蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子、その製造方法およびその用途
本発明は、蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子、その製造方法およびその用途に関し、詳細にはフラーレンとシリカとが共有結合で連結されている形態を含む、蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子、非極性有機溶媒および極性溶媒に界面活性剤を入れて撹拌し、逆ミセルを形成させる工程（工程１）、前記工程１で形成された逆ミセルにフラーレンを添加して撹拌する工程（工程２）、および前記工程２で製造されたフラーレンを含有する反応溶液にシリカ前駆体および触媒剤を添加して撹拌することでフラーレン−シリカナノ粒子を製造する工程（工程３）を含むフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法およびその用途に関する。本発明よると、数十ナノメートルサイズの均一な球形形状を形成するフラーレン−シリカナノ粒子を製造することができ、製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、ナノメートルサイズの構造体によって広い表面積を有するため反応性が良く、シリカを用いることで重金属や金属ナノ粒子に比べて生体に無害であり、強い蛍光を発現するため生体イメージング造影剤または薬物伝達体として有用に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子、その製造方法およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
バックミンスターフラーレン（Ｃ６０）は、６０個の炭素からなる球形形状の構造を有する安定した炭素分子である。同分子は正二十面体対称をなしており、すべての炭素の環境が同一であるが、これは１３Ｃ−ＮＭＲで単一ピークを示すことから確認された。Ｃ６０フラーレンだけでなく、Ｃ７０、Ｃ８０フラーレンも合成できるが、その量が多くないため、Ｃ６０を主に合成して研究しているのが実情である。
【０００３】
フラーレン分子は、ほぼ球形で対称の非極性分子であり、水、アルコールなどの極性溶媒には溶解せずに、ベンゼンやトルエンなどの非極性溶媒にのみよく溶解する。また、フラーレンは、光に極めて敏感な分子であり、光を受けると励起した状態になって容易にラジカルや光増感剤になることができる。フラーレンの電気化学的性質は極めて有用であり、フラーレン分子は、溶液中で６個の電子が可逆的な酸化還元を行うことができる。そればかりかフラーレンは、独特の構造によって極めて堅い性質を有しており、最近ではアルカリ金属との混入時、超伝導体になることができ、産業上もその応用性が注目されてきている。
【０００４】
フラーレンは、上述のとおり光に極めて敏感であり、特に紫外線領域（２１３、２５７、３２９ｎｍ）の光吸収率は極めて高い方である。しかし、蛍光特性は、全体的に極めて低いことが知られており、これは蛍光量子効率で表すことができる。蛍光量子効率とは、吸収された光子数に対して放出された蛍光光子をいう。フラーレンの量子効率は、常温で約１〜２×１０−４で示される。このような低い蛍光効率のために、フラーレンの蛍光を用いた応用は、成り立っていないのが実情である。そればかりでなく、独特の光学的、電気的性質を有するにもかかわらず、フラーレンはそれを応用する上でいくつかの難点を有する。有機溶媒に対する低い溶解度、自発的凝集現象などがそれである。特にフラーレンは、周辺の環境に極めて敏感であり、物理的、化学的性質が容易に変化する特徴を有しているため、これを調節するために多様な方法が開発されている。
【０００５】
その方法の中には、フラーレンをホストマトリックスにドーピングしたり、多孔性無機材料に閉じこめる方法、またはゾル−ゲル材料を用いた方法などがある。前記ゾル−ゲル法は、低い反応温度と比較的容易な化学反応でフラーレンナノ複合体を合成するのに有用である。また、フラーレンを合体したシリカエアロゲル（非特許文献１）や、多孔性ＶＩＰ−５ゼオライトにフラーレンを挟み入れたり（非特許文献２）、ゾル−ゲル法でフラーレンを含有させたガラス（非特許文献３）も製造されたりした。このようなフラーレン−シリカ複合体は、フラーレンの独特の光学的特性を活用して光学材料として活用するために製造されたが、応用された例がほとんどないのが実情である。一方、前記方法によって製造されたフラーレン複合体は、ナノ粒子形態ではないバルク状態の物質として得られる。
【０００６】
最近になってナノ科学への関心が高まるにつれて、フラーレンを用いたナノ粒子の合成に関する研究も進められた。代表的な例として、フラーレン誘導体を用いてフラーレン−シリカハイブリッドナノ構造体を合成し（非特許文献４）、酸性条件でヒドロキシル基を含んだフラーレンをシリカにコーティングするに至った（非特許文献５）。
【０００７】
しかし、製造されたフラーレン−シリカナノ複合体は、そのサイズや形状が一定せず不均一なだけでなく、フラーレンとシリカが別途のリンカーによって連結された構造を有し、このようにして得られたフラーレン−シリカナノ複合体の蛍光特性に対する研究も充分でないのが実情である。
【０００８】
したがって、前記問題点を解決するために、数十ナノメートルサイズの均一なフラーレン−シリカナノ粒子の合成、それに対する光学的性質、特にフラーレン−シリカナノ粒子の独特の蛍光に対する研究とそれを用いた技術開発が切実に求められている。
【０００９】
そこで、本発明者等は、ナノサイズの均一な形状のフラーレン−シリカナノ粒子を製造するために研究する中、逆マイクロエマルジョン法を用いてフラーレンとシリカとが別途のリンカーなしに共有結合で直接連結している数十ナノメートルサイズのフラーレン−シリカナノ粒子を合成し、それらの粒子が強い蛍光を発生することを確認し、生体イメージング造影剤または薬物伝達体として有用に用いることができることを見出して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｚｈｕ等，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｌｉｄｓ，１９９８年，第５９巻，ｐ．８１９
【非特許文献２】Ｌａｍｒａｂｔｅ等，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，１９９８年，第２９５巻，ｐ．２５７
【非特許文献３】Ｐｅｎｇ等，Ｊ．Ｓｏｌ−Ｇｅｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．２００１年，第２２巻，ｐ．２０５
【非特許文献４】Ｐａｔｗａｒｄｈａｎ等，Ｊ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００２年，第１２巻，ｐ．４９
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｓｉｔｔ等，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２００３年，ｐ．１０４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ナノサイズの均一な形状のフラーレン−シリカナノ粒子を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記フラーレン−シリカナノ粒子の製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、前記製造されたフラーレン−シリカナノ粒子を含む生体イメージング造影剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は、フラーレンとシリカとが共有結合で連結されている形態を含む、蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子を提供する。
【００１５】
また、本発明は、非極性有機溶媒および極性溶媒に界面活性剤を入れて撹拌し、逆ミセルを形成させる工程（工程１）、
前記工程１で形成された逆ミセルにフラーレンを添加して撹拌する工程（工程２）、および
