蛍光相関分光分析装置及び方法並びにそのためのコンピュータプログラム
【課題】 蛍光相関分光分析を用いて複数の種類の成分の分子が共存する試料中の各成分の存在比を検出する測定に於いて、各成分のみを含むコントロール試料の蛍光測定の回数をできるだけ少なくできるようにすると伴に、複数のウェルの光学的な条件が互いに異なることに起因する不具合を回避すること。
【解決手段】 本発明の蛍光分析装置、方法及びコンピュータプログラムに於いては、蛍光相関分光分析法により蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の各成分の存在比を検出する場合に、前記成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する各成分の並進拡散時間の比を用いて溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から各成分の存在比を検出することを特徴とする。
【解決手段】 本発明の蛍光分析装置、方法及びコンピュータプログラムに於いては、蛍光相関分光分析法により蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の各成分の存在比を検出する場合に、前記成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する各成分の並進拡散時間の比を用いて溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から各成分の存在比を検出することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光相関分光分析による蛍光分析装置、蛍光分析方法並びにそのためのコンピュータプログラムに係り、より詳細には、蛍光相関分光分析を用いて、種々の分子、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸及びその他の生体分子（以下、「生体分子等」とする。）の相互作用、結合・解離状態の検出及び解析を行うための装置、方法並びにコンピュータプログラムに係る。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、分子レベルの蛍光を測定・解析することが可能な蛍光相関分光分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ)が利用できるようになっている（非特許文献１、２、）。蛍光相関分光分析に於いては、端的に述べれば、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）が可能な超高感度の光検出装置とを用いて、溶液試料中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度が測定され、その蛍光強度の自己相関関数が演算される。自己相関関数とは、蛍光分子等からの蛍光強度の揺らぎの指標となるものであり、蛍光強度の揺らぎは、微小領域内の蛍光分子等の数の揺らぎに対応するので、自己相関関数の値には、微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留数（平均分子数）が反映されている。従って、かかる自己相関関数の値から蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報が得られ、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象を検出することができる。
【０００３】
生物科学、医学又は薬学の分野に於いては、上記の如き蛍光相関分光分析を生体分子等の状態及び運動の検出・観測に応用し、種々の生体分子等の現象・反応を細胞レベル又は分子レベルで解明する試みがなされている（特許文献１、２、非特許文献３）。例えば、互いに結合する一対の分子（抗原と抗体、ＤＮＡとタンパク質など）のうち、少なくとも一方の分子に蛍光分子等の蛍光標識を付加した上で、それらの分子を反応させると、一方の分子上の蛍光分子等の運動や状態の変化が蛍光分子からの蛍光強度の揺らぎに反映され、これにより、タンパク質又はＤＮＡ等の分子間の結合が検出できることとなる。特に、蛍光が観察される微小領域に複数成分の蛍光分子等が出入りする場合の蛍光強度の自己相関関数値を与えるモデル式が提案されており、かかるモデル式を用いると、溶液試料中の複数成分の蛍光分子等の存在比が決定され、その値から解離定数、結合定数なども算出できるようになってきている（非特許文献２）。また、蛍光相関分光分析は、従前の生化学的な方法に比して極めて微量な試料にて且短時間にて計測が可能であるので、医学・薬理学等の分野に於いて、種々の病気の臨床診断や生理活性物質のスクーリングに於ける応用も期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金城政孝、蛋白質 核酸 酵素 Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁 １９９９年
【非特許文献２】エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁
【非特許文献３】加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の蛍光相関分光分析を用いて複数の種類の成分の分子が共存する試料中の各成分の存在比（分子の数の比）を検出する場合、例えば、少なくとも二つの成分の分子間の結合比の検出や分子量の変化を伴う反応の進行の度合の検出を行う場合などに於いて、検査されるべき溶液試料（検査試料）についての蛍光強度の測定、自己相関関数の算出が実行された後、典型的には、算出された自己相関関数Ｃ（τ）に対して下記の式のフィッティングが為され、各成分の存在比ｙｉが決定される。
【数１】
ここに於いて、Ｎは、コンフォーカル・ボリューム内に存在する蛍光分子等の数の平均値であり、ＡＲは、ストラクチャ・パラメータと称されるコンフォーカル・ボリュームの長軸ｗｚと横方向半径ｗｏとの比（ＡＲ＝ｗｚ／ｗｏ）であり（図１（Ｂ）参照）、τｉは、各成分の並進拡散時間である。従って、式（１）による自己相関関数のフィッティングを実行して、各成分の存在比ｙｉを決定するためには、ストラクチャパラメータＡＲと各成分の並進拡散時間τｉが予め決定されていることが好ましい（Ｎは、Ｃ（０）により与えられるので、フィッティングにより与えられる。）。この点に関し、ストラクチャパラメータＡＲと並進拡散時間τｉとには、測定条件や装置の調整による変動がある。そこで、通常、精度良く測定を実行しようとする場合には、検査試料についての蛍光強度の測定を行う度に、検査試料中の成分に付加されている蛍光標識（通常、蛍光色素）の試料について蛍光強度の測定、自己相関関数の算出が為され、算出された自己相関関数の値からストラクチャ・パラメータＡＲが決定され、また、試料中の各成分が単独にて存在する状態の試料（例えば、或る蛍光分子等が他の分子と結合する反応の場合には、全ての蛍光分子等が当該他の分子に結合した状態の試料と全ての蛍光分子等が相手の分子から解離した状態の試料：以下、試料中の各成分が単独にて存在する状態の試料を「コントロール試料」と称する。）について蛍光強度の測定、自己相関関数の算出が為され、各成分の並進拡散時間の算出が実行される。例えば、２成分を含む検査試料中に於ける成分１、２の存在比を蛍光強度の自己相関関数のフィッティングにより決定する場合、検査試料と伴に、成分１、２のコントロール試料が別途に準備される。そして、検査試料の蛍光測定と前後して、それらコントロール試料について蛍光測定が実行されて、それらの蛍光強度の自己相関関数のフィッティングから各成分の並進拡散時間τ１、τ２が決定され、かかるτ１、τ２が検査試料の蛍光強度の自己相関関数のフィッティングに於いて、固定値として用いられる。
【０００７】
しかしながら、上記の如く、検査試料についての蛍光強度の測定を行う度に、蛍光標識試料、コントロール試料のついての蛍光測定、自己相関関数の算出を行うことは、検査時間や手間を要することとなる。検査試料中の成分に付加される蛍光標識の試料は、入手及び調製が比較的容易であるが（通常、予め十分な量にて準備されている。）、特に、コントロール試料は、しばしば、高価又は希少な試料となる場合があり、また、調製にも手間がかかることがあるので、コントロール試料のついての蛍光測定の回数は、できるだけ少なくできることが好ましい。
【０００８】
また、検査試料の蛍光強度の測定を行う度に、例えば、検査試料の蛍光測定と前後して、蛍光標識試料及びコントロール試料の蛍光測定を行う場合、検査試料と、蛍光標識試料及びコントロール試料とは、別々の容器に注入されて測定されることになるので、一連の測定の間に温度等の環境条件に変化がなくても、光学的な条件が若干異なることがあり、そのことが測定精度に影響し得ることが見出されている。例えば、典型的な測定に際しては、検査試料、蛍光標識試料及びコントロール試料は、底面がカバーガラスにより成り複数のウェルを有するマイクロプレートと称される容器の異なるウェルに別々に注入され、蛍光測定が為される。その際、各ウェルの光学的な条件が互いに異なる場合、例えば、マイクロプレートの底面を成すカバーガラスの厚さがウェルの位置毎に異なる場合（カバーガラスの厚さにばらつきがある場合）、或いは、対物レンズとカバーガラス面までの距離がウェル毎に変化してしまう場合などには、励起光の集光状態がウェル毎に変化し、従って、コンフォーカル・ボリュームの寸法が変化することが起き得る。そうなると、検出される並進拡散時間がウェル毎に異なることになるので、コントロール試料や蛍光標識試料について得られた並進拡散時間の値を検査試料のフィッティングに用いると不正確な結果を導くこととなる（本発明の発明者の経験に於いて、同一のマイクロプレートのウェルに於いて、ストラクチャ・パラメータＡＲの値については、略一定に保って測定が可能であることが見出されている。）。
【０００９】
各ウェルの光学的な条件が互いに異なることに起因する不具合は、厚さのばらつきの少ないカバーガラスを用いることにより解決可能であるが、そのような厚さのばらつきの少ないカバーガラスは高価である。また、検査試料の蛍光強度の自己相関関数から並進拡散時間を検出する際に、試料中の各成分の並進拡散時間として、コントロール試料や蛍光標識試料について得られた並進拡散時間の値を用いずに、未知数として、フィッティングにより決定することも原理的には可能であるが、フィッティングに時間を要し、また、分子量の大きい成分の、フィッティングにより得られる値は、その変動幅が大きいため、検出精度が低下することとなる。
【００１０】
かくして、本発明の一つの課題は、蛍光相関分光分析を用いて複数の種類の成分の分子が共存する試料中の各成分の存在比を検出する測定に於いて、コントロール試料の蛍光測定の回数をできるだけ少なくすることができると伴に、上記の如き複数の容器又はウェルの光学的な条件が互いに異なることに起因する不具合を回避することのできる蛍光相関分光分析装置、方法又はそのためのコンピュータプログラムを提供することである。
【００１１】
この点に関し、本発明の発明者による研究によれば、任意の複数成分の分子のそれぞれの並進拡散時間の絶対的な値は、カバーガラスの厚さを含む測定条件、装置の調整等による変動があるところ、複数成分の分子同士の並進拡散時間の値の比、即ち、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対するその他の少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比は、測定条件や装置の調整状態等が異なっていても、略不変であることが実験的に確認された。例えば、任意の成分１、２の並進拡散時間τ１、τ２の比（τ２／τ１）は、任意の通常の測定条件や装置の調整状態に於いて、略一定の値となる。本発明では、かかる知見を生かして、上記の課題を達成することが提案される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、一つの態様として、蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出することができるよう構成された蛍光相関分光分析装置であって、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域を含み、その記憶された少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて、少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出することを特徴とする装置が提供される。
【００１３】
既に触れたように、任意の分子の並進拡散時間の値は、蛍光測定時の測定条件、例えば、温度、溶液の粘度等、及び装置の調整状態、特に、コンフォーカル・ボリュームの寸法（レーザー光の集光状態や溶液試料の容器のカバーガラスの厚みなどによって変化する。）等によって変動するところ、本発明の発明者による実験によれば、任意の複数の種類の分子同士の並進拡散時間の値の比は、測定条件、装置の調整状態によらず略一定となることが確認された。そこで、本発明では、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を装置に記憶しておき、溶液試料内の少なくとも二種類の成分の各々の存在比は、かかる並進拡散時間の比の値を参照して溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から検出されるよう構成される。かかる構成によれば、測定条件、装置の調整状態が変わる毎に行っていた検査されるべき溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々、即ち、コントロール試料の並進拡散時間の検出を省略することが可能となり、従って、コントロール試料の調製、測定、解析を大幅に低減することが可能となる。また、或る溶液試料についての測定に際して、その溶液試料に含まれている成分同士の並進拡散時間の値の比が分かっている場合には、コントロール試料の測定を行う必要がなくなるため、測定結果の解析（各成分の存在比の検出）に於いて、溶液試料のウェル又は容器とは別のウェル又は容器にて測定・検出された値を用いる必要がなくなり、複数のウェルの光学的な条件が互いに異なることに起因する不具合は問題とならなくなる。
【００１４】
なお、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値は、典型的には、少なくとも二種類の成分のうちの一つの成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間の比であってよいが、これに限定されない。少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間の絶対的な値は、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じた値により与えられる。
