血清高比重リボタンパク質を増加させるための方法及び技術
本発明は、血清高比重リボタンパクを増加させるとともに血清高比重リボタンパクが備えるコレステロールの組織への蓄積を妨げる効果を強化するための革新的な技術に関する。本発明はまたエンブリカ・オフィシナリスから、成分調整された効果的な植物ステロールを抽出する段階と、該抽出された植物ステロールを摂取可能な顆粒として提供する段階からなることを特徴とする環境にかける負荷の小さい方法を提供する。コレステロール蓄積に対する本発明の効果は請求項６乃至８記載の方法により実現される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの血清高比重リポタンパク質（Serum High Density Liboprotein、ＨＤＬ）の向上及び、動脈壁の内中膜複合体厚の調節に関する。また本発明は特に、アテローム性動脈硬化を効果的に抑制する目的での、エンブリカ・オフィシナリスの調整された抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンブリカ・オフィシナリス・ガエルトゥン（Emblica officinalis Gaertn.）（ヒンズー語でアムラ（amla））（トウダイグサ科）は、小規模な属であるエンブリカ（Emblica）属に属している。エンブリカ属は、インド、スリランカ、マレー半島、及び中国に自生している植物である。アムラの果実はアーユルヴェーダのラサヤナ（rasayana）（滋養強壮剤、生物学的反応修飾物質）としてよく知られている。アムラの果実は、多数の疾病及び衰弱状態に用いられる。「アーユルヴェーダ(Ayurveda)」の文献には、アムラの果実、果汁、或いは抽出物の心臓疾患の治療における使用についての記述がある。この場合、アムラの果実、果汁、或いは抽出物は、単独で、或いは他の植物と用いられる。アムラは看護婦（dhatri）と呼ばれている。これは、アムラの癒し効果が、看護婦や母親と似ているためである。古代のアーユルヴェーダの医者であるチャラク（Charak）は、アムラは老化防止に最もよい果物であると述べている。アムラは体の細胞及び組織を若返らせるとともに、体の全ての器官を強化する。このことは、スカンダ・プラナ（Skanda purana）、ガルンダプラナGarudapurana）、及び偉大な劇作家であるカリダス（Kalidas）の戯曲にも記述されている。チュヤバンプラシュ（Chyavanprash）、トリパラ（Triphala）、ダトリ・ラサヤナ（Dhatri Rasayan）などを用いたいくつかのアーユルヴェーダの調合物がある。
【０００３】
（食用）
アムラは、多肉質、丸型、薄緑色の果実で、その食味には、酸味と渋みがある。また、アムラは、生で、加熱調理して、或いはピクルスにして食される。アムラは、インドにおいて、数千年間、ピクルス、ジャム、スパリ（supari）、チャツネ、及びアリシュタ（arishta）（ワインに似た飲料）のような食飲料に用いられてきた。アムラはまた薬用にも用いられてきた。アムラは、1,3,6トリガロイル・グルコース、コリラジン、ターチェビン（terchebin）、などを含む。この果実を詳細に調査したところ、以下のような４つの成分が発見された。すなわち、エンブリカニン−Ａ（Emblicannin-A）、エンブリカニン−Ｂ（Emblicannin-B）、プニグルコニン（Punigluconin）、及びペダンクラジン（Pedunclagin）である。エンブリカニン−Ａとは、2,3 ジガロリル-4,6-(s)ヘキサヒドロキシ ジフェノール2 ケト グルコノ ラクトン (1)であり、組成物（B）であるエンブリカニン−Ｂは、2,3,4,6ビス-(s)-ヒドロキシ フェノール 2 ケト グルコン ラクトンである。微量成分としては、2,3,0 ガロリル ヘキサヒドロキシ ジフェノール グルコン酸及びペダンクラジンが挙げられる。ペダンクラジンとは、2,3,4,6ビス(s)ヘキサヒドロキシ ジフェノール D−グルコースである。
【０００４】
アテローム性動脈硬化は、進行性の疾患であり、冠動脈疾患（coronary artery disease、ＣＡＤ）や心臓発作を招く。血中コレステロール、特に低比重リポタンパク質（Low Density Lipoprotein）（ＬＤＬコレステロール）の増加と、高比重リポタンパク質（ＨＤＬコレステロール）の減少は、ＣＡＤを進行させる主たる要因である。血中コレステロール値はアテローム性動脈硬化の進行において極めて重要な役割を果たす。ＨＤＬが増加すると、アテローム性動脈硬化が効果的に抑制および改善される。ＨＤＬは、コレステロール逆転送により、体内のコレステロールおよび血管壁のコレステロールを除去する。ＨＤＬはまた、内皮細胞をＬＤＬが引き起こす損傷より保護する。ＨＤＬが動脈壁からアテローム性動脈硬化を除去したり、蓄積したコレステロールを除去したりするには、ＨＤＬが血中に適切な量（総コレステロール量の約２０％）含有される必要がある。諸研究によると、ＨＤＬ値は、ＣＡＤの発生と反比例する。英国での糖尿病治療に関する多施設大規模臨床研究（United Kingdom Prospective Diabetic Studies, ＵＫＰＤＳ）の基本データによって、ＨＤＬの減少とＬＤＬの増加の両方がＣＡＤの原因となることが示された。第二次米国コレステロール教育プログラム成人教育パネル（National Cholesterol Education Program（ＮＣＥＰ） Adult Treatment Panel II）によると、ＨＤＬコレステロール値が３５mg/dlを下回ると単独でＣＡＤの危険因子となり、６０mg/dlを上回るとＣＡＤを防止するとされている。
【０００５】
ＷＨＯは、アテローム性動脈硬化を、脂質、複合糖質、血液並びに血液製品、線維性組織及びカルシウム沈着物が局所的に蓄積して、血管内壁に変化を与えることと定義している。アテローム性動脈硬化には様々な要因があるとされているが、医学的続発症を引き起こす場合には、それら要因は、患部である動脈の内膜内部で、広範囲にわたって平滑筋の増殖が起こることである。アテローム性動脈硬化として、例えば、脂質がコレステロール・エステルとして及び遊離コレステロールとして、細胞内や周辺の結合組織内で蓄積することが挙げられる。
【０００６】
アテローム性動脈硬化は、アテローム、アテロームプラーク（粥状硬化斑）、或いは繊維性脂質性プラークと呼ばれる内膜組織を特徴とする。アテローム、アテロームプラーク、或いは繊維性脂質性プラークは、血管腔内に突出して血流を妨げるとともに、中膜を脆弱化させる。また重大な合併症を招くこともある。冠状動脈疾患はアテローム性動脈硬化が引き起こす疾患のうちで重大な疾患であるため、アテローム性動脈硬化についての疫学的データは通常、虚血性心疾患（ischemic heart disease、ＩＨＤ）による死亡数との関連において示される。実際、心筋梗塞だけで、米国の全ての死亡数の２０％から２５％の原因となっている。
【０００７】
アテローム性動脈硬化は初期において、弾性動脈（大動脈、頚動脈、及び腸骨動脈）を冒す。症候性のアテローム性動脈硬化疾患は大抵の場合、心臓、脳、腎臓、及び下肢の動脈を冒す。アテローム性動脈硬化は、主に、心筋梗塞（心臓発作）、脳梗塞（脳卒中）、大動脈瘤、及び末梢血管疾患（下肢の壊疽）に至る。小さな動脈では、アテロームは管腔を塞いで、末梢器官への血流を損なうこともある。これは虚血性損傷を招く。加えて、アテローム性動脈硬化によるプラークが破裂して血栓を沈着させ、この血栓が更に血流を妨げることもある。大きな動脈においては、プラークは破壊的性質を有する。大きな動脈では、プラークは下層である中膜を冒して、患部の血管壁を脆弱化させる。すなわち、プラークは、動脈瘤を引き起こしたり、中膜の破裂を引き起こしたりする。更に、広範囲にわたるアテロームは砕けやすく、しばしば末端の血管に塞栓を引き起こす。
【０００８】
平滑筋細胞の増殖は、酸化ＬＤＬの増加により引き起こされる。高脂血症やその他の要因による慢性的な血管壁内皮の損傷は、内皮の機能異常を引き起こす。これは結果としてＬＤＬの血管壁内への蓄積を引き起こす。ＬＤＬはその後酸化する。酸化したＬＤＬは、マクロファージ掃除屋レセプターＳＲ−ＡやＣＤ３６によって取り込まれ、泡沫細胞を形成するに至る。泡状細胞は初期のアテローマ性動脈硬化賞の病的組織変化の主な原因のひとつである。
【０００９】
【非特許文献１】Method of inhibiting Platelet aggregation（著者：Shibnath Ghosal 出版日：2000年9月21日）
【非特許文献２】Serum cholesterol level and amla(Emblica officinalis, Gaertn.)（著者：Mishra. M et.al 出版社：A preliminary report. Proceedings of World Congress on Coronary Heart Disease. 6th-8th April p.3 出版日：1984年）
【非特許文献３】Medicinal plants of India（著者： G.V Satyavati, M.K Raina & Sharma 出版社：Indian Council of Medical Research, New Delhi, Vol.1, 377. 出版日：1976年）
【非特許文献４】The Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial Results. Reduction in incidence of coronary heart disease JAMA（出版社：Preliminary report Proceedings of world Congress on Coronary Heart disease, 251:351-364 出版日：1984年）
【非特許文献５】Report of the National Cholesterol Education Program: Expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholesterol in adults. Arch. Intern. Med. 148:36 （出版日：1988年）
