融合蛋白質
う蝕病巣を形成する主要な病原菌の１つであるＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓに対する抗体を産生させることにより、効果的なう蝕予防を可能とする融合蛋白質、抗う蝕抗体製剤、及び、蛋白質製剤を提供する。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓの、高分子菌体表層タンパク質のアラニン繰り返し領域と、グルカン合成酵素のグルカン結合領域と、を含む融合蛋白質を作成する。また、当該融合蛋白質を哺乳動物に投与して、融合蛋白質に対する抗体を回収する。これらの融合蛋白質、および、抗体を用いることにより、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面への付着が抑制される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は融合蛋白質に関し、特にう蝕菌に対する抗体を誘導する融合蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、う蝕予防として、例えば、フッ化物を歯磨剤に添加したり、スクロースに代わる代用甘味料を菓子に添加することなどが行われてきた。
更に、近年においては、ワクチン投与などによって、う蝕病原菌やう蝕病原菌により産生されるう蝕原因物質等に対する免疫反応を誘導するう蝕予防法が注目されている。このような技術の一例として、う蝕病原菌の１つであるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（以下、「Ｓ．ｍｕｔａｎｓ」と表記することもある）の菌体表層に局在する２つの物質のそれぞれの機能部位をつなぎ合わせて融合蛋白質を作成する技術が非特許文献１に示されている。当該融合蛋白質を抗原として作成された抗体は、実際にＳ．ｍｕｔａｎｓの唾液被覆ハイドロキシアパタイトへの付着を強く阻害することが確認されている。
【０００３】
また、非特許文献２には、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの菌体表層の付着因子（ＰＡｃ）に対するモノクローナル抗体を、組み換え植物により大量生成する技術が示されている。
上述のように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに特異的に作用する免疫学的方法を用いることにより、口腔内の他の細胞等を傷めることなく、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの歯面への付着やＳ．ｍｕｔａｎｓによる酸生成を抑制することが可能となる。
【０００４】
しかしながら、う蝕の病原菌はＳ．ｍｕｔａｎｓに限られるものではなく、口腔内に存在する複数種類の細菌によりう蝕が誘発されると考えられている。特に、ヒトのう蝕病巣からは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓと、更にＳｔｏｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓと、が高頻度に分離されている。
このため、上述のように免疫学的手法を用いる場合には、特定の病原菌に対して特異的に作用させることができる反面、その特異性は非常に厳密であるためＳ．ｍｕｔａｎｓ以外の病原菌に作用させることができない。すなわち、たとえ上述の抗体によって、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの歯面への付着や、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの増殖を抑制できても、これに代わってその他のう蝕病原菌、特にＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓが増殖することとなり、効果的にう蝕予防を行うことができない。
【０００５】
本発明の目的は、上述の課題に鑑みてなされたものであり、う蝕病巣を形成する主要な病原菌の１つであるＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓに対する抗体を誘導することにより、効果的なう蝕予防を可能とする融合蛋白質を提供することにある。
【非特許文献１】：ＨＡＯ ＹＵ、他４名、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ ＰｒｏｔｅｉｎＡｎｔｉｇｅｎ ＰＡｃ−Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ Ｇｌｕｃａｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ”，ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ，Ａｍｅｒｉｃａ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ １９９７，Ｖｏｌ．６５，Ｎｏ．６，ｐ．２２９２−２２９８
【非特許文献２】：Ｍａ、他２名、“Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ”，ＴＩＢＴＥＣＨ，１９９５，Ｖｏｌ．１３，ｐ．５２２−５２７
【発明の開示】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究した結果、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面への定着を効果的に阻害する抗体を誘導可能な融合蛋白質を開発するに至った。
すなわち、本発明にかかる融合蛋白質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ（以下、「Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ」と表記することもある）の、高分子菌体表層蛋白質のアラニン繰り返し領域と、グルカン合成酵素のグルカン結合領域と、を含む。
【０００７】
また、前記アラニン繰り返し領域が、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質からなることを特徴とする。
（ａ）配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【０００８】
また、前記グルカン結合領域が、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質からなることを特徴とする。
（ａ）配列表の配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【０００９】
ここで、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの高分子菌体表層蛋白質（以下、「ＰＡｇ」と表記することもある。）のアラニン繰り返し領域（以下、「Ａ−ｒｅｐｅａｔ領域」と表記することもある。）は、ＰＡｇの機能領域すなわち口腔内ペリクルの唾液糖蛋白質に結合する唾液結合領域を構成し、そのＮ末付近において局在するアラニンを高濃度に含む領域である。この唾液結合領域は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓが歯面に初期定着に関与している。
【００１０】
また、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのグルカン合成酵素（以下、「ＧＴＦ」と表記することもある。）は、スクロースから非水溶性グルカンを合成することにより、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの唾液で処理したハイドロキシアパタイト粒子への付着をより強固にするものであり、グルコース結合領域（以下、「ｇｌｕｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ領域」と表記することもある。）は、グルコースに結合する当該酵素の機能領域である。
【００１１】
本発明者らは、口腔内に誘導されたＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓに対する抗体がう蝕抑制において果たす作用機序、すなわち菌体の歯面への付着阻害、抗体が結合した菌体の白血球による貪食促進、及び、菌体の代謝阻害機序などのうち、特に菌体の歯面への付着阻害機序に着目した。そして、当該作用機序の強化すべく、この付着の際に重要な役割をなす２つの蛋白質の機能領域でありかつ特異的な２つの領域を結合した融合蛋白を作成し、抗原として用いることとした。この結果、後述するように、本発明による融合蛋白質を投与後に得られた抗体は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面への付着を高率で阻害することが確認された。
【００１２】
ここで、本発明は、上記アラニン繰り返し領域及びグルコース結合領域の結合順序、すなわちアミノ酸配列を考慮したときにどちらの領域が上流に配列するか、上記２領域を連結する他のペプチドの挿入、上記２領域の前後へのペプチドの付加等について、特に限定するものではない。例えば、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのグルカン合成酵素について、グルカン結合領域の前後の１以上のアミノ酸をも含めて、融合蛋白質に組み入れるようにしてもよい。
