蛍光に基づいた検出方法及び装置
同一期間にわたって２つ以上の異なる放射供給源（１４５，１６０）による励起に応答して、サンプルからの蛍光放射の放出を検出する装置では、それぞれの放射供給源（１４５，１６０）が、放出された蛍光放射においてその後個々に検出され得る変調方式を備えている。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいた技術において、２つ以上の異なるＬＥＤ供給源（１４５，１６０）に対する駆動電流は、異なる変調方式に従って、周波数変調又はパルス幅変調される。それぞれの供給源（１４５，１６０）に対するサンプルの応答は、例えばサンプルに含まれる異なった供与体／受容体プローブの応答は、例え応答の波長又は波長レンジが同じか又は重なっていても、異なる変調方式を用いて、その後個々に検出され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アッセイや画像生成に使用可能なものなどの蛍光に基づいた検出方法及び装置に関するものである。これは、蛍光顕微鏡検査用の方法及び装置、並びに、蛍光共鳴エネルギー移動に基づいた方法及び装置に具体的な用途を有している。
【背景技術】
【０００２】
発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）に基づいたアッセイ又は画像生成法においては、影響を受け易い分子を物理的、化学的、又は機械的な刺激によって励起することにより、検出可能な光を放出させている。放出光を使用することにより、分子の位置を検出可能であり、従って、これは、画像生成に使用可能であると共に／又は、これを使用することにより、プロセスにおける放出分子の関与を検出可能である。
【０００３】
便利な形態の刺激は、影響を受け易い分子を含むサンプル上に導波可能な光であり、この形態の発光を蛍光と呼んでいる。放出光は、刺激光（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｌｉｇｈｔ）のものとは異なる波長又は波長レンジを具備しており、この結果、刺激光の存在下において、相対的に容易に検出可能である。刺激光にしても、放出光にしても、必ずしも、可視スペクトルにあるものではないが、放出光を検出する適切な方法の存在が明らかに必要である。
【０００４】
蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅｓｏｎａｎｔ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）アッセイ法においては、サンプル内におけるプロセスの進捗を放出光から決定可能である。影響を受け易い部分には、２つのタイプが存在しており、これらのタイプは、供与体（ｄｏｎｏｒ）部分と受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）部分から構成されている。これらの部分は、別個の蛍光分子又は同一分子における異なるフルオロフォアグループ（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ｇｒｏｕｐ）などの様々な形態をとることが可能であり、或いは、分子の形態を具備することなしに、例えば、蛍光ビーズ又は蛍光量子ドットなどのように粒子状であってもよい。供与体は、サンプルに供給された刺激光（本明細書においては、これを「励起放射」とも呼ぶ）に応答し、独力で蛍光を発する。しかしながら、受容体が物理的に近接している場合には、双極子間における励起エネルギーの移動が発生し、この結果、供与体の蛍光が消光され、この代わりに、受容体が蛍光を発することになる。これは、しばしば、「Ｆｏｒｓｔｅｒ」共鳴エネルギー移動とも呼ばれている。エネルギー移動の程度は、供与体と受容体間の離隔距離に依存している。ＦＲＥＴアッセイ法は、供与体／受容体ペアの物理的な近接性に対するプロセスの影響に基づいたものである。それらが互いに十分に近接している際には、供与体から受容体へのエネルギーの移動が発生し、ペアの全体的な蛍光出力は、この影響を受けることになる。ペアが離隔している場合には、エネルギーの移動が減少又は停止し、ペアの全体的な蛍光出力は、異なって検出可能である。従って、サンプル内の供与体／受容体ペアの物理的な近接性を変化させるプロセスにより、サンプルから放出される光のスペクトルコンテンツの変化が生じ、これを検出することにより、プロセスの進捗の尺度が得られる。
【０００５】
供与体／受容体ペアを含む影響を受け易いフルオロフォアは、しばしば、「プローブ」と呼ばれる構造に組み込まれている。プローブは、特定の方式によってサンプル内において振舞い、この結果、そのプローブの場所から放出される蛍光が有用な情報を付与することになるという特性を具備している。例えば、プローブは、蛍光がそれらのサイトを示すことになる特定のサイトを占有可能であろう。ＦＲＥＴにおいては、プローブは、しばしば、アッセイの対象であるプロセスによって構築又は分割されるように、選択されており、供与体及び受容体は、プローブの構築又は分割に伴って近接又は離隔するように、プローブの異なる部分に配置されている。或いは、この代わりに、プローブは、複数のコンポーネントを具備することも可能であり、これらのコンポーネントは、それぞれ、供与体及び受容体を保持すると共に、アッセイの対象であるプロセスによって接近又は離隔することになる。
【０００６】
供与体及び受容体フルオロフォアを提供する材料は、しばしば、色素と呼ばれており、このような色素の周知の例には、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（青励起、緑放出：通常、供与体として使用されている）及びローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）（緑励起、赤放出：通常、受容体として使用されている）が含まれている。
【０００７】
供与体／受容体ペアの物理的な近接性における変化は、様々な方法によって検出可能である。受容体は、供与体からエネルギーを受容した際に、独力で、但し、供与体が蛍光を発するものとは異なる波長において、蛍光を発することができる。従って、供与体又は受容体のこの波長における蛍光出力のレベルの変化を計測することにより、物理的な近接性の変化を検出可能である。供与体であるか受容体であるかを問わず、この変化を検出するべく監視されるものを「レポーター」と呼んでいる。いくつかの受容体は、それ自体は蛍光を発することなしに、供与体の蛍光を「消光」しているのみである。これらは、「ダーククエンチャ（ｄａｒｋ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）」と呼ばれており、この場合には、必然的に供与体がレポーターである。レポーターを内蔵している監視又は検出構成は、一般的に、レポーターシステムと呼称可能である。
【０００８】
又、受容体分子は、しばしば、「レセプタ」とも呼ばれているが、監視対象のプロセスに応じて、そのプロセスのその他の要素と混同される可能性があり、本明細書においては、受容体という用語を一般的に使用することとする。
【０００９】
ＦＲＥＴ法を使用して監視可能なプロセスには、蛋白質−蛋白質相互作用、核酸−核酸相互作用、及び蛋白質−核酸相互作用が含まれる。例えば、細胞膜内におけるレセプタに対する上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）のバインディングにおいては、この際に、レセプタが二量化し、ＥＧＦの個々の単位のいくつかのものに、供与体分子及び受容体分子として標識が予め付与される。この膜内におけるレセプタの二量化により、少なくともいくつかの供与体／受容体分子ペアが近接し、これにより、前述のように、サンプルから放出される光のスペクトルコンテンツにおける検出可能な変化が発生する。２つの蛍光標識抗体を使用して抗原に対する同時バインディングを通じてＦＲＥＴペアを形成し、抗体−抗原−抗体挟持複合体を形成することにより、或いは、ビーズの表面に固定されたキャプチャー抗体の作用因子を通じて抗原の存在下において蛍光ビーズの近傍に蛍光標識抗体を移動させることなどにより、同様の原理によって免疫アッセイ（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を構築可能である。核酸相互作用の観点においては、細胞及び組織の染色のためのＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）において、（特に、「ＤＮＡチップ」におけるアレイフォーマットの）核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（ｎｕｃｌｅｉ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）において、並びに、供与体／受容体ペアを含むシーケンス固有のプローブを試薬マスターミックスに追加可能であるＤＮＡ複製酵素の動作の検出において、ＦＲＥＴ標識試薬を使用可能である。酵素は、ＤＮＡに沿って移動するのに伴ってプローブと遭遇し、これを開裂させ、これにより、供与体／受容体ペアを分離し、前述のように、この場合にも、放出光のスペクトルコンテンツにおける変化を引き起こす。
【００１０】
酵素がＤＮＡを複製する既知のプロセスの非常に良好な例がポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）であり、この場合には、サンプルＤＮＡの二重螺旋が、そのヌクレオチドの２つのストランド（ｓｔｒａｎｄ）に変性し、次いで、それぞれのストランドをポリメラーゼの働きによって複写し、２つの新しい二重螺旋を生成している。このプロセスをいくつかの加熱及び冷却サイクルを使用して反復することにより、サンプルＤＮＡの量における大きな増大を得ている。この複写プロセスは、テンプレートとして使用されるそれぞれのストランドに対して「プライマ」をバインドすることによってトリガされている。プライマとは、ＤＮＡの変性ストランド内においてヌクレオチドの相補的なシーケンスに対してバインド可能である特定の順序のヌクレオチドの単一チェーンである。次いで、このプライマから開始し、ポリメラーゼは、テンプレートストランドを「判読」すると共に、これを相補的なヌクレオチドと非常に迅速に一致させることができる。この結果が、最初のものに代わる２つの新しい螺旋であり、このそれぞれは、オリジナルのストランドの中の１つのものにその新しく組み立てられた相補的なストランドを加えたものから構成されている。
【００１１】
又、ＰＣＲプロセスを監視するべく、１つ又は複数のプローブをＤＮＡの変性ストランドにバインドしている。プローブは、プライマと同一の原理を踏襲しているが、複写をトリガすることはない。この代わりに、これは、供与体、受容体、又はこれらの両方を保持しており、且つ、ストランドに沿った１つ又は複数の位置にバインドする。この結果、これが、プライマからストランドに沿って進入するのに伴ってポリメラーゼによって加水分解された場合に、結果的に供与体／受容体ペアが分離され、ＦＲＥＴに対する計測可能な変化を検出可能である。
【００１２】
供与体／受容体ペアを使用しており、且つ、従って、ＦＲＥＴに基づいたアッセイにおいて有用であるその他のプローブには、ターゲットコードがストランド内に存在している場合にストランドに沿って隣接位置にバインドすることによって物理的な近接状態となった異なる構造上に供与体及び受容体が保持されたデュアルハイブリダイゼーションを使用するプローブ、ループせずにストランドに対してバインドし、これにより、供与体／受容体ペアを分離するループ構造のそれぞれの端部に供与体及び受容体が保持された「分子ビーコン」、並びに、供与体／受容体ペアが標識プローブ及び挿入色素である「Ｒｅｓｏｎｓｅｎｓｅ（登録商標）」が含まれている。
【００１３】
