蛍光分光分析装置
【課題】スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損のない相関曲線を取得し得る蛍光分光分析装置を提供する。
【解決手段】蛍光分光分析装置１００は顕微鏡部１１０と励起光制御部１３０と蛍光検出部１４０と信号処理部１５０と演算部１６０とを有している。顕微鏡部１１０は、対物レンズ１１４と、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラー１１６と、波長の異なる励起光を切り替えながら試料Ｓに照射する励起光照射部１２０とを有している。励起光制御部１３０は、励起光の切り替えを時間経過とともに変化させるように励起光照射部１２０を制御する。蛍光検出部１４０は、励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する波長の異なる複数の蛍光を検出する。演算部１６０は、試料Ｓに照射される励起光の波長と蛍光検出部１４０で検出される蛍光の強度とに基づいて相関分析を行なう。
【解決手段】蛍光分光分析装置１００は顕微鏡部１１０と励起光制御部１３０と蛍光検出部１４０と信号処理部１５０と演算部１６０とを有している。顕微鏡部１１０は、対物レンズ１１４と、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラー１１６と、波長の異なる励起光を切り替えながら試料Ｓに照射する励起光照射部１２０とを有している。励起光制御部１３０は、励起光の切り替えを時間経過とともに変化させるように励起光照射部１２０を制御する。蛍光検出部１４０は、励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する波長の異なる複数の蛍光を検出する。演算部１６０は、試料Ｓに照射される励起光の波長と蛍光検出部１４０で検出される蛍光の強度とに基づいて相関分析を行なう。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光分光分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ法）は、顕微鏡視野の微小観測領域内で蛍光分子のブラウン運動が作り出す光の揺らぎを解析することにより、蛍光強度の自己相関関数を求め、分子の並進拡散時間や平均分子数を解析する手法であり、例えば非特許文献１に記載されている。
【０００３】
蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）は、異なる蛍光信号間の相互相関関数を求めることにより、両者の関連性を解析する手法で、２色の蛍光色素で標識された分子間の相互作用の解析に用いられ、例えば非特許文献２、非特許文献３に詳述されている。同様の解析法に共焦点蛍光コインシデンス分析（ＣＦＣＡ法）があり、非特許文献４に詳述されている。
【０００４】
ここで、例えば相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）では、通常は光源と受光器がそれぞれ２つずつの構成で測定している。しかし、この方法（測定）では色分離フィルターで色分離を通常行うが、蛍光色素の蛍光スペクトルにクロストークが発生し、測定結果の精度が低下する。特許文献１は、励起光を交互に切り替えながらＦＣＣＳ法を実施してクロストークを解消する手法を開示している。
【非特許文献１】「蛍光相関分光法による１分子検出」金城著、蛋白質核酸酵素、1999, vol. 44, N09 1431-1438
【非特許文献２】"Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy for Multicomponent Diffusional Analysis in Solution", Petra. Schwille et al, Biophysical Journal 1997, 72, 1878-1886
【非特許文献３】A dynamic view of cellular processes by in vivo fluorescence auto- and cross-correlation spectroscopy, Petra. Schwille et al, Methods 29 (2003) 74-85
【非特許文献４】Confocal fluorescence coincidence analysis (CFCA), Winkler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 1375-1378, 1999
【特許文献１】特開２００５−２８３２６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１によるスイッチングＦＣＣＳ法は、クロストークを解消するが、特定の遅延時間帯（片方の蛍光強度が無い遅延時間帯）で蛍光強度データの抜けが生じる。このため、測定結果として得られる相関曲線の特定の遅延時間帯に欠損が生じ、結果的に測定結果の信頼性を低下させてしまう。
【０００６】
本発明の目的は、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損のない相関曲線を取得し得る蛍光分光分析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による蛍光分光分析装置は、波長の異なる複数の励起光を切り替えながら試料に照射する励起光照射部と、前記励起光の切り替えを時間経過とともに変化させる励起光制御部と、前記励起光の照射に応じて前記試料から発生する波長の異なる複数の蛍光を検出する蛍光検出部と、前記試料に照射される励起光の波長と前記蛍光検出部で検出される蛍光の強度とに基づいて相関分析を行なう演算部とを有している。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損のない相関曲線を取得し得る蛍光分光分析装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１０】
図１は、本発明の実施形態による蛍光分光分析装置を概略的に示している。図１に示されるように、蛍光分光分析装置１００は、顕微鏡部１１０と励起光制御部１３０と蛍光検出部１４０と信号処理部１５０と演算部１６０とを有している。顕微鏡部１１０は、試料Ｓを支持するためのステージ１１２と、ステージ１１２の下方に配置された対物レンズ１１４と、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラー１１６と、試料Ｓに照射する励起光を発生させる励起光照射部１２０とを有している。励起光照射部１２０で発生した励起光は、ダイクロイックミラー１１６と対物レンズ１１４を介して試料Ｓに照射される。試料Ｓは、励起波長の異なる複数種類の蛍光色素を含んでいる。励起光照射部１２０は、波長の異なる励起光を切り替えながら試料に照射する。励起光照射部１２０から射出される励起光の波長は、それぞれ、試料Ｓに含まれる蛍光色素の励起波長に対応している。
【００１１】
励起光制御部１３０は、波長の異なる励起光が時間をずらして排他的に試料Ｓに照射されるように励起光照射部１２０を制御する。従って、励起光照射部１２０は、波長の異なる励起光を試料Ｓの同一部位に所定のタイミングで繰り返し照射し得る。励起光制御部１３０はさらに、励起光の切り替えを時間経過とともに変化させるように励起光照射部１２０を制御する。このため励起光制御部１３０は、励起光操作信号生成部１３４と変化パターン生成部１３２とを有している。変化パターン生成部１３２は、各種パラメーターに対して、所定の値を常時出力する。各種パラメーターとは、時間経過とともに周期やデューティー比を変化させるようなパラメーターである。励起光操作信号生成部１３４は、変化パターン生成部１３２から入力される各種パラメーターの値に従って励起光操作信号を生成して励起光照射部１２０に出力する。励起光操作信号生成部１３４は、一般の任意信号発生器で構成してもよく、また、例えばＦＰＧＡを代表とするロジック回路構成で構成してもよい。
【００１２】
蛍光検出部１４０は、試料Ｓから発生する蛍光を検出する。試料Ｓからは、波長の異なる励起光の照射に応じてそれぞれ異なる波長（波長帯域）の蛍光が発生する。蛍光検出部１４０は、異なる波長ごとに蛍光を分離して検出を行なう。
【００１３】
信号処理部１５０は、蛍光検出部１４０で検出された蛍光の強度を反映した蛍光強度データを生成する。演算部１６０は、試料Ｓに照射される励起光の波長と蛍光検出部１４０で検出される蛍光の強度とに基づいて、異なる波長ごとの蛍光のゆらぎの相関分析を行なう。例えば、演算部１６０は、それぞれの蛍光に対応した蛍光検出部１４０からの出力信号同士の比較に基づいて、自己相関分析または相互相関分析または共焦点蛍光コインシデンス分析解析する。
【００１４】
