６】
本発明のもう１つの実施態様において、メチオニン、および１以上の化合物を、蛋白質内で芳香族アミノ酸残基の酸化を阻害するのに十分な量で前記組成物に加えることを含む、蛋白質の医薬組成物を安定化させる方法が提供される。
【００１７】
本発明のもう１つの実施態様において、一定量の界面活性剤を蛋白質組成物およびこの界面活性剤の分解から生じる酸化剤種を無効にするのに十分な量の化合物を加えることを含む、医薬製剤を製造する方法が提供される。
【００１８】
本発明のもう１つの実施態様において、芳香族アミノ酸、ヌクレオチド、ビタミンおよびそれらの誘導体よりなる群から選択される１以上の化合物と組合せてメチオニンを加えることを含む、感受性蛋白質内で芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げる方法が提供される。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細の記載および限定的なものと解釈されるべきではない実施例から明らかとなるであろう。本出願を通じて引用された全ての文献、特許および公開された特許出願の内容は参照によって本願明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】メチオニン、トリプトファンおよびヒスチジンの酸化のための考えうる経路を示す図。
【図２】加熱に際してアルキルラジカルを生じ、酸素と組合せると、アルキルペルオキシド（丸印）を形成するアゾ化合物であるＡＩＢＮを示す図である。もう１つのアゾ化合物であるＡＡＰＨもまたその構造と共に示される。
【図３】Ｈ２Ｏ２によって分解されたＰＴＨのｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムの説明図。４０℃において反応させ、試料は２、４および６時間において除去した。ＰＴＨ一酸化物およびＰＴＨ二酸化物の高いピークが示される。
【図４】ＡＡＰＨで処理されたＰＴＨのクロマトグラム、圧倒的に高い、Ｔｒｐ［Ｏ］ＰＴＨピークが示される。４０℃にて反応させ、試料は２、４および６時間目に除去した。
【図５】分解した（酸化された）トリプトファンの化学構造。それらの質量は＋４、＋１６および＋３２として示される。
【図６】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料は遊離メチオニン２ｍｇ／ｍＬの添加が有りまたは無しいずれかであった。
【図７】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料は１５％マンニトールまたは６％スクロールの添加の有りまたは無しいずれかであった。
【図８】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料はＥＤＴＡ ｍｇ／ｍＬの添加の有りまたは無しのいずれかであった。
【図９】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料は２ｍｇ／ｍＬの遊離トリプトファンの添加の有りまたは無しのいずれかであった。
【図１０】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料は共に２ｍｇ／ｍＬの遊離トリプトファンおよびメチオニンの添加の有りまたは無しのいずれかであった。
【図１１】ＡＡＰＨによるＰＴＨの部位特異的酸化、および他の試薬と比較したＴｒｐおよびＭｅｔのさまざまな保護の役割を示すグラフ。個々のＴｒｐ２３、Ｍｅｔ８およびＭｅｔ１８残基の酸化の同定は、それらの対応するトリプシン分解ペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化スペクトルに基づいて割り当てられた。相対的酸化レベルは、酸化されたおよび酸化されていないペプチドの積分された抽出イオンクロマトグラムに基づいて定量した。
【図１２】Ｈ２Ｏ２／ＦｅによるＰＴＨの部位特異的酸化、および他の試薬と比較したＴｒｐおよびＭｅｔのさまざまな保護の役割を示すグラフ。個々のＴｒｐ２３、Ｍｅｔ８およびＭｅｔ１８残基の酸化の同定は、それらの対応するトリプシン分解ペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化のスペクトルに基づいて割り当てられた。相対的レベルは、酸化されたまたは酸化されていないペプチドの積分された抽出イオンクロマトグラムに基づいて定量した。
【図１３】種々の抗ＶＥＧＦ試料のＩＥＣクロマトグラム。Ｈ２Ｏ２は塩基性領域において酸化的種を生じず、ＡＡＰＨは生じた。塩基性ピークは、Ｔｗｅｅｎの不良ロットを用いた場合に、適格ロットにおいて顕著であった。
【図１４】ＡＡＰＨ（Ｔｒｐ無し）によって酸化し、次いで、２または１０ｍｇ／ｍＬ遊離Ｔｒｐを製剤に加えた場合の、抗ＶＥＧＦ抗体のＩＥＣ。酸化されたＭＡｂは塩基性領域において溶出した。これらの塩基性ピークは、Ｔｒｐの添加に際してベースラインまで降下した。
【図１５】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＴＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。４０℃にて６時間反応を行った。試料は、２ｍｇ／ｍＬの遊離Ｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、水溶性ビタミン誘導体）の添加の有りまたは無しのいずれかであった。
【図１６】ＡＡＰＨ、Ｈ２Ｏ２＋鉄、およびＨ２Ｏ２によって酸化されたＰＰＨ溶液のｒｐＨＰＬＣクロマトグラム。反応は４０℃にて６時間行った。試料は、２ｍｇ／ｍＬの（通常はビタミンＢ６として知られた）遊離ピリドキシンの添加の有りまたは無しのいずれかであった。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．定義
蛋白質の化学的不安定性は、蛋白質の一次構造との共有結合の切断または形成を含むことができる。蛋白質におけるいくつかの酸化反応が報告されている。アルカリ性または中性溶媒中では、アミノ酸のシステイン、ヒスチジン、メチオニン、トリプトファンおよびチロシンの残基は特に酸化しやすい。しかしながら、酸性条件においては、メチオニンは感受性である。酸化反応は、生物学的活性や免疫原性にも多大な喪失を引き起こすことが多い。本発明は、第一に、酸化による損傷に対して蛋白質を保護するための改良された組成物および方法に関する。この組成物は、典型的には、トリプトファン、チロシンまたはヒスチジン残基を酸化させるフリーラジカルが介する酸化を効果的に軽減させるための１以上の芳香族化合物と共に処方された酸化に対して感受性の１以上の蛋白質を含有する。
【００２２】
（ヌクレオチドにおけるプリンおよびピリミジンあるいは、具体的には、アミノ酸トリプトファンにおけるインドールの芳香族環において例示される）芳香族性は、芳香族化合物がフリーラジカルと反応する場合に過剰の電子を非局在化できるゆえに、生成物は電子非局在化によって安定化される。その結果、芳香族化合物とフリーラジカルとの反応は助長される。差し引きの結果は、フリーラジカルが芳香族化合物に吸収され、他の分子に対するさらなる損傷を及ぼすことができないことになる。この理由で、芳香族化合物は、製剤の賦形剤として加えた場合に、効果的な物質として作用し、フリーラジカルの酸化的損傷作用を中和する。
【００２３】
生理学的に適合する芳香族化合物の２つの主なクラスはヌクレオチドおよびアミノ酸である。これらの化合物は身体にある天然の成分であるので、それらは安全性プロフィールをもたらし、非経口製品のための賦形剤として用いるのに適切である。遊離メチオニンは抗酸化剤としてルーチン的に用いられており、多数の市販の非経口製品で見出すことができる。しかしながら、このアミノ酸は単独では酸化の全てのメカニズムに対して保護できず、メチオニンまたはシステイン残基の求核酸化を阻害する場合に最も有効である。また、ＤＮＡはフリーラジカルによって損傷を受けやすいこともよく知られており、フリーラジカルと好都合に反応する核酸誘導体の使用を裏付ける事実である。今日、製剤の賦形剤として核酸誘導体を用いることについてほとんど知られておらず、市場の製品は製剤の賦形剤として核酸を利用するものは無い。
【００２４】
本発明の１態様では、本発明の組成物は、典型的には、トリプトファン、ヒスチジン、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択される芳香族アミノ酸を含有する。分解された界面活性剤から生成することが多い、アルキルペルオキシドを介する酸化を緩和するための好ましい芳香族アミノ酸はトリプトファンまたはその誘導体、ナトリウムＮ−アセチルトリプトファナートである。メチオニンまたはメチオニン誘導体を製剤に加えると、メチオニンまたはシステインの求核酸化もまた阻害することができる。かくして、遊離トリプトファンおよびメチオニンの組合せは、酸化の多数のメカニズムを効果的にに阻害する。トリプトファンが製剤に存在する組成物は、典型的には、約２ないし１０ｍｇ／ｍＬの範囲の量を含有する。１つの実施態様において、本発明は、トリプトファン単独にて、あるいは１以上のさらなる芳香族アミノ酸およびメチオニンと組合せて、（例えば、実験室グレードまたは医薬組成物のような製剤において）処方された生物学的に活性な剤を含む医薬製剤に関する。アミノ酸の好ましい組合せはトリプトファンおよびメチオニンであり、これらは一緒になって、蛋白質酸化の最もよくみられるメカニズムの全てに対して有効に保護する。
【００２５】
本発明のもう１つの態様では、本発明の組成物は遊離ヌクレオチドまたはそのアナログを含むこともできる。核酸誘導体を、単独で、あるいはメチオニンと組合せて、蛋白質およびペプチドの非経口製剤に加えることができる。１以上の遊離ヌクレオチドが安定化剤として存在する製剤は、典型的には、約０．１ないし１０ｍｇ／ｍＬの範囲の量を含有する。特別な実施態様において、１以上の遊離ヌクレオチドが１以上の遊離芳香族アミノ酸と組合される。好ましい実施態様は、メチオニンと組合せた遊離ヌクレオチドを含むであろう。
【００２６】
本発明のもう１つの態様では、本発明の組成物はトロロックス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸；水溶性ビタミン誘導体）および（通常はビタミンＢ６として知られた）ピリドキシンのようなビタミン誘導体も含むこともできる。特別な実施態様において、１以上のビタミン誘導体を１以上の遊離芳香族アミノ酸と組合せる。好ましい実施態様はメチオニンと組合せたビタミン誘導体を含むであろう。
【００２７】
本発明の組成物は、さらに、酸素のフリーラジカルを中和する１以上の物質（すなわち、ＲＯＳスカベンジャー）を含有することができる。適切なＲＯＳスカベンジャーは、例えば、マンニトール、メチオニンおよび／またはヒスチジンを含む。従って、もう１つの実施態様において、本発明は、芳香族アミノ酸、およびマンニトール、メチオニンおよび／またはヒスチジンのような１以上のＲＯＳスカベンジャーと一緒に処方された１以上の蛋白質を含有する組成物を提供する。ＥＤＴＡのような金属キレート剤もまた用いることもできる。というのは、それはＲＯＳ生成の開始を阻害できるからである。
【００２８】
本発明の組成物は、蛋白質凝集を阻害する１以上の剤を含むこともできる。特別な実施態様において、この剤はＴＷＥＥＮ、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、グリセロールおよびポロキサマーポリマーから選択される。この組成物は、なおさらに、組成物のｐＨを、好ましくは、約５．０ないし約８．０に維持する緩衝液を含むことができる。適切な緩衝液は、例えば、ヒスチジン、Ｔｒｉｓ、アセテート、ＭＥＳ、コハク酸、ＰＩＰＥＳ、ビス−Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、エチレンジアミン、リン酸、およびマレイン酸を含む。組成物は塩化ナトリウム、アルギニン塩等のような等張剤を含有することもできる。
【００２９】
「界面活性剤」は、データによって十分明らかにされた極性および非極性領域を備えた分子であり、それらが溶液中で凝集してミセルを形成させるようにする。極性エリアの性質に依存して、界面活性剤は非−イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性であり得る。最も非経口的に許容される非イオン性界面活性剤はポリソルベートまたはポリエステル基いずれかから由来する。ポリソルベート２０および８０は、市販の蛋白質製剤における最新の界面活性剤安定化剤である。
【００３０】
ペルオキシドは非イオン性界面活性剤の不純物として知られている。ポリソルベート中のペルオキシドは、蛋白質の酸化的分解をもたらしかねない。配合者は、ペルオキシド混入についての蛋白質製剤中のポリソルベートおよび他のポリマー添加剤の原料を選別し、添加剤を用いるためのペルオキシドの規格を確立する傾向がある。別法として、抗酸化剤の取込みを用いて、非イオン性界面活性剤についての可能性を克服して、酸素−感受性蛋白質のための酸化的触媒として働くのを助ける。
【００３１】
酸化に対して感受性である注目するいずれの適切な蛋白質またはポリペプチドも保護することができ、かくして、本発明に従って安定化することができる（すなわち、本願明細書中に記載されたように酸化保護組成物に処方することができる）。蛋白質はその天然（例えば、天然の）形態の状態とすることができ、あるいは例えば、マイクロカプセル化またはコンジュゲーションによって修飾することができる。蛋白質は治療剤または診断剤とすることができる。そのような蛋白質は、例えば、免疫グロブリン、ペプチド、蛋白質、および酸化的損傷に対するそのアナログを含む。