ＰＣＲプロセス及びＦＲＥＴアッセイ法については、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から２００４年に出版されたＥｄｗａｒｄｓ、Ｌｏｇａｎ、及びＳａｕｎｄｅｒｓ編集による「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ： Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ」（ＩＳＢＮ ０−９５４５２３２−７−Ｘ）に記述されている。これからわかるように、１つのサンプルに関する計測値を多重化することが知られている。サンプル内において発生可能である複数のプロセスが存在可能であり、これらは、異なるプローブを使用して別個に検出可能であり、そして、これらのプローブは、異なる供与体／受容体ペアの組み合わせを保持することによって「ラベル付け」されている。例えば、供与体／受容体ペアは、異なる供与体分子の使用、異なる波長レンジにおける蛍光発光、又は異なる受容体分子の使用という点において異なることができる。複数のタイプの供与体が存在する場合には、１つのタイプの受容体分子が複数のタイプの供与体から共鳴エネルギーを受容する「ユニバーサル受容体」を使用することが知られている。受容体の蛍光のものである１つの波長を検出するだけでよいため、ユニバーサル受容体法によれば、検出が単純化される。供与体のタイプに応じて、複数波長の励起放射を提供する必要があろう。同様に、複数のタイプの受容体が存在する場合には、１つの供与体の共鳴エネルギーを複数の受容体によって受容可能である「ユニバーサル供与体」法を使用することも知られている。それぞれのプローブタイプは、同一の供与体を保持可能であるが、個々の受容体の蛍光波長レンジにより、異なるプローブタイプを弁別可能である。ユニバーサル供与体法及びユニバーサル受容体法は、いずれも、複数のユニバーサル供与体及び／又は受容体を使用することにより、プローブのグループが同一の供与体又は受容体を共有するように、拡張可能である。
【００１４】
ユニバーサル受容体フォーマットを使用する既知の構成においては、受容体分子が、異なる供与体のそれぞれに応答し、同一の方法によって蛍光を発することになるため、受容体の蛍光を計測することにより、異なるプローブからの応答を互いに直接的に弁別することはできない。従って、例えば、一連の異なる励起波長において計測をシーケンシャルに実行してきた。この結果、核酸増幅反応などのプロセスにおける蛍光の変化の連続的な監視が不可能であった。異なる励起波長に対するサンプルの蛍光応答を直接的に弁別可能である場合にも、例えば、異なる供与体分子は、ユニバーサル「クエンチャ」フォーマット（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ”ｑｕｅｎｃｈｅｒ” ｆｏｒｍａｔ）において、異なる波長において蛍光を発するため、或いは、ユニバーサル供与体フォーマットが使用されており、且つ、異なる受容体分子が異なる波長において蛍光を発するため、非常に多数の異なるプローブの多重化を得ることは、実際には困難であろう。例えば、ＦＲＥＴをリアルタイムで使用してＰＣＲのプロセスを監視する際には、略４つという実際的な限度が存在している。これは、蛍光の放出が、波長レンジにおいて相対的に広くなるという傾向を有しているためである。
【発明の開示】
【００１５】
本発明の実施例の第１の態様によれば、放射供給源による励起に応答したサンプルからの蛍光放射の放出を検出する装置が提供されており、この装置は、ｉ）同一期間にわたって少なくとも２つの供給源からの励起放射によってサンプルを照射するサンプル照射器であって、２つの供給源は、異なる波長の励起放射を供給している、サンプル照射器と、ｉｉ）異なる個々の変調方式に従って前述の少なくとも２つの供給源のそれぞれのものの励起放射を変調する変調構成と、ｉｉｉ）サンプルからの蛍光放射の放出を検出する放出検出器と、を有しており、放出検出器は、前述の少なくとも２つの供給源に対するサンプルの応答を別個に検出できるように、放出された放射内の前述の異なる個々の変調方式のそれぞれを検出するべく適合されている。
【００１６】
同一期間にわたって少なくとも２つの供給源からの励起放射を取り扱うことができるため、本発明の一実施例による装置は、少なくとも２つの供給源からの励起放射をサンプルに対して同一期間にわたって供給するべくサンプル照射器が設計されているという点において特徴付けられている。例えば、サンプル照射器は、サンプルに供給するために、前述の供給源の中の少なくとも１つの供給源から供給される励起放射を、前述の供給源の中の少なくとも１つのその他の供給源から供給される励起放射と共有された経路上に偏向させるべく、ハーフミラー又は２色性ミラー（ダイクロイックミラー）などの少なくとも１つの照射偏向器を有することができよう。
【００１７】
本発明の実施例の１つの固有の特徴は、異なる供給源に応答したサンプルからの放出の波長が潜在的に同一であるか又はオーバーラッピング可能であるという事実にある。当然のことながら、これは、その代わりに、異なる放出をその変調方式によって弁別可能であるためである。従って、放出検出器は、異なる共有源に応答したサンプルからの蛍光放射の放出をフィルタリングする単一の又は共有されたフィルタを有することができよう。尚、単一の又は共有されたフィルタは、システム内の雑音を低減するのに有用ではあるが、異なる応答を分離するべく、複数の異なるフィルタ、即ち、実際には、複数の異なる放射経路を提供する必要はない。
【００１８】
本発明の一実施例においては、蛍光応答の波長がそれぞれの供給源において同一である場合にも、同時に少なくとも２つの異なる励起源を使用することにより、サンプルを照射すると共に、供給源の中の１つのもののみによる励起に対するサンプルの蛍光応答を依然として弁別可能である。これは、サンプル放出内におけるそれぞれの放射供給源と関連した個別の変調方式を検出することによって実行可能である。従って、少なくとも２つの異なるプローブを使用することにより、同一のサンプルにおける少なくとも２つの異なるプロセス又は１つのプロセスの２つの異なる側面を検出すると共に、必要に応じて、その進捗を監視可能である。これは、サンプル放出内に１つの波長又は波長レンジしか存在しておらず、従って、サンプルが応答している励起源を弁別する方法として波長が機能しない場合にも、可能である。それぞれの個別の変調方式を使用することにより、励起源のそれぞれに応答して生成された蛍光内の波長又は波長レンジが同一である場合にもサンプル内のレポーターによって生成された蛍光内において検出可能である方式により、特定の励起源を効果的に「ラベル付け」又は刻み付けている。
【００１９】
サンプル放出内に１つの波長又は波長レンジしか存在していないが、少なくとも２つの励起源が存在している状況は、複数の異なる供与体を有するユニバーサル受容体の使用を含んでいる。従って、供与体が異なる励起源に応答しているが、たまたま同一又はオーバーラップする波長において蛍光を発するレポーターとして２つの異なる供与体を使用している（即ち、ユニバーサルクエンチャを有する）ケースにおいては、励起源を介した変調信号のインプリンティング（ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）を使用することにより、放出信号の分離分析を向上させることができる。
【００２０】
従って、その第１の態様における本発明の一実施例は、サンプルからの蛍光放射の放出を検出する蛍光共鳴エネルギー移動アッセイにおいて使用する装置を有することが可能であり、サンプルは、少なくとも２つの異なるプローブを含んでおり、それぞれのプローブは、供与体／受容体ペアを有しており、前述の少なくとも２つの供給源それぞれの励起放射の波長は、サンプル内の異なるそれぞれのプローブからの応答を励起するべく選択されており、放出検出器は、前述の少なくとも２つの供給源に対する少なくとも２つの異なるプローブの応答を別個に検出できるように、放出された放射内の前述の異なる個々の変調方式のそれぞれを検出するべく適合されている。
【００２１】
本発明の実施例において使用される変調構成の便利な形態は、放射供給源の振幅又は強度の周期的な変調を適用して個別の変調方式を付与するものである。放射供給源が発光ダイオードである場合には、これは、例えば、ダイオードに対する駆動電流における正弦波変動によって実行可能であろう。或いは、この代わりに、例えば、光電子変調器、振動シャッター、又は離隔したアパーチャを有する回転ホイールを供給源とサンプルの間の放射経路内に挿入することにより、変調を供給源の放出放射に印加することも可能であろう。この場合には、供給源によって放出される励起放射は、パルス列を有することが可能であり、変調構成は、パルス列の１つ又は複数のパラメータを制御し、その供給源用の変調方式を付与するべく適合されている。この方法において変調可能であるパルス列のパラメータは、０．１キロヘルツ〜１０メガヘルツのレンジのパルス周波数又は位相及び０．１マイクロ秒〜１０マイクロ秒のレンジのパルス幅を含んでいる。
【００２２】
複数の励起波長を使用することにより、検出可能であるサンプルによって付与される異なる応答の数を増大させることも１つの選択肢である。この場合には、放出検出器は、独立的に第１及び第２波長（又は、波長レンジ）において蛍光放射の放出を検出するべく適合可能であり、これにより、サンプルの少なくとも４つの異なる応答を、それぞれのケースにおいて、変調方式及び／又は波長により、別個に検出及び弁別可能である。異なる変調方式を使用することにより、この原理を、例えば、６つ以上の数の異なる応答に対して更に拡張可能である。
【００２３】
同時に複数の励起波長の使用を可能にすることにより、本発明の実施例は、リアルタイムＰＣＲなどのプロセスにおいて特に有用である動的な計測を実行するための能力を向上させている。リアルタイムＰＣＲは、数十秒の時間スケールにおいて発生する非特異的な熱サイクルによって誘発された蛍光の変化を伴う非常に動的なシステムである。例えば、ｐＨ、温度、及び蛍光放出の波長レンジの間には、複雑な関係が存在可能である。但し、例えば、プライマ内において又は生成物ストランドのアニーリング及びメルティングにおいて動作する使用プローブからの蛍光報告は、数十分の１秒〜数秒において発生可能である。蛍光報告をシーケンシャルにしか検出できない場合には、誤差を導入すると共に更なる時間及びサンプル材料を所要可能であるアッセイの反復の必要性を伴うことなしには、入手可能な豊富な蛍光情報を完全に取得する時間が存在しないであろう。しかしながら、本発明の実施例を使用することにより、１つを上回る、実際には、いくつかのプローブからの報告を同時に検出可能である。
【００２４】
従来は、最大で４つの異なる蛍光放出を弁別可能ではあったが、これには、多くの場合に、困難が伴っていた。本発明の一実施例を使用してそれぞれの励起源に「ラベル付け」することにより、この実際的なバリアが除去されることになり、この結果、はるかに大きな数の蛍光放出を弁別可能であり、これにより、多くの更なるプローブを同時に検出可能である。これが有効であるアッセイの例は、第１プローブを使用してサンプルＤＮＡにＰＣＲを適用し、同時に第２プローブを使用して制御ＤＮＡにＰＣＲを適用すると共に、ＰＣＲプロセスを認証するべく制御プローブをも使用している既知の「三重アッセイ（ｔｒｉｐｌｅｔ ａｓｓａｙ）」に基づいたものであろう。いくつかのアッセイにおいては、適用される複数のＰＣＲプロセスが存在すると共に、制御ＤＮＡ及び１つ又は複数の制御プローブを使用可能である。本発明の実施例は、同一のサンプル内において、且つ、同一時点において、５つ以上のすべてのこれらのプロセスの同時監視をサポートしている。
【００２５】
従って、このような検出及び／又は監視において使用される既知の励起源は、既に波長によって弁別されてはいるが、ＰＣＲプロセスの監視に供給源変調を導入することは、大きな利益を具備している。類似した又はオーバーラップする蛍光波長レンジを放出することにより、２つの異なるプローブが２つの異なる励起源に対して良好に応答可能であるため、本発明の実施においては、波長によって励起放射の供給源を弁別する能力は、プローブ放出のドメインにまで持続されないことが判明している。
【００２６】
本発明の実施例の更なる利益は、信号対雑音比の改善を通じた蛍光検出の改善された感度にある。
【００２７】
前述のように、本発明の実施例を使用することにより、１つ又は複数の計測の実行や一定の期間にわたる放出の監視などの様々な目的に、放出を検出及び弁別可能であろう。
【００２８】
本発明の実施例の第２の態様によれば、放射供給源による励起に応答して核酸増幅反応の過程においてサンプルから放出された蛍光放射を検出する装置が提供されており、この装置は、ｉ）供給源からの励起放射によってサンプルを照射するサンプル照射器と、ｉｉ）検出可能な変調方式に従って励起放射を変調する変調構成と、ｉｉｉ）サンプルからの蛍光放射の放出を検出する放出検出器と、を有しており、放出検出器は、供給源に対するサンプルの応答を、放出検出器に対する１つ又は複数のその他の放射入力の存在下において、検出できるように、放出された放射内の前述の変調方式を検出するべく適合されている。
【００２９】
その第２の態様における本発明の一実施例は、蛍光共鳴エネルギー移動を使用するプロセスにおいて、サンプル照射器は、少なくとも２つの異なる供給源からの励起放射によってサンプルを照射するべく適合されており、且つ、放出検出器は、サンプルの複数の異なる応答を検出するべく適合されており、それぞれの応答は、レポーターシステムの異なるプローブによって生成されており、それぞれのプローブは、供与体／受容体ペアを有している装置を有することが可能であろう。
