血球分離膜およびこれを用いた血液保持用具
血球の溶血を防止し、かつ、血清または血漿と血球とを分離する血球分離膜を提供する。
供給された血液から血球を分離する多孔質膜に、疎水性アミノカルボン酸、シルク由来のタンパク質、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸またはヘパリンを含む溶液を含有させて乾燥し、血球分離膜とする。
供給された血液から血球を分離する多孔質膜に、疎水性アミノカルボン酸、シルク由来のタンパク質、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸またはヘパリンを含む溶液を含有させて乾燥し、血球分離膜とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、血液中の血球と、血清または血漿とを分離する血球分離膜および血液の保持や検査に使用する血液保持用具に関する。
【背景技術】
血液を検査する場合、検体毎に使い切るシート状の血液検査用具（試験片ともいう）が汎用されている。この検査用具は、血液を保持し、ここから血液を抽出して検査を行うタイプのものや、予め試薬等を検査用具に含有させたもの等があげられる。後者の用具は、例えば、その検査用具に血液を滴下することで血液と試薬とを反応させ、その反応を光学的手法や電気化学的手法により測定できる。
このような血液検査用具は、一般の臨床検査等では汎用されているだけでなく、例えば、遠隔臨床検査システムにおいても実際に使用されている。この遠隔臨床検査システムとは、在宅で患者自身が血液を採血し、これを血液検査用具に含有、乾燥させて、この血液検査用具を病院等の検査機関に郵送し、検査するシステムである。血液を郵送した患者等は、郵便等で検査結果を知ることも、また直接病院等に出向いても検査結果を知ることができる。
血糖値等のように、検査項目が血清または血漿中の成分の場合は、血液検査用具において、血液を血球と血清または血漿とに分離する必要がある。このため、従来の血液検査用具では、グラスフィルター等の血球分離材を血液検査用具に組み込むことが一般的であった。このような血液検査用具によれば、例えば、血球分離材によって血液を血球と血清・血漿とに分離し、前記血球分離材を通過した血清・血漿をさらに展開部に毛管現象によって展開させることによって、血清・血漿サンプルを調製できる。この他に、最近、孔径が厚み方向に変化する非対称性多孔質膜を用いた血液検査用具も開発されている（例えば、特表平１１−５０５３２７号公報）。非対称性多孔質膜の孔径が大きい方の面から血液を供給すると、血液が厚み方向に浸透する過程で前記血液から血球が分離され、血清・血漿が供給面と反対側に出てくるため、これを回収すればよい。このような非対称性多孔質膜を用いた血液検査用具は、血球の目詰まりが防止されるという利点を有する。
しかしながら、このような従来の血液検査用具では、血球分離に伴って前記血球が溶血して、前記血球内成分が血清等に混入するおそれがあるため、予め、溶血防止のための添加剤を血液中に含有させる必要がある（例えば、特開平９−１９６９０８号公報）。しかし、この場合、溶血は防止されるものの、前記添加剤の影響によって得られた血清・血漿中のヘマトクリット（Ｈｔ）値が大幅に低下し、血清・血漿成分を精度よく測定することが困難であるという問題がある。
【発明の開示】
そこで、本発明の目的は、血球分離に伴う血球の溶血を防止しつつ、血球と血清・血漿とを分離できる血球分離膜およびそれを用いた血液保持用具の提供である。
前記目的を達成するために、本発明の血球分離膜は、血液中の血清または血漿と血球とを分離する多孔質膜を含み、前記多孔質膜が、疎水性アミノカルボン酸、シルク由来のタンパク質、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸およびヘパリンからなる群から選択された少なくとも一つの溶血防止剤を含有することを特徴とする。
このように、本発明の血球分離膜は、前述のような種類の溶血防止剤を含有することによって、血球の溶血を防止できる。このため、前記血球分離膜を通過し、分離された血清または血漿試料は、前記血球内成分を含むことがなく、優れた精度で血清等の成分測定を行うことができる。また、溶血によるヘモグロビン色素の混入が防止されるため、前記分離された試料を、光学的手段や目視等によって直接測定することも可能になる。
また、本発明の血球分離膜を用いて血清・血漿サンプルを調製すれば、各種成分を高精度で測定することも可能になる。本発明者らは、前述のような従来の血球分離膜を使用した場合におけるヘマトクリット（Ｈｔ）値の低下や、各種分析項目における測定精度の低下について鋭意研究を行った。その結果、従来から溶血防止に使用されている添加物質がグリシンであり、通常、血球分離膜の体積（ｃｍ３）当たり約１００ｍｇ〜２００ｍｇの高濃度で含まれているため、前述のような影響が出ていることを突き止めた。特にＧＧＴ等の分析項目については、グリシンによる希釈効果だけでなく、グリシンによって血清または血漿成分が変化する結果、測定精度が低下していることを突き止めた。そして、本発明の血球分離膜のように、グリシンではなく前述の溶血防止剤を含有すれば、例えば、グリシンのように高濃度である必要はない。そのため、Ｈｔ値への影響も軽減され、各種分析項目、例えば、ＧＧＴについても高精度での測定が可能になることを見出したのである。以上のように、本発明の血球分離膜を用いれば、血球分離に伴う血球の溶血を防止しつつ、血球と血清・血漿とを分離でき、また、各種分析に影響を与えない血清または血漿試料を調製することができる。
つぎに、本発明の血液保持用具は、血液中の血球を分離する血球分離部と、血液中の血清または血漿を毛管現象により展開する展開部とを有し、前記血球分離部が、前記本発明の血球分離膜である。本発明の血液保持用具は、前述のような効果を奏する血球分離膜を有するため、例えば、前述のような遠隔臨床検査システムに特に有用であるといえる。なお、本発明の検体保持用具は、血球と血清・血漿とが分離された血液検体を、例えば、郵送等のために保持する用具としても使用でき、また、これ自体を目的成分の血液検査用具として使用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の血液保持用具の一実施例を示す断面図である。
図２は、本発明の血液保持用具のその他の実施例を示す断面図である。
図３は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図４は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図５は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図６は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図７は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図８は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図９は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図１０は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
前述のように、本発明の血球分離膜は、血液中の血清または血漿と血球とを分離する多孔質膜を含み、前記多孔質膜が、疎水性アミノカルボン酸、シルク由来のタンパク質、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸およびヘパリンからなる群から選択された少なくとも一つの溶血防止剤を含有することを特徴とする。
前記疎水性アミノカルボン酸としては、例えば、疎水性アミノ酸が使用でき、具体的には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等が使用できる。前記シルク由来のタンパク質とは、フィブロインの加水分解物をいう（以下、「シルクエッセンス」ともいう）。
前記溶血防止剤の中でも、バリン、ロイシン、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸、シルクエッセンスが好ましい。これらを使用した場合、前述のような溶血防止効果に加えて、血清・血漿と血球とを優れた効率で分離するという効果をも奏するためである。メカニズムは不明であるが、前記血球分離膜内にこれらの溶血防止剤を含有させることによって、前記血球分離膜内における血球の浸透速度が抑制され、一方、血清・血漿の浸透速度が促進される。また、血球が前記血球分離膜を通過した場合でも、例えば、展開部における血球の展開速度が抑制され、かつ、血清または血漿の展開速度が促進される。そのため、前記展開部において、血球の展開距離を短く、血清または血漿の展開距離を長くすることができる。つまり、血球の展開抑制と血清・血漿の展開促進という、相反する効果を双方実現できるため、血清または血漿のみの展開量を増加できるのである。したがって、前述のような溶血防止剤を含有させた血球分離膜によれば、血球と血清または血漿とが分離し易くなる。さらに血球が前記血球分離膜を通過した場合でも、血球の展開による血清・血漿回収率への影響を抑制できるため、その回収率を向上することもできる。このため、供給する血液量も低減でき、例えば、採血時における患者の負担も軽減できる。
さらに、中でもバリン、トラネキサム酸、ε−アミノヘキサン酸が特に好ましい。これらを使用する場合、例えば、前述のグリシンと比較して、グリシンの１／５〜１／１０程度の含有量（重量）で、十分な効果を奏することからである
また、前記溶血防止剤は、いずれか一種類を用いてもよいし、二種類以上を組み合わせてもよい。組み合わせとしては、例えば、バリンとヘパリン、トラネキサム酸とヘパリン等の組み合わせがあげられる。
本発明において、前記溶血防止剤の含有量（重量）は、例えば、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり１ｍｇ〜５０ｍｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは５ｍｇ〜４０ｍｇの範囲であり、特に好ましくは１０ｍｇ〜３０ｍｇの範囲である。前記溶血防止剤の含有量が前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり１ｍｇ以上であれば溶血を十分に防止できる。なお、ここで「多孔質膜の体積」とは、多孔質膜の空孔部分を含む体積をいう。
具体的に、前記溶血防止剤がバリンの場合、その含有量（重量）は、例えば、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは１５ｍｇ〜４５ｍｇの範囲であり、特に好ましくは３０ｍｇ〜４０ｍｇの範囲である。
前記溶血防止剤がロイシンの場合、その含有量（重量）は、例えば、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり１ｍｇ〜３０ｍｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは５ｍｇ〜２５ｍｇの範囲であり、特に好ましくは１０ｍｇ〜２０ｍｇの範囲である。
前記溶血防止剤がトラネキサム酸の場合、その含有量（重量）は、例えば、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは１５ｍｇ〜４５ｍｇの範囲であり、特に好ましくは３０ｍｇ〜４０ｍｇの範囲である。
前記溶血防止剤がε−アミノヘキサン酸の場合、その含有量（重量）は、例えば、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは１０ｍｇ〜４５ｍｇの範囲であり、特に好ましくは３０ｍｇ〜４０ｍｇの範囲である。
本発明の血液分離膜は、前記溶血防止剤に加えて、さらに、例えば、プルラン、ＢＳＡ等の添加剤を含有していてもよい。これらと前記溶血防止剤とを併用することで、溶血防止効果をさらに向上できる。
前記血球分離膜は、その全体に前記溶血防止剤が含有されていることが好ましいが、例えば、血球分離膜の少なくとも一方の表面、特に血液が供給される表面のみに前記溶血防止剤が含有されていてもよい。