【００１３】
また、上記２領域について１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものも、本発明の融合蛋白質に含められる。これは例えば、特定のアミノ酸を置換又は欠失する方法としては、後述の組み換えＤＮＡについて行うポイントミューテーション法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの公知の方法が用いることができる。
また、上記２領域のアミノ酸について、例えば、上記領域がＣ末端となる場合にそのＣ末端をエステル化やアミド化し、上記領域の分子内のアミノ酸の側鎖にあるＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどをホルミル基などの適当な保護基で保護するなど、若干の化学的修飾を行うことも可能である。
【００１４】
尚、このようにして作成された本発明による融合蛋白質は、例えば、本発明による融合蛋白質を有効成分として含む医薬組成物としての利用することができる。すなわち、免疫誘導可能な有効量の本発明の融合蛋白質をヒトを含む哺乳動物に直接投与することにより、ヒト等の免疫応答を誘導し、長期的なう蝕予防を行うことが可能になる。あるいは、後述のように、本発明による融合蛋白質を投与した哺乳動物から抗体を回収し、当該抗体を口腔内に投与することによりう蝕予防を行うことも可能である。
【００１５】
この場合には、融合蛋白質をそのまま使用してもよいが、通常は、製剤学的に許容しうる製剤用添加剤や賦形剤などを用いて上記融合蛋白質を有効成分として含む医薬組成物として製造し、用いることが好ましい。この医薬組成物の投与経路としては、例えば、経鼻粘膜投与などの免疫応答が誘導可能な局所投与を挙げることができる。このため本発明の融合蛋白質は経鼻免疫などの局所投与剤の医薬組成物の有効成分として用いられる。
【００１６】
さらに、本発明による組み換えＤＮＡは、本発明による融合蛋白質をコードする。
また、本発明による組み換えＤＮＡは、前記融合蛋白質を構成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓの高分子菌体表層蛋白質のアラニン繰り返し領域をコードする以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有することを特徴とする。
（ａ）配列表の配列番号：３に示される塩基配列。
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列。
【００１７】
また、前記融合蛋白質を構成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓのグルカン合成酵素のグルカン結合領域をコードする以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有することを特徴とする。
（ａ）配列表の配列番号：４に示される塩基配列。
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列。
【００１８】
更に、本発明による組み換えＤＮＡを含有する発現ベクター、及び、当該発現ベクターを保持する形質転換体が提供される。
ここで、配列番号：３あるいは配列番号：４で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３あるいは配列番号：４で表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、例えばＤＩＧ核酸検出システム（Ｒｏｃｈｅ社）のマニュアル記載の方法に従って行わせることができる。この場合において、約２０％のミスマッチを許容するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（約８０％の相同性を保証する）としては、５０％フォルムアミド（脱イオン）、５×ＳＳＣ（ナトリウム濃度０．９７５Ｍ）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで、温度が４２℃である。さらにハイブリダイゼーション温度を１．４℃上げることでミスマッチを１％下げることができる。
【００１９】
また、本発明の組み換えＤＮＡは、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ由来のゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ由来のｃＤＮＡより公知の方法により単離されたものをＤＮＡライゲース等を用いて結合したもの、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
また、配列番号：３あるいは配列番号：４で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡを作成するためには、例えば、市販のキットなどを用いて、Ｋｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って、塩基配列の変換を行うことができる。
【００２０】
尚、上記形質転換体を用いれば融合蛋白質を容易かつ大量に精製させることができるが、上記融合蛋白質は、上記組み換えＤＮＡを形質転換体に導入し、作成されるものに限定されないことはいうまでもない。蛋白質合成の公知の方法、例えば、蛋白質合成用樹脂に、上述のアミノ酸配列通りに、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を縮合させていき、縮合反応終了後に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施することにより、本発明による融合蛋白質を合成することなども可能である。
【００２１】
また、本発明の発現ベクターは、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどいずれであってもよい。発現ベクターには、宿主細胞に応じたプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。
【００２２】
また、本発明の形質転換体に用いられる宿主細胞としては、例えば、大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などのいずれでもよい。
更に、本発明の抗体製剤によれば、上述の融合蛋白質に対する抗体を含む。
すなわち、本発明による融合蛋白質に対する抗体は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面への付着阻害作用を有するものであり、当該作用は、ヒトを含む他の哺乳動物等により作成された当該抗体を含む抗体製剤として口腔内へ投与した場合にも有効に発揮しうるものである。
【００２３】
また、本発明による抗体製剤に含有される抗体は、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。例えば、ポリクローナル抗体であれば、哺乳動物に対して上記融合蛋白質をそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与し、免疫された哺乳動物から抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより取得する。免疫を行う哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどが挙げられる。例えば、ウシ、ニワトリなどの家畜動物である場合には、乳や卵等をそのまま回収し、融合蛋白質に対する抗体を含む食品として口腔内に投与することが可能である。特に、ウシからは大量に牛乳を回収することができるため、分離精製して用いることもできる。この場合には、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を、細胞融合や核移植等公知の方法を経て作成されるヒトポリクローナル抗体産生ＨＡＣウシ等に融合蛋白質を投与して免疫し、ヒト抗体を作成させることとしてもよい。このように、歯面への付着阻害に関与する抗体を、同時に作成されるポリクローナル抗体として取得することが望ましいが、免疫された動物から抗体産生細胞を回収し、公知の方法によりモノクローナル抗体を産生してもよい。また、本発明による抗体製剤の形態としては、、例えば、口腔用の軟膏、ゼリー製剤、洗口剤、若しくは噴霧剤などが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
［図１］（ａ）は、ＰＡｇＡ遺伝子領域を説明する図、（ｂ）は、ｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡの構成を説明する図、（ｃ）は、ｇｔｆＩ−ＧＢ遺伝子領域を説明する図、（ｄ）は、ｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡ−ｇｔｆＩ−ＧＢの構成を説明する図である。
［図２］融合蛋白質を発現した大腸菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
［図３］精製後の融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
［図４］ハイドロキシアパタイトへの付着菌数と、ＩｇＧ抗体の添加量と、の関係を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