【００３０】
本発明の第３の態様によれば、サンプルから蛍光放出を検出する方法が提供されており、この方法は、少なくとも２つの蛍光放出を検出する段階を有しており、少なくとも２つの放出は、異なる個々の変調方式によって区別されている。
【００３１】
その第３の態様における本発明の一実施例による方法においては、それぞれの蛍光放出の検出は、それぞれの蛍光放出に相応しい変調方式を検出することにより、別個に実行可能である。
【００３２】
その第３の態様における本発明の実施例は、その第１及び第２の態様における本発明の実施例による装置を使用することにより、適用可能であろう。本発明の一態様又は任意の一実施例との関係において記述されている任意の特徴は、適宜、本発明の１つ又は複数のその他の態様又は実施例との関係において適用可能である。
【００３３】
例えば、ＦＲＥＴ法の唯一の要件は、供与体／受容体ペアが方法又はプロセスの過程において互いの関係において移動するということであるため、本発明の実施例は、非生物学的な方法及びプロセスに用途を見出すことも可能であろう。但し、サンプルが生物学的なサンプルから構成されている多数の用途が明らかに存在している。１つのこのような用途は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅反応に基づいたプロセスである。但し、本発明の実施例の用途は、ＦＲＥＴに基づいたアッセイ及びＰＣＲプロセス以外にも広がっている。例えば、変調による放出の区別は、サンプル内の異なるコンポーネントが励起放射に対する蛍光応答によってその位置を示している蛍光に基づいた画像生成においても有用であろう。ＦＲＥＴに基づいたアッセイ及びＰＣＲプロセスと同様に、放出波長によっては容易に弁別できないが異なる励起源によって励起可能であるコンポーネントによって放出を弁別することが重要であろう。この場合にも、異なる供給源の固有の変調を、それに対する応答において検出可能であってよい。これは、ＣＣＤカメラなどの一般的な検出器が、内在的な波長弁別を欠いていると共に、感度、単純さ、及び費用の観点における結果としてのペナルティを伴う色分離を実現するためのフィルタ構成を必要としている画像生成アプリケーションにおいて特に好適であろう。
【００３４】
以下、添付の図面を参照し、一例としてのみ、本発明の一実施例として、ＰＣＲアッセイにおいて使用される蛍光放射プローブモニタについて説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
図１を参照すれば、アッセイ用のサンプルが、既知の方式において、サンプル供給入力１００を介して、キャピラリーアセンブリ１０５を構成している導電性ポリマーによってコーティングされた１５ｍｍのガラスキャピラリーに供給されている。キャピラリーアセンブリ１０５には、加熱回路１１５に対する動的なフィードバック制御のためのポリマー及び赤外線サーモパイル１１０を介して、熱を供給する加熱回路１１５が提供されている。蛍光プローブの動作の監視において使用される励起放射１７０を、個々のレンズ１４０、１５５、ハーフミラー１３５、ダイクロイックミラー１３０、及び更なるレンズ１２５を介して、２つの供給源１４５、１６０からキャピラリーアセンブリ１０５に供給している。キャピラリー自体は、ビーデッド端部（ｂｅａｄｅｄ ｅｎｄ）１２０を具備しており、これを通じて、励起放射１７０を受光すると共に、蛍光出力を供給している。このような構成は、既知のタイプである。ダイクロイックミラー１３０は、励起放射の波長を有する放射を反射するべく適合されており、従って、更なるレンズ１２５を介して励起放射をキャピラリーアセンブリ１０５に対して供給しているが、サンプル内に存在している蛍光プローブの波長を有する放射は透過している。従って、サンプルから放出された蛍光放射１７５は、更なるレンズ１２５によって集光されると共に、ダイクロイックミラー１３０により、異なる光経路に沿って放射検出器１５０に供給可能である。
【００３６】
それぞれの供給源１４５、１６０の出力において、ショートパスフィルタ１９５、１９７を使用することにより、励起放射１７０を所望の波長に制限すると共に、寄生励起を遮断している。検出器１５０への入力において、ロングパスフィルタ１９６を使用することにより、サンプル内に存在している蛍光プローブ以外の供給源からの雑音を低減している。
【００３７】
図２を参照すれば、それぞれのフィルタ１９５、１９６、１９７は、既知のタイプであり、且つ、任意選択により、いくつかの異なるフィルタリングアパーチャ２０５を有するディスク２００から構成可能である。ディスク２００を回転させることによって選択されたフィルタリングアパーチャ２０５をビームに対して提示可能であり、この結果、これを使用し、いくつかの異なる波長レンジの中のいずれかをフィルタリング可能である。図１に示されている構成においては、ロングパスフィルタ１９６のみがディスク２００を有しており、ショートパスフィルタ１９５、１９７は、それぞれ、単純なフィルタしか有していない。
【００３８】
再度図１を参照すれば、２つの供給源１４５、１６０は、それぞれ、３６０ｎｍ（紫）及び４８０ｎｍ（青）に中心を有する波長において励起放射１７０を放出している。それぞれの供給源は、駆動電流の供給によって励起放射を放出するべく駆動される発光ダイオード（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ：ＬＥＤ）を有している。駆動電流における変動は、供給される励起放射の強度を変化させることになり、それぞれの供給源１４５、１６０は、正弦波に基づいた強度の変動を示すべく、変調構成１８０を介して駆動されている。周波数はそれぞれの供給源に固有のものであり、それぞれの供給源ごとに特徴的な変調方式を生成している。例えば、紫の供給源１４５は、５ｋＨＺにおいて変調可能であり、青の供給源１６０は、１２ｋＨＺにおいて変調可能であろう。
【００３９】
尚、５ｋＨＺ及び１２ｋＨＺという前述の周波数は、一例に過ぎない。例えば、６５Ｈｚ〜１０ＭＨｚなどの広い周波数レンジ内のどこかにおいて変調を適用可能であろう。このレンジは、米国の商用電源周波数（６０Ｈｚ）を大きく上回っているところから、最大では、それを超過した場合に蛍光緩和時間（約１００ナノ秒）が有意となる周波数までをカバーしているため、適切である。
【００４０】
使用可能であるフォトダイオードの駆動電流用の好適な変調構成１８０については、既知であり、従って、本明細書においてはその詳細な説明を省略することとする。１つの変調構成１８０は、実際には、複数の駆動電流出力を具備可能であり、従って、複数のフォトダイオード１４５、１６０の駆動電流を制御可能であろう。このような構成１８０は、それぞれの出力においてフォトダイオード１４５、１６０に供給される個々の駆動電流を設定する制御ソフトウェアを内蔵可能であろう。或いは、この代わりに、変調構成１８０は、実際には、個々の駆動電流を設定するべくそれぞれのものが独立的に制御可能である複数の別個の変調構成によって表現することも可能であろう。
【００４１】
フォトダイオードに対する駆動電流の変動は、ダイオード出力における色のドリフトを生成する可能性があるが、これは、一般に、わずかであり、従って、問題にはならないであろう。但し、駆動電流の強度変調に対する１つの代替肢は、１つの又はそれぞれのフォトダイオード１４５、１６０の駆動電流に対して又は個々の出力ビームに対してオン／オフスイッチとして適用可能であるパルス幅又は反復レート変調である。この場合にも、適切な変調構成１８０については、既知であり、本明細書においては、詳細な説明を省略することとする。例えば、変調構成１８０は、１つ又は複数の出力ビームを選択的に遮断するべく、１つ又は複数の制御信号を１つ又は複数の光電変調器（図示されてはいない）に対して供給可能であろう。尚、パルスに基づいた変調は、色のドリフトを回避するが、フィルタリングによる除去を必要とすることになる高調波をシステムに導入し得る。
【００４２】
キャピラリーアセンブリ１０５内の蛍光プローブは、既知の方式により、励起放射１７０に応答して蛍光を発することになる。キャピラリーアセンブリ１０５内において発生しているプロセスの進捗及び使用されている特定のプローブに応じて、１つ又は複数のプローブからの蛍光放射が、キャピラリーのビーデッド端部１２０を介して放出され、更なるレンズ１２５を介してピックアップされると共に、ロングパスフィルタ１９６を介して放射検出器１５０に供給されている。検出器１５０の適切な既知の形態は、関連する増幅器を有するフォトダイオードであり、この結果、１つ又は複数のプローブによって監視されている１つ又は複数のプロセスの活動レベルを表す増幅された電気出力信号を供給している。この出力信号は、信号アナライザ１８５に供給されており、且つ、モニタ１９０上において観察すると共に／又は保存可能である。
【００４３】
放射検出器１５０の出力信号は、検出されている蛍光放射内の変動を反映することになる。従って、蛍光放射内の変調を生成することになる供給源の特徴的な変調方式は、検出器１５０の電気出力に継続されている。複数の供給源１４５、１６０が存在している場合には、複数の特徴的な変調方式が存在することになる。蛍光が、供給源１４５、１６０のそれぞれのものによって同一期間において刺激され、且つ、同一検出器によって検出されている場合には、これらの変調方式の両方が、検出器１５０の電気出力信号内に存在することになる。
【００４４】
図３を参照すれば、一例は、例えば、駆動電流コントローラが、５ｋＨＺにおいて変調されている第１駆動電流信号３００を第１供給源１４５に対して、そして、１２ｋＨＺにおいて変調されている第２駆動電流信号３０５を第２供給源１６０に対して生成するというものであってよいであろう。次いで、これらは、独立的に、変調された蛍光をサンプル内において生成可能であり、これが、変調された電気出力信号３１０を検出器１５０において生成することになる。電気出力信号３１０は、重畳された両方の方式の周波数、即ち、５ｋＨＺ及び１２ｋＨＺを含む更に複雑な変調を示すことになる。検出器の電気出力信号３１０内における変調方式のいずれか１つの存在又は不存在は、２つの異なる供給源１４５、１６０に対するプローブによる応答の存在又は不存在と、従って、サンプル内における関連するプロセス活動の存在又は不存在を示すことになる。
【００４５】
更に図１を参照すれば、相対的に単純な方式で検出器１５０の電気出力３１０において個々の変調方式を検出するべく、検出器出力３１０を、同期検出を提供している既知のタイプの信号アナライザ１８５に供給している。又、信号アナライザ１８５は、変調構成１８０から５ｋＨＺ及び１２ｋＨＺの第１及び第２駆動電流信号をも受信している。供給源１４５、１６０のそれぞれのものに対する別個の蛍光応答を識別するべく、これらの駆動電流信号をオシロスコープと共に使用して信号アナライザ１８５をチューニングすることにより、検出を要する２つの変調方式の周波数において検出器出力３１０をサンプリング可能である。
【００４６】
図４を参照すれば、前述のように、同期検出と共に使用される変調の一代替形態においては、変調は、この代わりに、パルス幅又は反復レートなどのパルスに基づいた変調の形態をとることができよう。図４に示されている例においては、第１変調方式は、４：５のデューティ比を具備したパルス列４００によって表されており、第２変調方式は、１：５のデューティ比を具備したパルス列４０５によって表されている。この結果、信号アナライザ１８５によって観察されるサンプル４１０の蛍光応答は、変調方式のそれぞれのものから派生した成分を提示可能であり、これらも既知の検出法によって分離可能である。
【００４７】
前述のように、蛍光放出の寿命は、１００ナノ秒のレベルである。従って、実際の最大変調周波数又はパルス反復レートは、約１０ＭＨｚとなろう。最小値は、通常、システム内における雑音の潜在的な供給源を低減するべく、商用電源周波数（英国においては５０Ｈｚであり、米国において６０Ｈｚである）を上回るように設定されることになろう。適切なパルス幅、又はパルス幅における変調は、０．１マイクロ秒〜約１０ミリ秒というレンジ内に位置することになり、これは、約１００Ｈｚ〜１０ＭＨｚのレンジの周波数ドメインにおいて検出可能である変調を生成することになる。
【００４８】
図４に示されているように、パルス幅は変調されているが、パルス反復レートは、変調方式間において同一に留まっている。或いは、この代わりに、又は、これに加えて、パルス反復レートを変化させることによって変調方式を適用することも可能であろう。
【００４９】
図５〜図７を参照すれば、いずれも同一サンプル内の、且つ、同一波長を具備したプローブの様々なペア５００の応答が示されている。プローブのそれぞれのペア５００は、変調された励起放射５０５に応答しており、この結果、変調された応答５１０を生成している。