【００１５】
上記の本発明の装置の構成に於いて、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値は、一つの態様に於いては、少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から決定された少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間から算出されて、前記のデータ記憶領域に記憶されるようになっていてよい。この点に関し、一旦、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値が決定されれば、その比の値は、測定条件、装置の調整状態が変わっても保存されるので、少なくとも二種類の成分の各々の蛍光測定、自己相関関数の演算、並進拡散時間の算出の処理は、各成分について同一の測定条件及び装置の調整状態で十分な精度にて少なくとも一回ずつ行われればよく、これにより、検査に要する時間や手間が大幅に低減されることとなる。なお、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値は、測定条件、装置の調整状態が変わっても保存されることから、同一の装置にて決定されたものではなく、別の装置にて実験的に又は理論的に予め決定された少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値がデータ記憶領域に記憶されるようになっていてもよい。
【００１６】
本発明の装置の実施の態様に於いて、検査されるべき溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々の存在比は、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む自己相関関数の理論式を少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより、検出されるようになっていてよい。理論式に於いては、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じて得られた値が少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられるようになっていてよい。また、かかるフィッティングに於いて、理論式に於ける前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間は、未知数として扱われ、フィッティング演算により与えられるようになっていてよい。かかる構成によれば、従前に於いて検査試料の蛍光測定に前後して毎回別途に行われていたコントロール試料の蛍光測定を行わなくてよくなり、検査試料が注入された容器又はウェルとは別の容器又はウェルで得られた結果（コントロール試料の並進拡散時間）をフィッティングに用いる必要がなくなるので、容器又はウェルのカバーガラスの厚みのばらつきなどに起因する光学的条件の差異は問題とならなくなる。また、検査試料中の全ての成分の並進拡散時間を未知数としたフィッティング演算を行う必要がなく、フィッティングにかかる時間を短縮することが可能となる。
【００１７】
なお、理論式に於けるストラクチャ・パラメータも、未知数として扱われ、フィッティング演算により与えられるようになっていてよく、その場合には、ストラクチャ・パラメータを得るための試料（通常、検査されるべき溶液試料中の成分に付加された蛍光標識を有する基準物質が用いられ、典型的には、蛍光色素分子そのもの）の蛍光測定も必要なくなる。（基準物質は、比較的容易に入手可能であり、カバーガラスの厚みのばらつきやカバーガラス−対物レンズ間距離のばらつきに対してストラクチャ・パラメータを略不変に維持して蛍光測定が可能である。従って、測定条件、装置の調整状態が変わる毎に、ストラクチャ・パラメータを得るために基準物質の試料を用いて得られた蛍光強度の自己相関関数値から、装置のストラクチャ・パラメータが決定され、装置内に記憶されるようになっていてよい。）
【００１８】
また、上記の如きフィッティングに於いて、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の各々は、検出値ではなく、推定値になるので、このことにより、フィッティングの精度が低下してしまうことも考えられる。そこで、本発明の装置は、フィッティングに於けるｃｈｉ２乗値が所定の閾値を越えたとき、フィッティングの精度が不十分あることの警告が発せられるよう構成されていてよく、これにより、フィッティングの精度の低い検出結果が採用されることを回避できるようになっていてよい。また、フィッティングが巧く行えるか否かは、蛍光の励起波長や検出波長によってばらつきがあるので（波長によってレーザー光の集光度合や光検出器の感度が異なるため）、ｃｈｉ２乗値のための所定の閾値は、蛍光の励起波長毎に或いは検出波長毎に設定可能となっていることが好ましい。
【００１９】
上記の本発明の装置に於ける少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比を用いるという特徴的な構成は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、蛍光相関分光分析を用いて蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出するためのコンピュータプログラムであって、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域に記憶された少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。
【００２０】
かかるコンピュータプログラムに於いても、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値は、少なくとも二種類の成分のうちの一つの成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比であってよい。また、少なくとも二種類の成分の各々の存在比は、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む自己相関関数値の理論式を少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から検出されるようになっていてよく、理論式に於いて、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じて得られた値が少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられるようになっていてよい。更に、上記の本発明のコンピュータプログラムに於いても、少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間を決定し、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を算出してデータ記憶領域に記憶する手順、予め決定された少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値をデータ記憶領域に記憶させる手順及び／又はフィッティングに於いてｃｈｉ２乗値が所定の閾値を越えたとき、フィッティングの精度が不十分あることの警告を発する手順をコンピュータに実行させるようになっていてよい。前記の理論式に於ける前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間、及び／又は、理論式に於けるストラクチャ・パラメータは、理論式を溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられるようになっていてよい。
【００２１】
更に、上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比を用いて蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々の存在比を決定する方法が提供される。従って、本発明の溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する方法は、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域に記憶された少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する過程を含むことを特徴とする。
【００２２】
かかる方法に於いても、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値が、少なくとも二種類の成分の一つの成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比であってよい。また、少なくとも二種類の成分の各々の存在比は、少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む自己相関関数値の理論式を少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から検出されるようになっていてよく、理論式に於いて少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記の少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間を乗じて得られた値が、少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられるようになっていてよい。そして、上記の方法に於いて、少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値の記憶は、少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間を決定し、少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を算出してデータ記憶領域に記憶する過程又は予め決定された少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間の比の値をデータ記憶領域に記憶する過程のいずれかにより為されてよい。前記の理論式に於ける前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間、及び／又は、理論式に於けるストラクチャ・パラメータは、理論式を溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられるようになっていてよい。
【発明の効果】
【００２３】
上記の本発明の構成によれば、コントロール試料についての蛍光測定、自己相関関数の演算及び並進拡散時間の検出の回数を大幅に低減することが可能となる。従って、検査されるべき溶液試料についての蛍光強度の測定を行う度にコントロール試料の調製を行う必要はなくなり、また、測定時間が短縮される（多数のウェルを有するマイクロプレートのウェルに試料を分注して測定を実行する場合には、コントロール試料のために余分なウェルを使用しなくてよくなる。）。
【００２４】
また、本発明では、検査されるべき溶液試料中の少なくとも二つの成分の各々の並進拡散時間は、各成分について十分な精度にて実行された測定から得られた並進拡散時間の比に基づいて決定可能となるので、検出結果の信頼性が高くなることが期待される。蛍光相関分光分析では、蛍光測定の結果を統計的に処理して並進拡散時間を算出するので、並進拡散時間の算出結果は、本質的に、ばらつきが大きい。従って、検査されるべき試料についての蛍光強度の測定を行う度にコントロール試料の各々について少ない又は限られた測定回数にて検出された並進拡散時間の値の信頼性は必ずしも高くなく、そのような並進拡散時間を用いて得られる検査されるべき試料についての検出結果は、精度が悪化しているおそれがある。一方、本発明の場合、十分な時間をかけて決定されたコントロール試料の並進拡散時間の比を用いることで、検査されるべき試料についての検出結果の精度を高くすることができることとなる。
【００２５】
更にまた、本発明によれば、試料が分注されるマイクロプレートの底面を構成するカバーガラスの厚さのウェル毎のばらつきなど、容器又はウェル毎の光学的な条件のばらつきによる測定精度への影響が低減されることとなる。上記から理解される如く、本発明の構成では、容器又はウェル毎の光学的な条件によらず略不変な複数成分の分子同士の並進拡散時間の値の比を用いて、検査試料とは別に実行されていたコントロール試料の蛍光測定を行うことなく、蛍光相関分光分析測定による試料中の複数成分の各存在比の検出が可能となっている。即ち、本発明に於いては、検査試料の蛍光強度の自己相関関数から試料中の複数成分の各存在比を決定する際に、検査試料の容器又はウェルとは別の容器又はウェルにて行われた測定により得られた並進拡散時間を用いないので、容器又はウェル毎の光学的な条件のばらつきは測定精度に何等影響を及ぼさなくなる。従って、実験に於いては、厚みのばらつきが非常に小さい高価なカバーガラスを毎回使用する必要はなくなり、測定・解析のコストが低減されることとなる。また、試料中の複数成分の各存在比の検出するために検査試料の蛍光強度の自己相関関数に理論式をフィッティングする場合、いずれかの成分の並進拡散時間の値が分かれば、その他の成分の並進拡散時間は、並進拡散時間の比から自動的に分かるので、フィッティングに於ける未知数が低減され、これにより、フィッティングに要する時間を短縮することが可能となり、また、フィッティング演算の精度も向上されることが期待される。
【００２６】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１（Ａ）は、本発明による蛍光相関分光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。
【図２】図２は、本発明の蛍光相関分光分析装置にて算出される蛍光強度の自己相関関数を模式的に示したグラフ図（左図）と、計測される試料中の分子を模式的に示した図（右図）である。（Ａ）は、検査試料中に含まれる一つの成分のコントロール試料１について得られる自己相関関数、（Ｂ）は、検査試料中に含まれるもう一つの成分のコントロール試料２について自己相関関数、（Ｃ）は、検査試料について得られる自己相関関数を、それぞれ示している。図中、矢印は、検査試料中の各成分の並進拡散時間（τ１、τ２）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００２９】
蛍光相関分光分析装置の構成と分析方法の概要