前記工程２で製造されたフラーレンを含有する反応溶液にシリカ前駆体および触媒剤を添加して撹拌することで、フラーレン−シリカナノ粒子を製造する工程（工程３）を含む、フラーレン−シリカナノ粒子の製造方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、前記フラーレン−シリカナノ粒子を含む生体イメージング造影剤を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、数十ナノメートルサイズの均一な球形形状を形成するフラーレン−シリカナノ粒子を製造することができ、Ｃ６０フラーレンのみならずＣ７０、Ｃ８０等の多様なフラーレンを含むフラーレン−シリカナノ粒子を製造することができ、種々のフラーレンの濃度を有するフラーレン−シリカナノ粒子を製造することができる。このように製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、ナノメートルサイズの構造体による広い表面積を有するため、反応性が良く、シリカを用いることで重金属や金属ナノ粒子に比べて生体に無害であり、強い蛍光を発現するため生体イメージング造影剤または薬物伝達体として有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子の模式図である。
【図２】図２は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子の走査電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子の吸光および蛍光グラフである。
【図４】図４は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子とＣ６０フラーレンの蛍光グラフである。
【図５】図５は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子と中間産物であるフロロールの赤外線吸光（ＩＲ）グラフである。
【図６】図６は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子のＸ線光電子分光（ＸＰＳ）グラフである。
【図７】図７は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子と純粋シリカナノ粒子の熱重量分析（ＴＧＡ）グラフである。
【図８】図８は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光特性を用いた細胞イメージング写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は、フラーレンとシリカとが共有結合で連結されている形態を含む、蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子を提供する。
【００２１】
本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子は、図１に示すとおり、製造時に界面活性剤からなる逆ミセル内で形成され、ここで、前記逆ミセルは、フラーレン−シリカナノ粒子形成時に均一な球形形状をなすようにする役割をし、逆ミセルのサイズによってナノ粒子のサイズが決定される。
【００２２】
本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子において、前記フラーレンとシリカとは、共有結合によって連結されており、結合が単純で分離しにくく、フラーレンとシリカでは発現されなかった独特の蛍光特徴を示す。
【００２３】
一般的にＣ６０フラーレンは、紫外線および可視光線領域の光を吸収し、７００ｎｍで極めて弱い蛍光を発現し、シリカは光を放出する性質を示さない。しかし、本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子は、可視光線ないし紫外線領域の光を吸収して可視光線領域の光を放出する光学的特性を示す。具体的には、前記フラーレン−シリカナノ粒子は、５００〜７００ｎｍで強い蛍光を発現し、特に６００ｎｍでは最大蛍光強度を示すことが分かる。
【００２４】
本発明のフラーレン−シリカナノ粒子の特性を詳細に調べるために、赤外線分光光度計およびＸ線光電子分光器を用いて化学的組成を調査した結果、フラーレンとシリカとの結合がＣ−Ｏ−Ｓｉからなることを確認した（図５および図６参照）。
【００２５】
また、本発明の非極性有機溶媒および極性溶媒に界面活性剤を入れて撹拌し、逆ミセルを形成させる工程（工程１）、
前記工程１で形成された逆ミセルにフラーレンを添加して撹拌する工程（工程２）、および
前記工程２で製造されたフラーレンを含有する反応溶液にシリカ前駆体および触媒剤を添加して撹拌することで、フラーレン−シリカナノ粒子を製造する工程（工程３）を含むフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法を提供する。
【００２６】
以下、本発明による製造方法を工程別に詳しく説明する。
【００２７】
まず、工程１は、非極性有機溶媒および極性溶媒に界面活性剤を入れて撹拌し、逆ミセルを形成させる工程である。
【００２８】
有機溶媒に存在する界面活性剤集合体である逆ミセルは、集合体内部に水や親水性を帯びた物質を可溶化させることができるだけでなく、界面活性剤の種類によって集合体のサイズや形状を調節することができる。また、逆ミセル内に分散している親水性溶媒は、粒子の核成長および成長速度を調節することができ、熱力学的に安定したナノ粒子を製造することができる。
【００２９】
本発明による製造方法において、前記非極性有機溶媒は、トルエン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、デカンなどを用いることができる。
【００３０】
本発明による製造方法において、前記極性溶媒は、非極性有機溶媒中に親水性溶媒が分散できるように用いられ、アルコール、例えばプロパノール、ブタノール、ヘプタノール、ヘキサノールなどを用いることができる。
【００３１】
本発明による製造方法において、前記界面活性剤は、オイルと親水性相で集合体をなして逆ミセルを形成し、ここで、界面活性剤の集合体によって粒子のサイズと数を決定することができる。前記界面活性剤は、化学的構造と濃度によって区分され得るが、具体的にはアルキル基の長さ、官能基の種類、位置などで分けることができ、非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤に大別することができる。
【００３２】
非イオン性界面活性剤では、トリトンＸ１００（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）、ノニルフェニルペンタエチレングリコール（ＮＰ４、ＮＰ５、ＮＰ９）などを用いることができ、イオン性界面活性剤では、ジ２−エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム（別名エアロゾールＯＴ（ＡＯＴ））、ドデシル硫酸ナトリウムなどを用いることができる。
【００３３】
また、界面強度を調節するために補助界面活性剤（co-surfactant）を追加的に用いることができる。前記補助界面活性剤も化学的構造と濃度によって多様に選択することができ、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどを用いることができる。
【００３４】
本発明による製造方法において、前記非極性有機溶媒と、極性溶媒と界面活性剤との混合比は、非極性有機溶媒：極性溶媒：界面活性剤＝２〜８：１〜５：１〜３であることが好ましい。前記範囲を逸脱する場合には、粒子を形成するのに必要な逆ミセルが形成されないという問題が発生し得る。
【００３５】
次に、工程２は、前記工程１で形成された逆ミセルにフラーレンを添加して撹拌する工程である。
【００３６】
前記フラーレンは、フラーレン−シリカナノ粒子の材料としてＣ６０のほかにＣ７０、Ｃ８０、Ｃ９０等のフラーレンファミリー系統のフラーレンを用いることもできる。フラーレンファミリーは、純粋炭素で構成された、球形形状の対称をなしている分子の通称である。一部炭素数が多いフラーレンは、完全な対称をなさないこともある。
【００３７】
フラーレンは、有機溶媒に分散しているものを用いることもできる。フラーレンを分散させる溶媒としては、トルエン、シクロヘキサン、ヘプタン、ベンゼンなどを用いることができる。
