血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤
【課題】血痕、血液に対しても抗Ｈレクチン血液型判定用溶剤の使用で、正確かつ迅速に血液型判定ができる血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤の提供。
【解決手段】血液型判定、血痕の解離試験に用いられる、ゴーヤの種子から抽出され、かつ分子量が１００，０００〜１７０，０００の範囲内にある血液型判定用レクチン及び該レクチンを含有する血液型判定用溶剤。
【解決手段】血液型判定、血痕の解離試験に用いられる、ゴーヤの種子から抽出され、かつ分子量が１００，０００〜１７０，０００の範囲内にある血液型判定用レクチン及び該レクチンを含有する血液型判定用溶剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤に関し、特に赤血球膜表面のＨ抗原に対して特異的な凝集力を持ち、血痕の正確且つ迅速な血液型判定を行うことを特徴とする血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、植物から抽出されたレクチンとしては、例えば、抗Ａ１レクチン（ヒマラヤフジマメ由来）、抗Ｈレクチン（ハリエニシダ由来）等が挙げられる。例えば、ヨーロッパハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）から抽出された抗Ｈレクチンは、Ｈ抗原の判定に用いられている。これまでの抗Ｈレクチンよりも活性を高めたタイプの抗Ｈレクチン−ストロングは微量の体液や毛髪の血液型判定（解離試験）に適している。また、抗Ｈレクチン−ストロングは従来の抗Ｈレクチンよりも４倍以上の凝集力価を有していることから、少量のサンプル（試料）からでもＨ抗原の判定が可能である（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。
【０００３】
参考値として下記に凝集力価の比較値を下記に示す。
【０００４】
≪参考値≫
凝集力価（２％人Ｏ型赤血球凝集力価ＰＢＳでの連続希釈法により測定）
・抗Ｈレクチン ２6（６４倍）
・抗Ｈレクチン−ストロング ２8（２５６倍）
【０００５】
また、血液型判定に用いられる、動物から抽出されたレクチンとしては、ドジョウ、特にその卵から抽出され、かつ分子量が１５，０００〜５０，０００の範囲にあるレクチンが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【非特許文献１】日本臨床衛生検査技術会ライブラリーＸＩＩ輸血検査の実際、改訂第１版、「日臨技輸血検査標準法」改訂委員会著、（社）日本臨床衛生検査技術会１９９６年１７１項
【非特許文献２】生化学工業株式会社Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ研究用試薬情報ＰＲＯＤＵＣＴ ＲＥＰＯＲＴ Ｎｏ．１０５
【特許文献１】特開平１１−０８３８６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記従来の技術では、以下のような欠点があった。
【０００７】
（１）以上述べたヨーロッパハリエニシダから抽出した抗Ｈレクチンは、血痕に対する血液型判定（解離試験）でＨ抗原を検出することが困難であった。
（２）従来の抗Ｈレクチンを用いた血液型判定用溶剤は原材料の入手が困難かつ使用量が多く、コストの面での問題があった。
（３）これまでのハリエニシダ由来レクチンの力価は使用する原材料（Ｕｌｅｘ ｓｅｅｄ）によって影響され、ロット内で不均一である。
（４）また、ドジョウから抽出されたレクチンは、血液型判定に用いられるものであるが、Ｈ抗原を検出することは困難である。
【０００８】
この発明の目的は、上記従来技術における問題点を解消し、血痕、血液に対しても抗Ｈレクチン血液型判定用溶剤の使用で、正確かつ迅速に血液型判定ができる血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明の発明者らは、上述の問題点を解決すべく鋭意研究の結果、ゴーヤの種子から抽出したレクチンが、従来の植物を由来とする抗Ｈレクチンよりも赤血球膜表面のＨ抗原に対して特異的な凝集力があることを見出し、この知見に基づいてこの発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、この発明の構成は以下の事項からなる。
【００１１】
（１）ゴーヤの種子から抽出され、かつ分子量が１００，０００〜１７０，０００の範囲内にある血液型判定用レクチン。
（２）血液型判定、血痕の解離試験に用いられる前項（１）に記載される血液型判定用レクチン。
（３）ゴーヤの種子から抽出され、かつ分子量が１００，０００〜１７０，０００の範囲内にあるレクチンを含有する血液型判定用溶剤。