次に、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。なお、以下の説明において参照する各図においては、他の図と同等の部分が同一符号によって示されている。
［実施例１］融合蛋白質発現ベクターの作成
（１）ＰＡｇのＡ−ｒｅｐｅａｔ領域（以下、「ＰＡｇＡ」と表記することもある。）をコードするＤＮＡ断片の調整
この断片は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ菌株ＯＭＺ１７６から単離された染色体ＤＮＡについて、以下のフォワードプライマー１及びリバースプライマー１を用いて、ＰＣＲ反応を行うことにより取得した。
【００２６】
プライマーの合成は、ＤＮＡ合成機を用いて行った。
フォワードプライマー１：ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＡＴＡＡＴＧＡＣＡＧＴＣＡＡＧＣＡ（配列表の配列番号：５に記載の塩基配列、開始コドン及びＢａｍＨＩサイトを含む）
リバースプライマー１：ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣ（配列表の配列番号：６に記載の塩基配列、ＳａｃＩサイトを含む）
ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１．０分間を１サイクルとして３０サイクル行った。
【００２７】
これにより、図１（ａ）に示されるように、ＰＡｇＡをコードする遺伝子領域（以下、「ｐａｇＡ」と表記することもある）の５’末端側にＢａｍＨＩサイト及び３’末端側にＳａｃＩサイトを有するＤＮＡ断片１を作成した。
（２）ＧＴＦ−Ｉのｇｌｕｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ領域をコードするＤＮＡ断片の調整
Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ由来のＧＴＦの１種類である非水溶性グルカン合成酵素ＧＴＦ−Ｉのｇｌｕｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ領域をコードする遺伝子領域（以下、「ｇｔｆＩ−ＧＢ」と表記することもある。）は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ菌株ＯＭＺ１７６から単離された染色体ＤＮＡについて、以下のフォワードプライマー２及びリバースプライマー２を用いて、ＰＣＲ反応を行うことにより取得した。
【００２８】
プライマーの合成は、ＤＮＡ合成機を用いて行った。
フォワードプライマー２：ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＡＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＡＡＧＡＣ（配列表の配列番号：７に記載の塩基配列、ＳａｃＩサイトを含む）
リバースプライマー２：ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＡＣＧＧＴＡＧＡＴ（配列表の配列番号：８に記載の塩基配列、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む）
ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で２．０分間を１サイクルとして３０サイクル行った。
【００２９】
これにより、図１（ｃ）に示されるように、ｇｔｆＩ−ＧＢの５’末端側にＳａｃＩサイト及び３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトを有するＤＮＡ断片２を作成した。
（３）ｐａｇＡ及びｇｔｆＩ−ＧＢのベクターへの挿入
上記（１）及び（２）により得られたＤＮＡ断片を以下のようにして、６個の連続するＨｉｓ残基をコードするプラスミド発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（キアゲン社製）に組み込んだ。
【００３０】
上記（１）で得られたＤＮＡ断片、及び、ｐＱＥ８０Ｌを、それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩにより切断反応を行い、切断後のそれぞれの反応液についてそれぞれ電気泳動を行い、組み込みに使用するバンドを切り出し、ゲルからそれぞれのＤＮＡ断片を溶出、精製した。
そして、精製後の（１）のＤＮＡ断片と精製後のベクターとをＤＮＡライゲース（宝酒造（株）製）を用いて結合させた。これにより、図１（ｂ）に示されるように、ｐａｇＡ遺伝子領域を挿入したベクターｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡが作成された。
【００３１】
また、上記（２）においてられたＤＮＡ断片、及び、ベクターｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡについて、制限酵素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断反応を行った。切断後の反応液についても上述のようにそれぞれ電気泳動を行い、対応するバンドを切り出し、溶出精製した。
さらに、精製後の（２）のＤＮＡ断片と精製後のｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡとを、ＤＮＡライゲース（宝酒造（株）製）を用いて、結合させた。これにより、図１（ｄ）に示されるように、更にｇｔｆＩ−ＧＢ遺伝子領域を挿入したベクターｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡ−ｇｔｆＩ−ＧＢが作成された。
［実施例２］形質転換体の作成、融合蛋白質の発現、及び、融合蛋白質の精製
（１）形質転換体の作成、及び、融合蛋白質の発現
上述の［実施例１］において得られた形質転換体をコンピテント大腸菌ＤＨ５−αに混合し、形質転換した。得られた形質転換体を、アンピシリン濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地にて１晩培養し、この培養液を新たに準備した２×ＹＴ培地（アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む）に１：２０の割合で加え、３７℃で１時間培養した。更に、この培養液にＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を終末濃度１ｍＭになるように加えた後、３７℃で３時間培養し、発現誘導を行った。
【００３２】
その後、培養液を３５００×ｇ、２０分間、遠心機にかけて沈殿し集菌し、さらにＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）にて３回洗浄した。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる融合蛋白質の発現の確認
（１）のようにして得られた菌体に２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを添加して溶解し、１００℃にて５分間加熱後、１０％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。１００Ｖ（定電圧）、１時間の泳動後、クーマシーブリリアントブルーを用いて蛋白質染色したゲルの像が図２に示されている。
【００３３】
同図において、レーンＭは、マーカーレーンであり、レーン１は、上述のようにＩＰＴＧを加えて培養した菌体の溶解反応液を泳動させたレーンであり、レーン２は、ＩＰＴＧを加えずに、すなわち発現誘導せずに、そのまま培養した菌体の溶解反応液を泳動させたレーンである。
同図に示されるように、レーン１には、レーン２には確認できない８２ｋＤａ付近の太いバンドが出現しており、約８２ｋＤａの融合蛋白質の発現が確認された。
（３）融合蛋白質の精製
又、（１）のようにして得られた菌体を溶解し、Ｎｉ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｎｉ−ＮＴＡ）樹脂カラム（キアゲン社製）を用いて精製した。この操作は、キアゲン社のマニュアルに従って行った。
【００３４】
簡潔に記載すれば、菌体に溶解Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，８Ｍｕｒｅａ，ｐＨ８）を菌体１ｇ当たり５ｍｌ添加して懸濁したうえに、１０，０００×ｇで２０分〜３０分間遠心機にかけて細胞片を破砕した。更に、２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを添加して溶解し、１００℃にて５分間加熱したあと、この溶菌液とカラムベッドとを混合してカラムに導入し、精製操作を行った。この吸着反応後のカラムに、Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，８Ｍｕｒｅａ，ｐＨ６．３）を流して未吸着の物質を洗浄した。その後、ｐＨ５．９及びｐＨ４．５に調整された同組成のＢｕｆｆｅｒをそれぞれ順に流し、カラムに吸着しているＨｉｓ残基を含む蛋白質を溶出した。
【００３５】
溶出した蛋白質画分を上述と同様に１０％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。１００Ｖ（定電圧）、１時間の泳動後、クーマシーブリリアントブルーを用いて蛋白質染色したゲルの像が図３に示されている。