図１（Ａ）を参照して、本発明による好ましい実施形態である蛍光相関分光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。蛍光相関分光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよい。端的に述べれば、まず、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μｌの溶液試料が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の溶液試料中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。溶液試料中の成分（分子）には、蛍光色素等の蛍光標識が付加されており、かかる成分が溶液試料中にてブラウン運動により移動し、励起領域に進入すると、その間、蛍光標識が励起され蛍光が放出される。放出された蛍光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入される。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如き対物レンズ８の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた蛍光のみが光検出器１６に到達し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示された対物レンズ８の焦点領域は、コンフォーカル・ボリュームと称され、その体積は、通常、１ｆｌ程度である。
【００３０】
かくして、光検出器１６にて検出された蛍光は、逐次的に、時系列の電気信号に変換された後、コントローラー１７を経て、コンピュータ１８へ入力される。そして、コンピュータ１８に於いては、図示していないメモリ装置に記憶されたプログラムに従って、蛍光強度Ｉ（ｔ）の自己相関関数Ｃ（τ）の演算が
【数２】
（ここに於いて、ｔ、τ及びｎは、それぞれ、計測時間、相関時間及び総和演算の項数である。）
を用いて為され、種々の解析が為される。かかる解析に於いては、基本的には、蛍光の自己相関関数の値に対して、下記の式（３）がフィッティングされ、並進拡散時間τＤ、即ち、コンフォーカル・ボリューム内に進入した成分の滞在時間の平均と、コンフォーカル・ボリューム内に滞在する（蛍光を発する）粒子の数の平均Ｎとが決定される。
【数３】
ここに於いて、ＡＲは、ストラクチャ・パラメータと称される装置の調整状態を表す特性値であり、図１（Ｂ）に例示されている如きコンフォーカル・ボリュームの長軸方向の長さｗｚと半径ｗｏとの比（＝ｗｚ／ｗｏ）に相当する。また、溶液試料中に複数の（少なくとも２種類の）成分が含まれており、これらの成分の各々の存在比が決定される場合には、自己相関関数に対して下記の式をフィッティングして各成分の存在比ｙｉが決定される。
【数４】
ここに於いて、τｉは、各成分の並進拡散時間である。
【００３１】
上記の如き蛍光相関分光分析装置１を用いて任意の溶液試料について実際に測定を実行する際には、一般的には、数秒〜十数秒間程度の蛍光測定を数回実行し、各回の測定毎に自己相関関数の演算とフィッティングが為され、並進拡散時間、平均粒子数又は各成分の存在比が算出され、数回の算出値の平均値が最終的な値として採用される。
【００３２】
また、任意の溶液試料について上記の如き蛍光相関分光分析による測定を実行する場合には、典型的には、全ての蛍光測定に先立って、装置の調整状態の確認が行われる。特に、自己相関関数値及び並進拡散時間、平均粒子数等の検出値に影響を与えるコンフォーカル・ボリュームの寸法（半径ｗｏと長軸方向の長さｗｚ）は、レーザー光の集光状態又はパワー、対物レンズ８の上方に配置される試料容器又はマイクロプレートのウェルの底面を為すカバーガラスの厚み並びに対物レンズの補正環の設定状態、ピンホール１３の位置及び／又は寸法によって異なる。そこで、通常、検査されるべき溶液試料中の成分に付加されている蛍光標識を含む基準物質（蛍光色素分子そのものであってよい。）の溶液について、蛍光測定、自己相関関数値の演算が実行され、算出された自己相関関数値に対して式（３）のフィッティングし、ストラクチャ・パラメータＡＲ（及び並進拡散時間τＤ）が決定される。そして、このストラクチャ・パラメータＡＲの値が、所定の範囲内に収まっていれば、装置の調整状態が正常であると判断され、得られたＡＲが、その後に行われる測定・解析に於いて用いられる（装置の調整状態が正常でなければ、調整がやり直される。）。
【００３３】
更に、複数の成分を含む溶液試料中の各成分の存在比を決定する測定・解析が行われる場合には、各成分の並進拡散時間τｉが決定される（図２（Ａ）、（Ｂ）参照）。そのために、各成分のみを含有するコントロール試料が調製され、かかる各コントロール試料について、蛍光測定、自己相関関数値の演算が実行され、各コントロール試料について算出された自己相関関数値に対してストラクチャ・パラメータＡＲを既知数として式（３）のフィッティングが為されて、各成分の並進拡散時間τｉが算出される。そして、含有する成分の存在比が検査されるべき試料の蛍光の自己相関関数値に対する式（４）のフィッティングに於いて、上記の如く決定されたストラクチャパラメータＡＲと各成分の並進拡散時間τｉとが既知数として用いられる（図２（Ｃ）参照）。
【００３４】
なお、ストラクチャ・パラメータＡＲ、各成分の並進拡散時間τｉを決定するための蛍光標識の溶液、コントロール試料についての蛍光測定も、それぞれ、通常、数回実行され、それらの蛍光自己相関関数から算出されたＡＲ、τｉの平均値が最終的な値として採用される。
【００３５】
本発明による蛍光相関分光分析の改良
上記の如き蛍光相関分光分析を用いた複数の成分を含む溶液試料中の各成分の存在比の測定・解析に於いて、「発明の概要」の欄に於いて述べたように、式（４）によるフィッティングに用いられるストラクチャ・パラメータＡＲと各成分の並進拡散時間τｉは、蛍光測定時の測定条件、例えば、温度、溶液の粘度等や装置の調整状態、特に、コンフォーカル・ボリュームの寸法等によって変動するパラメータである。従って、従前では、或る検査されるべき試料についての測定・解析を行う度に、基準物質溶液と各成分のコントロール試料とが準備され（例えば、図１（Ａ）に例示されている如き複数のウェル１０が配列されたマイクロプレート９が試料容器として使用される場合、いくつかのウェルに基準物質溶液と各成分のコントロール試料とが分注される。）、基準物質溶液と各成分のコントロール試料の各々について蛍光測定と自己相関関数の演算が行われていた。しかしながら、特に、コントロール試料は、高価又は希少な試料である場合があり、また、調製にも手間がかかることがある。
【００３６】
更に、試料容器であるマイクロプレートのウェルの光学的な条件が各々異なるような場合（例えば、廉価なマイクロプレートの場合）、コンフォーカル・ボリュームがウェル毎に変化し得るため、検査試料とは別のウェルで為された各成分のコントロール試料についての蛍光測定と自己相関関数の演算から得られる並進拡散時間τｉを、検査試料についての測定・解析を行うためのフィッティングに於いて固定値（既知値）として用いると、検出結果（検査試料中の各成分の存在比）の精度が悪化し得ることとなる。かかるウェルの光学的な条件が各々異なることに起因する精度の悪化を回避するために、検査試料中の各成分の並進拡散時間を、未知の値として、検査試料についての測定・解析を行うためのフィッティングを行うことも原理的には可能であるが、フィッティングに時間を要することとなり、検査試料の数が多くなる場合には不利である。また、分子量の大きい成分の、フィッティングにより得られる並進拡散時間の値は、変動幅が大きく、全ての成分の並進拡散時間を未知数としてフィッティングを行う上記の手法は、不正確なものと成り得る。
【００３７】
そこで、本発明に於いては、任意の複数成分のそれぞれの並進拡散時間の絶対値は、カバーガラスの厚さ等の光学的条件によって変動するものの、それらの複数成分の並進拡散時間の比が、光学的条件によらず略不変であることを利用して、検査試料とは別に為されるコントロール試料のついての蛍光測定をできるだけ少なくできるようにし、廉価なカバーガラスの使用を許し、フィッティングにかかる時間を削減し、安定なフィッティングが行えるように、蛍光相関分光分析の処理が以下の如く改良される。
【００３８】
（ｉ）改良の原理
或る成分ｉについて、その並進拡散時間τｉは、
τｉ＝ｗｏ２／４Ｄｉ …（５）
により定義される。ここで、Ｄｉは、成分ｉの分子の拡散定数である。拡散定数は、分子が水溶液中で半径ｒｉの球体にて振舞うと仮定したとき、
Ｄｉ＝ｋＢ・Ｔ／６π・ｒｉ・η（Ｔ） …（６）
［ここで、ｋＢは、ボルツマン定数であり、Ｔは、溶液試料の絶対温度であり、η（Ｔ）は、溶液試料の粘性係数であり、温度Ｔの関数である。］
により与えられる。結局、並進拡散時間τｉは、
τｉ＝（３π／２ｋＢ）・ｗｏ２・（η（Ｔ）／Ｔ）・ｒｉ …（７）
となる。そこで、複数の成分を含む溶液試料について蛍光測定することを考えると、式（７）に於いて、ｗｏは、コンフォーカル・ボリュームの寸法であり、η（Ｔ）／Ｔは、測定時の環境条件であり、溶液試料中の各成分について共通の値である。かくして、成分１，２，…，ｉ，…の並進拡散時間の比τ１：τ２：…：τｉ：…は、コンフォーカル・ボリューム、測定時の環境条件が変わっても、
τ１：τ２：…：τｉ：…＝ｒ１：ｒ２：…：ｒｉ：… …（８）
により与えられ、保存されることとなる。従って、各成分について、つまり、各コントロール試料について、少なくとも１回、同一のコンフォーカル・ボリューム、測定時の環境条件に於いて並進拡散時間を測定し、その比を記憶しておけば、コンフォーカル・ボリューム、測定時の環境条件が変わっても、コントロール試料の蛍光測定、自己相関関数の演算を行わずに、各成分の並進拡散時間の値が推定できることとなる。
【００３９】
（ii）確認実験
上記の如く、複数の成分を含む溶液試料の蛍光相関分光分析に於いて、各成分の並進拡散時間の比が保存されることは、以下の実験により確認された。実験に於いては、蛍光色素の一つであるＡＴＴ０６３３が付加されたＤＮＡプライマー（図２（Ａ）右図）と、かかるＡＴＴ０６３３が付加されたプライマーによって伸長されたＤＮＡ（図２（Ｂ）右図）をそれぞれ単独にて含む溶液試料について、厚さの異なるカバーガラスにより底面が構成されたマイクロプレートを用いて、上記の蛍光測定を行い、測定された蛍光の自己相関関数から並進拡散時間を算出した。なお、プライマーの長さは、１５ベース（塩基配列は、agctcgtgggagggc）、ＤＮＡの長さは、１３４ベースペア（塩基配列は、cagctcgtgggagggtggcatccggcagcagctgaacgtgacaacacgtcttccaaagcggtcatcccctggaggagcagacacaggtgagcctctgtgccaccttctcctagaaaatcctcaggcacttagca）である。また、カバーガラスの厚さは、標準的な０．１７ｍｍのものと、それから±０．０２ｍｍの範囲のものを用いた。（厚さの誤差が０．０１ｍｍ以下のカバーガラスを用いた比較的大きな面積のマイクロプレートは、高価である。）結果は、以下の通りとなった。
【表１】
上記の結果の如く、同一の試料でも並進拡散時間の絶対的な値は、カバーガラスの厚さが異なると変動することが確認される。（０．１７ｍｍから離れると、並進拡散時間τ１、τ２は、ともに増大した。）しかしながら、並進拡散時間の値の比は、表１の最下段に示されている如く、略保存されることが確認された。
【００４０】
（iii）改良の構成
本実施形態に於いては、測定条件等が変わっても、複数の成分を含む溶液試料中の各成分の並進拡散時間の比が保存されるという上記の知見を用いて、蛍光相関分光分析を用いて複数の成分を含む溶液試料中の各成分の存在比を決定する方法及びそのための蛍光相関分光分析装置１の構成並びに装置１の作動を制御するコンピュータプログラムの一部が変更される。
【００４１】
複数の成分を含む或る溶液試料中の各成分の存在比を決定する際に於いては、各成分の並進拡散時間の比が未知である場合、まず、かかる各成分の並進拡散時間の比が、例えば、上記に説明された蛍光相関分光分析の手法に従って決定されてよい。具体的には、まず、各成分のコントロール試料が調製され、マイクロプレートのウェルに、基準物質（蛍光色素分子そのものであってよい。）と、検査試料に含まれる各成分に対応するコントロール試料とが分注される。その際、試料容器として用いられるマイクロプレートとして、ウェルの間で光学的な条件の変動が少ないもの、具体的には、マイクロプレートの底面を成すカバーガラスの厚さの変動の少ないものが用いられるべきであり、典型的には、公称の厚さが０．１７ｍｍであり、変動が±０．０１ｍｍ以下のものが用いられる。そして、それぞれのウェルについて、蛍光強度が測定され、自己相関関数の演算、式（３）のフィッティングを用いた並進拡散時間の算出が実行される（コントロール試料の蛍光測定に先立って、基準物質溶液を用いたストラクチャ・パラメータＡＲの算出と基準物質の並進拡散時間の算出が為される点は、従前と同様である。）。
【００４２】
かくして、各成分のコントロール試料についての並進拡散時間τｉが算出されると、各成分のうちの任意に選択された成分の並進拡散時間に対する各成分の並進拡散時間の比κｉが、算出された各成分の並進拡散時間を選択された成分の並進拡散時間で規格化することにより、即ち、
κｉ＝τｉ／τ１ …（９）
（τ１は、選択された成分の並進拡散時間とする。）
により決定され、任意のデータ記憶領域に保存される。例えば、検査されるべき溶液試料が、蛍光標識された二つの成分、成分１、成分２を含むときには、成分１のコントロール試料１、成分２のコントロール試料２について、蛍光測定を行い、図２（Ａ）、（Ｂ）にそれぞれ例示されている如き自己相関関数を演算して並進拡散時間τ１、τ２を決定した後、コントロール試料１を選択された成分として設定すると、並進拡散時間の比κ１、κ２が
κ１＝τ１／τ１ …（１０ａ）
κ２＝τ２／τ１ …（１０ｂ）
により決定され記憶される。（κ１は、敢えて計算されなくてもよい。）
【００４３】
なお、上記の選択された成分の並進拡散時間に対する各成分の並進拡散時間の比は、蛍光相関分光分析以外の手法により、実験的に又は理論的に決定されたものであってもよい。例えば、式（５）から理解される如く、選択された成分の並進拡散時間に対する各成分の並進拡散時間の比は、拡散定数の比となるので、各成分の拡散定数がわかったものであれば、
κｉ＝Ｄ１／Ｄｉ …（１０ｃ）
（Ｄ１は、選択された成分の拡散定数とする。）
により算出されてよい。また、選択される成分は、典型的には、検査試料中に含まれる成分のうち、分子量の小さい成分が選択されてよいが、これに限定されないことは理解されるべきである。上記の処理により決定された各成分の並進拡散時間の比は、装置のデータ記憶領域に記憶される。
【００４４】
かくして、各成分の並進拡散時間の比が決定された後、溶液試料中の各成分の存在比を決定する際には、検査試料が調製され、検査試料の蛍光測定が為され、自己相関関数が算出される（ストラクチャ・パラメータＡＲの算出のために、検査試料の蛍光測定に前後して、基準物質溶液の蛍光測定が為され、その結果から算出されるストラクチャ・パラメータＡＲが用いられてよい。）。しかる後、検査試料についての自己相関関数に対して、上記の各成分の並進拡散時間の比κｉと選択された成分の並進拡散時間τ１との積を各成分の並進拡散時間として含む
