血液脳関門インヴィトロ・モデル、病態血液脳関門インヴィトロ・モデル、及びこれを用いた薬物スクリーニング方法、病態血液脳関門機能解析方法、病因解析方法
【課題】血液脳関門を通過して中枢に作用する薬物、あるいは血液脳関門自体に作用する薬物、あるいは中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行する薬物のスクリーニング系を提供することである。また、本発明の他の目的は、このスクリーニング系に様々な病態環境を負荷することで病態下における病因解析研究や上記スクリーニングを可能とすることである。
【解決手段】培養液と、当該培養液を保持するプレートと、当該培養液に浸漬し、かつ、当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、からなる立体培養装置を用い、当該フィルターが直径０．３５〜０．４５μｍの穴を多数有し、当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイトを播き、当該プレートの内面に初代培養アストロサイトを播き、通常の培養液で共培養してなる、血液脳関門インヴィトロ・モデルである。
【解決手段】培養液と、当該培養液を保持するプレートと、当該培養液に浸漬し、かつ、当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、からなる立体培養装置を用い、当該フィルターが直径０．３５〜０．４５μｍの穴を多数有し、当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイトを播き、当該プレートの内面に初代培養アストロサイトを播き、通常の培養液で共培養してなる、血液脳関門インヴィトロ・モデルである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液脳関門（ｂｌｏｏｄ―ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）
（一般に、「ＢＢＢ」と略して呼ばれている。）ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル及び病態血液脳関門インヴィトロ・モデルに関する。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」あるいは「インヴィトロ」とは、「ガラス容器の中で」という意味のラテン語で、生物学用語としては種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」摘出・遊離されている状態をさす。（岩波 生物学辞典、 岩波書店、 １９９８年１１月１０日、参照）
すなわち、血液脳関門を通過して中枢に作用する薬物、あるいは血液脳関門自体に作用する薬物、あるいは中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行する薬物のスクリーニング系に関する。
【０００２】
また、本発明は、血液脳関門インヴィトロ・モデル及び病態血液脳関門インヴィトロ・モデルを用いた薬物スクリーニング方法に関する。すなわち、本発明の血液脳関門インヴィトロ・モデルあるいはスクリーニング系に様々な病態環境を負荷することで病態下における病因解析研究や上記スクリーニングを可能とする。
【背景技術】
【０００３】
血液脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）は、繊細な神経細胞が生きる、脳という特異な環境における神経細胞の生存と活動のために進化した環境整備機構である。血液から中枢神経系への物質の侵入の遮断（関門）と取り込み（輸送）という二律背反を、その構成単位である脳毛細血管内皮細胞、アストロサイト（星状膠細胞）およびペリサイト（周皮細胞）の３種類の細胞が機能的に一体となって克服した高度機能分化システムということができる。ＢＢＢの関門機能は脳毛細血管内皮細胞の細胞間接着構造であるタイトジャンクション（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ， 密着結合）に代表され、選択的な取り込み（輸送）機構は神経細胞のエネルギー源であるＤ―グルコースの１型グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ１）が代表的である。関門機能と輸送機構はまた相互に密接に関連し合っていて、例えば構造的に一群の輸送分子群（ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）の一員であるＰ―糖タンパク（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）はくみ出しポンプとして関門機能を担っているし、タイトジャンクションも陰イオンよりも陽イオンに選択的な低分子輸送を担っている（細胞間隙輸送ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙ）。タイトジャンクションが密に存在すること、選択的な取り込みを担う担体（トランスポーター）やイオンチャネルなど経細胞性輸送（ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙ）を担う輸送分子が管腔側（ａｐｉｃａｌ 膜脂質）と基底膜側細胞膜（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ 膜脂質）において非対称的に分布すること（極性）が、ＢＢＢの機能的本態である。
【０００４】
この特異なＢＢＢ機能により、神経細胞の恒常性は保たれているが、その存在のために、疾病などの原因で人工的に生体に何らかの処理を施こそうとする場合に大きな障害となっている。開発が急がれている中枢神経性疾患（認知症、アルツハイマー病、プリオン病、脳卒中など）の予防薬・治療薬開発の大きな障壁となっており、試験管内や細胞培養実験で作用が発見された薬物候補化合物であっても、実験動物など生体に投与すると、その多くはＢＢＢのために脳内に移行できず、実際の治療薬になり得ず、開発を断念せざるを得なくなっている。
【０００５】
一方、多剤併用療法が主流になった現在、ほとんど脳内に移行しないと考えられる薬物が、薬物相互作用により脳内に移行し、中枢性の副作用の原因になることも予想される。
【０００６】
以上のように、薬物のＢＢＢ透過性の予測は非常に重要であるが、ＢＢＢの特異な機能のために、脳内への移行性には一定の法則性が無く、薬物の化学構造や分子量などから予め判断できない。薬物の脳内移行性を動物実験で検討するには、膨大な手間と費用がかかるだけでなく、複雑な生体内で薬物の移行性だけを正確に判断する事は困難である。また、動物実験で使用する薬物量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏに比べ多くの量が必要になり、リード化合物の段階で動物実験に耐えうる化合物量を確保することは、更なる時間と費用が必要になり現実的ではない。よって、脳内で作用する薬物の新規開発、および適正な薬物治療のためには、我々生体の複雑なＢＢＢと、近似的な機能を持つ試験管内再現システムを用いて薬物の透過性を予測することが必要である。脳内移行性を簡便に検定する検査キットがあれば、現在、膨大な費用と時間をかけて行われている創薬研究の効率化が図られ、より即応的で確実な創薬のスクリーニングシステムが達成できる。
【０００７】
更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルには大きな利点がある。その培養条件を最適化することにより、病態を容易に再現できることである。中枢神経を取り巻き、恒常性を守る脳毛細血管内皮細胞は、様々な中枢神経性疾患と関係があり、ＢＢＢの機能障害が、発症あるいは病態進行に密接に関与する疾患が最近次々に明らかにされている。例えば、血液脳関門（ｂｌｏｏｄ―ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ、 ＢＢＢ）は、脳浮腫発症の責任部位であり、タイトジャンクションの離開によって血漿タンパクが脳内への漏出し、Ｎａ+、グルタミン酸などの輸送体や水チャネルのアクアポリンなどの機能障害による水と電解質の貯留が生じ病態を進展させる(血管原生脳浮腫)。病態でのＢＢＢ機能の解析には、これまで述べてきた薬物脳内移行性スクリーニングと同様に、複雑な生体内のＢＢＢを再現したｉｎ ｖｉｔｒｏのＢＢＢモデルが力を発揮する。即ちｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルの培養環境を変化させることにより、容易に病態環境を再現でき、病因解析研究に応用できる。
【０００８】
また、病態下におけるＢＢＢ薬物透過性は変化していると考えられ、病態時における薬物透過性を判定することも重要である。
【０００９】
血液脳関門の解剖学的な実体は密着結合した脳毛細血管内皮細胞であるが、その機能と維持にはアストロサイトやペリサイトが密接に関与していることが明らかとなった。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて脳毛細血管内皮細胞とアストロサイトを共培養すると、脳毛細血管内皮細胞に特異的な酵素であるａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ活性、γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ活性の上昇 、膜抵抗の上昇 、ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎの増強 、Ｐ糖蛋白質の発現 （Ｓｏｂｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７；Ｓｔａｎｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｆｅｎａｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、などの血液脳関門機能に特異的な機能が増強するとの報告がありアストロサイトの重要性を示している。一方で、ペリサイトの血液脳関門に果たす役割は不明な点が多いが、近年になりペリサイトがＢＢＢにおいて重要な役割をしている事が報告されている。
【００１０】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて血管内皮細胞とペリサイトを共培養すると、膜抵抗が増強する（Ｄｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）との報告は、ペリサイトが血液脳関門の維持機構を構成する素子としての重要性を示すものである。即ち、高度機能分化システムであるＢＢＢは、内皮細胞単独では形成できず、内皮細胞、アストロサイト、ペリサイトの３種細胞のクロストークにより初めて構成され得ると考えられ、これら３種細胞を考慮したモデルが必要である。しかし、これまでのＢＢＢ ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、内皮細胞単層培養系や、内皮細胞とアストロサイトとの共培養系などの不完全なモデルしか報告されていない。
【００１１】
最近の研究成果により、ＢＢＢの機能分子であるタイトジャンクション構成タンパク質群が明らかになった。血管内皮細胞管腔側（ａｐｉｃａｌ 膜脂質）に局在し関門機能の本態である。その中でも、クローディン（ｃｌａｕｄｉｎ、 Ｆｕｒｕｓｅら）、オクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ、Ｆｕｒｕｓｅら）、およびＺＯ（ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）−１などが、関門機能の主要なタンパク質である事が判明した。ＢＢＢタイトジャンクションは、末梢組織（脳毛細血管内）と中枢神経系（脳実質内）という異空間を隔てる関門であるが、異なる環境にそれぞれ面した脳毛細血管内皮細胞の管腔側膜（ａｐｉｃａｌ膜脂質）と基底膜側細胞膜（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ膜脂質）の境界に位置していて輸送体などの機能分子の非対称的な配列に寄与している（極性、タイトジャンクションのフェンス機能）。また関門であると同時に、陽イオン性物質に選択性のある低分子物質の細胞間隙輸送（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）を担う機能分子単位でもある。事実、細胞内でのシグナル伝達分子との結合を介在する新しいＰＤＺタンパクであるＭＵＰＰ１（ｍｕｌｔｉ―ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）が発見され、タイトジャンクションは従来考えられていたような静的な固定的な関門では無く、細胞内情報伝達機構という動的・機動的な機能分子であることが明らかにされつつある。即ち、ＢＢＢ ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて、タイトジャンクション機能が保たれていることは、必要不可欠であるが、これまで、その利便性より用いられてきた不死化脳毛細血管内皮細胞株は、このタイトジャンクション機能が保たれているか疑問がもたれる。また、関門機能だけではなく、細胞極性の不保持、薬物への細胞応答などが不十分であると考えられる。事実、ラット不死化脳毛細血管内皮細胞を用いた検討によると、タイトジャンクションタンパク質が、細胞−細胞間に集積しておらず、電気抵抗値も非常に低い事が分かった。よって、不死化脳毛細血管内皮細胞を用いた血液脳関門モデルは不完全なモデルであり正常なＢＢＢを反映していない。
【００１２】
また一方で、内皮細胞のタイトジャンクション機能を維持するために、その亢進因子として知られるｃＡＭＰを細胞培養液に添加するモデルが報告されているが、生理的なモデルと言い難く、特にｃＡＭＰを変動させる薬物のスクリーニングにおいて、問題があると考えられる。
【００１３】
また、中枢神経を取り巻き、恒常性を守る脳毛細血管内皮細胞は、様々な中枢神経性疾患と関係があり、ＢＢＢの機能障害が、発症あるいは病態進行に密接に関与する疾患が最近次々に明らかにされている。ここでも重要となるのが、生体の血液脳関門は、脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトにより構成されていて、様々な病態下ではそれぞれの細胞が様々な影響を及ぼし合っていることである。内皮細胞単独、あるいは内皮細胞とアストロサイトの共培養系など、ＢＢＢ構成細胞がそろっていない不完全なＢＢＢモデルでは、病態時のＢＢＢを十分には再現していないと考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