【発明の効果】
【００１２】
この発明によれば、血痕、血液に対しても抗Ｈレクチン血液型判定用溶剤の使用で、正確かつ迅速に血液型判定ができる。
【００１３】
（１）請求項１に記載されるように、この発明による血液型判定用レクチンは、ゴーヤの種子という安価な原料から非常に力価の高いレクチンを容易に得ることができる。通常、ゴーヤの種子は果肉を取った後は、廃棄、又は家畜飼料として再利用されている。その点からみれば、原材料のコストはゼロに等しい。また、抽出からレクチン精製にかかるコストは、従来のレクチン製造にかかるコストと同等である。この点で従来の血液型判定用レクチンに比較して、非常に低コストで製造できる利点を有している。
（２）従来の血液型判定用レクチンに比較して、Ｈ抗原に特異的に凝集反応を示す。
（３）従来の血液型判定用レクチンに比較し力価が非常に高いため、血痕に対しても血液型の判定が可能であり、科学捜査等で必要とされる信頼度の高いデータを提供できる。
（４）ゴーヤ由来レクチンは、使用する原材料に影響されず、高力価であるため原材料による影響が少なく、力価はロット内で均一である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、この発明において用いることができる、ゴーヤの種子、レクチンの抽出及び精製技術、分子量範囲、血液型判定、血液型判定用溶剤、ならびに血痕の解離試験等について詳細に説明する。
【００１５】
この発明においてはゴーヤの種類はすべてのものを用いることができ、すべてのゴーヤでレクチンは抽出可能である。また、用いられるゴーヤの種子の生育状況は完熟、未熟のどちらでもよい。完熟の方が力価が高いが、求められる血液型判定の効果はどちらでも充分に得られる。
【００１６】
この発明では、レクチンの分子量の測定は、周知のＳＤＳ存在下（変性条件下）でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のうち、濃縮ゲルを用いる不連続ゲル電気泳動（Laemmli法）による方法を用いて行う。
【００１７】
また、レクチンの分子量を１００，０００〜１７０，０００とする根拠は、血液を凝固することができる分子量の範囲である。
【００１８】
分子量が、１００，０００未満である場合、ならびに分子量が、１７０，０００を超える場合には、血液を凝固しにくく、好ましくない。
【００１９】
次に、レクチンを抽出するための操作について説明する。
【００２０】
ゴーヤとしてはゴーヤ乾燥種子を使用する。種子は未熟でも、完熟でもどちらでもよいが、但し乾燥させる。以下にその手順を示す。
【００２１】
１．ゴーヤ乾燥種子１０ｇをコーヒーミルで粉砕し、微粉末にする。
２．種子乾燥重量１０ｇの１０倍量（１００ｍｌ）の蒸留水を加え、スターラーで３時間攪拌抽出する。
３．さらし布で絞ってろ過し、ろ液を採る（８０ｍｌ程度）。
４．遠心分離機で回転数５０００ｒｐｍで、１０分間液体部分を遠心分離する。
５．上清を回収し、最初に加えた蒸留水の１．５倍量（１５０ｍｌ）のエタノールを加えて攪拌し、１時間放置する。
６．上清を捨て、沈殿物を回収し、遠心分離機にかける（回転数５０００ｒｐｍで１０分間。）。
７．上清を捨て、沈殿物を蒸発皿に広げ、乾燥させる。
８．乾燥したものを回収し乳鉢ですりつぶし、粉末にしたもの（約０．３ｇ）にゼラチン入り生理食塩水５〜１０ｍｌを加え溶かす。
９．遠心分離機にかける（回転数５０００ｒｐｍで１０分間。）。
１０．上清を回収し、抗Ｈレクチンとして用いる。
１１．凝集素価を測定する。凝集素価の測定方法を以下に示す。
【００２２】
《測定方法》
（１）生理食塩水で血清を２倍連続希釈し、各試験管に０．２５ｍｌずつ残るようにする。
（２）抗Ｈレクチンに対応するＯ型赤血球を生理食塩水で３回洗い、２％の生理食塩水浮遊液をつくり、希釈した血清に２％赤血球浮遊液０．２５ｍｌを加え試験管を振ってよく混合する。
（３）回転数１０００ｒｐｍで１分間遠心分離機にかける。
（４）試験管を静かに振って凝集を確認する。
（５）凝集の強さを＋＋＋〜＋に分け、＋の凝集を示した試験管の最高希釈倍数を持って、その血清の凝集素価とする。
【００２３】
凝集の強さの判定は「各血液型血球に対する凝集素価」（後掲する表４参照）による。
例えば、ゴーヤ種子由来抗ＨレクチンによるＯ型血球の測定値は、ホールグラス法（室温で３０分放置後、判定）で２8（２５６）倍であり、試験管法（回転数１０００ｒｐｍで１分間遠心後、判定）で２9（５１２倍）である。
【００２４】
なお、上述した測定方法については、「法医血清学的検査法マニュアル」９０ページ、表３-１２（金原出版）に準拠した。
【００２５】
次に、この発明において用いられる解離試験・判定方法について説明する。
【００２６】
《解離試験》