【００３２】
加えて、当該蛋白質を診断的におよび治療的に非機能的とする、酸化的損傷、蛋白質凝集および分解に対して特に感受性である抗体のようなマルチ−サブユニット蛋白質は、本発明に従って保護することができる。特別な実施態様において、本発明は、十分にヒトの抗体、ならびにその断片および免疫コンジュゲート（すなわち、例えば、トキシン、ポリマー、造影剤または薬物などの治療剤にコンジュゲートした抗体）を含めた１以上のモノクローナル抗体を含むもののような、保護された（すなわち、安定化された）抗体組成物を提供する。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様は、酸化による損傷に対して蛋白質を保護するための組成物および方法に関するが、この生物学的に活性な剤はペプチド、小分子、炭水化物、核酸、脂質、蛋白質、抗体および／またはそのアナログよりなる群から選択することもできる。
【００３４】
ここに、用語「約」が頭に付く数値範囲または量は、明示的に、正確な範囲または正確な数値的量を含む。
【００３５】
用語「医薬製剤」とは、有効成分の生物学的活性を有効なものとするような形態である、かつ製剤が投与される対象に対して許容できないように毒性ではない更なる成分を含有しない製剤をいう。
【００３６】
もし所与の時間において抗体の生物学的活性が、イン・ビトロまたはイン・ビボにて抗原に結合する抗体の能力によって決定されるとき、医薬製剤が調製された時点で示した生物学的活性の約１０％以内（アッセイの誤差内）であり、測定可能な生物学的応答をもたらすならば、抗体は医薬製剤において「生物学的活性」を保有するという。
【００３７】
「安定な」製剤とは、その中の蛋白質が貯蔵に際してその物理的および／または化学的安定性を実質的に保持するものである。安定性は選択された温度において選択された期間測定することができる。好ましくは、製剤は、室温（〜３０℃）にて、または４０℃にて少なくとも１カ月安定であり、および／または約２ないし８℃において少なくとも１年、好ましくは、少なくとも２年の間安定である。例えば、貯蔵の間における凝集の程度は蛋白質安定性の指標として用いることができる。かくして、「安定な」製剤は、蛋白質の約１０％未満、好ましくは、約５％未満が製剤中において凝集物として存在するものであってよい。蛋白質安定性を測定するための種々の分析手技が当該技術で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）においてレビューされている。
【００３８】
用語「水性溶液」とは、水が溶解するための媒体または溶媒である溶液をいう。物質が液体に溶解する場合、混合物は溶液と言われる。溶解した物質は溶質であって、溶解を行う液体（この場合、水）は溶媒である。
【００３９】
酸化を［阻害する］とは、少なくとも１つの酸化阻害剤を含む蛋白質含有溶液に存在する酸化の量を、少なくとも１つの酸化阻害剤を含まない蛋白質含有溶液に存在する酸化の量と比較することによって測定された、酸化を妨げ、酸化の量を低下させ、または減少させることを意図する。
【００４０】
本願明細書中において、「酸化された」蛋白質または抗体は、１以上のそのアミノ酸残基が酸化されているものである。
【００４１】
「酸化に対して感受性である」蛋白質または抗体は、酸化される傾向があることが判明している１以上の残基を含むものである。
【００４２】
蛋白質の酸化を測定するための本発明で用途が見出すことができる方法は、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、毛細管電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー、ペプチドマッピング、オリゴ糖マッピング、質量分析、紫外線吸収分光法、蛍光分光法、円偏光二色性分光法、等温滴定熱量測定、示差走査熱量測定、分析用超遠心、動的光散乱、蛋白質分解、および架橋、濁度測定、フィルター遅延アッセイ、免疫学的アッセイ、蛍光色素結合アッセイ、蛋白質染色アッセイ、顕微鏡測定法、および他の結合アッセイを含む。
【００４３】
「ポリペプチド」または「蛋白質」は、鎖の長さが、さらに高次の第三次および／または第四次構造を生じさせるのに十分な長さのアミノ酸を意味する。かくして、蛋白質は、そのような構造を有しないアミノ酸を主体とする分子でもある「ペプチド」から区別される。
【００４４】
処方される蛋白質は好ましくは実質的には純粋であって、望ましくは実質的には均一である（すなわち、不純物を含まない蛋白質）。「実質的に純粋な蛋白質」は、組成物の全重量に基づいて少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％の蛋白質を含む組成物を意味する「実質的に均一な」蛋白質は、組成物の全重量に基づいて、少なくとも約９９重量％を含む組成物を意味する。
【００４５】
ある実施態様において、蛋白質は抗体である。本願明細書中において、この抗体は注目する「抗原」に対する抗体である。好ましくは、この抗原は生物学的に重要な蛋白質であって、疾患または障害に罹っている哺乳動物への抗体の投与の結果、その哺乳動物において治療的便益がもたらされ得る。しかしながら、（腫瘍関連糖脂質抗原のような（米国特許第５，０９１，１７８号参照））非蛋白抗原に対する抗体もまた対象になる。抗原が蛋白質である場合、それは膜貫通分子（例えば、受容体）または増殖因子のようなリガンドであってよい。例示的な抗原は先に議論した蛋白質を含む。本発明に含まれる抗体のための好ましい分子標的はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４およびＣＤ４０のようなＣＤポリペプチド；ＥＧＦ受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体のようなＨＥＲ受容体ファミリーのメンバー；ＬＦＡ１、ＭＡＣ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭおよびそのαまたはβサブユニットいずれかを含めたａｖ／ｂ３インテグリン（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８または抗ＣＤ１１ｂ抗体）のような細胞接着分子；ＣＲＩｇのようなマクロファージ受容体、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ−２のような腫瘍壊死因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のような増殖因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ４；ポリペプチドＣ等を含む。他の例示的な蛋白質はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）およびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）を含めた成長ホルモン（ＧＨ）；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポ蛋白質；α−１アンチトリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、因子、組織因子、およびフォンビルブラント因子のような凝固因子；プロテインＣのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；ウロキナーゼまたは組織タイプのプラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）のようなプラスミノーゲンアクチベータ；ボンバジン；トロンビン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；（活性に際して調節され、通常Ｔ−細胞発現され、分泌される）ＲＡＮＴＥＳ；ヒトマクロファージ炎症蛋白質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような血清アルブミン；ミュラー管−阻害物質；レラキシンＡ−鎖；レラキシンＢ−鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン−関連ペプチド；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；ホルモンまたは成長因子に対する受容体；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）のような神経栄養因子またはＮＧＦ−βのような神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦのような線維芽細胞成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含めた、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン−様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−１（脳ＩＧＦ−１）；インスリン−様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；トロンボポエチン（ＴＰ）；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、および−γのようなインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１ないしＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ−細胞受容体；表面膜蛋白質；崩壊促進因子（ＤＡＦ）；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部のようなウイルス抗原；輸送蛋白質；ホーミング受容体；アドレシン；調節蛋白質；イムノアドヘシン；抗体；および前記リストのポリペプチドのいずれかの生物学的に活性な断片または変種を含む。多くの他の抗体および／または他の蛋白質を本発明に従って用いてもよく、前記リストは限定するものとはならない。
【００４６】
所望により他の分子にコンジュゲートしていてもよい可溶性抗原またはその断片は、抗体を生じさせるための免疫原として用いることができる。受容体のような膜貫通分子については、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として用いることができる。別法として、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として用いることができる。そのような細胞は天然源（例えば、癌細胞株）に由来することができるか、あるいは膜貫通分子を発現するように組換え技術によって形質転換された細胞であってよい。
【００４７】
処方される抗体の例は、本願明細書中においては、限定されるものではないが：トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９；４２８５−４２８９（１９９２）、米国特許第５，７２５，８５６号）およびペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標））（国際公開第０１／００２４５号パンフレット）を含めたＨＥＲ２抗体；ＣＤ２０抗体（後記参照）；ＩＬ−８抗体（Ｓｔ Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｓｔ，１０３：９３２（１９９３）、および国際公開第９５／２３８６５号パンフレット）；ヒト化ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））およびラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，７：５３−６４（１９９２），国際公開第９６／３００４６号パンフレット、および１９９８年１０月１５日に公開された国際公開第９８／４５３３１号パンフレット）のようなヒト化および／または親和性成熟化ＶＥＧＦ抗体を含めたＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体抗体；ＰＳＣＡ抗体（国際公開第０１／４０３０９号パンフレット）；エファリズマズ（ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標））（米国特許第６，０３７４５４号、米国特許第５，６２２，７００号、国際公開第９８／２３７６１号パンフレット、Ｓｔｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｔｌ．４：３−７（１９９１）、およびＨｏｕｒｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５８：３７７−３８０（１９９４））を含めたＣＤ１１ａ抗体；オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２（１９９３）、および国際公開第９５／１９１８１号パンフレット；１９９８年２月３日に発行された米国特許第５，７１４，３３８号または１９９２年２月２５日に発行された米国特許第５，０９１，３１３号、１９９３年３月４日に公開された国際公開第９３／０４１７３号パンフレット、または１９９８年６月３０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４１０、米国特許第５，７１４，３３８号）を含めた、ＩｇＥに結合する抗体；ＣＤ１８抗体（１９９７年４月２２日に発行された米国特許第５，６２２，７００号、または１９９７年７月３１日に公開された国際公開第９７／２６９１２号パンフレット）；Ａｐｏ−２受容体抗体（１９９８年１１月１９日に公開された国際公開第９８／５１７９３号パンフレット）；組織因子（ＴＦ）抗体（１９９４年１１月９日に特許権が付与された欧州特許第０４２０９３７（Ｂ１）号）；α４−α７インテグリン抗体（１９９８年２月１９日に公開された国際公開第９８／０６２４８号パンフレット）；ＥＧＦＲ抗体（例えば、キメラ化またはヒト化２２５抗体、セツキシマブ、１９９６年１２月１９日に公開された国際公開第９６／４０２１０号パンフレットにおけるようなＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標））；ＯＫＴ３（１９８５年５月７日に発行された米国特許第４，５１５，８９３号）のようなＣＤ３抗体；ＣＨＩ−６２１（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））およびＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（１９９７年１２月２日に発行された米国特許第５，６９３，７６２号参照）のようなＣＤ２５またはＴａｃ抗体；ｃＭ−７４１２抗体（Ｃｈｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３９（１）：５２−５６（１９９６））のようなＣＤ４抗体；ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ＩＬＥＸ／Ｂｅｒｌｅｘ）（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３３７（１９８８））のようなＣＤ５２抗体；Ｆｃに対するＭ２２抗体（Ｇｒａｚｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２（１９９５）におけるようなＲＩ）のようなＦｃ受容体抗体；ｈＭＮ−１４（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ（１９９５））のような癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体；ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ３およびＣＨＬ６（Ｃｅｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３）：５８５２ｓ−５８５６ｓ（１９９５）；およびＲｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐ）：５９１６ｓ−５９２０ｓ（１９９５））を含めた乳房上皮細胞に対する抗体；Ｃ２４２（Ｌｉｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１−９（１９９６））のような結腸癌腫細胞に結合する抗体；ＣＤ３８抗体、例えば、ＡＴ １３／５（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：９２５−９３７（１９９５））；Ｈｕ Ｍ１９５（Ｊｕｒｃｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（２３ Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ−５９１０ｓ（１９９５））およびＣＭＡ−６７６またはＣＤＰ７７１のようなＣＤ３３抗体；１７−１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））のようなＥｐＣＡＭ抗体；アブシキマブまたはｃ７Ｅ３ Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））のようなＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；ＭＤＥＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））のようなＲＳＶ抗体；ＰＲＯＴＯＶＩＲ（登録商標））のようなＣＭＶ抗体；ＰＲＯ５４２のようなＨＩＶ抗体；Ｈｅｐ Ｂ抗体、ＯＳＴＡＶＩＲ（登録商標）のような肝炎抗体；抗ＭＵＣ１６（国際公開第２００７／００１８５１号パンフレット；Ｙｉｎ，ＢＷＴ ａｎｄ Ｌｌｏｙｄ，ＫＯ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６−２７３７１−２７３７５（２００１））およびＯｖａＲｒｅｘを含めたＣＡ１２５抗体；イディオタイプのＧＤ３エピト−プ抗体ＢＥＣ２；αｖβ３抗体（例えば、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）；ｃｈ−Ｇ２５０のようなヒト腎臓細胞癌腫抗体；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１ Ａｎ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト結直腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平細胞癌腫（ＳＦ２５）；Ｓｍａｒｔ ＩＤ１０および抗−ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）のようなヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体；ＴＲＵ０１６（Ｔｒｕｂｉｏｎ）のようなＣＤ３７抗体；ＩＬ−２１抗体（Ｚｙｍｏｚｅｎｅｔｉｃｓ／Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）；抗Ｂ細胞抗体（Ｉｍｐｈｅｒｏｎ）；Ｂ細胞標的化ＭＡｂ（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ）；１Ｄ０９Ｃ３（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ／ＧＰＣ）；ＬｙｍｐｈｏＲａｄ１３１（ＨＧＳ）；Ｌｙｍ−１Ｙ−９０（ＵＳＣ）または抗Ｌｙｍ−１ Ｏｎｃｏｌｙｍ（ＵＳＣ／Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）のようなＬｙｍ−１抗体；ＬＩＦ ２２６（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｌｉｆｅｓｃｉ．）；ＢＡＦＦ抗体（例えば、国際公開第０３／３３６５８号パンフレット）；ＢＡＦＦ受容体抗体（例えば、国際公開第０２／２４９０９号パンフレット参照）；ＢＲ３抗体；べリムマブのようなＢｌｙｓ抗体；ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−Ｂ（商標）；ＩＳＦ １５４（ＵＣＳＤ／Ｒｏｃｈｅ／Ｔｒａｇｅｎ）；ゴミリキシマ（Ｉｄｅｃ １５２；Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）；アトリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（商標）；Ｃｈｕｇａｉ／Ｒｏｃｈｅ）のようなＩＬ−６受容体抗体；ＨｕＭａｘ−Ｉｌ−１５（Ｇｅｎｍａｂ／Ａｍｇｅｎ）のようなＩＬ−１５抗体；ＣＣＲ２抗体（例えば、ＭＬＮ１２０２；Ｍｉｌｌｉｅｎｅｕｍ）のようなケモカイン受容体抗体；Ｃ５抗体（例えば、エクリズマブ，５Ｇ１．１；Ａｌｅｘｉｏｌ）のような抗補体抗体；ヒト免疫ブロブリンの経口製剤（例えば、ＩｇＰＯ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；ＡＢＴ−８７４（ＣＡＴ／Ａｂｂｏｔｔ）のようなＩＬ−１２抗体；テネリキシマブ（ＢＭＳ−２２４８１８；ＢＭＳ）；Ｓ２Ｃ６およびそのヒト化変種国際公開第００／７５３４８号パンフレット）およびＴＮＸ１００（Ｃｈｉｒｏｎ／Ｔａｎｏｘ）を含めたＣＤ４０抗体；ｃＡ２またはインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ＣＤＰ５７１、ＭＡＫ−１９５、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（商標））、ＣＤＰ−８７０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）のようなＰＥＧ化ＴＮＦ−α抗体断片、Ｄ２Ｅ７（Ｋｎｏｌｌ）、抗−ＴＮＦ−αポリクローナル抗体（例えば、ＰａｓｓＴＮＦ；Ｖｅｒｉｇｅｎ）を含めたＴＮＦ−α抗体；ＬＬ２、またはエプラツズマブＹ−９０およびエプラツマブＩ−１３１を含めたエプラツズマブ（ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（登録商標）；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＡｂｉｏｇｅｎのＣＤ２２抗体（Ａｂｉｏｇｅｎ，Ｉｔａｌｙ）、ＣＭＣ５４４（Ｗｙｅｔｈ／Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、コムボトックス（ＵＴ Ｓｏｕｔｗｅｓｔｅｒｎ）、ＢＬ２２（ＮＩＨ），およびＬｙｍｐｏＳｃａｎ Ｔｃ９９（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ならびに抗−アミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）、抗−ＣＤ４（ＭＴＲＸ１０１１Ａ）、抗−ＥＧＦＬ７（ＥＧＦ−様−ドメイン７）、抗−ＩＬ１３、Ａｐｏｍａｂ（抗ＤＲ５−標的化プロ−アポトーシス受容体抗体アゴニスト（ＰＡＲＡ））、抗−ＢＲ３（ＣＤ２６８，ＢＬｙＳ受容体３，ＢＡＦＦ−Ｒ，ＢＡＦＦ受容体）、抗−ベータ７インテグリンサブユニット、ダセツズマブ（抗−ＣＤ４０）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）、ＭｅｔＭＡｂ（抗ＭＥＴ受容体チロシンキナーゼ）、抗−ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）、オクレリズマブ（抗ＣＤ２０抗体）、抗−ＯＸ４０リガンド、抗−酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）、ペルツズマブ（ＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）、およびｒｈｕＭＡｂ ＩＦＮアルファのようなＣＤ２２抗体を含む。
【００４８】
抗ＣＤ２０抗体の例は：今では「リツキシマブ」（「ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）」）（米国特許第５，７３６，１３７号）と呼ばれる「Ｃ２Ｂ８」；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能な「Ｙ２Ｂ８」または「Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ Ｔｉｕｘｅｔａｎ」（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））と命名されたイッテリウム−［９０］−標識２Ｂ８マウス抗体（米国特許第５，７３６，１３７号；１９９３年６月２２日に受託番号ＨＢ１１３８８下でＡＴＣＣに寄託された２Ｂ８）；Ｃｏｒｉｘａから商業的に入手可能な、「１３１Ｉ−Ｂ１」または「ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ」抗体（ＢＥＸＸＡＲ（商標））を生じさせるために所望により１３１Ｉで標識されていてもよい、「トシツモマブ」とも呼ばれるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」（また、米国特許第５，５９５，７２１号も参照）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」（Ｐｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ６９（２）：５８４−５９１（１９８７））および「フレームワークパッチ化」またはヒト化１Ｆ５（国際公開第２００３／００２６０７号パンフレット，Ｌｅｕｎｇ，Ｓ．；ＡＴＣＣ寄託ＨＢ−９６４５０）を含めたその変種；マウス２Ｈ７およびキメラ２Ｈ７抗体（米国特許第５，６７７，１８０号）；ヒト化２Ｈ７（国際公開第２００４／０５６３１２号パンフレット，Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，）；２Ｆ２（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０）、Ｂ細胞膜中のＣＤ２０分子に標的化された十分にヒトの高親和性抗体（Ｇｅｎｍａｂ，Ｄｅｎｍａｒｋ；例えば、Ｇｌｅｎｎｉｅ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ８：５０３−５１０（２００３）およびＣｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５−１０５２（２００３）；国際公開第２００４／０３５６０７号パンフレット；米国特許出願公開第２００４／０１６７３１９号参照）；国際公開第２００４／０３５６０７号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００４／０１６７３１９（Ｔｅｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）に記載されたヒトモノクローナル抗体；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｓｈｉｔａｒａ ｅｔ ａｌ．）