よって、本発明の１つの目的は、血液脳関門を通過して中枢に作用する薬物、あるいは血液脳関門自体に作用する薬物、あるいは中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行する薬物のスクリーニング系を提供することである。また、本発明の他の目的は、このスクリーニング系に様々な病態環境を負荷することで病態下における病因解析研究や上記スクリーニングを可能とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本出願の発明者は鋭意研究を行い、初代培養脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトを共培養することにより、生体に近似し、高度な密着結合を有する血液脳関門モデルの開発に成功した。
【００１６】
上記目的は、請求項１に記載の本発明に係る血液脳関門インヴィトロ・モデル、すなわち、培養液と、当該培養液を保持するプレートと、当該培養液に浸漬し、かつ、当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、からなる立体培養装置を用い、当該フィルターが直径０．３５〜０．４５μｍの穴を多数有し、当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイトを播き、当該プレートの内面に初代培養アストロサイトを播き、通常の培養液で共培養してなる血液脳関門インヴィトロ・モデルによって、達成される。
【００１７】
また、上記目的は、請求項２に記載の本発明に係る病態血液脳関門インヴィトロ・モデル、すなわち、培養液と、当該培養液を保持するプレートと、当該培養液に浸漬し、かつ、当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、からなる立体培養装置を用い、当該フィルターが直径０．３５〜０．４５μｍの穴を多数有し、当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイトを播き、当該プレートの内面に初代培養アストロサイトを播き、所定の病態条件に対応する培養液で共培養してなる、病態血液脳関門インヴィトロ・モデルによって、も達成される。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様においては、請求項３に記載のように、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルを用い、フィルターの上方部に薬物を添加し、一定時間後に、当該フィルターの下方部に漏れ出た、当該薬物の量を測定して行う、薬物の血液脳関門通過容易性評価方法を開示している。
【００１９】
本発明の他の好ましい実施態様においては、請求項４に記載のように、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルを用い、フィルターの上方部に薬物を添加し、一定時間後に、脳毛細血管内皮細胞を採取し、当該薬物添加後の脳毛細血管内皮細胞の性質を評価し、添加前の脳毛細血管内皮細胞の性質と比較して行う、薬物のスクリーニング評価方法を開示している。
【００２０】
本発明のさらに他の好ましい実施態様においては、請求項５に記載のように、請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門の病態解析方法を開示している。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施態様においては、請求項６に記載のように、請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門における薬物の反応性評価方法を開示している。
【００２２】
本発明のさらに別の好ましい実施態様においては、請求項７に記載のように、請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門における薬物の脳移行性評価方法を開示している。
【００２３】
（作用）
請求項１に記載の本発明においては、多孔質のフィルター上に脳毛細血管内皮細胞を播き、フィルター裏側にペリサイトを播き、フィルターの受け皿であるプレートの内側にアストロサイトを播くことで、３種細胞間のクロストークが可能となり、生体に近似した血液脳関門ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが完成した。
【００２４】
また、請求項２に記載の本発明においては、上記血液脳関門インビトロ・モデルに様々な病態環境を負荷することにより病態血液脳関門インビトロモデルを得た。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は生体に最も近似したｉｎ ｖｉｔｒｏのＢＢＢモデルであるから、現在開発が急がれている中枢神経作用薬の開発（血液脳関門を通過して中枢に作用する薬物）が効率的に行えるようになる。
【００２６】
また、本発明は中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行する薬物のスクリーニング系であるため、適切な薬物療法の開発や新薬の開発に貢献できる。また、血液脳関門自体に作用する薬物のスクリーニングに有用である。
【００２７】
さらには、本発明はこのスクリーニング系に様々な病態環境を負荷したものであるため、病態下における病因解析研究や上記スクリーニングが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
初代培養脳毛細血管内皮細胞と、初代培養脳ペリサイト、初代培養アストロサイトを、多孔質のフィルターを含有する立体培養装置で、共培養することにより本発明の血液脳関門インヴィトロ・モデルが得られる。本発明の血液脳関門インヴィトロ・モデルは高度にタイトジャンクションが発達しており、より生体に近似した血液脳関門の再構成系となっている。
【００２９】
図１１は本発明に係る血液脳関門インヴィトロ・モデルの実施形態の概略図である。容器３の中に培養液４を収容し、フィルター２を吊るすハンガー１によって、フィルター２を培養液４の中の所定の位置に浸漬させている。直径０．４μｍの穴２ａを多数持つフィルター２の上部は血管腔側１０として想定され、その下部は脳実質側２０として想定されている。即ち、フィルター２の表面に初代培養脳毛細血管内皮細胞Ｅを播き、フィルター２の裏側に初代培養脳ペリサイトＰを播き、更にそのフィルター２の下方に初代培養アストロサイトＡを播く事で、生体での血液脳関門を最も良く再現した構造であると考えられる。また、フィルター２の多孔性により、３種の細胞間のクロストークが可能であり、複雑な生体での血液脳関門の維持・調節機構をも再現する事が可能となっている。
【００３０】
３種細胞共培養により、ＢＢＢの特徴である、高度に発達したタイトジャンクションが内皮細胞に誘導されており、薬物のスクリーニング等に耐えうる血液脳関門再構成系が提供される。この血液脳関門再構成系を用いる事で、脳内での作用を期待する薬物、あるいは中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行する薬が、血液脳関門を通過できるかを容易に判断する事ができる。即ち、血管腔側１０である、フィルター２の上部に当該薬物を添加し、一定時間後に、フィルター２の下部に漏れ出た薬物量を測定する事で判断できる。また、同様にこの血液脳関門再構成系を用いる事で、血液脳関門自体に作用する薬物のスクリーニングが容易に行う事ができる。即ち、血管腔側１０である、フィルター２の上部に当該薬物を添加し、一定時間後に、脳毛細血管内皮細胞Ｅの性質を添加前後で比較する事で、判断できる。
【００３１】
更には、ＢＢＢキットの培養条件を変化させることで容易に病態ＢＢＢキットが作製できる。即ち、ＢＢＢキットの培養液４を実際の病態条件に変えることにより病態ＢＢＢキットを作製し、この病態ＢＢＢキットにおける、脳毛細血管内皮細胞Ｅ、ペリサイトＰ、アストロサイトＡの変化を通常の培養液で培養したそれらと比較することにより、ＢＢＢの病態解析ならびに病態下における薬物の反応性、脳移行性が判断できる。
【実施例１】
【００３２】
（脳毛細血管片の単離）
クリーンベンチ内で３週齢のラットの脳を摘出し、氷冷したＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ（―／―）（ＰＢＳ（―／―）；Ｓｉｇｍａ）中に入れ、滅菌した濾紙上で、硬膜、小脳、間脳、脳幹などを取り除き大脳皮質だけにした。この大脳皮質を氷冷したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ社製）３ｍＬに入れ約１ｍｍ3大の大きさにメスで細断した。更に酵素（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ―ｃｌａｓｓ２（１ｍｇ／ｍｌ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）、３００μＬ ＤＮａｓｅ（１５μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製））を含む１５ｍＬのＤＭＥＭを加え、５ｍＬピペットで２５回ｕｐ−ｄｏｗｎし懸濁した。９０分間３７℃で振盪・インキュベートした後、１０ｍＬのＤＭＥＭを加え、遠心した。遠心後の沈殿ペレットを２０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）／ＤＭＥＭ で遠心分離し、下層のペレットに酵素（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ／ｄｉｓｐａｓｅ（１ｍｇ／ｍＬ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社製））、ＤＮａｓｅ（６．７μｇ／ｍＬ） を含む１５ｍＬ ＤＭＥＭで 懸濁し、６０分３７℃で振盪・インキュベートした。その後１０ｍＬのＤＭＥＭを加え遠心し、下層のペレットをあらかじめ ３０００ｇで１時間遠心したパーコール（３３％；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に重層させ遠心分離した。内皮層をシリンジで取り、２回ＤＭＥＭで洗浄し脳毛細血管片を得た。得られた脳毛細血管片には、ｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ； Ｓｉｇｍａ社製）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製）でコーティングしたディッシュに分離した脳毛細血管片を播種した。３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下で２０％ Ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｅｒｕｍ（ＰＤＳ）−ＤＭＥＭ／Ｆ１２ にｂＦＧＦ（１ｍｇ／ｍＬ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社製）、ｈｅｐａｒｉｎ（１００μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製）、ｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製）、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（４μｇ／ｍＬ； Ｓｉｇｍａ社製）を加えた培養液（ＲＢＥＣ 培養液１）で、脳毛細血管内皮細胞を２日間培養した。３日目にｐｕｒｏｍｙｃｉｎを加えない培養液（２０％ ＰＤＳ―ＤＭＥＭ／Ｆ１２にｂＦＧＦ（１ｍｇ／ｍＬ）、 ｈｅｐａｒｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）、ｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養液；ＲＢＥＣ培養液２）に置換し８０％コンフルエントになるまで培養した。
【実施例２】
【００３３】
（脳毛細血管周皮細胞：ペリサイト）
実施例１の脳毛細血管片には数パーセントペリサイトが含まれている。そこで、コラーゲンコーティングしたディッシュに、脳毛細血管片を播き、３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）−ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養液にて１週間培養し、ペリサイトを増殖させた。この段階では、脳毛細血管内皮細胞とペリサイトは混在している状態である。次に、１×トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）で細胞を剥ぎ、コーティングなしのディッシュに播き直しペリサイトを単離した（内皮細胞は接着できず、ペリサイトだけが増殖する）。
【実施例３】
【００３４】
（アストロサイト）
クリーンベンチ内で、生後１、２日齢のラットから脳を取り出し、氷冷したＰＢＳ（―／―）中にいれ、滅菌した濾紙上で、硬膜、小脳、間脳、脳幹などを取り除き大脳皮質だけにした。この大脳皮質５０ｍＬのチューブに入れ、氷冷したＤＭＥＭ１０ｍＬを加えた。２０Ｇのシリンジでゆっくりｕｐ−ｄｏｗｎし組織をバラバラにした。しばらく静置した後、上清５ｍＬを別の５０ｍＬチューブに入れた。残りの細胞懸濁液５ｍＬに更に５ｍＬのＤＭＥＭを加え、２０Ｇのシリンジでｕｐ−ｄｏｗｎした。この操作を細胞塊が肉眼で確認できなくなるまで繰り返し、最後の細胞懸濁液５ｍＬも加えた。その後、細胞懸濁液を７０μｍの登録商標セルストレイナー（Ｆａｌｃｏｎ社製）に通した。遠心し細胞を集め１０％ ＦＢＳ―ＤＭＥＭで再懸濁し、７５ｃｍ2のフラスコに播いた。３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ ＦＢＳ―ＤＭＥＭ
にｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で培養し、細胞がコンフルエントになったら、フラスコを２００ｒｐｍで１時間振盪し、ミクログリアを浮遊させ、取り除いた。１×トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で継代し、新しい７５ｃｍ2のフラスコに播き直し、コンフルエントになったら、もう一度２００ｒｐｍで１時間浸透し、ミクログリアを浮遊させ、取り除き、アストロサイトを得た。
【実施例４】
【００３５】