前記多孔質膜は、通常、その内部を血球が通過し難いことが望ましく、例えば、血球が通過できない孔径の孔を有していることが好ましい。本発明において、「血球が通過できない孔径の孔」とは、孔径が血球の球径より小さいという意味ではなく、どのようなメカニズムかは問わず、結果的に血球が通過できない孔径であればよい。したがって、血球が通過できない孔径には、血球の球径より大きい孔径も含まれる。また、本発明の血球分離膜によれば、前述のように、例えば、前記分離膜を血球が通過した場合であっても、前記溶血防止剤により血清または血漿の展開速度を促進し、血球の展開速度を抑制されることも可能である。この場合には、前記多孔質膜は、多孔質膜内部で完全に血球の通過を阻止し、前記血球を保持するものではなく、例えば、血球が部分的に通過してしまう多孔質膜であってもよい。
具体的に、前記多孔質膜は、０．１μｍ〜２０μｍの孔径の孔を有することが好ましく、より好ましくは１μｍ〜１０μｍであり、特に好ましくは２μｍ〜８μｍである。
前記多孔質膜としては、特に制限されず、従来から血球分離に使用されている各種材料が使用できる。具体的には、例えば、グラスフィルターや、厚み方向に平均孔径が連続的または不連続的に小さくなる孔径分布の非対称性多孔質膜等が使用できる。
前記グラスフィルターとしては、例えば、繊維密度が疎であるものが好ましく、市販のグラスフィルター、例えば、ミリポア社製の商品名ＡＰ２５等を使用してもよい。
また、前記多孔質膜として非対称性多孔質膜を使用した場合、厚み方向に向かって孔径が変化するため、例えば、前記多孔質膜内部を厚み方向に血液が進むにつれ、徐々に血球が通過できなくなり、血球が通過できない孔径の部位で血球が保持される。したがって、目詰まりも起こり難く、迅速かつ容易に血球を分離できる。なお、本発明において、「平均孔径が不連続的に小さくなる」とは、例えば、段階的に小さくなること等をいう。
前記非対称性多孔質膜の孔径は、最大孔径が１０μｍ〜３００μｍの範囲で、最小孔径が０．１μｍ〜３０μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは最大孔径が１００μｍ〜２００μｍの範囲で、最小孔径が１μｍ〜１０μｍの範囲であり、特に好ましくは最大孔径が１５０μｍ〜２００μｍの範囲で、最小孔径１μｍ〜５μｍの範囲である。
前記非対称性多孔質膜の材質としては、特に制限されないが、例えば、ポリエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、セルロースアセテート、ポリアミド、ポリイミド、ポリスチレン等の樹脂があげられる。これらの多孔質膜は、単独で使用してもよいし、これらを２種類以上組み合わせて使用してもよい。これらの中でも好ましくは、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンであり、特に好ましくはポリエーテルスルホンである。
また、前記非対称性多孔質膜は、前述のような各種樹脂を用いて作製してもよいし、市販の非対称性多孔質膜、例えば、Ｕ．Ｓフィルター社製の商品名ＢＳＴ−ＳＰ、Ｐｒｉｍｅｃａｒｅ社製の商品名Ｓ／Ｇ等を使用してもよい。
前記血球分離膜の大きさは、例えば、供給する血液量等に応じて適宜決定できる。具体的には、供給する血液量が１２０μＬの場合、例えば、長さ４ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み５０μｍ〜長さ５０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み２０００μｍであり、好ましくは長さ５ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み７５μｍ〜長さ３０ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み１２５０μｍであり、より好ましくは長さ１０ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み９０μｍ〜長さ２０ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み１１００μｍである。なお、前記長さとは、血球分離膜の長手方向の長さ、幅とは幅方向の長さをそれぞれ示し、以下同様である。
前記血球分離膜としてグラスフィルターを使用した場合、その厚みは、例えば、２００μｍ〜２０００μｍの範囲であり、好ましくは５００μｍ〜１０００μｍの範囲である。また、その大きさは、供給する血液量が１２０μＬの場合、例えば、長さ４ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み１００μｍ〜長さ５０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み２０００μｍであり、好ましくは長さ５ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み２００μｍ〜長さ３０ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み１２５０μｍであり、より好ましくは長さ１０ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み２５０μｍ〜長さ２０ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み１１００μｍである。
前記血球分離膜として非対称性多孔質膜を使用した場合、その厚みは、例えば、５０μｍ〜４００μｍの範囲であり、好ましくは１００μｍ〜３５０μｍの範囲である。また、その大きさは、供給する血液量が４０μＬの場合、例えば、長さ４ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み５０μｍ〜長さ５０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み４００μｍであり、好ましくは長さ５ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み１００μｍ〜長さ３０ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み３５０μｍであり、より好ましくは長さ１０ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み２００μｍ〜長さ２０ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み３００μｍである。
本発明の血球分離膜の製造方法は、特に制限されず、例えば、前記溶血防止剤の分散液または溶液に前記多孔質膜を浸漬して乾燥させたり、前記分散液等を前記多孔質膜に滴下して浸透させた後、乾燥する方法等がある。
前記分散液または溶液における前記溶血防止剤の濃度は、例えば、０．１重量％〜５重量％の範囲であり、好ましくは０．５重量％〜４重量％の範囲、より好ましくは２重量％〜３重量％の範囲である。
また、前記多孔質膜は、全血の透過を速やかに行えることから、前記溶血防止剤を保持させる前に、予め、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等の親水性高分子等の処理溶液に浸漬することによって、親水化処理を施してもよい。前記処理溶液の濃度は、例えば、０．１重量％〜５０重量％の範囲であり、処理時間は、例えば、０．１時間〜２４時間の範囲である。前記溶液の溶媒としては、例えば、水や各種有機溶媒等が使用でき、前記有機溶媒としてはエタノール等のアルコール類等があげられる。
つぎに、本発明の血液保持用具は、前述のように、血液中の血球を分離する血球分離部と、血液中の血清または血漿を毛管現象により展開する展開部とを有し、前記血球分離部が、前記本発明の血球分離膜であることを特徴とする。
本発明の血液保持用具としては、例えば、前記展開部と前記血球分離部とが積層された積層型の実施形態Ａ−１、非対称性多孔質膜が前記展開部と前記血球分離部とを備える単層型の実施形態（Ａ−２およびＡ−３）および血液分離膜が血球分離部と展開部とを備える単層型の実施形態があげられる。Ａ−１、Ａ−２およびＡ−３の形態について、以下に具体的に説明する。
（実施形態Ａ−１）
この実施形態は、前記血球分離部が本発明の血球分離膜であり、前記展開部が多孔質膜から構成され、前記展開部（展開用多孔質膜）の上に、前記血球分離膜が積層されている例である。この実施形態においては、前記血球分離膜の表面が血液供給部となる。
図１の断面図に、前記血液保持用具の一例を示す。同図に示すように、この血液保持用具１０は、展開部１１の一方の端部上に、血球分離部１２が積層された構造であり、血球分離部１２の表面が、血液供給部１３となっている。同図において矢印Ａは、血液中の血清・血漿の展開方向を示す（以下、図２〜１０においても同じ）。
展開部１１を構成する展開用多孔質膜としては、例えば、ろ紙、酢酸セルロース膜、多孔質膜、ガラス繊維膜が使用できる。前記多孔質膜の材質としては、例えば、ポリエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、セルロースアセテート、ポリアミド、ポリイミド、ポリスチレン等の樹脂等があげられ、好ましくはポリエーテルスルホン、ポリカーボネートである。また、前述のような非対称性多孔質膜を使用することもできる。展開部として前記非対称性多孔質膜を使用すれば、血球が血球分離部を通過した場合でも、前記非対称性多孔質膜の孔構造によって、展開部において、さらに、血球分離を行うことができる。これらの多孔質膜は、単独で使用してもよいし、これらを２種類以上組み合わせて使用してもよい。これらの中でも好ましくは、例えば、ろ紙、酢酸セルロース膜、ニトロセルロース膜、ポリスルホン製多孔質膜、ポリエステル製多孔質膜、ポリカーボネート製多孔質膜であり、特に好ましくは、ろ紙、ポリスルホン製多孔質膜、ポリエステル製多孔質膜である。また、前述の血球分離膜と同様に、血清または血漿の展開をより一層促進できることから、親水化処理を施してもよい。
前記展開用多孔質膜の平均孔径は、例えば、血清または血漿が毛管現象によって展開できれば特に制限されないが、０．１μｍ〜３００μｍの範囲が好ましく、より好ましくは１μｍ〜１００μｍであり、特に好ましくは２μｍ〜５０μｍである。この展開用多孔質膜の大きさは、例えば、供給する血液量等に応じて適宜決定できるが、供給する血液量が４０μＬの場合、例えば、長さ４ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み５０μｍ〜長さ５０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み４００μｍであり、好ましくは長さ５ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み１００μｍ〜長さ３０ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み３５０μｍであり、より好ましくは長さ１０ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み２００μｍ〜長さ２０ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み３００μｍである。
また、前記血球分離膜だけでなく、前記展開用多孔質膜にも前記溶血防止剤が含有されていてもよい。
前記血球分離膜と展開用多孔質膜との組み合わせとしては、特に制限されないが、例えば、血球分離膜としてグラスフィルター、展開用多孔質膜として非対称性多孔質膜を使用する組み合わせや、血球分離膜として非対称性多孔質膜、展開用多孔質膜としてニトロセルロース膜を使用する組み合わせ等が好ましい。
本実施形態の血液保持用具は、例えば、前記展開用多孔質膜の上に前記血球分離膜を配置して、積層するだけでもよいし、前記展開用多孔質膜と前記血球分離膜との位置決めを行い、前記両者の端部を接着または圧着等することで製造できる。
また、前記展開用多孔質膜が、支持体で支持されていることが好ましい。前記展開用多孔質膜の強度に関係なく、充分な強度の血液保持用具を得ることができ、かつ、取り扱いが簡便になるためである。前記支持体を形成する材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン共重合体（ＡＢＳ）等のプラスチックが使用できる。前記材料は、いずれか一種類でも、二種類以上を併用してもよい。また、後述のように血液保持用具を用いて、光学的手法等によって直接測定する場合には、前記支持体が、光透過性であることが好ましく、例えば、ポリスチレン、ＰＥＴ、アクリル樹脂製の支持体等が使用できる。
つぎに、図１に基づき、血液保持用具１０に血液を添加して血清または血漿試料を調製する一例について説明する。