【非特許文献６】Arb. Med. Soz. Med. Prav. Med. 10,25（著者：Schettler et al 出版日：1975年）
【非特許文献７】W.W., J Bacteriol（著者：Koditschek, et al, 68, 1063-1068 出版日：1969年）
【非特許文献８】Effect of the Indian Gooseberry (Amla) on serum cholesterol levels in men aged 35-55 years（著者：Annu Jacob et. Al 雑誌名：European .J. Clinical Nutrition, 42, 939-944 出版日：1988）
【非特許文献９】Egg protein and defatted soya protein on cholesterol induced hypercholesterolemia and atherosclerosis in rabbits（著者：Thakur and Majid 雑誌名： IJMR, 75, 862-867 出版日：1982）
【非特許文献１０】Helsinki heart study: primary-prevention trial with gemfibrozil in middle-aged men with dyslipidemia. Safety of treatment changes in risk factors, and incidence of coronary heart disease（著者：Frick MH et. al. Volume 317:1237-1245. Number 20 出版日：1987年11月12日）
【非特許文献１１】Robbins: Basic pathology 7th edition. （出版社：Saunders company 出版日：2003年）
【非特許文献１２】: A Textbook of Biochemistry. （著者：D.M. Vasudevan Sreekumari出版社：Jaypee Brothers 出版日： 2001年）
【非特許文献１３】Ischaemic heart disease, artherosclerosis and longevity（著者：Gofman, J.W., Young, W. & Tandy, R. 雑誌名：Circulation 34,p679 出版日：1966)
【非特許文献１４】Randomised trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease: the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S) Cardiology Section, Medical Department, Aker Hospital, N 0514 Oslo. Norway（著者：Dr. Terje R Pedersen 雑誌名： Lancet ;344:1383-89 出版日：1994年）
【非特許文献１５】Sharma P.V Dravyaguna vijnana （出版社：Chaukhambha Sanskrit Sansthan, Varansasi 出版日：1978年）
【非特許文献１６】Active constituents of E.officinalis: Part I The Chemistry and antioxidative effects of two new hydrolysable tannins. Ind（著者：Shibnath G .et. al 雑誌名： J. Chemistry Vol.35 B P.941-948. 出版日：1996年9月）
【非特許文献１７】Effects of oral and intracecal pectin administration on blood lipids in guinea pigs （著者：Abrens, H et al 雑誌名：J. Nutr. 116, p70-76 出版日：1986年）
【非特許文献１８】Framingham Diet Study. Diet and regulation of serum cholesterol（著者：Gordon T 発行者：U.S. Dept. of Health Education and welfare 出版日：1970年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
脂質沈着物（プラークと呼ばれる）の存在は、血管の弾性喪失及び狭窄を招く。この結果、血流が制限され、究極的には器官に血液が供給されなくなる。血塊が心臓に血液を供給する動脈に詰まると心臓発作を起こし、脳に血液を供給する動脈に詰まると卒中を起こす。飽和脂肪酸、コレステロール、及びカロリーに富む食事は、血中コレステロール値が上昇する主たる要因であると考えられる。また、このような食事は動脈硬化を進行させると考えられる。しかしながら、コレステロールを運搬するリポタンパク質の種類がコレステロールのプラークを形成する傾向に影響を与える。低比重リポタンパク質は明らかにアテロームの発生原因であるが、高比重リポタンパク質はコレステロールの組織内での蓄積を防止すると考えられる。これらリポタンパク質の血中濃度は、部分的にではあるが、食事要因（特に摂取された野菜の種類）に左右される。このことは、このような健康問題に対しての、植物の薬用としての価値及び栄養的価値の重要性を示している。このことが、どのような過程によるかは、複雑で、いまだ解決されていない。植物は、コレステロール吸収の均衡を保つのに役立つ。コレステロールの吸収は、脂質の代謝及び血液の化学成分に、実質的に一体的に影響を及ぼす。この問題について医学的研究が行われた結果、多くの一般的食事成分が血中コレステロール値を低減することが解明されている。しかしながら、これら食事成分がいかにしてコレステロール値を低減するかについては必ずしも明らかではない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、血清高比重リボタンパク質を増加させ、該血清高比重リボタンパク質が備えるコレステロールの組織への蓄積を妨げる能力を強化するための方法及び技術を提供する。この技術及び方法、並びに本発明のその他の目的及び特徴は、以下の詳細な発明の説明により明らかにされる。
【００１２】
本発明は、エンブリカ・オフィシナリスから、成分調整された有効な植物ステロールを抽出する段階と、該抽出された植物ステロールを摂取可能な顆粒及び薬剤として提供する段階からなることを特徴とする環境に負荷をかけず価値工学的な手法並びに方法及び高比重リポタンパク質を増加させるための方法並びに技術を提供する。
【００１３】
本発明は、効能と生体吸収性に優れ、動脈壁の内中膜複合体の肥厚を抑制するとともに該内中膜複合体厚を低減することを特徴とする最良且つ理想的な植物ステロール提供する。
【００１４】
本発明は、３０％から４０％のガロ−エラギタンニンを含有する有効且つ即効性の植物ステロール抽出物を提供することを特徴とする請求項１乃至４記載の最も最適な含有率、及び請求項３記載の抽出物の理想的な服用量であって、該服用量が１０−３０mg／kg／日であることを特徴とする服用量を提供する。
【００１５】
本発明は、有効性及び投与対象に対する効果を失うことなしに、他の植物成分、栄養補助成分、或いは合成成分と混合可能であることを特徴とする理想的且つ調整された抽出物
を提供する。
【００１６】
したがって、本発明の１つの目的は、ヒトの血清ＨＤＬ値を上昇させるための改良された方法を提供することである。血清ＨＤＬ値が上昇すると、ＣＡＤを防止する効果が得られる。
本発明の他の目的は、高コレステロール血症の動物或いはヒトの、動脈壁の内中膜複合体厚を低減するための方法を提供することである。
本発明の他の目的は、高コレステロール血症の動物或いはヒトの、動脈壁の内中膜複合体肥厚を抑制するための方法を提供することである。
本発明の他の特徴は、エンブリカ・オフィシナリス果実の調整された抽出物を、１０から３０mg／kg／日経口服用することにより血清ＨＤＬ値を向上させるとともに内中膜複合体厚を正常な状態に近づけるための方法を提供することである。
本発明の他の特徴は、エンブリカ・オフィシナリス果実の調整された抽出物によって、血清ＨＤＬ値を向上させることにより、副作用を起こすことなくヒトの内中膜複合体厚を正常な状態に近づけることである。
本発明の他の特徴は、調整された抽出物を３５０mgから１０００mg含有する薬剤組成物を提供することである。これらの目的並びに特徴、及び本発明の他の目的並びに特徴は、以下の詳細な説明により明らかにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明ではまず、洗浄の後、破砕して種を除いたエンブリカ・オフィシナリス果実の水アルコール混合液（３０％から６０％のアルコール）による抽出を行った。抽出は、３回から４回行われた。これらの抽出での抽出物は、混合された後、一定条件下で濾過膜を用いて濾過（逆浸透）された。その結果全固形分が２５％から３０％の濃縮液が得られた。この濃縮液は、ＡＴＦＤ（Agitated Thin Film Dryer）を用いて、一定条件下で乾燥された。その結果３０％から４５％のポリフェノール（エラギ・タンニン：Ellagi Tannins）を含有する乾燥粉末状抽出物が得られた。この粉末状抽出物は、淡緑色から濃緑色を帯びた茶色で、やや吸湿性を有する。
【００１８】
本発明の組成物は通常、総量の３０％から５０％のポリフェノールを含有するように調整されている。主要成分であるエンブリカニン−Ａは、分子中にほぼ４１．５％の没食子酸を含んでおり、また没食子酸が副次成分であるプニグルコニンを構成するため、抽出物を完全に加水分解した後に得られる没食子酸を基準にして調整すればよいと考えられる。よってこの抽出物は、エンブリカニン−Ａを主要成分とする。抽出物をＨＰＴＬＣ分析にかけた結果、該抽出物が上述の成分に対応する３つのスポットを有することが確認された。
【００１９】
本発明による、血清高比重リポタンパク（ＨＤＬ）を増加させ、ヒト及び動物の動脈壁の内中膜複合体厚を調節する物質は、エンブリカ・オフィシナリスの果実から抽出される調整抽出物（以下REDUCEROL（登録商標）という）である。
【００２０】