に記載された、Ｆｃ領域に結合した複雑なＮ−グリコシド−結合糖鎖を有する抗体；ＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−２５、およびＭＢ２０−１１のような、ＣＤ２０に結合するモノクローナル抗体および抗原結合断片（国際公開第２００５／０００９０１号パンフレット，Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）；抗体のＡＭＥシリーズのようなＣＤ２０結合分子、例えば、国際公開第２００４／１０３４０４号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００５／００２５７６４号（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ＡＭＥ）に記載されたＡＭＥ３３抗体；米国特許出願公開第２００５／００２５７６４号（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）に記載されたもののようなＣＤ２０結合分子；キメラまたはヒト化Ａ２０抗体（各々、ｃＡ２０，ｈＡ２０）またはＩＭＭＵ−１０６（米国特許出願公開第２００３／０２１９４３３号，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）のようなＡ２０抗体またはその変種；ＵＳ ２００５／００６９５４５Ａ１および国際公開第２００５／１６９６９号パンフレット（Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．）におけるような、所望によりＩＬ−２とコンジュゲートしていてもよいエピトープ−欠損Ｌｅｕ−１６、１Ｈ４、または２Ｂ８を含めたＣＤ２０−結合抗体；ＣＤ２２およびＣＤ２０に結合する二重特異性抗体、例えば、ｈＬＬ２ｘｈＡ２０（国際公開第２００５／１４６１８号パンフレット，Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．）；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｗｏｒｋｓｈｏｐから入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８−２、９３−１Ｂ３、Ｂ−ＣｌまたはＮＵ−Ｂ２（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ｅｄ．，ｐ．４４０，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８７））；１Ｈ４（Ｈａｉｓｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９２：１８４（１９９８））；抗ＣＤ２０アウリスタチンＥコンジュゲート（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；抗−ＣＤ２０−ＩＬ２（ＥＭＤ／Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ／Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ）；抗ＣＤ２０ ＭＡｂ療法（ＥｐｉＣｙｔｅ）；抗ＣＤ２０抗体ＴＲＵ ０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ）を含む。
【００４９】
本願明細書中で用いる用語「抗体」は、（免疫グロブリンＦｃ領域を有する抗体全体を含めた）モノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を持つ抗体組成物、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体，ダイヤボディー，および単一鎖分子）、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，およびＦｖ）を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本願明細書中においては、抗体と同じ意味で用いられる。
【００５０】
本願明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわちこの集団を含む個々の抗体は、微量で存在するかも知れない可能な天然に生じる突然変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性体化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一の抗原部位に対するものである。更に、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、他の免疫グロブリンが混合していないハイブリドーマ培養によって合成される点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５年）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成されてもよく、あるいは組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作成されてもよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１年）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１年）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００５１】
モノクローナル抗体は、ここでは、具体的には、望まれる生物学的活性を呈する限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスまたはサブクラスの属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同であり、他方、この鎖の残りがもう１つの種に由来する、あるいはもう１つの抗体のクラスまたはサブクラスに属する対応する配列と同一であるか、または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。注目するキメラ抗体は、ここでは、ヒト以外の霊長類（例えば、旧世界サル、無尾猿など）に由来する可変ドメイン抗原−結合配列、およびヒト内容領域配列を含む「プリミタイズド（ｐｒｉｍｉｔｉｚｅｄ）」抗体を含む。
【００５２】
用語「治療抗体」とは、疾患の治療に用いる抗体をいう。治療用抗体は、種々の作用メカニズムを有することができる。治療用抗体は、抗原と会合した標的に結合し、この標的の正常な機能を中和することができる。例えば、癌細胞の生存に必要な蛋白質の活性をブロックするモノクローナル抗体は細胞死を引き起こす。もう１つの治療モノクローナル抗体は、抗原と会合した標的に結合し、この標的の正常な機能を活性化することができる。例えば、モノクローナル抗体は細胞上の蛋白質に結合し、アポトーシスシグナルを引き金とすることができる。なお、もう１つのモノクローナル抗体は、疾患のある組織上にのみ発現された標的抗原に結合することができ；化学治療剤または放射性剤のような毒性ペイロード（有効な剤）のモノクローナル抗体へのコンジュゲーションは、疾患のある組織への毒性ペイロードの特異的送達のための剤を作り出すことができ、健康な組織に対する有害性を低下させる。治療抗体の「生物学的に機能的な断片」は、無傷の抗体に帰属される生物学的機能のいくらかまたは全てではないにせよ少なくとも１つを呈し、この機能は標的抗原への少なくとも特異的結合を含む。
【００５３】
「無傷の」抗体は、抗原結合部位、ならびにＣＬおよび少なくとも重鎖ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変種であってよい。好ましくは、無傷の抗体は１以上のエフェクター機能を有する。
【００５４】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。抗体断片の例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片；ダイヤボディー；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］参照）；単一鎖抗体分子および抗体断片から形成された多特異的抗体を含む。
【００５５】
抗体の「生物学的に機能的な断片」は、無傷抗体の一部のみを含み、ここに、この一部は、無傷抗体において存在する場合、その一部と通常は関連する機能の少なくとも１つ、およびほとんどまたは全てのように多くを保有する。１つの実施態様において、抗体の生物学的に機能的な断片は無傷抗体の抗原結合部位を含み、かくして、抗原に結合する能力を保有する。もう１つの実施態様において、抗体の生物学的に機能的な断片、例えば、Ｆｃ領域を含むものは、ＦｃＲｎ結合、抗体の半減期の調節、ＡＤＣＣ機能および補体結合のような、無傷抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常は関連する生物学的機能の少なくとも１つを保有する。１つの実施態様において、抗体の生物学的に機能的な断片は、無傷抗体に実質的に同様なイン・ビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、抗体のそのような生物学的に機能的な断片は、この断片にイン・ビボ安定性を与えることができるＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含むことができる。
【００５６】
ヒト以外の（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、ほとんどヒトの配列のキメラ免疫グロブリン免疫グロブリン鎖または（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原−結合サブ配列のような）その断片である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容体の超可変領域（また、ＣＤＲ）からの残基が、望まれる特異性、親和性、および力価を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非−ヒト残基によって置き換えられている。更に、本願明細書中で用いる「ヒト化抗体」は、受容体抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良し、最適化するためになされる。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれをやはり含むであろう。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）参照。
【００５７】
「単離された」とは、本願明細書中で開示された種々のポリペプチドおよび抗体を記載するのに用いる場合、その産生環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されたポリペプチドまたは抗体を意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドはその生成環境からの全ての他の成分と会合していない。組換えトランスフェクト細胞に由来するもののようなその生成環境の混入成分は、典型的には、ポリペプチドのための診断的または治療的使用に干渉するであろう材料であり、酵素、ホルモン、および他の蛋白質性または非−蛋白質性溶質を含んでもよい。好ましい実施態様において、ポリペプチドは（１）スピニングカップシーケネーターの使用によって、Ｎ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（２）クーマシーブルーまたは、好ましくは、銀染色を用いて非−還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドまたは抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されうる。
【００５８】
「治療」とは、治療的処置および予防的または予防手段の双方を含む。治療を必要とする者は、既に障害を持つ者ならびに障害を予防すべき者を含む。
【００５９】
治療の目的の「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および農場動物、およびイヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、白イタチ、ラット、ネコなどのような動物園、スポーツ用または愛玩動物を含めた、哺乳動物として分類されるいずれの動物もいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００６０】