血痕が金属、岩石、プラスチックおよび合成繊維などの付着している場合、切り取ることのできない場合、または粉末状ないし凝塊状になっている場合には、蒸留水で湿らせた木綿糸や小ガーゼ片に擦って付着させるか、少量の糸片と溶解後、糸などに付着させてから乾燥させたものを検査試料として、「法医血清学的検査法マニュアル」１８１ページ、図４-２２（金原出版）に示す下記操作方法に従って実施する。手技が複雑でなく検出感度も優れていることから、犯罪捜査の分野で最もよく利用されている方法である。使用する装置、試薬としては、高温槽（ＡＤＶＥＮＴＥＣ製 ＬＴ−４８０ ＣＯＮＳＴＡＮＴ ＴＥＭＰＡＲＡＴＵＲＥ ＢＡＴＨ）、試験管、ホールグラス、抗Ａ血清、抗Ｂ血清、抗Ｈレクチン、スピレーター、指示血球などである。
【００２７】
《操作方法》
（１）資料の血痕付着部位、および対象部位から長さ約１．５ｃｍの片を切り取り、３等分する。
（２）試料名（血痕、対照）と、加える凝集素名（抗Ｈ、抗Ａ、抗Ｂ）とを記入した小試験管に３等分した片各１個ずつ入れる。
（３）抗Ｈ、抗Ａ、抗Ｂの凝集素を対応する試験管に０．１ｍｌずつ加える。ここで抗Ｈレクチンを用いる。
（４）凝集素を充分に吸着させる。
（５）吸着後、冷生理食塩水を全試験管一杯に注ぐ。次いで、試料を残して、反応しなかった抗体を含んだ生理食塩水を捨てる。
（６）生理食塩水を吸い取った試験管を３組に分けて、それぞれの組にＯ型、Ａ型、Ｂ型の０．２％赤血球浮遊液を滴下した後、５６℃、１０分間加温する（解離）。
（７）試験管を回転数１，０００ｒｐｍで１分間遠心分離にかける。
【００２８】
《判定方法》
判定方法については、「法医血清学的検査法マニュアル」１８１ページ、図４-２２「８」（金原出版）に示す下記判定方法に従って実施する。
【００２９】
上述の解離試験において、遠心分離した試験管を静かに振ってから、判定表に従って判定する。ここでハリエニシダ由来抗Ｈレクチンは凝集反応はないが、この発明のゴーヤ種子由来抗Ｈレクチンは凝集反応があることを判定する。
【００３０】
また、この発明の血液型判定用レクチンは、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ（ゴーヤ、にがうり、ツルレイシ、苦瓜、ＢＡＬＳＡＭ ＰＥＡＲ）の種子から抽出された赤血球凝集タンパク質であることからＨ抗原の存在しないＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ血球を用いた赤血球凝集反応においても図１に示すように、凝集反応が認められず、この発明のレクチンが抗Ｈレクチンであることが示唆された。図１（ａ）はこの発明によるゴーヤ種子抽出レクチンを用いた時のＯ型血球の凝集反応を示す図である。図１（ｂ）はユーレックス抗Ｈレクチンを用いた時のＯ型血球の凝集反応を示す図である。図１（ｃ）はこの発明によるゴーヤ種子抽出レクチンを用いた時のＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ型血球の凝集反応結果であり、血球凝集反応は認められない。図１（ｄ）はユーレックス抗Ｈレクチンを用いた時のＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ型血球の凝集反応結果であり、同様に血球凝集反応は認められない。
【００３１】
以下、この発明のゴーヤの種子から抽出された血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤の最良の実施の形態について、実施例を用いて具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではないことは勿論のことである。
【実施例】
【００３２】
なお、下記実施例１、２において用いられたゴーヤの入手先は、ＪＡ宮崎農協果汁（宮崎県川南町）、イシハラフーズ（株）（宮崎県都城市）である。
【００３３】
（実施例１）
この発明に係るレクチンの抽出について説明する。
(1)ゴーヤの種子を１００ｇ用い、コーヒーミルのような粉砕器で粉砕し微粉末状態にする。
(2)次に、該微粉末を容器の中に入れ、１リットルの蒸留水を加えスターラーで攪拌する。
(3)その後、約１２時間以上放置しゴーヤの種子成分を抽出して抽出液を得る。
(4)さらし布で、上記抽出液をろ過し、ろ液を採取する。
(5)さらに、遠心分離器で回転数３０００ｒｐｍ、回転時間３０分間で、液体部分を遠心分離する。
(6)遠心分離後、上澄み液を採取し、約２リットルのエタノールを加え攪拌し、４℃の環境下で、約１２時間インキュベートする。こうして粗抗Ｈレクチンが抽出される。得られた粗抗Ｈレクチンにはレクチンと他のタンパク、糖分が含まれているが、求められる力価は粗抗Ｈレクチンにも十分にある。
【００３４】
次に、前記工程で得られた粗抗Ｈレクチンの精製について説明する。
(1)上記抽出液の上澄み液をアスプレーターで吸引除去し、沈殿物を採取する。
(2)さらに、遠心分離器を用い、回転数３０００ｒｐｍ、回転時間３０分間で、液体部分を遠心分離する。