【００３８】
本発明による製造方法において、前記フラーレンの濃度は、０．００００１〜０．１重量％であることが好ましい。添加するフラーレンの濃度が、０．００００１重量％未満であると、蛍光の強さも低く効用性がなく、添加するフラーレンの濃度が０．１重量％を超過すると、ナノ粒子を形成する逆ミセルの生成の妨げになる問題がある。
【００３９】
次に、工程３は、前記工程２で製造されたフラーレンを含有する反応溶液にシリカ前駆体および触媒剤を添加して撹拌することで、フラーレン−シリカナノ粒子を製造する工程である。
【００４０】
本発明による製造方法において、前記シリカ前駆体は、フラーレン−シリカナノ粒子の材料であり、前記シリカ前駆体の種類によって製造されるフラーレン−シリカナノ粒子のサイズと形状を調節することができる。ここで、用いられるシリカ前駆体は、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラプロピルオルトシリケート（ＴＰＯＳ）などを用いることができるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明による製造方法において、前記触媒剤は、逆ミセル中にあるシリカ前駆体を加水分解してシリカナノ粒子を形成させ、ここで、フラーレンにも化学反応を起こしてシリカと化学的に結合させてフラーレン−シリカナノ粒子を形成する役割をする。ここで、用いられる触媒剤は、アンモニア水溶液であることが好ましく、前記アンモニア水溶液は、２５〜３０重量％であることが好ましい。
【００４２】
その後、生成されたフラーレン−シリカナノ粒子の周囲にある逆ミセルを除去するためにメタノール、エチルアルコールなどのアルコールまたはアルコール水溶液を添加して追加的に撹拌して本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子を得ることができる。
【００４３】
前記のような製造方法で製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、図２に示すとおり、数十ナノメートルサイズの均一な球形形状を形成する。
【００４４】
また、図３および図４に示したように、フラーレンとシリカで発現しなかった独特の蛍光特徴を示す。具体的には、前記フラーレン−シリカナノ粒子は、５００〜７００ｎｍで強い蛍光を示し、特に６００ｎｍで最大蛍光強度を示すことが分かる。
【００４５】
さらに、本発明よって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、ナノメートルサイズの構造体によって広い表面積を有するため、反応性が良く、シリカを用いることから重金属や金属ナノ粒子に比べて生体に無害である。
【００４６】
したがって、本発明によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、強い蛍光とナノ粒子の特徴を用いて生体イメージング造影剤（図８参照）または薬物伝達体（図示せず）として有用に用いることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の範囲が下記の実施例によって限定されるわけではない。
【００４８】
＜実施例１＞フラーレン−シリカナノ粒子の製造
シクロヘキサン５．５ｍｌ、ヘキサノール２．２ｍｌ、トリトンＸ１００ １．７ｍｌおよび水０．５ｍｌの混合溶液に、トルエンに溶解された０．１％Ｃ６０フラーレン溶液２ｍｌを入れて撹拌し、逆マイクロエマルジョンを形成させた。次に前記逆マイクロエマルジョンにテトラエチルオルトシリケート１００μｌと２８重量％アンモニア水溶液６０μｌを添加して２０時間撹拌した。撹拌終了後、９９％エチルアルコール２０ｍｌを添加して２時間さらに撹拌し、形成されたフラーレン−シリカナノ粒子周囲にある界面活性剤の構造を溶解させた。生成されたナノ粒子溶液を遠心分離機を用いて反応液からナノ粒子を回収した。未反応分子を除去するためにエチルアルコール２０ｍｌを再び添加して分散させた後、遠心分離でナノ粒子を回収した。このような過程を３回経て黄色の純粋なナノ粒子を取得した。
【００４９】
＜分析＞
前記ナノ粒子をエチルアルコールに分散させた後、一部を採取し、シリコンウエハーに滴下して乾かしたものを走査電子顕微鏡で観察し、その結果を図２に示した。
【００５０】
図２に示すとおり、直径約６５ｎｍの球形形状のナノ粒子を確認した。
【００５１】
フラーレン−シリカナノ粒子の特性を詳しく調べるために、化学的組成および熱的安定性試験を実施した。化学的組成を確認するために、赤外線分光光度計とＸ線光電子分光を用いた。
【００５２】
前記フラーレン−シリカナノ粒子の赤外線スペクトルを図５に示した。
【００５３】
図５から分かるように、フラーレン−シリカナノ粒子の赤外線スペクトルに次のようなピークが現われた：４６９（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉベンド（bend））、８００（Ｓｉ−Ｏ−Ｃ対称伸縮（symmetric stretch））、９５３（Ｓｉ−ＯＨ）、１１００〜１３００（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ非対称伸縮（assymmetric stretch）、Ｓｉ−Ｏ−Ｃ非対称伸縮）、１６２９（ＯＨベンド）、３４００（ＯＨ伸縮）ｃｍ−１。この中で、Ｓｉ−Ｏ−ＳｉとＳｉ−Ｏ−Ｃピークは相当に重畳していて区分しにくい。しかし、シリカ前駆体を添加しないまま合成したフレロール（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）の赤外線スペクトルと比較すると、フラーレンの特徴を示す４種類のピーク（５２７、５７５、１１８２、１４２８ｃｍ−１）のほかに１０７４（Ｃ−Ｏ伸縮）ｃｍ−１、３４００（ＯＨ伸縮）ｃｍ−１が現われた。これは、アンモニア水によってフラーレンのＣ＝Ｃ結合が壊れ、ヒドロキシ基と反応してＣ−Ｏを形成したことを意味する。したがって、フレロール−シリカナノ粒子の合成時に、シリカ前駆体がシリカネットワークを形成する過程でＳｉ−Ｏ結合が生成される過程でフレロールのＣ−Ｏと結合してＳｉ−Ｏ−Ｃ結合が形成されたことを推測することができる。
【００５４】
これを裏付けるためにフラーレン−シリカナノ粒子のＸＰＳを測定してＣ １ｓ、Ｏ １ｓ、Ｓｉ ２ｐに対して曲線適合（curve fitting）を行った。図６にみられるように、Ｃ １ｓで２８３．９ｅＶ（１６．２４％）および２８５．０ｅＶ（８３．７６％）でピークが現われたが、これはそれぞれフラーレンの骨格をなす炭素の二重結合（Ｃ＝Ｃ−Ｃ）と酸素１個が結合したフラーレン（mono-oxygenated fullerene、Ｃ−Ｏ）であることを示している。そればかりではなく、シリコン２ｐ領域ではシリカ（ＳｉＯ２）を示す１０４．０８ｅＶ、酸素１ｓ領域ではシリカと結合した酸素を示す５３２．０ｅＶピークを示しているため、フラーレン−シリカナノ粒子がＣ、Ｏ、Ｓｉからなっていることが証明された。
【００５５】
このほかに、熱重量分析によりフラーレン−シリカナノ粒子と純粋なシリカナノ粒子の熱的特性を比較し、その結果を図７に示した。
【００５６】
図７に示すとおり、シリカは５４０〜５６０℃の間で急激な重量減少を示すが、これはシリカ内に存在するシラノール（ＳｉＯＨ）の分解に起因したものである。これとは異なり、フラーレン−シリカナノ粒子は、３００〜６００℃で重量が徐々に減少するが、これはフラーレンの炭素、酸素とシリコンが有機的ネットワークをなして一酸化炭素（ＣＯ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、そしてシラノール（ＳｉＯＨ）の分解が複合的に起きるからである。そればかりでなく、フラーレン−シリカナノ粒子の重量減少が純粋シリカナノ粒子の重量減少より急激に起きることからして、フラーレン−シリカナノ粒子中に分布したフラーレンが外側ではなく粒子全体に分散していることが分かる。
【００５７】
＜実施例２＞フラーレンの濃度が異なるフラーレン−シリカナノ粒子の製造
トルエンに分散したＣ６０フラーレンの濃度を０．００００１％から０．１重量％の種々の濃度に変化させることを除き、実施例１と同じ方法を遂行してフラーレン−シリカナノ粒子を製造した。
【００５８】
製造されたナノ粒子は、フラーレンの濃度に関わらず、同じサイズと形状を有することを走査電子顕微鏡により確認した（図示せず）。