同図において、レーンＭは、マーカーレーンであり、レーン１は、精製を行う前の溶菌液を泳動させたレーンであり、レーン２は、上記精製操作における非蛋白質画分を泳動させたレーンであり、レーン３は、蛋白質画分を泳動させたレーンである。
【００３６】
同図に示されるように、レーン３には、レーン１と同様に８２ｋＤａ付近に太いバンドが出現しており、６個のＨｉｓ残基を付加した融合蛋白質の発現が確認された。また、レーン１、２に出現する融合蛋白質以外の蛋白質のバンドはほとんど確認することができず、ｐＨ４．５条件での溶出により、その他の蛋白質は除去され、融合蛋白質が精製されていることが確認された。
［実施例３］抗体の作成、及び、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面成分への付着抑制効果の確認
（１）抗体の作成
［実施例２］において作成された融合蛋白質を家兎（日本白色種、メス）に投与することにより抗体を作成した。融合蛋白質は２週間毎に６回にわたって０．３ｍｇずつ完全フロイントアジュバントと共に皮内注射により投与し、血中からＩｇＧ抗体を精製、取得した。ＩｇＧ抗体の精製はＡｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、マニュアル記載の方法で行った。すなわちｋｉｔに付属しているｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０に調整）で平衡化したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ アガロースをカラムに充填した。その後、融合蛋白質で免疫されたウサギの血清に等量のｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えた後、カラムに添加してウサギＩｇＧをＡｆｆｉ−Ｇｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ アガロースに吸着させた。平衡ｂｕｆｆｅｒでカラムを十分洗浄した後、ｋｉｔに付属したｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３．０に調整）でウサギＩｇＧを溶出し、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）で透析後、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮して精製ＩｇＧ抗体として用いた。
（２）Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面成分への付着抑制実験
（１）により作成されたＩｇＧ抗体を用いて行った、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面成分への付着抑制効果を確認するための実験結果が図４及び表１に示されている。
【００３７】
【００３８】
図４は、唾液でコートしたハイドロキシアパタイト１０ｍｇに、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ（菌数３×１０７）及びＩｇＧ抗体を加え、３時間、３７℃で保温後に測定されたハイドロキシアパタイトへの付着菌数と、ＩｇＧ抗体の添加量（μｇ）と、の関係を示したグラフである。また、表１は、ＩｇＧ抗体の各添加量における付着菌数の測定値を示している。
【００３９】
同図中のａｎｔｉ ＰＡｇＡ−ＧＴＦ−ＩＧＢ ＩｇＧは、上述の（１）のように作成されたＩｇＧ抗体であり、ｐｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ＩｇＧ（以下、「ｐｒｅｉｍｍ．ＩｇＧ」と表記することもある）は、融合蛋白質を投与しない非免疫ウサギの血中から精製したＩｇＧ抗体である。ｃｏｎｔｏｒｏｌは、ＩｇＧ抗体を加えなかった場合の測定値である。唾液コートハイドロキシアパタイトには、口腔における歯面と同様の状態とするため、歯面成分であるハイドロキシアパタイトで表面加工されたセラミックビーズ（直径８０μｍ、Ｂｉｏｒａｄ社製）を唾液に浸して、１時間、３７℃で保温したものを用いた。また、付着菌数は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓをＢＣＥＣＦ−ＡＭ（２’、７’−ｂｉｓ［２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］−５［６］−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）で蛍光ラベルし、付着反応時間後においてハイドロキシアパタイトに付着する当該菌をフォトカウンターで測定することにより取得した。
【００４０】
表１及び図４に示されるように、ｐｒｅｉｍｍ．ＩｇＧ添加時の菌の付着数は１．０×１０７〜０．７×１０７であったのに対し、ａｎｔｉ ＰＡｇＡ−ＧＴＦ−ＩＧＢ ＩｇＧ添加時では０．６×１０７〜０．２×１０７であり、ＩｇＧの各添加量におけるそれぞれの付着菌数について統計的有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。このことから、ａｎｔｉ ＰＡｇＡ−ＧＴＦ−ＩＧＢ ＩｇＧによって、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの唾液コートハイドロキシアパタイトへの付着が有意に抑制されることが確認された。
産業状の利用可能性
【００４１】
以上説明詳細に説明したように、本発明の融合蛋白質によれば、例えば、本発明による融合蛋白質を有効成分として含む医薬組成物としてヒトに投与することにより、ヒト等の免疫応答を誘導し、口腔内あるいは血中等に抗体が長期的に生成されて、う蝕予防を行うことが可能になる。あるいは、本発明による融合蛋白質を投与することにより、哺乳動物からＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面への付着阻害に関与する複数種の抗体を効率的に生成させて、回収することが可能になる。
【００４２】
本発明による組み換えＤＮＡ、ベクター、及び、形質転換体によれば、融合蛋白質の効率的な生産が可能になる。
本発明による抗体製剤によれば、口腔内に投与することにより、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面への付着を阻害し、あるいは、菌体の代謝阻害や白血球等による菌体の貪食をもたらして、う蝕予防が可能になる。このため、抗体によりう蝕予防のために、皮下注射等により上記融合蛋白質を含むワクチンを投与しなくても、簡便にう蝕予防を行うことが可能になる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は融合蛋白質に関し、特にう蝕菌に対する抗体を誘導する融合蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、う蝕予防として、例えば、フッ化物を歯磨剤に添加したり、スクロースに代わる代用甘味料を菓子に添加することなどが行われてきた。
更に、近年においては、ワクチン投与などによって、う蝕病原菌やう蝕病原菌により産生されるう蝕原因物質等に対する免疫反応を誘導するう蝕予防法が注目されている。このような技術の一例として、う蝕病原菌の１つであるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（以下、「Ｓ．ｍｕｔａｎｓ」と表記することもある）の菌体表層に局在する２つの物質のそれぞれの機能部位をつなぎ合わせて融合蛋白質を作成する技術が非特許文献１に示されている。当該融合蛋白質を抗原として作成された抗体は、実際にＳ．ｍｕｔａｎｓの唾液被覆ハイドロキシアパタイトへの付着を強く阻害することが確認されている。
【０００３】
また、非特許文献２には、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの菌体表層の付着因子（ＰＡｃ）に対するモノクローナル抗体を、組み換え植物により大量生成する技術が示されている。
上述のように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに特異的に作用する免疫学的方法を用いることにより、口腔内の他の細胞等を傷めることなく、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの歯面への付着やＳ．ｍｕｔａｎｓによる酸生成を抑制することが可能となる。
【０００４】
しかしながら、う蝕の病原菌はＳ．ｍｕｔａｎｓに限られるものではなく、口腔内に存在する複数種類の細菌によりう蝕が誘発されると考えられている。特に、ヒトのう蝕病巣からは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓと、更にＳｔｏｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓと、が高頻度に分離されている。
このため、上述のように免疫学的手法を用いる場合には、特定の病原菌に対して特異的に作用させることができる反面、その特異性は非常に厳密であるためＳ．ｍｕｔａｎｓ以外の病原菌に作用させることができない。すなわち、たとえ上述の抗体によって、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの歯面への付着や、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの増殖を抑制できても、これに代わってその他のう蝕病原菌、特にＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓが増殖することとなり、効果的にう蝕予防を行うことができない。