(3)沈殿物を広口の容器に広げて乾燥させて乾燥物を得る。
(4)次に、ゼラチン入り生理食塩水１００ｍｌ中に上記乾燥物を溶かす。
(5)遠心分離器を用い、回転数３０００ｒｐｍ、回転時間３０分間で、液体部分を遠心分離し、該液体部分の上澄み液を採取する。
【００３５】
以上の工程を経て精製された抗Ｈレクチンが得られる。得られた精製された抗Ｈレクチンの分子量は、上述したＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定で約１２０，０００である。得られた精製された抗Ｈレクチンは余分のタンパク、糖分が除かれ、レクチンの純度が高く、力価も高くなっている。
【００３６】
（実施例２）
上記実施例１により抽出されたレクチンを用いた血液型判定用溶剤により、ゴーヤ抗Ｈレクチンによる血液型のおもて試験、ゴーヤ抗Ｈレクチンによる血痕のＡＢＯ式血液型試験の解離試験、及びゴーヤ抗Ｈレクチンによる血痕のＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ式血液型試験の解離試験を、上述した解離試験法により行った。
【００３７】
この際用いたレクチン量は５０μｌであり、それぞれの試験結果を、下記表１〜表３に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
上記表１〜表３から分かるように、この発明のゴーヤ種子由来抗Ｈレクチンを用いた血液型判定用溶剤は、従来のハリエニシダ種子抽出抗Ｈレクチンでは判定不能である血痕に対し、明らかに力価及び赤血球凝集反応の面で従来品よりも高い反応性を示し、優れていることが判明した。
【００４２】
また、この発明の血液型判定用レクチンの検定成績を下記表４〜表８に示す。
【００４３】
【表４】
【００４４】
【表５】
【００４５】
上記表５に示される凝集力の試験結果から次のことが分かる。従来のハリエニシダ種子抽出抗Ｈレクチンでは、凝集反応時間が２分〜１５分掛かっているのに対し、この発明のゴーヤ種子由来レクチンは凝集反応に要する時間が数十秒と反応性がよい。また、１００万人に１人の血液型といわれるＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ型については、Ｈ抗原の存在しない血液型であることから、凝集反応は認められず、この発明のゴーヤ種子由来レクチンが抗Ｈレクチンであることがいえる。
【００４６】
【表６】
【００４７】
上記表６に示される、３ヶ月間保存したときの保存温度依存について調べた結果、凝集素価の保存安定性は温度には依存しないことが判明した。
【００４８】
【表７】
【００４９】
上記表７に示される、加熱に対する安定性について調べた結果、加熱に対しては５５℃近くまでは高凝集素価（２５６倍）を維持できることが判明した。
【００５０】
【表８】
【００５１】
上記表８に示される各血液型血痕に対する解離試験結果から次のことが分かる。Ａ型の血痕は抗Ａ抗体と抗Ｈ抗体で血液型の判定が可能であり、Ｂ型の血痕は抗Ｂ抗体で血液型の判定が可能であるが、Ｏ型の血痕については、従来のハリエニシダ種子抽出抗Ｈレクチンでは、凝集反応が見られず、血痕から血液型を判定する方法がなかった。しかし、この発明のゴーヤ種子由来レクチンでは、明らかに力価及び赤血球の凝集反応の面で従来品より高い反応性を示し、優れていることが判明した。
【００５２】
【表９】
【００５３】
上記表９に示される比較からこの発明のゴーヤ種子由来抗Ｈレクチンは従来のハリエニシダ種子由来の抗Ｈレクチンに比べて凝集素価が高いことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ユーレックス抗Ｈレクチン及びこの発明のゴーヤ種子抽出レクチンを用いた赤血球凝集反応を示す図であり、（ａ）は、この発明によるゴーヤ種子抽出レクチンを用いた時のＯ型血球の凝集反応を、（ｂ）は、ユーレックス抗Ｈレクチンを用いた時のＯ型血球の凝集反応を、（ｃ）は、この発明によるゴーヤ種子抽出レクチンを用いた時のＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ型血球の凝集反応を、（ｄ）は、ユーレックス抗Ｈレクチンを用いた時のＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ型血球の凝集反応をそれぞれ示す。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤に関し、特に赤血球膜表面のＨ抗原に対して特異的な凝集力を持ち、血痕の正確且つ迅速な血液型判定を行うことを特徴とする血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、植物から抽出されたレクチンとしては、例えば、抗Ａ１レクチン（ヒマラヤフジマメ由来）、抗Ｈレクチン（ハリエニシダ由来）等が挙げられる。例えば、ヨーロッパハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）から抽出された抗Ｈレクチンは、Ｈ抗原の判定に用いられている。これまでの抗Ｈレクチンよりも活性を高めたタイプの抗Ｈレクチン−ストロングは微量の体液や毛髪の血液型判定（解離試験）に適している。また、抗Ｈレクチン−ストロングは従来の抗Ｈレクチンよりも４倍以上の凝集力価を有していることから、少量のサンプル（試料）からでもＨ抗原の判定が可能である（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。