【００５９】
＜実施例３＞分子量が異なるフラーレンを含んだフラーレン−シリカナノ粒子の製造
フラーレンの種類にＣ７０フラーレンを用いたことを除き、実施例１と同じ方法を遂行してフラーレン−シリカナノ粒子を製造した。
【００６０】
＜実験例１＞フラーレン−シリカナノ粒子の蛍光測定
実施例を通じて製造されたフラーレン−シリカナノ粒子の光学的特性を調べるために、吸光分光器（UV/Visible spectrophotometer）およびアルゴンレーザーを装着した蛍光分光器を用いて特性を観察し、その結果を図３に示した。
【００６１】
図３に示すとおり、本発明よって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、紫外線領域の光を吸収して可視光線領域の光を放出することが示された。具体的には、紫外線領域範囲内の３００〜３６０ｎｍ間の光を吸収して５００〜７００ｎｍに至る広い領域にわたって光を放出し、６００ｎｍで最大の光を放出することが分かる。
【００６２】
また、フラーレンと本発明によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子を蛍光分光器で測定し、図４に示した。測定条件は４８８ｎｍの光で励起し、フラーレンは２００μＷ、フラーレン−シリカナノ粒子は１０μＷで測定した。
【００６３】
図４に示すとおり、フラーレンは６００〜９００ｎｍにわたって光を放出するものの、その強度は微弱であるが、本発明よって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、５００〜７００ｎｍに至る領域にわたって光を放出し、６００ｎｍで最大の光を放出し、その強度はフラーレンより１４０倍以上強いことが分かる。
【００６４】
＜実験例２＞フラーレンの濃度が異なるフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光測定
本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子において、フラーレンの濃度によるフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光特性を調べるために次のような実験を遂行した。
【００６５】
実施例２で製造したフラーレンの濃度が異なるフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光特性を、蛍光光度計を用いて観察し、その結果を表１に示した。
【００６６】
【表１】
【００６７】
表１に示すとおり、フラーレン−シリカナノ粒子の製造時に添加したフラーレンの濃度が少ないほど蛍光強度が低くなることを確認した。
【００６８】
＜実験例３＞フラーレン−シリカナノ粒子を用いた細胞イメージング
本発明よって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光特性を用いて細胞イメージングに適用するために次のような実験を遂行した。
【００６９】
大食細胞として知られるマクロファージ（Macrophage、RAW264.7）に実施例で製造されたフラーレン−シリカナノ粒子を入れたものと、対照群として入れないものをそれぞれ培養した。２０時間後、吸収されないナノ粒子を除去するために各々の培養液を捨て、緩衝液で細胞を数回洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、その結果を図８に示した。
【００７０】
４８８ｎｍで入射して６１７ｎｍで放出される蛍光信号をフィルターを用いて観察した結果、図８に示すとおり、ナノ粒子がない細胞では蛍光が現われない一方、本発明よって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子を添加した細胞では、細胞の形状と一緒の蛍光が現われたことを確認することができた。これは、大食細胞によってフラーレン−シリカナノ粒子が細胞内に吸収されたことを意味し、細胞中に存在するフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光を観察することで、細胞のイメージングが可能であるということを意味する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子、その製造方法およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
バックミンスターフラーレン（Ｃ６０）は、６０個の炭素からなる球形形状の構造を有する安定した炭素分子である。同分子は正二十面体対称をなしており、すべての炭素の環境が同一であるが、これは１３Ｃ−ＮＭＲで単一ピークを示すことから確認された。Ｃ６０フラーレンだけでなく、Ｃ７０、Ｃ８０フラーレンも合成できるが、その量が多くないため、Ｃ６０を主に合成して研究しているのが実情である。
【０００３】
フラーレン分子は、ほぼ球形で対称の非極性分子であり、水、アルコールなどの極性溶媒には溶解せずに、ベンゼンやトルエンなどの非極性溶媒にのみよく溶解する。また、フラーレンは、光に極めて敏感な分子であり、光を受けると励起した状態になって容易にラジカルや光増感剤になることができる。フラーレンの電気化学的性質は極めて有用であり、フラーレン分子は、溶液中で６個の電子が可逆的な酸化還元を行うことができる。そればかりかフラーレンは、独特の構造によって極めて堅い性質を有しており、最近ではアルカリ金属との混入時、超伝導体になることができ、産業上もその応用性が注目されてきている。
【０００４】
フラーレンは、上述のとおり光に極めて敏感であり、特に紫外線領域（２１３、２５７、３２９ｎｍ）の光吸収率は極めて高い方である。しかし、蛍光特性は、全体的に極めて低いことが知られており、これは蛍光量子効率で表すことができる。蛍光量子効率とは、吸収された光子数に対して放出された蛍光光子をいう。フラーレンの量子効率は、常温で約１〜２×１０−４で示される。このような低い蛍光効率のために、フラーレンの蛍光を用いた応用は、成り立っていないのが実情である。そればかりでなく、独特の光学的、電気的性質を有するにもかかわらず、フラーレンはそれを応用する上でいくつかの難点を有する。有機溶媒に対する低い溶解度、自発的凝集現象などがそれである。特にフラーレンは、周辺の環境に極めて敏感であり、物理的、化学的性質が容易に変化する特徴を有しているため、これを調節するために多様な方法が開発されている。
【０００５】
その方法の中には、フラーレンをホストマトリックスにドーピングしたり、多孔性無機材料に閉じこめる方法、またはゾル−ゲル材料を用いた方法などがある。前記ゾル−ゲル法は、低い反応温度と比較的容易な化学反応でフラーレンナノ複合体を合成するのに有用である。また、フラーレンを合体したシリカエアロゲル（非特許文献１）や、多孔性ＶＩＰ−５ゼオライトにフラーレンを挟み入れたり（非特許文献２）、ゾル−ゲル法でフラーレンを含有させたガラス（非特許文献３）も製造されたりした。このようなフラーレン−シリカ複合体は、フラーレンの独特の光学的特性を活用して光学材料として活用するために製造されたが、応用された例がほとんどないのが実情である。一方、前記方法によって製造されたフラーレン複合体は、ナノ粒子形態ではないバルク状態の物質として得られる。
【０００６】
最近になってナノ科学への関心が高まるにつれて、フラーレンを用いたナノ粒子の合成に関する研究も進められた。代表的な例として、フラーレン誘導体を用いてフラーレン−シリカハイブリッドナノ構造体を合成し（非特許文献４）、酸性条件でヒドロキシル基を含んだフラーレンをシリカにコーティングするに至った（非特許文献５）。
【０００７】
しかし、製造されたフラーレン−シリカナノ複合体は、そのサイズや形状が一定せず不均一なだけでなく、フラーレンとシリカが別途のリンカーによって連結された構造を有し、このようにして得られたフラーレン−シリカナノ複合体の蛍光特性に対する研究も充分でないのが実情である。
【０００８】
したがって、前記問題点を解決するために、数十ナノメートルサイズの均一なフラーレン−シリカナノ粒子の合成、それに対する光学的性質、特にフラーレン−シリカナノ粒子の独特の蛍光に対する研究とそれを用いた技術開発が切実に求められている。
【０００９】