まず、血液を血球分離部１２表面の血液供給部１３に滴下する。血液は、血球分離部１２内を厚み方向に移行しながら、血球と血清・血漿とに分離される。そして、分離された血清・血漿は、展開部１１に到達し、毛管現象によって展開部１１内を面方向（同図において矢印Ａ方向）に展開する。この際、本発明の血液保持用具によれば、血球分離部１２は前記溶血防止剤を含有するため、血球を分離する際に生じる溶血が防止され、血球成分の混入が抑制された血清または血漿試料が得られる。
展開した血清または血漿試料を回収する場合は、血液保持用具１０を風乾または自然乾燥等により乾燥する。その後、血液保持用具１０から展開部１１を剥離し、展開部１１から血清または血漿の展開部分のみを切り抜けばよい。
そして、切り抜き等により得られた切片を、例えば、試験管に入れ、これに抽出溶液を添加し、放置することによって血清または血漿を抽出し、回収する。前記抽出溶液としては、血清または血漿を抽出でき、血清または血漿中の分析対象成分の検出に影響を与えないものであれば特に制限されない。例えば、緩衝液、生理食塩水、精製水、蛋白溶液等や、これらの混合液であってもよい。前記緩衝液としては、例えば、リン酸、クエン酸、塩酸、酢酸等を含む各種緩衝液等があげられ、そのｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８の範囲である。前記抽出溶液の添加量は、特に制限されないが、切片の大きさ等によって適宜決定でき、例えば、切片体積の１倍〜１０００倍の範囲である。また、抽出処理時間は、特に制限されず、例えば、１分〜３００分の範囲である。
また、血清または血漿を展開させた後、展開部を切り抜き、直接遠心分離することによっても回収できる。
この回収液を用いて、血清または血漿中の分析対象成分の測定を行うことができる。
一方、この血液保持用具１０において、展開部１１に保持された血清または血漿を抽出液で回収せずに、そのまま分析を行うこともできる。この場合は、予め、展開部１１に分析用試薬を含有させて、試薬部を形成すればよい。展開部１１に試薬を配置する方法は、例えば、印刷法、含浸法、噴霧法等があげられる。
前記分析用試薬は、特に制限されず、目的の分析対象成分の種類により適宜決定できる。前記試薬の成分としては、例えば、各種酵素、リン酸塩や炭酸塩等の緩衝物質、発色剤等があげられる。具体的には、グルコースを分析する場合は、例えば、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、β−ＮＡＤＰ、ＡＴＰおよび緩衝液等を含有させればよい。
また、展開部１１に、血清または血漿の移動方向に対し並列に試薬を含有させれば、同一の血液保持用具において、多項目の分析を行うことができる。この場合、多項目の試薬が混合しないように、例えば、疎水性樹脂溶液を含有させておくことにより、試薬部間に境界層を設けることが好ましい。
このような血液保持用具１０によれば、前述のように血液を供給して血清または血漿を展開させると、展開部１１内で各種分析対象成分とその検出試薬とがそれぞれ反応する。この反応による発色等を、電気化学的手法や光学的手法（目視を含む）により検出すれば、容易に分析を行うことができる。
（実施形態Ａ−２）
この実施形態は、前記血球分離部が非対称性多孔質膜であり、前記非対称性多孔質膜がさらに前記展開部を有し、前記非対称性多孔質膜において、前記血球分離部と前記展開部とが面方向に位置し、血球を供給する側が前記血球分離部であり、前記供給した血液の展開方向に沿って下流側が展開部である構成となる。つまり、一つの非対称性多孔質膜の面方向に、血球分離部と展開部とが存在し、一つの非対称性多孔質膜内において、血球分離と血清または血漿の展開とを行うことができる形態である。
図２の断面図に、前記血液保持用具の一例を示す。同図に示すように、この血液保持用具２０は、厚み方向に平均孔径が連続的または不連続的に小さくなる孔径分布の非対称性多孔質膜から構成されている。矢印Ａ方向の上流側が血液分離部２２であり、下流側が展開部２１である。そして、血液分離部２２の表面が血液供給部２３となる。
前記非対称性多孔質膜の孔径は、最大孔径が、例えば、１０μｍ〜３００μｍの範囲であり、好ましくは５０μｍ〜１５０μｍの範囲、最小孔径が、例えば、０．１μｍ〜３０μｍの範囲であり、好ましくは１μｍ〜１０μｍの範囲である。
血液保持用具２０の大きさは、前述と同様に特に制限されず、供給する血液検体の量等に応じて適宜決定できる。供給する全血が約１００μＬの場合、血液保持用具２０全体の大きさは、例えば、長さ４ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み５０μｍ〜長さ６０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み４００μｍであり、好ましくは長さ５ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み１００μｍ〜長さ３０ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み３５０μｍであり、より好ましくは長さ１０ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み２００μｍ〜長さ２０ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み３００μｍである。なお、長さとは、血液保持用具の長手方向の長さを、幅とは幅方向の長さをそれぞれいう。
このような血液保持用具２０は、例えば、血液分離部２２と展開部２１とが、厳密に境界線によって分けられる必要はない。血液保持用具２０では、血液供給部２３に血液を滴下すると、前記血液は、厚み方向に移動しながら、血球と血清または血漿とに分離しつつ、その面方向（同図において矢印Ａ方向）にさらに展開される。血液供給部２３の大きさは、例えば、長さ２ｍｍ×幅１．５ｍｍ〜長さ１５ｍｍ×幅２０ｍｍであり、好ましくは長さ４ｍｍ×幅３ｍｍ〜長さ１０ｍｍ×幅１５ｍｍであり、より好ましくは長さ４ｍｍ×幅５ｍｍ〜長さ６ｍｍ×幅１２ｍｍである。この血液供給部２３の厚み方向領域が、通常、血球分離部２２にあたる。
この血液保持用具２０は、前述のように単層の非対称性多孔質膜から構成される。このため、例えば、前記溶血防止剤を含有する溶液を、血球分離部２２とする部分のみに含有させてもよいし、また、前記非対称性多孔質膜を前記溶液に浸漬させて、全体に含浸させてもよい。
つぎに、図２に基づき、前記血液保持用具２０に血液を添加して血清または血漿試料を調製する一例について説明する。
まず、血液供給部２３に血液を滴下する。前記血液は、血液分離部２２の内部を厚み方向に移行しながら血球を分離する。そして、血清または血漿は、その面方向（同図において矢印Ａ方向）に移動し、毛管現象によって展開部２１に展開される。以後は、前記実施形態Ａ−１と同様に展開部２１から血清または血漿を回収すればよい。
（実施形態Ａ−３）
実施形態Ａ−２に示すような血液分離部および展開部の双方を備える非対称性多孔質膜から構成される血液保持用具は、より一層血球分離の効率を上げるため、例えば、前記血球分離部と前記展開部との境界に、さらに血球遮断部が設けられていることが好ましい。具体的には、前記血球分離部と前記展開部との間であって前記非対称性多孔質膜の幅方向に、血球が通過できない孔径の孔のみからなる血球遮断部が形成されている。そして、血液を供給した際に、血液の展開方向に沿って、前記血球遮断部よりも下流側が展開部であり、前記血球遮断部と、前記血球遮断部よりも上流側とが血液分離部となる構造である。このような構造であれば、例えば、血液中の血球が厚み方向だけでなく、面方向に移動した場合であっても、前記血球遮断部によって、確実に展開部への血球の通過が防止され、血清または血漿のみを展開部に展開することが可能になる。また、前記血球遮断部は、例えば、前記非対称性多孔質膜の前記幅方向に溝が形成され、前記溝の底面からこの底面に対応する非対称性多孔質膜表面までの間の部分であることが好ましい。なお、特に示さない限り、本実施形態の血液保持用具は、前記実施形態Ａ−２と同様の条件（大きさ、材料等）である。
図３の断面図に、前記血液保持用具の一例を示す。同図に示すように、この血液保持用具３０は、前記実施形態Ａ−２の血液保持用具２０と同様に、単層の非対称性多孔質膜から構成されており、さらに、その幅方向に溝が形成されている。この溝の底面から、前記底面に対応する非対称性多孔質膜表面までの間の部分が、血球遮断部３２となる。そして、血球遮断部３２と矢印Ａ方向の上流側とが血球分離部となり、血球遮断部３２の下流側が展開部３１となる。また、血球分離部の孔径の大きい表面が血液供給部３３となる。
前記非対称性多孔質膜において、血球遮断部３２の孔径は、例えば、０．１μｍ〜５０μｍの範囲であり、好ましくは１μｍ〜３０μｍの範囲である。
血液保持用具３０の大きさは、前述と同様に特に制限されず、供給する血液検体の量等に応じて適宜決定できる。供給する全血が約１００μＬの場合、血球遮断部３２の大きさは、例えば、長さ０．１ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み１０μｍ〜長さ１０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み４００μｍであり、好ましくは長さ０．２ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み１５μｍ〜長さ８ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み３５０μｍであり、より好ましくは長さ０．３ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み２０μｍ〜長さ６ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み３００μｍである。
前記溝は、例えば、前記非対称性多孔質膜の表面の一部を圧縮して形成できる。例えば、円盤状ローラーを転がして圧縮したり、刃先が鈍い刃物で切れない程度に圧縮することにより形成できる。このように、圧縮により溝を形成した場合、血球遮断部において、非対称性多孔質膜の大きい孔径の孔も含まれることとなるが、圧縮により孔が変形したり潰れたりしているため、血球が通過することがない。
また、前記溝は、例えば、カッター等の刃物を用いて、前記非対称性多孔質膜の一部を切り取って形成してもよい。この時の溝の大きさなどは前述と同様である。
次に、本発明の血液保持用具の具体例として、血液検査用具として使用できる実施形態について、図４〜１０を用いて説明する。なお、本発明の血液保持用具は、これらには制限されない。
（実施形態Ｂ−１）
図４の断面図に、血液保持用具の第１の形態（Ｂ−１）を示す。同図に示すように、血液保持用具４０は、血液分離膜４６と支持体４４とを備え、血液分離膜４６の一端には分析試薬を含有させた試薬部４５が形成されている。血液分離膜４６の一方の表面には、その一端（試薬部４５とは反対側）が露出するように支持体４４が積層され、この露出部分が血液供給部４３となる。
このような血液保持用具４０によれば、例えば、血液供給部４３に血液を滴下すると、滴下された血液は、血液分離膜４６内を矢印Ａ方向に移行しながら、血球と血清とに分離される。なお、血液分離膜４６は前述のように溶血防止剤を含有するため、血球の溶血を防止しつつ、血球と血清とが分離される。そして、分離された血清は、血液分離膜４６内を移動して試薬部４５に展開され、試薬部４５において、分析試薬と血清中の分析対象物とが反応する。この反応を、例えば、電気化学的手法や光学的手法（目視を含む）によって検出すればよい。
（実施形態Ｂ−２）
図５の断面図に、血液保持用具の第２の形態（Ｂ−２）を示す。なお、特に示さない限り、本形態は、第１の形態（Ｂ−１）と同様であり、以下に示す第３〜第６の形態（Ｂ−３〜Ｂ−６）についても同様である。
同図に示すように、血液保持用具５０は、血液分離膜５６と分析試薬を含む試薬層５５と支持体５４とを備える。血液分離膜５６の一方の表面には、その一端が露出するように支持体５４が積層されており、この露出部分が血液供給部５３となる。また、血液分離膜５６の他方の表面（支持体積層面とは反対側表面）であって、かつ、血液供給部５３とは反対側の端部に、試薬層５５が積層されている。
このような血液保持用具５０によれば、例えば、血液分離膜５６内で分離された血清は、血液分離膜５６に積層した試薬層５５に展開され、試薬層５５中の分析試薬と血清中の分析対象物とが反応する。
（実施形態Ｂ−３）