【０００３】
参考値として下記に凝集力価の比較値を下記に示す。
【０００４】
≪参考値≫
凝集力価（２％人Ｏ型赤血球凝集力価ＰＢＳでの連続希釈法により測定）
・抗Ｈレクチン ２6（６４倍）
・抗Ｈレクチン−ストロング ２8（２５６倍）
【０００５】
また、血液型判定に用いられる、動物から抽出されたレクチンとしては、ドジョウ、特にその卵から抽出され、かつ分子量が１５，０００〜５０，０００の範囲にあるレクチンが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【非特許文献１】日本臨床衛生検査技術会ライブラリーＸＩＩ輸血検査の実際、改訂第１版、「日臨技輸血検査標準法」改訂委員会著、（社）日本臨床衛生検査技術会１９９６年１７１項
【非特許文献２】生化学工業株式会社Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ研究用試薬情報ＰＲＯＤＵＣＴ ＲＥＰＯＲＴ Ｎｏ．１０５
【特許文献１】特開平１１−０８３８６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記従来の技術では、以下のような欠点があった。
【０００７】
（１）以上述べたヨーロッパハリエニシダから抽出した抗Ｈレクチンは、血痕に対する血液型判定（解離試験）でＨ抗原を検出することが困難であった。
（２）従来の抗Ｈレクチンを用いた血液型判定用溶剤は原材料の入手が困難かつ使用量が多く、コストの面での問題があった。
（３）これまでのハリエニシダ由来レクチンの力価は使用する原材料（Ｕｌｅｘ ｓｅｅｄ）によって影響され、ロット内で不均一である。
（４）また、ドジョウから抽出されたレクチンは、血液型判定に用いられるものであるが、Ｈ抗原を検出することは困難である。
【０００８】
この発明の目的は、上記従来技術における問題点を解消し、血痕、血液に対しても抗Ｈレクチン血液型判定用溶剤の使用で、正確かつ迅速に血液型判定ができる血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明の発明者らは、上述の問題点を解決すべく鋭意研究の結果、ゴーヤの種子から抽出したレクチンが、従来の植物を由来とする抗Ｈレクチンよりも赤血球膜表面のＨ抗原に対して特異的な凝集力があることを見出し、この知見に基づいてこの発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、この発明の構成は以下の事項からなる。
【００１１】
（１）ゴーヤの種子から抽出され、かつ分子量が１００，０００〜１７０，０００の範囲内にある血液型判定用レクチン。
（２）血液型判定、血痕の解離試験に用いられる前項（１）に記載される血液型判定用レクチン。
（３）ゴーヤの種子から抽出され、かつ分子量が１００，０００〜１７０，０００の範囲内にあるレクチンを含有する血液型判定用溶剤。
【発明の効果】
【００１２】
この発明によれば、血痕、血液に対しても抗Ｈレクチン血液型判定用溶剤の使用で、正確かつ迅速に血液型判定ができる。
【００１３】
（１）請求項１に記載されるように、この発明による血液型判定用レクチンは、ゴーヤの種子という安価な原料から非常に力価の高いレクチンを容易に得ることができる。通常、ゴーヤの種子は果肉を取った後は、廃棄、又は家畜飼料として再利用されている。その点からみれば、原材料のコストはゼロに等しい。また、抽出からレクチン精製にかかるコストは、従来のレクチン製造にかかるコストと同等である。この点で従来の血液型判定用レクチンに比較して、非常に低コストで製造できる利点を有している。
（２）従来の血液型判定用レクチンに比較して、Ｈ抗原に特異的に凝集反応を示す。
（３）従来の血液型判定用レクチンに比較し力価が非常に高いため、血痕に対しても血液型の判定が可能であり、科学捜査等で必要とされる信頼度の高いデータを提供できる。
（４）ゴーヤ由来レクチンは、使用する原材料に影響されず、高力価であるため原材料による影響が少なく、力価はロット内で均一である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、この発明において用いることができる、ゴーヤの種子、レクチンの抽出及び精製技術、分子量範囲、血液型判定、血液型判定用溶剤、ならびに血痕の解離試験等について詳細に説明する。