【数５】
がフィッティングされ、各成分の存在比ｙｉが決定される。例えば、検査試料が、成分１、成分２を含むときには、検査試料の蛍光測定を行い、図２（Ｃ）に例示されている如く得られた自己相関関数に対して、
【数６】
がフィッティングされ、成分１の存在比ｙ１と、成分２の存在比ｙ２＝１−ｙ１とが決定される。（上記の式（１１）又は（１２）に於いて、選択された成分の並進拡散時間τ１は、未知数であり、フィッティングにより同時に決定される値である。ストラクチャ・パラメータＡＲは、検査試料の測定ともに基準物質試料の測定を行い、その結果から算出された値を用いてもよく、或いは、式（１１）又は（１２）のフィッティングに於いて同時に決定されてもよい。）
【００４５】
なお、平均粒子数Ｎ（式（１１）又は（１２）のフィッティングに於いて同時に決定される。）を用いて、成分１、２の粒子数Ｎ１、Ｎ２が、
Ｎ１＝Ｎ・ｙ１ …（１３ａ）
Ｎ２＝Ｎ・ｙ２ …（１３ｂ）
により与えられてよい。なお、コンフォーカル・ボリュームの体積Ｖｃが任意の手法にて決定されると、成分１、２の濃度が、
Ｎ・ｙ１／Ｖｃ；Ｎ・ｙ２／Ｖｃ
により決定される。
【００４６】
上記の蛍光相関分光分析を達成するために、コンピュータ１８には、並進拡散時間の比κｉを記憶するデータ記憶領域が準備され、並進拡散時間の比κｉを取得し記憶するための構成が設けられる。また、コンピュータ１８を作動させるコンピュータプログラムに於いては、コントロール試料の自己相関関数から算出される並進拡散時間の比κｉを取得し記憶する手順、データ記憶領域に記憶された並進拡散時間の比κｉを用いて上記の式（１１）又は（１２）のフィッティングをする手順が組み込まれる。
【００４７】
更に、各成分の並進拡散時間の比κｉの値は、測定条件等が変わっても保存されることから、必ずしも同一の蛍光相関分光分析装置１にて測定された値でなくてもよい。従って、蛍光相関分光分析装置１並びにコンピュータプログラムは、装置１の外部で別に決定された各成分の並進拡散時間の比κｉを操作者が装置１のデータ領域へ入力できるようになっていてよい。入力される並進拡散時間の比κｉの値は、任意の手法、例えば、高度な分子動力学的な計算によって決定された値であってもよい。
【００４８】
（iv）フィッティング精度の悪化防止
上記の如く蛍光測定から得られた自己相関関数に対して並進拡散時間の比κｉを用いた式（１１）又は（１２）をフィッティングする場合、各成分の並進拡散時間は、実測値ではなく、推定値であり、このことに起因して、フィッティング精度が悪化してしまうこともあり得る。そこで、本実施形態に於いては、式（１１）又は（１２）によるフィッティング精度が操作者に確認できるようになっていてよい。具体的には、式（１１）又は（１２）のフィッティングが為される際、実際の自己相関関数値とフィッティング関数値との差異を表す特性パラメータであるｃｈｉ２乗値が算出される（ｃｈｉ２乗値は、端的に述べれば、実際の自己相関関数値とフィッティング関数値との差の２乗の総和である。）。そして、ｃｈｉ２乗値が所定の閾値を越えたときには、フィッティングの精度が不十分であることがコンピュータのモニター上に表示されるなどして、操作者に対して警告が発せられるよう構成される。また、装置に於いて、レーザー光の集光度合や光検出器の感度が波長によって異なるため、フィッティングが巧く行えるか否かは、励起波長や検出波長（蛍光の波長）によって異なることがある。そこで、ｃｈｉ２乗値のための所定の閾値は、励起波長毎及び／又は検出波長毎に設定できるよう構成されていてよい。
【００４９】
かくして、上記の実施形態によれば、測定条件等が変わっても、複数の成分を含む溶液試料中の各成分の並進拡散時間の比が保存されるという知見に基づき、蛍光相関分光分析に於いて任意の溶液試料に含まれる成分の存在比を検出する場合に、一度、各成分の並進拡散時間の比が取得されれば、その後は、各成分のコントロール試料の蛍光測定及び自己相関関数の演算が省略することができることとなる。これにより、コントロール試料を節約することが可能となり、また、コントロール試料のための測定・解析時間を大幅に低減され、スループットを向上することが可能となる（溶液試料を複数のウェルが配列されたマイクロプレートに分注して測定が為される場合には、ウェルをコントロール試料のために割り当てる必要性が低減される。）。
【００５０】
また特に、上記の実施形態に於いて特徴的な利点は、或る容器又はウェルに分注された検査試料から得られた蛍光強度の自己相関関数から検査試料中の各成分の存在比を算出するフィッティング演算に於いて、別の容器又はウェルにて測定・検出された並進拡散定数の値を使用しなくてよく、これにより、マイクロプレートの底面を構成するカバーガラスの厚さがウェルの位置毎にばらつきがある場合など、試料の分注される容器又はウェルによって光学的条件が異なることを気にせずに測定及び解析が実行可能であるということである。従って、検査試料についての蛍光測定の際に用いるマイクロプレートの底面のカバーガラスとして、ばらつきの少ない高価な物を用いる必要性が低減され、費用面で有利となる（廉価なカバーガラスを使用してもそのことによる精度の悪化がない。）。また、上記の実施形態のフィッティング演算に於いては、任意の（通常の）測定条件又は光学的条件に於いて略不変的に保存される各成分の並進拡散時間の比を固定値とすることで、未知値（各成分の存在比、選択された成分の並進拡散時間（τ１）、平均粒子数Ｎ、場合によって、ストラクチャ・パラメータＡＲ）の数が大幅に低減されているので、全ての成分の並進拡散時間を未知定数として演算する場合よりも大幅に演算時間が短縮されることとなる。そして、各成分の並進拡散時間の比さえ、十分に精度良く決定されていれば、検査試料についての検出結果の精度を高くすることができる。（検査試料中に分子量の大きい成分が含まれている場合、その成分のフィッティングにより得られる拡散時間の値の変動幅が大きく、誤差要因の一つとなり得るが、本実施形態では、並進拡散時間を直接にフィッティングから求める成分は、分子量の小さいものを選択できるので、かかる誤差要因を回避することができる。）
【００５１】
上記の本発明の手法は、任意の複数の分子の結合又は解離の結合のし易さ又は結合定数若しくは解離定数を決定する際などに有利に用いられる。
【符号の説明】
【００５２】
１…蛍光相関分光分析装置
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１８…コンピュータ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光相関分光分析による蛍光分析装置、蛍光分析方法並びにそのためのコンピュータプログラムに係り、より詳細には、蛍光相関分光分析を用いて、種々の分子、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸及びその他の生体分子（以下、「生体分子等」とする。）の相互作用、結合・解離状態の検出及び解析を行うための装置、方法並びにコンピュータプログラムに係る。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、分子レベルの蛍光を測定・解析することが可能な蛍光相関分光分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ)が利用できるようになっている（非特許文献１、２、）。蛍光相関分光分析に於いては、端的に述べれば、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）が可能な超高感度の光検出装置とを用いて、溶液試料中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度が測定され、その蛍光強度の自己相関関数が演算される。自己相関関数とは、蛍光分子等からの蛍光強度の揺らぎの指標となるものであり、蛍光強度の揺らぎは、微小領域内の蛍光分子等の数の揺らぎに対応するので、自己相関関数の値には、微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留数（平均分子数）が反映されている。従って、かかる自己相関関数の値から蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報が得られ、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象を検出することができる。
【０００３】
生物科学、医学又は薬学の分野に於いては、上記の如き蛍光相関分光分析を生体分子等の状態及び運動の検出・観測に応用し、種々の生体分子等の現象・反応を細胞レベル又は分子レベルで解明する試みがなされている（特許文献１、２、非特許文献３）。例えば、互いに結合する一対の分子（抗原と抗体、ＤＮＡとタンパク質など）のうち、少なくとも一方の分子に蛍光分子等の蛍光標識を付加した上で、それらの分子を反応させると、一方の分子上の蛍光分子等の運動や状態の変化が蛍光分子からの蛍光強度の揺らぎに反映され、これにより、タンパク質又はＤＮＡ等の分子間の結合が検出できることとなる。特に、蛍光が観察される微小領域に複数成分の蛍光分子等が出入りする場合の蛍光強度の自己相関関数値を与えるモデル式が提案されており、かかるモデル式を用いると、溶液試料中の複数成分の蛍光分子等の存在比が決定され、その値から解離定数、結合定数なども算出できるようになってきている（非特許文献２）。また、蛍光相関分光分析は、従前の生化学的な方法に比して極めて微量な試料にて且短時間にて計測が可能であるので、医学・薬理学等の分野に於いて、種々の病気の臨床診断や生理活性物質のスクーリングに於ける応用も期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金城政孝、蛋白質 核酸 酵素 Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁 １９９９年
【非特許文献２】エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁
【非特許文献３】加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の蛍光相関分光分析を用いて複数の種類の成分の分子が共存する試料中の各成分の存在比（分子の数の比）を検出する場合、例えば、少なくとも二つの成分の分子間の結合比の検出や分子量の変化を伴う反応の進行の度合の検出を行う場合などに於いて、検査されるべき溶液試料（検査試料）についての蛍光強度の測定、自己相関関数の算出が実行された後、典型的には、算出された自己相関関数Ｃ（τ）に対して下記の式のフィッティングが為され、各成分の存在比ｙｉが決定される。
【数１】
ここに於いて、Ｎは、コンフォーカル・ボリューム内に存在する蛍光分子等の数の平均値であり、ＡＲは、ストラクチャ・パラメータと称されるコンフォーカル・ボリュームの長軸ｗｚと横方向半径ｗｏとの比（ＡＲ＝ｗｚ／ｗｏ）であり（図１（Ｂ）参照）、τｉは、各成分の並進拡散時間である。従って、式（１）による自己相関関数のフィッティングを実行して、各成分の存在比ｙｉを決定するためには、ストラクチャパラメータＡＲと各成分の並進拡散時間τｉが予め決定されていることが好ましい（Ｎは、Ｃ（０）により与えられるので、フィッティングにより与えられる。）。この点に関し、ストラクチャパラメータＡＲと並進拡散時間τｉとには、測定条件や装置の調整による変動がある。そこで、通常、精度良く測定を実行しようとする場合には、検査試料についての蛍光強度の測定を行う度に、検査試料中の成分に付加されている蛍光標識（通常、蛍光色素）の試料について蛍光強度の測定、自己相関関数の算出が為され、算出された自己相関関数の値からストラクチャ・パラメータＡＲが決定され、また、試料中の各成分が単独にて存在する状態の試料（例えば、或る蛍光分子等が他の分子と結合する反応の場合には、全ての蛍光分子等が当該他の分子に結合した状態の試料と全ての蛍光分子等が相手の分子から解離した状態の試料：以下、試料中の各成分が単独にて存在する状態の試料を「コントロール試料」と称する。）について蛍光強度の測定、自己相関関数の算出が為され、各成分の並進拡散時間の算出が実行される。例えば、２成分を含む検査試料中に於ける成分１、２の存在比を蛍光強度の自己相関関数のフィッティングにより決定する場合、検査試料と伴に、成分１、２のコントロール試料が別途に準備される。そして、検査試料の蛍光測定と前後して、それらコントロール試料について蛍光測定が実行されて、それらの蛍光強度の自己相関関数のフィッティングから各成分の並進拡散時間τ１、τ２が決定され、かかるτ１、τ２が検査試料の蛍光強度の自己相関関数のフィッティングに於いて、固定値として用いられる。
【０００７】
しかしながら、上記の如く、検査試料についての蛍光強度の測定を行う度に、蛍光標識試料、コントロール試料のついての蛍光測定、自己相関関数の算出を行うことは、検査時間や手間を要することとなる。検査試料中の成分に付加される蛍光標識の試料は、入手及び調製が比較的容易であるが（通常、予め十分な量にて準備されている。）、特に、コントロール試料は、しばしば、高価又は希少な試料となる場合があり、また、調製にも手間がかかることがあるので、コントロール試料のついての蛍光測定の回数は、できるだけ少なくできることが好ましい。
【０００８】
また、検査試料の蛍光強度の測定を行う度に、例えば、検査試料の蛍光測定と前後して、蛍光標識試料及びコントロール試料の蛍光測定を行う場合、検査試料と、蛍光標識試料及びコントロール試料とは、別々の容器に注入されて測定されることになるので、一連の測定の間に温度等の環境条件に変化がなくても、光学的な条件が若干異なることがあり、そのことが測定精度に影響し得ることが見出されている。例えば、典型的な測定に際しては、検査試料、蛍光標識試料及びコントロール試料は、底面がカバーガラスにより成り複数のウェルを有するマイクロプレートと称される容器の異なるウェルに別々に注入され、蛍光測定が為される。その際、各ウェルの光学的な条件が互いに異なる場合、例えば、マイクロプレートの底面を成すカバーガラスの厚さがウェルの位置毎に異なる場合（カバーガラスの厚さにばらつきがある場合）、或いは、対物レンズとカバーガラス面までの距離がウェル毎に変化してしまう場合などには、励起光の集光状態がウェル毎に変化し、従って、コンフォーカル・ボリュームの寸法が変化することが起き得る。そうなると、検出される並進拡散時間がウェル毎に異なることになるので、コントロール試料や蛍光標識試料について得られた並進拡散時間の値を検査試料のフィッティングに用いると不正確な結果を導くこととなる（本発明の発明者の経験に於いて、同一のマイクロプレートのウェルに於いて、ストラクチャ・パラメータＡＲの値については、略一定に保って測定が可能であることが見出されている。）。
【０００９】