そこで、本発明者等は、ナノサイズの均一な形状のフラーレン−シリカナノ粒子を製造するために研究する中、逆マイクロエマルジョン法を用いてフラーレンとシリカとが別途のリンカーなしに共有結合で直接連結している数十ナノメートルサイズのフラーレン−シリカナノ粒子を合成し、それらの粒子が強い蛍光を発生することを確認し、生体イメージング造影剤または薬物伝達体として有用に用いることができることを見出して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｚｈｕ等，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｌｉｄｓ，１９９８年，第５９巻，ｐ．８１９
【非特許文献２】Ｌａｍｒａｂｔｅ等，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，１９９８年，第２９５巻，ｐ．２５７
【非特許文献３】Ｐｅｎｇ等，Ｊ．Ｓｏｌ−Ｇｅｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．２００１年，第２２巻，ｐ．２０５
【非特許文献４】Ｐａｔｗａｒｄｈａｎ等，Ｊ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００２年，第１２巻，ｐ．４９
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｓｉｔｔ等，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２００３年，ｐ．１０４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ナノサイズの均一な形状のフラーレン−シリカナノ粒子を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記フラーレン−シリカナノ粒子の製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、前記製造されたフラーレン−シリカナノ粒子を含む生体イメージング造影剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は、フラーレンとシリカとが共有結合で連結されている形態を含む、蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子を提供する。
【００１５】
また、本発明は、非極性有機溶媒および極性溶媒に界面活性剤を入れて撹拌し、逆ミセルを形成させる工程（工程１）、
前記工程１で形成された逆ミセルにフラーレンを添加して撹拌する工程（工程２）、および
前記工程２で製造されたフラーレンを含有する反応溶液にシリカ前駆体および触媒剤を添加して撹拌することで、フラーレン−シリカナノ粒子を製造する工程（工程３）を含む、フラーレン−シリカナノ粒子の製造方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、前記フラーレン−シリカナノ粒子を含む生体イメージング造影剤を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、数十ナノメートルサイズの均一な球形形状を形成するフラーレン−シリカナノ粒子を製造することができ、Ｃ６０フラーレンのみならずＣ７０、Ｃ８０等の多様なフラーレンを含むフラーレン−シリカナノ粒子を製造することができ、種々のフラーレンの濃度を有するフラーレン−シリカナノ粒子を製造することができる。このように製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、ナノメートルサイズの構造体による広い表面積を有するため、反応性が良く、シリカを用いることで重金属や金属ナノ粒子に比べて生体に無害であり、強い蛍光を発現するため生体イメージング造影剤または薬物伝達体として有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子の模式図である。
【図２】図２は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子の走査電子顕微鏡写真である。
【図３】図３は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子の吸光および蛍光グラフである。
【図４】図４は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子とＣ６０フラーレンの蛍光グラフである。
【図５】図５は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子と中間産物であるフロロールの赤外線吸光（ＩＲ）グラフである。
【図６】図６は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子のＸ線光電子分光（ＸＰＳ）グラフである。
【図７】図７は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子と純粋シリカナノ粒子の熱重量分析（ＴＧＡ）グラフである。
【図８】図８は、本発明の一実施例によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光特性を用いた細胞イメージング写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は、フラーレンとシリカとが共有結合で連結されている形態を含む、蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子を提供する。
【００２１】
本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子は、図１に示すとおり、製造時に界面活性剤からなる逆ミセル内で形成され、ここで、前記逆ミセルは、フラーレン−シリカナノ粒子形成時に均一な球形形状をなすようにする役割をし、逆ミセルのサイズによってナノ粒子のサイズが決定される。
【００２２】
本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子において、前記フラーレンとシリカとは、共有結合によって連結されており、結合が単純で分離しにくく、フラーレンとシリカでは発現されなかった独特の蛍光特徴を示す。
【００２３】
一般的にＣ６０フラーレンは、紫外線および可視光線領域の光を吸収し、７００ｎｍで極めて弱い蛍光を発現し、シリカは光を放出する性質を示さない。しかし、本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子は、可視光線ないし紫外線領域の光を吸収して可視光線領域の光を放出する光学的特性を示す。具体的には、前記フラーレン−シリカナノ粒子は、５００〜７００ｎｍで強い蛍光を発現し、特に６００ｎｍでは最大蛍光強度を示すことが分かる。
【００２４】
本発明のフラーレン−シリカナノ粒子の特性を詳細に調べるために、赤外線分光光度計およびＸ線光電子分光器を用いて化学的組成を調査した結果、フラーレンとシリカとの結合がＣ−Ｏ−Ｓｉからなることを確認した（図５および図６参照）。
【００２５】
また、本発明の非極性有機溶媒および極性溶媒に界面活性剤を入れて撹拌し、逆ミセルを形成させる工程（工程１）、
前記工程１で形成された逆ミセルにフラーレンを添加して撹拌する工程（工程２）、および
前記工程２で製造されたフラーレンを含有する反応溶液にシリカ前駆体および触媒剤を添加して撹拌することで、フラーレン−シリカナノ粒子を製造する工程（工程３）を含むフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法を提供する。
【００２６】
以下、本発明による製造方法を工程別に詳しく説明する。
【００２７】
まず、工程１は、非極性有機溶媒および極性溶媒に界面活性剤を入れて撹拌し、逆ミセルを形成させる工程である。
【００２８】
有機溶媒に存在する界面活性剤集合体である逆ミセルは、集合体内部に水や親水性を帯びた物質を可溶化させることができるだけでなく、界面活性剤の種類によって集合体のサイズや形状を調節することができる。また、逆ミセル内に分散している親水性溶媒は、粒子の核成長および成長速度を調節することができ、熱力学的に安定したナノ粒子を製造することができる。
【００２９】