「障害」は、当該蛋白質での処置から利益を受けるいずれの疾患である。これは、哺乳動物が問題とする障害に対して素因がある病理学的疾患を含めた、慢性および急性障害を含む。ここでは、治療すべき障害の非限定的例は癌腫および炎症を含む。
【００６１】
「治療有効量」とは、特定の障害の測定可能な改善または予防を行うのに必要な少なくとも最小の濃度である。既知の蛋白質の治療有効量は当該分野においてよく知られており、他方、今後発見される蛋白質のこの有効量は、十分に、通常の医師のような当業者の技量内にある標準的技術によって決定することができる。
【００６２】
ＩＩ．発明を実施するための形態
モノクローナル抗体候補についての最近の酸化事象が、我々が、Ｍｅｔ、ＴｒｐおよびＨｉｓ残基に対する酸化のメカニズムを調べ、および適切な安定化剤をサーチするよう駆り立てた。ｒｐ−ＨＰＬＣ、ペプチドマッピングおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって助けられた、モデル蛋白質である副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ，１−３４）を用いることによって、我々は、さまざまなオキシダントによって引き起こされたこれらの不安定な残基に対する酸化を確認し、定量することができた。
【００６３】
Ａ．酸化的損傷の特徴付け
酸化メチオニン（Ｍｅｔ［Ｏ］）は、多数の医薬品用蛋白質において容易に検出されるという事実が、Ｈ２Ｏ２単独に対するだけではなく酸化剤に対するその感受性に帰すことができる。光、ｔＢＨＰ、および／またはペルオキソジスルフェートは、Ｍｅｔ［Ｏ］を生じさせるのに種々の研究室によって用いられてきた。通常の貯蔵条件下での医薬品用蛋白質中のＴｒｐまたはＨｉｓの酸化は非常に遅い可能性がある。酸化を促進するためには、１以上のストレスモデルが共通して用いられている。
【００６４】
多くの蛋白質製剤はポリソルベート（２０および８０）を含有する。古くなったポリソルベート中に存在するオキシダントは圧倒的にＨ２Ｏ２よりなる（７５％まで）ことが報告されている（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９：７７−８１（１９９４年））。Ｈａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１：２２５２−２２６４（２００２年））は、古くなったポリソルベートによりインターロイキン−２突然変異体の酸化が高まっていることを報告した。ポリソルベートは蛋白質薬物製品におけるオキシダントの原因であるので、界面活性剤含有製剤における酸化的反応を刺激する方法としてＨ２Ｏ２を用いることが考えられる。加えて、滅菌製品の充填において用いられるアイソレーター用の防腐剤としてＨ２Ｏ２は用いられてきた。残存Ｈ２Ｏ２は薬物製品中に認められる可能性がある。この理由で、Ｈ２Ｏ２による酸化に対する蛋白質の感度を決定するのが重要である。
【００６５】
ＴｒｐおよびＨｉｓ酸化は、金属触媒またはフリーラジカル媒介による酸化であると考えられる（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．１９８７，Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ ２００１）。理論的には、金属−触媒酸化は有用なモデルになると考えられる。しかしながら、実験の設計においては、金属（例えば、鉄または銅）の選択、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を加えるか否かの決定は、実験結果の成果に対して多大のインパクトを有する。以下の例は金属が関連する酸化から達成された結果の複雑性を示す。アスコルベート／Ｃｕ（ＩＩ）／Ｏ２のような酸化系への金属の添加に関しては、レラキシン中の２つのＭｅｔおよび１つのＨｉｓ残基が酸化され、２つのトリプトファン残基のいずれも酸化されなかった。ウシ血清アルブミンに関しては、フリーラジカルはＦｅ（ＩＩ）／ＥＤＴＡ／アスコルビン酸系、好ましくはトリプトファンから生じ、他方、Ｃｕ（ＩＩ）／アスコルビン酸（ＥＤＴＡは除く）、好ましくはヒスチジンから生じた（Ｕｃｈｉｄａ Ｋ，Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ５３：３２８５−９２，１９８９）。Ｈ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）／ＥＤＴＡおよびＨ２Ｏ２／Ｃｕ（ＩＩ）はアルブミン分解の異なるパターンを生じた（Ｋｏｃｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３３７：３１９−２６（１９９７））。金属触媒された酸化を介し、α−クリスタリン中のトリプトファンおよびメチオニン残基はＨ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）／ＥＤＴＡによって酸化された（Ｆｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：２３９１−７（１９９８））。
【００６６】
医薬の生産の間に、組換え蛋白質は、必然的に、ステンレス鋼に暴露され；かくして、蛋白質溶液は痕跡量の鉄または他の金属を含有するだろう。従って、我々は、我々の薬物候補の酸化能力を評価するためのストレス条件としてＦｅ（ＩＩ）と共にＨ２Ｏ２を選択する−通常知られているＦｅｎｔｏｎ反応―。
【００６７】
先の段落で議論したように、金属の存在は酸化の研究の複雑性を増大させる。ＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩）は金属−イオン独立性の活性酸素種（ＲＯＳ）生成系である（Ｎｉｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１８６：１００−８，１９９０）。規定された速度にて、それは水性好気性溶液中で分解して、アルキルラジカルおよびアルキルペルオキシドを生じる。アルキルペルオキシドの化学的構造および生成は図２に示される。ＡＡＰＨでの処理は、肝臓蛋白質中のＭｅｔ、ＴｙｒおよびＴｒｂ残基の酸化に導いた（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４：２９６９−７４（１９９７））。同一の研究において、酸化から誘導されるもう１つのアミノ酸であるジチロシンも検出された。グルタミンシンターゼをＡＡＰＨに４時間暴露すると、双方のＴｒｐ残基、１６のＨｉｓの内の２、１７のＴｙｒの内の６、および１６のＭｅｔの内５は失われた（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３６３：１２９−１３４（１９９９））。これらの２つの報告は、ＡＡＰＨが、Ｍｅｔに加えて広い範囲のアミノ酸の酸化に導いたことを示した。より最近では、小分子薬物に関しては、共にＡＡＰＨと同様なアゾ化合物である、ＡＩＢＮ（２，２’−アゾビスイソブチロニトリル）およびＡＣＶＡ（４，４’−アゾ−ビス−４−シアノ吉草酸）を、酸化的強制分解実験で用いるために評価した（Ｎｅｌｓｏｎ ＥＤ，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９５：１５２７−３９（２００６））。アゾ化合物は再現可能な量のラジカルを金属から独立して生じさせることができるゆえに、ＡＡＰＨは、特異的にＴｒｐ酸化蛋白質を生じさせるその能力についてのモデルオキシダントである。
【００６８】
部位非特異的酸化では、副甲状腺ホルモン（１−３４）（ＰＴＨ）を、その最小三次構造（Ｂａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，３２：７１２６−３２（１９９３））および全ての３つの望ましいアミノ酸（１ Ｔｒｐ，２ Ｍｅｔおよび３ Ｈｉｓ）を含有するその配列、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐ−ＨＰＬＣ）によってそれをアッセイできる容易性、およびその利用可能性のためモデル蛋白質として選択した。Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＴｒｏｕｔのグループはＨ２Ｏ２によってのみストレスがかけられたＰＴＨにおけるＭｅｔ酸化を研究し、Ｍｅｔ８およびＭｅｔ１８の異なる酸化速度は２−シェル水配位数に相関することが見出された（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ４３：１４１３９−４８（２００４）およびＪ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９３：３０９６−１０２（２００４））の１．５倍未満の差は、我々が我々の研究から導いた結論に影響を与えるのに十分有意ではなかった。成長ホルモン（Ｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：６４７２−７（１９８７））およびｒｈＶＥＧＦ（Ｄｕｅｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １８：１４５５−６０（２００１））における異なるＭｅｔ残基の酸化速度は、第一に、異なる程度の溶媒暴露に帰属された。我々は、ＰＴＨ、成長ホルモンおよびｒｈＶＥＧＦ中の十分に溶媒に暴露されたＭｅｔの酸化速度が匹敵すると予測する。従って、ＰＴＨ上の２つのＭｅｔ残基は全ての蛋白質中の溶媒に暴露されたＭｅｔをシミュレートすることができる。ただ１つのＴｒｐによるＬＣ／ＭＳによる分析の容易性はＰＴＨを我々の研究のための良好なモデル蛋白質とする。
【００６９】
Ｆｅ（ＩＩ）の有りおよび無しでのＨ２Ｏ２、ｔＢＨＰは主として２つのＭｅｔ残基を酸化したが、ＡＡＰＨおよびＨ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）はＭｅｔおよびＴｒｐ残基を酸化し、前者は後者よりもＴｒｐ［Ｏ］種より生じさせることができる。金属独立性フリーラジカルジェネレーターであるＡＡＰＨはアルキルペルオキシドを生じさせ、これは、分解したＴｗｅｅｎから生じた反応性酸化種をシミュレートした。
【００７０】
他方、部位特異的金属触媒酸化は、Ｈ２Ｏ２でのみ生じた反応とはかなり異なるだろう。例えば、レラキシンにおいては、Ｍｅｔ−Ｂ（２５）はＭｅｔ−Ｂ（４）よりも速くＨ２Ｏ２と反応した。金属触媒反応によってレラキシンがＡｓｃ／Ｃｕ（ＩＩ）と反応した場合には、順序は逆となり、金属結合部位に近いＭｅｔ−Ｂ（４）はより速く酸化される傾向がある（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４：５７６２−７２（１９９５））。我々の研究において、我々は、部位特異的金属触媒酸化に感受性の蛋白質として、新生血管（湿潤）年齢関連黄斑変性の治療について示された、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体断片を用いた。なぜならば、我々はＴｒｐ５０（Ｈ２）酸化をＥＤＴＡの添加によって阻害することができ、さらに、隣接Ｈｉｓを突然変異させると、Ｔｒｐ５０（Ｈ２）が安定となることを見出したからである（製剤における原稿）。また、我々は、乾癬の発生に導くＴ細胞の活性化、再活性化およびトラフィッキングを選択的かつ可逆的にブロックするように設計されたＡｎ抗ＣＤ１１ａ抗体の酸化も研究した。なぜならば、それは、異なるＭｅｔ［Ｏ］生成物が観察された種々の条件において酸化されたからである。しかしながら、これらのストレスがかかった条件下で抗ＣＤ１１ａ抗体においてＴｒｐ酸化は見出されず、抗ＶＥＧＦ抗体とは非常に異なった挙動である。この理由で、抗ＣＤ１１ａ抗体を我々の研究において含めた。
【００７１】
Ｂ．酸化的分解の予防のための安定化剤のスクリーニング
この研究における鍵となる目的は安定化剤をスクリーニングすることであった。これらのストレス実験において生じた情報は、我々を、医薬上有効な製剤で用いるための新規な安定化剤に導くだろうと予測される。Ｈ２Ｏ２、Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）およびＡＡＰＨを用いることによって安定化剤をスクリーニングするのは賢明である。というのは、それらは、各々、防腐剤として通常は用いられるＨ２Ｏ２蒸気からの潜在的攻撃、分解したＴｗｅｅｎからのＨ２Ｏ２、およびステンレス鋼表面からの金属、および分解したＴｗｅｅｎからのアルキルペルオキシドを表すからである。我々のスクリーニング実験から、我々は、１）遊離メチオニンはＨ２Ｏ２およびＨ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）に対してＰＴＨ酸化を保護し、２）マンニトールおよびＥＤＴＨはＨ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）に対して有効であり、３）遊離トリプトファンはＡＡＰＨによる酸化に対してのみ効果的であり、他方、ＴｒｐおよびＭｅｔの組合せは全ての３つのオキシダント条件に対して有効であったと決定した。
【００７２】
抗ＶＥＧＦ抗体の酸化は部位−特異的金属−触媒酸化を表す。ＡＡＰＨは、トラブル適格ロットとしてのＩＥＣクロマトグラムにおける塩基性領域において過剰なピークを示した抗−ＶＥＧＦ抗体分解物を生じさせることができよう。遊離Ｔｒｐは、ＡＥＰＨによって酸化されると、抗ＶＥＧＦ抗体における酸化を緩和するにおいて有効であった。これらの結果は、遊離Ｔｒｐが部位−特異的金属−触媒酸化に対して有効であることを示唆する。メチオニン、トリプトファンおよび、恐らくは、ヒスチジンのような全ての不安定なアミノ酸残基が保護されるのを確実とするために、メチオニンおよびトリプトファンの組合せは有効な対策であろう。