図２は、励起光照射部１２０の構成例を示している。この例では、励起光照射部１２０は、複数の光源と、対物レンズ（図１参照）と、複数のダイクロイックミラーを有している。複数の光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・は、互いに波長の異なる励起光をそれぞれ発する。ダイクロイックミラー１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ，・・・は、光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・の発する励起光を、それぞれ対物レンズ１１４に向けて反射する。光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・は連続的に駆動され、波長の異なる励起光をそれぞれ発し続ける。ダイクロイックミラー１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ，・・・は、対応する光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・以外の光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・の発する励起光は透過する。励起光照射部１２０はさらに、透過帯域を制御可能な音響光学素子（ＡＯＴＦ）１２６を有している。ダイクロイックミラー１２４ａとダイクロイックミラー１１６（図１参照）との間に配置されている。また、音響光学素子１２６は、励起光制御部１３０（図１参照）から供給される励起光操作信号に従って、光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・の発する光のうちの１つを通過させる。これにより、波長の異なる励起光のうちから試料Ｓに照射する励起光を選択することができる。
【００１５】
この構成において、光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・は、こ単一の光源に置き換えられてもよい。この場合、単一の光源は、これらの光源が発する光の波長帯域の全てを含む光を発する。また、光源が単一の場合、ダイクロイックミラー１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ，・・・は不要となる。
【００１６】
図３は、励起光照射部１２０の別の構成例を示している。この例でも励起光照射部１２０は、複数の光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・と、複数のダイクロイックミラー１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ，・・・とを有している。光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・とダイクロイックミラー１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ，・・・の機能は図２の例と同様である。光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・はオンオフ制御可能である。励起光照射部１２０はさらに、発光する光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・を選択する切替器１２８を有している。切替器１２８は、図１の励起光制御部１３０から供給される励起光操作信号に従って、光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・のいずれか一つを選択的にオンにし、残りをオフにする。これにより、光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・の発する波長の異なる励起光から試料Ｓに照射する励起光を選択する。
【００１７】
図４は、蛍光検出部１４０の構成例を示している。蛍光検出部１４０は、複数のビームスプリッター１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ，・・・と、複数の蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・と、複数の受光素子１４６ａ，１４６ｂ，１４６ｃ，・・・とを有している。複数のビームスプリッター１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ，・・・は、顕微鏡部１１０から入射する蛍光を分割する。なお複数のビームスプリッター１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ，・・・に変えて、ダイクロイックミラを用いると光の利用効率を高めることができる。複数の蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・は、ビームスプリッター１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ，・・・で分割された蛍光から特定の蛍光を選択的に透過する複数の受光素子１４６ａ，１４６ｂ，１４６ｃ，・・・は、蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・を透過した蛍光をそれぞれ検出する。蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・はそれぞれ異なる透過帯域を有し、試料Ｓから発する複数の蛍光の一つを選択的に透過する。受光素子１４６ａ，１４６ｂ，１４６ｃ，・・・は、それぞれ、蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・の透過帯域に対応する波長帯域の光を受光する。
【００１８】
この構成において、複数の受光素子１４６ａ，１４６ｂ，１４６ｃ，・・・は、単一の受光素子に置き換えられてもよい。この場合、ビームスプリッター１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ，・・・は不要となる。また、蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・は、励起光の切り替えに応じて、対応する傾向蛍光フィルターが光路中に挿入されるようにしておけばよい。
【００１９】
以下、図５のフローチャートを参照しながら、本実施形態の蛍光分光分析装置の動作について説明する。続く説明では、説明を簡単にするため、二つの励起光（第１励起光と第２励起光）を切り替える例について述べる。
【００２０】
励起光制御部１３０による励起光操作信号の生成に先立って、励起光の切り替えを時間経過とともに変化させるために、励起光切り替えタイミングを設定しておく。
【００２１】
変化パターン生成部１３２は、設定された励起光切り替えタイミングに基づいて、時間経過とともに周期やデューティー比が変化するようなパラメーターについて、所定の値を常時出力する。励起光操作信号生成部１３４は、変化パターン生成部１３２から入力されるパラメーターの値に従って励起光操作信号を生成し、これを励起光照射部１２０に出力する。
【００２２】
励起光操作信号は、図６に示されるように、「０」と「１」の二値信号である。励起光照射部１２０が図２の構成の場合、音響光学素子１２６は、励起光操作信号が「０」のときに第１励起光を選択的に透過し、励起光操作信号が「１」のときに第２励起光を選択的に透過する。また、励起光照射部１２０が図３の構成の場合、切替器１２８は、励起光操作信号が「０」のときに第１励起光を発する第１光源１２２ａを選択的にオンし、励起光操作信号が「１」のときに第２励起光を発する第２光源１２２ｂを選択的にオンにする。その結果、試料Ｓに照射される励起光は、図７に示されるように、第１励起光と第２励起光が交互に切り替わるものとなる。
【００２３】
さらに励起光操作信号は、例えば、図６に示されるように、互いに周期が異なるブロック１とブロック２とを繰り返したものとなっている。これにより、励起光照射部１２０は、第１励起光と第２励起光の切り替え周期をブロックごとに変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。ここでは、励起光操作信号は、２つのブロックの繰り返しになっているが、周期がそれぞれ異なる３つ以上のブロックの繰り返してであってもよい。つまり、励起光操作信号は、一定の時間間隔のブロックごとに、その周期が異なっている。これにより、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔のブロックごとに、励起光の切り替えの周期を変更する。
【００２４】
励起光の照射に応じて試料Ｓから蛍光が発生する。第１受光素子１４６ａは、第１励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する第１蛍光を検出し、図７に示される第１蛍光検出信号を信号処理部１５０に出力する。第２受光素子１４６ｂは、第２励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する第２蛍光を検出し、図７に示される第２蛍光検出信号を信号処理部１５０に出力する。
【００２５】
信号処理部１５０には、蛍光検出部１４０の第１受光素子１４６ａと第２受光素子１４６ｂから、それぞれ第１蛍光検出信号と第２蛍光検出信号が供給される。信号処理部１５０は、供給された第１蛍光検出信号と第２蛍光検出信号を一定時間ごとの蛍光強度信号に変換し、その蛍光強度信号と励起光制御信号を最適な形で組み合わせて演算用データを生成し、これを演算部１６０に出力する。
【００２６】
演算部１６０は、信号処理部１５０から供給される演算用データに基づいて、自己相関分析または相互相関分析または共焦点蛍光コインシデンス分析を実施する。
【００２７】