各ウェルの光学的な条件が互いに異なることに起因する不具合は、厚さのばらつきの少ないカバーガラスを用いることにより解決可能であるが、そのような厚さのばらつきの少ないカバーガラスは高価である。また、検査試料の蛍光強度の自己相関関数から並進拡散時間を検出する際に、試料中の各成分の並進拡散時間として、コントロール試料や蛍光標識試料について得られた並進拡散時間の値を用いずに、未知数として、フィッティングにより決定することも原理的には可能であるが、フィッティングに時間を要し、また、分子量の大きい成分の、フィッティングにより得られる値は、その変動幅が大きいため、検出精度が低下することとなる。
【００１０】
かくして、本発明の一つの課題は、蛍光相関分光分析を用いて複数の種類の成分の分子が共存する試料中の各成分の存在比を検出する測定に於いて、コントロール試料の蛍光測定の回数をできるだけ少なくすることができると伴に、上記の如き複数の容器又はウェルの光学的な条件が互いに異なることに起因する不具合を回避することのできる蛍光相関分光分析装置、方法又はそのためのコンピュータプログラムを提供することである。
【００１１】
この点に関し、本発明の発明者による研究によれば、任意の複数成分の分子のそれぞれの並進拡散時間の絶対的な値は、カバーガラスの厚さを含む測定条件、装置の調整等による変動があるところ、複数成分の分子同士の並進拡散時間の値の比、即ち、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対するその他の少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比は、測定条件や装置の調整状態等が異なっていても、略不変であることが実験的に確認された。例えば、任意の成分１、２の並進拡散時間τ１、τ２の比（τ２／τ１）は、任意の通常の測定条件や装置の調整状態に於いて、略一定の値となる。本発明では、かかる知見を生かして、上記の課題を達成することが提案される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、一つの態様として、蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出することができるよう構成された蛍光相関分光分析装置であって、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域を含み、その記憶された少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて、少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出することを特徴とする装置が提供される。
【００１３】
既に触れたように、任意の分子の並進拡散時間の値は、蛍光測定時の測定条件、例えば、温度、溶液の粘度等、及び装置の調整状態、特に、コンフォーカル・ボリュームの寸法（レーザー光の集光状態や溶液試料の容器のカバーガラスの厚みなどによって変化する。）等によって変動するところ、本発明の発明者による実験によれば、任意の複数の種類の分子同士の並進拡散時間の値の比は、測定条件、装置の調整状態によらず略一定となることが確認された。そこで、本発明では、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を装置に記憶しておき、溶液試料内の少なくとも二種類の成分の各々の存在比は、かかる並進拡散時間の比の値を参照して溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から検出されるよう構成される。かかる構成によれば、測定条件、装置の調整状態が変わる毎に行っていた検査されるべき溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々、即ち、コントロール試料の並進拡散時間の検出を省略することが可能となり、従って、コントロール試料の調製、測定、解析を大幅に低減することが可能となる。また、或る溶液試料についての測定に際して、その溶液試料に含まれている成分同士の並進拡散時間の値の比が分かっている場合には、コントロール試料の測定を行う必要がなくなるため、測定結果の解析（各成分の存在比の検出）に於いて、溶液試料のウェル又は容器とは別のウェル又は容器にて測定・検出された値を用いる必要がなくなり、複数のウェルの光学的な条件が互いに異なることに起因する不具合は問題とならなくなる。
【００１４】
なお、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値は、典型的には、少なくとも二種類の成分のうちの一つの成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間の比であってよいが、これに限定されない。少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間の絶対的な値は、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じた値により与えられる。
【００１５】
上記の本発明の装置の構成に於いて、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値は、一つの態様に於いては、少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から決定された少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間から算出されて、前記のデータ記憶領域に記憶されるようになっていてよい。この点に関し、一旦、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値が決定されれば、その比の値は、測定条件、装置の調整状態が変わっても保存されるので、少なくとも二種類の成分の各々の蛍光測定、自己相関関数の演算、並進拡散時間の算出の処理は、各成分について同一の測定条件及び装置の調整状態で十分な精度にて少なくとも一回ずつ行われればよく、これにより、検査に要する時間や手間が大幅に低減されることとなる。なお、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値は、測定条件、装置の調整状態が変わっても保存されることから、同一の装置にて決定されたものではなく、別の装置にて実験的に又は理論的に予め決定された少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値がデータ記憶領域に記憶されるようになっていてもよい。
【００１６】
本発明の装置の実施の態様に於いて、検査されるべき溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々の存在比は、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む自己相関関数の理論式を少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより、検出されるようになっていてよい。理論式に於いては、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じて得られた値が少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられるようになっていてよい。また、かかるフィッティングに於いて、理論式に於ける前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間は、未知数として扱われ、フィッティング演算により与えられるようになっていてよい。かかる構成によれば、従前に於いて検査試料の蛍光測定に前後して毎回別途に行われていたコントロール試料の蛍光測定を行わなくてよくなり、検査試料が注入された容器又はウェルとは別の容器又はウェルで得られた結果（コントロール試料の並進拡散時間）をフィッティングに用いる必要がなくなるので、容器又はウェルのカバーガラスの厚みのばらつきなどに起因する光学的条件の差異は問題とならなくなる。また、検査試料中の全ての成分の並進拡散時間を未知数としたフィッティング演算を行う必要がなく、フィッティングにかかる時間を短縮することが可能となる。
【００１７】
なお、理論式に於けるストラクチャ・パラメータも、未知数として扱われ、フィッティング演算により与えられるようになっていてよく、その場合には、ストラクチャ・パラメータを得るための試料（通常、検査されるべき溶液試料中の成分に付加された蛍光標識を有する基準物質が用いられ、典型的には、蛍光色素分子そのもの）の蛍光測定も必要なくなる。（基準物質は、比較的容易に入手可能であり、カバーガラスの厚みのばらつきやカバーガラス−対物レンズ間距離のばらつきに対してストラクチャ・パラメータを略不変に維持して蛍光測定が可能である。従って、測定条件、装置の調整状態が変わる毎に、ストラクチャ・パラメータを得るために基準物質の試料を用いて得られた蛍光強度の自己相関関数値から、装置のストラクチャ・パラメータが決定され、装置内に記憶されるようになっていてよい。）
【００１８】
また、上記の如きフィッティングに於いて、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の各々は、検出値ではなく、推定値になるので、このことにより、フィッティングの精度が低下してしまうことも考えられる。そこで、本発明の装置は、フィッティングに於けるｃｈｉ２乗値が所定の閾値を越えたとき、フィッティングの精度が不十分あることの警告が発せられるよう構成されていてよく、これにより、フィッティングの精度の低い検出結果が採用されることを回避できるようになっていてよい。また、フィッティングが巧く行えるか否かは、蛍光の励起波長や検出波長によってばらつきがあるので（波長によってレーザー光の集光度合や光検出器の感度が異なるため）、ｃｈｉ２乗値のための所定の閾値は、蛍光の励起波長毎に或いは検出波長毎に設定可能となっていることが好ましい。
【００１９】
上記の本発明の装置に於ける少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比を用いるという特徴的な構成は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、蛍光相関分光分析を用いて蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出するためのコンピュータプログラムであって、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域に記憶された少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。
【００２０】
かかるコンピュータプログラムに於いても、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値は、少なくとも二種類の成分のうちの一つの成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比であってよい。また、少なくとも二種類の成分の各々の存在比は、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む自己相関関数値の理論式を少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から検出されるようになっていてよく、理論式に於いて、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じて得られた値が少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられるようになっていてよい。更に、上記の本発明のコンピュータプログラムに於いても、少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間を決定し、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を算出してデータ記憶領域に記憶する手順、予め決定された少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値をデータ記憶領域に記憶させる手順及び／又はフィッティングに於いてｃｈｉ２乗値が所定の閾値を越えたとき、フィッティングの精度が不十分あることの警告を発する手順をコンピュータに実行させるようになっていてよい。前記の理論式に於ける前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間、及び／又は、理論式に於けるストラクチャ・パラメータは、理論式を溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられるようになっていてよい。
【００２１】
更に、上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比を用いて蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々の存在比を決定する方法が提供される。従って、本発明の溶液試料中の少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する方法は、少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域に記憶された少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する過程を含むことを特徴とする。
【００２２】
かかる方法に於いても、少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値が、少なくとも二種類の成分の一つの成分の並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比であってよい。また、少なくとも二種類の成分の各々の存在比は、少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む自己相関関数値の理論式を少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から検出されるようになっていてよく、理論式に於いて少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記の少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間を乗じて得られた値が、少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられるようになっていてよい。そして、上記の方法に於いて、少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値の記憶は、少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間を決定し、少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を算出してデータ記憶領域に記憶する過程又は予め決定された少なくとも二種類の成分のいずれかの並進拡散時間に対する少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間の比の値をデータ記憶領域に記憶する過程のいずれかにより為されてよい。前記の理論式に於ける前記の少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間、及び／又は、理論式に於けるストラクチャ・パラメータは、理論式を溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられるようになっていてよい。