【００７３】
メチオニンと組合せて良好な安定化剤であるトリプトファン以外に、我々は、ｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸；水溶性ビタミン誘導体）および（通常はビタミンＢ６として知られた）ピリドキシンが、共に、蛋白質中のトリプトファン残基の優れた保護を示したことも証明した（図１５および１６）。これらの安定化剤の各々は、ＰＴＨの０．１ｍｇ／ｍＬ蛋白質溶液、ｐＨ５．０への添加によって、２ｍｇ／ｍＬ濃度において別々にテストした。引き続いて、１ｍＭのＡＡＰＨの添加によって、蛋白質溶液にストレスをかけ、４０℃において６時間インキュベートした。ｔｒｏｌｏｘまたはピリドキシンの保護がなければ、ＰＴＨはそのトリプトファン残基における有意な量の酸化を呈し、他方、ｔｒｏｌｏｘまたはピリドキシンの存在下では、トリプトファン残基はよく保護された（図１５および１６）。これらの結果は、蛋白質中のトリプトファン残基を保護するためにフリーラジカルスカベンジャーを用いる利用性を肯定した。
【実施例】
【００７４】
実施例１
蛋白質酸化の実験：酸化的分解メカニズムに対する有効な安定化剤としてのメチオニンおよびトリプトファン
本実施例は、抗体および蛋白質の酸化を妨げるための、単独で、およびメチオニンと組合せたトリプトファンの使用を示す。
【００７５】
実験方法
材料：
ＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩）（ロット番号Ｄ０００２４２８７）はＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。副甲状腺ホルモン（１−３４）（ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ，ロット番号Ｕ０７０４６Ａ１）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から購入した。この報告においては、それは単にＰＴＨという。Ｌ−メチオニンおよびＥＤＴＡ二ナトリウム（ロット番号Ｅ０５６４３）はＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から購入した。酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、Ｈ２Ｏ２、ｔ−ＢＨＰ、Ｌ−トリプトファン（ロット番号１１５２３３３）、および塩化第二鉄六水和物（ロット番号５３Ｈ０６１９）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。塩化第一鉄五水和物（ロット番号ＮＡ１７５９）はＥＭＤ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。マンニトール（Ｇ１０３０３，ロット番号１３９４７６）およびスクロース（Ｇ２０２４４，ロット番号２９２４２６）はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．内で得られた。トリプシン、配列決定グレード（ＴＰＣＫ処理）はＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（ＡＣＮ）および水はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒｌａｗｎ，ＮＪ）から購入した。試料調製実験で用いた水はＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｐｌｕｓ精製系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から得られた。
【００７６】
試料の調製
ｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中で１：４２（蛋白質：オキシダント）のモル比率で、ＰＴＨ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、各々、Ｈ２Ｏ２、Ｈ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）、ｔ−ＢＨＰ、ｔ−ＢＨＰ／Ｆｅ（ＩＩ）、またはＡＡＰＨと混合した。Ｆｅ（ＩＩ）の濃度は０．２ｍＭであった。組成物の詳細は表１中に掲げる。括弧中に示すように、テスト試料、マンニトール（１５％）、スクロース（６％）、Ｍｅｔ（２ｍｇ／ｍＬ）、ＥＤＴＡ（０．０４％）、およびＴｒｐ（２ｍｇ／ｍＬ）中の最終濃度を各濃度にて安定化剤としてこれらの試料に加えた。抗ＶＥＧＦ抗体試料では、２および１０ｍｇ／ｍＬのＴｒｐ濃度をテストした。４０℃における６および２４時間のインキュベーションの後に、試料のアリコットをメタノールおよびＭｅｔと混合して、ｒｐ−ＨＰＬＣ分析、ペプチドマッピング、および液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に先立って反応をクエンチした。液体形態の、復元された抗ＣＤ１１ａ抗体凍結乾燥製剤を、３１ｍＭのＡＡＰＨにて９２ｍｇ／ｍＬでテストした。変性された条件において、６ＭグアニジンＨＣｌを用いて５ｍｇ／ｍＬ抗ＣＤ１１ａ抗体を変性し、１．７ｍＭ ＡＡＰＨを加えた。
【００７７】
逆相クロマトグラフィー（ｒｐ−ＨＰＬＣ）
実験は、Ｃ４（Ｖｙｄａｃ，２１４ＴＰ，５μ，２．１×２５０ｍｍ）を用いてＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ機器で行った。溶媒ＡはＨ２Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であって、溶媒Ｂはアセトニトリル中の０．０８％ＴＦＡであった。試料は、４５分以内で、０．２ｍＬ／分の流速にて２０％Ｂないし８０％Ｂの直線状グラジエントで分析した。カラムの温度は３０℃に設定した。ＵＶ検出は２１４ｎｍに設定した。
【００７８】
トリプシン消化
試料のｐＨは、１Ｍ炭酸水素アンモニウムを加えることによって＞７．５に調整した。５ミリリットルの０．５ｍｇ／ｍＬトリプシンを２００μＬの試料に加え、次いで、これを３７℃にて３ないし４時間インキュベートした。消化は０．１％ＴＦＡでクエンチした。
【００７９】
トリプシン分解ペプチドマップのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ特徴付け：
トリプシン消化後のＰＴＨ試料をＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズのＨＰＬＣシステムで分離し、ペプチドの質量および配列はオンライン−カップルドＬＴＱ直線状イオン−トラップ・マス・スペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で決定した。Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｏ １．０×１５０ｍｍカラム（粒子サイズ４μｍ，ポアサイズ９０Å；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を用いた；その温度は３０℃に制御し、カラム流出物を２１４ｎｍでモニターした。流速は１５０μＬ／分に制御し、用いた移動相は水中の０．１％ＴＦＡ（Ａ）およびアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ（Ｂ）であった。１００μＬ容量の試料を注入した。（％Ｂ当たりの分として表した）最適化されたグラジエントは０／２％、３／２％、１０／８％、１５／８％、６０／４０％、６１／９５％、６５／９５％、６６／２％、および７６／２％であった。ＨＰＬＣからの流出物は、直接、ＬＴＱ電子スプレイイオン化源に注入した。正イオンモードの電子スプレイイオン化は、４．５ｋＶの針スプレイ電圧および４４Ｖの毛細管電圧を用いることによって達成された。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ実験において、３００ないし２０００ｍ／ｚの範囲の全スキャンを含めた９つのスキャン事象を行い、続いて、４つの最も強いイオンについて４サイクルのズームスキャンおよびＭＳ／ＭＳスキャンを行った。
【００８０】
ＭＳ／ＭＳスペクトルの解釈およびペプチドの帰属は、ＢｉｏＷｏｒｋｓ Ｂｒｏｗｓｅｒバージョン３．２ソフトウエア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）および各マッチした生成物イオンスペクトルの手動による調査を用い、ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムにて自動データベースサーチで達成した。ＰＴＨのＦＡＳＴＡ単一蛋白質データベースを作成し、サーチング標的として用いた。酸化生成物の同定のために、酸化−関連修飾を可変なものとして定義した（Ｔｒｐについては＋４，＋１６，および＋３２Ｄａ；Ｍｅｔについては＋１６Ｄａ；およびＰＴＨに対する、Ｈｉｓについては＋１６，−２２，および−２３Ｄａ）。満足された相関−因子値（単一に荷電についてはＸｃ≧１．５，二重に荷電については≧２．０，および三重に荷電されたペプチドイオンについては≧２．５）を持つペプチドマッチを、酸化−修飾ペプチドについての潜在的に有意なマッチとして選択した。引き続いて、マッチしたペプチドイオンのズーム−スキャン・マス・スペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの手動による調査を行って、偽陽性同定を排除した。ズーム−スキャンＭＳプロフィールを調べて、マッチしたペプチドの電荷状態およびモノアイソトピック質量を確認した。各酸化部位についての酸化レベルを評価するために、対応するペプチドの抽出されたイオンのクロマトグラムを、Ｘｃａｌｉｂｕｒ Ｑｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて手動により積分した。引き続いて、酸化されたペプチドイオンのピーク面積を酸化されたおよび酸化されていないペプチドのピーク面積の総和で割ることによって、酸化の相対的パーセンテージを計算した。
【００８１】
結果および考察
部位非特異的酸化、ＰＴＨ：
金属結合部位を含有しないＰＴＨは、非−部位−特異的酸化を実験するためのモデル蛋白質である。反応は溶媒に暴露された残基に対して起こる。０．１ｍｇ／ｍＬのＰＴＨを４０℃にて全て１ｍＭのオキシダントと６および２４時間反応させた。ＰＴＨに対するオキシダントのモル比率は４１．２であった。合計５つのオキシダントを用いた、すなわち、Ｆｅ（ＩＩ）の有りまたは無しでのＡＥＰＨ、Ｈ２Ｏ２およびｔＢＨＰであった。反応体を表１にまとめる。試料は、ｒｐ−ＨＰＬＣおよびトリプシン分解ペプチドのマッピング、続いての、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ特徴付けによって分析した。
【００８２】
【表１】
【００８３】
図３は、Ｈ２Ｏ２と反応させたＰＴＨのｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、そこでは、Ｍｅｔ１８−修飾、Ｍｅｔ８−修飾、および二重に修飾されたＰＴＨ種が検出された。この傾向は、Ｍｅｔ８よりも酸化され、続いて、二重に酸化されたＭｅｔ１８でのｒｐ−ＨＰＬＣによって検出されたように３つのＭｅｔ−酸化種を報告したＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ４３：１４１３９−４８（２００４年）によって作成されたデータと合致する。図４はＡＡＰＨと反応したＰＴＨのｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示し、図３に示されたそれとは非常に異なるパターンを明らかにする。トリプレットピークの２つの組は、ＰＴＨおよびＭｅｔ［Ｏ］ピークの間の保持時間に出現した。個々のピークは十分に特徴付けされなかったが、これらの新しいピークはＴｒｐ［Ｏ］修飾ＰＴＨ種であったことが、トリプシン消化、続いての、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって後に確認された。ＰＴＨ消化物のトリプシン分解ペプチドマッピングにより、Ｍｅｔ酸化生成物に加えて、ＰＴＨがＡＡＰＨで処理された場合には、Ｍ＋４、Ｍ＋３２、Ｍ＋１６（ここに、ＭはＰＴＨのトリプシン分解ペプチドＶＧＷＬＲの質量である）の分子質量を持つ３つのトリプシン分解ペプチド種が生じたことが判明した。ペプチド種のＭＳ／ＭＳスペクトルの分析の結果、３つのＴｒｐ酸化誘導体、すなわち、クヌレニン（Ｍ＋４）、Ｌ−フォルミルクヌレニン（Ｍ＋３２）および５−ヒドロキシトリプトファンまたはＯＸ−インドールアラニン（Ｍ＋１６）としてのそれらの帰属がもたらされた。それらの化学構造は図５に示される。３つのモデルオキシダント（例えば、Ｈ２Ｏ２，Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ），およびＡＡＰＨ）によってＰＴＨをテストするための論理的根拠は先に議論した。ｔＢＨＰおよびｔＢＨＰ＋鉄もテストした。なぜならば、ｔＢＨＰは、現在、分解された試料の調製のためのプロトコルにおいて選択されたオキシダントだからである。
【００８４】