【００５０】
それぞれのケースにおいて、２つの供給源１４５、１６０が使用されており、その１つである紫（３６０ｎｍ）は、５ｋＨＺにおいて変調されており、もう１つの青（４８０ｎｍ）は、１２ｋＨＺにおいて変調されている。図５及び図６を参照すれば、プローブの第１ペア５００は、両方とも、５２０ｎｍにおいて変調された蛍光５１０によって応答可能であり、プローブの第２ペア５００は、いずれも、６６０ｎｍにおいて変調された蛍光５１０によって応答可能であろう。プローブのこれらのペア５００は、波長によっては弁別不可能であるが、これらは、供給源に対する駆動電流の２つの変調方式である５ｋＨＺ及び１２ｋＨＺによって「ラベル付け」されているため、その個々の変調によって弁別可能である。
【００５１】
図７を参照すれば、前述のものの一変形においては、プローブのペア５００は、両方とも、ダーククエンチャＤＱ３を使用可能である。このケースにおいては、レポーターは、個々の供与体Ｄ１、Ｄ２となり、例えば、６００ｎｍ及び６２０ｎｍにおける蛍光を付与している。これらの波長は、明瞭に弁別するには、近接し過ぎている可能性があるが、この場合にも、検出された蛍光５１０は、供給源に対する駆動電流の変調方式である５ｋＨＺ及び１２ｋＨＺを保持しており、従って、弁別可能である。
【００５２】
図８を参照すれば、本発明の実施例の感度は、既知の変調されていない装置と比べて、非常に高いことが判明した。プローブ内において一般的に使用されている色素であるフルオレセインの異なる濃度を有する一連の溶液を使用することにより、変調された蛍光との関係において検出器出力において計測される電圧は、１０ｐＭのフルオレセインの濃度において雑音を上回る明瞭な信号を示し始めた。更に高い濃度においては、信号レベルが大幅に増大し、同一の傾向を検出する既知の構成によって実現されているものを数倍も上回っていた。
【００５３】
以上の説明においては、複数の異なる供給源に対するサンプルによる蛍光応答の分離は、すべての供給源によるサンプルの同時照射を使用して実行可能であり、これらの供給源及びそれらに対する個々の応答は、固有の変調方式を使用することによって「ラベル付け」されている。異なる供給源に対する応答を波長によって識別することが既に知られている。異なるレポーターは、異なる波長において蛍光を発することが可能であり、検出器１５０においてフィルタを使用することにより、一度に１つのレポーターに検出を制限することが知られている。或いは、この代わりに、例えば、複数の光検出器を有する蛍光分光計又は蛍光計を使用することにより、更に高度な検出を実行することも可能である。適切なシステムの例は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７０００、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、Ｃｅｐｈｅｉｄ ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ、及びＣｏｒｂｅｔｔ Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅである。本発明の一実施例における変調及び波長弁別を使用することにより、格段に大きな数の蛍光応答を弁別することが可能になる。従って、蛍光応答の波長特性に起因し、ＦＲＥＴに基づいたアッセイにおいて波長弁別のみを使用して最大で４つの応答しか弁別できなかった場合にも、同時に単純な変調方式を使用することにより、弁別される応答の数が、１６、又は、潜在的には、これを上回るものに到達可能である。これは、４つの変調方式及び異なる波長の４つの供給源の使用に基づいている。適切な供給源を提供するための発光ダイオードは、既に容易に入手可能である。
【００５４】
別の利点は、複数の変調方式を同時に弁別可能であるという点にある。既知のシステムにおいては、しばしば、蛍光応答の様々な波長を検出するべく、シーケンシャル検出を実行する必要がある。従って、変調方式を使用することにより、サンプルの量を低減可能であると共に、全体的なアッセイの時間を極小化可能である。
【００５５】
本発明の実施例においては、蛍光応答は、互いに弁別されるべく異なる波長である必要がないため、検出器１５０の前面のフィルタは、単純なロングパスフィルタであってよい。このような単純な光学構成は、放出フィルタを伴う既知の構成と比べて、キャピラリーチューブ１０５がマルチウェルプレートフォーマットによって置換されている場合などのその他のタイプのアッセイ構成において特に有用であろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】モニタの概略的な平面図を示している。
【図２】図１のモニタ内において使用されるフィルタの概略正面図を示している。
【図３】図１のモニタの使用の際に存在可能である２つの異なる正弦波変調方式及び可能な検出出力を示している。
【図４】図１のモニタの使用の際に存在可能である２つの異なるパルス幅変調方式及び可能な検出出力を示している。
【図５】図１のモニタを使用するアッセイにおいて使用される弁別可能なプローブの１つのペアを概略的に示している。
【図６】図１のモニタを使用するアッセイにおいて使用される弁別可能なプローブの他の１つのペアを概略的に示している。
【図７】図１のモニタを使用するアッセイにおいて使用される弁別可能なプローブの更に他の１つのペアを概略的に示している。
【図８】図１のモニタを使用することによって実現可能である検出の限度を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アッセイや画像生成に使用可能なものなどの蛍光に基づいた検出方法及び装置に関するものである。これは、蛍光顕微鏡検査用の方法及び装置、並びに、蛍光共鳴エネルギー移動に基づいた方法及び装置に具体的な用途を有している。
【背景技術】
【０００２】
発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）に基づいたアッセイ又は画像生成法においては、影響を受け易い分子を物理的、化学的、又は機械的な刺激によって励起することにより、検出可能な光を放出させている。放出光を使用することにより、分子の位置を検出可能であり、従って、これは、画像生成に使用可能であると共に／又は、これを使用することにより、プロセスにおける放出分子の関与を検出可能である。
【０００３】
便利な形態の刺激は、影響を受け易い分子を含むサンプル上に導波可能な光であり、この形態の発光を蛍光と呼んでいる。放出光は、刺激光（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｌｉｇｈｔ）のものとは異なる波長又は波長レンジを具備しており、この結果、刺激光の存在下において、相対的に容易に検出可能である。刺激光にしても、放出光にしても、必ずしも、可視スペクトルにあるものではないが、放出光を検出する適切な方法の存在が明らかに必要である。
【０００４】
蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅｓｏｎａｎｔ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）アッセイ法においては、サンプル内におけるプロセスの進捗を放出光から決定可能である。影響を受け易い部分には、２つのタイプが存在しており、これらのタイプは、供与体（ｄｏｎｏｒ）部分と受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）部分から構成されている。これらの部分は、別個の蛍光分子又は同一分子における異なるフルオロフォアグループ（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ｇｒｏｕｐ）などの様々な形態をとることが可能であり、或いは、分子の形態を具備することなしに、例えば、蛍光ビーズ又は蛍光量子ドットなどのように粒子状であってもよい。供与体は、サンプルに供給された刺激光（本明細書においては、これを「励起放射」とも呼ぶ）に応答し、独力で蛍光を発する。しかしながら、受容体が物理的に近接している場合には、双極子間における励起エネルギーの移動が発生し、この結果、供与体の蛍光が消光され、この代わりに、受容体が蛍光を発することになる。これは、しばしば、「Ｆｏｒｓｔｅｒ」共鳴エネルギー移動とも呼ばれている。エネルギー移動の程度は、供与体と受容体間の離隔距離に依存している。ＦＲＥＴアッセイ法は、供与体／受容体ペアの物理的な近接性に対するプロセスの影響に基づいたものである。それらが互いに十分に近接している際には、供与体から受容体へのエネルギーの移動が発生し、ペアの全体的な蛍光出力は、この影響を受けることになる。ペアが離隔している場合には、エネルギーの移動が減少又は停止し、ペアの全体的な蛍光出力は、異なって検出可能である。従って、サンプル内の供与体／受容体ペアの物理的な近接性を変化させるプロセスにより、サンプルから放出される光のスペクトルコンテンツの変化が生じ、これを検出することにより、プロセスの進捗の尺度が得られる。
【０００５】
供与体／受容体ペアを含む影響を受け易いフルオロフォアは、しばしば、「プローブ」と呼ばれる構造に組み込まれている。プローブは、特定の方式によってサンプル内において振舞い、この結果、そのプローブの場所から放出される蛍光が有用な情報を付与することになるという特性を具備している。例えば、プローブは、蛍光がそれらのサイトを示すことになる特定のサイトを占有可能であろう。ＦＲＥＴにおいては、プローブは、しばしば、アッセイの対象であるプロセスによって構築又は分割されるように、選択されており、供与体及び受容体は、プローブの構築又は分割に伴って近接又は離隔するように、プローブの異なる部分に配置されている。或いは、この代わりに、プローブは、複数のコンポーネントを具備することも可能であり、これらのコンポーネントは、それぞれ、供与体及び受容体を保持すると共に、アッセイの対象であるプロセスによって接近又は離隔することになる。
【０００６】
供与体及び受容体フルオロフォアを提供する材料は、しばしば、色素と呼ばれており、このような色素の周知の例には、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（青励起、緑放出：通常、供与体として使用されている）及びローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）（緑励起、赤放出：通常、受容体として使用されている）が含まれている。
【０００７】
供与体／受容体ペアの物理的な近接性における変化は、様々な方法によって検出可能である。受容体は、供与体からエネルギーを受容した際に、独力で、但し、供与体が蛍光を発するものとは異なる波長において、蛍光を発することができる。従って、供与体又は受容体のこの波長における蛍光出力のレベルの変化を計測することにより、物理的な近接性の変化を検出可能である。供与体であるか受容体であるかを問わず、この変化を検出するべく監視されるものを「レポーター」と呼んでいる。いくつかの受容体は、それ自体は蛍光を発することなしに、供与体の蛍光を「消光」しているのみである。これらは、「ダーククエンチャ（ｄａｒｋ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）」と呼ばれており、この場合には、必然的に供与体がレポーターである。レポーターを内蔵している監視又は検出構成は、一般的に、レポーターシステムと呼称可能である。
【０００８】
又、受容体分子は、しばしば、「レセプタ」とも呼ばれているが、監視対象のプロセスに応じて、そのプロセスのその他の要素と混同される可能性があり、本明細書においては、受容体という用語を一般的に使用することとする。
【０００９】