（共培養作製方法）
図１は種々の共培養作製方法を示す説明図である。実施例１で得られた、脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトを、登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、０．４μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）を用い以下の種々の共培養モデルを作製した。
【００３６】
（i）脳毛細血管内皮細胞Ｅの単層培養系（Ｅ００）
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ インサートのｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ両面をｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のｗｅｌｌに設置した。その後登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に脳毛細血管内皮細胞Ｅ（１．５×１０5 ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％大気下、ＲＢＥＣ培養液２で培養した。
【００３７】
（ii）脳毛細血管内皮細胞ＥとアストロサイトＡが非接触状態の共培養
系（Ｅ０Ａ）
１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートの底面をｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）溶液でコーティングし、アストロサイトＡ（１．０×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳毛細血管内皮細胞Ｅを登録商標Ｔｒａ
ｎｓｗｅｌｌ インサートの内側に播種した。
【００３８】
（iii）脳毛細血管内皮細胞ＥとアストロサイトＡが接触した状態の共培
養系（ＥＡ０）
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ インサートのｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ両面をｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、上下逆にディッシュに設置した。アストロサイトＡ（２．０×１０4ｃｅｌｌ／ｃｍ2）
を播種し、６時間以上培養した。登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートを１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートのｗｅｌｌに設置し、
３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。
翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳毛細血管内皮
細胞Ｅを登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に播種した。
【００３９】
（iv）脳毛細血管内皮細胞ＥとペリサイトＰが非接触状態の共培養系
（Ｅ０Ｐ）
１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートの底面をｃｏｌｌａｇｅｎ 溶液でコーティングし、ペリサイトＰ（１．０×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳
毛細血管内皮細胞Ｅを登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に播種した。
【００４０】
（v）脳毛細血管内皮細胞ＥとペリサイトＰが接触した状態の共培養系
（ＥＰ０）
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートのｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ両面をｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、上下逆にディッシュに設置した。ペリサイト（２．０×１０4ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し、６時間以上培養した。登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートを１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートのｗｅｌｌに設置し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下１０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳毛細血管内皮細胞Ｅを
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に播種した。
【００４１】
（vi）脳毛細血管内皮細胞ＥとペリサイトＰが接触し、アストロサイト
Ａが非接触状態の共培養系（ＥＰＡ）
１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートの底面をｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ溶液でコーティングし、アストロサイトＡ（１．０×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。また、同時に、登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート（０．４μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）のｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ両面をｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、上下逆にディッシュに設置した。ペリサイトＰ（２．０×１０4ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し、6 時間以上培養した。登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ インサートをアストロサイトＡを播種した、１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートのｗｅｌｌに設置し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下１０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳毛細血管内皮細胞Ｅを登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に播種した。
【００４２】
（vii）脳毛細血管内皮細胞ＥとアストロサイトＡが接触し、ペリサイト
Ｐが非接触状態の共培養系 （ＥＡＰ）
１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートの底面をｃｏｌｌａｇｅｎ溶液でコーティングし、ペリサイトＰ（１．０×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下１０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。また、同時に登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ インサート（０．４μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）のｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ両面をｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、上下逆にディッシュに設置した。アストロサイトＡ（２．０×１０4ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し、６時間以上培養した。
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ インサートにアストロサイトＡを播種した、１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートのｗｅｌｌに設置し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下１０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳毛細血管内皮細胞Ｅを
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に播種した。
【実施例５】
【００４３】
（不死化脳毛細血管内皮細胞と初代培養脳毛細血管内皮細胞の比較）
５―１． 初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）の発現（図２）
細胞培養の実施例１で得られたＲＢＥＣならびに実施例４で得られたＧＰ８．３を、８―ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｌｉｄｅ に１×
１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2で播き、３日後、培養液を取り除いて、ＰＢＳ（―／―）で２回洗浄した。洗浄後、３％パラホルムアルデヒドで１０分間室温固定した。その後０．２％ ｔｒｉｔｏｎ―Ｘ溶液で１０分間室温処理した。３％Ｈ2Ｏ2溶液で３分間処理し内因性のペルオキシダーゼ活性を除いた。ＰＢＳ（―／―）で２回洗浄後、３％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）溶液で室温３０分間ブロッキングした。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で洗浄後、1次抗体反応として、ａｎｔｉ−ｖＷＦ（Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃３０分インキュベートした。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で３回洗浄後、２次抗体反応として、ビオチン標識二次抗体で３７℃３０分間インキュベートした。その後、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で３回洗浄後、パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液で室温１０分間反応させた。最後に発色基質としてジアミノベンジジン四塩酸塩を用い、顕微鏡で観察した。図２は初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞とを比較するための顕微鏡観察写真である。ＲＢＥＣならびにＧＰ８．３は共に内皮細胞のマーカーであるｖＷＦ陽性を示した。
【００４４】
５―２． 初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞のタイトジャンクション構成タンパク質の発現（図２）
細胞培養の実施例１で得られたＲＢＥＣならびに実施例４で得られたＧＰ８．３を、８−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｌｉｄｅに１×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2で播き３日間培養した。培養液を取り除いて、ＰＢＳ（―／―）で２回洗浄した。洗浄後、３％パラホルムアルデヒドで１０分間室温固定した。その後０．２％ ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液で１０分間室温処理した。ＰＢＳ（―／―）で２回洗浄後、３％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）溶液で室温３０分間ブロッキングした。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で洗浄後、１次抗体反応として、各タンパク質に特異的な抗体（ａｎｔｉ ｃｌａｕｄｉｎ−１；Ｚｙｍｅｄ， ａｎｔｉ ｃｌａｕｄｉｎ−３；Ｚｙｍｅｄ， ａｎｔｉ ｃｌａｕｄｉｎ−５；Ｚｙｍｅｄ，ａｎｔｉ ｏｃｃｌｕｄｉｎ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ａｎｔｉ ＺＯ−１；Ｚｙｍｅｄ）を用いて３７℃３０分インキュベートした。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で３回洗浄後、２次抗体反応として、Ａｌｅｘａ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＩｇＧ抗体で３７℃３０分間インキュベートした。その後、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で３回洗浄後、ＬＳＭ ５ Ｐａｓｃａｌ（Ｚｅｉｓｓ）で観察した。図２は初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞とを比較するための顕微鏡観察写真である。その結果、ＲＢＥＣでは、細胞−細胞間に全てのタイトジャンクション構成タンパク質の集積が確認できたが、ＧＰ８．３ではＺＯ−１のみ僅かに確認できた。
【００４５】
５−３． 初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞の電気抵抗（ＴＥＥＲ）とＮａ−Ｆ透過性の検討（図３）