図６の断面図に、血液保持用具の第３の形態（Ｂ−３）を示す。同図に示すように、血液保持用具６０は、血液分離膜６６、支持体６４および６７を備える。血液分離膜６６の一方の表面には、支持体６７が積層され、血液分離膜６６の他方の表面には、その一端が露出するように、支持体６４が積層されている。この露出部分が血液供給部６３となる。血液分離膜６６は、分析試薬を含有させた３つの試薬部を有し、これらの第１試薬部６５１、第２試薬部６５２および第３試薬部６５３は、図中の矢印Ａ方向に沿って順に形成されている。なお、これらの第１試薬部６５１、第２試薬部６５２および第３試薬部６５３には、第１分析試薬、第２分析試薬および第３分析試薬がそれぞれ含有されている。
このような血液保持用具６０によれば、例えば、血液分離膜６６内で分離された血清は、まず、第１試薬部６５１に展開され、血清中の分析対象物と第１分析試薬とが反応する。この反応液は、さらに第２試薬部６５２に展開され、第２分析試薬と反応する。そして、この反応液は、最終的に第３試薬部６５３に展開され、第３分析試薬と反応する。この反応を前述のように検出すればよい。
このような血液保持用具６０は、分析対象の測定を多段階反応を利用して行う場合に適しており、その反応順序に応じて、第１試薬部６５１、第２試薬部６５２および第３試薬部６５３にそれぞれ対応する試薬を配置すればよい。
（実施形態Ｂ−４）
図７の断面図に、血液保持用具の第４の形態（Ｂ−４）を示す。同図に示すように、血液保持用具７０は、血液分離膜７６、分析試薬を含む３つの試薬層（７５１、７５２および７５３）、支持体７４および７７を備える。血液分離膜７６の一方の表面には、その一端が露出するように支持体７４が積層されており、この露出部分が血液供給部７３となる。また、血液分離膜７６の他方の表面には、第１試薬層７５１、第２試薬層７５２および第３試薬層７５３が、図中の矢印Ａ方向に沿って順に積層されており、これらの試薬層を介して支持体７７がさらに積層されている。なお、第１試薬層７５１、第２試薬層７５２および第３試薬層７５３には、第１分析試薬、第２分析試薬および第３分析試薬がそれぞれ含有されている。
このような血液保持用具７０によれば、例えば、血液分離膜７６内で分離された血清は、血液分離膜７６に積層された第１試薬部７５１、第２試薬層７５２および第３試薬層７５３にそれぞれ展開される。そして、血清中の分析対象物が、各試薬層（７５１、７５２および７５３）の各分析試薬と反応する。このため、例えば、各試薬層にそれぞれ分析項目に応じた試薬を配置すれば、同一の用具で、同一の検体について、多項目の分析を行うことができる。
（実施形態Ｂ−５）
図８の断面図に、血液保持用具の第５の形態（Ｂ−５）を示す。
同図に示すように、血液保持用具８０は、血液分離膜８６、分析試薬を含む試薬層８５、支持体８４および８７を備える。血液分離膜８６の一方の表面には、その一端が露出するように支持体８４が積層されており、この露出部分が血液供給部８３となる。また、血液分離膜８６の他方の表面には、貫通孔を有する支持体８７が積層され、前記貫通孔に対応する部分には、試薬層８５が積層されている。
また、図９の断面図に示すように、支持体９７の貫通孔を矢印Ａ方向に沿って順に３つ設け、各貫通孔に対応する血液分離膜８６表面にそれぞれ試薬層（８５１、８５２および８５３）を設けてもよい。この血液保持用具９０は、第４の形態（Ｂ−４）と同様に、多項目検査に適している。なお、図８と同一箇所には、同一の符号を付してある。
（実施形態Ｂ−６）
図１０の断面図に、血液保持用具の第６の形態（Ｂ−６）を示す。
同図に示すように、血液保持用具１００は、血液分離膜１０２、展開層１０１、支持体１０４および１０７を備える。展開層１０１の一方の表面には、支持体１０７が積層されており、他方の表面には、その一端が露出するように支持体１０４が積層され、かつ、この露出部分には、血液分離膜１０２が積層されている。この血液分離膜１０２の表面が、血液供給部１０３となる。そして、展開層１０１には、図中の矢印Ａ方向に沿って、分析試薬を含有させた第１試薬部１５１および第２試薬部１５２が順に形成されている。そして、第２試薬部１５２は、さらに第１検出部を兼ね、この第２試薬部（第１検出部）１５２に対して、矢印Ａ方向の下流側が、第２検出部１５３となる。
以下に、血液保持用具１００を使用して、抗原抗体反応により、血清内成分の分析を行う方法の一例を説明する。なお、第１試薬部１５１には、分析対象物（抗原）に対する標識化された第１抗体および後述する第２抗体に対する標識化された第３抗体が配置されている。第２試薬部１５２には、抗原に対する未標識の第２抗体が固定化されている。前記標識化第１抗体と標識化第３抗体には、それぞれ、標識として着色ラテックス粒子が使用できる。
まず、血液供給部１０３に血液を滴下すると、血液分離膜１０２を通過することで血清が分離され、分離された血清は、展開層１０１内を矢印Ａ方向に移行する。前記血清は、はじめに、第１試薬部１５１に展開され、血清中の抗原と標識化第１抗体とが抗原抗体反応により複合体を形成する。この複合体、抗原と未結合の標識化第１抗体および標識化第３抗体を含む血清は、さらに第２試薬部１５２に展開される。ここで、前記複合体および標識化第３抗体は、第２試薬部１５２に固定化された未標識の第２抗体と、抗原抗体反応によって結合し、第２試薬部１５２に捕捉される。そして、抗原と未結合の標識化第１抗体、第１検出部（第２試薬部）１５２で捕捉されなかった前記複合体および標識化第３抗体を含む血清は、さらに、第２検出部１５３に展開される。
そして、測定は以下のように行われる。まず、第１検出部（第２試薬部）１５２において、捕捉された抗原と標識化第１抗体との複合体を検出する。さらに、第１検出部１５２において、捕捉された標識化第３抗体、第２検出部１５３において、第２試薬部１５２で捕捉されなかった標識化第３抗体をそれぞれ検出する。なお、これらの検出は、標識化第１抗体および標識化第３抗体の各標識（着色ラテックス）に特有の波長で吸光度を測定することにより行える。そして、標識化第３抗体の検出結果から、第２試薬部１５２における捕捉効率を求める。この捕捉効率と前記複合体の見かけ上の検出結果とから、真の複合体量（抗原量）を算出する。このように標識化第３抗体を合わせて測定することにより、捕捉効率を用いて補正できるため、本実施形態によれば、分析対象物（抗原）の分析制度を向上できる。
【実施例】
（実施例１、比較例１）
前記実施形態Ａ−１における図１に示す血液保持用具を作製し、これを用いて血球分離を行い、溶血の有無を確認した。以下、溶血防止剤の溶液濃度（％）は、特に示さない限り、溶媒の体積（１００ｍＬ）における溶血防止剤重量（単位：ｇ）を１００分率で示す（単位：（ｗ／ｖ）％）。
（展開用多孔質膜）
市販のポリエーテルスルホン酸製非対称性多孔質膜（商品名プライムケアーＳ／Ｇ：スペクトラル社製）を以下の条件で洗浄し、これを展開用多孔質膜として使用した。この多孔質膜の大きさは、厚み２９０μｍ、長さ２０ｍｍ、幅６ｍｍであり、その最大孔径は２００μｍであり、最小孔径は２μｍである。洗浄は、まず、前記非対称性多孔質膜を精製水に浸漬して１０分間放置した後、新たな精製水に入れ替え、この操作を合計５回行った。そして、前記非対称性多孔質を、半日風乾させた後、さらにデシケーター内で半日乾燥させたものを、前記展開用多孔質膜とした。
（血液分離膜）
予め、溶血防止剤を溶媒（蒸留水）に溶解して、下記表１に示す各溶血防止剤を準備した。ついで、厚み１２００μｍ、長さ１２ｍｍ、幅６ｍｍの市販のグラスフィルター（商品名ＡＰ２５：ミリポア社製）に、下記表１に示す各種濃度の溶血防止剤溶液３０μＬを滴下して乾燥させた。乾燥後のグラスフィルターを、血液分離膜として使用した。下記シルクエッセンスは、福井絹商事社製の商品名シルクエッセンスを使用した。
（血液保持用具の作製方法）
支持体として、長さ５０ｍｍ、幅６ｍｍ、厚み１８０μｍのＰＥＴフィルムを準備し、この上に、接着剤によって前記展開用多孔質膜を接着し、さらに図１に示すように前記展開用多孔質膜の一方の端部上に前記グラスフィルターを配置した。そして、グラスフィルターを配置していない前記展開用多孔質膜の表面にカバー用のＰＥＴ（厚み１００μｍ）を配置した。これを血液保持用具として使用した（実施例１−１〜１−８）。
一方、比較例１としては、グラスフィルターに５％グリシン溶液を含有させた以外は、前記実施例１と同様にして血液保持用具を作製した。
（血球の溶血）
作製した各血液保持用具のグラスフィルター表面に、全血（ヘマトクリット３８％）１００μＬを点着し、血球と血漿とを分離させて前記血漿を展開させた。そして、２分経過後、血球の溶血の有無を確認した。なお、血漿は、完全に展開部の先端（図１において、展開部１１の右端部）に浸透するまで展開させた。血球の溶血は、展開した血漿が血球内のＨｂによって赤く着色されているか否かで判断した。
前記表１に示すように、比較例１では溶血が見られたが、同じ濃度もしくはそれ以下の濃度の溶血防止剤溶液を含有させた実施例１（１−１〜１−８）では溶血が防止された。
（実施例２、比較例２）
溶血防止剤として、下記表２に示す各種溶血防止剤を含有させた以外は、実施例１と同様にして血液保持用具を作製し、これを用い血球の展開を確認した。
（血球展開距離の測定）
血球展開距離は、血漿が展開して展開部の先端（図１において、展開部１１の右端部）に達した時点において、展開用多孔質膜の血液を点着した側の端から血球の展開した先端（図１において、展開部１１の左端部）までの距離を測定した。
前記表１および表２に示すように、５％グリシン（比較例２）では溶血が生じたのに対し、溶血防止剤を同量若しくはそれ以下の量を含有させた実施例２（２−１〜２−６）では、溶血防止はもちろんのこと、血球の展開距離も比較例２より抑えることができた。このように、前記溶血防止剤を含有させた本実施例の血液保持用具によれば、血球展開の抑制と血漿展開の促進とにより血球と血漿とが十分に分離されるため、血漿の展開量が増加し、血漿回収率を向上できることがわかった。
（実施例３、比較例３）
以下に示す展開用多孔質膜（ろ紙、酢酸セルロース膜）および血球分離用多孔質膜（グラスフィルター）を使用し、溶血防止剤としてバリンを用いた以外は、前記実施例１と同様にして血液保持用具を作製した（実施例３−１、３−２）。なお、比較例３としては、血球分離用多孔質膜にバリンを含有させない以外は、前記実施例３−１もしくは３−２と同様にして血液保持用具を作製した（比較例３−１、３−２）。そして、これらを用いて実施例１および２と同様に血球分離を行い、溶血の有無、および血球の展開を確認した。これらの結果を下記表３に示す。
（ろ紙）
商品名３ＭＭｃｈｒ（ワットマン社製）
材質：セルロース製
厚み：３４０μｍ
重量：１８５ｇ／ｍｍ２
空孔率（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）：２０ｓｅｃ／１００ｍＬ／ｉｎｃｈ２
（酢酸セルロース膜）
商品名Ｃ３００Ａ２９３Ｃ（東洋ろ紙社製）
材質：酢酸セルロース
厚み：１８５μｍ
重量：４０ｇ／ｍｍ２
（血球分離用多孔質膜）
厚み１２００μｍのグラスフィルター（商品名ＡＰ２５：ミリポア社製）を使用した。
前記表３に示すように、グラスフィルターにバリンを含有させていない比較例３−１、３−２では溶血が生じたのに対して、実施例３−１、３−２では共に溶血が起こらなかった。また、実施例３−１は、比較例３−１よりも短い血球展開距離を示し、実施例３−２も、比較例３−２より短い血球展開距離を示した。このことから、前記実施例２と同様に、本実施例の血液保持用具によれば、血球の展開を抑制できるため、血漿のみの展開を増加でき、その回収率を向上できるといえる。なお、前記実施例３−１と３−２とにおいて、血球展開距離が異なるが、これは展開用多孔質膜の種類に起因するものである。
（実施例４、比較例４）
溶血防止剤として、各種濃度（５％、２％、１％）のバリン溶液、２％のロイシン溶液を含有させた以外は、実施例１と同様にして血液保持用具をそれぞれ１０個ずつ作製し、これを用いて血漿を回収し、血漿成分の測定を行った（実施例４）。
比較例４としては、所定濃度（２０％、５％、０％）のグリシン溶液をグラスフィルターに含有させた以外は、前記実施例１と同様にして血液保持用具それぞれ１０個ずつを作製した。
各血液保持用具に全血検体を滴下し、血球分離および血漿展開を行った。血漿の展開後、展開用多孔質膜のうち血漿のみが展開された部分を１０ｍｍ×６ｍｍの大きさに切り出した。この切片を、各溶血防止剤について１０枚集め、これらを直接遠心分離機にかけて（１５，０００ｇ、１０分間）、血漿を回収した。この血漿を試料として各成分量の測定を行った。なお、コントロールとしては、前記全血検体を遠心分離（３０００ｇ、１０分間）して得られた血漿を使用した。
（成分量の測定）
各成分量は、以下に示す市販キットを使用し、それらの使用方法に準じて、自動分析器（商品名：日立７０７０、日立製作所社製）により測定した。各種測定において、ブランクとして精製水を用いた。
１． 高比重リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）