本発明による製造方法において、前記非極性有機溶媒は、トルエン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、デカンなどを用いることができる。
【００３０】
本発明による製造方法において、前記極性溶媒は、非極性有機溶媒中に親水性溶媒が分散できるように用いられ、アルコール、例えばプロパノール、ブタノール、ヘプタノール、ヘキサノールなどを用いることができる。
【００３１】
本発明による製造方法において、前記界面活性剤は、オイルと親水性相で集合体をなして逆ミセルを形成し、ここで、界面活性剤の集合体によって粒子のサイズと数を決定することができる。前記界面活性剤は、化学的構造と濃度によって区分され得るが、具体的にはアルキル基の長さ、官能基の種類、位置などで分けることができ、非イオン性界面活性剤とイオン性界面活性剤に大別することができる。
【００３２】
非イオン性界面活性剤では、トリトンＸ１００（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）、ノニルフェニルペンタエチレングリコール（ＮＰ４、ＮＰ５、ＮＰ９）などを用いることができ、イオン性界面活性剤では、ジ２−エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム（別名エアロゾールＯＴ（ＡＯＴ））、ドデシル硫酸ナトリウムなどを用いることができる。
【００３３】
また、界面強度を調節するために補助界面活性剤（co-surfactant）を追加的に用いることができる。前記補助界面活性剤も化学的構造と濃度によって多様に選択することができ、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどを用いることができる。
【００３４】
本発明による製造方法において、前記非極性有機溶媒と、極性溶媒と界面活性剤との混合比は、非極性有機溶媒：極性溶媒：界面活性剤＝２〜８：１〜５：１〜３であることが好ましい。前記範囲を逸脱する場合には、粒子を形成するのに必要な逆ミセルが形成されないという問題が発生し得る。
【００３５】
次に、工程２は、前記工程１で形成された逆ミセルにフラーレンを添加して撹拌する工程である。
【００３６】
前記フラーレンは、フラーレン−シリカナノ粒子の材料としてＣ６０のほかにＣ７０、Ｃ８０、Ｃ９０等のフラーレンファミリー系統のフラーレンを用いることもできる。フラーレンファミリーは、純粋炭素で構成された、球形形状の対称をなしている分子の通称である。一部炭素数が多いフラーレンは、完全な対称をなさないこともある。
【００３７】
フラーレンは、有機溶媒に分散しているものを用いることもできる。フラーレンを分散させる溶媒としては、トルエン、シクロヘキサン、ヘプタン、ベンゼンなどを用いることができる。
【００３８】
本発明による製造方法において、前記フラーレンの濃度は、０．００００１〜０．１重量％であることが好ましい。添加するフラーレンの濃度が、０．００００１重量％未満であると、蛍光の強さも低く効用性がなく、添加するフラーレンの濃度が０．１重量％を超過すると、ナノ粒子を形成する逆ミセルの生成の妨げになる問題がある。
【００３９】
次に、工程３は、前記工程２で製造されたフラーレンを含有する反応溶液にシリカ前駆体および触媒剤を添加して撹拌することで、フラーレン−シリカナノ粒子を製造する工程である。
【００４０】
本発明による製造方法において、前記シリカ前駆体は、フラーレン−シリカナノ粒子の材料であり、前記シリカ前駆体の種類によって製造されるフラーレン−シリカナノ粒子のサイズと形状を調節することができる。ここで、用いられるシリカ前駆体は、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラプロピルオルトシリケート（ＴＰＯＳ）などを用いることができるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明による製造方法において、前記触媒剤は、逆ミセル中にあるシリカ前駆体を加水分解してシリカナノ粒子を形成させ、ここで、フラーレンにも化学反応を起こしてシリカと化学的に結合させてフラーレン−シリカナノ粒子を形成する役割をする。ここで、用いられる触媒剤は、アンモニア水溶液であることが好ましく、前記アンモニア水溶液は、２５〜３０重量％であることが好ましい。
【００４２】
その後、生成されたフラーレン−シリカナノ粒子の周囲にある逆ミセルを除去するためにメタノール、エチルアルコールなどのアルコールまたはアルコール水溶液を添加して追加的に撹拌して本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子を得ることができる。
【００４３】
前記のような製造方法で製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、図２に示すとおり、数十ナノメートルサイズの均一な球形形状を形成する。
【００４４】
また、図３および図４に示したように、フラーレンとシリカで発現しなかった独特の蛍光特徴を示す。具体的には、前記フラーレン−シリカナノ粒子は、５００〜７００ｎｍで強い蛍光を示し、特に６００ｎｍで最大蛍光強度を示すことが分かる。
【００４５】
さらに、本発明よって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、ナノメートルサイズの構造体によって広い表面積を有するため、反応性が良く、シリカを用いることから重金属や金属ナノ粒子に比べて生体に無害である。
【００４６】
したがって、本発明によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、強い蛍光とナノ粒子の特徴を用いて生体イメージング造影剤（図８参照）または薬物伝達体（図示せず）として有用に用いることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の範囲が下記の実施例によって限定されるわけではない。
【００４８】
＜実施例１＞フラーレン−シリカナノ粒子の製造
シクロヘキサン５．５ｍｌ、ヘキサノール２．２ｍｌ、トリトンＸ１００ １．７ｍｌおよび水０．５ｍｌの混合溶液に、トルエンに溶解された０．１％Ｃ６０フラーレン溶液２ｍｌを入れて撹拌し、逆マイクロエマルジョンを形成させた。次に前記逆マイクロエマルジョンにテトラエチルオルトシリケート１００μｌと２８重量％アンモニア水溶液６０μｌを添加して２０時間撹拌した。撹拌終了後、９９％エチルアルコール２０ｍｌを添加して２時間さらに撹拌し、形成されたフラーレン−シリカナノ粒子周囲にある界面活性剤の構造を溶解させた。生成されたナノ粒子溶液を遠心分離機を用いて反応液からナノ粒子を回収した。未反応分子を除去するためにエチルアルコール２０ｍｌを再び添加して分散させた後、遠心分離でナノ粒子を回収した。このような過程を３回経て黄色の純粋なナノ粒子を取得した。
【００４９】
＜分析＞
前記ナノ粒子をエチルアルコールに分散させた後、一部を採取し、シリコンウエハーに滴下して乾かしたものを走査電子顕微鏡で観察し、その結果を図２に示した。
【００５０】
図２に示すとおり、直径約６５ｎｍの球形形状のナノ粒子を確認した。
【００５１】
フラーレン−シリカナノ粒子の特性を詳しく調べるために、化学的組成および熱的安定性試験を実施した。化学的組成を確認するために、赤外線分光光度計とＸ線光電子分光を用いた。
【００５２】
前記フラーレン−シリカナノ粒子の赤外線スペクトルを図５に示した。
【００５３】
図５から分かるように、フラーレン−シリカナノ粒子の赤外線スペクトルに次のようなピークが現われた：４６９（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉベンド（bend））、８００（Ｓｉ−Ｏ−Ｃ対称伸縮（symmetric stretch））、９５３（Ｓｉ−ＯＨ）、１１００〜１３００（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ非対称伸縮（assymmetric stretch）、Ｓｉ−Ｏ−Ｃ非対称伸縮）、１６２９（ＯＨベンド）、３４００（ＯＨ伸縮）ｃｍ−１。この中で、Ｓｉ−Ｏ−ＳｉとＳｉ−Ｏ−Ｃピークは相当に重畳していて区分しにくい。しかし、シリカ前駆体を添加しないまま合成したフレロール（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）の赤外線スペクトルと比較すると、フラーレンの特徴を示す４種類のピーク（５２７、５７５、１１８２、１４２８ｃｍ−１）のほかに１０７４（Ｃ−Ｏ伸縮）ｃｍ−１、３４００（ＯＨ伸縮）ｃｍ−１が現われた。これは、アンモニア水によってフラーレンのＣ＝Ｃ結合が壊れ、ヒドロキシ基と反応してＣ−Ｏを形成したことを意味する。したがって、フレロール−シリカナノ粒子の合成時に、シリカ前駆体がシリカネットワークを形成する過程でＳｉ−Ｏ結合が生成される過程でフレロールのＣ−Ｏと結合してＳｉ−Ｏ−Ｃ結合が形成されたことを推測することができる。