【発明の効果】
【００２３】
上記の本発明の構成によれば、コントロール試料についての蛍光測定、自己相関関数の演算及び並進拡散時間の検出の回数を大幅に低減することが可能となる。従って、検査されるべき溶液試料についての蛍光強度の測定を行う度にコントロール試料の調製を行う必要はなくなり、また、測定時間が短縮される（多数のウェルを有するマイクロプレートのウェルに試料を分注して測定を実行する場合には、コントロール試料のために余分なウェルを使用しなくてよくなる。）。
【００２４】
また、本発明では、検査されるべき溶液試料中の少なくとも二つの成分の各々の並進拡散時間は、各成分について十分な精度にて実行された測定から得られた並進拡散時間の比に基づいて決定可能となるので、検出結果の信頼性が高くなることが期待される。蛍光相関分光分析では、蛍光測定の結果を統計的に処理して並進拡散時間を算出するので、並進拡散時間の算出結果は、本質的に、ばらつきが大きい。従って、検査されるべき試料についての蛍光強度の測定を行う度にコントロール試料の各々について少ない又は限られた測定回数にて検出された並進拡散時間の値の信頼性は必ずしも高くなく、そのような並進拡散時間を用いて得られる検査されるべき試料についての検出結果は、精度が悪化しているおそれがある。一方、本発明の場合、十分な時間をかけて決定されたコントロール試料の並進拡散時間の比を用いることで、検査されるべき試料についての検出結果の精度を高くすることができることとなる。
【００２５】
更にまた、本発明によれば、試料が分注されるマイクロプレートの底面を構成するカバーガラスの厚さのウェル毎のばらつきなど、容器又はウェル毎の光学的な条件のばらつきによる測定精度への影響が低減されることとなる。上記から理解される如く、本発明の構成では、容器又はウェル毎の光学的な条件によらず略不変な複数成分の分子同士の並進拡散時間の値の比を用いて、検査試料とは別に実行されていたコントロール試料の蛍光測定を行うことなく、蛍光相関分光分析測定による試料中の複数成分の各存在比の検出が可能となっている。即ち、本発明に於いては、検査試料の蛍光強度の自己相関関数から試料中の複数成分の各存在比を決定する際に、検査試料の容器又はウェルとは別の容器又はウェルにて行われた測定により得られた並進拡散時間を用いないので、容器又はウェル毎の光学的な条件のばらつきは測定精度に何等影響を及ぼさなくなる。従って、実験に於いては、厚みのばらつきが非常に小さい高価なカバーガラスを毎回使用する必要はなくなり、測定・解析のコストが低減されることとなる。また、試料中の複数成分の各存在比の検出するために検査試料の蛍光強度の自己相関関数に理論式をフィッティングする場合、いずれかの成分の並進拡散時間の値が分かれば、その他の成分の並進拡散時間は、並進拡散時間の比から自動的に分かるので、フィッティングに於ける未知数が低減され、これにより、フィッティングに要する時間を短縮することが可能となり、また、フィッティング演算の精度も向上されることが期待される。
【００２６】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１（Ａ）は、本発明による蛍光相関分光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。
【図２】図２は、本発明の蛍光相関分光分析装置にて算出される蛍光強度の自己相関関数を模式的に示したグラフ図（左図）と、計測される試料中の分子を模式的に示した図（右図）である。（Ａ）は、検査試料中に含まれる一つの成分のコントロール試料１について得られる自己相関関数、（Ｂ）は、検査試料中に含まれるもう一つの成分のコントロール試料２について自己相関関数、（Ｃ）は、検査試料について得られる自己相関関数を、それぞれ示している。図中、矢印は、検査試料中の各成分の並進拡散時間（τ１、τ２）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００２９】
蛍光相関分光分析装置の構成と分析方法の概要
図１（Ａ）を参照して、本発明による好ましい実施形態である蛍光相関分光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。蛍光相関分光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよい。端的に述べれば、まず、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μｌの溶液試料が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の溶液試料中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。溶液試料中の成分（分子）には、蛍光色素等の蛍光標識が付加されており、かかる成分が溶液試料中にてブラウン運動により移動し、励起領域に進入すると、その間、蛍光標識が励起され蛍光が放出される。放出された蛍光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入される。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如き対物レンズ８の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた蛍光のみが光検出器１６に到達し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示された対物レンズ８の焦点領域は、コンフォーカル・ボリュームと称され、その体積は、通常、１ｆｌ程度である。
【００３０】
かくして、光検出器１６にて検出された蛍光は、逐次的に、時系列の電気信号に変換された後、コントローラー１７を経て、コンピュータ１８へ入力される。そして、コンピュータ１８に於いては、図示していないメモリ装置に記憶されたプログラムに従って、蛍光強度Ｉ（ｔ）の自己相関関数Ｃ（τ）の演算が
【数２】
（ここに於いて、ｔ、τ及びｎは、それぞれ、計測時間、相関時間及び総和演算の項数である。）
を用いて為され、種々の解析が為される。かかる解析に於いては、基本的には、蛍光の自己相関関数の値に対して、下記の式（３）がフィッティングされ、並進拡散時間τＤ、即ち、コンフォーカル・ボリューム内に進入した成分の滞在時間の平均と、コンフォーカル・ボリューム内に滞在する（蛍光を発する）粒子の数の平均Ｎとが決定される。
【数３】
ここに於いて、ＡＲは、ストラクチャ・パラメータと称される装置の調整状態を表す特性値であり、図１（Ｂ）に例示されている如きコンフォーカル・ボリュームの長軸方向の長さｗｚと半径ｗｏとの比（＝ｗｚ／ｗｏ）に相当する。また、溶液試料中に複数の（少なくとも２種類の）成分が含まれており、これらの成分の各々の存在比が決定される場合には、自己相関関数に対して下記の式をフィッティングして各成分の存在比ｙｉが決定される。
【数４】
ここに於いて、τｉは、各成分の並進拡散時間である。
【００３１】
上記の如き蛍光相関分光分析装置１を用いて任意の溶液試料について実際に測定を実行する際には、一般的には、数秒〜十数秒間程度の蛍光測定を数回実行し、各回の測定毎に自己相関関数の演算とフィッティングが為され、並進拡散時間、平均粒子数又は各成分の存在比が算出され、数回の算出値の平均値が最終的な値として採用される。
【００３２】
また、任意の溶液試料について上記の如き蛍光相関分光分析による測定を実行する場合には、典型的には、全ての蛍光測定に先立って、装置の調整状態の確認が行われる。特に、自己相関関数値及び並進拡散時間、平均粒子数等の検出値に影響を与えるコンフォーカル・ボリュームの寸法（半径ｗｏと長軸方向の長さｗｚ）は、レーザー光の集光状態又はパワー、対物レンズ８の上方に配置される試料容器又はマイクロプレートのウェルの底面を為すカバーガラスの厚み並びに対物レンズの補正環の設定状態、ピンホール１３の位置及び／又は寸法によって異なる。そこで、通常、検査されるべき溶液試料中の成分に付加されている蛍光標識を含む基準物質（蛍光色素分子そのものであってよい。）の溶液について、蛍光測定、自己相関関数値の演算が実行され、算出された自己相関関数値に対して式（３）のフィッティングし、ストラクチャ・パラメータＡＲ（及び並進拡散時間τＤ）が決定される。そして、このストラクチャ・パラメータＡＲの値が、所定の範囲内に収まっていれば、装置の調整状態が正常であると判断され、得られたＡＲが、その後に行われる測定・解析に於いて用いられる（装置の調整状態が正常でなければ、調整がやり直される。）。
【００３３】
更に、複数の成分を含む溶液試料中の各成分の存在比を決定する測定・解析が行われる場合には、各成分の並進拡散時間τｉが決定される（図２（Ａ）、（Ｂ）参照）。そのために、各成分のみを含有するコントロール試料が調製され、かかる各コントロール試料について、蛍光測定、自己相関関数値の演算が実行され、各コントロール試料について算出された自己相関関数値に対してストラクチャ・パラメータＡＲを既知数として式（３）のフィッティングが為されて、各成分の並進拡散時間τｉが算出される。そして、含有する成分の存在比が検査されるべき試料の蛍光の自己相関関数値に対する式（４）のフィッティングに於いて、上記の如く決定されたストラクチャパラメータＡＲと各成分の並進拡散時間τｉとが既知数として用いられる（図２（Ｃ）参照）。
【００３４】
なお、ストラクチャ・パラメータＡＲ、各成分の並進拡散時間τｉを決定するための蛍光標識の溶液、コントロール試料についての蛍光測定も、それぞれ、通常、数回実行され、それらの蛍光自己相関関数から算出されたＡＲ、τｉの平均値が最終的な値として採用される。
【００３５】
本発明による蛍光相関分光分析の改良
上記の如き蛍光相関分光分析を用いた複数の成分を含む溶液試料中の各成分の存在比の測定・解析に於いて、「発明の概要」の欄に於いて述べたように、式（４）によるフィッティングに用いられるストラクチャ・パラメータＡＲと各成分の並進拡散時間τｉは、蛍光測定時の測定条件、例えば、温度、溶液の粘度等や装置の調整状態、特に、コンフォーカル・ボリュームの寸法等によって変動するパラメータである。従って、従前では、或る検査されるべき試料についての測定・解析を行う度に、基準物質溶液と各成分のコントロール試料とが準備され（例えば、図１（Ａ）に例示されている如き複数のウェル１０が配列されたマイクロプレート９が試料容器として使用される場合、いくつかのウェルに基準物質溶液と各成分のコントロール試料とが分注される。）、基準物質溶液と各成分のコントロール試料の各々について蛍光測定と自己相関関数の演算が行われていた。しかしながら、特に、コントロール試料は、高価又は希少な試料である場合があり、また、調製にも手間がかかることがある。
【００３６】
更に、試料容器であるマイクロプレートのウェルの光学的な条件が各々異なるような場合（例えば、廉価なマイクロプレートの場合）、コンフォーカル・ボリュームがウェル毎に変化し得るため、検査試料とは別のウェルで為された各成分のコントロール試料についての蛍光測定と自己相関関数の演算から得られる並進拡散時間τｉを、検査試料についての測定・解析を行うためのフィッティングに於いて固定値（既知値）として用いると、検出結果（検査試料中の各成分の存在比）の精度が悪化し得ることとなる。かかるウェルの光学的な条件が各々異なることに起因する精度の悪化を回避するために、検査試料中の各成分の並進拡散時間を、未知の値として、検査試料についての測定・解析を行うためのフィッティングを行うことも原理的には可能であるが、フィッティングに時間を要することとなり、検査試料の数が多くなる場合には不利である。また、分子量の大きい成分の、フィッティングにより得られる並進拡散時間の値は、変動幅が大きく、全ての成分の並進拡散時間を未知数としてフィッティングを行う上記の手法は、不正確なものと成り得る。
【００３７】
そこで、本発明に於いては、任意の複数成分のそれぞれの並進拡散時間の絶対値は、カバーガラスの厚さ等の光学的条件によって変動するものの、それらの複数成分の並進拡散時間の比が、光学的条件によらず略不変であることを利用して、検査試料とは別に為されるコントロール試料のついての蛍光測定をできるだけ少なくできるようにし、廉価なカバーガラスの使用を許し、フィッティングにかかる時間を削減し、安定なフィッティングが行えるように、蛍光相関分光分析の処理が以下の如く改良される。
【００３８】
（ｉ）改良の原理
或る成分ｉについて、その並進拡散時間τｉは、
τｉ＝ｗｏ２／４Ｄｉ …（５）
により定義される。ここで、Ｄｉは、成分ｉの分子の拡散定数である。拡散定数は、分子が水溶液中で半径ｒｉの球体にて振舞うと仮定したとき、
Ｄｉ＝ｋＢ・Ｔ／６π・ｒｉ・η（Ｔ） …（６）
［ここで、ｋＢは、ボルツマン定数であり、Ｔは、溶液試料の絶対温度であり、η（Ｔ）は、溶液試料の粘性係数であり、温度Ｔの関数である。］
により与えられる。結局、並進拡散時間τｉは、
τｉ＝（３π／２ｋＢ）・ｗｏ２・（η（Ｔ）／Ｔ）・ｒｉ …（７）
となる。そこで、複数の成分を含む溶液試料について蛍光測定することを考えると、式（７）に於いて、ｗｏは、コンフォーカル・ボリュームの寸法であり、η（Ｔ）／Ｔは、測定時の環境条件であり、溶液試料中の各成分について共通の値である。かくして、成分１，２，…，ｉ，…の並進拡散時間の比τ１：τ２：…：τｉ：…は、コンフォーカル・ボリューム、測定時の環境条件が変わっても、
τ１：τ２：…：τｉ：…＝ｒ１：ｒ２：…：ｒｉ：… …（８）
により与えられ、保存されることとなる。従って、各成分について、つまり、各コントロール試料について、少なくとも１回、同一のコンフォーカル・ボリューム、測定時の環境条件に於いて並進拡散時間を測定し、その比を記憶しておけば、コンフォーカル・ボリューム、測定時の環境条件が変わっても、コントロール試料の蛍光測定、自己相関関数の演算を行わずに、各成分の並進拡散時間の値が推定できることとなる。
【００３９】
（ii）確認実験