ＲＢＥＣならびＧＰ８．３細胞がタイトジャンクション機能を保持しているか検討するために以下の実験を行った。また、タイトジャンクション機能を亢進させる物質として知られる、ｃＡＭＰを負荷し、その反応も検討した。細胞培養の実施例１で得られたＲＢＥＣならびに実施例４で得られたＧＰ８．３を、１２−ｗｅｌｌ ｔｙｐｅの登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌに１．５×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2で播き、３日間培養した。ｃＡＭＰ（ｃｐｔ−ｃＡＭＰ：Ｓｉｇｍａ社製）は２日目に２５０μＭで負荷し１２時間処置した。ＴＥＥＲをＥＮＤＯＨＭ（ＷＰＩ社製）で測定した。その後、Ｎａ−Ｆ透過性の実験を行った。まず、培養液を取り除いて、ＰＢＳ（―／―）で２回洗浄した。その後インサートの下部 （脳実質側）のｗｅｌｌにはａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ ＰＢＳ（＋／＋）；Ｓｉｇｍａ、ｄ−ｇｌｕｃｏｒｓｅ（４．５ｍｇ／ｍＬ）；和光純薬社製、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）；Ｓｉｇｍａを１．５ｍＬ満たした。１０μｇ／ｍＬ ｓｏｄｉｕｍ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｎａ−Ｆ）；Ｓｉｇｍａ、を含んだａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ （０．５ｍＬ）をインサートの上部 （血管側）に添加した後、２０分ごとに新しいｗｅｌｌにインサートを移動した。サンプルの蛍光強度は蛍光光度計 （島津制作）を用いて測定し（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長 ５３０ｎｍ）、検量線よりＮａ−Ｆ濃度を算出した。クリアランスと透過係数 （Ｐ） の算出はＤｅｈｏｕｃｋ、Ｉｓｏｂｅらに従った（Ｄｅｈｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｉｓｏｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。クリアランスは血管側のｃｈａｍｂｅｒから脳実質側のｃｈａｍｂｅｒに移行したＮａ−Ｆの量をμＬで表し、血管側に入れたＮａ−Ｆ、の初濃度［Ｃ］Ｌと脳実質側に移行したＮａ−Ｆ、ＥＢＡの最終濃度［Ｃ］Ａから、Ｃｌｅａｒａｎｃｅ（μＬ）＝［Ｃ］Ａ×ＶＡ／［Ｃ］Ｌより算出した（ＶＡ：脳実質側ｃｈａｍｂｅｒの容積 （１．５ｍＬ））。透過係数 （ｃｍ／ｍｉｎ）は１／ＰＳａｐｐｅｒ＝１／ＰＳｍｅｍｂｒａｎｅ＋１／ＰＳｔｒａｎｓより求めた。ＰＳは時間に対してクリアランスをプロットした直線の傾きで、（透過係数×（ｍｅｍｂｒａｎｅの表面積）を表している。Ｐａｐｐはみかけの透過係数、Ｐｔｒａｎｓは真の透過係数を表す。Ｐｍｅｍｂｒａｎｅは、ｍｅｍｂｒａｎｅのみの透過係数を表す。図３はＲＢＥＣとＧＰ８．３に対するｃＡＭＰの効果を示すグラフである。その結果、ＲＢＥＣはＧＰ８．３に比べ有意に電気抵抗が高く、Ｎａ−Ｆ透過性も低い事が判明した。また、ＲＢＥＣで観察される、ｃＡＭＰによるタイトジャンクション機能の亢進作用がＧＰ８．３では確認されなかった。
【実施例６】
【００４６】
初代培養脳毛細血管内皮細胞と初代培養脳ペリサイト、アストロサイトを用いた共培養の検討
６−１． 経内皮電気抵抗（図４）
図４は実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルについて経内皮電気抵抗値測定結果の経日変化を示すグラフであり、図５は実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルについて経内皮電気抵抗値の測定結果を比較したグラフである。経内皮電気抵抗（Ｔｒａｎｓ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＴＥＥＲ）はＥＮＤＯＨＭ（ＷＰＩ社製）で測定した。各ＢＢＢモデルの電気抵抗値は、モデル作成後２日から７日後まで測定し、Ｅ００、Ｅ０Ａ、Ｅ０Ｐではｍｅｍｂｒａｎｅのみの電気抵抗値、ＥＡ０、ＥＡＰではアストロサイトのみを培養させたｍｅｍｂｒａｎｅの電気抵抗値、ＥＰ０、ＥＰＡではペリサイトのみを培養させたｍｅｍｂｒａｎｅの電気抵抗値を差し引く事で算出した。脳毛細血管内皮細胞の単層培養系（Ｅ００）に比べ、脳毛細血管内皮細胞とアストロサイトが非接触状態の共培養系（Ｅ０Ａ）、脳毛細血管内皮細胞とペリサイトが非接触状態の共培養系（Ｅ０Ｐ）、脳毛細血管内皮細胞とペリサイトが接触し、アストロサイトが非接触状態の共培養系（ＥＰＡ）において、経内皮電気抵抗値の有意な上昇が認められ、その中でもＥＰＡ型が最も高い値を示した。
【００４７】
６−２． ウエスタンブロッティング（図６）
図６は実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルにおけるタイトジャンクション構成タンパク質（ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ−５、ＺＯ−１）の発現を示す写真である。６ｗｅｌｌの登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを用い、各ＢＢＢモデルを作製した。３日後、培養液を取り除いて、ＰＢＳ（−／−）で２回洗浄した。洗浄後、メンブランの裏側に貼り付いている細胞を取り除くために、メスで裏面の細胞を剥ぎ取った。その後、ＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ）にｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ）を加えた細胞溶解液３００μＬを加え、２０分間シェーカー上でインキュベートした。その後細胞溶解液を回収し、１２，０００×ｇで１５分遠心した。上清を回収し一部を蛋白定量に使用し、残りをサンプルとした。サンプルにＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含むトリス塩酸−５×サンプルバッファーを加え、９５℃で５分間熱処理し、−８０℃で保存した。各サンプルのタンパク質量を測定し、タンパク質量が同量になるように、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。次にＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写し、１％ 登録商標ｐｅｒｆｅｃｔ ｂｌｏｃｋ（ＭｏＢｉＴｅｃ）を含む０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、）溶液で室温１時間ブロッキングした。１次抗体反応として、各タンパク質に特異的な抗体（ａｎｔｉ−Ｃｌａｕｄｉｎ−５；Ｚｙｍｅｄ、ａｎｔｉ−ｏｃｃｌｕｄｉｎ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ａｎｔｉ−ＺＯ−１；Ｚｙｍｅｄ、β−ａｃｔｉｎ；Ｓｉｇｍａ）を用いて室温１時間インキュベートした。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで５分×３回洗浄後、２次抗体反応として、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ＩｇＧ抗体で１時間インキュベートした。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで５分×３回洗浄後、ＥＣＬ ｐｌｕｓ（アマシャム）で目的のバンドを検出した。バンドの解析には、ＮＩＨ ｉｍａｇｉｎｇを用いた。各共培養系の中でＥＰＡ型が最もｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ−５、ＺＯ−１の発現が亢進していた。
【実施例７】
【００４８】
虚血再灌流ＢＢＢモデル
７−１． 経内皮電気抵抗とＮａ−Ｆ透過性（図７、８、９）
細胞培養の実施例５の（i）、（vi）で示した、共培養方法を用い脳
毛細血管内皮細胞の単層培養系（Ｅ００）、と脳毛細血管内皮細胞とペリサイトが接触し、アストロサイトが非接触状態の共培養系（ＥＰＡ）を作製した。作製したモデルをＰＢＳ（−／−）で１回洗浄後、窒素ガスで５分間バブリングしたｇｌｕｃｏｓｅ ｆｒｅｅ Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｕｆｆｅｒ（１４３ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＣａＣｌ2、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．０ ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１１ｍＭｓｕｃｒｏｓｅ（以上すべて和光純薬） １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）で置換し、アネロカルト登録商標Ａ ｍｉｎｉに入れ６時間インキュベートした（虚血期間）。インキュベート後 ｎｏｒｍａｌ Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｕｆｆｅｒ（１４３ ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＣａＣｌ2、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．０ ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１１ ｍＭ ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に置換し、３時間インキュベートした（再灌流期間）。コントロールとして上記操作を、全てｎｏｒｍａｌ Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｕｆｆｅｒ を用いて３７℃、９５％ ａｉｒ／５％ＣＯ2下で行った。虚血再灌流モデルにおける電気抵抗値を図７に示した。虚血再灌流群では、コントロール群に比べ、電気抵抗の低下、Ｎａ−Ｆ透過性の増加が見られ、タイトジャンクション機能が低下していることが判明した。また、このタイトジャンクション機能の低下は、Ｅ００群よりも、ＥＰＡ群がより顕著にタイトジャンクション機能の低下が見られたことから、ペリサイト及びアストロサイトが虚血再灌流障害に対し、影響を与えていることが考えられる（図８、９）。
【００４９】
７−２．虚血再灌流ＢＢＢモデルにおけるラジカルスカベンジャー・エダラボンの効果（図１０）
図７は虚血再灌流ＢＢＢモデルにおけるラジカルスカベンジャー・エダラボンの効果を示すグラフである。前記の方法で虚血再灌流ＢＢＢモデルを作製しエダラボンの効果を検討した。ラジカルスカベンジャーであるエダラボンは、虚血期間終了時に添加した。図１０に示すように、虚血再灌流におけるタイトジャンクション機能の低下（ＴＥＥＲの減少、Ｎａ−Ｆ透過性の上昇）は、エダラボンの投与により有意に抑えられていた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】種々の共培養作製方法を示す説明図である。
【図２】初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞とを比較するための顕微鏡観察写真である。
【図３】ＲＢＥＣとＧＰ８．３に対するｃＡＭＰの効果を示すグラフで ある
【図４】実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルについて経内皮電気抵抗値測定結果の経日変化を示すグラフである。
【図５】実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルについて経内皮電気抵抗値の測定結果を比較したグラフである。
【図６】実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルにおけるタイトジャンクション構成タンパク質（ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ−５、ＺＯ−１）の発現を示す写真である。
【図７】虚血再灌流モデルにおける電気抵抗値を示すグラフである。
【図８】共培養により虚血再灌流障害（電気抵抗値の減少）が増悪したことを示すグラフである。
【図９】共培養により虚血再灌流障害（Ｎａ−Ｆ透過性の増加）が増悪したことを示すグラフである。
【図１０】虚血再灌流ＢＢＢモデルにおけるラジカルスカベンジャー・エダラボンの効果を示すグラフである。
【図１１】本発明に係る血液脳関門インヴィトロ・モデルの実施形態の概略図である。
【符号の説明】
【００５１】
１ ハンガー
２ フィルター
２ａ 穴
３ 容器
４ 培養液
１０ 血管腔側
２０ 脳実質側
Ｅ 脳毛細血管内皮細胞
Ｐ ペリサイト
Ａ アストロサイト
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液脳関門（ｂｌｏｏｄ―ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）
（一般に、「ＢＢＢ」と略して呼ばれている。）ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル及び病態血液脳関門インヴィトロ・モデルに関する。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」あるいは「インヴィトロ」とは、「ガラス容器の中で」という意味のラテン語で、生物学用語としては種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」摘出・遊離されている状態をさす。（岩波 生物学辞典、 岩波書店、 １９９８年１１月１０日、参照）
すなわち、血液脳関門を通過して中枢に作用する薬物、あるいは血液脳関門自体に作用する薬物、あるいは中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行する薬物のスクリーニング系に関する。
【０００２】
また、本発明は、血液脳関門インヴィトロ・モデル及び病態血液脳関門インヴィトロ・モデルを用いた薬物スクリーニング方法に関する。すなわち、本発明の血液脳関門インヴィトロ・モデルあるいはスクリーニング系に様々な病態環境を負荷することで病態下における病因解析研究や上記スクリーニングを可能とする。
【背景技術】
【０００３】