【０００５】
本発明の目的は、上述の課題に鑑みてなされたものであり、う蝕病巣を形成する主要な病原菌の１つであるＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓに対する抗体を誘導することにより、効果的なう蝕予防を可能とする融合蛋白質を提供することにある。
【非特許文献１】：ＨＡＯ ＹＵ、他４名、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ ＰｒｏｔｅｉｎＡｎｔｉｇｅｎ ＰＡｃ−Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ Ｇｌｕｃａｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ”，ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ，Ａｍｅｒｉｃａ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ １９９７，Ｖｏｌ．６５，Ｎｏ．６，ｐ．２２９２−２２９８
【非特許文献２】：Ｍａ、他２名、“Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ”，ＴＩＢＴＥＣＨ，１９９５，Ｖｏｌ．１３，ｐ．５２２−５２７
【発明の開示】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究した結果、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面への定着を効果的に阻害する抗体を誘導可能な融合蛋白質を開発するに至った。
すなわち、本発明にかかる融合蛋白質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ（以下、「Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ」と表記することもある）の、高分子菌体表層蛋白質のアラニン繰り返し領域と、グルカン合成酵素のグルカン結合領域と、を含む。
【０００７】
また、前記アラニン繰り返し領域が、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質からなることを特徴とする。
（ａ）配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【０００８】
また、前記グルカン結合領域が、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質からなることを特徴とする。
（ａ）配列表の配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【０００９】
ここで、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの高分子菌体表層蛋白質（以下、「ＰＡｇ」と表記することもある。）のアラニン繰り返し領域（以下、「Ａ−ｒｅｐｅａｔ領域」と表記することもある。）は、ＰＡｇの機能領域すなわち口腔内ペリクルの唾液糖蛋白質に結合する唾液結合領域を構成し、そのＮ末付近において局在するアラニンを高濃度に含む領域である。この唾液結合領域は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓが歯面に初期定着に関与している。
【００１０】
また、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのグルカン合成酵素（以下、「ＧＴＦ」と表記することもある。）は、スクロースから非水溶性グルカンを合成することにより、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの唾液で処理したハイドロキシアパタイト粒子への付着をより強固にするものであり、グルコース結合領域（以下、「ｇｌｕｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ領域」と表記することもある。）は、グルコースに結合する当該酵素の機能領域である。
【００１１】
本発明者らは、口腔内に誘導されたＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓに対する抗体がう蝕抑制において果たす作用機序、すなわち菌体の歯面への付着阻害、抗体が結合した菌体の白血球による貪食促進、及び、菌体の代謝阻害機序などのうち、特に菌体の歯面への付着阻害機序に着目した。そして、当該作用機序の強化すべく、この付着の際に重要な役割をなす２つの蛋白質の機能領域でありかつ特異的な２つの領域を結合した融合蛋白を作成し、抗原として用いることとした。この結果、後述するように、本発明による融合蛋白質を投与後に得られた抗体は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面への付着を高率で阻害することが確認された。
【００１２】
ここで、本発明は、上記アラニン繰り返し領域及びグルコース結合領域の結合順序、すなわちアミノ酸配列を考慮したときにどちらの領域が上流に配列するか、上記２領域を連結する他のペプチドの挿入、上記２領域の前後へのペプチドの付加等について、特に限定するものではない。例えば、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓのグルカン合成酵素について、グルカン結合領域の前後の１以上のアミノ酸をも含めて、融合蛋白質に組み入れるようにしてもよい。
【００１３】
また、上記２領域について１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものも、本発明の融合蛋白質に含められる。これは例えば、特定のアミノ酸を置換又は欠失する方法としては、後述の組み換えＤＮＡについて行うポイントミューテーション法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの公知の方法が用いることができる。
また、上記２領域のアミノ酸について、例えば、上記領域がＣ末端となる場合にそのＣ末端をエステル化やアミド化し、上記領域の分子内のアミノ酸の側鎖にあるＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどをホルミル基などの適当な保護基で保護するなど、若干の化学的修飾を行うことも可能である。
【００１４】
尚、このようにして作成された本発明による融合蛋白質は、例えば、本発明による融合蛋白質を有効成分として含む医薬組成物としての利用することができる。すなわち、免疫誘導可能な有効量の本発明の融合蛋白質をヒトを含む哺乳動物に直接投与することにより、ヒト等の免疫応答を誘導し、長期的なう蝕予防を行うことが可能になる。あるいは、後述のように、本発明による融合蛋白質を投与した哺乳動物から抗体を回収し、当該抗体を口腔内に投与することによりう蝕予防を行うことも可能である。
【００１５】
この場合には、融合蛋白質をそのまま使用してもよいが、通常は、製剤学的に許容しうる製剤用添加剤や賦形剤などを用いて上記融合蛋白質を有効成分として含む医薬組成物として製造し、用いることが好ましい。この医薬組成物の投与経路としては、例えば、経鼻粘膜投与などの免疫応答が誘導可能な局所投与を挙げることができる。このため本発明の融合蛋白質は経鼻免疫などの局所投与剤の医薬組成物の有効成分として用いられる。
【００１６】
さらに、本発明による組み換えＤＮＡは、本発明による融合蛋白質をコードする。
また、本発明による組み換えＤＮＡは、前記融合蛋白質を構成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓの高分子菌体表層蛋白質のアラニン繰り返し領域をコードする以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有することを特徴とする。
（ａ）配列表の配列番号：３に示される塩基配列。
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列。
【００１７】
また、前記融合蛋白質を構成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓのグルカン合成酵素のグルカン結合領域をコードする以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有することを特徴とする。
（ａ）配列表の配列番号：４に示される塩基配列。
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列。
【００１８】
更に、本発明による組み換えＤＮＡを含有する発現ベクター、及び、当該発現ベクターを保持する形質転換体が提供される。