ＦＲＥＴ法を使用して監視可能なプロセスには、蛋白質−蛋白質相互作用、核酸−核酸相互作用、及び蛋白質−核酸相互作用が含まれる。例えば、細胞膜内におけるレセプタに対する上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）のバインディングにおいては、この際に、レセプタが二量化し、ＥＧＦの個々の単位のいくつかのものに、供与体分子及び受容体分子として標識が予め付与される。この膜内におけるレセプタの二量化により、少なくともいくつかの供与体／受容体分子ペアが近接し、これにより、前述のように、サンプルから放出される光のスペクトルコンテンツにおける検出可能な変化が発生する。２つの蛍光標識抗体を使用して抗原に対する同時バインディングを通じてＦＲＥＴペアを形成し、抗体−抗原−抗体挟持複合体を形成することにより、或いは、ビーズの表面に固定されたキャプチャー抗体の作用因子を通じて抗原の存在下において蛍光ビーズの近傍に蛍光標識抗体を移動させることなどにより、同様の原理によって免疫アッセイ（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を構築可能である。核酸相互作用の観点においては、細胞及び組織の染色のためのＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）において、（特に、「ＤＮＡチップ」におけるアレイフォーマットの）核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（ｎｕｃｌｅｉ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）において、並びに、供与体／受容体ペアを含むシーケンス固有のプローブを試薬マスターミックスに追加可能であるＤＮＡ複製酵素の動作の検出において、ＦＲＥＴ標識試薬を使用可能である。酵素は、ＤＮＡに沿って移動するのに伴ってプローブと遭遇し、これを開裂させ、これにより、供与体／受容体ペアを分離し、前述のように、この場合にも、放出光のスペクトルコンテンツにおける変化を引き起こす。
【００１０】
酵素がＤＮＡを複製する既知のプロセスの非常に良好な例がポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）であり、この場合には、サンプルＤＮＡの二重螺旋が、そのヌクレオチドの２つのストランド（ｓｔｒａｎｄ）に変性し、次いで、それぞれのストランドをポリメラーゼの働きによって複写し、２つの新しい二重螺旋を生成している。このプロセスをいくつかの加熱及び冷却サイクルを使用して反復することにより、サンプルＤＮＡの量における大きな増大を得ている。この複写プロセスは、テンプレートとして使用されるそれぞれのストランドに対して「プライマ」をバインドすることによってトリガされている。プライマとは、ＤＮＡの変性ストランド内においてヌクレオチドの相補的なシーケンスに対してバインド可能である特定の順序のヌクレオチドの単一チェーンである。次いで、このプライマから開始し、ポリメラーゼは、テンプレートストランドを「判読」すると共に、これを相補的なヌクレオチドと非常に迅速に一致させることができる。この結果が、最初のものに代わる２つの新しい螺旋であり、このそれぞれは、オリジナルのストランドの中の１つのものにその新しく組み立てられた相補的なストランドを加えたものから構成されている。
【００１１】
又、ＰＣＲプロセスを監視するべく、１つ又は複数のプローブをＤＮＡの変性ストランドにバインドしている。プローブは、プライマと同一の原理を踏襲しているが、複写をトリガすることはない。この代わりに、これは、供与体、受容体、又はこれらの両方を保持しており、且つ、ストランドに沿った１つ又は複数の位置にバインドする。この結果、これが、プライマからストランドに沿って進入するのに伴ってポリメラーゼによって加水分解された場合に、結果的に供与体／受容体ペアが分離され、ＦＲＥＴに対する計測可能な変化を検出可能である。
【００１２】
供与体／受容体ペアを使用しており、且つ、従って、ＦＲＥＴに基づいたアッセイにおいて有用であるその他のプローブには、ターゲットコードがストランド内に存在している場合にストランドに沿って隣接位置にバインドすることによって物理的な近接状態となった異なる構造上に供与体及び受容体が保持されたデュアルハイブリダイゼーションを使用するプローブ、ループせずにストランドに対してバインドし、これにより、供与体／受容体ペアを分離するループ構造のそれぞれの端部に供与体及び受容体が保持された「分子ビーコン」、並びに、供与体／受容体ペアが標識プローブ及び挿入色素である「Ｒｅｓｏｎｓｅｎｓｅ（登録商標）」が含まれている。
【００１３】
ＰＣＲプロセス及びＦＲＥＴアッセイ法については、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から２００４年に出版されたＥｄｗａｒｄｓ、Ｌｏｇａｎ、及びＳａｕｎｄｅｒｓ編集による「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ： Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ」（ＩＳＢＮ ０−９５４５２３２−７−Ｘ）に記述されている。これからわかるように、１つのサンプルに関する計測値を多重化することが知られている。サンプル内において発生可能である複数のプロセスが存在可能であり、これらは、異なるプローブを使用して別個に検出可能であり、そして、これらのプローブは、異なる供与体／受容体ペアの組み合わせを保持することによって「ラベル付け」されている。例えば、供与体／受容体ペアは、異なる供与体分子の使用、異なる波長レンジにおける蛍光発光、又は異なる受容体分子の使用という点において異なることができる。複数のタイプの供与体が存在する場合には、１つのタイプの受容体分子が複数のタイプの供与体から共鳴エネルギーを受容する「ユニバーサル受容体」を使用することが知られている。受容体の蛍光のものである１つの波長を検出するだけでよいため、ユニバーサル受容体法によれば、検出が単純化される。供与体のタイプに応じて、複数波長の励起放射を提供する必要があろう。同様に、複数のタイプの受容体が存在する場合には、１つの供与体の共鳴エネルギーを複数の受容体によって受容可能である「ユニバーサル供与体」法を使用することも知られている。それぞれのプローブタイプは、同一の供与体を保持可能であるが、個々の受容体の蛍光波長レンジにより、異なるプローブタイプを弁別可能である。ユニバーサル供与体法及びユニバーサル受容体法は、いずれも、複数のユニバーサル供与体及び／又は受容体を使用することにより、プローブのグループが同一の供与体又は受容体を共有するように、拡張可能である。
【００１４】
ユニバーサル受容体フォーマットを使用する既知の構成においては、受容体分子が、異なる供与体のそれぞれに応答し、同一の方法によって蛍光を発することになるため、受容体の蛍光を計測することにより、異なるプローブからの応答を互いに直接的に弁別することはできない。従って、例えば、一連の異なる励起波長において計測をシーケンシャルに実行してきた。この結果、核酸増幅反応などのプロセスにおける蛍光の変化の連続的な監視が不可能であった。異なる励起波長に対するサンプルの蛍光応答を直接的に弁別可能である場合にも、例えば、異なる供与体分子は、ユニバーサル「クエンチャ」フォーマット（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ”ｑｕｅｎｃｈｅｒ” ｆｏｒｍａｔ）において、異なる波長において蛍光を発するため、或いは、ユニバーサル供与体フォーマットが使用されており、且つ、異なる受容体分子が異なる波長において蛍光を発するため、非常に多数の異なるプローブの多重化を得ることは、実際には困難であろう。例えば、ＦＲＥＴをリアルタイムで使用してＰＣＲのプロセスを監視する際には、略４つという実際的な限度が存在している。これは、蛍光の放出が、波長レンジにおいて相対的に広くなるという傾向を有しているためである。
【発明の開示】
【００１５】
本発明の実施例の第１の態様によれば、放射供給源による励起に応答したサンプルからの蛍光放射の放出を検出する装置が提供されており、この装置は、ｉ）同一期間にわたって少なくとも２つの供給源からの励起放射によってサンプルを照射するサンプル照射器であって、２つの供給源は、異なる波長の励起放射を供給している、サンプル照射器と、ｉｉ）異なる個々の変調方式に従って前述の少なくとも２つの供給源のそれぞれのものの励起放射を変調する変調構成と、ｉｉｉ）サンプルからの蛍光放射の放出を検出する放出検出器と、を有しており、放出検出器は、前述の少なくとも２つの供給源に対するサンプルの応答を別個に検出できるように、放出された放射内の前述の異なる個々の変調方式のそれぞれを検出するべく適合されている。
【００１６】
同一期間にわたって少なくとも２つの供給源からの励起放射を取り扱うことができるため、本発明の一実施例による装置は、少なくとも２つの供給源からの励起放射をサンプルに対して同一期間にわたって供給するべくサンプル照射器が設計されているという点において特徴付けられている。例えば、サンプル照射器は、サンプルに供給するために、前述の供給源の中の少なくとも１つの供給源から供給される励起放射を、前述の供給源の中の少なくとも１つのその他の供給源から供給される励起放射と共有された経路上に偏向させるべく、ハーフミラー又は２色性ミラー（ダイクロイックミラー）などの少なくとも１つの照射偏向器を有することができよう。
【００１７】
本発明の実施例の１つの固有の特徴は、異なる供給源に応答したサンプルからの放出の波長が潜在的に同一であるか又はオーバーラッピング可能であるという事実にある。当然のことながら、これは、その代わりに、異なる放出をその変調方式によって弁別可能であるためである。従って、放出検出器は、異なる共有源に応答したサンプルからの蛍光放射の放出をフィルタリングする単一の又は共有されたフィルタを有することができよう。尚、単一の又は共有されたフィルタは、システム内の雑音を低減するのに有用ではあるが、異なる応答を分離するべく、複数の異なるフィルタ、即ち、実際には、複数の異なる放射経路を提供する必要はない。
【００１８】
本発明の一実施例においては、蛍光応答の波長がそれぞれの供給源において同一である場合にも、同時に少なくとも２つの異なる励起源を使用することにより、サンプルを照射すると共に、供給源の中の１つのもののみによる励起に対するサンプルの蛍光応答を依然として弁別可能である。これは、サンプル放出内におけるそれぞれの放射供給源と関連した個別の変調方式を検出することによって実行可能である。従って、少なくとも２つの異なるプローブを使用することにより、同一のサンプルにおける少なくとも２つの異なるプロセス又は１つのプロセスの２つの異なる側面を検出すると共に、必要に応じて、その進捗を監視可能である。これは、サンプル放出内に１つの波長又は波長レンジしか存在しておらず、従って、サンプルが応答している励起源を弁別する方法として波長が機能しない場合にも、可能である。それぞれの個別の変調方式を使用することにより、励起源のそれぞれに応答して生成された蛍光内の波長又は波長レンジが同一である場合にもサンプル内のレポーターによって生成された蛍光内において検出可能である方式により、特定の励起源を効果的に「ラベル付け」又は刻み付けている。
【００１９】
サンプル放出内に１つの波長又は波長レンジしか存在していないが、少なくとも２つの励起源が存在している状況は、複数の異なる供与体を有するユニバーサル受容体の使用を含んでいる。従って、供与体が異なる励起源に応答しているが、たまたま同一又はオーバーラップする波長において蛍光を発するレポーターとして２つの異なる供与体を使用している（即ち、ユニバーサルクエンチャを有する）ケースにおいては、励起源を介した変調信号のインプリンティング（ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）を使用することにより、放出信号の分離分析を向上させることができる。
【００２０】
従って、その第１の態様における本発明の一実施例は、サンプルからの蛍光放射の放出を検出する蛍光共鳴エネルギー移動アッセイにおいて使用する装置を有することが可能であり、サンプルは、少なくとも２つの異なるプローブを含んでおり、それぞれのプローブは、供与体／受容体ペアを有しており、前述の少なくとも２つの供給源それぞれの励起放射の波長は、サンプル内の異なるそれぞれのプローブからの応答を励起するべく選択されており、放出検出器は、前述の少なくとも２つの供給源に対する少なくとも２つの異なるプローブの応答を別個に検出できるように、放出された放射内の前述の異なる個々の変調方式のそれぞれを検出するべく適合されている。
【００２１】
本発明の実施例において使用される変調構成の便利な形態は、放射供給源の振幅又は強度の周期的な変調を適用して個別の変調方式を付与するものである。放射供給源が発光ダイオードである場合には、これは、例えば、ダイオードに対する駆動電流における正弦波変動によって実行可能であろう。或いは、この代わりに、例えば、光電子変調器、振動シャッター、又は離隔したアパーチャを有する回転ホイールを供給源とサンプルの間の放射経路内に挿入することにより、変調を供給源の放出放射に印加することも可能であろう。この場合には、供給源によって放出される励起放射は、パルス列を有することが可能であり、変調構成は、パルス列の１つ又は複数のパラメータを制御し、その供給源用の変調方式を付与するべく適合されている。この方法において変調可能であるパルス列のパラメータは、０．１キロヘルツ〜１０メガヘルツのレンジのパルス周波数又は位相及び０．１マイクロ秒〜１０マイクロ秒のレンジのパルス幅を含んでいる。