スイッチングＦＣＣＳにおいて、波長の異なる複数の励起光を一定の周期で切り替えて測定した場合、蛍光色素が励起されていない間は、その蛍光色素に対応する蛍光強度データが欠損する。このような部分的にデータ欠損のある蛍光強度データに基づいて相関演算を行なうと、相関演算によって得られる相関曲線には欠損区間が生じる。例えば、常に図７中のブロック１の周期Ｔ１で、第１励起光と第２励起光を切り替えながら測定をおこなったとする。この場合、測定によって取得された蛍光強度データに基づいて相関分析を行なうと、図８の上段に示すように、相関曲線に欠損区間が生じる。また、常に図７中のブロック２の周期Ｔ２で、第１励起光と第２励起光を切り替えながら測定を行なったとする。この場合、測定によって取得された蛍光強度データに基づいて相関分析を行なうと、やはり、図８の中段に示すように、相関曲線に欠損区間が生じる。図８では、周期Ｔ２による相関曲線の不連続区間が、周期Ｔ１による相関曲線の連続区間に一致している。しかしながら、実際は、周期Ｔ１による相関曲線の連続区間の中のごく一部に、不連続区間が一致することになる。
【００２８】
そこで、本実施形態では、励起光の切り替えを時間経過とともに変化させながら測定を行なっている。具体的には、一定時間間隔のブロックごとに周期を変えつつ、第１励起光と第２励起光を切り替えながら相関分析を行なっている。これにより、図８の下段に示すように、蛍光強度データの欠損に起因する欠損区間のない相関曲線が得られる。
【００２９】
以下、一定の周期で複数の励起光を切り替えるスイッチングＦＣＣＳにおけるデータ欠損が発生するメカニズムについて図１２〜図２２を参照しながら説明する。続く説明では、説明を簡単にするため、２つの励起光（第１励起光と第２励起光）を切り替える例について述べる。３つ以上の励起光を切り替えるスイッチングＦＣＣＳにおいてもデータ欠損の発生メカニズムは同様である。
【００３０】
ＦＣＣＳでは、遅延時間ごとに２つの蛍光強度データ（第１蛍光強度データと第２蛍光強度データ）を積和演算する。スイッチングＦＣＣＳでは、２つの励起光が遅延時間を挟んで照射されている場合の積和演算のみを実施するが、励起光切り替え周期の倍数の遅延時間ごとに、積和演算データが存在しない部分が生じる。また、実際には励起光切り替え間際のデータを無効とするので、積和演算データの生じない遅延時間範囲はさらに拡大する。遅延時間を横軸に取ったグラフにおいてはこの遅延時間範囲ではデータの欠損が生じることになる。
【００３１】
図１２〜図１６は、さまざまな遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。図中、ｓは有効な蛍光強度データがあることを示し、ｏは有効な蛍光強度データ間の積和演算により有効な演算結果が得られていることを示し、ｘは有効な蛍光強度データがないか、または有効な演算結果がないことを示している。
【００３２】
図１７と図１８は、さまざまな遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。図１２〜図１６に示した積和演算は、図１７と図１８に示すように、第１蛍光強度データを１つずつ右にずらしながら縦の列で積和演算することと等価である。
【００３３】
図１９は、図１７と図１８に示した積和演算結果の一覧と積和演算データのグラフを示している。積和演算データ数ｓは、τ＝０では０、τ＝τ０では２、τ＝２τ０では４と、遅延時間が大きくなるにつれて増えていき、τ＝８τ０では最大の１６となる。その後は、τ＝９τ０では１４、τ＝１０τ０では１２と、遅延時間が大きくなるにつれて減っていき、τ＝１６τ０では再び０となる。その後は、τ＝１７τ０では１、τ＝１８τ０では２と、遅延時間が大きくなるにつれて増えていき、τ＝２４τ０では８となる。その後は、τ＝２５τ０では７、τ＝２６τ０では６と、遅延時間が大きくなるにつれて減っていき、τ＝３２τ０で０となり、その後は常に０となる。
【００３４】
図２０と図２１は、図１７と図１８に示した蛍光強度データ（ｄａｔａ１）のサンプリング周期の１／２のサンプリング周期で取得した蛍光強度データ（ｄａｔａ２）において、さまざまな遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【００３５】
図２２は、図２０と図２１に示した積和演算結果の一覧と積和演算データ（ｄａｔａ２）のグラフを、図１９に示した積和演算データ（ｄａｔａ２）のグラフとともに示している。積和演算データ数ｓは、τ＝０では０、τ＝τ０では５、τ＝２τ０では１０と、遅延時間が大きくなるにつれて増えていき、τ＝４τ０では最大の２０となる。その後は、τ＝５τ０では１５、τ＝６τ０では１０と、遅延時間が大きくなるにつれて減っていき、τ＝８τ０では再び０となる。その後は、τ＝９τ０では４、τ＝１０τ０では８と、遅延時間が大きくなるにつれて増えていき、τ＝１２τ０では１６となる。その後は、τ＝１３τ０では１２、τ＝１４τ０では８と、遅延時間が大きくなるにつれて減っていき、τ＝１６τ０で０となる。その後も同様に、遅延時間が大きくなるにつれて増加と減少を繰り返す。
【００３６】
ｄａｔａ１とｄａｔａ２では、共にデータの欠損が生じている。相互相関の計算では、計算の対象となるデータは、遅延時間相当分の２つのデータである。この２つのデータの片方が無効区間(上述の励起光切り替え間際のデータを無効とする区間)にあるとき、その計算値は相互相関演算の対象外として無視する。その結果、データの欠損が発生する。
【００３７】
図２２において、ｄａｔａ１とｄａｔａ２を比べて分かるように、τ＝８τ０においてｄａｔａ２にはデータ欠損があるが、ｄａｔａ１にはデータ欠損がない。従って、ｄａｔａ２のデータ欠損はｄａｔａ１を用いて補填することができる。しかし、この例では、ｄａｔａ２のサンプリング周期がｄａｔａ１のサンプリング周期の１／２なので、τ＝１６τ０においてｄａｔａ１とｄａｔａ２の両方にデータ欠損がある。このため、τ＝１６τ０におけるデータ欠損はｄａｔａ１とｄａｔａ２を組み合わせても補填できない。
【００３８】
しかし、例えばｄａｔａ２のサンプリング周期をｄａｔａ１のサンプリング周期の１／３にすれば、ｄａｔａ１にデータ欠損が生じるτ＝１６τ０においてｄａｔａ２のデータは存在する。したがって、ｄａｔａ２を用いてｄａｔａ１のτ＝１６τ０におけるデータの欠損を補填することができる。
【００３９】
欠損を補填できる条件の例としては、（１）一方の蛍光強度データのサンプリング周波数が他方の蛍光強度データのサンプリング周波数の整数倍でないこと、（２）データの欠損部分が重ならないように２つの蛍光強度データのサンプリング周波数の比が適度に大きいこと、が挙げられる。なお、（２）については、互いの遅延時間がデータの無効区間を補填しうる適度な比である、ということができる。
【００４０】
つまり、同じ遅延時間帯にｄａｔａ１とｄａｔａ２の両方にデータ欠損が生じないように各ブロック内での励起光の切り替えの周期を調整すれば、ｄａｔａ１とｄａｔａ２のデータ欠損を相互に補填することができる。これにより、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損区間のない相関曲線を取得することができる。
【００４１】
［励起光操作信号の変形例]
図９は、図６に示した励起光操作信号に代替可能な別の励起光操作信号を示している。励起光操作信号は、例えば、図９に示されるように、周期が時間経過とともに変化するブロックを繰り返したものとなっている。これにより、励起光照射部１２０は、各ブロックにおいて第１励起光と第２励起光の切り替えの各回の周期を変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。図９の例では、周期が徐々に減少しているが、周期の変化の仕方は、これに限定されるものではなく、一定の時間間隔のブロック内で周期が変化していればよい。また、周期の変化の仕方は、各ブロックで同じであるが、これに限らず、ブロックごとに異なっていてもよい。つまり、励起光操作信号は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、その周期が時間経過とともに変化している。これにより、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、励起光の切り替えの周期を時間経過とともに変更している。この場合も、二つの蛍光強度データの両方に同じ遅延時間帯に欠損が生じないように各ブロック内での励起光の切り替えの周期の変化を調整すれば、データ欠損を互いに補填することができる。これにより、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損区間のない相関曲線を取得することができる。
【００４２】
図１０は、図６に示した励起光操作信号に代替可能なまた別の励起光操作信号を示している。励起光操作信号は、例えば、図１０に示されるように、デューティー比がそれぞれ異なるブロック１とブロック２とブロック３とを繰り返したものとなっている。これにより、励起光照射部１２０は、ブロックごとに第１励起光と第２励起光の照射時間の割合を変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。ここでは、励起光操作信号は、３つのブロックの繰り返しになっているが、デューティー比がそれぞれ異なる２つまたは４つ以上のブロックの繰り返してであってもよい。つまり、励起光操作信号は、一定の時間間隔のブロックごとに、そのデューティー比が異なっている。これにより、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔のブロックごとに、励起光の切り替えのデューティー比を変更している。この場合も、二つの蛍光強度データの両方に同じ遅延時間帯に欠損が生じないように各ブロックの励起光の切り替えのデューティー比を調整すれば、データ欠損を互いに補填することができる。これにより、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損区間のない相関曲線を取得することができる。