【００１５】
この発明においてはゴーヤの種類はすべてのものを用いることができ、すべてのゴーヤでレクチンは抽出可能である。また、用いられるゴーヤの種子の生育状況は完熟、未熟のどちらでもよい。完熟の方が力価が高いが、求められる血液型判定の効果はどちらでも充分に得られる。
【００１６】
この発明では、レクチンの分子量の測定は、周知のＳＤＳ存在下（変性条件下）でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のうち、濃縮ゲルを用いる不連続ゲル電気泳動（Laemmli法）による方法を用いて行う。
【００１７】
また、レクチンの分子量を１００，０００〜１７０，０００とする根拠は、血液を凝固することができる分子量の範囲である。
【００１８】
分子量が、１００，０００未満である場合、ならびに分子量が、１７０，０００を超える場合には、血液を凝固しにくく、好ましくない。
【００１９】
次に、レクチンを抽出するための操作について説明する。
【００２０】
ゴーヤとしてはゴーヤ乾燥種子を使用する。種子は未熟でも、完熟でもどちらでもよいが、但し乾燥させる。以下にその手順を示す。
【００２１】
１．ゴーヤ乾燥種子１０ｇをコーヒーミルで粉砕し、微粉末にする。
２．種子乾燥重量１０ｇの１０倍量（１００ｍｌ）の蒸留水を加え、スターラーで３時間攪拌抽出する。
３．さらし布で絞ってろ過し、ろ液を採る（８０ｍｌ程度）。
４．遠心分離機で回転数５０００ｒｐｍで、１０分間液体部分を遠心分離する。
５．上清を回収し、最初に加えた蒸留水の１．５倍量（１５０ｍｌ）のエタノールを加えて攪拌し、１時間放置する。
６．上清を捨て、沈殿物を回収し、遠心分離機にかける（回転数５０００ｒｐｍで１０分間。）。
７．上清を捨て、沈殿物を蒸発皿に広げ、乾燥させる。
８．乾燥したものを回収し乳鉢ですりつぶし、粉末にしたもの（約０．３ｇ）にゼラチン入り生理食塩水５〜１０ｍｌを加え溶かす。
９．遠心分離機にかける（回転数５０００ｒｐｍで１０分間。）。
１０．上清を回収し、抗Ｈレクチンとして用いる。
１１．凝集素価を測定する。凝集素価の測定方法を以下に示す。
【００２２】
《測定方法》
（１）生理食塩水で血清を２倍連続希釈し、各試験管に０．２５ｍｌずつ残るようにする。
（２）抗Ｈレクチンに対応するＯ型赤血球を生理食塩水で３回洗い、２％の生理食塩水浮遊液をつくり、希釈した血清に２％赤血球浮遊液０．２５ｍｌを加え試験管を振ってよく混合する。
（３）回転数１０００ｒｐｍで１分間遠心分離機にかける。
（４）試験管を静かに振って凝集を確認する。
（５）凝集の強さを＋＋＋〜＋に分け、＋の凝集を示した試験管の最高希釈倍数を持って、その血清の凝集素価とする。
【００２３】
凝集の強さの判定は「各血液型血球に対する凝集素価」（後掲する表４参照）による。
例えば、ゴーヤ種子由来抗ＨレクチンによるＯ型血球の測定値は、ホールグラス法（室温で３０分放置後、判定）で２8（２５６）倍であり、試験管法（回転数１０００ｒｐｍで１分間遠心後、判定）で２9（５１２倍）である。
【００２４】
なお、上述した測定方法については、「法医血清学的検査法マニュアル」９０ページ、表３-１２（金原出版）に準拠した。
【００２５】
次に、この発明において用いられる解離試験・判定方法について説明する。
【００２６】
《解離試験》
血痕が金属、岩石、プラスチックおよび合成繊維などの付着している場合、切り取ることのできない場合、または粉末状ないし凝塊状になっている場合には、蒸留水で湿らせた木綿糸や小ガーゼ片に擦って付着させるか、少量の糸片と溶解後、糸などに付着させてから乾燥させたものを検査試料として、「法医血清学的検査法マニュアル」１８１ページ、図４-２２（金原出版）に示す下記操作方法に従って実施する。手技が複雑でなく検出感度も優れていることから、犯罪捜査の分野で最もよく利用されている方法である。使用する装置、試薬としては、高温槽（ＡＤＶＥＮＴＥＣ製 ＬＴ−４８０ ＣＯＮＳＴＡＮＴ ＴＥＭＰＡＲＡＴＵＲＥ ＢＡＴＨ）、試験管、ホールグラス、抗Ａ血清、抗Ｂ血清、抗Ｈレクチン、スピレーター、指示血球などである。
【００２７】
《操作方法》
（１）資料の血痕付着部位、および対象部位から長さ約１．５ｃｍの片を切り取り、３等分する。
（２）試料名（血痕、対照）と、加える凝集素名（抗Ｈ、抗Ａ、抗Ｂ）とを記入した小試験管に３等分した片各１個ずつ入れる。
（３）抗Ｈ、抗Ａ、抗Ｂの凝集素を対応する試験管に０．１ｍｌずつ加える。ここで抗Ｈレクチンを用いる。
（４）凝集素を充分に吸着させる。
（５）吸着後、冷生理食塩水を全試験管一杯に注ぐ。次いで、試料を残して、反応しなかった抗体を含んだ生理食塩水を捨てる。
（６）生理食塩水を吸い取った試験管を３組に分けて、それぞれの組にＯ型、Ａ型、Ｂ型の０．２％赤血球浮遊液を滴下した後、５６℃、１０分間加温する（解離）。