：商品名 リキテック ＨＤＬ−Ｃ（ロシュ社製）
２． アミラーゼ（ＡＭＹ）
：商品名 ＡＭＹ−ＮＰ（デンカ生研社製）
３． アルブミン（ＡＬＢ）
：商品名 クリンメイトアルブミン（第一化学薬品社製）
４． グルタミック−オキサロアセティックトランスアミナーゼ（ＧＯＴ）
：商品名 リキテック ＧＯＴ ＩＦＣＣ（ロシュ社製）
５． ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）
：商品名 γ−ＧＴＰ−Ｊ−ＨＡワコー（和光純薬社製）
６． グルタミック−ピルビックトランスアミナーゼ（ＧＰＴ）
：商品名 リキテック ＧＰＴ ＩＦＣＣ（ロシュ社製）
７． トリグリセライド（ＴＧ）
：商品名 リキテック ＴＧ（ロシュ社製）
８． ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）
：商品名 ＬＤＨ ＩＩ−ＨＡワコー（和光純薬社製）
９． 総タンパク（ＴＰ）
：商品名 ＲＤ総タンパク（ロシュ社製）
１０． 総ビリルビン（Ｔ−Ｂｉｌ）
：商品名 Ｔ−Ｂｉｌ−Ｖ５（アズウェル社製）
１１． クレアチニン（ＣＲＥ）
：商品名 リキテック クレアチニン ＰＡＰ（ロシュ社製）
１２． 総コレステロール（ＴＣ）
：商品名 Ｔ−Ｃｈｏ−ＫＬ（国際試薬社製）
１３． アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）
：商品名 アルカリ性ホスファＩＩ−ＨＲテストワコー（和光純薬社製）
１４． 尿素窒素（ＢＵＮ）
：商品名 尿素窒素ＩＩ−ＨＡテストワコー（和光純薬社製）
１５． 尿酸（ＵＡ）
：商品名 ウリカラー・リキッド尿酸（小野薬品社製）
１６． フルクトサミン（ＦＲＡ）
：商品名 リキテックフルクトサミン（ロシュ社製）
１７． グルコース（Ｇｌｕ）
：商品名 リキテックグルコース（ロシュ社製）
１８． クレアチニンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）
：商品名 ＣＫ Ｅ−ＨＡテストワコー（和光純薬社製）
これらの実施例４および比較例４の結果について、コントロールの測定値を１００％とした場合の相対値（平均％）を下記表４に示す。
前記表４に示すように、グリシン添加の比較例によると、各成分の測定精度にバラツキが見られた。特にＧＧＴについてはコントロールに対する相対値が５０％前後という結果になった。これに対して、バリンまたはロイシンを添加した血液保持用具によれば、各成分ともに優れた測定結果が得られ、特にＧＧＴについても同様に優れた結果をなった。また、実施例４は全て溶血を防止できたが、比較例４においては、５％のグリシン溶液を含有させた血液保持用具について溶血が確認された。また、２０％のグリシン溶液を含有させた比較例４の血液保持用具については、すべての成分項目において、低い相対値を示す結果となった。これは、高グリシン濃度が原因となって血球が萎縮し、その分血漿成分の体積増加が起こり、その結果血漿成分の希釈が生じたためと考えられる。以上の結果から、本発明の血液保持用具によれば、溶血を防止し、かつ、各種成分測定に影響を与えることのないサンプルを調製できるといえる。
【産業上の利用可能性】
以上のように、本発明の血球分離膜によれば、血球の溶血を防止しつつ、血球と血清または血漿とを分離することができるため、効率よく血清または血漿サンプルを調製できる。また、これによって調製したサンプルは、各種成分の測定系への影響が少ないため、高精度な測定が可能になる。このため、本発明の血球分離膜および血液保持用具は、例えば、前述のような臨床医療等の分野において有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【技術分野】
本発明は、血液中の血球と、血清または血漿とを分離する血球分離膜および血液の保持や検査に使用する血液保持用具に関する。
【背景技術】
血液を検査する場合、検体毎に使い切るシート状の血液検査用具（試験片ともいう）が汎用されている。この検査用具は、血液を保持し、ここから血液を抽出して検査を行うタイプのものや、予め試薬等を検査用具に含有させたもの等があげられる。後者の用具は、例えば、その検査用具に血液を滴下することで血液と試薬とを反応させ、その反応を光学的手法や電気化学的手法により測定できる。
このような血液検査用具は、一般の臨床検査等では汎用されているだけでなく、例えば、遠隔臨床検査システムにおいても実際に使用されている。この遠隔臨床検査システムとは、在宅で患者自身が血液を採血し、これを血液検査用具に含有、乾燥させて、この血液検査用具を病院等の検査機関に郵送し、検査するシステムである。血液を郵送した患者等は、郵便等で検査結果を知ることも、また直接病院等に出向いても検査結果を知ることができる。
血糖値等のように、検査項目が血清または血漿中の成分の場合は、血液検査用具において、血液を血球と血清または血漿とに分離する必要がある。このため、従来の血液検査用具では、グラスフィルター等の血球分離材を血液検査用具に組み込むことが一般的であった。このような血液検査用具によれば、例えば、血球分離材によって血液を血球と血清・血漿とに分離し、前記血球分離材を通過した血清・血漿をさらに展開部に毛管現象によって展開させることによって、血清・血漿サンプルを調製できる。この他に、最近、孔径が厚み方向に変化する非対称性多孔質膜を用いた血液検査用具も開発されている（例えば、特表平１１−５０５３２７号公報）。非対称性多孔質膜の孔径が大きい方の面から血液を供給すると、血液が厚み方向に浸透する過程で前記血液から血球が分離され、血清・血漿が供給面と反対側に出てくるため、これを回収すればよい。このような非対称性多孔質膜を用いた血液検査用具は、血球の目詰まりが防止されるという利点を有する。
しかしながら、このような従来の血液検査用具では、血球分離に伴って前記血球が溶血して、前記血球内成分が血清等に混入するおそれがあるため、予め、溶血防止のための添加剤を血液中に含有させる必要がある（例えば、特開平９−１９６９０８号公報）。しかし、この場合、溶血は防止されるものの、前記添加剤の影響によって得られた血清・血漿中のヘマトクリット（Ｈｔ）値が大幅に低下し、血清・血漿成分を精度よく測定することが困難であるという問題がある。
【発明の開示】
そこで、本発明の目的は、血球分離に伴う血球の溶血を防止しつつ、血球と血清・血漿とを分離できる血球分離膜およびそれを用いた血液保持用具の提供である。
前記目的を達成するために、本発明の血球分離膜は、血液中の血清または血漿と血球とを分離する多孔質膜を含み、前記多孔質膜が、疎水性アミノカルボン酸、シルク由来のタンパク質、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸およびヘパリンからなる群から選択された少なくとも一つの溶血防止剤を含有することを特徴とする。
このように、本発明の血球分離膜は、前述のような種類の溶血防止剤を含有することによって、血球の溶血を防止できる。このため、前記血球分離膜を通過し、分離された血清または血漿試料は、前記血球内成分を含むことがなく、優れた精度で血清等の成分測定を行うことができる。また、溶血によるヘモグロビン色素の混入が防止されるため、前記分離された試料を、光学的手段や目視等によって直接測定することも可能になる。
また、本発明の血球分離膜を用いて血清・血漿サンプルを調製すれば、各種成分を高精度で測定することも可能になる。本発明者らは、前述のような従来の血球分離膜を使用した場合におけるヘマトクリット（Ｈｔ）値の低下や、各種分析項目における測定精度の低下について鋭意研究を行った。その結果、従来から溶血防止に使用されている添加物質がグリシンであり、通常、血球分離膜の体積（ｃｍ３）当たり約１００ｍｇ〜２００ｍｇの高濃度で含まれているため、前述のような影響が出ていることを突き止めた。特にＧＧＴ等の分析項目については、グリシンによる希釈効果だけでなく、グリシンによって血清または血漿成分が変化する結果、測定精度が低下していることを突き止めた。そして、本発明の血球分離膜のように、グリシンではなく前述の溶血防止剤を含有すれば、例えば、グリシンのように高濃度である必要はない。そのため、Ｈｔ値への影響も軽減され、各種分析項目、例えば、ＧＧＴについても高精度での測定が可能になることを見出したのである。以上のように、本発明の血球分離膜を用いれば、血球分離に伴う血球の溶血を防止しつつ、血球と血清・血漿とを分離でき、また、各種分析に影響を与えない血清または血漿試料を調製することができる。
つぎに、本発明の血液保持用具は、血液中の血球を分離する血球分離部と、血液中の血清または血漿を毛管現象により展開する展開部とを有し、前記血球分離部が、前記本発明の血球分離膜である。本発明の血液保持用具は、前述のような効果を奏する血球分離膜を有するため、例えば、前述のような遠隔臨床検査システムに特に有用であるといえる。なお、本発明の検体保持用具は、血球と血清・血漿とが分離された血液検体を、例えば、郵送等のために保持する用具としても使用でき、また、これ自体を目的成分の血液検査用具として使用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の血液保持用具の一実施例を示す断面図である。
図２は、本発明の血液保持用具のその他の実施例を示す断面図である。
図３は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図４は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図５は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図６は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図７は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図８は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図９は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
図１０は、本発明の血液保持用具のさらにその他の実施例を示す断面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
前述のように、本発明の血球分離膜は、血液中の血清または血漿と血球とを分離する多孔質膜を含み、前記多孔質膜が、疎水性アミノカルボン酸、シルク由来のタンパク質、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸およびヘパリンからなる群から選択された少なくとも一つの溶血防止剤を含有することを特徴とする。
前記疎水性アミノカルボン酸としては、例えば、疎水性アミノ酸が使用でき、具体的には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等が使用できる。前記シルク由来のタンパク質とは、フィブロインの加水分解物をいう（以下、「シルクエッセンス」ともいう）。
前記溶血防止剤の中でも、バリン、ロイシン、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸、シルクエッセンスが好ましい。これらを使用した場合、前述のような溶血防止効果に加えて、血清・血漿と血球とを優れた効率で分離するという効果をも奏するためである。メカニズムは不明であるが、前記血球分離膜内にこれらの溶血防止剤を含有させることによって、前記血球分離膜内における血球の浸透速度が抑制され、一方、血清・血漿の浸透速度が促進される。また、血球が前記血球分離膜を通過した場合でも、例えば、展開部における血球の展開速度が抑制され、かつ、血清または血漿の展開速度が促進される。そのため、前記展開部において、血球の展開距離を短く、血清または血漿の展開距離を長くすることができる。つまり、血球の展開抑制と血清・血漿の展開促進という、相反する効果を双方実現できるため、血清または血漿のみの展開量を増加できるのである。したがって、前述のような溶血防止剤を含有させた血球分離膜によれば、血球と血清または血漿とが分離し易くなる。さらに血球が前記血球分離膜を通過した場合でも、血球の展開による血清・血漿回収率への影響を抑制できるため、その回収率を向上することもできる。このため、供給する血液量も低減でき、例えば、採血時における患者の負担も軽減できる。
さらに、中でもバリン、トラネキサム酸、ε−アミノヘキサン酸が特に好ましい。これらを使用する場合、例えば、前述のグリシンと比較して、グリシンの１／５〜１／１０程度の含有量（重量）で、十分な効果を奏することからである