エンブリカ・オフィシナリスの調整された抽出物は、付属の図面に従って製造される。付属の図面は抽出工程を、簡略に示したものである。この抽出工程は、生の粉砕されたエンブリカ・オフィシナリスの果実を水アルコール抽出並びにろ過する段階を含む。
【００２１】
以下に示す研究は血中の血清ＨＤＬ値を上昇させる抽出物について実施された。研究内容としては、動物実験並びに人体での研究が行われた。また、急性毒性試験が、急性毒性及び亜急性毒性について行われた。以上のような長年にわたる研究によって、次のようなことが見出された。
【００２２】
（毒性実験）
（例１：急性毒性）
この実験では、体重20−25gの健康な白ハツカネズミの雄または雌を使用した。餌と水を備えた清潔なポリプロピレンのケージに、これらのネズミを収容した。実験開始一週間後、ネズミの体重を測定し、6匹ずつ8つのグループに分けた。グループAをコントロール・グループとし、残りの7つのグループを実験用グループとした。一夜絶食させた後、実験用グループB、C、D、E、F、G、Hのネズミには、200mg/kg、400mg/kg、600mg/kg、800mg/kg、2.5g/kg、5g/kg、10g/kgのREDUCEROL（登録商標）抽出物をそれぞれ経口投与した。また、グループAには、0.25mlのコントロール溶液を与えた。これらのネズミを継続的に6時間観察し、72時間死亡率を記録した。
【００２３】
（実験結果）
10g/kg以下のREDUCEROL（登録商標）の投与では、運動の増加、震え、間代性痙攣、立毛、筋肉の痙攣、触覚過敏、運動失調、鎮静、催眠、痛覚欠如などの副作用は現れず、最初の72時間中に死亡も確認されなかった。
【００２４】
（例２：亜急性毒性）
本実験では、体重200−250gの健康な雄のSprague-Dawlyラットを使用した。餌と水を備えた清潔なポリプロピレンのケージに、これらのラットを収容した。実験開始2週間後、ラットの体重を測定し、赤血球、白血球、ヘモグロビン、リンパ球数を測定するために、EDTAチューブを用いて尾静脈から血液サンプルを採取した。尚、血糖値は、還元方法によって測定した。これらのラットを6匹ずつ５つのグループに分け、グループAをコントロール・グループとし、残り4つのグループを実験用グループとした。グループAでは、ラットの体重250gに対し、2mlのコントロール溶液を経口投与し、グループB、C、D、Eのラットには、100mg/kg、500mg/kg、1ｇ/kg、2g/kgのREDUCEROL（登録商標）抽出物をそれぞれ3ヶ月間与えた。
【００２５】
25％のREDUCEROL（登録商標）抽出物（原液）を、15ｇのイソトレチノイン（sorbitrate）と10ｇのプロピレングリコールの混合物に調合した。尚、REDUCEROL（登録商標）抽出物は非水溶性である。また、25％のコントロール溶液をコントロール・グループに投与した。体重測定を毎週行った。実験開始3ヵ月後、赤血球、白血球、リンパ球、ヘモグロビン、そして血清を検査するために、EDTAチューブを用いて採血を行った。尚、該血清は、アミノトランフェラーゼ（SGOT、 SGPT）、アルカリホスファターゼ（Alkaline Phosphatases, ALP）、血清総コレステロール、血清総たんぱく質および血糖を測定するために分離された。実験後、全てのラットを解剖したが、肉眼検査では異常は見られなかった。また、それぞれの臓器の重さを記録した。尚、コレステロール値を測定するために、肝臓の一部と心臓を均質化（ホモジナイズ、homogenize）した。
【００２６】
（実験結果）
全ての５つの実験用グループにおいて、ラットの体重は増加した。グループA、B、C、D、 Eにおける体重増加の割合は、それぞれ34%、42%、28%、49%、24% であった。表１で記載しているように、コントロール・グループ、実験用グループともに、赤血球、白血球、リンパ球、ヘモグロビンの数値は正常範囲内であった。尚、グループCでは、赤血球の増加が見られた（表２）。また、白血球の増加はグループCにて8% 、グループDにて19%、グループEにて 6%の増加が観測された（表２）。表２に記載しているように、リンパ球の増加は全ての実験グループで見られた。（グループB にて1%、グループCにて12%、グループDにて2%、グループEにて7 %増加した。）
【００２７】
実験開始3ヵ月後の実験グループの血糖値はベースライン値よりも低かった（表４）。また、酵素の解析結果において、実験用グループ、コントロール・グループともに、酵素の数値は正常範囲内であった（表３）。また、グループC、D、Eにおける血清コレステロール値、肝臓コレステロール値および心臓コレステロール値は比較的低かった（表５）。
【００２８】
（表１）
実験に用いた動物の体重
【００２９】
（表２）
ヘモグラム
【００３０】
（表３）
肝機能テスト
【００３１】
（表４）
血糖値
【００３２】
（表５）
総コレステロール
【００３３】
グループAには2mlのコントロール溶液、グループBには100mg/kgのREDUCEROL（登録商標）、グループCには500ml/kgのREDUCEROL（登録商標）、グループDには1g/kgのREDUCEROL（登録商標）、グループEには2g/kgのREDUCEROL（登録商標）を投与した。
【００３４】
（高コレステロール血症の動物を用いた実験）
（例３）
体重約2kgの雄のニュージーランド・ホワイト・ウサギを6匹ずつ４つのグループに分けた。グループBのウサギには、コレステロール結晶性粉末を100mg/kg経口投与し、高コレステロール血症にさせた。同時にグループCのウサギには本発明の抽出物10mg/kgを、グループDのウサギには同抽出物25mgを投与した。尚、グループAのウサギを標準対照とし、グループBのウサギを高コレステロール対照とした。実験は6ヶ月にわたり行われた。高比重リポタンパク質の解析は高比重リポタンパク質（CHOD-RAP）の酵素測定により実施された。高コレステロール血症は、コレステロール結晶性粉末により誘発された（Takur とMajidの研究論文（IJMR, 75, p862-867, 1982年）に記載の方法による）。
【００３５】
（実験結果）
脂質プロフィールは、本発明の抽出物を10mg/kgおよび 25mg/kgを経口投与することにより、全体のコレステロール値を69−73％、低比重リポ・タンパク・コレステロールを78%、トリグリセリドを53-56%減少させた。グループBの高比重リポタンパク質コレステロールと比較すると、実験用グループのそれは28−33％増加した（表６−１０）。
【００３６】
（表６）
様々な服用量のREDUCEROL（登録商標）を与えられたウサギにおける血清コレステロール低減効果
【００３７】
（表７）
REDUCEROLを与えた動物のHDL値(HDL-mg/dl)
【００３８】
（表８）
REDUCEROLを与えた動物のLDLの低下効果(LDL-mg/dl)
【００３９】
（表９）
REDUCEROL(登録商標)を与えた動物のトリグリセリド値(トリグリセリド-mg/dl)
*p<0.01、**p<0.05
【００４０】
（表１０）
ウサギの脂質プロフィールに対するReducerol（登録商標）の効果
【００４１】
動脈硬化指数は、式（LDL+VLDL（超低比重リポタンパク）/HDL）で求められる。尚、本発明において、本発明の抽出物を投与しなかったコントロール・グループと比べると、動脈硬化指数は80−81％減少した。
【００４２】
（高コレステロール血症の患者に対する実験）
（例４）
この実験では、年齢30歳から60歳の男性または女性の高コレステロール血症患者（TC＞240、 LDL＞130）を対象とした。尚、心臓弁膜症、鬱血性心臓麻痺、糖尿病等の患者は、本実験の対象から除外した。合計70人の患者が本実験に参加した。20人のコントロール・グループと50人のトリートメント・グループに分け、食事制限を行い観察した。トリートメント・グループの患者には、本発明の抽出物を含んだ硬カプセルを朝夕2カプセル投与した。コントロール・グループには、食事制限のみ行った。尚、抽出物を投与する前に、全体的な脂質プロフィール（絶食）とヘモグラムを測定した。これらの患者は、上記パラメータについて毎月測定を受けた。尚、倫理委員会は本実験計画を承認し、書面による同意書は実験開始前に提出された。
【００４３】
（実験結果）
Reducerol（登録商標）により、総コレステロールの血漿中濃度は17％、低比重リポ・タンパク・コレステロールは22％、トリグリセリドは24％減少した。しかし、実験開始3ヶ月後、高比重リポ・タンパク・コレステロールは24％増加した（表１１、図２−６）。ヘモグラムの解析結果によって、赤血球およびリンパ球が4%、 ヘモグロビンが3%、白血球が1％増加したことが分かった。（表１２、図１２−１０）実験開始後3ヵ月後、トリートメント・グループの動脈硬化指数は37％減少した。
【００４４】
（動脈壁の内中膜複合体厚の低減）
（例５）
体重1.4−1.6kgの雄のニュージーランド・ホワイト・ラビットを2つのグループに分けた。グループAをコントロール・グループとした。もう1つのグループのウサギには、3ヶ月間コレステロール結晶性粉末100mg/kg投与し、高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化を誘発させた（Takur & Majidの方法による）。コレステロール結晶性粉末を投与したグループを更に2つのグループに分け、そのうち1つのグループをグループBとし、本発明の抽出物を投与しないコントロール・グループとした。また、もう一方のグループをグループCとし、一日あたり10mg/kgのReducerola を3ヶ月間投与した。実験開始から3ヵ月後、3つのグループ全てのウサギは解剖され、それらの組織は、組織学的に研究された。高コレステロール血症ウサギの大動脈条片における組織検査では、平滑筋細胞（Smooth muscle cell, SMC）増殖、脂肪変化、脂肪浸潤および泡沫細胞の形成と共に生じる平滑筋細胞の初期肥厚が現れた。しかし、Reducerolaを投与したグループのウサギの動脈条片においては、内中膜複合体厚の明らかな減少が見られ、動脈壁は正常であった。
【００４５】
（動脈壁の内中膜複合体肥厚の抑制）
（例６）