血液脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）は、繊細な神経細胞が生きる、脳という特異な環境における神経細胞の生存と活動のために進化した環境整備機構である。血液から中枢神経系への物質の侵入の遮断（関門）と取り込み（輸送）という二律背反を、その構成単位である脳毛細血管内皮細胞、アストロサイト（星状膠細胞）およびペリサイト（周皮細胞）の３種類の細胞が機能的に一体となって克服した高度機能分化システムということができる。ＢＢＢの関門機能は脳毛細血管内皮細胞の細胞間接着構造であるタイトジャンクション（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ， 密着結合）に代表され、選択的な取り込み（輸送）機構は神経細胞のエネルギー源であるＤ―グルコースの１型グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ１）が代表的である。関門機能と輸送機構はまた相互に密接に関連し合っていて、例えば構造的に一群の輸送分子群（ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）の一員であるＰ―糖タンパク（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）はくみ出しポンプとして関門機能を担っているし、タイトジャンクションも陰イオンよりも陽イオンに選択的な低分子輸送を担っている（細胞間隙輸送ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙ）。タイトジャンクションが密に存在すること、選択的な取り込みを担う担体（トランスポーター）やイオンチャネルなど経細胞性輸送（ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｗａｙ）を担う輸送分子が管腔側（ａｐｉｃａｌ 膜脂質）と基底膜側細胞膜（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ 膜脂質）において非対称的に分布すること（極性）が、ＢＢＢの機能的本態である。
【０００４】
この特異なＢＢＢ機能により、神経細胞の恒常性は保たれているが、その存在のために、疾病などの原因で人工的に生体に何らかの処理を施こそうとする場合に大きな障害となっている。開発が急がれている中枢神経性疾患（認知症、アルツハイマー病、プリオン病、脳卒中など）の予防薬・治療薬開発の大きな障壁となっており、試験管内や細胞培養実験で作用が発見された薬物候補化合物であっても、実験動物など生体に投与すると、その多くはＢＢＢのために脳内に移行できず、実際の治療薬になり得ず、開発を断念せざるを得なくなっている。
【０００５】
一方、多剤併用療法が主流になった現在、ほとんど脳内に移行しないと考えられる薬物が、薬物相互作用により脳内に移行し、中枢性の副作用の原因になることも予想される。
【０００６】
以上のように、薬物のＢＢＢ透過性の予測は非常に重要であるが、ＢＢＢの特異な機能のために、脳内への移行性には一定の法則性が無く、薬物の化学構造や分子量などから予め判断できない。薬物の脳内移行性を動物実験で検討するには、膨大な手間と費用がかかるだけでなく、複雑な生体内で薬物の移行性だけを正確に判断する事は困難である。また、動物実験で使用する薬物量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏに比べ多くの量が必要になり、リード化合物の段階で動物実験に耐えうる化合物量を確保することは、更なる時間と費用が必要になり現実的ではない。よって、脳内で作用する薬物の新規開発、および適正な薬物治療のためには、我々生体の複雑なＢＢＢと、近似的な機能を持つ試験管内再現システムを用いて薬物の透過性を予測することが必要である。脳内移行性を簡便に検定する検査キットがあれば、現在、膨大な費用と時間をかけて行われている創薬研究の効率化が図られ、より即応的で確実な創薬のスクリーニングシステムが達成できる。
【０００７】
更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルには大きな利点がある。その培養条件を最適化することにより、病態を容易に再現できることである。中枢神経を取り巻き、恒常性を守る脳毛細血管内皮細胞は、様々な中枢神経性疾患と関係があり、ＢＢＢの機能障害が、発症あるいは病態進行に密接に関与する疾患が最近次々に明らかにされている。例えば、血液脳関門（ｂｌｏｏｄ―ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ、 ＢＢＢ）は、脳浮腫発症の責任部位であり、タイトジャンクションの離開によって血漿タンパクが脳内への漏出し、Ｎａ+、グルタミン酸などの輸送体や水チャネルのアクアポリンなどの機能障害による水と電解質の貯留が生じ病態を進展させる(血管原生脳浮腫)。病態でのＢＢＢ機能の解析には、これまで述べてきた薬物脳内移行性スクリーニングと同様に、複雑な生体内のＢＢＢを再現したｉｎ ｖｉｔｒｏのＢＢＢモデルが力を発揮する。即ちｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルの培養環境を変化させることにより、容易に病態環境を再現でき、病因解析研究に応用できる。
【０００８】
また、病態下におけるＢＢＢ薬物透過性は変化していると考えられ、病態時における薬物透過性を判定することも重要である。
【０００９】
血液脳関門の解剖学的な実体は密着結合した脳毛細血管内皮細胞であるが、その機能と維持にはアストロサイトやペリサイトが密接に関与していることが明らかとなった。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて脳毛細血管内皮細胞とアストロサイトを共培養すると、脳毛細血管内皮細胞に特異的な酵素であるａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ活性、γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ活性の上昇 、膜抵抗の上昇 、ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎの増強 、Ｐ糖蛋白質の発現 （Ｓｏｂｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７；Ｓｔａｎｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｆｅｎａｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、などの血液脳関門機能に特異的な機能が増強するとの報告がありアストロサイトの重要性を示している。一方で、ペリサイトの血液脳関門に果たす役割は不明な点が多いが、近年になりペリサイトがＢＢＢにおいて重要な役割をしている事が報告されている。
【００１０】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて血管内皮細胞とペリサイトを共培養すると、膜抵抗が増強する（Ｄｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）との報告は、ペリサイトが血液脳関門の維持機構を構成する素子としての重要性を示すものである。即ち、高度機能分化システムであるＢＢＢは、内皮細胞単独では形成できず、内皮細胞、アストロサイト、ペリサイトの３種細胞のクロストークにより初めて構成され得ると考えられ、これら３種細胞を考慮したモデルが必要である。しかし、これまでのＢＢＢ ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、内皮細胞単層培養系や、内皮細胞とアストロサイトとの共培養系などの不完全なモデルしか報告されていない。
【００１１】
最近の研究成果により、ＢＢＢの機能分子であるタイトジャンクション構成タンパク質群が明らかになった。血管内皮細胞管腔側（ａｐｉｃａｌ 膜脂質）に局在し関門機能の本態である。その中でも、クローディン（ｃｌａｕｄｉｎ、 Ｆｕｒｕｓｅら）、オクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ、Ｆｕｒｕｓｅら）、およびＺＯ（ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）−１などが、関門機能の主要なタンパク質である事が判明した。ＢＢＢタイトジャンクションは、末梢組織（脳毛細血管内）と中枢神経系（脳実質内）という異空間を隔てる関門であるが、異なる環境にそれぞれ面した脳毛細血管内皮細胞の管腔側膜（ａｐｉｃａｌ膜脂質）と基底膜側細胞膜（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ膜脂質）の境界に位置していて輸送体などの機能分子の非対称的な配列に寄与している（極性、タイトジャンクションのフェンス機能）。また関門であると同時に、陽イオン性物質に選択性のある低分子物質の細胞間隙輸送（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）を担う機能分子単位でもある。事実、細胞内でのシグナル伝達分子との結合を介在する新しいＰＤＺタンパクであるＭＵＰＰ１（ｍｕｌｔｉ―ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）が発見され、タイトジャンクションは従来考えられていたような静的な固定的な関門では無く、細胞内情報伝達機構という動的・機動的な機能分子であることが明らかにされつつある。即ち、ＢＢＢ ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて、タイトジャンクション機能が保たれていることは、必要不可欠であるが、これまで、その利便性より用いられてきた不死化脳毛細血管内皮細胞株は、このタイトジャンクション機能が保たれているか疑問がもたれる。また、関門機能だけではなく、細胞極性の不保持、薬物への細胞応答などが不十分であると考えられる。事実、ラット不死化脳毛細血管内皮細胞を用いた検討によると、タイトジャンクションタンパク質が、細胞−細胞間に集積しておらず、電気抵抗値も非常に低い事が分かった。よって、不死化脳毛細血管内皮細胞を用いた血液脳関門モデルは不完全なモデルであり正常なＢＢＢを反映していない。
【００１２】
また一方で、内皮細胞のタイトジャンクション機能を維持するために、その亢進因子として知られるｃＡＭＰを細胞培養液に添加するモデルが報告されているが、生理的なモデルと言い難く、特にｃＡＭＰを変動させる薬物のスクリーニングにおいて、問題があると考えられる。
【００１３】
また、中枢神経を取り巻き、恒常性を守る脳毛細血管内皮細胞は、様々な中枢神経性疾患と関係があり、ＢＢＢの機能障害が、発症あるいは病態進行に密接に関与する疾患が最近次々に明らかにされている。ここでも重要となるのが、生体の血液脳関門は、脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトにより構成されていて、様々な病態下ではそれぞれの細胞が様々な影響を及ぼし合っていることである。内皮細胞単独、あるいは内皮細胞とアストロサイトの共培養系など、ＢＢＢ構成細胞がそろっていない不完全なＢＢＢモデルでは、病態時のＢＢＢを十分には再現していないと考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
よって、本発明の１つの目的は、血液脳関門を通過して中枢に作用する薬物、あるいは血液脳関門自体に作用する薬物、あるいは中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行する薬物のスクリーニング系を提供することである。また、本発明の他の目的は、このスクリーニング系に様々な病態環境を負荷することで病態下における病因解析研究や上記スクリーニングを可能とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本出願の発明者は鋭意研究を行い、初代培養脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトを共培養することにより、生体に近似し、高度な密着結合を有する血液脳関門モデルの開発に成功した。
【００１６】
上記目的は、請求項１に記載の本発明に係る血液脳関門インヴィトロ・モデル、すなわち、培養液と、当該培養液を保持するプレートと、当該培養液に浸漬し、かつ、当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、からなる立体培養装置を用い、当該フィルターが直径０．３５〜０．４５μｍの穴を多数有し、当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイトを播き、当該プレートの内面に初代培養アストロサイトを播き、通常の培養液で共培養してなる血液脳関門インヴィトロ・モデルによって、達成される。
【００１７】
また、上記目的は、請求項２に記載の本発明に係る病態血液脳関門インヴィトロ・モデル、すなわち、培養液と、当該培養液を保持するプレートと、当該培養液に浸漬し、かつ、当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、からなる立体培養装置を用い、当該フィルターが直径０．３５〜０．４５μｍの穴を多数有し、当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイトを播き、当該プレートの内面に初代培養アストロサイトを播き、所定の病態条件に対応する培養液で共培養してなる、病態血液脳関門インヴィトロ・モデルによって、も達成される。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様においては、請求項３に記載のように、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルを用い、フィルターの上方部に薬物を添加し、一定時間後に、当該フィルターの下方部に漏れ出た、当該薬物の量を測定して行う、薬物の血液脳関門通過容易性評価方法を開示している。
【００１９】
本発明の他の好ましい実施態様においては、請求項４に記載のように、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルを用い、フィルターの上方部に薬物を添加し、一定時間後に、脳毛細血管内皮細胞を採取し、当該薬物添加後の脳毛細血管内皮細胞の性質を評価し、添加前の脳毛細血管内皮細胞の性質と比較して行う、薬物のスクリーニング評価方法を開示している。
【００２０】
本発明のさらに他の好ましい実施態様においては、請求項５に記載のように、請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門の病態解析方法を開示している。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施態様においては、請求項６に記載のように、請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門における薬物の反応性評価方法を開示している。