また、前記溶血防止剤は、いずれか一種類を用いてもよいし、二種類以上を組み合わせてもよい。組み合わせとしては、例えば、バリンとヘパリン、トラネキサム酸とヘパリン等の組み合わせがあげられる。
本発明において、前記溶血防止剤の含有量（重量）は、例えば、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり１ｍｇ〜５０ｍｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは５ｍｇ〜４０ｍｇの範囲であり、特に好ましくは１０ｍｇ〜３０ｍｇの範囲である。前記溶血防止剤の含有量が前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり１ｍｇ以上であれば溶血を十分に防止できる。なお、ここで「多孔質膜の体積」とは、多孔質膜の空孔部分を含む体積をいう。
具体的に、前記溶血防止剤がバリンの場合、その含有量（重量）は、例えば、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは１５ｍｇ〜４５ｍｇの範囲であり、特に好ましくは３０ｍｇ〜４０ｍｇの範囲である。
前記溶血防止剤がロイシンの場合、その含有量（重量）は、例えば、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり１ｍｇ〜３０ｍｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは５ｍｇ〜２５ｍｇの範囲であり、特に好ましくは１０ｍｇ〜２０ｍｇの範囲である。
前記溶血防止剤がトラネキサム酸の場合、その含有量（重量）は、例えば、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは１５ｍｇ〜４５ｍｇの範囲であり、特に好ましくは３０ｍｇ〜４０ｍｇの範囲である。
前記溶血防止剤がε−アミノヘキサン酸の場合、その含有量（重量）は、例えば、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは１０ｍｇ〜４５ｍｇの範囲であり、特に好ましくは３０ｍｇ〜４０ｍｇの範囲である。
本発明の血液分離膜は、前記溶血防止剤に加えて、さらに、例えば、プルラン、ＢＳＡ等の添加剤を含有していてもよい。これらと前記溶血防止剤とを併用することで、溶血防止効果をさらに向上できる。
前記血球分離膜は、その全体に前記溶血防止剤が含有されていることが好ましいが、例えば、血球分離膜の少なくとも一方の表面、特に血液が供給される表面のみに前記溶血防止剤が含有されていてもよい。
前記多孔質膜は、通常、その内部を血球が通過し難いことが望ましく、例えば、血球が通過できない孔径の孔を有していることが好ましい。本発明において、「血球が通過できない孔径の孔」とは、孔径が血球の球径より小さいという意味ではなく、どのようなメカニズムかは問わず、結果的に血球が通過できない孔径であればよい。したがって、血球が通過できない孔径には、血球の球径より大きい孔径も含まれる。また、本発明の血球分離膜によれば、前述のように、例えば、前記分離膜を血球が通過した場合であっても、前記溶血防止剤により血清または血漿の展開速度を促進し、血球の展開速度を抑制されることも可能である。この場合には、前記多孔質膜は、多孔質膜内部で完全に血球の通過を阻止し、前記血球を保持するものではなく、例えば、血球が部分的に通過してしまう多孔質膜であってもよい。
具体的に、前記多孔質膜は、０．１μｍ〜２０μｍの孔径の孔を有することが好ましく、より好ましくは１μｍ〜１０μｍであり、特に好ましくは２μｍ〜８μｍである。
前記多孔質膜としては、特に制限されず、従来から血球分離に使用されている各種材料が使用できる。具体的には、例えば、グラスフィルターや、厚み方向に平均孔径が連続的または不連続的に小さくなる孔径分布の非対称性多孔質膜等が使用できる。
前記グラスフィルターとしては、例えば、繊維密度が疎であるものが好ましく、市販のグラスフィルター、例えば、ミリポア社製の商品名ＡＰ２５等を使用してもよい。
また、前記多孔質膜として非対称性多孔質膜を使用した場合、厚み方向に向かって孔径が変化するため、例えば、前記多孔質膜内部を厚み方向に血液が進むにつれ、徐々に血球が通過できなくなり、血球が通過できない孔径の部位で血球が保持される。したがって、目詰まりも起こり難く、迅速かつ容易に血球を分離できる。なお、本発明において、「平均孔径が不連続的に小さくなる」とは、例えば、段階的に小さくなること等をいう。
前記非対称性多孔質膜の孔径は、最大孔径が１０μｍ〜３００μｍの範囲で、最小孔径が０．１μｍ〜３０μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは最大孔径が１００μｍ〜２００μｍの範囲で、最小孔径が１μｍ〜１０μｍの範囲であり、特に好ましくは最大孔径が１５０μｍ〜２００μｍの範囲で、最小孔径１μｍ〜５μｍの範囲である。
前記非対称性多孔質膜の材質としては、特に制限されないが、例えば、ポリエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、セルロースアセテート、ポリアミド、ポリイミド、ポリスチレン等の樹脂があげられる。これらの多孔質膜は、単独で使用してもよいし、これらを２種類以上組み合わせて使用してもよい。これらの中でも好ましくは、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンであり、特に好ましくはポリエーテルスルホンである。
また、前記非対称性多孔質膜は、前述のような各種樹脂を用いて作製してもよいし、市販の非対称性多孔質膜、例えば、Ｕ．Ｓフィルター社製の商品名ＢＳＴ−ＳＰ、Ｐｒｉｍｅｃａｒｅ社製の商品名Ｓ／Ｇ等を使用してもよい。
前記血球分離膜の大きさは、例えば、供給する血液量等に応じて適宜決定できる。具体的には、供給する血液量が１２０μＬの場合、例えば、長さ４ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み５０μｍ〜長さ５０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み２０００μｍであり、好ましくは長さ５ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み７５μｍ〜長さ３０ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み１２５０μｍであり、より好ましくは長さ１０ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み９０μｍ〜長さ２０ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み１１００μｍである。なお、前記長さとは、血球分離膜の長手方向の長さ、幅とは幅方向の長さをそれぞれ示し、以下同様である。
前記血球分離膜としてグラスフィルターを使用した場合、その厚みは、例えば、２００μｍ〜２０００μｍの範囲であり、好ましくは５００μｍ〜１０００μｍの範囲である。また、その大きさは、供給する血液量が１２０μＬの場合、例えば、長さ４ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み１００μｍ〜長さ５０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み２０００μｍであり、好ましくは長さ５ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み２００μｍ〜長さ３０ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み１２５０μｍであり、より好ましくは長さ１０ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み２５０μｍ〜長さ２０ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み１１００μｍである。
前記血球分離膜として非対称性多孔質膜を使用した場合、その厚みは、例えば、５０μｍ〜４００μｍの範囲であり、好ましくは１００μｍ〜３５０μｍの範囲である。また、その大きさは、供給する血液量が４０μＬの場合、例えば、長さ４ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み５０μｍ〜長さ５０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み４００μｍであり、好ましくは長さ５ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み１００μｍ〜長さ３０ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み３５０μｍであり、より好ましくは長さ１０ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み２００μｍ〜長さ２０ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み３００μｍである。
本発明の血球分離膜の製造方法は、特に制限されず、例えば、前記溶血防止剤の分散液または溶液に前記多孔質膜を浸漬して乾燥させたり、前記分散液等を前記多孔質膜に滴下して浸透させた後、乾燥する方法等がある。
前記分散液または溶液における前記溶血防止剤の濃度は、例えば、０．１重量％〜５重量％の範囲であり、好ましくは０．５重量％〜４重量％の範囲、より好ましくは２重量％〜３重量％の範囲である。
また、前記多孔質膜は、全血の透過を速やかに行えることから、前記溶血防止剤を保持させる前に、予め、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等の親水性高分子等の処理溶液に浸漬することによって、親水化処理を施してもよい。前記処理溶液の濃度は、例えば、０．１重量％〜５０重量％の範囲であり、処理時間は、例えば、０．１時間〜２４時間の範囲である。前記溶液の溶媒としては、例えば、水や各種有機溶媒等が使用でき、前記有機溶媒としてはエタノール等のアルコール類等があげられる。
つぎに、本発明の血液保持用具は、前述のように、血液中の血球を分離する血球分離部と、血液中の血清または血漿を毛管現象により展開する展開部とを有し、前記血球分離部が、前記本発明の血球分離膜であることを特徴とする。
本発明の血液保持用具としては、例えば、前記展開部と前記血球分離部とが積層された積層型の実施形態Ａ−１、非対称性多孔質膜が前記展開部と前記血球分離部とを備える単層型の実施形態（Ａ−２およびＡ−３）および血液分離膜が血球分離部と展開部とを備える単層型の実施形態があげられる。Ａ−１、Ａ−２およびＡ−３の形態について、以下に具体的に説明する。
（実施形態Ａ−１）
この実施形態は、前記血球分離部が本発明の血球分離膜であり、前記展開部が多孔質膜から構成され、前記展開部（展開用多孔質膜）の上に、前記血球分離膜が積層されている例である。この実施形態においては、前記血球分離膜の表面が血液供給部となる。
図１の断面図に、前記血液保持用具の一例を示す。同図に示すように、この血液保持用具１０は、展開部１１の一方の端部上に、血球分離部１２が積層された構造であり、血球分離部１２の表面が、血液供給部１３となっている。同図において矢印Ａは、血液中の血清・血漿の展開方向を示す（以下、図２〜１０においても同じ）。
展開部１１を構成する展開用多孔質膜としては、例えば、ろ紙、酢酸セルロース膜、多孔質膜、ガラス繊維膜が使用できる。前記多孔質膜の材質としては、例えば、ポリエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、セルロースアセテート、ポリアミド、ポリイミド、ポリスチレン等の樹脂等があげられ、好ましくはポリエーテルスルホン、ポリカーボネートである。また、前述のような非対称性多孔質膜を使用することもできる。展開部として前記非対称性多孔質膜を使用すれば、血球が血球分離部を通過した場合でも、前記非対称性多孔質膜の孔構造によって、展開部において、さらに、血球分離を行うことができる。これらの多孔質膜は、単独で使用してもよいし、これらを２種類以上組み合わせて使用してもよい。これらの中でも好ましくは、例えば、ろ紙、酢酸セルロース膜、ニトロセルロース膜、ポリスルホン製多孔質膜、ポリエステル製多孔質膜、ポリカーボネート製多孔質膜であり、特に好ましくは、ろ紙、ポリスルホン製多孔質膜、ポリエステル製多孔質膜である。また、前述の血球分離膜と同様に、血清または血漿の展開をより一層促進できることから、親水化処理を施してもよい。