体重約2kgの雄のニュージーランド・ホワイト・ラビットを6匹ずつ4つのグループに分けた。100mg/kgのコレステロール結晶性粉末をTakur & Majidによる方法によって経口投与し、高コレステロール血症にさせた。同時にグループCに、25mg/kgのReducerol（登録商標）を投与し、このグループをグループCとした。グループAを標準対照とし、グループBを高コレステロール対照とした。実験が行われる前に脂質プロフィールを分析し、6ヶ月間に渡って毎月分析を行った。
【００４６】
実験が終了した6ヵ月後、全てのウサギは解剖された。高コレステロールウサギの動脈条片における組織検査では、コントロール・グループのそれと比べて内中膜複合体厚の増加や脂肪変化が見られた。また、一日25g/kgのReducerolaを同時投与することにより、これらの変化は妨げられ、血管腔はコントロール・グループ同様正常であった。
【００４７】
REDUCEROL（登録商標）によるコレステロール値の低下のメカニズムは、亜急性毒性実験とともに、シロネズミを用いて研究された。尚、3ヶ月間の処置後、HMG-CoA還元酵素を用いて測定するために、解剖されたネズミの肝臓の一部を均質化した。該還元酵素は、コレステロール合成における主要酵素である。グループB、C、D、EのHMG-CoA還元酵素は、コントロール・グループに比べて低かった。（表４）
【００４８】
（表１１）
トリートメント・グループ及びコントロール・グループの脂質プロフィール
【００４９】
（表１２）
トリートメント・グループ及びコントロール・グループのヘモグラム
【００５０】
上記非特許文献は以下のごとくである。
・ Shibnath Ghosal: Method of inhibiting Platelet aggregation September 21, 2000.
・ Mishra. M et.al. Serum cholesterol level and amla (Emblica officinalis, Gaertn.) A preliminary report. Proceedings of World Congress on Coronary Heart Disease. 6th-8th April, p.3, 1984
・ Medicinal plants of India, Vol.1, edited by G.V Satyavati, M.K Raina & Sharma (Indian Council of Medical Research, New Delhi) 1976, 377.
・ The Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial Results. Reduction in incidence of coronary heart disease JAMA 251:351-364 (1984) Preliminary report Proceedings of world Congress on Coronary Heart disease
・ Report of the National Cholesterol Education Program: Expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholesterol in adults. Arch. Intern. Med.1988, 148:36
・ Schettler et al Arb. Med. Soz. Med. Prav. Med. 10,25 (1975)
・ Koditschek, et al W.W., J Bacteriol. 68, 1063-1068 (1969)
・ Annu Jacob et. Al. Effect of the Indian Gooseberry (Amla) on serum
cholesterol levels in men aged 35-55 years. European .J. Clinical Nutrition, 42, 939-944, 1988
・ Thakur and Majid: Egg protein and defatted soya protein on
cholesterol induced hypercholesterolemia and atherosclerosis in rabbits, IJMR,
75, 862-867 (1982)
・ Frick MH et. al. Helsinki heart study: primary-prevention trial with
gemfibrozil in middle-aged men with dyslipidemia. Safety of treatment changes
in risk factors, and incidence of coronary heart disease. Volume 317:1237-1245. November 12, 1987. Number 20
・ Robbins: Basic pathology 7th edition. Saunders company. 2003
・ D.M. Vasudevan Sreekumari: A Textbook of Biochemistry. Jaypee Brothers, 2001.
・ Gofman, J.W., Young, W. & Tandy, R. (1966): Ischaemic heart disease, artherosclerosis and longevity. Circulation 34,679.
・ Dr. Terje R Pedersen, Randomised trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease: the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S). Cardiology Section, Medical Department, Aker Hospital, N 0514 Oslo. Norway. Lancet 1994;344:1383-89
・ Sharma P.V Dravyaguna vijnana (Chaukhambha Sanskrit Sansthan, Varansasi) 1978
・ Shibnath G .et. al: Active constituents of E.officinalis: Part I The Chemistry and antioxidative effects of two new hydrolysable tannins. Ind. J. Chemistry Vol.35 B Sept, 1996, P.941-948.
・ Abrens, H et al (1986): Effects of oral and intracecal pectin administration on blood lipids in guinea pigs. J. Nutr. 116, 70-76
Gordon T: Framingham Diet Study. Diet and regulation of serum cholesterol. U.S. Dept. of Health Education and welfare. 1970.
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物がコレステロールを低減するときの考えられる作用メカニズムを表す。
【図２】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの血中ＨＤＬコレステロール値変化の経過を表すグラフである。
【図３】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの血中総コレステロール値変化の経過を表すグラフである。
【図４】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの血中ＬＤＬコレステロール値変化の経過を表すグラフである。
【図５】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの血中ＶＬＤＬコレステロール値変化の経過を表すグラフである。
【図６】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの血清トリグリセリド値変化の経過を表すグラフである。
【図７】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの白血球値変化の経過を表すグラフである。
【図８】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの赤血球値変化の経過を表すグラフである。
【図９】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれのリンパ球値変化の経過を表すグラフである。
【図１０】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれのヘモグロビン値変化の経過を表すグラフである。
【図１１】本発明によるエンブリカ・オフィシナリスの調整された抽出物を抽出する工程を簡略に示すフローチャートである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの血清高比重リポタンパク質（Serum High Density Liboprotein、ＨＤＬ）の向上及び、動脈壁の内中膜複合体厚の調節に関する。また本発明は特に、アテローム性動脈硬化を効果的に抑制する目的での、エンブリカ・オフィシナリスの調整された抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンブリカ・オフィシナリス・ガエルトゥン（Emblica officinalis Gaertn.）（ヒンズー語でアムラ（amla））（トウダイグサ科）は、小規模な属であるエンブリカ（Emblica）属に属している。エンブリカ属は、インド、スリランカ、マレー半島、及び中国に自生している植物である。アムラの果実はアーユルヴェーダのラサヤナ（rasayana）（滋養強壮剤、生物学的反応修飾物質）としてよく知られている。アムラの果実は、多数の疾病及び衰弱状態に用いられる。「アーユルヴェーダ(Ayurveda)」の文献には、アムラの果実、果汁、或いは抽出物の心臓疾患の治療における使用についての記述がある。この場合、アムラの果実、果汁、或いは抽出物は、単独で、或いは他の植物と用いられる。アムラは看護婦（dhatri）と呼ばれている。これは、アムラの癒し効果が、看護婦や母親と似ているためである。古代のアーユルヴェーダの医者であるチャラク（Charak）は、アムラは老化防止に最もよい果物であると述べている。アムラは体の細胞及び組織を若返らせるとともに、体の全ての器官を強化する。このことは、スカンダ・プラナ（Skanda purana）、ガルンダプラナGarudapurana）、及び偉大な劇作家であるカリダス（Kalidas）の戯曲にも記述されている。チュヤバンプラシュ（Chyavanprash）、トリパラ（Triphala）、ダトリ・ラサヤナ（Dhatri Rasayan）などを用いたいくつかのアーユルヴェーダの調合物がある。