上記の如く、複数の成分を含む溶液試料の蛍光相関分光分析に於いて、各成分の並進拡散時間の比が保存されることは、以下の実験により確認された。実験に於いては、蛍光色素の一つであるＡＴＴ０６３３が付加されたＤＮＡプライマー（図２（Ａ）右図）と、かかるＡＴＴ０６３３が付加されたプライマーによって伸長されたＤＮＡ（図２（Ｂ）右図）をそれぞれ単独にて含む溶液試料について、厚さの異なるカバーガラスにより底面が構成されたマイクロプレートを用いて、上記の蛍光測定を行い、測定された蛍光の自己相関関数から並進拡散時間を算出した。なお、プライマーの長さは、１５ベース（塩基配列は、agctcgtgggagggc）、ＤＮＡの長さは、１３４ベースペア（塩基配列は、cagctcgtgggagggtggcatccggcagcagctgaacgtgacaacacgtcttccaaagcggtcatcccctggaggagcagacacaggtgagcctctgtgccaccttctcctagaaaatcctcaggcacttagca）である。また、カバーガラスの厚さは、標準的な０．１７ｍｍのものと、それから±０．０２ｍｍの範囲のものを用いた。（厚さの誤差が０．０１ｍｍ以下のカバーガラスを用いた比較的大きな面積のマイクロプレートは、高価である。）結果は、以下の通りとなった。
【表１】
上記の結果の如く、同一の試料でも並進拡散時間の絶対的な値は、カバーガラスの厚さが異なると変動することが確認される。（０．１７ｍｍから離れると、並進拡散時間τ１、τ２は、ともに増大した。）しかしながら、並進拡散時間の値の比は、表１の最下段に示されている如く、略保存されることが確認された。
【００４０】
（iii）改良の構成
本実施形態に於いては、測定条件等が変わっても、複数の成分を含む溶液試料中の各成分の並進拡散時間の比が保存されるという上記の知見を用いて、蛍光相関分光分析を用いて複数の成分を含む溶液試料中の各成分の存在比を決定する方法及びそのための蛍光相関分光分析装置１の構成並びに装置１の作動を制御するコンピュータプログラムの一部が変更される。
【００４１】
複数の成分を含む或る溶液試料中の各成分の存在比を決定する際に於いては、各成分の並進拡散時間の比が未知である場合、まず、かかる各成分の並進拡散時間の比が、例えば、上記に説明された蛍光相関分光分析の手法に従って決定されてよい。具体的には、まず、各成分のコントロール試料が調製され、マイクロプレートのウェルに、基準物質（蛍光色素分子そのものであってよい。）と、検査試料に含まれる各成分に対応するコントロール試料とが分注される。その際、試料容器として用いられるマイクロプレートとして、ウェルの間で光学的な条件の変動が少ないもの、具体的には、マイクロプレートの底面を成すカバーガラスの厚さの変動の少ないものが用いられるべきであり、典型的には、公称の厚さが０．１７ｍｍであり、変動が±０．０１ｍｍ以下のものが用いられる。そして、それぞれのウェルについて、蛍光強度が測定され、自己相関関数の演算、式（３）のフィッティングを用いた並進拡散時間の算出が実行される（コントロール試料の蛍光測定に先立って、基準物質溶液を用いたストラクチャ・パラメータＡＲの算出と基準物質の並進拡散時間の算出が為される点は、従前と同様である。）。
【００４２】
かくして、各成分のコントロール試料についての並進拡散時間τｉが算出されると、各成分のうちの任意に選択された成分の並進拡散時間に対する各成分の並進拡散時間の比κｉが、算出された各成分の並進拡散時間を選択された成分の並進拡散時間で規格化することにより、即ち、
κｉ＝τｉ／τ１ …（９）
（τ１は、選択された成分の並進拡散時間とする。）
により決定され、任意のデータ記憶領域に保存される。例えば、検査されるべき溶液試料が、蛍光標識された二つの成分、成分１、成分２を含むときには、成分１のコントロール試料１、成分２のコントロール試料２について、蛍光測定を行い、図２（Ａ）、（Ｂ）にそれぞれ例示されている如き自己相関関数を演算して並進拡散時間τ１、τ２を決定した後、コントロール試料１を選択された成分として設定すると、並進拡散時間の比κ１、κ２が
κ１＝τ１／τ１ …（１０ａ）
κ２＝τ２／τ１ …（１０ｂ）
により決定され記憶される。（κ１は、敢えて計算されなくてもよい。）
【００４３】
なお、上記の選択された成分の並進拡散時間に対する各成分の並進拡散時間の比は、蛍光相関分光分析以外の手法により、実験的に又は理論的に決定されたものであってもよい。例えば、式（５）から理解される如く、選択された成分の並進拡散時間に対する各成分の並進拡散時間の比は、拡散定数の比となるので、各成分の拡散定数がわかったものであれば、
κｉ＝Ｄ１／Ｄｉ …（１０ｃ）
（Ｄ１は、選択された成分の拡散定数とする。）
により算出されてよい。また、選択される成分は、典型的には、検査試料中に含まれる成分のうち、分子量の小さい成分が選択されてよいが、これに限定されないことは理解されるべきである。上記の処理により決定された各成分の並進拡散時間の比は、装置のデータ記憶領域に記憶される。
【００４４】
かくして、各成分の並進拡散時間の比が決定された後、溶液試料中の各成分の存在比を決定する際には、検査試料が調製され、検査試料の蛍光測定が為され、自己相関関数が算出される（ストラクチャ・パラメータＡＲの算出のために、検査試料の蛍光測定に前後して、基準物質溶液の蛍光測定が為され、その結果から算出されるストラクチャ・パラメータＡＲが用いられてよい。）。しかる後、検査試料についての自己相関関数に対して、上記の各成分の並進拡散時間の比κｉと選択された成分の並進拡散時間τ１との積を各成分の並進拡散時間として含む
【数５】
がフィッティングされ、各成分の存在比ｙｉが決定される。例えば、検査試料が、成分１、成分２を含むときには、検査試料の蛍光測定を行い、図２（Ｃ）に例示されている如く得られた自己相関関数に対して、
【数６】
がフィッティングされ、成分１の存在比ｙ１と、成分２の存在比ｙ２＝１−ｙ１とが決定される。（上記の式（１１）又は（１２）に於いて、選択された成分の並進拡散時間τ１は、未知数であり、フィッティングにより同時に決定される値である。ストラクチャ・パラメータＡＲは、検査試料の測定ともに基準物質試料の測定を行い、その結果から算出された値を用いてもよく、或いは、式（１１）又は（１２）のフィッティングに於いて同時に決定されてもよい。）
【００４５】
なお、平均粒子数Ｎ（式（１１）又は（１２）のフィッティングに於いて同時に決定される。）を用いて、成分１、２の粒子数Ｎ１、Ｎ２が、
Ｎ１＝Ｎ・ｙ１ …（１３ａ）
Ｎ２＝Ｎ・ｙ２ …（１３ｂ）
により与えられてよい。なお、コンフォーカル・ボリュームの体積Ｖｃが任意の手法にて決定されると、成分１、２の濃度が、
Ｎ・ｙ１／Ｖｃ；Ｎ・ｙ２／Ｖｃ
により決定される。
【００４６】
上記の蛍光相関分光分析を達成するために、コンピュータ１８には、並進拡散時間の比κｉを記憶するデータ記憶領域が準備され、並進拡散時間の比κｉを取得し記憶するための構成が設けられる。また、コンピュータ１８を作動させるコンピュータプログラムに於いては、コントロール試料の自己相関関数から算出される並進拡散時間の比κｉを取得し記憶する手順、データ記憶領域に記憶された並進拡散時間の比κｉを用いて上記の式（１１）又は（１２）のフィッティングをする手順が組み込まれる。
【００４７】
更に、各成分の並進拡散時間の比κｉの値は、測定条件等が変わっても保存されることから、必ずしも同一の蛍光相関分光分析装置１にて測定された値でなくてもよい。従って、蛍光相関分光分析装置１並びにコンピュータプログラムは、装置１の外部で別に決定された各成分の並進拡散時間の比κｉを操作者が装置１のデータ領域へ入力できるようになっていてよい。入力される並進拡散時間の比κｉの値は、任意の手法、例えば、高度な分子動力学的な計算によって決定された値であってもよい。
【００４８】
（iv）フィッティング精度の悪化防止
上記の如く蛍光測定から得られた自己相関関数に対して並進拡散時間の比κｉを用いた式（１１）又は（１２）をフィッティングする場合、各成分の並進拡散時間は、実測値ではなく、推定値であり、このことに起因して、フィッティング精度が悪化してしまうこともあり得る。そこで、本実施形態に於いては、式（１１）又は（１２）によるフィッティング精度が操作者に確認できるようになっていてよい。具体的には、式（１１）又は（１２）のフィッティングが為される際、実際の自己相関関数値とフィッティング関数値との差異を表す特性パラメータであるｃｈｉ２乗値が算出される（ｃｈｉ２乗値は、端的に述べれば、実際の自己相関関数値とフィッティング関数値との差の２乗の総和である。）。そして、ｃｈｉ２乗値が所定の閾値を越えたときには、フィッティングの精度が不十分であることがコンピュータのモニター上に表示されるなどして、操作者に対して警告が発せられるよう構成される。また、装置に於いて、レーザー光の集光度合や光検出器の感度が波長によって異なるため、フィッティングが巧く行えるか否かは、励起波長や検出波長（蛍光の波長）によって異なることがある。そこで、ｃｈｉ２乗値のための所定の閾値は、励起波長毎及び／又は検出波長毎に設定できるよう構成されていてよい。
【００４９】
かくして、上記の実施形態によれば、測定条件等が変わっても、複数の成分を含む溶液試料中の各成分の並進拡散時間の比が保存されるという知見に基づき、蛍光相関分光分析に於いて任意の溶液試料に含まれる成分の存在比を検出する場合に、一度、各成分の並進拡散時間の比が取得されれば、その後は、各成分のコントロール試料の蛍光測定及び自己相関関数の演算が省略することができることとなる。これにより、コントロール試料を節約することが可能となり、また、コントロール試料のための測定・解析時間を大幅に低減され、スループットを向上することが可能となる（溶液試料を複数のウェルが配列されたマイクロプレートに分注して測定が為される場合には、ウェルをコントロール試料のために割り当てる必要性が低減される。）。
【００５０】
また特に、上記の実施形態に於いて特徴的な利点は、或る容器又はウェルに分注された検査試料から得られた蛍光強度の自己相関関数から検査試料中の各成分の存在比を算出するフィッティング演算に於いて、別の容器又はウェルにて測定・検出された並進拡散定数の値を使用しなくてよく、これにより、マイクロプレートの底面を構成するカバーガラスの厚さがウェルの位置毎にばらつきがある場合など、試料の分注される容器又はウェルによって光学的条件が異なることを気にせずに測定及び解析が実行可能であるということである。従って、検査試料についての蛍光測定の際に用いるマイクロプレートの底面のカバーガラスとして、ばらつきの少ない高価な物を用いる必要性が低減され、費用面で有利となる（廉価なカバーガラスを使用してもそのことによる精度の悪化がない。）。また、上記の実施形態のフィッティング演算に於いては、任意の（通常の）測定条件又は光学的条件に於いて略不変的に保存される各成分の並進拡散時間の比を固定値とすることで、未知値（各成分の存在比、選択された成分の並進拡散時間（τ１）、平均粒子数Ｎ、場合によって、ストラクチャ・パラメータＡＲ）の数が大幅に低減されているので、全ての成分の並進拡散時間を未知定数として演算する場合よりも大幅に演算時間が短縮されることとなる。そして、各成分の並進拡散時間の比さえ、十分に精度良く決定されていれば、検査試料についての検出結果の精度を高くすることができる。（検査試料中に分子量の大きい成分が含まれている場合、その成分のフィッティングにより得られる拡散時間の値の変動幅が大きく、誤差要因の一つとなり得るが、本実施形態では、並進拡散時間を直接にフィッティングから求める成分は、分子量の小さいものを選択できるので、かかる誤差要因を回避することができる。）
【００５１】
上記の本発明の手法は、任意の複数の分子の結合又は解離の結合のし易さ又は結合定数若しくは解離定数を決定する際などに有利に用いられる。
【符号の説明】
【００５２】
１…蛍光相関分光分析装置
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１８…コンピュータ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比が検出可能な蛍光相関分光分析装置であって、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域を含み、前記記憶された少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出することを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対して前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む前記自己相関関数値の理論式をフィッティングすることにより前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出することを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１の装置であって、前記少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間を決定し、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を算出して前記データ記憶領域に記憶することが可能なことを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１の装置であって、予め決定された前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を前記データ記憶領域に記憶させることが可能なことを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項２の装置であって、前記理論式に於いて前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じて得られた値が前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられることを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項５の装置であって、前記理論式に於ける前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間が前記理論式を前記溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられることを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項２の装置であって、前記理論式に於けるストラクチャ・パラメータが前記理論式を前記溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられることを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項２の装置であって、前記フィッティングに於いて、ｃｈｉ２乗値が所定の閾値を越えたとき、前記フィッティングの精度が不十分あることの警告が発せられることを特徴とする装置。
【請求項９】
蛍光相関分光分析を用いて蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出するためのコンピュータプログラムであって、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域に記憶された少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１０】