【００２２】
本発明のさらに別の好ましい実施態様においては、請求項７に記載のように、請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門における薬物の脳移行性評価方法を開示している。
【００２３】
（作用）
請求項１に記載の本発明においては、多孔質のフィルター上に脳毛細血管内皮細胞を播き、フィルター裏側にペリサイトを播き、フィルターの受け皿であるプレートの内側にアストロサイトを播くことで、３種細胞間のクロストークが可能となり、生体に近似した血液脳関門ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが完成した。
【００２４】
また、請求項２に記載の本発明においては、上記血液脳関門インビトロ・モデルに様々な病態環境を負荷することにより病態血液脳関門インビトロモデルを得た。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は生体に最も近似したｉｎ ｖｉｔｒｏのＢＢＢモデルであるから、現在開発が急がれている中枢神経作用薬の開発（血液脳関門を通過して中枢に作用する薬物）が効率的に行えるようになる。
【００２６】
また、本発明は中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行する薬物のスクリーニング系であるため、適切な薬物療法の開発や新薬の開発に貢献できる。また、血液脳関門自体に作用する薬物のスクリーニングに有用である。
【００２７】
さらには、本発明はこのスクリーニング系に様々な病態環境を負荷したものであるため、病態下における病因解析研究や上記スクリーニングが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
初代培養脳毛細血管内皮細胞と、初代培養脳ペリサイト、初代培養アストロサイトを、多孔質のフィルターを含有する立体培養装置で、共培養することにより本発明の血液脳関門インヴィトロ・モデルが得られる。本発明の血液脳関門インヴィトロ・モデルは高度にタイトジャンクションが発達しており、より生体に近似した血液脳関門の再構成系となっている。
【００２９】
図１１は本発明に係る血液脳関門インヴィトロ・モデルの実施形態の概略図である。容器３の中に培養液４を収容し、フィルター２を吊るすハンガー１によって、フィルター２を培養液４の中の所定の位置に浸漬させている。直径０．４μｍの穴２ａを多数持つフィルター２の上部は血管腔側１０として想定され、その下部は脳実質側２０として想定されている。即ち、フィルター２の表面に初代培養脳毛細血管内皮細胞Ｅを播き、フィルター２の裏側に初代培養脳ペリサイトＰを播き、更にそのフィルター２の下方に初代培養アストロサイトＡを播く事で、生体での血液脳関門を最も良く再現した構造であると考えられる。また、フィルター２の多孔性により、３種の細胞間のクロストークが可能であり、複雑な生体での血液脳関門の維持・調節機構をも再現する事が可能となっている。
【００３０】
３種細胞共培養により、ＢＢＢの特徴である、高度に発達したタイトジャンクションが内皮細胞に誘導されており、薬物のスクリーニング等に耐えうる血液脳関門再構成系が提供される。この血液脳関門再構成系を用いる事で、脳内での作用を期待する薬物、あるいは中枢での作用を期待しない薬物で脳内に移行する薬が、血液脳関門を通過できるかを容易に判断する事ができる。即ち、血管腔側１０である、フィルター２の上部に当該薬物を添加し、一定時間後に、フィルター２の下部に漏れ出た薬物量を測定する事で判断できる。また、同様にこの血液脳関門再構成系を用いる事で、血液脳関門自体に作用する薬物のスクリーニングが容易に行う事ができる。即ち、血管腔側１０である、フィルター２の上部に当該薬物を添加し、一定時間後に、脳毛細血管内皮細胞Ｅの性質を添加前後で比較する事で、判断できる。
【００３１】
更には、ＢＢＢキットの培養条件を変化させることで容易に病態ＢＢＢキットが作製できる。即ち、ＢＢＢキットの培養液４を実際の病態条件に変えることにより病態ＢＢＢキットを作製し、この病態ＢＢＢキットにおける、脳毛細血管内皮細胞Ｅ、ペリサイトＰ、アストロサイトＡの変化を通常の培養液で培養したそれらと比較することにより、ＢＢＢの病態解析ならびに病態下における薬物の反応性、脳移行性が判断できる。
【実施例１】
【００３２】
（脳毛細血管片の単離）
クリーンベンチ内で３週齢のラットの脳を摘出し、氷冷したＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ（―／―）（ＰＢＳ（―／―）；Ｓｉｇｍａ）中に入れ、滅菌した濾紙上で、硬膜、小脳、間脳、脳幹などを取り除き大脳皮質だけにした。この大脳皮質を氷冷したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ社製）３ｍＬに入れ約１ｍｍ3大の大きさにメスで細断した。更に酵素（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ―ｃｌａｓｓ２（１ｍｇ／ｍｌ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）、３００μＬ ＤＮａｓｅ（１５μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製））を含む１５ｍＬのＤＭＥＭを加え、５ｍＬピペットで２５回ｕｐ−ｄｏｗｎし懸濁した。９０分間３７℃で振盪・インキュベートした後、１０ｍＬのＤＭＥＭを加え、遠心した。遠心後の沈殿ペレットを２０％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）／ＤＭＥＭ で遠心分離し、下層のペレットに酵素（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ／ｄｉｓｐａｓｅ（１ｍｇ／ｍＬ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社製））、ＤＮａｓｅ（６．７μｇ／ｍＬ） を含む１５ｍＬ ＤＭＥＭで 懸濁し、６０分３７℃で振盪・インキュベートした。その後１０ｍＬのＤＭＥＭを加え遠心し、下層のペレットをあらかじめ ３０００ｇで１時間遠心したパーコール（３３％；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に重層させ遠心分離した。内皮層をシリンジで取り、２回ＤＭＥＭで洗浄し脳毛細血管片を得た。得られた脳毛細血管片には、ｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ； Ｓｉｇｍａ社製）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製）でコーティングしたディッシュに分離した脳毛細血管片を播種した。３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下で２０％ Ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｅｒｕｍ（ＰＤＳ）−ＤＭＥＭ／Ｆ１２ にｂＦＧＦ（１ｍｇ／ｍＬ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社製）、ｈｅｐａｒｉｎ（１００μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製）、ｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製）、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（４μｇ／ｍＬ； Ｓｉｇｍａ社製）を加えた培養液（ＲＢＥＣ 培養液１）で、脳毛細血管内皮細胞を２日間培養した。３日目にｐｕｒｏｍｙｃｉｎを加えない培養液（２０％ ＰＤＳ―ＤＭＥＭ／Ｆ１２にｂＦＧＦ（１ｍｇ／ｍＬ）、 ｈｅｐａｒｉｎ（１００μｇ／ｍＬ）、ｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養液；ＲＢＥＣ培養液２）に置換し８０％コンフルエントになるまで培養した。
【実施例２】
【００３３】
（脳毛細血管周皮細胞：ペリサイト）
実施例１の脳毛細血管片には数パーセントペリサイトが含まれている。そこで、コラーゲンコーティングしたディッシュに、脳毛細血管片を播き、３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）−ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養液にて１週間培養し、ペリサイトを増殖させた。この段階では、脳毛細血管内皮細胞とペリサイトは混在している状態である。次に、１×トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）で細胞を剥ぎ、コーティングなしのディッシュに播き直しペリサイトを単離した（内皮細胞は接着できず、ペリサイトだけが増殖する）。
【実施例３】
【００３４】
（アストロサイト）
クリーンベンチ内で、生後１、２日齢のラットから脳を取り出し、氷冷したＰＢＳ（―／―）中にいれ、滅菌した濾紙上で、硬膜、小脳、間脳、脳幹などを取り除き大脳皮質だけにした。この大脳皮質５０ｍＬのチューブに入れ、氷冷したＤＭＥＭ１０ｍＬを加えた。２０Ｇのシリンジでゆっくりｕｐ−ｄｏｗｎし組織をバラバラにした。しばらく静置した後、上清５ｍＬを別の５０ｍＬチューブに入れた。残りの細胞懸濁液５ｍＬに更に５ｍＬのＤＭＥＭを加え、２０Ｇのシリンジでｕｐ−ｄｏｗｎした。この操作を細胞塊が肉眼で確認できなくなるまで繰り返し、最後の細胞懸濁液５ｍＬも加えた。その後、細胞懸濁液を７０μｍの登録商標セルストレイナー（Ｆａｌｃｏｎ社製）に通した。遠心し細胞を集め１０％ ＦＢＳ―ＤＭＥＭで再懸濁し、７５ｃｍ2のフラスコに播いた。３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ ＦＢＳ―ＤＭＥＭ
にｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で培養し、細胞がコンフルエントになったら、フラスコを２００ｒｐｍで１時間振盪し、ミクログリアを浮遊させ、取り除いた。１×トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で継代し、新しい７５ｃｍ2のフラスコに播き直し、コンフルエントになったら、もう一度２００ｒｐｍで１時間浸透し、ミクログリアを浮遊させ、取り除き、アストロサイトを得た。
【実施例４】
【００３５】
（共培養作製方法）
図１は種々の共培養作製方法を示す説明図である。実施例１で得られた、脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトを、登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、０．４μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）を用い以下の種々の共培養モデルを作製した。
【００３６】
（i）脳毛細血管内皮細胞Ｅの単層培養系（Ｅ００）
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ インサートのｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ両面をｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のｗｅｌｌに設置した。その後登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に脳毛細血管内皮細胞Ｅ（１．５×１０5 ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％大気下、ＲＢＥＣ培養液２で培養した。
【００３７】
（ii）脳毛細血管内皮細胞ＥとアストロサイトＡが非接触状態の共培養
系（Ｅ０Ａ）
１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートの底面をｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）溶液でコーティングし、アストロサイトＡ（１．０×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳毛細血管内皮細胞Ｅを登録商標Ｔｒａ
ｎｓｗｅｌｌ インサートの内側に播種した。
【００３８】
（iii）脳毛細血管内皮細胞ＥとアストロサイトＡが接触した状態の共培
養系（ＥＡ０）
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ インサートのｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ両面をｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、上下逆にディッシュに設置した。アストロサイトＡ（２．０×１０4ｃｅｌｌ／ｃｍ2）
を播種し、６時間以上培養した。登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートを１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートのｗｅｌｌに設置し、
３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。
翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳毛細血管内皮
細胞Ｅを登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に播種した。
【００３９】
（iv）脳毛細血管内皮細胞ＥとペリサイトＰが非接触状態の共培養系
（Ｅ０Ｐ）
１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートの底面をｃｏｌｌａｇｅｎ 溶液でコーティングし、ペリサイトＰ（１．０×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳
毛細血管内皮細胞Ｅを登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に播種した。
【００４０】
（v）脳毛細血管内皮細胞ＥとペリサイトＰが接触した状態の共培養系