【００４３】
図１１は、図６に示した励起光操作信号に代替可能なさらに別の励起光操作信号を示している。励起光操作信号は、例えば、図１１に示されるように、デューティー比が時間経過とともに変化するブロックを繰り返したものとなっている。これにより、励起光照射部１２０は、各ブロックにおいて第１励起光と第２励起光の切り替えの各回における第１励起光と第２励起光の照射時間の割合を変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。図１１の例では、デューティー比が一方向に（「１」が減少するように）変化しているが、デューティー比の変化の仕方は、これに限定されるものではなく、一定の時間間隔のブロック内でデューティー比が変化していればよい。また、デューティー比の変化の仕方は、各ブロックで同じであるが、これに限らず、ブロックごとに異なっていてもよい。つまり、励起光操作信号は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、そのデューティー比が時間経過とともに変化している。これにより、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、励起光の切り替えのデューティー比を時間経過とともに変更している。この場合も、二つの蛍光強度データの両方に同じ遅延時間帯に欠損が生じないように各ブロック内での励起光の切り替えのデューティー比の変化を調整すれば、データ欠損を互いに補填することができる。これにより、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損区間のない相関曲線を取得することができる。
【００４４】
さらに、励起光操作信号は、図６と図１０の組み合わせとして、周期とデューティー比がそれぞれ異なる複数のブロックを繰り返したものであってもよい。この場合、励起光照射部１２０は、ブロックごとに第１励起光と第２励起光の切り替え周期と第１励起光と第２励起光の照射時間の割合とを変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。つまり、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔のブロックごとに、励起光の切り替えの周期とデューティー比を変更する。また、図９と図１１の組み合わせとして、周期とデューティー比が時間経過とともに変化するブロックを繰り返したものであってもよい。この場合、励起光照射部１２０は、各ブロックにおいて、第１励起光と第２励起光の切り替えの各回の周期と、切り替えの各回における第１励起光と第２励起光の照射時間の割合とを変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。つまり、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、励起光の切り替えの周期とデューティー比を時間経過とともに変更する。
【００４５】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施形態による蛍光分光分析装置を概略的に示している。
【図２】図１に示した励起光照射部の構成例を示している。
【図３】図１に示した励起光照射部の別の構成例を示している。
【図４】図１に示した蛍光検出部の構成例を示している。
【図５】図１に示した蛍光分光分析装置の動作のフローチャートを示している。
【図６】励起光操作信号を示している。
【図７】図１に示した蛍光分光分析装置における信号のタイムチャートを示している。
【図８】周期Ｔ１による相関曲線と、周期Ｔ２による相関曲線と、周期Ｔ１と周期Ｔ２の切り替えによる相関曲線とを示している。
【図９】図６に示した励起光操作信号に代替可能な別の励起光操作信号を示している。
【図１０】図６に示した励起光操作信号に代替可能なまた別の励起光操作信号を示している。
【図１１】図６に示した励起光操作信号に代替可能なさらに別の励起光操作信号を示している。
【図１２】τ＝０とτ＝τ０とτ＝２τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１３】τ＝３τ０とτ＝７τ０とτ＝８τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１４】τ＝９τ０とτ＝１３τ０とτ＝１４τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１５】τ＝１５τ０とτ＝１６τ０とτ＝１７τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１６】τ＝１８τ０とτ＝１９τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１７】τ＝０とτ＝τ０とτ＝２τ０とτ＝３τ０とτ＝６τ０とτ＝７τ０とτ＝８τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１８】τ＝９τ０とτ＝１０τ０とτ＝１５τ０とτ＝１６τ０とτ＝１７τ０とτ＝２４τ０とτ＝３２τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１９】図１７と図１８に示した積和演算結果の一覧と積和演算データのグラフを示している。
【図２０】図１７と図１８に示した蛍光強度データのサンプリング周期の１／２のサンプリング周期で取得した蛍光強度データにおいて、τ＝０とτ＝τ０とτ＝２τ０とτ＝３τ０とτ＝４τ０とτ＝５τ０とτ＝６τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図２１】図１７と図１８に示した蛍光強度データのサンプリング周期の１／２のサンプリング周期で取得した蛍光強度データにおいて、τ＝７τ０とτ＝８τ０とτ＝９τ０とτ＝１０τ０とτ＝１４τ０とτ＝１５τ０とτ＝１６τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図２２】図２０と図２１に示した積和演算結果の一覧と積和演算データのグラフを、図１９に示した積和演算データのグラフとともに示している。
【符号の説明】
【００４７】
１００…蛍光分光分析装置、１１０…顕微鏡部、１１２…ステージ、１１４…対物レンズ、１１６…ダイクロイックミラー、１２０…励起光照射部、１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ…光源、１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ…ダイクロイックミラー、１２６…音響光学素子、１２８…切替器、１３０…励起光制御部、１３２…変化パターン生成部、１３４…励起光操作信号生成部、１４０…蛍光検出部、１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ…ビームスプリッター、１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ…蛍光フィルター、１４６ａ，１４６ｂ，１４６ｃ…受光素子、１５０…信号処理部、１６０…演算部。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光分光分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ法）は、顕微鏡視野の微小観測領域内で蛍光分子のブラウン運動が作り出す光の揺らぎを解析することにより、蛍光強度の自己相関関数を求め、分子の並進拡散時間や平均分子数を解析する手法であり、例えば非特許文献１に記載されている。
【０００３】
蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）は、異なる蛍光信号間の相互相関関数を求めることにより、両者の関連性を解析する手法で、２色の蛍光色素で標識された分子間の相互作用の解析に用いられ、例えば非特許文献２、非特許文献３に詳述されている。同様の解析法に共焦点蛍光コインシデンス分析（ＣＦＣＡ法）があり、非特許文献４に詳述されている。
【０００４】
ここで、例えば相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）では、通常は光源と受光器がそれぞれ２つずつの構成で測定している。しかし、この方法（測定）では色分離フィルターで色分離を通常行うが、蛍光色素の蛍光スペクトルにクロストークが発生し、測定結果の精度が低下する。特許文献１は、励起光を交互に切り替えながらＦＣＣＳ法を実施してクロストークを解消する手法を開示している。
【非特許文献１】「蛍光相関分光法による１分子検出」金城著、蛋白質核酸酵素、1999, vol. 44, N09 1431-1438
【非特許文献２】"Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy for Multicomponent Diffusional Analysis in Solution", Petra. Schwille et al, Biophysical Journal 1997, 72, 1878-1886