ここで、配列番号：３あるいは配列番号：４で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３あるいは配列番号：４で表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、例えばＤＩＧ核酸検出システム（Ｒｏｃｈｅ社）のマニュアル記載の方法に従って行わせることができる。この場合において、約２０％のミスマッチを許容するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（約８０％の相同性を保証する）としては、５０％フォルムアミド（脱イオン）、５×ＳＳＣ（ナトリウム濃度０．９７５Ｍ）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで、温度が４２℃である。さらにハイブリダイゼーション温度を１．４℃上げることでミスマッチを１％下げることができる。
【００１９】
また、本発明の組み換えＤＮＡは、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ由来のゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ由来のｃＤＮＡより公知の方法により単離されたものをＤＮＡライゲース等を用いて結合したもの、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
また、配列番号：３あるいは配列番号：４で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡを作成するためには、例えば、市販のキットなどを用いて、Ｋｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って、塩基配列の変換を行うことができる。
【００２０】
尚、上記形質転換体を用いれば融合蛋白質を容易かつ大量に精製させることができるが、上記融合蛋白質は、上記組み換えＤＮＡを形質転換体に導入し、作成されるものに限定されないことはいうまでもない。蛋白質合成の公知の方法、例えば、蛋白質合成用樹脂に、上述のアミノ酸配列通りに、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を縮合させていき、縮合反応終了後に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施することにより、本発明による融合蛋白質を合成することなども可能である。
【００２１】
また、本発明の発現ベクターは、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどいずれであってもよい。発現ベクターには、宿主細胞に応じたプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。
【００２２】
また、本発明の形質転換体に用いられる宿主細胞としては、例えば、大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などのいずれでもよい。
更に、本発明の抗体製剤によれば、上述の融合蛋白質に対する抗体を含む。
すなわち、本発明による融合蛋白質に対する抗体は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面への付着阻害作用を有するものであり、当該作用は、ヒトを含む他の哺乳動物等により作成された当該抗体を含む抗体製剤として口腔内へ投与した場合にも有効に発揮しうるものである。
【００２３】
また、本発明による抗体製剤に含有される抗体は、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。例えば、ポリクローナル抗体であれば、哺乳動物に対して上記融合蛋白質をそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与し、免疫された哺乳動物から抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより取得する。免疫を行う哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどが挙げられる。例えば、ウシ、ニワトリなどの家畜動物である場合には、乳や卵等をそのまま回収し、融合蛋白質に対する抗体を含む食品として口腔内に投与することが可能である。特に、ウシからは大量に牛乳を回収することができるため、分離精製して用いることもできる。この場合には、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を、細胞融合や核移植等公知の方法を経て作成されるヒトポリクローナル抗体産生ＨＡＣウシ等に融合蛋白質を投与して免疫し、ヒト抗体を作成させることとしてもよい。このように、歯面への付着阻害に関与する抗体を、同時に作成されるポリクローナル抗体として取得することが望ましいが、免疫された動物から抗体産生細胞を回収し、公知の方法によりモノクローナル抗体を産生してもよい。また、本発明による抗体製剤の形態としては、、例えば、口腔用の軟膏、ゼリー製剤、洗口剤、若しくは噴霧剤などが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
［図１］（ａ）は、ＰＡｇＡ遺伝子領域を説明する図、（ｂ）は、ｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡの構成を説明する図、（ｃ）は、ｇｔｆＩ−ＧＢ遺伝子領域を説明する図、（ｄ）は、ｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡ−ｇｔｆＩ−ＧＢの構成を説明する図である。
［図２］融合蛋白質を発現した大腸菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
［図３］精製後の融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
［図４］ハイドロキシアパタイトへの付着菌数と、ＩｇＧ抗体の添加量と、の関係を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
次に、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。なお、以下の説明において参照する各図においては、他の図と同等の部分が同一符号によって示されている。
［実施例１］融合蛋白質発現ベクターの作成
（１）ＰＡｇのＡ−ｒｅｐｅａｔ領域（以下、「ＰＡｇＡ」と表記することもある。）をコードするＤＮＡ断片の調整
この断片は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ菌株ＯＭＺ１７６から単離された染色体ＤＮＡについて、以下のフォワードプライマー１及びリバースプライマー１を用いて、ＰＣＲ反応を行うことにより取得した。
【００２６】
プライマーの合成は、ＤＮＡ合成機を用いて行った。
フォワードプライマー１：ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＡＴＡＡＴＧＡＣＡＧＴＣＡＡＧＣＡ（配列表の配列番号：５に記載の塩基配列、開始コドン及びＢａｍＨＩサイトを含む）
リバースプライマー１：ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣ（配列表の配列番号：６に記載の塩基配列、ＳａｃＩサイトを含む）
ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１．０分間を１サイクルとして３０サイクル行った。
【００２７】
これにより、図１（ａ）に示されるように、ＰＡｇＡをコードする遺伝子領域（以下、「ｐａｇＡ」と表記することもある）の５’末端側にＢａｍＨＩサイト及び３’末端側にＳａｃＩサイトを有するＤＮＡ断片１を作成した。
（２）ＧＴＦ−Ｉのｇｌｕｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ領域をコードするＤＮＡ断片の調整
Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ由来のＧＴＦの１種類である非水溶性グルカン合成酵素ＧＴＦ−Ｉのｇｌｕｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ領域をコードする遺伝子領域（以下、「ｇｔｆＩ−ＧＢ」と表記することもある。）は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ菌株ＯＭＺ１７６から単離された染色体ＤＮＡについて、以下のフォワードプライマー２及びリバースプライマー２を用いて、ＰＣＲ反応を行うことにより取得した。
【００２８】
プライマーの合成は、ＤＮＡ合成機を用いて行った。
フォワードプライマー２：ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＡＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＡＡＧＡＣ（配列表の配列番号：７に記載の塩基配列、ＳａｃＩサイトを含む）
リバースプライマー２：ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＡＣＧＧＴＡＧＡＴ（配列表の配列番号：８に記載の塩基配列、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む）
ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で２．０分間を１サイクルとして３０サイクル行った。
【００２９】
これにより、図１（ｃ）に示されるように、ｇｔｆＩ−ＧＢの５’末端側にＳａｃＩサイト及び３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトを有するＤＮＡ断片２を作成した。