請求項９のコンピュータプログラムであって、前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対して前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む前記自己相関関数値の理論式をフィッティングすることにより前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１１】
請求項９のコンピュータプログラムであって、更に、前記少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間を決定し、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を算出して前記データ記憶領域に記憶する手順をコンピュータに実行させることが可能なことを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１２】
請求項９のコンピュータプログラムであって、予め決定された前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を前記データ記憶領域に記憶させる手順をコンピュータに実行させることが可能なことを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１３】
請求項１０のコンピュータプログラムであって、前記理論式に於いて前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じて得られた値が前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１４】
請求項１３のコンピュータプログラムであって、前記理論式に於ける前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間が前記理論式を前記溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１５】
請求項１０のコンピュータプログラムであって、前記理論式に於けるストラクチャ・パラメータが前記理論式を前記溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１６】
請求項１０のコンピュータプログラムであって、前記フィッティングに於いて、ｃｈｉ２乗値が所定の閾値を越えたとき、前記フィッティングの精度が不十分あることの警告を発する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１７】
蛍光相関分光分析を用いて蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する方法であって、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域に記憶された少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法であって、前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対して前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む前記自己相関関数値の理論式をフィッティングすることにより前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７の方法であって、前記少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間を決定し、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を算出して前記データ記憶領域に記憶する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１７の方法であって、予め決定された前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を前記データ記憶領域に記憶する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１８の方法であって、前記理論式に於いて前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じて得られた値が前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１の装置であって、前記理論式に於ける前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間が前記理論式を前記溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられることを特徴とする装置。
【請求項１】
蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比が検出可能な蛍光相関分光分析装置であって、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域を含み、前記記憶された少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出することを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対して前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む前記自己相関関数値の理論式をフィッティングすることにより前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出することを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１の装置であって、前記少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間を決定し、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を算出して前記データ記憶領域に記憶することが可能なことを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１の装置であって、予め決定された前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を前記データ記憶領域に記憶させることが可能なことを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項２の装置であって、前記理論式に於いて前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じて得られた値が前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられることを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項５の装置であって、前記理論式に於ける前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間が前記理論式を前記溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられることを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項２の装置であって、前記理論式に於けるストラクチャ・パラメータが前記理論式を前記溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられることを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項２の装置であって、前記フィッティングに於いて、ｃｈｉ２乗値が所定の閾値を越えたとき、前記フィッティングの精度が不十分あることの警告が発せられることを特徴とする装置。
【請求項９】
蛍光相関分光分析を用いて蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出するためのコンピュータプログラムであって、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域に記憶された少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１０】
請求項９のコンピュータプログラムであって、前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対して前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む前記自己相関関数値の理論式をフィッティングすることにより前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１１】
請求項９のコンピュータプログラムであって、更に、前記少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間を決定し、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を算出して前記データ記憶領域に記憶する手順をコンピュータに実行させることが可能なことを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１２】
請求項９のコンピュータプログラムであって、予め決定された前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を前記データ記憶領域に記憶させる手順をコンピュータに実行させることが可能なことを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１３】
請求項１０のコンピュータプログラムであって、前記理論式に於いて前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じて得られた値が前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１４】
請求項１３のコンピュータプログラムであって、前記理論式に於ける前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間が前記理論式を前記溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１５】
請求項１０のコンピュータプログラムであって、前記理論式に於けるストラクチャ・パラメータが前記理論式を前記溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１６】
請求項１０のコンピュータプログラムであって、前記フィッティングに於いて、ｃｈｉ２乗値が所定の閾値を越えたとき、前記フィッティングの精度が不十分あることの警告を発する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１７】
蛍光相関分光分析を用いて蛍光標識が付加された少なくとも二種類の成分を含む溶液試料中の前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する方法であって、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を記憶するデータ記憶領域に記憶された少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を用いて前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法であって、前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対して前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比をパラメータとして含む前記自己相関関数値の理論式をフィッティングすることにより前記少なくとも二種類の成分を含む溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の存在比を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７の方法であって、前記少なくとも二種類の成分の各々について測定された蛍光強度の自己相関関数値から前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間を決定し、前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を算出して前記データ記憶領域に記憶する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１７の方法であって、予め決定された前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比の値を前記データ記憶領域に記憶する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１８の方法であって、前記理論式に於いて前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間に対する前記少なくとも二種類の成分の並進拡散時間の比に前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間を乗じて得られた値が前記少なくとも二種類の成分の各々の並進拡散時間として用いられることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１の装置であって、前記理論式に於ける前記少なくとも二種類の成分のうちの選択された成分の並進拡散時間が前記理論式を前記溶液試料について測定された蛍光強度の自己相関関数値に対してフィッティングすることにより与えられることを特徴とする装置。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−８０７６３（Ｐ２０１１−８０７６３Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３０５６４（Ｐ２００９−２３０５６４）
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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