【非特許文献３】A dynamic view of cellular processes by in vivo fluorescence auto- and cross-correlation spectroscopy, Petra. Schwille et al, Methods 29 (2003) 74-85
【非特許文献４】Confocal fluorescence coincidence analysis (CFCA), Winkler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 1375-1378, 1999
【特許文献１】特開２００５−２８３２６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１によるスイッチングＦＣＣＳ法は、クロストークを解消するが、特定の遅延時間帯（片方の蛍光強度が無い遅延時間帯）で蛍光強度データの抜けが生じる。このため、測定結果として得られる相関曲線の特定の遅延時間帯に欠損が生じ、結果的に測定結果の信頼性を低下させてしまう。
【０００６】
本発明の目的は、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損のない相関曲線を取得し得る蛍光分光分析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による蛍光分光分析装置は、波長の異なる複数の励起光を切り替えながら試料に照射する励起光照射部と、前記励起光の切り替えを時間経過とともに変化させる励起光制御部と、前記励起光の照射に応じて前記試料から発生する波長の異なる複数の蛍光を検出する蛍光検出部と、前記試料に照射される励起光の波長と前記蛍光検出部で検出される蛍光の強度とに基づいて相関分析を行なう演算部とを有している。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損のない相関曲線を取得し得る蛍光分光分析装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１０】
図１は、本発明の実施形態による蛍光分光分析装置を概略的に示している。図１に示されるように、蛍光分光分析装置１００は、顕微鏡部１１０と励起光制御部１３０と蛍光検出部１４０と信号処理部１５０と演算部１６０とを有している。顕微鏡部１１０は、試料Ｓを支持するためのステージ１１２と、ステージ１１２の下方に配置された対物レンズ１１４と、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラー１１６と、試料Ｓに照射する励起光を発生させる励起光照射部１２０とを有している。励起光照射部１２０で発生した励起光は、ダイクロイックミラー１１６と対物レンズ１１４を介して試料Ｓに照射される。試料Ｓは、励起波長の異なる複数種類の蛍光色素を含んでいる。励起光照射部１２０は、波長の異なる励起光を切り替えながら試料に照射する。励起光照射部１２０から射出される励起光の波長は、それぞれ、試料Ｓに含まれる蛍光色素の励起波長に対応している。
【００１１】
励起光制御部１３０は、波長の異なる励起光が時間をずらして排他的に試料Ｓに照射されるように励起光照射部１２０を制御する。従って、励起光照射部１２０は、波長の異なる励起光を試料Ｓの同一部位に所定のタイミングで繰り返し照射し得る。励起光制御部１３０はさらに、励起光の切り替えを時間経過とともに変化させるように励起光照射部１２０を制御する。このため励起光制御部１３０は、励起光操作信号生成部１３４と変化パターン生成部１３２とを有している。変化パターン生成部１３２は、各種パラメーターに対して、所定の値を常時出力する。各種パラメーターとは、時間経過とともに周期やデューティー比を変化させるようなパラメーターである。励起光操作信号生成部１３４は、変化パターン生成部１３２から入力される各種パラメーターの値に従って励起光操作信号を生成して励起光照射部１２０に出力する。励起光操作信号生成部１３４は、一般の任意信号発生器で構成してもよく、また、例えばＦＰＧＡを代表とするロジック回路構成で構成してもよい。
【００１２】
蛍光検出部１４０は、試料Ｓから発生する蛍光を検出する。試料Ｓからは、波長の異なる励起光の照射に応じてそれぞれ異なる波長（波長帯域）の蛍光が発生する。蛍光検出部１４０は、異なる波長ごとに蛍光を分離して検出を行なう。
【００１３】
信号処理部１５０は、蛍光検出部１４０で検出された蛍光の強度を反映した蛍光強度データを生成する。演算部１６０は、試料Ｓに照射される励起光の波長と蛍光検出部１４０で検出される蛍光の強度とに基づいて、異なる波長ごとの蛍光のゆらぎの相関分析を行なう。例えば、演算部１６０は、それぞれの蛍光に対応した蛍光検出部１４０からの出力信号同士の比較に基づいて、自己相関分析または相互相関分析または共焦点蛍光コインシデンス分析解析する。
【００１４】
図２は、励起光照射部１２０の構成例を示している。この例では、励起光照射部１２０は、複数の光源と、対物レンズ（図１参照）と、複数のダイクロイックミラーを有している。複数の光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・は、互いに波長の異なる励起光をそれぞれ発する。ダイクロイックミラー１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ，・・・は、光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・の発する励起光を、それぞれ対物レンズ１１４に向けて反射する。光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・は連続的に駆動され、波長の異なる励起光をそれぞれ発し続ける。ダイクロイックミラー１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ，・・・は、対応する光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・以外の光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・の発する励起光は透過する。励起光照射部１２０はさらに、透過帯域を制御可能な音響光学素子（ＡＯＴＦ）１２６を有している。ダイクロイックミラー１２４ａとダイクロイックミラー１１６（図１参照）との間に配置されている。また、音響光学素子１２６は、励起光制御部１３０（図１参照）から供給される励起光操作信号に従って、光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・の発する光のうちの１つを通過させる。これにより、波長の異なる励起光のうちから試料Ｓに照射する励起光を選択することができる。
【００１５】
この構成において、光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・は、こ単一の光源に置き換えられてもよい。この場合、単一の光源は、これらの光源が発する光の波長帯域の全てを含む光を発する。また、光源が単一の場合、ダイクロイックミラー１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ，・・・は不要となる。
【００１６】
図３は、励起光照射部１２０の別の構成例を示している。この例でも励起光照射部１２０は、複数の光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・と、複数のダイクロイックミラー１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ，・・・とを有している。光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・とダイクロイックミラー１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ，・・・の機能は図２の例と同様である。光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・はオンオフ制御可能である。励起光照射部１２０はさらに、発光する光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・を選択する切替器１２８を有している。切替器１２８は、図１の励起光制御部１３０から供給される励起光操作信号に従って、光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・のいずれか一つを選択的にオンにし、残りをオフにする。これにより、光源１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，・・・の発する波長の異なる励起光から試料Ｓに照射する励起光を選択する。
【００１７】