（３）ｐａｇＡ及びｇｔｆＩ−ＧＢのベクターへの挿入
上記（１）及び（２）により得られたＤＮＡ断片を以下のようにして、６個の連続するＨｉｓ残基をコードするプラスミド発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（キアゲン社製）に組み込んだ。
【００３０】
上記（１）で得られたＤＮＡ断片、及び、ｐＱＥ８０Ｌを、それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩにより切断反応を行い、切断後のそれぞれの反応液についてそれぞれ電気泳動を行い、組み込みに使用するバンドを切り出し、ゲルからそれぞれのＤＮＡ断片を溶出、精製した。
そして、精製後の（１）のＤＮＡ断片と精製後のベクターとをＤＮＡライゲース（宝酒造（株）製）を用いて結合させた。これにより、図１（ｂ）に示されるように、ｐａｇＡ遺伝子領域を挿入したベクターｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡが作成された。
【００３１】
また、上記（２）においてられたＤＮＡ断片、及び、ベクターｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡについて、制限酵素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断反応を行った。切断後の反応液についても上述のようにそれぞれ電気泳動を行い、対応するバンドを切り出し、溶出精製した。
さらに、精製後の（２）のＤＮＡ断片と精製後のｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡとを、ＤＮＡライゲース（宝酒造（株）製）を用いて、結合させた。これにより、図１（ｄ）に示されるように、更にｇｔｆＩ−ＧＢ遺伝子領域を挿入したベクターｐＱＥ８０Ｌ−ｐａｇＡ−ｇｔｆＩ−ＧＢが作成された。
［実施例２］形質転換体の作成、融合蛋白質の発現、及び、融合蛋白質の精製
（１）形質転換体の作成、及び、融合蛋白質の発現
上述の［実施例１］において得られた形質転換体をコンピテント大腸菌ＤＨ５−αに混合し、形質転換した。得られた形質転換体を、アンピシリン濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを加えた２×ＹＴ培地にて１晩培養し、この培養液を新たに準備した２×ＹＴ培地（アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む）に１：２０の割合で加え、３７℃で１時間培養した。更に、この培養液にＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を終末濃度１ｍＭになるように加えた後、３７℃で３時間培養し、発現誘導を行った。
【００３２】
その後、培養液を３５００×ｇ、２０分間、遠心機にかけて沈殿し集菌し、さらにＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）にて３回洗浄した。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる融合蛋白質の発現の確認
（１）のようにして得られた菌体に２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを添加して溶解し、１００℃にて５分間加熱後、１０％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。１００Ｖ（定電圧）、１時間の泳動後、クーマシーブリリアントブルーを用いて蛋白質染色したゲルの像が図２に示されている。
【００３３】
同図において、レーンＭは、マーカーレーンであり、レーン１は、上述のようにＩＰＴＧを加えて培養した菌体の溶解反応液を泳動させたレーンであり、レーン２は、ＩＰＴＧを加えずに、すなわち発現誘導せずに、そのまま培養した菌体の溶解反応液を泳動させたレーンである。
同図に示されるように、レーン１には、レーン２には確認できない８２ｋＤａ付近の太いバンドが出現しており、約８２ｋＤａの融合蛋白質の発現が確認された。
（３）融合蛋白質の精製
又、（１）のようにして得られた菌体を溶解し、Ｎｉ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｎｉ−ＮＴＡ）樹脂カラム（キアゲン社製）を用いて精製した。この操作は、キアゲン社のマニュアルに従って行った。
【００３４】
簡潔に記載すれば、菌体に溶解Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，８Ｍｕｒｅａ，ｐＨ８）を菌体１ｇ当たり５ｍｌ添加して懸濁したうえに、１０，０００×ｇで２０分〜３０分間遠心機にかけて細胞片を破砕した。更に、２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを添加して溶解し、１００℃にて５分間加熱したあと、この溶菌液とカラムベッドとを混合してカラムに導入し、精製操作を行った。この吸着反応後のカラムに、Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，８Ｍｕｒｅａ，ｐＨ６．３）を流して未吸着の物質を洗浄した。その後、ｐＨ５．９及びｐＨ４．５に調整された同組成のＢｕｆｆｅｒをそれぞれ順に流し、カラムに吸着しているＨｉｓ残基を含む蛋白質を溶出した。
【００３５】
溶出した蛋白質画分を上述と同様に１０％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。１００Ｖ（定電圧）、１時間の泳動後、クーマシーブリリアントブルーを用いて蛋白質染色したゲルの像が図３に示されている。
同図において、レーンＭは、マーカーレーンであり、レーン１は、精製を行う前の溶菌液を泳動させたレーンであり、レーン２は、上記精製操作における非蛋白質画分を泳動させたレーンであり、レーン３は、蛋白質画分を泳動させたレーンである。
【００３６】
同図に示されるように、レーン３には、レーン１と同様に８２ｋＤａ付近に太いバンドが出現しており、６個のＨｉｓ残基を付加した融合蛋白質の発現が確認された。また、レーン１、２に出現する融合蛋白質以外の蛋白質のバンドはほとんど確認することができず、ｐＨ４．５条件での溶出により、その他の蛋白質は除去され、融合蛋白質が精製されていることが確認された。
［実施例３］抗体の作成、及び、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面成分への付着抑制効果の確認
（１）抗体の作成
［実施例２］において作成された融合蛋白質を家兎（日本白色種、メス）に投与することにより抗体を作成した。融合蛋白質は２週間毎に６回にわたって０．３ｍｇずつ完全フロイントアジュバントと共に皮内注射により投与し、血中からＩｇＧ抗体を精製、取得した。ＩｇＧ抗体の精製はＡｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、マニュアル記載の方法で行った。すなわちｋｉｔに付属しているｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０に調整）で平衡化したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ アガロースをカラムに充填した。その後、融合蛋白質で免疫されたウサギの血清に等量のｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えた後、カラムに添加してウサギＩｇＧをＡｆｆｉ−Ｇｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ アガロースに吸着させた。平衡ｂｕｆｆｅｒでカラムを十分洗浄した後、ｋｉｔに付属したｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３．０に調整）でウサギＩｇＧを溶出し、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）で透析後、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮して精製ＩｇＧ抗体として用いた。
（２）Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面成分への付着抑制実験
（１）により作成されたＩｇＧ抗体を用いて行った、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面成分への付着抑制効果を確認するための実験結果が図４及び表１に示されている。
【００３７】
【００３８】
図４は、唾液でコートしたハイドロキシアパタイト１０ｍｇに、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ（菌数３×１０７）及びＩｇＧ抗体を加え、３時間、３７℃で保温後に測定されたハイドロキシアパタイトへの付着菌数と、ＩｇＧ抗体の添加量（μｇ）と、の関係を示したグラフである。また、表１は、ＩｇＧ抗体の各添加量における付着菌数の測定値を示している。
【００３９】