（７）試験管を回転数１，０００ｒｐｍで１分間遠心分離にかける。
【００２８】
《判定方法》
判定方法については、「法医血清学的検査法マニュアル」１８１ページ、図４-２２「８」（金原出版）に示す下記判定方法に従って実施する。
【００２９】
上述の解離試験において、遠心分離した試験管を静かに振ってから、判定表に従って判定する。ここでハリエニシダ由来抗Ｈレクチンは凝集反応はないが、この発明のゴーヤ種子由来抗Ｈレクチンは凝集反応があることを判定する。
【００３０】
また、この発明の血液型判定用レクチンは、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ（ゴーヤ、にがうり、ツルレイシ、苦瓜、ＢＡＬＳＡＭ ＰＥＡＲ）の種子から抽出された赤血球凝集タンパク質であることからＨ抗原の存在しないＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ血球を用いた赤血球凝集反応においても図１に示すように、凝集反応が認められず、この発明のレクチンが抗Ｈレクチンであることが示唆された。図１（ａ）はこの発明によるゴーヤ種子抽出レクチンを用いた時のＯ型血球の凝集反応を示す図である。図１（ｂ）はユーレックス抗Ｈレクチンを用いた時のＯ型血球の凝集反応を示す図である。図１（ｃ）はこの発明によるゴーヤ種子抽出レクチンを用いた時のＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ型血球の凝集反応結果であり、血球凝集反応は認められない。図１（ｄ）はユーレックス抗Ｈレクチンを用いた時のＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ型血球の凝集反応結果であり、同様に血球凝集反応は認められない。
【００３１】
以下、この発明のゴーヤの種子から抽出された血液型判定用レクチン及び血液型判定用溶剤の最良の実施の形態について、実施例を用いて具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではないことは勿論のことである。
【実施例】
【００３２】
なお、下記実施例１、２において用いられたゴーヤの入手先は、ＪＡ宮崎農協果汁（宮崎県川南町）、イシハラフーズ（株）（宮崎県都城市）である。
【００３３】
（実施例１）
この発明に係るレクチンの抽出について説明する。
(1)ゴーヤの種子を１００ｇ用い、コーヒーミルのような粉砕器で粉砕し微粉末状態にする。
(2)次に、該微粉末を容器の中に入れ、１リットルの蒸留水を加えスターラーで攪拌する。
(3)その後、約１２時間以上放置しゴーヤの種子成分を抽出して抽出液を得る。
(4)さらし布で、上記抽出液をろ過し、ろ液を採取する。
(5)さらに、遠心分離器で回転数３０００ｒｐｍ、回転時間３０分間で、液体部分を遠心分離する。
(6)遠心分離後、上澄み液を採取し、約２リットルのエタノールを加え攪拌し、４℃の環境下で、約１２時間インキュベートする。こうして粗抗Ｈレクチンが抽出される。得られた粗抗Ｈレクチンにはレクチンと他のタンパク、糖分が含まれているが、求められる力価は粗抗Ｈレクチンにも十分にある。
【００３４】
次に、前記工程で得られた粗抗Ｈレクチンの精製について説明する。
(1)上記抽出液の上澄み液をアスプレーターで吸引除去し、沈殿物を採取する。
(2)さらに、遠心分離器を用い、回転数３０００ｒｐｍ、回転時間３０分間で、液体部分を遠心分離する。
(3)沈殿物を広口の容器に広げて乾燥させて乾燥物を得る。
(4)次に、ゼラチン入り生理食塩水１００ｍｌ中に上記乾燥物を溶かす。
(5)遠心分離器を用い、回転数３０００ｒｐｍ、回転時間３０分間で、液体部分を遠心分離し、該液体部分の上澄み液を採取する。
【００３５】
以上の工程を経て精製された抗Ｈレクチンが得られる。得られた精製された抗Ｈレクチンの分子量は、上述したＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定で約１２０，０００である。得られた精製された抗Ｈレクチンは余分のタンパク、糖分が除かれ、レクチンの純度が高く、力価も高くなっている。
【００３６】
（実施例２）
上記実施例１により抽出されたレクチンを用いた血液型判定用溶剤により、ゴーヤ抗Ｈレクチンによる血液型のおもて試験、ゴーヤ抗Ｈレクチンによる血痕のＡＢＯ式血液型試験の解離試験、及びゴーヤ抗Ｈレクチンによる血痕のＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ式血液型試験の解離試験を、上述した解離試験法により行った。
【００３７】
この際用いたレクチン量は５０μｌであり、それぞれの試験結果を、下記表１〜表３に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