図４は、蛍光検出部１４０の構成例を示している。蛍光検出部１４０は、複数のビームスプリッター１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ，・・・と、複数の蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・と、複数の受光素子１４６ａ，１４６ｂ，１４６ｃ，・・・とを有している。複数のビームスプリッター１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ，・・・は、顕微鏡部１１０から入射する蛍光を分割する。なお複数のビームスプリッター１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ，・・・に変えて、ダイクロイックミラを用いると光の利用効率を高めることができる。複数の蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・は、ビームスプリッター１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ，・・・で分割された蛍光から特定の蛍光を選択的に透過する複数の受光素子１４６ａ，１４６ｂ，１４６ｃ，・・・は、蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・を透過した蛍光をそれぞれ検出する。蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・はそれぞれ異なる透過帯域を有し、試料Ｓから発する複数の蛍光の一つを選択的に透過する。受光素子１４６ａ，１４６ｂ，１４６ｃ，・・・は、それぞれ、蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・の透過帯域に対応する波長帯域の光を受光する。
【００１８】
この構成において、複数の受光素子１４６ａ，１４６ｂ，１４６ｃ，・・・は、単一の受光素子に置き換えられてもよい。この場合、ビームスプリッター１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ，・・・は不要となる。また、蛍光フィルター１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ，・・・は、励起光の切り替えに応じて、対応する傾向蛍光フィルターが光路中に挿入されるようにしておけばよい。
【００１９】
以下、図５のフローチャートを参照しながら、本実施形態の蛍光分光分析装置の動作について説明する。続く説明では、説明を簡単にするため、二つの励起光（第１励起光と第２励起光）を切り替える例について述べる。
【００２０】
励起光制御部１３０による励起光操作信号の生成に先立って、励起光の切り替えを時間経過とともに変化させるために、励起光切り替えタイミングを設定しておく。
【００２１】
変化パターン生成部１３２は、設定された励起光切り替えタイミングに基づいて、時間経過とともに周期やデューティー比が変化するようなパラメーターについて、所定の値を常時出力する。励起光操作信号生成部１３４は、変化パターン生成部１３２から入力されるパラメーターの値に従って励起光操作信号を生成し、これを励起光照射部１２０に出力する。
【００２２】
励起光操作信号は、図６に示されるように、「０」と「１」の二値信号である。励起光照射部１２０が図２の構成の場合、音響光学素子１２６は、励起光操作信号が「０」のときに第１励起光を選択的に透過し、励起光操作信号が「１」のときに第２励起光を選択的に透過する。また、励起光照射部１２０が図３の構成の場合、切替器１２８は、励起光操作信号が「０」のときに第１励起光を発する第１光源１２２ａを選択的にオンし、励起光操作信号が「１」のときに第２励起光を発する第２光源１２２ｂを選択的にオンにする。その結果、試料Ｓに照射される励起光は、図７に示されるように、第１励起光と第２励起光が交互に切り替わるものとなる。
【００２３】
さらに励起光操作信号は、例えば、図６に示されるように、互いに周期が異なるブロック１とブロック２とを繰り返したものとなっている。これにより、励起光照射部１２０は、第１励起光と第２励起光の切り替え周期をブロックごとに変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。ここでは、励起光操作信号は、２つのブロックの繰り返しになっているが、周期がそれぞれ異なる３つ以上のブロックの繰り返してであってもよい。つまり、励起光操作信号は、一定の時間間隔のブロックごとに、その周期が異なっている。これにより、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔のブロックごとに、励起光の切り替えの周期を変更する。
【００２４】
励起光の照射に応じて試料Ｓから蛍光が発生する。第１受光素子１４６ａは、第１励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する第１蛍光を検出し、図７に示される第１蛍光検出信号を信号処理部１５０に出力する。第２受光素子１４６ｂは、第２励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する第２蛍光を検出し、図７に示される第２蛍光検出信号を信号処理部１５０に出力する。
【００２５】
信号処理部１５０には、蛍光検出部１４０の第１受光素子１４６ａと第２受光素子１４６ｂから、それぞれ第１蛍光検出信号と第２蛍光検出信号が供給される。信号処理部１５０は、供給された第１蛍光検出信号と第２蛍光検出信号を一定時間ごとの蛍光強度信号に変換し、その蛍光強度信号と励起光制御信号を最適な形で組み合わせて演算用データを生成し、これを演算部１６０に出力する。
【００２６】
演算部１６０は、信号処理部１５０から供給される演算用データに基づいて、自己相関分析または相互相関分析または共焦点蛍光コインシデンス分析を実施する。
【００２７】
スイッチングＦＣＣＳにおいて、波長の異なる複数の励起光を一定の周期で切り替えて測定した場合、蛍光色素が励起されていない間は、その蛍光色素に対応する蛍光強度データが欠損する。このような部分的にデータ欠損のある蛍光強度データに基づいて相関演算を行なうと、相関演算によって得られる相関曲線には欠損区間が生じる。例えば、常に図７中のブロック１の周期Ｔ１で、第１励起光と第２励起光を切り替えながら測定をおこなったとする。この場合、測定によって取得された蛍光強度データに基づいて相関分析を行なうと、図８の上段に示すように、相関曲線に欠損区間が生じる。また、常に図７中のブロック２の周期Ｔ２で、第１励起光と第２励起光を切り替えながら測定を行なったとする。この場合、測定によって取得された蛍光強度データに基づいて相関分析を行なうと、やはり、図８の中段に示すように、相関曲線に欠損区間が生じる。図８では、周期Ｔ２による相関曲線の不連続区間が、周期Ｔ１による相関曲線の連続区間に一致している。しかしながら、実際は、周期Ｔ１による相関曲線の連続区間の中のごく一部に、不連続区間が一致することになる。
【００２８】
そこで、本実施形態では、励起光の切り替えを時間経過とともに変化させながら測定を行なっている。具体的には、一定時間間隔のブロックごとに周期を変えつつ、第１励起光と第２励起光を切り替えながら相関分析を行なっている。これにより、図８の下段に示すように、蛍光強度データの欠損に起因する欠損区間のない相関曲線が得られる。
【００２９】
以下、一定の周期で複数の励起光を切り替えるスイッチングＦＣＣＳにおけるデータ欠損が発生するメカニズムについて図１２〜図２２を参照しながら説明する。続く説明では、説明を簡単にするため、２つの励起光（第１励起光と第２励起光）を切り替える例について述べる。３つ以上の励起光を切り替えるスイッチングＦＣＣＳにおいてもデータ欠損の発生メカニズムは同様である。
【００３０】
ＦＣＣＳでは、遅延時間ごとに２つの蛍光強度データ（第１蛍光強度データと第２蛍光強度データ）を積和演算する。スイッチングＦＣＣＳでは、２つの励起光が遅延時間を挟んで照射されている場合の積和演算のみを実施するが、励起光切り替え周期の倍数の遅延時間ごとに、積和演算データが存在しない部分が生じる。また、実際には励起光切り替え間際のデータを無効とするので、積和演算データの生じない遅延時間範囲はさらに拡大する。遅延時間を横軸に取ったグラフにおいてはこの遅延時間範囲ではデータの欠損が生じることになる。
【００３１】
図１２〜図１６は、さまざまな遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。図中、ｓは有効な蛍光強度データがあることを示し、ｏは有効な蛍光強度データ間の積和演算により有効な演算結果が得られていることを示し、ｘは有効な蛍光強度データがないか、または有効な演算結果がないことを示している。
【００３２】
図１７と図１８は、さまざまな遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。図１２〜図１６に示した積和演算は、図１７と図１８に示すように、第１蛍光強度データを１つずつ右にずらしながら縦の列で積和演算することと等価である。
【００３３】
図１９は、図１７と図１８に示した積和演算結果の一覧と積和演算データのグラフを示している。積和演算データ数ｓは、τ＝０では０、τ＝τ０では２、τ＝２τ０では４と、遅延時間が大きくなるにつれて増えていき、τ＝８τ０では最大の１６となる。その後は、τ＝９τ０では１４、τ＝１０τ０では１２と、遅延時間が大きくなるにつれて減っていき、τ＝１６τ０では再び０となる。その後は、τ＝１７τ０では１、τ＝１８τ０では２と、遅延時間が大きくなるにつれて増えていき、τ＝２４τ０では８となる。その後は、τ＝２５τ０では７、τ＝２６τ０では６と、遅延時間が大きくなるにつれて減っていき、τ＝３２τ０で０となり、その後は常に０となる。
【００３４】
図２０と図２１は、図１７と図１８に示した蛍光強度データ（ｄａｔａ１）のサンプリング周期の１／２のサンプリング周期で取得した蛍光強度データ（ｄａｔａ２）において、さまざまな遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【００３５】