【００５４】
これを裏付けるためにフラーレン−シリカナノ粒子のＸＰＳを測定してＣ １ｓ、Ｏ １ｓ、Ｓｉ ２ｐに対して曲線適合（curve fitting）を行った。図６にみられるように、Ｃ １ｓで２８３．９ｅＶ（１６．２４％）および２８５．０ｅＶ（８３．７６％）でピークが現われたが、これはそれぞれフラーレンの骨格をなす炭素の二重結合（Ｃ＝Ｃ−Ｃ）と酸素１個が結合したフラーレン（mono-oxygenated fullerene、Ｃ−Ｏ）であることを示している。そればかりではなく、シリコン２ｐ領域ではシリカ（ＳｉＯ２）を示す１０４．０８ｅＶ、酸素１ｓ領域ではシリカと結合した酸素を示す５３２．０ｅＶピークを示しているため、フラーレン−シリカナノ粒子がＣ、Ｏ、Ｓｉからなっていることが証明された。
【００５５】
このほかに、熱重量分析によりフラーレン−シリカナノ粒子と純粋なシリカナノ粒子の熱的特性を比較し、その結果を図７に示した。
【００５６】
図７に示すとおり、シリカは５４０〜５６０℃の間で急激な重量減少を示すが、これはシリカ内に存在するシラノール（ＳｉＯＨ）の分解に起因したものである。これとは異なり、フラーレン−シリカナノ粒子は、３００〜６００℃で重量が徐々に減少するが、これはフラーレンの炭素、酸素とシリコンが有機的ネットワークをなして一酸化炭素（ＣＯ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、そしてシラノール（ＳｉＯＨ）の分解が複合的に起きるからである。そればかりでなく、フラーレン−シリカナノ粒子の重量減少が純粋シリカナノ粒子の重量減少より急激に起きることからして、フラーレン−シリカナノ粒子中に分布したフラーレンが外側ではなく粒子全体に分散していることが分かる。
【００５７】
＜実施例２＞フラーレンの濃度が異なるフラーレン−シリカナノ粒子の製造
トルエンに分散したＣ６０フラーレンの濃度を０．００００１％から０．１重量％の種々の濃度に変化させることを除き、実施例１と同じ方法を遂行してフラーレン−シリカナノ粒子を製造した。
【００５８】
製造されたナノ粒子は、フラーレンの濃度に関わらず、同じサイズと形状を有することを走査電子顕微鏡により確認した（図示せず）。
【００５９】
＜実施例３＞分子量が異なるフラーレンを含んだフラーレン−シリカナノ粒子の製造
フラーレンの種類にＣ７０フラーレンを用いたことを除き、実施例１と同じ方法を遂行してフラーレン−シリカナノ粒子を製造した。
【００６０】
＜実験例１＞フラーレン−シリカナノ粒子の蛍光測定
実施例を通じて製造されたフラーレン−シリカナノ粒子の光学的特性を調べるために、吸光分光器（UV/Visible spectrophotometer）およびアルゴンレーザーを装着した蛍光分光器を用いて特性を観察し、その結果を図３に示した。
【００６１】
図３に示すとおり、本発明よって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、紫外線領域の光を吸収して可視光線領域の光を放出することが示された。具体的には、紫外線領域範囲内の３００〜３６０ｎｍ間の光を吸収して５００〜７００ｎｍに至る広い領域にわたって光を放出し、６００ｎｍで最大の光を放出することが分かる。
【００６２】
また、フラーレンと本発明によって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子を蛍光分光器で測定し、図４に示した。測定条件は４８８ｎｍの光で励起し、フラーレンは２００μＷ、フラーレン−シリカナノ粒子は１０μＷで測定した。
【００６３】
図４に示すとおり、フラーレンは６００〜９００ｎｍにわたって光を放出するものの、その強度は微弱であるが、本発明よって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子は、５００〜７００ｎｍに至る領域にわたって光を放出し、６００ｎｍで最大の光を放出し、その強度はフラーレンより１４０倍以上強いことが分かる。
【００６４】
＜実験例２＞フラーレンの濃度が異なるフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光測定
本発明によるフラーレン−シリカナノ粒子において、フラーレンの濃度によるフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光特性を調べるために次のような実験を遂行した。
【００６５】
実施例２で製造したフラーレンの濃度が異なるフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光特性を、蛍光光度計を用いて観察し、その結果を表１に示した。
【００６６】
【表１】
【００６７】
表１に示すとおり、フラーレン−シリカナノ粒子の製造時に添加したフラーレンの濃度が少ないほど蛍光強度が低くなることを確認した。
【００６８】
＜実験例３＞フラーレン−シリカナノ粒子を用いた細胞イメージング
本発明よって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光特性を用いて細胞イメージングに適用するために次のような実験を遂行した。
【００６９】
大食細胞として知られるマクロファージ（Macrophage、RAW264.7）に実施例で製造されたフラーレン−シリカナノ粒子を入れたものと、対照群として入れないものをそれぞれ培養した。２０時間後、吸収されないナノ粒子を除去するために各々の培養液を捨て、緩衝液で細胞を数回洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察し、その結果を図８に示した。
【００７０】
４８８ｎｍで入射して６１７ｎｍで放出される蛍光信号をフィルターを用いて観察した結果、図８に示すとおり、ナノ粒子がない細胞では蛍光が現われない一方、本発明よって製造されたフラーレン−シリカナノ粒子を添加した細胞では、細胞の形状と一緒の蛍光が現われたことを確認することができた。これは、大食細胞によってフラーレン−シリカナノ粒子が細胞内に吸収されたことを意味し、細胞中に存在するフラーレン−シリカナノ粒子の蛍光を観察することで、細胞のイメージングが可能であるということを意味する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラーレンとシリカとが共有結合で連結されている、蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子。
【請求項２】
蛍光特性が、可視光線ないし紫外線領域の光を吸収して可視光線領域の光を放出する光学的特性であることを特徴とする、請求項１に記載のフラーレン−シリカナノ粒子。
【請求項３】
非極性有機溶媒および極性溶媒に界面活性剤を入れて撹拌し、逆ミセルを形成させる工程（工程１）、
前記工程１で形成された逆ミセルにフラーレンを添加して撹拌する工程（工程２）、および
前記工程２で製造されたフラーレンを含有する反応溶液にシリカ前駆体および触媒剤を添加して撹拌することで、フラーレン−シリカナノ粒子を製造する工程（工程３）を含む、請求項１のフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
工程１の非極性有機溶媒が、トルエン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタンおよびデカンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
工程１の極性溶媒が、アルコールであることを特徴とする、請求項３に記載のフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