上記表１〜表３から分かるように、この発明のゴーヤ種子由来抗Ｈレクチンを用いた血液型判定用溶剤は、従来のハリエニシダ種子抽出抗Ｈレクチンでは判定不能である血痕に対し、明らかに力価及び赤血球凝集反応の面で従来品よりも高い反応性を示し、優れていることが判明した。
【００４２】
また、この発明の血液型判定用レクチンの検定成績を下記表４〜表８に示す。
【００４３】
【表４】
【００４４】
【表５】
【００４５】
上記表５に示される凝集力の試験結果から次のことが分かる。従来のハリエニシダ種子抽出抗Ｈレクチンでは、凝集反応時間が２分〜１５分掛かっているのに対し、この発明のゴーヤ種子由来レクチンは凝集反応に要する時間が数十秒と反応性がよい。また、１００万人に１人の血液型といわれるＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ型については、Ｈ抗原の存在しない血液型であることから、凝集反応は認められず、この発明のゴーヤ種子由来レクチンが抗Ｈレクチンであることがいえる。
【００４６】
【表６】
【００４７】
上記表６に示される、３ヶ月間保存したときの保存温度依存について調べた結果、凝集素価の保存安定性は温度には依存しないことが判明した。
【００４８】
【表７】
【００４９】
上記表７に示される、加熱に対する安定性について調べた結果、加熱に対しては５５℃近くまでは高凝集素価（２５６倍）を維持できることが判明した。
【００５０】
【表８】
【００５１】
上記表８に示される各血液型血痕に対する解離試験結果から次のことが分かる。Ａ型の血痕は抗Ａ抗体と抗Ｈ抗体で血液型の判定が可能であり、Ｂ型の血痕は抗Ｂ抗体で血液型の判定が可能であるが、Ｏ型の血痕については、従来のハリエニシダ種子抽出抗Ｈレクチンでは、凝集反応が見られず、血痕から血液型を判定する方法がなかった。しかし、この発明のゴーヤ種子由来レクチンでは、明らかに力価及び赤血球の凝集反応の面で従来品より高い反応性を示し、優れていることが判明した。
【００５２】
【表９】
【００５３】
上記表９に示される比較からこの発明のゴーヤ種子由来抗Ｈレクチンは従来のハリエニシダ種子由来の抗Ｈレクチンに比べて凝集素価が高いことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ユーレックス抗Ｈレクチン及びこの発明のゴーヤ種子抽出レクチンを用いた赤血球凝集反応を示す図であり、（ａ）は、この発明によるゴーヤ種子抽出レクチンを用いた時のＯ型血球の凝集反応を、（ｂ）は、ユーレックス抗Ｈレクチンを用いた時のＯ型血球の凝集反応を、（ｃ）は、この発明によるゴーヤ種子抽出レクチンを用いた時のＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ型血球の凝集反応を、（ｄ）は、ユーレックス抗Ｈレクチンを用いた時のＰａｒａ−Ｂｏｍｂｅｙ型血球の凝集反応をそれぞれ示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴーヤの種子から抽出され、かつ分子量が１００，０００〜１７０，０００の範囲内にあることを特徴とする血液型判定用レクチン。
【請求項２】
血液型判定、血痕の解離試験に用いられることを特徴とする請求項１に記載される血液型判定用レクチン。
【請求項３】
ゴーヤの種子から抽出され、かつ分子量が１００，０００〜１７０，０００の範囲内にあるレクチンを含有することを特徴とする血液型判定用溶剤。
【請求項１】
ゴーヤの種子から抽出され、かつ分子量が１００，０００〜１７０，０００の範囲内にあることを特徴とする血液型判定用レクチン。
【請求項２】
血液型判定、血痕の解離試験に用いられることを特徴とする請求項１に記載される血液型判定用レクチン。
【請求項３】
ゴーヤの種子から抽出され、かつ分子量が１００，０００〜１７０，０００の範囲内にあるレクチンを含有することを特徴とする血液型判定用溶剤。
【図１】
【公開番号】特開２００６−１２６０２５（Ｐ２００６−１２６０２５Ａ）
【公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３１５３６６（Ｐ２００４−３１５３６６）
【出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【出願人】（００００００２９５）沖電気工業株式会社 (6,645)
【出願人】（３９０００８８５５）宮崎沖電気株式会社 (151)
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【出願人】（００００００２９５）沖電気工業株式会社 (6,645)
【出願人】（３９０００８８５５）宮崎沖電気株式会社 (151)
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【Ｆターム（参考）】
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