図２２は、図２０と図２１に示した積和演算結果の一覧と積和演算データ（ｄａｔａ２）のグラフを、図１９に示した積和演算データ（ｄａｔａ２）のグラフとともに示している。積和演算データ数ｓは、τ＝０では０、τ＝τ０では５、τ＝２τ０では１０と、遅延時間が大きくなるにつれて増えていき、τ＝４τ０では最大の２０となる。その後は、τ＝５τ０では１５、τ＝６τ０では１０と、遅延時間が大きくなるにつれて減っていき、τ＝８τ０では再び０となる。その後は、τ＝９τ０では４、τ＝１０τ０では８と、遅延時間が大きくなるにつれて増えていき、τ＝１２τ０では１６となる。その後は、τ＝１３τ０では１２、τ＝１４τ０では８と、遅延時間が大きくなるにつれて減っていき、τ＝１６τ０で０となる。その後も同様に、遅延時間が大きくなるにつれて増加と減少を繰り返す。
【００３６】
ｄａｔａ１とｄａｔａ２では、共にデータの欠損が生じている。相互相関の計算では、計算の対象となるデータは、遅延時間相当分の２つのデータである。この２つのデータの片方が無効区間(上述の励起光切り替え間際のデータを無効とする区間)にあるとき、その計算値は相互相関演算の対象外として無視する。その結果、データの欠損が発生する。
【００３７】
図２２において、ｄａｔａ１とｄａｔａ２を比べて分かるように、τ＝８τ０においてｄａｔａ２にはデータ欠損があるが、ｄａｔａ１にはデータ欠損がない。従って、ｄａｔａ２のデータ欠損はｄａｔａ１を用いて補填することができる。しかし、この例では、ｄａｔａ２のサンプリング周期がｄａｔａ１のサンプリング周期の１／２なので、τ＝１６τ０においてｄａｔａ１とｄａｔａ２の両方にデータ欠損がある。このため、τ＝１６τ０におけるデータ欠損はｄａｔａ１とｄａｔａ２を組み合わせても補填できない。
【００３８】
しかし、例えばｄａｔａ２のサンプリング周期をｄａｔａ１のサンプリング周期の１／３にすれば、ｄａｔａ１にデータ欠損が生じるτ＝１６τ０においてｄａｔａ２のデータは存在する。したがって、ｄａｔａ２を用いてｄａｔａ１のτ＝１６τ０におけるデータの欠損を補填することができる。
【００３９】
欠損を補填できる条件の例としては、（１）一方の蛍光強度データのサンプリング周波数が他方の蛍光強度データのサンプリング周波数の整数倍でないこと、（２）データの欠損部分が重ならないように２つの蛍光強度データのサンプリング周波数の比が適度に大きいこと、が挙げられる。なお、（２）については、互いの遅延時間がデータの無効区間を補填しうる適度な比である、ということができる。
【００４０】
つまり、同じ遅延時間帯にｄａｔａ１とｄａｔａ２の両方にデータ欠損が生じないように各ブロック内での励起光の切り替えの周期を調整すれば、ｄａｔａ１とｄａｔａ２のデータ欠損を相互に補填することができる。これにより、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損区間のない相関曲線を取得することができる。
【００４１】
［励起光操作信号の変形例]
図９は、図６に示した励起光操作信号に代替可能な別の励起光操作信号を示している。励起光操作信号は、例えば、図９に示されるように、周期が時間経過とともに変化するブロックを繰り返したものとなっている。これにより、励起光照射部１２０は、各ブロックにおいて第１励起光と第２励起光の切り替えの各回の周期を変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。図９の例では、周期が徐々に減少しているが、周期の変化の仕方は、これに限定されるものではなく、一定の時間間隔のブロック内で周期が変化していればよい。また、周期の変化の仕方は、各ブロックで同じであるが、これに限らず、ブロックごとに異なっていてもよい。つまり、励起光操作信号は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、その周期が時間経過とともに変化している。これにより、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、励起光の切り替えの周期を時間経過とともに変更している。この場合も、二つの蛍光強度データの両方に同じ遅延時間帯に欠損が生じないように各ブロック内での励起光の切り替えの周期の変化を調整すれば、データ欠損を互いに補填することができる。これにより、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損区間のない相関曲線を取得することができる。
【００４２】
図１０は、図６に示した励起光操作信号に代替可能なまた別の励起光操作信号を示している。励起光操作信号は、例えば、図１０に示されるように、デューティー比がそれぞれ異なるブロック１とブロック２とブロック３とを繰り返したものとなっている。これにより、励起光照射部１２０は、ブロックごとに第１励起光と第２励起光の照射時間の割合を変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。ここでは、励起光操作信号は、３つのブロックの繰り返しになっているが、デューティー比がそれぞれ異なる２つまたは４つ以上のブロックの繰り返してであってもよい。つまり、励起光操作信号は、一定の時間間隔のブロックごとに、そのデューティー比が異なっている。これにより、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔のブロックごとに、励起光の切り替えのデューティー比を変更している。この場合も、二つの蛍光強度データの両方に同じ遅延時間帯に欠損が生じないように各ブロックの励起光の切り替えのデューティー比を調整すれば、データ欠損を互いに補填することができる。これにより、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損区間のない相関曲線を取得することができる。
【００４３】
図１１は、図６に示した励起光操作信号に代替可能なさらに別の励起光操作信号を示している。励起光操作信号は、例えば、図１１に示されるように、デューティー比が時間経過とともに変化するブロックを繰り返したものとなっている。これにより、励起光照射部１２０は、各ブロックにおいて第１励起光と第２励起光の切り替えの各回における第１励起光と第２励起光の照射時間の割合を変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。図１１の例では、デューティー比が一方向に（「１」が減少するように）変化しているが、デューティー比の変化の仕方は、これに限定されるものではなく、一定の時間間隔のブロック内でデューティー比が変化していればよい。また、デューティー比の変化の仕方は、各ブロックで同じであるが、これに限らず、ブロックごとに異なっていてもよい。つまり、励起光操作信号は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、そのデューティー比が時間経過とともに変化している。これにより、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、励起光の切り替えのデューティー比を時間経過とともに変更している。この場合も、二つの蛍光強度データの両方に同じ遅延時間帯に欠損が生じないように各ブロック内での励起光の切り替えのデューティー比の変化を調整すれば、データ欠損を互いに補填することができる。これにより、スイッチングＦＣＣＳ法を実施しつつも欠損区間のない相関曲線を取得することができる。
【００４４】
さらに、励起光操作信号は、図６と図１０の組み合わせとして、周期とデューティー比がそれぞれ異なる複数のブロックを繰り返したものであってもよい。この場合、励起光照射部１２０は、ブロックごとに第１励起光と第２励起光の切り替え周期と第１励起光と第２励起光の照射時間の割合とを変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。つまり、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔のブロックごとに、励起光の切り替えの周期とデューティー比を変更する。また、図９と図１１の組み合わせとして、周期とデューティー比が時間経過とともに変化するブロックを繰り返したものであってもよい。この場合、励起光照射部１２０は、各ブロックにおいて、第１励起光と第２励起光の切り替えの各回の周期と、切り替えの各回における第１励起光と第２励起光の照射時間の割合とを変えながら、第１励起光と第２励起光を切り替える。つまり、励起光制御部１３０は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、励起光の切り替えの周期とデューティー比を時間経過とともに変更する。
【００４５】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施形態による蛍光分光分析装置を概略的に示している。
【図２】図１に示した励起光照射部の構成例を示している。
【図３】図１に示した励起光照射部の別の構成例を示している。
【図４】図１に示した蛍光検出部の構成例を示している。
【図５】図１に示した蛍光分光分析装置の動作のフローチャートを示している。
【図６】励起光操作信号を示している。
【図７】図１に示した蛍光分光分析装置における信号のタイムチャートを示している。
【図８】周期Ｔ１による相関曲線と、周期Ｔ２による相関曲線と、周期Ｔ１と周期Ｔ２の切り替えによる相関曲線とを示している。