【００２２】
複数の励起波長を使用することにより、検出可能であるサンプルによって付与される異なる応答の数を増大させることも１つの選択肢である。この場合には、放出検出器は、独立的に第１及び第２波長（又は、波長レンジ）において蛍光放射の放出を検出するべく適合可能であり、これにより、サンプルの少なくとも４つの異なる応答を、それぞれのケースにおいて、変調方式及び／又は波長により、別個に検出及び弁別可能である。異なる変調方式を使用することにより、この原理を、例えば、６つ以上の数の異なる応答に対して更に拡張可能である。
【００２３】
同時に複数の励起波長の使用を可能にすることにより、本発明の実施例は、リアルタイムＰＣＲなどのプロセスにおいて特に有用である動的な計測を実行するための能力を向上させている。リアルタイムＰＣＲは、数十秒の時間スケールにおいて発生する非特異的な熱サイクルによって誘発された蛍光の変化を伴う非常に動的なシステムである。例えば、ｐＨ、温度、及び蛍光放出の波長レンジの間には、複雑な関係が存在可能である。但し、例えば、プライマ内において又は生成物ストランドのアニーリング及びメルティングにおいて動作する使用プローブからの蛍光報告は、数十分の１秒〜数秒において発生可能である。蛍光報告をシーケンシャルにしか検出できない場合には、誤差を導入すると共に更なる時間及びサンプル材料を所要可能であるアッセイの反復の必要性を伴うことなしには、入手可能な豊富な蛍光情報を完全に取得する時間が存在しないであろう。しかしながら、本発明の実施例を使用することにより、１つを上回る、実際には、いくつかのプローブからの報告を同時に検出可能である。
【００２４】
従来は、最大で４つの異なる蛍光放出を弁別可能ではあったが、これには、多くの場合に、困難が伴っていた。本発明の一実施例を使用してそれぞれの励起源に「ラベル付け」することにより、この実際的なバリアが除去されることになり、この結果、はるかに大きな数の蛍光放出を弁別可能であり、これにより、多くの更なるプローブを同時に検出可能である。これが有効であるアッセイの例は、第１プローブを使用してサンプルＤＮＡにＰＣＲを適用し、同時に第２プローブを使用して制御ＤＮＡにＰＣＲを適用すると共に、ＰＣＲプロセスを認証するべく制御プローブをも使用している既知の「三重アッセイ（ｔｒｉｐｌｅｔ ａｓｓａｙ）」に基づいたものであろう。いくつかのアッセイにおいては、適用される複数のＰＣＲプロセスが存在すると共に、制御ＤＮＡ及び１つ又は複数の制御プローブを使用可能である。本発明の実施例は、同一のサンプル内において、且つ、同一時点において、５つ以上のすべてのこれらのプロセスの同時監視をサポートしている。
【００２５】
従って、このような検出及び／又は監視において使用される既知の励起源は、既に波長によって弁別されてはいるが、ＰＣＲプロセスの監視に供給源変調を導入することは、大きな利益を具備している。類似した又はオーバーラップする蛍光波長レンジを放出することにより、２つの異なるプローブが２つの異なる励起源に対して良好に応答可能であるため、本発明の実施においては、波長によって励起放射の供給源を弁別する能力は、プローブ放出のドメインにまで持続されないことが判明している。
【００２６】
本発明の実施例の更なる利益は、信号対雑音比の改善を通じた蛍光検出の改善された感度にある。
【００２７】
前述のように、本発明の実施例を使用することにより、１つ又は複数の計測の実行や一定の期間にわたる放出の監視などの様々な目的に、放出を検出及び弁別可能であろう。
【００２８】
本発明の実施例の第２の態様によれば、放射供給源による励起に応答して核酸増幅反応の過程においてサンプルから放出された蛍光放射を検出する装置が提供されており、この装置は、ｉ）供給源からの励起放射によってサンプルを照射するサンプル照射器と、ｉｉ）検出可能な変調方式に従って励起放射を変調する変調構成と、ｉｉｉ）サンプルからの蛍光放射の放出を検出する放出検出器と、を有しており、放出検出器は、供給源に対するサンプルの応答を、放出検出器に対する１つ又は複数のその他の放射入力の存在下において、検出できるように、放出された放射内の前述の変調方式を検出するべく適合されている。
【００２９】
その第２の態様における本発明の一実施例は、蛍光共鳴エネルギー移動を使用するプロセスにおいて、サンプル照射器は、少なくとも２つの異なる供給源からの励起放射によってサンプルを照射するべく適合されており、且つ、放出検出器は、サンプルの複数の異なる応答を検出するべく適合されており、それぞれの応答は、レポーターシステムの異なるプローブによって生成されており、それぞれのプローブは、供与体／受容体ペアを有している装置を有することが可能であろう。
【００３０】
本発明の第３の態様によれば、サンプルから蛍光放出を検出する方法が提供されており、この方法は、少なくとも２つの蛍光放出を検出する段階を有しており、少なくとも２つの放出は、異なる個々の変調方式によって区別されている。
【００３１】
その第３の態様における本発明の一実施例による方法においては、それぞれの蛍光放出の検出は、それぞれの蛍光放出に相応しい変調方式を検出することにより、別個に実行可能である。
【００３２】
その第３の態様における本発明の実施例は、その第１及び第２の態様における本発明の実施例による装置を使用することにより、適用可能であろう。本発明の一態様又は任意の一実施例との関係において記述されている任意の特徴は、適宜、本発明の１つ又は複数のその他の態様又は実施例との関係において適用可能である。
【００３３】
例えば、ＦＲＥＴ法の唯一の要件は、供与体／受容体ペアが方法又はプロセスの過程において互いの関係において移動するということであるため、本発明の実施例は、非生物学的な方法及びプロセスに用途を見出すことも可能であろう。但し、サンプルが生物学的なサンプルから構成されている多数の用途が明らかに存在している。１つのこのような用途は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅反応に基づいたプロセスである。但し、本発明の実施例の用途は、ＦＲＥＴに基づいたアッセイ及びＰＣＲプロセス以外にも広がっている。例えば、変調による放出の区別は、サンプル内の異なるコンポーネントが励起放射に対する蛍光応答によってその位置を示している蛍光に基づいた画像生成においても有用であろう。ＦＲＥＴに基づいたアッセイ及びＰＣＲプロセスと同様に、放出波長によっては容易に弁別できないが異なる励起源によって励起可能であるコンポーネントによって放出を弁別することが重要であろう。この場合にも、異なる供給源の固有の変調を、それに対する応答において検出可能であってよい。これは、ＣＣＤカメラなどの一般的な検出器が、内在的な波長弁別を欠いていると共に、感度、単純さ、及び費用の観点における結果としてのペナルティを伴う色分離を実現するためのフィルタ構成を必要としている画像生成アプリケーションにおいて特に好適であろう。
【００３４】
以下、添付の図面を参照し、一例としてのみ、本発明の一実施例として、ＰＣＲアッセイにおいて使用される蛍光放射プローブモニタについて説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
図１を参照すれば、アッセイ用のサンプルが、既知の方式において、サンプル供給入力１００を介して、キャピラリーアセンブリ１０５を構成している導電性ポリマーによってコーティングされた１５ｍｍのガラスキャピラリーに供給されている。キャピラリーアセンブリ１０５には、加熱回路１１５に対する動的なフィードバック制御のためのポリマー及び赤外線サーモパイル１１０を介して、熱を供給する加熱回路１１５が提供されている。蛍光プローブの動作の監視において使用される励起放射１７０を、個々のレンズ１４０、１５５、ハーフミラー１３５、ダイクロイックミラー１３０、及び更なるレンズ１２５を介して、２つの供給源１４５、１６０からキャピラリーアセンブリ１０５に供給している。キャピラリー自体は、ビーデッド端部（ｂｅａｄｅｄ ｅｎｄ）１２０を具備しており、これを通じて、励起放射１７０を受光すると共に、蛍光出力を供給している。このような構成は、既知のタイプである。ダイクロイックミラー１３０は、励起放射の波長を有する放射を反射するべく適合されており、従って、更なるレンズ１２５を介して励起放射をキャピラリーアセンブリ１０５に対して供給しているが、サンプル内に存在している蛍光プローブの波長を有する放射は透過している。従って、サンプルから放出された蛍光放射１７５は、更なるレンズ１２５によって集光されると共に、ダイクロイックミラー１３０により、異なる光経路に沿って放射検出器１５０に供給可能である。
【００３６】
それぞれの供給源１４５、１６０の出力において、ショートパスフィルタ１９５、１９７を使用することにより、励起放射１７０を所望の波長に制限すると共に、寄生励起を遮断している。検出器１５０への入力において、ロングパスフィルタ１９６を使用することにより、サンプル内に存在している蛍光プローブ以外の供給源からの雑音を低減している。
【００３７】
図２を参照すれば、それぞれのフィルタ１９５、１９６、１９７は、既知のタイプであり、且つ、任意選択により、いくつかの異なるフィルタリングアパーチャ２０５を有するディスク２００から構成可能である。ディスク２００を回転させることによって選択されたフィルタリングアパーチャ２０５をビームに対して提示可能であり、この結果、これを使用し、いくつかの異なる波長レンジの中のいずれかをフィルタリング可能である。図１に示されている構成においては、ロングパスフィルタ１９６のみがディスク２００を有しており、ショートパスフィルタ１９５、１９７は、それぞれ、単純なフィルタしか有していない。
【００３８】
再度図１を参照すれば、２つの供給源１４５、１６０は、それぞれ、３６０ｎｍ（紫）及び４８０ｎｍ（青）に中心を有する波長において励起放射１７０を放出している。それぞれの供給源は、駆動電流の供給によって励起放射を放出するべく駆動される発光ダイオード（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ：ＬＥＤ）を有している。駆動電流における変動は、供給される励起放射の強度を変化させることになり、それぞれの供給源１４５、１６０は、正弦波に基づいた強度の変動を示すべく、変調構成１８０を介して駆動されている。周波数はそれぞれの供給源に固有のものであり、それぞれの供給源ごとに特徴的な変調方式を生成している。例えば、紫の供給源１４５は、５ｋＨＺにおいて変調可能であり、青の供給源１６０は、１２ｋＨＺにおいて変調可能であろう。
【００３９】
尚、５ｋＨＺ及び１２ｋＨＺという前述の周波数は、一例に過ぎない。例えば、６５Ｈｚ〜１０ＭＨｚなどの広い周波数レンジ内のどこかにおいて変調を適用可能であろう。このレンジは、米国の商用電源周波数（６０Ｈｚ）を大きく上回っているところから、最大では、それを超過した場合に蛍光緩和時間（約１００ナノ秒）が有意となる周波数までをカバーしているため、適切である。
【００４０】
使用可能であるフォトダイオードの駆動電流用の好適な変調構成１８０については、既知であり、従って、本明細書においてはその詳細な説明を省略することとする。１つの変調構成１８０は、実際には、複数の駆動電流出力を具備可能であり、従って、複数のフォトダイオード１４５、１６０の駆動電流を制御可能であろう。このような構成１８０は、それぞれの出力においてフォトダイオード１４５、１６０に供給される個々の駆動電流を設定する制御ソフトウェアを内蔵可能であろう。或いは、この代わりに、変調構成１８０は、実際には、個々の駆動電流を設定するべくそれぞれのものが独立的に制御可能である複数の別個の変調構成によって表現することも可能であろう。
【００４１】
フォトダイオードに対する駆動電流の変動は、ダイオード出力における色のドリフトを生成する可能性があるが、これは、一般に、わずかであり、従って、問題にはならないであろう。但し、駆動電流の強度変調に対する１つの代替肢は、１つの又はそれぞれのフォトダイオード１４５、１６０の駆動電流に対して又は個々の出力ビームに対してオン／オフスイッチとして適用可能であるパルス幅又は反復レート変調である。この場合にも、適切な変調構成１８０については、既知であり、本明細書においては、詳細な説明を省略することとする。例えば、変調構成１８０は、１つ又は複数の出力ビームを選択的に遮断するべく、１つ又は複数の制御信号を１つ又は複数の光電変調器（図示されてはいない）に対して供給可能であろう。尚、パルスに基づいた変調は、色のドリフトを回避するが、フィルタリングによる除去を必要とすることになる高調波をシステムに導入し得る。
【００４２】