前記展開用多孔質膜の平均孔径は、例えば、血清または血漿が毛管現象によって展開できれば特に制限されないが、０．１μｍ〜３００μｍの範囲が好ましく、より好ましくは１μｍ〜１００μｍであり、特に好ましくは２μｍ〜５０μｍである。この展開用多孔質膜の大きさは、例えば、供給する血液量等に応じて適宜決定できるが、供給する血液量が４０μＬの場合、例えば、長さ４ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み５０μｍ〜長さ５０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み４００μｍであり、好ましくは長さ５ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み１００μｍ〜長さ３０ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み３５０μｍであり、より好ましくは長さ１０ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み２００μｍ〜長さ２０ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み３００μｍである。
また、前記血球分離膜だけでなく、前記展開用多孔質膜にも前記溶血防止剤が含有されていてもよい。
前記血球分離膜と展開用多孔質膜との組み合わせとしては、特に制限されないが、例えば、血球分離膜としてグラスフィルター、展開用多孔質膜として非対称性多孔質膜を使用する組み合わせや、血球分離膜として非対称性多孔質膜、展開用多孔質膜としてニトロセルロース膜を使用する組み合わせ等が好ましい。
本実施形態の血液保持用具は、例えば、前記展開用多孔質膜の上に前記血球分離膜を配置して、積層するだけでもよいし、前記展開用多孔質膜と前記血球分離膜との位置決めを行い、前記両者の端部を接着または圧着等することで製造できる。
また、前記展開用多孔質膜が、支持体で支持されていることが好ましい。前記展開用多孔質膜の強度に関係なく、充分な強度の血液保持用具を得ることができ、かつ、取り扱いが簡便になるためである。前記支持体を形成する材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン共重合体（ＡＢＳ）等のプラスチックが使用できる。前記材料は、いずれか一種類でも、二種類以上を併用してもよい。また、後述のように血液保持用具を用いて、光学的手法等によって直接測定する場合には、前記支持体が、光透過性であることが好ましく、例えば、ポリスチレン、ＰＥＴ、アクリル樹脂製の支持体等が使用できる。
つぎに、図１に基づき、血液保持用具１０に血液を添加して血清または血漿試料を調製する一例について説明する。
まず、血液を血球分離部１２表面の血液供給部１３に滴下する。血液は、血球分離部１２内を厚み方向に移行しながら、血球と血清・血漿とに分離される。そして、分離された血清・血漿は、展開部１１に到達し、毛管現象によって展開部１１内を面方向（同図において矢印Ａ方向）に展開する。この際、本発明の血液保持用具によれば、血球分離部１２は前記溶血防止剤を含有するため、血球を分離する際に生じる溶血が防止され、血球成分の混入が抑制された血清または血漿試料が得られる。
展開した血清または血漿試料を回収する場合は、血液保持用具１０を風乾または自然乾燥等により乾燥する。その後、血液保持用具１０から展開部１１を剥離し、展開部１１から血清または血漿の展開部分のみを切り抜けばよい。
そして、切り抜き等により得られた切片を、例えば、試験管に入れ、これに抽出溶液を添加し、放置することによって血清または血漿を抽出し、回収する。前記抽出溶液としては、血清または血漿を抽出でき、血清または血漿中の分析対象成分の検出に影響を与えないものであれば特に制限されない。例えば、緩衝液、生理食塩水、精製水、蛋白溶液等や、これらの混合液であってもよい。前記緩衝液としては、例えば、リン酸、クエン酸、塩酸、酢酸等を含む各種緩衝液等があげられ、そのｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８の範囲である。前記抽出溶液の添加量は、特に制限されないが、切片の大きさ等によって適宜決定でき、例えば、切片体積の１倍〜１０００倍の範囲である。また、抽出処理時間は、特に制限されず、例えば、１分〜３００分の範囲である。
また、血清または血漿を展開させた後、展開部を切り抜き、直接遠心分離することによっても回収できる。
この回収液を用いて、血清または血漿中の分析対象成分の測定を行うことができる。
一方、この血液保持用具１０において、展開部１１に保持された血清または血漿を抽出液で回収せずに、そのまま分析を行うこともできる。この場合は、予め、展開部１１に分析用試薬を含有させて、試薬部を形成すればよい。展開部１１に試薬を配置する方法は、例えば、印刷法、含浸法、噴霧法等があげられる。
前記分析用試薬は、特に制限されず、目的の分析対象成分の種類により適宜決定できる。前記試薬の成分としては、例えば、各種酵素、リン酸塩や炭酸塩等の緩衝物質、発色剤等があげられる。具体的には、グルコースを分析する場合は、例えば、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、β−ＮＡＤＰ、ＡＴＰおよび緩衝液等を含有させればよい。
また、展開部１１に、血清または血漿の移動方向に対し並列に試薬を含有させれば、同一の血液保持用具において、多項目の分析を行うことができる。この場合、多項目の試薬が混合しないように、例えば、疎水性樹脂溶液を含有させておくことにより、試薬部間に境界層を設けることが好ましい。
このような血液保持用具１０によれば、前述のように血液を供給して血清または血漿を展開させると、展開部１１内で各種分析対象成分とその検出試薬とがそれぞれ反応する。この反応による発色等を、電気化学的手法や光学的手法（目視を含む）により検出すれば、容易に分析を行うことができる。
（実施形態Ａ−２）
この実施形態は、前記血球分離部が非対称性多孔質膜であり、前記非対称性多孔質膜がさらに前記展開部を有し、前記非対称性多孔質膜において、前記血球分離部と前記展開部とが面方向に位置し、血球を供給する側が前記血球分離部であり、前記供給した血液の展開方向に沿って下流側が展開部である構成となる。つまり、一つの非対称性多孔質膜の面方向に、血球分離部と展開部とが存在し、一つの非対称性多孔質膜内において、血球分離と血清または血漿の展開とを行うことができる形態である。
図２の断面図に、前記血液保持用具の一例を示す。同図に示すように、この血液保持用具２０は、厚み方向に平均孔径が連続的または不連続的に小さくなる孔径分布の非対称性多孔質膜から構成されている。矢印Ａ方向の上流側が血液分離部２２であり、下流側が展開部２１である。そして、血液分離部２２の表面が血液供給部２３となる。
前記非対称性多孔質膜の孔径は、最大孔径が、例えば、１０μｍ〜３００μｍの範囲であり、好ましくは５０μｍ〜１５０μｍの範囲、最小孔径が、例えば、０．１μｍ〜３０μｍの範囲であり、好ましくは１μｍ〜１０μｍの範囲である。
血液保持用具２０の大きさは、前述と同様に特に制限されず、供給する血液検体の量等に応じて適宜決定できる。供給する全血が約１００μＬの場合、血液保持用具２０全体の大きさは、例えば、長さ４ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み５０μｍ〜長さ６０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み４００μｍであり、好ましくは長さ５ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み１００μｍ〜長さ３０ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み３５０μｍであり、より好ましくは長さ１０ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み２００μｍ〜長さ２０ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み３００μｍである。なお、長さとは、血液保持用具の長手方向の長さを、幅とは幅方向の長さをそれぞれいう。
このような血液保持用具２０は、例えば、血液分離部２２と展開部２１とが、厳密に境界線によって分けられる必要はない。血液保持用具２０では、血液供給部２３に血液を滴下すると、前記血液は、厚み方向に移動しながら、血球と血清または血漿とに分離しつつ、その面方向（同図において矢印Ａ方向）にさらに展開される。血液供給部２３の大きさは、例えば、長さ２ｍｍ×幅１．５ｍｍ〜長さ１５ｍｍ×幅２０ｍｍであり、好ましくは長さ４ｍｍ×幅３ｍｍ〜長さ１０ｍｍ×幅１５ｍｍであり、より好ましくは長さ４ｍｍ×幅５ｍｍ〜長さ６ｍｍ×幅１２ｍｍである。この血液供給部２３の厚み方向領域が、通常、血球分離部２２にあたる。
この血液保持用具２０は、前述のように単層の非対称性多孔質膜から構成される。このため、例えば、前記溶血防止剤を含有する溶液を、血球分離部２２とする部分のみに含有させてもよいし、また、前記非対称性多孔質膜を前記溶液に浸漬させて、全体に含浸させてもよい。
つぎに、図２に基づき、前記血液保持用具２０に血液を添加して血清または血漿試料を調製する一例について説明する。
まず、血液供給部２３に血液を滴下する。前記血液は、血液分離部２２の内部を厚み方向に移行しながら血球を分離する。そして、血清または血漿は、その面方向（同図において矢印Ａ方向）に移動し、毛管現象によって展開部２１に展開される。以後は、前記実施形態Ａ−１と同様に展開部２１から血清または血漿を回収すればよい。
（実施形態Ａ−３）
実施形態Ａ−２に示すような血液分離部および展開部の双方を備える非対称性多孔質膜から構成される血液保持用具は、より一層血球分離の効率を上げるため、例えば、前記血球分離部と前記展開部との境界に、さらに血球遮断部が設けられていることが好ましい。具体的には、前記血球分離部と前記展開部との間であって前記非対称性多孔質膜の幅方向に、血球が通過できない孔径の孔のみからなる血球遮断部が形成されている。そして、血液を供給した際に、血液の展開方向に沿って、前記血球遮断部よりも下流側が展開部であり、前記血球遮断部と、前記血球遮断部よりも上流側とが血液分離部となる構造である。このような構造であれば、例えば、血液中の血球が厚み方向だけでなく、面方向に移動した場合であっても、前記血球遮断部によって、確実に展開部への血球の通過が防止され、血清または血漿のみを展開部に展開することが可能になる。また、前記血球遮断部は、例えば、前記非対称性多孔質膜の前記幅方向に溝が形成され、前記溝の底面からこの底面に対応する非対称性多孔質膜表面までの間の部分であることが好ましい。なお、特に示さない限り、本実施形態の血液保持用具は、前記実施形態Ａ−２と同様の条件（大きさ、材料等）である。
図３の断面図に、前記血液保持用具の一例を示す。同図に示すように、この血液保持用具３０は、前記実施形態Ａ−２の血液保持用具２０と同様に、単層の非対称性多孔質膜から構成されており、さらに、その幅方向に溝が形成されている。この溝の底面から、前記底面に対応する非対称性多孔質膜表面までの間の部分が、血球遮断部３２となる。そして、血球遮断部３２と矢印Ａ方向の上流側とが血球分離部となり、血球遮断部３２の下流側が展開部３１となる。また、血球分離部の孔径の大きい表面が血液供給部３３となる。
前記非対称性多孔質膜において、血球遮断部３２の孔径は、例えば、０．１μｍ〜５０μｍの範囲であり、好ましくは１μｍ〜３０μｍの範囲である。
血液保持用具３０の大きさは、前述と同様に特に制限されず、供給する血液検体の量等に応じて適宜決定できる。供給する全血が約１００μＬの場合、血球遮断部３２の大きさは、例えば、長さ０．１ｍｍ×幅１．５ｍｍ×厚み１０μｍ〜長さ１０ｍｍ×幅２０ｍｍ×厚み４００μｍであり、好ましくは長さ０．２ｍｍ×幅３ｍｍ×厚み１５μｍ〜長さ８ｍｍ×幅１５ｍｍ×厚み３５０μｍであり、より好ましくは長さ０．３ｍｍ×幅５ｍｍ×厚み２０μｍ〜長さ６ｍｍ×幅１２ｍｍ×厚み３００μｍである。
前記溝は、例えば、前記非対称性多孔質膜の表面の一部を圧縮して形成できる。例えば、円盤状ローラーを転がして圧縮したり、刃先が鈍い刃物で切れない程度に圧縮することにより形成できる。このように、圧縮により溝を形成した場合、血球遮断部において、非対称性多孔質膜の大きい孔径の孔も含まれることとなるが、圧縮により孔が変形したり潰れたりしているため、血球が通過することがない。