【図９】図６に示した励起光操作信号に代替可能な別の励起光操作信号を示している。
【図１０】図６に示した励起光操作信号に代替可能なまた別の励起光操作信号を示している。
【図１１】図６に示した励起光操作信号に代替可能なさらに別の励起光操作信号を示している。
【図１２】τ＝０とτ＝τ０とτ＝２τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１３】τ＝３τ０とτ＝７τ０とτ＝８τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１４】τ＝９τ０とτ＝１３τ０とτ＝１４τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１５】τ＝１５τ０とτ＝１６τ０とτ＝１７τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１６】τ＝１８τ０とτ＝１９τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１７】τ＝０とτ＝τ０とτ＝２τ０とτ＝３τ０とτ＝６τ０とτ＝７τ０とτ＝８τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１８】τ＝９τ０とτ＝１０τ０とτ＝１５τ０とτ＝１６τ０とτ＝１７τ０とτ＝２４τ０とτ＝３２τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図１９】図１７と図１８に示した積和演算結果の一覧と積和演算データのグラフを示している。
【図２０】図１７と図１８に示した蛍光強度データのサンプリング周期の１／２のサンプリング周期で取得した蛍光強度データにおいて、τ＝０とτ＝τ０とτ＝２τ０とτ＝３τ０とτ＝４τ０とτ＝５τ０とτ＝６τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図２１】図１７と図１８に示した蛍光強度データのサンプリング周期の１／２のサンプリング周期で取得した蛍光強度データにおいて、τ＝７τ０とτ＝８τ０とτ＝９τ０とτ＝１０τ０とτ＝１４τ０とτ＝１５τ０とτ＝１６τ０の遅延時間における積和演算の蛍光強度データの組み合わせと積和演算実施の結果とを示している。
【図２２】図２０と図２１に示した積和演算結果の一覧と積和演算データのグラフを、図１９に示した積和演算データのグラフとともに示している。
【符号の説明】
【００４７】
１００…蛍光分光分析装置、１１０…顕微鏡部、１１２…ステージ、１１４…対物レンズ、１１６…ダイクロイックミラー、１２０…励起光照射部、１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ…光源、１２４ａ，１２４ｂ，１２４ｃ…ダイクロイックミラー、１２６…音響光学素子、１２８…切替器、１３０…励起光制御部、１３２…変化パターン生成部、１３４…励起光操作信号生成部、１４０…蛍光検出部、１４２ａ，１４２ｂ，１４２ｃ…ビームスプリッター、１４４ａ，１４４ｂ，１４４ｃ…蛍光フィルター、１４６ａ，１４６ｂ，１４６ｃ…受光素子、１５０…信号処理部、１６０…演算部。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
波長の異なる複数の励起光を切り替えながら試料に照射する励起光照射部と、
前記励起光の切り替えを時間経過とともに変化させる励起光制御部と、
前記励起光の照射に応じて前記試料から発生する波長の異なる複数の蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記試料に照射される励起光の波長と前記蛍光検出部で検出される蛍光の強度とに基づいて相関分析を行なう演算部とを有している蛍光分光分析装置。
【請求項２】
前記励起光制御部は、一定の時間間隔のブロックごとに、前記励起光の切り替えの周期を変更する、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項３】
前記励起光制御部は、一定の時間間隔のブロックごとに、前記励起光の切り替えのデューティー比を変更する、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項４】
前記励起光制御部は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、前記励起光の切り替えのデューティー比を時間経過とともに変更する、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項５】
前記演算部は、相関分析を行う際の補完処理条件は一定である、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項６】
前記励起光学部は、前記複数の励起光を含む波長帯域の光を発する単一の光源と、この光源の発する光から前記試料に照射する励起光を選択する選択部とを有している、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項７】
前記励起光学部は、前記複数の励起光をそれぞれ発する複数の光源と、これら複数の光源の発する複数の励起光から前記試料に照射する励起光を選択する選択部とを有している、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項８】
前記選択部は、透過帯域を制御可能な音響光学素子を有している、請求項６または請求項７に記載の蛍光分光装置。
【請求項９】
前記選択部は、発光する光源を選択する光源切替部を有している、請求項７に記載の蛍光分光装置。
【請求項１０】
前記蛍光検出部は、それぞれ異なる波長帯域に感度を有する複数の受光素子を有している、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項１１】
前記蛍光検出部は、前記複数の蛍光の波長帯域を含む受光帯域を有する単一の受光素子を有している、請求項１に記載の蛍光分光装置。
【請求項１】
波長の異なる複数の励起光を切り替えながら試料に照射する励起光照射部と、
前記励起光の切り替えを時間経過とともに変化させる励起光制御部と、
前記励起光の照射に応じて前記試料から発生する波長の異なる複数の蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記試料に照射される励起光の波長と前記蛍光検出部で検出される蛍光の強度とに基づいて相関分析を行なう演算部とを有している蛍光分光分析装置。
【請求項２】
前記励起光制御部は、一定の時間間隔のブロックごとに、前記励起光の切り替えの周期を変更する、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項３】
前記励起光制御部は、一定の時間間隔のブロックごとに、前記励起光の切り替えのデューティー比を変更する、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項４】
前記励起光制御部は、一定の時間間隔の各ブロックにおいて、前記励起光の切り替えのデューティー比を時間経過とともに変更する、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項５】
前記演算部は、相関分析を行う際の補完処理条件は一定である、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項６】
前記励起光学部は、前記複数の励起光を含む波長帯域の光を発する単一の光源と、この光源の発する光から前記試料に照射する励起光を選択する選択部とを有している、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項７】
前記励起光学部は、前記複数の励起光をそれぞれ発する複数の光源と、これら複数の光源の発する複数の励起光から前記試料に照射する励起光を選択する選択部とを有している、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項８】
前記選択部は、透過帯域を制御可能な音響光学素子を有している、請求項６または請求項７に記載の蛍光分光装置。
【請求項９】
前記選択部は、発光する光源を選択する光源切替部を有している、請求項７に記載の蛍光分光装置。
【請求項１０】
前記蛍光検出部は、それぞれ異なる波長帯域に感度を有する複数の受光素子を有している、請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項１１】
前記蛍光検出部は、前記複数の蛍光の波長帯域を含む受光帯域を有する単一の受光素子を有している、請求項１に記載の蛍光分光装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２００９−１０３５２２（Ｐ２００９−１０３５２２Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７４２２４（Ｐ２００７−２７４２２４）
【出願日】平成１９年１０月２２日（２００７．１０．２２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２２日（２００７．１０．２２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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