【０００３】
（食用）
アムラは、多肉質、丸型、薄緑色の果実で、その食味には、酸味と渋みがある。また、アムラは、生で、加熱調理して、或いはピクルスにして食される。アムラは、インドにおいて、数千年間、ピクルス、ジャム、スパリ（supari）、チャツネ、及びアリシュタ（arishta）（ワインに似た飲料）のような食飲料に用いられてきた。アムラはまた薬用にも用いられてきた。アムラは、1,3,6トリガロイル・グルコース、コリラジン、ターチェビン（terchebin）、などを含む。この果実を詳細に調査したところ、以下のような４つの成分が発見された。すなわち、エンブリカニン−Ａ（Emblicannin-A）、エンブリカニン−Ｂ（Emblicannin-B）、プニグルコニン（Punigluconin）、及びペダンクラジン（Pedunclagin）である。エンブリカニン−Ａとは、2,3 ジガロリル-4,6-(s)ヘキサヒドロキシ ジフェノール2 ケト グルコノ ラクトン (1)であり、組成物（B）であるエンブリカニン−Ｂは、2,3,4,6ビス-(s)-ヒドロキシ フェノール 2 ケト グルコン ラクトンである。微量成分としては、2,3,0 ガロリル ヘキサヒドロキシ ジフェノール グルコン酸及びペダンクラジンが挙げられる。ペダンクラジンとは、2,3,4,6ビス(s)ヘキサヒドロキシ ジフェノール D−グルコースである。
【０００４】
アテローム性動脈硬化は、進行性の疾患であり、冠動脈疾患（coronary artery disease、ＣＡＤ）や心臓発作を招く。血中コレステロール、特に低比重リポタンパク質（Low Density Lipoprotein）（ＬＤＬコレステロール）の増加と、高比重リポタンパク質（ＨＤＬコレステロール）の減少は、ＣＡＤを進行させる主たる要因である。血中コレステロール値はアテローム性動脈硬化の進行において極めて重要な役割を果たす。ＨＤＬが増加すると、アテローム性動脈硬化が効果的に抑制および改善される。ＨＤＬは、コレステロール逆転送により、体内のコレステロールおよび血管壁のコレステロールを除去する。ＨＤＬはまた、内皮細胞をＬＤＬが引き起こす損傷より保護する。ＨＤＬが動脈壁からアテローム性動脈硬化を除去したり、蓄積したコレステロールを除去したりするには、ＨＤＬが血中に適切な量（総コレステロール量の約２０％）含有される必要がある。諸研究によると、ＨＤＬ値は、ＣＡＤの発生と反比例する。英国での糖尿病治療に関する多施設大規模臨床研究（United Kingdom Prospective Diabetic Studies, ＵＫＰＤＳ）の基本データによって、ＨＤＬの減少とＬＤＬの増加の両方がＣＡＤの原因となることが示された。第二次米国コレステロール教育プログラム成人教育パネル（National Cholesterol Education Program（ＮＣＥＰ） Adult Treatment Panel II）によると、ＨＤＬコレステロール値が３５mg/dlを下回ると単独でＣＡＤの危険因子となり、６０mg/dlを上回るとＣＡＤを防止するとされている。
【０００５】
ＷＨＯは、アテローム性動脈硬化を、脂質、複合糖質、血液並びに血液製品、線維性組織及びカルシウム沈着物が局所的に蓄積して、血管内壁に変化を与えることと定義している。アテローム性動脈硬化には様々な要因があるとされているが、医学的続発症を引き起こす場合には、それら要因は、患部である動脈の内膜内部で、広範囲にわたって平滑筋の増殖が起こることである。アテローム性動脈硬化として、例えば、脂質がコレステロール・エステルとして及び遊離コレステロールとして、細胞内や周辺の結合組織内で蓄積することが挙げられる。
【０００６】
アテローム性動脈硬化は、アテローム、アテロームプラーク（粥状硬化斑）、或いは繊維性脂質性プラークと呼ばれる内膜組織を特徴とする。アテローム、アテロームプラーク、或いは繊維性脂質性プラークは、血管腔内に突出して血流を妨げるとともに、中膜を脆弱化させる。また重大な合併症を招くこともある。冠状動脈疾患はアテローム性動脈硬化が引き起こす疾患のうちで重大な疾患であるため、アテローム性動脈硬化についての疫学的データは通常、虚血性心疾患（ischemic heart disease、ＩＨＤ）による死亡数との関連において示される。実際、心筋梗塞だけで、米国の全ての死亡数の２０％から２５％の原因となっている。
【０００７】
アテローム性動脈硬化は初期において、弾性動脈（大動脈、頚動脈、及び腸骨動脈）を冒す。症候性のアテローム性動脈硬化疾患は大抵の場合、心臓、脳、腎臓、及び下肢の動脈を冒す。アテローム性動脈硬化は、主に、心筋梗塞（心臓発作）、脳梗塞（脳卒中）、大動脈瘤、及び末梢血管疾患（下肢の壊疽）に至る。小さな動脈では、アテロームは管腔を塞いで、末梢器官への血流を損なうこともある。これは虚血性損傷を招く。加えて、アテローム性動脈硬化によるプラークが破裂して血栓を沈着させ、この血栓が更に血流を妨げることもある。大きな動脈においては、プラークは破壊的性質を有する。大きな動脈では、プラークは下層である中膜を冒して、患部の血管壁を脆弱化させる。すなわち、プラークは、動脈瘤を引き起こしたり、中膜の破裂を引き起こしたりする。更に、広範囲にわたるアテロームは砕けやすく、しばしば末端の血管に塞栓を引き起こす。
【０００８】
平滑筋細胞の増殖は、酸化ＬＤＬの増加により引き起こされる。高脂血症やその他の要因による慢性的な血管壁内皮の損傷は、内皮の機能異常を引き起こす。これは結果としてＬＤＬの血管壁内への蓄積を引き起こす。ＬＤＬはその後酸化する。酸化したＬＤＬは、マクロファージ掃除屋レセプターＳＲ−ＡやＣＤ３６によって取り込まれ、泡沫細胞を形成するに至る。泡状細胞は初期のアテローマ性動脈硬化賞の病的組織変化の主な原因のひとつである。
【０００９】
【非特許文献１】Method of inhibiting Platelet aggregation（著者：Shibnath Ghosal 出版日：2000年9月21日）
【非特許文献２】Serum cholesterol level and amla(Emblica officinalis, Gaertn.)（著者：Mishra. M et.al 出版社：A preliminary report. Proceedings of World Congress on Coronary Heart Disease. 6th-8th April p.3 出版日：1984年）
【非特許文献３】Medicinal plants of India（著者： G.V Satyavati, M.K Raina & Sharma 出版社：Indian Council of Medical Research, New Delhi, Vol.1, 377. 出版日：1976年）
【非特許文献４】The Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial Results. Reduction in incidence of coronary heart disease JAMA（出版社：Preliminary report Proceedings of world Congress on Coronary Heart disease, 251:351-364 出版日：1984年）
【非特許文献５】Report of the National Cholesterol Education Program: Expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholesterol in adults. Arch. Intern. Med. 148:36 （出版日：1988年）
【非特許文献６】Arb. Med. Soz. Med. Prav. Med. 10,25（著者：Schettler et al 出版日：1975年）
【非特許文献７】W.W., J Bacteriol（著者：Koditschek, et al, 68, 1063-1068 出版日：1969年）
【非特許文献８】Effect of the Indian Gooseberry (Amla) on serum cholesterol levels in men aged 35-55 years（著者：Annu Jacob et. Al 雑誌名：European .J. Clinical Nutrition, 42, 939-944 出版日：1988）
【非特許文献９】Egg protein and defatted soya protein on cholesterol induced hypercholesterolemia and atherosclerosis in rabbits（著者：Thakur and Majid 雑誌名： IJMR, 75, 862-867 出版日：1982）
【非特許文献１０】Helsinki heart study: primary-prevention trial with gemfibrozil in middle-aged men with dyslipidemia. Safety of treatment changes in risk factors, and incidence of coronary heart disease（著者：Frick MH et. al. Volume 317:1237-1245. Number 20 出版日：1987年11月12日）