（ＥＰ０）
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートのｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ両面をｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、上下逆にディッシュに設置した。ペリサイト（２．０×１０4ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し、６時間以上培養した。登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートを１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートのｗｅｌｌに設置し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下１０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳毛細血管内皮細胞Ｅを
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に播種した。
【００４１】
（vi）脳毛細血管内皮細胞ＥとペリサイトＰが接触し、アストロサイト
Ａが非接触状態の共培養系（ＥＰＡ）
１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートの底面をｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ溶液でコーティングし、アストロサイトＡ（１．０×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下 １０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。また、同時に、登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート（０．４μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）のｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ両面をｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、上下逆にディッシュに設置した。ペリサイトＰ（２．０×１０4ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し、6 時間以上培養した。登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ インサートをアストロサイトＡを播種した、１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートのｗｅｌｌに設置し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下１０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳毛細血管内皮細胞Ｅを登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に播種した。
【００４２】
（vii）脳毛細血管内皮細胞ＥとアストロサイトＡが接触し、ペリサイト
Ｐが非接触状態の共培養系 （ＥＡＰ）
１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートの底面をｃｏｌｌａｇｅｎ溶液でコーティングし、ペリサイトＰ（１．０×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下１０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。また、同時に登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ インサート（０．４μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）のｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ両面をｃｏｌｌａｇｅｎ（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、上下逆にディッシュに設置した。アストロサイトＡ（２．０×１０4ｃｅｌｌ／ｃｍ2）を播種し、６時間以上培養した。
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ インサートにアストロサイトＡを播種した、１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅプレートのｗｅｌｌに設置し３７℃、５％ＣＯ2／９５％大気下１０％ＦＢＳ―ＤＭＥＭにｇｅｎｔａｍａｃｉｎ（５０μｇ／ｍＬ）を加えた培養で一昼夜培養した。翌日、ＲＢＥＣ培養液２に交換し、（i）で示した方法で脳毛細血管内皮細胞Ｅを
登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの内側に播種した。
【実施例５】
【００４３】
（不死化脳毛細血管内皮細胞と初代培養脳毛細血管内皮細胞の比較）
５―１． 初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）の発現（図２）
細胞培養の実施例１で得られたＲＢＥＣならびに実施例４で得られたＧＰ８．３を、８―ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｌｉｄｅ に１×
１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2で播き、３日後、培養液を取り除いて、ＰＢＳ（―／―）で２回洗浄した。洗浄後、３％パラホルムアルデヒドで１０分間室温固定した。その後０．２％ ｔｒｉｔｏｎ―Ｘ溶液で１０分間室温処理した。３％Ｈ2Ｏ2溶液で３分間処理し内因性のペルオキシダーゼ活性を除いた。ＰＢＳ（―／―）で２回洗浄後、３％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）溶液で室温３０分間ブロッキングした。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で洗浄後、1次抗体反応として、ａｎｔｉ−ｖＷＦ（Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃３０分インキュベートした。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で３回洗浄後、２次抗体反応として、ビオチン標識二次抗体で３７℃３０分間インキュベートした。その後、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で３回洗浄後、パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液で室温１０分間反応させた。最後に発色基質としてジアミノベンジジン四塩酸塩を用い、顕微鏡で観察した。図２は初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞とを比較するための顕微鏡観察写真である。ＲＢＥＣならびにＧＰ８．３は共に内皮細胞のマーカーであるｖＷＦ陽性を示した。
【００４４】
５―２． 初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞のタイトジャンクション構成タンパク質の発現（図２）
細胞培養の実施例１で得られたＲＢＥＣならびに実施例４で得られたＧＰ８．３を、８−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｌｉｄｅに１×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2で播き３日間培養した。培養液を取り除いて、ＰＢＳ（―／―）で２回洗浄した。洗浄後、３％パラホルムアルデヒドで１０分間室温固定した。その後０．２％ ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液で１０分間室温処理した。ＰＢＳ（―／―）で２回洗浄後、３％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）溶液で室温３０分間ブロッキングした。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で洗浄後、１次抗体反応として、各タンパク質に特異的な抗体（ａｎｔｉ ｃｌａｕｄｉｎ−１；Ｚｙｍｅｄ， ａｎｔｉ ｃｌａｕｄｉｎ−３；Ｚｙｍｅｄ， ａｎｔｉ ｃｌａｕｄｉｎ−５；Ｚｙｍｅｄ，ａｎｔｉ ｏｃｃｌｕｄｉｎ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ａｎｔｉ ＺＯ−１；Ｚｙｍｅｄ）を用いて３７℃３０分インキュベートした。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で３回洗浄後、２次抗体反応として、Ａｌｅｘａ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＩｇＧ抗体で３７℃３０分間インキュベートした。その後、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（―／―）で３回洗浄後、ＬＳＭ ５ Ｐａｓｃａｌ（Ｚｅｉｓｓ）で観察した。図２は初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞とを比較するための顕微鏡観察写真である。その結果、ＲＢＥＣでは、細胞−細胞間に全てのタイトジャンクション構成タンパク質の集積が確認できたが、ＧＰ８．３ではＺＯ−１のみ僅かに確認できた。
【００４５】
５−３． 初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞の電気抵抗（ＴＥＥＲ）とＮａ−Ｆ透過性の検討（図３）
ＲＢＥＣならびＧＰ８．３細胞がタイトジャンクション機能を保持しているか検討するために以下の実験を行った。また、タイトジャンクション機能を亢進させる物質として知られる、ｃＡＭＰを負荷し、その反応も検討した。細胞培養の実施例１で得られたＲＢＥＣならびに実施例４で得られたＧＰ８．３を、１２−ｗｅｌｌ ｔｙｐｅの登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌに１．５×１０5ｃｅｌｌ／ｃｍ2で播き、３日間培養した。ｃＡＭＰ（ｃｐｔ−ｃＡＭＰ：Ｓｉｇｍａ社製）は２日目に２５０μＭで負荷し１２時間処置した。ＴＥＥＲをＥＮＤＯＨＭ（ＷＰＩ社製）で測定した。その後、Ｎａ−Ｆ透過性の実験を行った。まず、培養液を取り除いて、ＰＢＳ（―／―）で２回洗浄した。その後インサートの下部 （脳実質側）のｗｅｌｌにはａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ ＰＢＳ（＋／＋）；Ｓｉｇｍａ、ｄ−ｇｌｕｃｏｒｓｅ（４．５ｍｇ／ｍＬ）；和光純薬社製、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）；Ｓｉｇｍａを１．５ｍＬ満たした。１０μｇ／ｍＬ ｓｏｄｉｕｍ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｎａ−Ｆ）；Ｓｉｇｍａ、を含んだａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ （０．５ｍＬ）をインサートの上部 （血管側）に添加した後、２０分ごとに新しいｗｅｌｌにインサートを移動した。サンプルの蛍光強度は蛍光光度計 （島津制作）を用いて測定し（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長 ５３０ｎｍ）、検量線よりＮａ−Ｆ濃度を算出した。クリアランスと透過係数 （Ｐ） の算出はＤｅｈｏｕｃｋ、Ｉｓｏｂｅらに従った（Ｄｅｈｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｉｓｏｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。クリアランスは血管側のｃｈａｍｂｅｒから脳実質側のｃｈａｍｂｅｒに移行したＮａ−Ｆの量をμＬで表し、血管側に入れたＮａ−Ｆ、の初濃度［Ｃ］Ｌと脳実質側に移行したＮａ−Ｆ、ＥＢＡの最終濃度［Ｃ］Ａから、Ｃｌｅａｒａｎｃｅ（μＬ）＝［Ｃ］Ａ×ＶＡ／［Ｃ］Ｌより算出した（ＶＡ：脳実質側ｃｈａｍｂｅｒの容積 （１．５ｍＬ））。透過係数 （ｃｍ／ｍｉｎ）は１／ＰＳａｐｐｅｒ＝１／ＰＳｍｅｍｂｒａｎｅ＋１／ＰＳｔｒａｎｓより求めた。ＰＳは時間に対してクリアランスをプロットした直線の傾きで、（透過係数×（ｍｅｍｂｒａｎｅの表面積）を表している。Ｐａｐｐはみかけの透過係数、Ｐｔｒａｎｓは真の透過係数を表す。Ｐｍｅｍｂｒａｎｅは、ｍｅｍｂｒａｎｅのみの透過係数を表す。図３はＲＢＥＣとＧＰ８．３に対するｃＡＭＰの効果を示すグラフである。その結果、ＲＢＥＣはＧＰ８．３に比べ有意に電気抵抗が高く、Ｎａ−Ｆ透過性も低い事が判明した。また、ＲＢＥＣで観察される、ｃＡＭＰによるタイトジャンクション機能の亢進作用がＧＰ８．３では確認されなかった。
【実施例６】
【００４６】
初代培養脳毛細血管内皮細胞と初代培養脳ペリサイト、アストロサイトを用いた共培養の検討
６−１． 経内皮電気抵抗（図４）
図４は実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルについて経内皮電気抵抗値測定結果の経日変化を示すグラフであり、図５は実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルについて経内皮電気抵抗値の測定結果を比較したグラフである。経内皮電気抵抗（Ｔｒａｎｓ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＴＥＥＲ）はＥＮＤＯＨＭ（ＷＰＩ社製）で測定した。各ＢＢＢモデルの電気抵抗値は、モデル作成後２日から７日後まで測定し、Ｅ００、Ｅ０Ａ、Ｅ０Ｐではｍｅｍｂｒａｎｅのみの電気抵抗値、ＥＡ０、ＥＡＰではアストロサイトのみを培養させたｍｅｍｂｒａｎｅの電気抵抗値、ＥＰ０、ＥＰＡではペリサイトのみを培養させたｍｅｍｂｒａｎｅの電気抵抗値を差し引く事で算出した。脳毛細血管内皮細胞の単層培養系（Ｅ００）に比べ、脳毛細血管内皮細胞とアストロサイトが非接触状態の共培養系（Ｅ０Ａ）、脳毛細血管内皮細胞とペリサイトが非接触状態の共培養系（Ｅ０Ｐ）、脳毛細血管内皮細胞とペリサイトが接触し、アストロサイトが非接触状態の共培養系（ＥＰＡ）において、経内皮電気抵抗値の有意な上昇が認められ、その中でもＥＰＡ型が最も高い値を示した。