キャピラリーアセンブリ１０５内の蛍光プローブは、既知の方式により、励起放射１７０に応答して蛍光を発することになる。キャピラリーアセンブリ１０５内において発生しているプロセスの進捗及び使用されている特定のプローブに応じて、１つ又は複数のプローブからの蛍光放射が、キャピラリーのビーデッド端部１２０を介して放出され、更なるレンズ１２５を介してピックアップされると共に、ロングパスフィルタ１９６を介して放射検出器１５０に供給されている。検出器１５０の適切な既知の形態は、関連する増幅器を有するフォトダイオードであり、この結果、１つ又は複数のプローブによって監視されている１つ又は複数のプロセスの活動レベルを表す増幅された電気出力信号を供給している。この出力信号は、信号アナライザ１８５に供給されており、且つ、モニタ１９０上において観察すると共に／又は保存可能である。
【００４３】
放射検出器１５０の出力信号は、検出されている蛍光放射内の変動を反映することになる。従って、蛍光放射内の変調を生成することになる供給源の特徴的な変調方式は、検出器１５０の電気出力に継続されている。複数の供給源１４５、１６０が存在している場合には、複数の特徴的な変調方式が存在することになる。蛍光が、供給源１４５、１６０のそれぞれのものによって同一期間において刺激され、且つ、同一検出器によって検出されている場合には、これらの変調方式の両方が、検出器１５０の電気出力信号内に存在することになる。
【００４４】
図３を参照すれば、一例は、例えば、駆動電流コントローラが、５ｋＨＺにおいて変調されている第１駆動電流信号３００を第１供給源１４５に対して、そして、１２ｋＨＺにおいて変調されている第２駆動電流信号３０５を第２供給源１６０に対して生成するというものであってよいであろう。次いで、これらは、独立的に、変調された蛍光をサンプル内において生成可能であり、これが、変調された電気出力信号３１０を検出器１５０において生成することになる。電気出力信号３１０は、重畳された両方の方式の周波数、即ち、５ｋＨＺ及び１２ｋＨＺを含む更に複雑な変調を示すことになる。検出器の電気出力信号３１０内における変調方式のいずれか１つの存在又は不存在は、２つの異なる供給源１４５、１６０に対するプローブによる応答の存在又は不存在と、従って、サンプル内における関連するプロセス活動の存在又は不存在を示すことになる。
【００４５】
更に図１を参照すれば、相対的に単純な方式で検出器１５０の電気出力３１０において個々の変調方式を検出するべく、検出器出力３１０を、同期検出を提供している既知のタイプの信号アナライザ１８５に供給している。又、信号アナライザ１８５は、変調構成１８０から５ｋＨＺ及び１２ｋＨＺの第１及び第２駆動電流信号をも受信している。供給源１４５、１６０のそれぞれのものに対する別個の蛍光応答を識別するべく、これらの駆動電流信号をオシロスコープと共に使用して信号アナライザ１８５をチューニングすることにより、検出を要する２つの変調方式の周波数において検出器出力３１０をサンプリング可能である。
【００４６】
図４を参照すれば、前述のように、同期検出と共に使用される変調の一代替形態においては、変調は、この代わりに、パルス幅又は反復レートなどのパルスに基づいた変調の形態をとることができよう。図４に示されている例においては、第１変調方式は、４：５のデューティ比を具備したパルス列４００によって表されており、第２変調方式は、１：５のデューティ比を具備したパルス列４０５によって表されている。この結果、信号アナライザ１８５によって観察されるサンプル４１０の蛍光応答は、変調方式のそれぞれのものから派生した成分を提示可能であり、これらも既知の検出法によって分離可能である。
【００４７】
前述のように、蛍光放出の寿命は、１００ナノ秒のレベルである。従って、実際の最大変調周波数又はパルス反復レートは、約１０ＭＨｚとなろう。最小値は、通常、システム内における雑音の潜在的な供給源を低減するべく、商用電源周波数（英国においては５０Ｈｚであり、米国において６０Ｈｚである）を上回るように設定されることになろう。適切なパルス幅、又はパルス幅における変調は、０．１マイクロ秒〜約１０ミリ秒というレンジ内に位置することになり、これは、約１００Ｈｚ〜１０ＭＨｚのレンジの周波数ドメインにおいて検出可能である変調を生成することになる。
【００４８】
図４に示されているように、パルス幅は変調されているが、パルス反復レートは、変調方式間において同一に留まっている。或いは、この代わりに、又は、これに加えて、パルス反復レートを変化させることによって変調方式を適用することも可能であろう。
【００４９】
図５〜図７を参照すれば、いずれも同一サンプル内の、且つ、同一波長を具備したプローブの様々なペア５００の応答が示されている。プローブのそれぞれのペア５００は、変調された励起放射５０５に応答しており、この結果、変調された応答５１０を生成している。
【００５０】
それぞれのケースにおいて、２つの供給源１４５、１６０が使用されており、その１つである紫（３６０ｎｍ）は、５ｋＨＺにおいて変調されており、もう１つの青（４８０ｎｍ）は、１２ｋＨＺにおいて変調されている。図５及び図６を参照すれば、プローブの第１ペア５００は、両方とも、５２０ｎｍにおいて変調された蛍光５１０によって応答可能であり、プローブの第２ペア５００は、いずれも、６６０ｎｍにおいて変調された蛍光５１０によって応答可能であろう。プローブのこれらのペア５００は、波長によっては弁別不可能であるが、これらは、供給源に対する駆動電流の２つの変調方式である５ｋＨＺ及び１２ｋＨＺによって「ラベル付け」されているため、その個々の変調によって弁別可能である。
【００５１】
図７を参照すれば、前述のものの一変形においては、プローブのペア５００は、両方とも、ダーククエンチャＤＱ３を使用可能である。このケースにおいては、レポーターは、個々の供与体Ｄ１、Ｄ２となり、例えば、６００ｎｍ及び６２０ｎｍにおける蛍光を付与している。これらの波長は、明瞭に弁別するには、近接し過ぎている可能性があるが、この場合にも、検出された蛍光５１０は、供給源に対する駆動電流の変調方式である５ｋＨＺ及び１２ｋＨＺを保持しており、従って、弁別可能である。
【００５２】
図８を参照すれば、本発明の実施例の感度は、既知の変調されていない装置と比べて、非常に高いことが判明した。プローブ内において一般的に使用されている色素であるフルオレセインの異なる濃度を有する一連の溶液を使用することにより、変調された蛍光との関係において検出器出力において計測される電圧は、１０ｐＭのフルオレセインの濃度において雑音を上回る明瞭な信号を示し始めた。更に高い濃度においては、信号レベルが大幅に増大し、同一の傾向を検出する既知の構成によって実現されているものを数倍も上回っていた。
【００５３】
以上の説明においては、複数の異なる供給源に対するサンプルによる蛍光応答の分離は、すべての供給源によるサンプルの同時照射を使用して実行可能であり、これらの供給源及びそれらに対する個々の応答は、固有の変調方式を使用することによって「ラベル付け」されている。異なる供給源に対する応答を波長によって識別することが既に知られている。異なるレポーターは、異なる波長において蛍光を発することが可能であり、検出器１５０においてフィルタを使用することにより、一度に１つのレポーターに検出を制限することが知られている。或いは、この代わりに、例えば、複数の光検出器を有する蛍光分光計又は蛍光計を使用することにより、更に高度な検出を実行することも可能である。適切なシステムの例は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７０００、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、Ｃｅｐｈｅｉｄ ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ、及びＣｏｒｂｅｔｔ Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅである。本発明の一実施例における変調及び波長弁別を使用することにより、格段に大きな数の蛍光応答を弁別することが可能になる。従って、蛍光応答の波長特性に起因し、ＦＲＥＴに基づいたアッセイにおいて波長弁別のみを使用して最大で４つの応答しか弁別できなかった場合にも、同時に単純な変調方式を使用することにより、弁別される応答の数が、１６、又は、潜在的には、これを上回るものに到達可能である。これは、４つの変調方式及び異なる波長の４つの供給源の使用に基づいている。適切な供給源を提供するための発光ダイオードは、既に容易に入手可能である。
【００５４】
別の利点は、複数の変調方式を同時に弁別可能であるという点にある。既知のシステムにおいては、しばしば、蛍光応答の様々な波長を検出するべく、シーケンシャル検出を実行する必要がある。従って、変調方式を使用することにより、サンプルの量を低減可能であると共に、全体的なアッセイの時間を極小化可能である。
【００５５】
本発明の実施例においては、蛍光応答は、互いに弁別されるべく異なる波長である必要がないため、検出器１５０の前面のフィルタは、単純なロングパスフィルタであってよい。このような単純な光学構成は、放出フィルタを伴う既知の構成と比べて、キャピラリーチューブ１０５がマルチウェルプレートフォーマットによって置換されている場合などのその他のタイプのアッセイ構成において特に有用であろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】モニタの概略的な平面図を示している。
【図２】図１のモニタ内において使用されるフィルタの概略正面図を示している。
【図３】図１のモニタの使用の際に存在可能である２つの異なる正弦波変調方式及び可能な検出出力を示している。
【図４】図１のモニタの使用の際に存在可能である２つの異なるパルス幅変調方式及び可能な検出出力を示している。
【図５】図１のモニタを使用するアッセイにおいて使用される弁別可能なプローブの１つのペアを概略的に示している。
【図６】図１のモニタを使用するアッセイにおいて使用される弁別可能なプローブの他の１つのペアを概略的に示している。
【図７】図１のモニタを使用するアッセイにおいて使用される弁別可能なプローブの更に他の１つのペアを概略的に示している。
【図８】図１のモニタを使用することによって実現可能である検出の限度を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射供給源による励起に応答したサンプルからの蛍光放射の放出を検出する装置において、
ｉ）同一期間にわたって少なくとも２つの供給源からの励起放射によって前記サンプルを照射するサンプル照射器であって、前記２つの供給源は、異なる波長の励起放射を供給している、サンプル照射器と、
ｉｉ）異なる個々の変調方式に従って前記少なくとも２つの供給源それぞれの前記励起放射を変調する変調構成と、
ｉｉｉ）前記サンプルからの蛍光放射の放出を検出する放出検出器と、
を有しており、
前記放出検出器は、前記少なくとも２つの供給源に対する前記サンプルの応答を別個に検出できるように、放出された放射内において前記異なる個々の変調方式のそれぞれを検出するべく適合されている、ことを特徴とする装置。
【請求項２】
サンプルからの蛍光放射の放出を検出するべく蛍光共鳴エネルギー移動アッセイにおいて使用するために、前記サンプルは、少なくとも２つの異なるプローブを含んでおり、それぞれのプローブは、供与体／受容体ペアを有しており、前記少なくとも２つの供給源それぞれの前記励起放射の前記波長は、前記サンプル内の異なる個々のプローブからの応答を励起するべく選択されており、前記放出検出器は、前記少なくとも２つの供給源に対する前記少なくとも２つの異なるプローブの応答を別個に検出できるように、放出された放射内の前記異なる個々の変調方式のそれぞれを検出するべく適合されている請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記放出検出器は、第１波長における蛍光放射の放出と、第２波長における蛍光放射の放出と、を検出するべく適合されており、これにより、前記サンプルの少なくとも４つの異なる応答を、それぞれのケースにおいて、変調方式及び／又は波長により、別個に検出及び弁別可能である請求項１又は２記載の装置。
【請求項４】
前記少なくとも４つの異なる応答は、前記サンプル内の少なくとも４つの異なるプローブの応答を有する請求項３記載の装置。
【請求項５】
前記サンプル照射器は、前記同一期間にわたって２つを上回る数の供給源からの励起放射によって前記サンプルを照射するべく適合されており、前記変調構成は、異なる個々の変調方式に従って前記供給源それぞれの前記励起放射を変調するべく適合されており、これにより、前記サンプルの少なくとも６つの異なる応答を、それぞれのケースにおいて、変調方式及び／又は波長により、別個に検出及び弁別可能である請求項２〜４のいずれか一項記載の装置。
【請求項６】