同図中のａｎｔｉ ＰＡｇＡ−ＧＴＦ−ＩＧＢ ＩｇＧは、上述の（１）のように作成されたＩｇＧ抗体であり、ｐｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ＩｇＧ（以下、「ｐｒｅｉｍｍ．ＩｇＧ」と表記することもある）は、融合蛋白質を投与しない非免疫ウサギの血中から精製したＩｇＧ抗体である。ｃｏｎｔｏｒｏｌは、ＩｇＧ抗体を加えなかった場合の測定値である。唾液コートハイドロキシアパタイトには、口腔における歯面と同様の状態とするため、歯面成分であるハイドロキシアパタイトで表面加工されたセラミックビーズ（直径８０μｍ、Ｂｉｏｒａｄ社製）を唾液に浸して、１時間、３７℃で保温したものを用いた。また、付着菌数は、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓをＢＣＥＣＦ−ＡＭ（２’、７’−ｂｉｓ［２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］−５［６］−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）で蛍光ラベルし、付着反応時間後においてハイドロキシアパタイトに付着する当該菌をフォトカウンターで測定することにより取得した。
【００４０】
表１及び図４に示されるように、ｐｒｅｉｍｍ．ＩｇＧ添加時の菌の付着数は１．０×１０７〜０．７×１０７であったのに対し、ａｎｔｉ ＰＡｇＡ−ＧＴＦ−ＩＧＢ ＩｇＧ添加時では０．６×１０７〜０．２×１０７であり、ＩｇＧの各添加量におけるそれぞれの付着菌数について統計的有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。このことから、ａｎｔｉ ＰＡｇＡ−ＧＴＦ−ＩＧＢ ＩｇＧによって、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの唾液コートハイドロキシアパタイトへの付着が有意に抑制されることが確認された。
産業状の利用可能性
【００４１】
以上説明詳細に説明したように、本発明の融合蛋白質によれば、例えば、本発明による融合蛋白質を有効成分として含む医薬組成物としてヒトに投与することにより、ヒト等の免疫応答を誘導し、口腔内あるいは血中等に抗体が長期的に生成されて、う蝕予防を行うことが可能になる。あるいは、本発明による融合蛋白質を投与することにより、哺乳動物からＳ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面への付着阻害に関与する複数種の抗体を効率的に生成させて、回収することが可能になる。
【００４２】
本発明による組み換えＤＮＡ、ベクター、及び、形質転換体によれば、融合蛋白質の効率的な生産が可能になる。
本発明による抗体製剤によれば、口腔内に投与することにより、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓの歯面への付着を阻害し、あるいは、菌体の代謝阻害や白血球等による菌体の貪食をもたらして、う蝕予防が可能になる。このため、抗体によりう蝕予防のために、皮下注射等により上記融合蛋白質を含むワクチンを投与しなくても、簡便にう蝕予防を行うことが可能になる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓの、高分子菌体表層タンパク質のアラニン繰り返し領域と、グルカン合成酵素のグルカン結合領域と、を含む融合蛋白質。
【請求項２】
前記アラニン繰り返し領域が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項３】
前記グルカン結合領域が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質からなることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の融合蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項４】
請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする組み換えＤＮＡ。
【請求項５】
前記融合蛋白質を構成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓの高分子菌体表層タンパク質のアラニン繰り返し領域をコードする以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有することを特徴とする請求の範囲第４項に記載の組み換えＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号：３に示される塩基配列。
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列。
【請求項６】
前記融合蛋白質を構成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓのグルカン合成酵素のグルカン結合領域をコードする以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有することを特徴とする請求の範囲第４項又は第５項に記載の組み換えＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号：４に示される塩基配列。
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列。
【請求項７】
請求の範囲第４項から第６項のいずれかに記載の組み換えＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載の発現ベクターを保持する形質転換体。
【請求項９】
請求の範囲第１項から第８項のいずれかに記載の融合蛋白質に対する抗体を含む抗体製剤。
【請求項１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓの、高分子菌体表層タンパク質のアラニン繰り返し領域と、グルカン合成酵素のグルカン結合領域と、を含む融合蛋白質。
【請求項２】
前記アラニン繰り返し領域が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の融合蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項３】
前記グルカン結合領域が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質からなることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の融合蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項４】
請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする組み換えＤＮＡ。
【請求項５】
前記融合蛋白質を構成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓの高分子菌体表層タンパク質のアラニン繰り返し領域をコードする以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有することを特徴とする請求の範囲第４項に記載の組み換えＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号：３に示される塩基配列。
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列。
【請求項６】
前記融合蛋白質を構成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓのグルカン合成酵素のグルカン結合領域をコードする以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有することを特徴とする請求の範囲第４項又は第５項に記載の組み換えＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号：４に示される塩基配列。
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列。
【請求項７】
請求の範囲第４項から第６項のいずれかに記載の組み換えＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載の発現ベクターを保持する形質転換体。
【請求項９】
請求の範囲第１項から第８項のいずれかに記載の融合蛋白質に対する抗体を含む抗体製剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９４１８
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【発行日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６０２５（Ｐ２００５−５０６０２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６３９３
【国際出願日】平成１６年５月１２日（２００４．５．１２）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【発行日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６３９３
【国際出願日】平成１６年５月１２日（２００４．５．１２）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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