アルコールが、ブタノール、ヘプタノールまたはヘキサノールであることを特徴とする、請求項５に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項７】
工程１の界面活性剤が、非イオン性界面活性剤であるトリトンＸ１００またはノニルフェニルペンタエチレングリコール（ＮＰ４、ＮＰ５、ＮＰ９）、またはイオン性界面活性剤のジ２−エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム（ＡＯＴ）、またはドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
工程１で界面強度を調節するために補助界面活性剤をさらに含む、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項９】
工程１の非極性有機溶媒と、極性溶媒と界面活性剤との混合比が、非極性有機溶媒：極性溶媒：界面活性剤＝２〜８：１〜５：１〜３であることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１０】
工程２のフラーレンが、Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ８０またはＣ９０フラーレンであることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
工程２のフラーレンが、トルエン、シクロヘキサン、ヘプタンおよびベンゼンからなる群から選択される溶媒に分散させて添加することを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１２】
工程２のフラーレンの濃度が、０．００００１〜０．１重量％であることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１３】
工程３のシリカ前駆体が、テトラエチルオルトシリケート、テトラメチルオルトシリケートまたはテトラプロピルオルトシリケートであることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
工程３の触媒剤が、アンモニア水溶液であることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１５】
アンモニア水溶液が、２５〜３０重量％アンモニア水溶液であることを特徴とする、請求項１４に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のフラーレン−シリカナノ粒子を含む、生体イメージング造影剤。
【請求項１】
フラーレンとシリカとが共有結合で連結されている、蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子。
【請求項２】
蛍光特性が、可視光線ないし紫外線領域の光を吸収して可視光線領域の光を放出する光学的特性であることを特徴とする、請求項１に記載のフラーレン−シリカナノ粒子。
【請求項３】
非極性有機溶媒および極性溶媒に界面活性剤を入れて撹拌し、逆ミセルを形成させる工程（工程１）、
前記工程１で形成された逆ミセルにフラーレンを添加して撹拌する工程（工程２）、および
前記工程２で製造されたフラーレンを含有する反応溶液にシリカ前駆体および触媒剤を添加して撹拌することで、フラーレン−シリカナノ粒子を製造する工程（工程３）を含む、請求項１のフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
工程１の非極性有機溶媒が、トルエン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタンおよびデカンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
工程１の極性溶媒が、アルコールであることを特徴とする、請求項３に記載のフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
アルコールが、ブタノール、ヘプタノールまたはヘキサノールであることを特徴とする、請求項５に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項７】
工程１の界面活性剤が、非イオン性界面活性剤であるトリトンＸ１００またはノニルフェニルペンタエチレングリコール（ＮＰ４、ＮＰ５、ＮＰ９）、またはイオン性界面活性剤のジ２−エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム（ＡＯＴ）、またはドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
工程１で界面強度を調節するために補助界面活性剤をさらに含む、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項９】
工程１の非極性有機溶媒と、極性溶媒と界面活性剤との混合比が、非極性有機溶媒：極性溶媒：界面活性剤＝２〜８：１〜５：１〜３であることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１０】
工程２のフラーレンが、Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ８０またはＣ９０フラーレンであることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
工程２のフラーレンが、トルエン、シクロヘキサン、ヘプタンおよびベンゼンからなる群から選択される溶媒に分散させて添加することを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１２】
工程２のフラーレンの濃度が、０．００００１〜０．１重量％であることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１３】
工程３のシリカ前駆体が、テトラエチルオルトシリケート、テトラメチルオルトシリケートまたはテトラプロピルオルトシリケートであることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
工程３の触媒剤が、アンモニア水溶液であることを特徴とする、請求項３に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１５】
アンモニア水溶液が、２５〜３０重量％アンモニア水溶液であることを特徴とする、請求項１４に記載の蛍光特性が向上したフラーレン−シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のフラーレン−シリカナノ粒子を含む、生体イメージング造影剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５２４４３０（Ｐ２０１１−５２４４３０Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１０４１１（Ｐ２０１１−５１０４１１）
【出願日】平成２１年１月６日（２００９．１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００００４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４２３７８
【国際公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【出願人】（５０８１３９４５７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月６日（２００９．１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００００４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４２３７８
【国際公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【出願人】（５０８１３９４５７）コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (19)
【Ｆターム（参考）】
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