【非特許文献１１】Robbins: Basic pathology 7th edition. （出版社：Saunders company 出版日：2003年）
【非特許文献１２】: A Textbook of Biochemistry. （著者：D.M. Vasudevan Sreekumari出版社：Jaypee Brothers 出版日： 2001年）
【非特許文献１３】Ischaemic heart disease, artherosclerosis and longevity（著者：Gofman, J.W., Young, W. & Tandy, R. 雑誌名：Circulation 34,p679 出版日：1966)
【非特許文献１４】Randomised trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease: the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S) Cardiology Section, Medical Department, Aker Hospital, N 0514 Oslo. Norway（著者：Dr. Terje R Pedersen 雑誌名： Lancet ;344:1383-89 出版日：1994年）
【非特許文献１５】Sharma P.V Dravyaguna vijnana （出版社：Chaukhambha Sanskrit Sansthan, Varansasi 出版日：1978年）
【非特許文献１６】Active constituents of E.officinalis: Part I The Chemistry and antioxidative effects of two new hydrolysable tannins. Ind（著者：Shibnath G .et. al 雑誌名： J. Chemistry Vol.35 B P.941-948. 出版日：1996年9月）
【非特許文献１７】Effects of oral and intracecal pectin administration on blood lipids in guinea pigs （著者：Abrens, H et al 雑誌名：J. Nutr. 116, p70-76 出版日：1986年）
【非特許文献１８】Framingham Diet Study. Diet and regulation of serum cholesterol（著者：Gordon T 発行者：U.S. Dept. of Health Education and welfare 出版日：1970年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
脂質沈着物（プラークと呼ばれる）の存在は、血管の弾性喪失及び狭窄を招く。この結果、血流が制限され、究極的には器官に血液が供給されなくなる。血塊が心臓に血液を供給する動脈に詰まると心臓発作を起こし、脳に血液を供給する動脈に詰まると卒中を起こす。飽和脂肪酸、コレステロール、及びカロリーに富む食事は、血中コレステロール値が上昇する主たる要因であると考えられる。また、このような食事は動脈硬化を進行させると考えられる。しかしながら、コレステロールを運搬するリポタンパク質の種類がコレステロールのプラークを形成する傾向に影響を与える。低比重リポタンパク質は明らかにアテロームの発生原因であるが、高比重リポタンパク質はコレステロールの組織内での蓄積を防止すると考えられる。これらリポタンパク質の血中濃度は、部分的にではあるが、食事要因（特に摂取された野菜の種類）に左右される。このことは、このような健康問題に対しての、植物の薬用としての価値及び栄養的価値の重要性を示している。このことが、どのような過程によるかは、複雑で、いまだ解決されていない。植物は、コレステロール吸収の均衡を保つのに役立つ。コレステロールの吸収は、脂質の代謝及び血液の化学成分に、実質的に一体的に影響を及ぼす。この問題について医学的研究が行われた結果、多くの一般的食事成分が血中コレステロール値を低減することが解明されている。しかしながら、これら食事成分がいかにしてコレステロール値を低減するかについては必ずしも明らかではない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、血清高比重リボタンパク質を増加させ、該血清高比重リボタンパク質が備えるコレステロールの組織への蓄積を妨げる能力を強化するための方法及び技術を提供する。この技術及び方法、並びに本発明のその他の目的及び特徴は、以下の詳細な発明の説明により明らかにされる。
【００１２】
本発明は、エンブリカ・オフィシナリスから、成分調整された有効な植物ステロールを抽出する段階と、該抽出された植物ステロールを摂取可能な顆粒及び薬剤として提供する段階からなることを特徴とする環境に負荷をかけず価値工学的な手法並びに方法及び高比重リポタンパク質を増加させるための方法並びに技術を提供する。
【００１３】
本発明は、効能と生体吸収性に優れ、動脈壁の内中膜複合体の肥厚を抑制するとともに該内中膜複合体厚を低減することを特徴とする最良且つ理想的な植物ステロール提供する。
【００１４】
本発明は、３０％から４０％のガロ−エラギタンニンを含有する有効且つ即効性の植物ステロール抽出物を提供することを特徴とする請求項１乃至４記載の最も最適な含有率、及び請求項３記載の抽出物の理想的な服用量であって、該服用量が１０−３０mg／kg／日であることを特徴とする服用量を提供する。
【００１５】
本発明は、有効性及び投与対象に対する効果を失うことなしに、他の植物成分、栄養補助成分、或いは合成成分と混合可能であることを特徴とする理想的且つ調整された抽出物
を提供する。
【００１６】
したがって、本発明の１つの目的は、ヒトの血清ＨＤＬ値を上昇させるための改良された方法を提供することである。血清ＨＤＬ値が上昇すると、ＣＡＤを防止する効果が得られる。
本発明の他の目的は、高コレステロール血症の動物或いはヒトの、動脈壁の内中膜複合体厚を低減するための方法を提供することである。
本発明の他の目的は、高コレステロール血症の動物或いはヒトの、動脈壁の内中膜複合体肥厚を抑制するための方法を提供することである。
本発明の他の特徴は、エンブリカ・オフィシナリス果実の調整された抽出物を、１０から３０mg／kg／日経口服用することにより血清ＨＤＬ値を向上させるとともに内中膜複合体厚を正常な状態に近づけるための方法を提供することである。
本発明の他の特徴は、エンブリカ・オフィシナリス果実の調整された抽出物によって、血清ＨＤＬ値を向上させることにより、副作用を起こすことなくヒトの内中膜複合体厚を正常な状態に近づけることである。
本発明の他の特徴は、調整された抽出物を３５０mgから１０００mg含有する薬剤組成物を提供することである。これらの目的並びに特徴、及び本発明の他の目的並びに特徴は、以下の詳細な説明により明らかにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明ではまず、洗浄の後、破砕して種を除いたエンブリカ・オフィシナリス果実の水アルコール混合液（３０％から６０％のアルコール）による抽出を行った。抽出は、３回から４回行われた。これらの抽出での抽出物は、混合された後、一定条件下で濾過膜を用いて濾過（逆浸透）された。その結果全固形分が２５％から３０％の濃縮液が得られた。この濃縮液は、ＡＴＦＤ（Agitated Thin Film Dryer）を用いて、一定条件下で乾燥された。その結果３０％から４５％のポリフェノール（エラギ・タンニン：Ellagi Tannins）を含有する乾燥粉末状抽出物が得られた。この粉末状抽出物は、淡緑色から濃緑色を帯びた茶色で、やや吸湿性を有する。
【００１８】
本発明の組成物は通常、総量の３０％から５０％のポリフェノールを含有するように調整されている。主要成分であるエンブリカニン−Ａは、分子中にほぼ４１．５％の没食子酸を含んでおり、また没食子酸が副次成分であるプニグルコニンを構成するため、抽出物を完全に加水分解した後に得られる没食子酸を基準にして調整すればよいと考えられる。よってこの抽出物は、エンブリカニン−Ａを主要成分とする。抽出物をＨＰＴＬＣ分析にかけた結果、該抽出物が上述の成分に対応する３つのスポットを有することが確認された。
【００１９】
本発明による、血清高比重リポタンパク（ＨＤＬ）を増加させ、ヒト及び動物の動脈壁の内中膜複合体厚を調節する物質は、エンブリカ・オフィシナリスの果実から抽出される調整抽出物（以下REDUCEROL（登録商標）という）である。
【００２０】
エンブリカ・オフィシナリスの調整された抽出物は、付属の図面に従って製造される。付属の図面は抽出工程を、簡略に示したものである。この抽出工程は、生の粉砕されたエンブリカ・オフィシナリスの果実を水アルコール抽出並びにろ過する段階を含む。
【００２１】
以下に示す研究は血中の血清ＨＤＬ値を上昇させる抽出物について実施された。研究内容としては、動物実験並びに人体での研究が行われた。また、急性毒性試験が、急性毒性及び亜急性毒性について行われた。以上のような長年にわたる研究によって、次のようなことが見出された。
【００２２】
（毒性実験）
（例１：急性毒性）
この実験では、体重20−25gの健康な白ハツカネズミの雄または雌を使用した。餌と水を備えた清潔なポリプロピレンのケージに、これらのネズミを収容した。実験開始一週間後、ネズミの体重を測定し、6匹ずつ8つのグループに分けた。グループAをコントロール・グループとし、残りの7つのグループを実験用グループとした。一夜絶食させた後、実験用グループB、C、D、E、F、G、Hのネズミには、200mg/kg、400mg/kg、600mg/kg、800mg/kg、2.5g/kg、5g/kg、10g/kgのREDUCEROL（登録商標）抽出物をそれぞれ経口投与した。また、グループAには、0.25mlのコントロール溶液を与えた。これらのネズミを継続的に6時間観察し、72時間死亡率を記録した。
【００２３】
（実験結果）
10g/kg以下のREDUCEROL（登録商標）の投与では、運動の増加、震え、間代性痙攣、立毛、筋肉の痙攣、触覚過敏、運動失調、鎮静、催眠、痛覚欠如などの副作用は現れず、最初の72時間中に死亡も確認されなかった。
【００２４】
（例２：亜急性毒性）