表２は、これらの分解された試料中でのＰＴＨのＭｅｔ８およびＴｒｐ２３の総じての酸化をまとめる。一緒にすると、各々、６時間および２４時間処理した場合、ＰＴＨのＴｒｐ残基の４３％および８４％がＡＡＰＨによって酸化された。よって、図２に示された新しいピークは、Ｔｒｐ［Ｏ］修飾ＰＴＨ種として同定された。実験ではＨｉｓの酸化は観察されなかった。トリプシン分解ペプチドを含有する酸化されたＭｅｔ１８は逆相カラムに保持されなかった。表２は、これらの分解された試料中でのＰＴＨのＭｅｔ８およびＴｒｐ２３の総じての酸化をまとめる。
【００８５】
【表２】
【００８６】
これらの結果からの鍵となる観察は以下の通りである：
ａ．３つの条件、鉄の有りまたは無しでのｔＢＨＰ、およびＨ２Ｏ２は最小量のＴｒｐ酸化を生じた。
ｂ．３つのＨｉｓ残基のいずれも影響されなかった。
ｃ．ＡＡＰＨおよびフェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）反応、Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）のみがＴｒｐ酸化を生じた。
ｄ．種（＋４および＋３２）以外のより多くの＋１６Ｔｒｐ［Ｏ］が生じた。
ｅ．匹敵する程度のレベルＴｒｐ酸化に到達するために、６時間のＡＡＰＨ処理は４３％Ｔｒｐ［Ｏ］、およびＭｅｔ８における２９％Ｍｅｔ［Ｏ］を生じ、他方、２４時間のＨ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）処理は、３５％Ｔｒｐ［Ｏ］を生じたが、Ｍｅｔ８においてかなりより多くの量（９１％）のＭｅｔ［Ｏ］を生じた。この比較は、ＡＡＰＨ処理が、フェントン反応よりもＴｒｐ酸化に向けてより特異的であることを示す。
【００８７】
ペルオキシド（Ｈ２Ｏ２，ｔＢＨＰ，または他のＲＯＯＨ種）によるチオエステル（メチオニン）の酸化のメカニズムは、ペルオキシド−プロトン性溶媒複合体上でのスルフィドの１−工程求核攻撃、続いての、一連の強調された電子置換であり、酸素のイオン原子への移動に導き、その結果、Ｍｅｔスルホキシド、Ｍｅｔ［Ｏ］がもたらされた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．４８：４９０−５００，１９９５）。この反応メカニズムは、ペルオキシドの酸素が電子親和性であることを示唆する。かくして、ｔ−ブチルのような電子−供与基が、酸素の電子親和性を減少させることによって反応を加速する。この理由で、ｔＢＨＰが表２においてより少ない量の酸化を生じたという事実は驚くべきことではない。Ｋｅｃｋ（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３６：５６（１９９６））が、組換えインターフェロンガンマ（ｒＩＦＮ−γ；Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）および組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｒｔＰＡ；アルテプラゼ（ａｌｔｅｐｌａｓｅ），ＡＣＴＩＶＡＳＥ（登録商標））を調べた場合に、最初に報告したように、ｔＢＨＰが暴露されたメチオニンのみを酸化する利点を提供することが指摘されるべきである。ＰＴＨにはほとんど三次構造がないので、我々は、ＰＴＨ中のいずれのＭｅｔもｔ−ＢＨＰによって選択的に酸化されると予測しない。
【００８８】
求核攻撃のメカニズムは特異的な酸触媒成分を予測させるが、反応速度は、ＰＴＨで示されたように、ｐＨ２ないし８の範囲においては有意に変化しない（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４：２９６９−７４（２００４））。この理由で、酢酸緩衝液中でｐＨ５を用いて得られたデータは、蛋白質製剤において見出された典型的なｐＨの範囲であるｐＨ５ないし７に適用できる。
【００８９】
ＡＡＰＨおよびフェントン反応のみがＴｒｐ酸化を生じた。この結果は、Ｈ２Ｏ２単独の求核反応がＴｒｐを酸化させることができないという考えを裏付ける。我々は、我々の実験においてＨｉｓ酸化を全く観察しなかったので驚いた。ウシ血清アルブミンがＦｅ（ＩＩ）／ＥＤＴＨ／アスコルベートまたはＣｕ（ＩＩ）／アスコルベートと反応した場合、前者はＴｒｐに対してより多くの酸化を引き起こし、他方、後者はより多くのＨｉｓ酸化を引き起こした（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．５３：３２８５−９２（１９８９））。もう１つの実験室において、ＡｓｃＡ／Ｃｕ（ＩＩ）によるレラキシン酸化の結果、同時に、有意な量のＨｉｓ酸化、および少量のＡｓｃＡ／Ｆｅ（ＩＩＩ）がもたらされ、ＴｒｐまたはＴｙｒ酸化はいずれも認められなかった（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４：５７６２−７２（１９９５））。双方の実験室からの結果は、Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）を用いた場合の、ＰＴＨにおけるＨｉｓ酸化の全くの不存在に矛盾する。Ｈｉｓ酸化は銅の存在に依存する可能性がある。
【００９０】
安定化剤ＰＴＨのスクリーニング：
前記分析に基づき、我々は、蛋白質が、図１に示されたいずれかまたは全ての３つの分解メカニズムならびに光誘導酸化を介して酸化的攻撃に感受性であろうと提唱する。Ｈ２Ｏ２（金属無し）との求核反応は、蛋白質生成物がアイソレーター中で防腐剤として用いられるＨ２Ｏ２蒸気に、またはＴｗｅｅｎの分解から得られたＨ２Ｏ２に暴露された場合に観察された酸化反応であり得る（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙ Ｍｅｔｈｏｄ ２９：７７−８１（１９９４））。微量金属（鉄、銅、またはクロム）を、ステンレス鋼との接触の結果として製剤の溶液に導入した場合、フェントン反応−Ｆｅ（ＩＩ）と共にＨ２Ｏ２−が働く。第三のメカニズムは、分解されたＴｗｅｅｎから来るであろうアルキルペルオキシドを介するものである（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙ Ｍｅｔｈｏｄ ２９：７７−８１（１９９４））。本研究において、ＡＡＰＨを用いて、アルキルペルオキシドから得られた活性酸素種をシミュレートした（図２）。
【００９１】
メチオニン：遊離Ｍｅｔは、鉄が存在するか否かに拘わらず、予測されたように、オキシダントＨ２Ｏ２の効果を中和した。遊離ＭｅｔはＰＴＨ中のＭｅｔ残基の酸化を有意に低下させた。というのは、Ｍｅｔ［Ｏ］ＰＴＨに対応するピークは出現しなかったからである（図６）。Ｔｒｐ［Ｏ］ピークは依然として存在したので、遊離ＭｅｔはＴｒｐの酸化に対しては効果を有しなかった。
【００９２】
マンニトール、スクロース：マンニトールはよく知られたヒドロキシルフリーラジカルスカベンジャーである。図７は、それにＨ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）でストレスをかけた場合の、いずれかのＭｅｔ［Ｏ］およびＴｒｐ［Ｏ］由来ＰＴＨの不存在によって証明されるように、マンニトールによるフェントン反応の完全な保護を示す。しかしながら、ＡＡＰＨによって、またはＨ２Ｏ２によってストレスをかけた場合、ＰＴＨはマンニトールによって全く保護されなかった。なぜならば、マンニトールはアルキルペルオキシドまたはＨ２Ｏ２と反応しないからである。スクロースは、ＰＴＨをヒドロキシル・フリー・ラジカルに対して保護する場合にマンニトールよりも有効でなかったことを除いて、同様な結果を生じた。ポリオールは、物理的および化学的双方の分解に対して普遍的な安定化剤と考えられた。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ ４８：４９０−５００（１９９５年））によるレビューにおいて認められているように、ヘモグロビンはある種の糖を使用して酸化なくして凍結乾燥することができる。ＡＡＰＨを用いる我々のモデルからの結果は、ポリオールと共に蛋白質はアルキルペルオキシドに直面した場合に保護されないままでいると示唆する。
【００９３】
ＥＤＴＡ：図８に示されるように、ＥＤＴＡは、それにＨ２Ｏ２／Ｆｅ（ＩＩ）によってストレスをかけた場合に、ＰＴＨを完全に保護した。この場合、ＥＤＴＨはフリーラジカルの生成を緩和しないのみならず、Ｈ２Ｏ２の酸化的効果も緩和しなかった。ＥＤＴＨは、それにＨ２Ｏ２単独によってストレスがかけられた場合に、ＰＴＨを保護しなかった。豊富なＭｅｔ［Ｏ］−およびＴｒｐ［Ｏ］ＰＴＨピークがあったことを仮定すれば、ＥＤＴＡはＡＡＰＨ酸化を悪化させるように見えた。ＥＤＴＡまたは（ＥＧＴＡのような）他の金属キレーターの効果の報告は混合されてきた。金属キレーターは金属−触媒反応を増強または阻害し得る。一般化して、ＥＤＴＡは、それが銅を有効に隔離するゆえに、銅―触媒反応を阻害すると言うことができる。それは鉄についての全ての５つの原子価をカバーできないので、ＥＤＴＡ−鉄錯体は時々非常に反応性である。ＥＤＴＡをＰＴＨおよびＡＡＰＨの反応混合物に加えた場合に、何故より多くの酸化が観察されたかは分からないが、そのような調査は本研究の範囲を超えている。
【００９４】
文献に頻繁に記載されているように、イン・ビボでの、Ｍｅｔ、ＴｒｐまたはＨｉｓ残基の酸化は、金属触媒酸化（ＭＣＯ）に帰せられてきた。本実験においては、金属を加えないでＡＡＰＨによって酸化されたＰＴＨは有意な量のＭｅｔおよびＴｒｐを生じ、これは、ＭｅｔまたはＴｒｐ酸化のいずれも金属触媒のみに依存するのではないことを示唆する。
【００９５】
遊離トリプトファン：文献においては、多くの物質がフリーラジカル用のスカベンジャーとして引用されてきた。チオ尿素、メタノールおよび尿酸が例であるが、それらは蛋白質製剤で用いるのに適しない。加えて、ブチル化ヒドロキシル−アニソール（ＢＨＡ）および−トルエン（ＢＨＴ）は、脂質からラジカルをクエンチングするのにかなり有効なラジカル鎖反応ターミネーターである。それらの低い水溶性のため、それらは蛋白質の水性製剤で適しない。適切な量の界面活性剤と共に、ＢＨＡおよびＢＨＴを水性製剤に導入して、いくらかの酸化的保護を供することができる。
【００９６】
非経口製剤中での抗酸化剤としての遊離Ｔｒｐの使用は文献において言及されてこなかった。遊離Ｍｅｔの使用と同様に、それはＰＴＨを酸化に対して保護し得る。図９は、ＰＴＨにＡＡＰＨまたはフェントン反応によってストレスを与えた場合、遊離ＴｒｐがＰＴＨ中のＴｒｐ残基の酸化からの良好な保護を提供することを示す。Ｍｅｔ［Ｏ］ＰＴＨピークはＡＡＰＨストレスの場合に、顕著であり、フェントン反応の場合にはそうでなかった。遊離Ｔｒｐ単独は、Ｈ２Ｏ２による酸化的ストレスに対して保護を供しなかった。
【００９７】
トリプトファンおよびメチオニンの組合せ：この組合せは、全ての３つの酸化的条件下でＰＴＨのほとんど完全な保護を提供した（図１０）。遊離ＴｒｐおよびＭｅｔは、各々、アルキルペルオキシドおよびＨ２Ｏ２の効果を中和するだろうと推定することができる。ＴｒｐおよびＭｅｔが組合せて用いられる場合、蛋白質製剤は、図１に示される全ての３つのメカニズムによる攻撃、ならびに光誘導酸化に耐えることができるはずである。
【００９８】
前記した分析は、各ｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムでのピークの定性的調査から得られた。ＡＡＰＨおよびフェントン反応によって酸化された試料をトリプシン分解ペプチドマッピングおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ特徴付けによる更なる定量的および残基特異的分析に付した。質量シグナルの対応するＥＩＣ（抽出イオンクロマトグラム）を積分することによって得られた相対的定量の結果によると、遊離Ｍｅｔ単独はＭｅｔ酸化を有意に抑制し、遊離Ｔｒｐ単独はＴｒｐ酸化を有意に抑制した（図１１）。ＴｒｐおよびＭｅｔの組合せは、ＡＡＰＨ（図１１）またはフェントン反応（図１２）による酸化に対して最も有効な保護を提供した。
【００９９】
部位特異的金属触媒酸化：
抗ＶＥＧＦ抗体のＴｒｐ５０酸化は、適格なロットが、３０℃にて１ヶ月間貯蔵した時により高い程度の種ピークの喪失を示した場合に最初に認められた。Ｔｒｐ５０に対する自己触媒的酸化は、後に、貧弱に扱われたＴｗｅｅｎ２０によって引き起こされたことが示され、その結果、主ピークの喪失およびＩＥＣ分析における塩基性ピークの増大がもたらされた。更なる実験は、Ｈ２Ｏ２が抗ＶＥＧＦ抗体酸化を引き起こさず、かくして、ＩＥＣクロマトグラフィーパターンに対する変化をもたらさなかったことを示した。安定化剤としてのＥＤＴＡの添加、および近くのＨｉｓの突然変異の結果、Ｔｒｐ酸化に関して抗ＶＥＧＦ抗体の改良された安定性がもたらされた。これらのデータに基づくと、抗ＶＥＧＦ抗体の酸化は部位−特異的金属触媒反応である可能性がある。
【０１００】
抗ＶＥＧＦ抗体溶液へのＡＡＰＨの添加は、ＩＥＣクロマトグラムの塩基性領域において、更なるピークも生じさせ、問題がある適格ロットによって示されるように、これらのピークは、フリーラジカルにより生じた抗ＶＥＧＦ抗体分解体を表した（図１３）。分解した蛋白質のこれらのピークは適格ロットからの分解したピークの匹敵する位置にあるが、プロフィールは同一でない。更なる分析は、これらのピークがＴｒｐ酸化に関連するか否かを確認する必要がある。
【０１０１】
ＩＥＣクロマトグラムにおける塩基性ピークの不存在によって証明されるように、製剤への遊離トリプトファンの添加はＡＡＰＨに対する優れた保護を提供した（図１４）。抗ＶＥＧＦ抗体におけるＭｅｔ残基はＨ２Ｏ２によって酸化させることができないゆえに、遊離Ｍｅｔは抗ＶＥＧＦ抗体には必要でないであろうと予測するのは合理的である。