前記サンプル照射器は、使用の際に、前記サンプルに供給するべく、前記供給源の中の少なくとも１つの供給源によって供給される励起放射を前記供給源の中の少なくと１つのその他の供給源によって供給される励起放射と共有された経路上に偏向させる少なくとも１つの放射偏向器を有する請求項１〜５のいずれか一項記載の装置。
【請求項７】
前記放出検出器は、前記サンプルからの蛍光放射の放出をフィルタリングするフィルタを有しており、前記異なる個々の変調方式の少なくとも２つの変調方式を示している放射が、前記装置の使用の際に、前記フィルタを介して前記同一期間にわたって検出される請求項１〜６のいずれか一項記載の装置。
【請求項８】
放射供給源による励起に応答して核酸増幅反応の過程においてサンプルから放出される蛍光放射を監視する装置において、
ｉ）供給源からの励起放射によって前記サンプルを照射するサンプル照射器と、
ｉｉ）検出可能な変調方式に従って前記励起放射を変調する変調構成と、
ｉｉｉ）前記サンプルからの蛍光放射の放出を検出する放出検出器と、
を有しており、
前記放出検出器は、前記供給源に対する前記サンプルの応答を前記放出検出器に対する１つ又は複数のその他の放射入力の存在下において検出できるように、放出された放射内の前記変調方式を検出するべく適合されている、ことを特徴とする装置。
【請求項９】
前記放出検出器は、前記サンプルの１つ又は複数の応答を検出するべく適合されており、前記１つ又は複数の応答は、蛍光共鳴エネルギー移動を使用するプロセスにおける供与体／受容体ペアを有するレポーターシステムによって生成されている請求項８記載の装置。
【請求項１０】
前記サンプル照射器は、少なくとも２つの異なる供給源からの励起放射によって前記サンプルを照射するべく適合されており、前記放出検出器は、前記サンプルの複数の異なる応答を検出するべく適合されており、それぞれの応答は、前記レポーターシステムの異なるプローブによって生成されており、それぞれのプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動を使用するプロセスにおける供与体／受容体ペアを有する請求項９記載の装置。
【請求項１１】
前記変調構成は、少なくとも１つの前記供給源の前記励起放射の強度を変調することにより、その供給源用の前記変調方式を付与するべく適合されている請求項１〜１０のいずれか一項記載の装置。
【請求項１２】
少なくとも１つの前記供給源によって放出された前記励起放射は、パルス列を有しており、前記変調構成は、前記パルス列を変調することにより、その供給源用の前記変調方式を付与するべく適合されている請求項１〜１１のいずれか一項記載の装置。
【請求項１３】
前記変調構成は、前記パルス列内のパルス幅を変調することにより、前記変調方式を付与するべく適合されている請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
前記変調構成は、前記パルス列内のパルス反復レートを変調することにより、前記変調方式を付与するべく適合されている請求項１２記載の装置。
【請求項１５】
前記変調構成は、６５Ｈｚ〜１０ＭＨｚの周波数レンジ内の周波数として検出可能である変調を提供する請求項１〜１４のいずれか一項記載の装置。
【請求項１６】
前記サンプルは、生物学的なサンプルを有する請求項１〜１５のいずれか一項記載の装置。
【請求項１７】
前記サンプルからの蛍光放射の検出される放出をもたらすプロセスは、核酸増幅反応を有する請求項１〜１６のいずれか一項記載の装置。
【請求項１８】
前記サンプルからの蛍光放射の検出される放出をもたらすプロセスは、免疫アッセイを有する請求項１〜１７のいずれか一項記載の装置。
【請求項１９】
前記サンプルからの蛍光放射の検出される放出をもたらすプロセスは、核酸ハイブリダイゼーション反応を有する請求項１〜１８のいずれか一項記載の装置。
【請求項２０】
前記サンプルからの蛍光放射の検出される放出をもたらすプロセスは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を有する請求項１〜１９のいずれか一項記載の装置。
【請求項２１】
サンプルからの蛍光放出を検出する方法において、
少なくとも２つの蛍光放出を検出する段階を有しており、
前記少なくとも２つの放出は、異なる個々の変調方式によって区別されている、ことを特徴とする方法。
【請求項１】
放射供給源による励起に応答したサンプルからの蛍光放射の放出を検出する装置において、
ｉ）同一期間にわたって少なくとも２つの供給源からの励起放射によって前記サンプルを照射するサンプル照射器であって、前記２つの供給源は、異なる波長の励起放射を供給している、サンプル照射器と、
ｉｉ）異なる個々の変調方式に従って前記少なくとも２つの供給源それぞれの前記励起放射を変調する変調構成と、
ｉｉｉ）前記サンプルからの蛍光放射の放出を検出する放出検出器と、
を有しており、
前記放出検出器は、前記少なくとも２つの供給源に対する前記サンプルの応答を別個に検出できるように、放出された放射内において前記異なる個々の変調方式のそれぞれを検出するべく適合されている、ことを特徴とする装置。
【請求項２】
サンプルからの蛍光放射の放出を検出するべく蛍光共鳴エネルギー移動アッセイにおいて使用するために、前記サンプルは、少なくとも２つの異なるプローブを含んでおり、それぞれのプローブは、供与体／受容体ペアを有しており、前記少なくとも２つの供給源それぞれの前記励起放射の前記波長は、前記サンプル内の異なる個々のプローブからの応答を励起するべく選択されており、前記放出検出器は、前記少なくとも２つの供給源に対する前記少なくとも２つの異なるプローブの応答を別個に検出できるように、放出された放射内の前記異なる個々の変調方式のそれぞれを検出するべく適合されている請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記放出検出器は、第１波長における蛍光放射の放出と、第２波長における蛍光放射の放出と、を検出するべく適合されており、これにより、前記サンプルの少なくとも４つの異なる応答を、それぞれのケースにおいて、変調方式及び／又は波長により、別個に検出及び弁別可能である請求項１又は２記載の装置。
【請求項４】
前記少なくとも４つの異なる応答は、前記サンプル内の少なくとも４つの異なるプローブの応答を有する請求項３記載の装置。
【請求項５】
前記サンプル照射器は、前記同一期間にわたって２つを上回る数の供給源からの励起放射によって前記サンプルを照射するべく適合されており、前記変調構成は、異なる個々の変調方式に従って前記供給源それぞれの前記励起放射を変調するべく適合されており、これにより、前記サンプルの少なくとも６つの異なる応答を、それぞれのケースにおいて、変調方式及び／又は波長により、別個に検出及び弁別可能である請求項２〜４のいずれか一項記載の装置。
【請求項６】
前記サンプル照射器は、使用の際に、前記サンプルに供給するべく、前記供給源の中の少なくとも１つの供給源によって供給される励起放射を前記供給源の中の少なくと１つのその他の供給源によって供給される励起放射と共有された経路上に偏向させる少なくとも１つの放射偏向器を有する請求項１〜５のいずれか一項記載の装置。
【請求項７】
前記放出検出器は、前記サンプルからの蛍光放射の放出をフィルタリングするフィルタを有しており、前記異なる個々の変調方式の少なくとも２つの変調方式を示している放射が、前記装置の使用の際に、前記フィルタを介して前記同一期間にわたって検出される請求項１〜６のいずれか一項記載の装置。
【請求項８】
放射供給源による励起に応答して核酸増幅反応の過程においてサンプルから放出される蛍光放射を監視する装置において、
ｉ）供給源からの励起放射によって前記サンプルを照射するサンプル照射器と、
ｉｉ）検出可能な変調方式に従って前記励起放射を変調する変調構成と、
ｉｉｉ）前記サンプルからの蛍光放射の放出を検出する放出検出器と、
を有しており、
前記放出検出器は、前記供給源に対する前記サンプルの応答を前記放出検出器に対する１つ又は複数のその他の放射入力の存在下において検出できるように、放出された放射内の前記変調方式を検出するべく適合されている、ことを特徴とする装置。
【請求項９】
前記放出検出器は、前記サンプルの１つ又は複数の応答を検出するべく適合されており、前記１つ又は複数の応答は、蛍光共鳴エネルギー移動を使用するプロセスにおける供与体／受容体ペアを有するレポーターシステムによって生成されている請求項８記載の装置。
【請求項１０】
前記サンプル照射器は、少なくとも２つの異なる供給源からの励起放射によって前記サンプルを照射するべく適合されており、前記放出検出器は、前記サンプルの複数の異なる応答を検出するべく適合されており、それぞれの応答は、前記レポーターシステムの異なるプローブによって生成されており、それぞれのプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動を使用するプロセスにおける供与体／受容体ペアを有する請求項９記載の装置。
【請求項１１】
前記変調構成は、少なくとも１つの前記供給源の前記励起放射の強度を変調することにより、その供給源用の前記変調方式を付与するべく適合されている請求項１〜１０のいずれか一項記載の装置。
【請求項１２】
少なくとも１つの前記供給源によって放出された前記励起放射は、パルス列を有しており、前記変調構成は、前記パルス列を変調することにより、その供給源用の前記変調方式を付与するべく適合されている請求項１〜１１のいずれか一項記載の装置。
【請求項１３】
前記変調構成は、前記パルス列内のパルス幅を変調することにより、前記変調方式を付与するべく適合されている請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
前記変調構成は、前記パルス列内のパルス反復レートを変調することにより、前記変調方式を付与するべく適合されている請求項１２記載の装置。
【請求項１５】
前記変調構成は、６５Ｈｚ〜１０ＭＨｚの周波数レンジ内の周波数として検出可能である変調を提供する請求項１〜１４のいずれか一項記載の装置。
【請求項１６】
前記サンプルは、生物学的なサンプルを有する請求項１〜１５のいずれか一項記載の装置。
【請求項１７】
前記サンプルからの蛍光放射の検出される放出をもたらすプロセスは、核酸増幅反応を有する請求項１〜１６のいずれか一項記載の装置。
【請求項１８】
前記サンプルからの蛍光放射の検出される放出をもたらすプロセスは、免疫アッセイを有する請求項１〜１７のいずれか一項記載の装置。
【請求項１９】
前記サンプルからの蛍光放射の検出される放出をもたらすプロセスは、核酸ハイブリダイゼーション反応を有する請求項１〜１８のいずれか一項記載の装置。
【請求項２０】
前記サンプルからの蛍光放射の検出される放出をもたらすプロセスは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を有する請求項１〜１９のいずれか一項記載の装置。
【請求項２１】
サンプルからの蛍光放出を検出する方法において、
少なくとも２つの蛍光放出を検出する段階を有しており、
前記少なくとも２つの放出は、異なる個々の変調方式によって区別されている、ことを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５１８６３８（Ｐ２００９−５１８６３８Ａ）
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３９０５（Ｐ２００８−５４３９０５）
【出願日】平成１８年１２月１１日（２００６．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４５９２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６６１２６
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５０６０７２０５５）エニグマ ディアグノスティックス リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１１日（２００６．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４５９２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６６１２６
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５０６０７２０５５）エニグマ ディアグノスティックス リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
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