本実験では、体重200−250gの健康な雄のSprague-Dawlyラットを使用した。餌と水を備えた清潔なポリプロピレンのケージに、これらのラットを収容した。実験開始2週間後、ラットの体重を測定し、赤血球、白血球、ヘモグロビン、リンパ球数を測定するために、EDTAチューブを用いて尾静脈から血液サンプルを採取した。尚、血糖値は、還元方法によって測定した。これらのラットを6匹ずつ５つのグループに分け、グループAをコントロール・グループとし、残り4つのグループを実験用グループとした。グループAでは、ラットの体重250gに対し、2mlのコントロール溶液を経口投与し、グループB、C、D、Eのラットには、100mg/kg、500mg/kg、1ｇ/kg、2g/kgのREDUCEROL（登録商標）抽出物をそれぞれ3ヶ月間与えた。
【００２５】
25％のREDUCEROL（登録商標）抽出物（原液）を、15ｇのイソトレチノイン（sorbitrate）と10ｇのプロピレングリコールの混合物に調合した。尚、REDUCEROL（登録商標）抽出物は非水溶性である。また、25％のコントロール溶液をコントロール・グループに投与した。体重測定を毎週行った。実験開始3ヵ月後、赤血球、白血球、リンパ球、ヘモグロビン、そして血清を検査するために、EDTAチューブを用いて採血を行った。尚、該血清は、アミノトランフェラーゼ（SGOT、 SGPT）、アルカリホスファターゼ（Alkaline Phosphatases, ALP）、血清総コレステロール、血清総たんぱく質および血糖を測定するために分離された。実験後、全てのラットを解剖したが、肉眼検査では異常は見られなかった。また、それぞれの臓器の重さを記録した。尚、コレステロール値を測定するために、肝臓の一部と心臓を均質化（ホモジナイズ、homogenize）した。
【００２６】
（実験結果）
全ての５つの実験用グループにおいて、ラットの体重は増加した。グループA、B、C、D、 Eにおける体重増加の割合は、それぞれ34%、42%、28%、49%、24% であった。表１で記載しているように、コントロール・グループ、実験用グループともに、赤血球、白血球、リンパ球、ヘモグロビンの数値は正常範囲内であった。尚、グループCでは、赤血球の増加が見られた（表２）。また、白血球の増加はグループCにて8% 、グループDにて19%、グループEにて 6%の増加が観測された（表２）。表２に記載しているように、リンパ球の増加は全ての実験グループで見られた。（グループB にて1%、グループCにて12%、グループDにて2%、グループEにて7 %増加した。）
【００２７】
実験開始3ヵ月後の実験グループの血糖値はベースライン値よりも低かった（表４）。また、酵素の解析結果において、実験用グループ、コントロール・グループともに、酵素の数値は正常範囲内であった（表３）。また、グループC、D、Eにおける血清コレステロール値、肝臓コレステロール値および心臓コレステロール値は比較的低かった（表５）。
【００２８】
（表１）
実験に用いた動物の体重
【００２９】
（表２）
ヘモグラム
【００３０】
（表３）
肝機能テスト
【００３１】
（表４）
血糖値
【００３２】
（表５）
総コレステロール
【００３３】
グループAには2mlのコントロール溶液、グループBには100mg/kgのREDUCEROL（登録商標）、グループCには500ml/kgのREDUCEROL（登録商標）、グループDには1g/kgのREDUCEROL（登録商標）、グループEには2g/kgのREDUCEROL（登録商標）を投与した。
【００３４】
（高コレステロール血症の動物を用いた実験）
（例３）
体重約2kgの雄のニュージーランド・ホワイト・ウサギを6匹ずつ４つのグループに分けた。グループBのウサギには、コレステロール結晶性粉末を100mg/kg経口投与し、高コレステロール血症にさせた。同時にグループCのウサギには本発明の抽出物10mg/kgを、グループDのウサギには同抽出物25mgを投与した。尚、グループAのウサギを標準対照とし、グループBのウサギを高コレステロール対照とした。実験は6ヶ月にわたり行われた。高比重リポタンパク質の解析は高比重リポタンパク質（CHOD-RAP）の酵素測定により実施された。高コレステロール血症は、コレステロール結晶性粉末により誘発された（Takur とMajidの研究論文（IJMR, 75, p862-867, 1982年）に記載の方法による）。
【００３５】
（実験結果）
脂質プロフィールは、本発明の抽出物を10mg/kgおよび 25mg/kgを経口投与することにより、全体のコレステロール値を69−73％、低比重リポ・タンパク・コレステロールを78%、トリグリセリドを53-56%減少させた。グループBの高比重リポタンパク質コレステロールと比較すると、実験用グループのそれは28−33％増加した（表６−１０）。
【００３６】
（表６）
様々な服用量のREDUCEROL（登録商標）を与えられたウサギにおける血清コレステロール低減効果
【００３７】
（表７）
REDUCEROLを与えた動物のHDL値(HDL-mg/dl)
【００３８】
（表８）
REDUCEROLを与えた動物のLDLの低下効果(LDL-mg/dl)
【００３９】
（表９）
REDUCEROL(登録商標)を与えた動物のトリグリセリド値(トリグリセリド-mg/dl)
*p<0.01、**p<0.05
【００４０】
（表１０）
ウサギの脂質プロフィールに対するReducerol（登録商標）の効果
【００４１】
動脈硬化指数は、式（LDL+VLDL（超低比重リポタンパク）/HDL）で求められる。尚、本発明において、本発明の抽出物を投与しなかったコントロール・グループと比べると、動脈硬化指数は80−81％減少した。
【００４２】
（高コレステロール血症の患者に対する実験）
（例４）
この実験では、年齢30歳から60歳の男性または女性の高コレステロール血症患者（TC＞240、 LDL＞130）を対象とした。尚、心臓弁膜症、鬱血性心臓麻痺、糖尿病等の患者は、本実験の対象から除外した。合計70人の患者が本実験に参加した。20人のコントロール・グループと50人のトリートメント・グループに分け、食事制限を行い観察した。トリートメント・グループの患者には、本発明の抽出物を含んだ硬カプセルを朝夕2カプセル投与した。コントロール・グループには、食事制限のみ行った。尚、抽出物を投与する前に、全体的な脂質プロフィール（絶食）とヘモグラムを測定した。これらの患者は、上記パラメータについて毎月測定を受けた。尚、倫理委員会は本実験計画を承認し、書面による同意書は実験開始前に提出された。
【００４３】
（実験結果）
Reducerol（登録商標）により、総コレステロールの血漿中濃度は17％、低比重リポ・タンパク・コレステロールは22％、トリグリセリドは24％減少した。しかし、実験開始3ヶ月後、高比重リポ・タンパク・コレステロールは24％増加した（表１１、図２−６）。ヘモグラムの解析結果によって、赤血球およびリンパ球が4%、 ヘモグロビンが3%、白血球が1％増加したことが分かった。（表１２、図１２−１０）実験開始後3ヵ月後、トリートメント・グループの動脈硬化指数は37％減少した。
【００４４】
（動脈壁の内中膜複合体厚の低減）
（例５）
体重1.4−1.6kgの雄のニュージーランド・ホワイト・ラビットを2つのグループに分けた。グループAをコントロール・グループとした。もう1つのグループのウサギには、3ヶ月間コレステロール結晶性粉末100mg/kg投与し、高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化を誘発させた（Takur & Majidの方法による）。コレステロール結晶性粉末を投与したグループを更に2つのグループに分け、そのうち1つのグループをグループBとし、本発明の抽出物を投与しないコントロール・グループとした。また、もう一方のグループをグループCとし、一日あたり10mg/kgのReducerola を3ヶ月間投与した。実験開始から3ヵ月後、3つのグループ全てのウサギは解剖され、それらの組織は、組織学的に研究された。高コレステロール血症ウサギの大動脈条片における組織検査では、平滑筋細胞（Smooth muscle cell, SMC）増殖、脂肪変化、脂肪浸潤および泡沫細胞の形成と共に生じる平滑筋細胞の初期肥厚が現れた。しかし、Reducerolaを投与したグループのウサギの動脈条片においては、内中膜複合体厚の明らかな減少が見られ、動脈壁は正常であった。
【００４５】
（動脈壁の内中膜複合体肥厚の抑制）
（例６）
体重約2kgの雄のニュージーランド・ホワイト・ラビットを6匹ずつ4つのグループに分けた。100mg/kgのコレステロール結晶性粉末をTakur & Majidによる方法によって経口投与し、高コレステロール血症にさせた。同時にグループCに、25mg/kgのReducerol（登録商標）を投与し、このグループをグループCとした。グループAを標準対照とし、グループBを高コレステロール対照とした。実験が行われる前に脂質プロフィールを分析し、6ヶ月間に渡って毎月分析を行った。
【００４６】
実験が終了した6ヵ月後、全てのウサギは解剖された。高コレステロールウサギの動脈条片における組織検査では、コントロール・グループのそれと比べて内中膜複合体厚の増加や脂肪変化が見られた。また、一日25g/kgのReducerolaを同時投与することにより、これらの変化は妨げられ、血管腔はコントロール・グループ同様正常であった。
【００４７】
REDUCEROL（登録商標）によるコレステロール値の低下のメカニズムは、亜急性毒性実験とともに、シロネズミを用いて研究された。尚、3ヶ月間の処置後、HMG-CoA還元酵素を用いて測定するために、解剖されたネズミの肝臓の一部を均質化した。該還元酵素は、コレステロール合成における主要酵素である。グループB、C、D、EのHMG-CoA還元酵素は、コントロール・グループに比べて低かった。（表４）
【００４８】
（表１１）
トリートメント・グループ及びコントロール・グループの脂質プロフィール
【００４９】
（表１２）
トリートメント・グループ及びコントロール・グループのヘモグラム
【００５０】
上記非特許文献は以下のごとくである。
・ Shibnath Ghosal: Method of inhibiting Platelet aggregation September 21, 2000.