【０１０２】
Ｔｒｐ酸化が予測されない場合の抗ＣＤ１１ａ抗体：
抗ＣＤ１１ａ抗体中のＭｅｔ残基の酸化は広範に研究されてきた。抗ＣＤ１１ａ抗体は４つの反応性メチオニン−Ｍｅｔ２５６、Ｍｅｔ４３２、Ｍｅｔ３６２およびＭｅｔ５０を有する（重鎖）。表３は、Ｈ２Ｏ２、ｔＢＨＰ、および熱ストレスがＭｅｔ２５６および、程度はより低いが、Ｍｅｔ５０の酸化を引き起こしたことを示す。金属（恐らくは、ステンレス鋼タンクからの溶解した金属）の存在下においては、Ｍｅｔ５０における酸化はＭｅｔ２５６のそれと匹敵するレベルまで増大した。酸化はＬｙｓ−Ｃペプチドマッピングによって測定された。反応性の順序の差は、適用された酸化ストレスのタイプに依存した。
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
ＡＡＰＨを抗ＣＤ１１ａ抗体に加えると、Ｍｅｔ５０のレベルが増大し、ステンレス鋼タンクにおける反応およびＡＡＰＨとの反応が匹敵することを示唆し、共に、Ｍｅｔ５０における増大した酸化をもたらす（表４）。Ｍｅｔ５０は、金属またはフリーラジカルが関係する場合、酸化の部位であると推定することができる。これらの条件下では、Ｔｒｐ、ＨｉｓまたはＴｙｒ残基は酸化されなかったのに注意するのは非常に重要である。しかしながら、変性剤を用いた場合には、Ｔｒｐは種々の場所において酸化することができる。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
蛋白質に対するオキシダントの比率が増大した場合、および蛋白質の三次構造がグアニジンの添加によって乱された場合、ＡＡＰＨによるＴｒｐ残基の酸化は豊富であった。更に、これらの条件下で、Ｍｅｔ５０の優先的な酸化は観察されなかった（データは示さず）。これらの結果は、更に、モデル酸化剤としてのＡＡＰＨの使用を裏付ける。適切なオキシダント／蛋白質比率を用いた場合、ＡＡＰＨは信頼性良くＴｒｐ酸化を引き起こす。抗ＣＤ１１ａ抗体であてはまるように、通常の取扱い条件がＴｒｐ酸化を生じさせない場合、ＡＡＰＨはＴｒｐ酸化を引き起こさない。
【０１０７】
結論
本報告において我々は、ＡＡＰＨが蛋白質中のＴｒｐ残基を酸化することができる良好なモデルオキシダントであることを示した。Ｈ２Ｏ２、Ｈ２Ｏ２＋鉄およびＡＡＰＨ（図１）を一緒に用いて、ＭｅｔおよびＴｒｐ残基の酸化に対する保護についての安定化剤をスクリーニングするのが賢明である。この系は、蛋白質製剤の製造および貯蔵の間に起こるかも知れない全ての可能な酸化的経路の改良されたシミュレーションを可能とする。抗−ＶＥＧＦ抗体の分解は、金属触媒酸化として別々に示された。
【０１０８】
また、我々は、遊離Ｔｒｐが、蛋白質含有製剤に加えられると、トリプトファン残基の酸化を有効にブロックしたことを最初に示した。ＡＡＰＨを用いることによってシミュレートされた酸化的ストレスの下では、トリプトファンはＴｈｅ抗ＶＥＧＦ抗体における酸化的反応を有効にブロックした。この結果は、遊離Ｔｒｐが部位−特異的金属−触媒酸化に対して有効であることを示唆する。Ｍｅｔ、Ｔｒｐおよび、可能性として、Ｈｉのような全ての不安定なアミノ酸残基が保護されることを確実とするためには、ＭｅｔおよびＴｒｐの組合せを考慮すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質、遊離メチオニン、および前記蛋白質内の芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げることができる１以上の化合物を含む医薬製剤。
【請求項２】
前記蛋白質がペプチド、蛋白質、抗体およびそのアナログよりなる群から選択される請求項１記載の製剤。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２記載の製剤。
【請求項４】
前記蛋白質が抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である請求項１記載の製剤。
【請求項５】
前記蛋白質が抗血管形成特性を有する請求項１位記載の製剤。
【請求項６】
前記蛋白質が抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である請求項１記載の製剤。
【請求項７】
前記蛋白質が抗ＣＤ１１ａモノクローナル抗体である請求項１記載の製剤。
【請求項８】
前記蛋白質が酸化に対して感受性である請求項１記載の製剤。
【請求項９】
前記蛋白質が凝集に対して感受性である請求項１記載の製剤。
【請求項１０】
前記蛋白質内の前記芳香族アミノ酸残基がトリプトファン、ヒスチジン、チロシン、およびフェニルアラニンよりなる群から選択される請求項１記載の製剤。
【請求項１１】
水性である請求項１記載の製剤。
【請求項１２】
酸化を妨げることができる前記化合物が非経口注射に適している請求項１記載の製剤。
【請求項１３】
前記化合物が薬理学的効果に寄与しない請求項１記載の製剤。
【請求項１４】
前記化合物が遊離芳香族アミノ酸またはそのアナログを含む請求項１記載の製剤。
【請求項１５】
前記芳香族アミノ酸がトリプトファン、ヒスチジン、チロシン、およびフェニルアラニンよりなる群から選択される請求項１１記載の製剤。
【請求項１６】
前記化合物がトリプトファンである請求項１記載の製剤。
【請求項１７】
前記トリプトファンが、約０．１ないし１０ｍｇ／ｍｌの範囲の量で前記製剤に存在する請求項１３記載の製剤。
【請求項１８】
遊離トリプトファンを１以上の別の芳香族アミノ酸と合わせた請求項１記載の製剤。
【請求項１９】
前記化合物が遊離ヌクレオチドまたはそのアナログを含む請求項１記載の製剤。
【請求項２０】
前記遊離ヌクレオチドが、約０．１ないし１０ｍｇ／ｍＬの範囲の量で前記製剤に存在する請求項１７記載の製剤。
【請求項２１】
１以上の遊離ヌクレオチドが１以上の遊離芳香族アミノ酸と組み合わせられた請求項１記載の製剤。
【請求項２２】
前記化合物が１以上のビタミンまたはビタミン誘導体を含む請求項１記載の製剤。
【請求項２３】
前記ビタミンまたはビタミン誘導体が６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸である請求項１９記載の製剤。
【請求項２４】
前記ビタミンまたはビタミン誘導体がピリドキシンである請求項１９記載の製剤。
【請求項２５】
前記抗酸化剤ビタミンまたはビタミン誘導体を、約０．１ないし１０ｍｇ／ｍｌの範囲の量で製剤に存在する請求項１９記載の製剤。
【請求項２６】
更に、界面活性剤を含有する請求項１記載の製剤。
【請求項２７】
更に、マンニトールを含有する請求項１記載の製剤。
【請求項２８】
哺乳動物において疾患または障害を予防または治療する方法であって、請求項１記載の製剤を、前記疾患または障害を予防または治療するのに有効な量にて前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２９】
請求項１記載の製剤を調製し、次いで、前記製剤中の蛋白質の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性を評価することを含む、医薬製剤の製造方法。
【請求項３０】
蛋白質の医薬組成物を安定化させる方法であって、メチオニンおよび１以上の化合物を、前記蛋白質内の芳香族アミノ酸の酸化を阻害するのに十分な量にて前記組成物に加えることを含む方法。
【請求項３１】
一定量の界面活性剤を、蛋白質組成物、および前記界面活性剤の分解から生じた酸化的種をなくするのに十分な量の化合物に加えることを含む、医薬製剤の製造方法。
【請求項３２】
芳香族アミノ酸、ヌクレオチド、およびビタミンまたはその誘導体よりなる群から選択される１以上の化合物と組合せてメチオニンを加えることを含む、感受性の蛋白質内の芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げる方法。
【請求項１】
蛋白質、遊離メチオニン、および前記蛋白質内の芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げることができる１以上の化合物を含む医薬製剤。
【請求項２】
前記蛋白質がペプチド、蛋白質、抗体およびそのアナログよりなる群から選択される請求項１記載の製剤。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２記載の製剤。
【請求項４】
前記蛋白質が抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である請求項１記載の製剤。
【請求項５】
前記蛋白質が抗血管形成特性を有する請求項１位記載の製剤。
【請求項６】
前記蛋白質が抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である請求項１記載の製剤。
【請求項７】
前記蛋白質が抗ＣＤ１１ａモノクローナル抗体である請求項１記載の製剤。
【請求項８】
前記蛋白質が酸化に対して感受性である請求項１記載の製剤。
【請求項９】
前記蛋白質が凝集に対して感受性である請求項１記載の製剤。
【請求項１０】
前記蛋白質内の前記芳香族アミノ酸残基がトリプトファン、ヒスチジン、チロシン、およびフェニルアラニンよりなる群から選択される請求項１記載の製剤。
【請求項１１】
水性である請求項１記載の製剤。
【請求項１２】
酸化を妨げることができる前記化合物が非経口注射に適している請求項１記載の製剤。
【請求項１３】
前記化合物が薬理学的効果に寄与しない請求項１記載の製剤。
【請求項１４】
前記化合物が遊離芳香族アミノ酸またはそのアナログを含む請求項１記載の製剤。
【請求項１５】
前記芳香族アミノ酸がトリプトファン、ヒスチジン、チロシン、およびフェニルアラニンよりなる群から選択される請求項１１記載の製剤。
【請求項１６】
前記化合物がトリプトファンである請求項１記載の製剤。
【請求項１７】
前記トリプトファンが、約０．１ないし１０ｍｇ／ｍｌの範囲の量で前記製剤に存在する請求項１３記載の製剤。
【請求項１８】
遊離トリプトファンを１以上の別の芳香族アミノ酸と合わせた請求項１記載の製剤。
【請求項１９】
前記化合物が遊離ヌクレオチドまたはそのアナログを含む請求項１記載の製剤。
【請求項２０】
前記遊離ヌクレオチドが、約０．１ないし１０ｍｇ／ｍＬの範囲の量で前記製剤に存在する請求項１７記載の製剤。
【請求項２１】
１以上の遊離ヌクレオチドが１以上の遊離芳香族アミノ酸と組み合わせられた請求項１記載の製剤。
【請求項２２】
前記化合物が１以上のビタミンまたはビタミン誘導体を含む請求項１記載の製剤。
【請求項２３】
前記ビタミンまたはビタミン誘導体が６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸である請求項１９記載の製剤。
【請求項２４】
前記ビタミンまたはビタミン誘導体がピリドキシンである請求項１９記載の製剤。
【請求項２５】
前記抗酸化剤ビタミンまたはビタミン誘導体を、約０．１ないし１０ｍｇ／ｍｌの範囲の量で製剤に存在する請求項１９記載の製剤。
【請求項２６】
更に、界面活性剤を含有する請求項１記載の製剤。
【請求項２７】
更に、マンニトールを含有する請求項１記載の製剤。
【請求項２８】
哺乳動物において疾患または障害を予防または治療する方法であって、請求項１記載の製剤を、前記疾患または障害を予防または治療するのに有効な量にて前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２９】
請求項１記載の製剤を調製し、次いで、前記製剤中の蛋白質の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性を評価することを含む、医薬製剤の製造方法。
【請求項３０】
蛋白質の医薬組成物を安定化させる方法であって、メチオニンおよび１以上の化合物を、前記蛋白質内の芳香族アミノ酸の酸化を阻害するのに十分な量にて前記組成物に加えることを含む方法。
【請求項３１】
一定量の界面活性剤を、蛋白質組成物、および前記界面活性剤の分解から生じた酸化的種をなくするのに十分な量の化合物に加えることを含む、医薬製剤の製造方法。
【請求項３２】
芳香族アミノ酸、ヌクレオチド、およびビタミンまたはその誘導体よりなる群から選択される１以上の化合物と組合せてメチオニンを加えることを含む、感受性の蛋白質内の芳香族アミノ酸残基の酸化を妨げる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１２−５０２１０２（Ｐ２０１２−５０２１０２Ａ）
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２６９４０（Ｐ２０１１−５２６９４０）
【出願日】平成２１年９月９日（２００９．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５６３６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３０６７０
【国際公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月９日（２００９．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５６３６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３０６７０
【国際公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
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