【００４７】
６−２． ウエスタンブロッティング（図６）
図６は実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルにおけるタイトジャンクション構成タンパク質（ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ−５、ＺＯ−１）の発現を示す写真である。６ｗｅｌｌの登録商標Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを用い、各ＢＢＢモデルを作製した。３日後、培養液を取り除いて、ＰＢＳ（−／−）で２回洗浄した。洗浄後、メンブランの裏側に貼り付いている細胞を取り除くために、メスで裏面の細胞を剥ぎ取った。その後、ＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ）にｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ）を加えた細胞溶解液３００μＬを加え、２０分間シェーカー上でインキュベートした。その後細胞溶解液を回収し、１２，０００×ｇで１５分遠心した。上清を回収し一部を蛋白定量に使用し、残りをサンプルとした。サンプルにＳＤＳと２−メルカプトエタノールを含むトリス塩酸−５×サンプルバッファーを加え、９５℃で５分間熱処理し、−８０℃で保存した。各サンプルのタンパク質量を測定し、タンパク質量が同量になるように、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。次にＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写し、１％ 登録商標ｐｅｒｆｅｃｔ ｂｌｏｃｋ（ＭｏＢｉＴｅｃ）を含む０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、）溶液で室温１時間ブロッキングした。１次抗体反応として、各タンパク質に特異的な抗体（ａｎｔｉ−Ｃｌａｕｄｉｎ−５；Ｚｙｍｅｄ、ａｎｔｉ−ｏｃｃｌｕｄｉｎ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ａｎｔｉ−ＺＯ−１；Ｚｙｍｅｄ、β−ａｃｔｉｎ；Ｓｉｇｍａ）を用いて室温１時間インキュベートした。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで５分×３回洗浄後、２次抗体反応として、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ＩｇＧ抗体で１時間インキュベートした。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで５分×３回洗浄後、ＥＣＬ ｐｌｕｓ（アマシャム）で目的のバンドを検出した。バンドの解析には、ＮＩＨ ｉｍａｇｉｎｇを用いた。各共培養系の中でＥＰＡ型が最もｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ−５、ＺＯ−１の発現が亢進していた。
【実施例７】
【００４８】
虚血再灌流ＢＢＢモデル
７−１． 経内皮電気抵抗とＮａ−Ｆ透過性（図７、８、９）
細胞培養の実施例５の（i）、（vi）で示した、共培養方法を用い脳
毛細血管内皮細胞の単層培養系（Ｅ００）、と脳毛細血管内皮細胞とペリサイトが接触し、アストロサイトが非接触状態の共培養系（ＥＰＡ）を作製した。作製したモデルをＰＢＳ（−／−）で１回洗浄後、窒素ガスで５分間バブリングしたｇｌｕｃｏｓｅ ｆｒｅｅ Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｕｆｆｅｒ（１４３ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＣａＣｌ2、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．０ ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１１ｍＭｓｕｃｒｏｓｅ（以上すべて和光純薬） １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）で置換し、アネロカルト登録商標Ａ ｍｉｎｉに入れ６時間インキュベートした（虚血期間）。インキュベート後 ｎｏｒｍａｌ Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｕｆｆｅｒ（１４３ ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＣａＣｌ2、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．０ ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１１ ｍＭ ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に置換し、３時間インキュベートした（再灌流期間）。コントロールとして上記操作を、全てｎｏｒｍａｌ Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｕｆｆｅｒ を用いて３７℃、９５％ ａｉｒ／５％ＣＯ2下で行った。虚血再灌流モデルにおける電気抵抗値を図７に示した。虚血再灌流群では、コントロール群に比べ、電気抵抗の低下、Ｎａ−Ｆ透過性の増加が見られ、タイトジャンクション機能が低下していることが判明した。また、このタイトジャンクション機能の低下は、Ｅ００群よりも、ＥＰＡ群がより顕著にタイトジャンクション機能の低下が見られたことから、ペリサイト及びアストロサイトが虚血再灌流障害に対し、影響を与えていることが考えられる（図８、９）。
【００４９】
７−２．虚血再灌流ＢＢＢモデルにおけるラジカルスカベンジャー・エダラボンの効果（図１０）
図７は虚血再灌流ＢＢＢモデルにおけるラジカルスカベンジャー・エダラボンの効果を示すグラフである。前記の方法で虚血再灌流ＢＢＢモデルを作製しエダラボンの効果を検討した。ラジカルスカベンジャーであるエダラボンは、虚血期間終了時に添加した。図１０に示すように、虚血再灌流におけるタイトジャンクション機能の低下（ＴＥＥＲの減少、Ｎａ−Ｆ透過性の上昇）は、エダラボンの投与により有意に抑えられていた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】種々の共培養作製方法を示す説明図である。
【図２】初代培養脳毛細血管内皮細胞と不死化脳毛細血管内皮細胞とを比較するための顕微鏡観察写真である。
【図３】ＲＢＥＣとＧＰ８．３に対するｃＡＭＰの効果を示すグラフで ある
【図４】実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルについて経内皮電気抵抗値測定結果の経日変化を示すグラフである。
【図５】実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルについて経内皮電気抵抗値の測定結果を比較したグラフである。
【図６】実施例４で示した方法で作製した７種類の共培養モデルにおけるタイトジャンクション構成タンパク質（ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ−５、ＺＯ−１）の発現を示す写真である。
【図７】虚血再灌流モデルにおける電気抵抗値を示すグラフである。
【図８】共培養により虚血再灌流障害（電気抵抗値の減少）が増悪したことを示すグラフである。
【図９】共培養により虚血再灌流障害（Ｎａ−Ｆ透過性の増加）が増悪したことを示すグラフである。
【図１０】虚血再灌流ＢＢＢモデルにおけるラジカルスカベンジャー・エダラボンの効果を示すグラフである。
【図１１】本発明に係る血液脳関門インヴィトロ・モデルの実施形態の概略図である。
【符号の説明】
【００５１】
１ ハンガー
２ フィルター
２ａ 穴
３ 容器
４ 培養液
１０ 血管腔側
２０ 脳実質側
Ｅ 脳毛細血管内皮細胞
Ｐ ペリサイト
Ａ アストロサイト
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液と、当該培養液を保持するプレートと、当該培養液に浸漬し、かつ、当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、からなる立体培養装置を用い、
当該フィルターが直径０．３５〜０．４５μｍの穴を多数有し、当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイトを播き、当該プレートの内面に初代培養アストロサイトを播き、通常の培養液で共培養してなる、血液脳関門インヴィトロ・モデル。
【請求項２】
培養液と、当該培養液を保持するプレートと、当該培養液に浸漬し、かつ、当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、からなる立体培養装置を用い、
当該フィルターが直径０．３５〜０．４５μｍの穴を多数有し、当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイトを播き、当該プレートの内面に初代培養アストロサイトを播き、所定の病態条件に対応する培養液で共培養してなる、病態血液脳関門インヴィトロ・モデル。
【請求項３】
請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルを用い、フィルターの上方部に薬物を添加し、一定時間後に、当該フィルターの下方部に漏れ出た、当該薬物の量を測定して行う、薬物の血液脳関門通過容易性評価方法。
【請求項４】
請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルを用い、フィルターの上方部に薬物を添加し、一定時間後に、脳毛細血管内皮細胞を採取し、当該薬物添加後の脳毛細血管内皮細胞の性質を評価し、添加前の脳毛細血管内皮細胞の性質と比較して行う、薬物のスクリーニング評価方法。
【請求項５】
請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門の病態解析方法。
【請求項６】
請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門における薬物の反応性評価方法。
【請求項７】
請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門における薬物の脳移行性評価方法。
【請求項１】
培養液と、当該培養液を保持するプレートと、当該培養液に浸漬し、かつ、当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、からなる立体培養装置を用い、
当該フィルターが直径０．３５〜０．４５μｍの穴を多数有し、当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイトを播き、当該プレートの内面に初代培養アストロサイトを播き、通常の培養液で共培養してなる、血液脳関門インヴィトロ・モデル。
【請求項２】
培養液と、当該培養液を保持するプレートと、当該培養液に浸漬し、かつ、当該プレートの底面に接触しないで配置されたフィルターと、からなる立体培養装置を用い、
当該フィルターが直径０．３５〜０．４５μｍの穴を多数有し、当該フィルターの上面に初代培養脳毛細血管内皮細胞を播き、当該フィルターの下面に初代培養脳ペリサイトを播き、当該プレートの内面に初代培養アストロサイトを播き、所定の病態条件に対応する培養液で共培養してなる、病態血液脳関門インヴィトロ・モデル。
【請求項３】
請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルを用い、フィルターの上方部に薬物を添加し、一定時間後に、当該フィルターの下方部に漏れ出た、当該薬物の量を測定して行う、薬物の血液脳関門通過容易性評価方法。
【請求項４】
請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルを用い、フィルターの上方部に薬物を添加し、一定時間後に、脳毛細血管内皮細胞を採取し、当該薬物添加後の脳毛細血管内皮細胞の性質を評価し、添加前の脳毛細血管内皮細胞の性質と比較して行う、薬物のスクリーニング評価方法。
【請求項５】
請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門の病態解析方法。
【請求項６】
請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門における薬物の反応性評価方法。
【請求項７】
請求項２に記載の病態血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトを、それぞれ、請求項１に記載の血液脳関門インヴィトロ・モデルにおける培養脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイト、及びアストロサイトと比較して行う、病態血液脳関門における薬物の脳移行性評価方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図６】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図６】
【公開番号】特開２００７−１６６９１５（Ｐ２００７−１６６９１５Ａ）
【公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３６４６３６（Ｐ２００５−３６４６３６）
【出願日】平成１７年１２月１９日（２００５．１２．１９）
【出願人】（５０５４６７８１２）
【出願人】（３０５０１４８３６）ファーマコセル株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１９日（２００５．１２．１９）
【出願人】（５０５４６７８１２）
【出願人】（３０５０１４８３６）ファーマコセル株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
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