・ Mishra. M et.al. Serum cholesterol level and amla (Emblica officinalis, Gaertn.) A preliminary report. Proceedings of World Congress on Coronary Heart Disease. 6th-8th April, p.3, 1984
・ Medicinal plants of India, Vol.1, edited by G.V Satyavati, M.K Raina & Sharma (Indian Council of Medical Research, New Delhi) 1976, 377.
・ The Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial Results. Reduction in incidence of coronary heart disease JAMA 251:351-364 (1984) Preliminary report Proceedings of world Congress on Coronary Heart disease
・ Report of the National Cholesterol Education Program: Expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholesterol in adults. Arch. Intern. Med.1988, 148:36
・ Schettler et al Arb. Med. Soz. Med. Prav. Med. 10,25 (1975)
・ Koditschek, et al W.W., J Bacteriol. 68, 1063-1068 (1969)
・ Annu Jacob et. Al. Effect of the Indian Gooseberry (Amla) on serum
cholesterol levels in men aged 35-55 years. European .J. Clinical Nutrition, 42, 939-944, 1988
・ Thakur and Majid: Egg protein and defatted soya protein on
cholesterol induced hypercholesterolemia and atherosclerosis in rabbits, IJMR,
75, 862-867 (1982)
・ Frick MH et. al. Helsinki heart study: primary-prevention trial with
gemfibrozil in middle-aged men with dyslipidemia. Safety of treatment changes
in risk factors, and incidence of coronary heart disease. Volume 317:1237-1245. November 12, 1987. Number 20
・ Robbins: Basic pathology 7th edition. Saunders company. 2003
・ D.M. Vasudevan Sreekumari: A Textbook of Biochemistry. Jaypee Brothers, 2001.
・ Gofman, J.W., Young, W. & Tandy, R. (1966): Ischaemic heart disease, artherosclerosis and longevity. Circulation 34,679.
・ Dr. Terje R Pedersen, Randomised trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease: the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S). Cardiology Section, Medical Department, Aker Hospital, N 0514 Oslo. Norway. Lancet 1994;344:1383-89
・ Sharma P.V Dravyaguna vijnana (Chaukhambha Sanskrit Sansthan, Varansasi) 1978
・ Shibnath G .et. al: Active constituents of E.officinalis: Part I The Chemistry and antioxidative effects of two new hydrolysable tannins. Ind. J. Chemistry Vol.35 B Sept, 1996, P.941-948.
・ Abrens, H et al (1986): Effects of oral and intracecal pectin administration on blood lipids in guinea pigs. J. Nutr. 116, 70-76
Gordon T: Framingham Diet Study. Diet and regulation of serum cholesterol. U.S. Dept. of Health Education and welfare. 1970.
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物がコレステロールを低減するときの考えられる作用メカニズムを表す。
【図２】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの血中ＨＤＬコレステロール値変化の経過を表すグラフである。
【図３】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの血中総コレステロール値変化の経過を表すグラフである。
【図４】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの血中ＬＤＬコレステロール値変化の経過を表すグラフである。
【図５】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの血中ＶＬＤＬコレステロール値変化の経過を表すグラフである。
【図６】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの血清トリグリセリド値変化の経過を表すグラフである。
【図７】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの白血球値変化の経過を表すグラフである。
【図８】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれの赤血球値変化の経過を表すグラフである。
【図９】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれのリンパ球値変化の経過を表すグラフである。
【図１０】高コレステロール血症患者を対象とする実験における、本発明のエンブリカ・オフィシナリス抽出物の投与を受けたトリートメント・グループと、この抽出物の投与を受けなかったコントロール・グループそれぞれのヘモグロビン値変化の経過を表すグラフである。
【図１１】本発明によるエンブリカ・オフィシナリスの調整された抽出物を抽出する工程を簡略に示すフローチャートである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清高比重リボタンパク質を増加させ、
該血清高比重リボタンパク質が備えるコレステロールの組織への蓄積を妨げる能力を強化するための独自の技術によって特徴付けられる方法。
【請求項２】
エンブリカ・オフィシナリスから、成分調整された有効な植物ステロールを抽出する段階と、
該抽出された植物ステロールを摂取可能な顆粒及び薬剤として提供する段階からなることを特徴とする環境に負荷をかけず価値工学的な手法並びに方法。
【請求項３】
効能と生体吸収性に優れ、
動脈壁の内中膜複合体の肥厚を抑制するとともに該内中膜複合体厚を低減することを特徴とする最良且つ理想的な植物ステロール。
【請求項４】
３０％から４０％のガロ−エラギタンニンを含有する有効且つ即効性の植物ステロール抽出物を提供することを特徴とする請求項１乃至４記載の最も最適な含有率。
【請求項５】
請求項３記載の抽出物の理想的な服用量であって、
該服用量が１０−３０mg／kg／日であることを特徴とする服用量。
【請求項６】
有効性及び投与対象に対する効果を失うことなしに、他の植物成分、栄養補助成分、或いは合成成分と混合可能であることを特徴とする理想的且つ調整された抽出物。
【請求項７】
前記効能を得るためにエンブリカ・オフィシナリス果実の成分調整された抽出物を用いる段階を備えることを特徴とするヒトの血清ＨＤＬ値を上昇させる方法。
【請求項８】
前記効能を得るためにエンブリカ・オフィシナリス果実の成分調整された抽出物を用いる段階を備えることを特徴とする動脈壁の内中膜複合体の肥厚を抑制するための方法。
【請求項９】
前記効能を得るためにエンブリカ・オフィシナリス果実の成分調整された抽出物を用いる段階を備えることを特徴とする動脈壁の内中膜複合体厚を低減するための方法。
【請求項１】
血清高比重リボタンパク質を増加させ、
該血清高比重リボタンパク質が備えるコレステロールの組織への蓄積を妨げる能力を強化するための独自の技術によって特徴付けられる方法。
【請求項２】
エンブリカ・オフィシナリスから、成分調整された有効な植物ステロールを抽出する段階と、
該抽出された植物ステロールを摂取可能な顆粒及び薬剤として提供する段階からなることを特徴とする環境に負荷をかけず価値工学的な手法並びに方法。
【請求項３】
効能と生体吸収性に優れ、
動脈壁の内中膜複合体の肥厚を抑制するとともに該内中膜複合体厚を低減することを特徴とする最良且つ理想的な植物ステロール。
【請求項４】
３０％から４０％のガロ−エラギタンニンを含有する有効且つ即効性の植物ステロール抽出物を提供することを特徴とする請求項１乃至４記載の最も最適な含有率。
【請求項５】
請求項３記載の抽出物の理想的な服用量であって、
該服用量が１０−３０mg／kg／日であることを特徴とする服用量。
【請求項６】
有効性及び投与対象に対する効果を失うことなしに、他の植物成分、栄養補助成分、或いは合成成分と混合可能であることを特徴とする理想的且つ調整された抽出物。
【請求項７】
前記効能を得るためにエンブリカ・オフィシナリス果実の成分調整された抽出物を用いる段階を備えることを特徴とするヒトの血清ＨＤＬ値を上昇させる方法。
【請求項８】
前記効能を得るためにエンブリカ・オフィシナリス果実の成分調整された抽出物を用いる段階を備えることを特徴とする動脈壁の内中膜複合体の肥厚を抑制するための方法。
【請求項９】
前記効能を得るためにエンブリカ・オフィシナリス果実の成分調整された抽出物を用いる段階を備えることを特徴とする動脈壁の内中膜複合体厚を低減するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００６−５１４６７０（Ｐ２００６−５１４６７０Ａ）
【公表日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６９０５９（Ｐ２００４−５６９０５９）
【出願日】平成１５年４月３日（２００３．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００３／０００１３７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８１９０
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（３９００１９４６０）稲畑香料株式会社 (22)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年４月３日（２００３．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００３／０００１３７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８１９０
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（３９００１９４６０）稲畑香料株式会社 (22)
【Ｆターム（参考）】
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