また、前記溝は、例えば、カッター等の刃物を用いて、前記非対称性多孔質膜の一部を切り取って形成してもよい。この時の溝の大きさなどは前述と同様である。
次に、本発明の血液保持用具の具体例として、血液検査用具として使用できる実施形態について、図４〜１０を用いて説明する。なお、本発明の血液保持用具は、これらには制限されない。
（実施形態Ｂ−１）
図４の断面図に、血液保持用具の第１の形態（Ｂ−１）を示す。同図に示すように、血液保持用具４０は、血液分離膜４６と支持体４４とを備え、血液分離膜４６の一端には分析試薬を含有させた試薬部４５が形成されている。血液分離膜４６の一方の表面には、その一端（試薬部４５とは反対側）が露出するように支持体４４が積層され、この露出部分が血液供給部４３となる。
このような血液保持用具４０によれば、例えば、血液供給部４３に血液を滴下すると、滴下された血液は、血液分離膜４６内を矢印Ａ方向に移行しながら、血球と血清とに分離される。なお、血液分離膜４６は前述のように溶血防止剤を含有するため、血球の溶血を防止しつつ、血球と血清とが分離される。そして、分離された血清は、血液分離膜４６内を移動して試薬部４５に展開され、試薬部４５において、分析試薬と血清中の分析対象物とが反応する。この反応を、例えば、電気化学的手法や光学的手法（目視を含む）によって検出すればよい。
（実施形態Ｂ−２）
図５の断面図に、血液保持用具の第２の形態（Ｂ−２）を示す。なお、特に示さない限り、本形態は、第１の形態（Ｂ−１）と同様であり、以下に示す第３〜第６の形態（Ｂ−３〜Ｂ−６）についても同様である。
同図に示すように、血液保持用具５０は、血液分離膜５６と分析試薬を含む試薬層５５と支持体５４とを備える。血液分離膜５６の一方の表面には、その一端が露出するように支持体５４が積層されており、この露出部分が血液供給部５３となる。また、血液分離膜５６の他方の表面（支持体積層面とは反対側表面）であって、かつ、血液供給部５３とは反対側の端部に、試薬層５５が積層されている。
このような血液保持用具５０によれば、例えば、血液分離膜５６内で分離された血清は、血液分離膜５６に積層した試薬層５５に展開され、試薬層５５中の分析試薬と血清中の分析対象物とが反応する。
（実施形態Ｂ−３）
図６の断面図に、血液保持用具の第３の形態（Ｂ−３）を示す。同図に示すように、血液保持用具６０は、血液分離膜６６、支持体６４および６７を備える。血液分離膜６６の一方の表面には、支持体６７が積層され、血液分離膜６６の他方の表面には、その一端が露出するように、支持体６４が積層されている。この露出部分が血液供給部６３となる。血液分離膜６６は、分析試薬を含有させた３つの試薬部を有し、これらの第１試薬部６５１、第２試薬部６５２および第３試薬部６５３は、図中の矢印Ａ方向に沿って順に形成されている。なお、これらの第１試薬部６５１、第２試薬部６５２および第３試薬部６５３には、第１分析試薬、第２分析試薬および第３分析試薬がそれぞれ含有されている。
このような血液保持用具６０によれば、例えば、血液分離膜６６内で分離された血清は、まず、第１試薬部６５１に展開され、血清中の分析対象物と第１分析試薬とが反応する。この反応液は、さらに第２試薬部６５２に展開され、第２分析試薬と反応する。そして、この反応液は、最終的に第３試薬部６５３に展開され、第３分析試薬と反応する。この反応を前述のように検出すればよい。
このような血液保持用具６０は、分析対象の測定を多段階反応を利用して行う場合に適しており、その反応順序に応じて、第１試薬部６５１、第２試薬部６５２および第３試薬部６５３にそれぞれ対応する試薬を配置すればよい。
（実施形態Ｂ−４）
図７の断面図に、血液保持用具の第４の形態（Ｂ−４）を示す。同図に示すように、血液保持用具７０は、血液分離膜７６、分析試薬を含む３つの試薬層（７５１、７５２および７５３）、支持体７４および７７を備える。血液分離膜７６の一方の表面には、その一端が露出するように支持体７４が積層されており、この露出部分が血液供給部７３となる。また、血液分離膜７６の他方の表面には、第１試薬層７５１、第２試薬層７５２および第３試薬層７５３が、図中の矢印Ａ方向に沿って順に積層されており、これらの試薬層を介して支持体７７がさらに積層されている。なお、第１試薬層７５１、第２試薬層７５２および第３試薬層７５３には、第１分析試薬、第２分析試薬および第３分析試薬がそれぞれ含有されている。
このような血液保持用具７０によれば、例えば、血液分離膜７６内で分離された血清は、血液分離膜７６に積層された第１試薬部７５１、第２試薬層７５２および第３試薬層７５３にそれぞれ展開される。そして、血清中の分析対象物が、各試薬層（７５１、７５２および７５３）の各分析試薬と反応する。このため、例えば、各試薬層にそれぞれ分析項目に応じた試薬を配置すれば、同一の用具で、同一の検体について、多項目の分析を行うことができる。
（実施形態Ｂ−５）
図８の断面図に、血液保持用具の第５の形態（Ｂ−５）を示す。
同図に示すように、血液保持用具８０は、血液分離膜８６、分析試薬を含む試薬層８５、支持体８４および８７を備える。血液分離膜８６の一方の表面には、その一端が露出するように支持体８４が積層されており、この露出部分が血液供給部８３となる。また、血液分離膜８６の他方の表面には、貫通孔を有する支持体８７が積層され、前記貫通孔に対応する部分には、試薬層８５が積層されている。
また、図９の断面図に示すように、支持体９７の貫通孔を矢印Ａ方向に沿って順に３つ設け、各貫通孔に対応する血液分離膜８６表面にそれぞれ試薬層（８５１、８５２および８５３）を設けてもよい。この血液保持用具９０は、第４の形態（Ｂ−４）と同様に、多項目検査に適している。なお、図８と同一箇所には、同一の符号を付してある。
（実施形態Ｂ−６）
図１０の断面図に、血液保持用具の第６の形態（Ｂ−６）を示す。
同図に示すように、血液保持用具１００は、血液分離膜１０２、展開層１０１、支持体１０４および１０７を備える。展開層１０１の一方の表面には、支持体１０７が積層されており、他方の表面には、その一端が露出するように支持体１０４が積層され、かつ、この露出部分には、血液分離膜１０２が積層されている。この血液分離膜１０２の表面が、血液供給部１０３となる。そして、展開層１０１には、図中の矢印Ａ方向に沿って、分析試薬を含有させた第１試薬部１５１および第２試薬部１５２が順に形成されている。そして、第２試薬部１５２は、さらに第１検出部を兼ね、この第２試薬部（第１検出部）１５２に対して、矢印Ａ方向の下流側が、第２検出部１５３となる。
以下に、血液保持用具１００を使用して、抗原抗体反応により、血清内成分の分析を行う方法の一例を説明する。なお、第１試薬部１５１には、分析対象物（抗原）に対する標識化された第１抗体および後述する第２抗体に対する標識化された第３抗体が配置されている。第２試薬部１５２には、抗原に対する未標識の第２抗体が固定化されている。前記標識化第１抗体と標識化第３抗体には、それぞれ、標識として着色ラテックス粒子が使用できる。
まず、血液供給部１０３に血液を滴下すると、血液分離膜１０２を通過することで血清が分離され、分離された血清は、展開層１０１内を矢印Ａ方向に移行する。前記血清は、はじめに、第１試薬部１５１に展開され、血清中の抗原と標識化第１抗体とが抗原抗体反応により複合体を形成する。この複合体、抗原と未結合の標識化第１抗体および標識化第３抗体を含む血清は、さらに第２試薬部１５２に展開される。ここで、前記複合体および標識化第３抗体は、第２試薬部１５２に固定化された未標識の第２抗体と、抗原抗体反応によって結合し、第２試薬部１５２に捕捉される。そして、抗原と未結合の標識化第１抗体、第１検出部（第２試薬部）１５２で捕捉されなかった前記複合体および標識化第３抗体を含む血清は、さらに、第２検出部１５３に展開される。
そして、測定は以下のように行われる。まず、第１検出部（第２試薬部）１５２において、捕捉された抗原と標識化第１抗体との複合体を検出する。さらに、第１検出部１５２において、捕捉された標識化第３抗体、第２検出部１５３において、第２試薬部１５２で捕捉されなかった標識化第３抗体をそれぞれ検出する。なお、これらの検出は、標識化第１抗体および標識化第３抗体の各標識（着色ラテックス）に特有の波長で吸光度を測定することにより行える。そして、標識化第３抗体の検出結果から、第２試薬部１５２における捕捉効率を求める。この捕捉効率と前記複合体の見かけ上の検出結果とから、真の複合体量（抗原量）を算出する。このように標識化第３抗体を合わせて測定することにより、捕捉効率を用いて補正できるため、本実施形態によれば、分析対象物（抗原）の分析制度を向上できる。
【実施例】
（実施例１、比較例１）
前記実施形態Ａ−１における図１に示す血液保持用具を作製し、これを用いて血球分離を行い、溶血の有無を確認した。以下、溶血防止剤の溶液濃度（％）は、特に示さない限り、溶媒の体積（１００ｍＬ）における溶血防止剤重量（単位：ｇ）を１００分率で示す（単位：（ｗ／ｖ）％）。
（展開用多孔質膜）
市販のポリエーテルスルホン酸製非対称性多孔質膜（商品名プライムケアーＳ／Ｇ：スペクトラル社製）を以下の条件で洗浄し、これを展開用多孔質膜として使用した。この多孔質膜の大きさは、厚み２９０μｍ、長さ２０ｍｍ、幅６ｍｍであり、その最大孔径は２００μｍであり、最小孔径は２μｍである。洗浄は、まず、前記非対称性多孔質膜を精製水に浸漬して１０分間放置した後、新たな精製水に入れ替え、この操作を合計５回行った。そして、前記非対称性多孔質を、半日風乾させた後、さらにデシケーター内で半日乾燥させたものを、前記展開用多孔質膜とした。
（血液分離膜）
予め、溶血防止剤を溶媒（蒸留水）に溶解して、下記表１に示す各溶血防止剤を準備した。ついで、厚み１２００μｍ、長さ１２ｍｍ、幅６ｍｍの市販のグラスフィルター（商品名ＡＰ２５：ミリポア社製）に、下記表１に示す各種濃度の溶血防止剤溶液３０μＬを滴下して乾燥させた。乾燥後のグラスフィルターを、血液分離膜として使用した。下記シルクエッセンスは、福井絹商事社製の商品名シルクエッセンスを使用した。
（血液保持用具の作製方法）
支持体として、長さ５０ｍｍ、幅６ｍｍ、厚み１８０μｍのＰＥＴフィルムを準備し、この上に、接着剤によって前記展開用多孔質膜を接着し、さらに図１に示すように前記展開用多孔質膜の一方の端部上に前記グラスフィルターを配置した。そして、グラスフィルターを配置していない前記展開用多孔質膜の表面にカバー用のＰＥＴ（厚み１００μｍ）を配置した。これを血液保持用具として使用した（実施例１−１〜１−８）。
一方、比較例１としては、グラスフィルターに５％グリシン溶液を含有させた以外は、前記実施例１と同様にして血液保持用具を作製した。
（血球の溶血）
作製した各血液保持用具のグラスフィルター表面に、全血（ヘマトクリット３８％）１００μＬを点着し、血球と血漿とを分離させて前記血漿を展開させた。そして、２分経過後、血球の溶血の有無を確認した。なお、血漿は、完全に展開部の先端（図１において、展開部１１の右端部）に浸透するまで展開させた。血球の溶血は、展開した血漿が血球内のＨｂによって赤く着色されているか否かで判断した。
前記表１に示すように、比較例１では溶血が見られたが、同じ濃度もしくはそれ以下の濃度の溶血防止剤溶液を含有させた実施例１（１−１〜１−８）では溶血が防止された。
（実施例２、比較例２）
溶血防止剤として、下記表２に示す各種溶血防止剤を含有させた以外は、実施例１と同様にして血液保持用具を作製し、これを用い血球の展開を確認した。
（血球展開距離の測定）
血球展開距離は、血漿が展開して展開部の先端（図１において、展開部１１の右端部）に達した時点において、展開用多孔質膜の血液を点着した側の端から血球の展開した先端（図１において、展開部１１の左端部）までの距離を測定した。
前記表１および表２に示すように、５％グリシン（比較例２）では溶血が生じたのに対し、溶血防止剤を同量若しくはそれ以下の量を含有させた実施例２（２−１〜２−６）では、溶血防止はもちろんのこと、血球の展開距離も比較例２より抑えることができた。このように、前記溶血防止剤を含有させた本実施例の血液保持用具によれば、血球展開の抑制と血漿展開の促進とにより血球と血漿とが十分に分離されるため、血漿の展開量が増加し、血漿回収率を向上できることがわかった。
（実施例３、比較例３）
以下に示す展開用多孔質膜（ろ紙、酢酸セルロース膜）および血球分離用多孔質膜（グラスフィルター）を使用し、溶血防止剤としてバリンを用いた以外は、前記実施例１と同様にして血液保持用具を作製した（実施例３−１、３−２）。なお、比較例３としては、血球分離用多孔質膜にバリンを含有させない以外は、前記実施例３−１もしくは３−２と同様にして血液保持用具を作製した（比較例３−１、３−２）。そして、これらを用いて実施例１および２と同様に血球分離を行い、溶血の有無、および血球の展開を確認した。これらの結果を下記表３に示す。
（ろ紙）
商品名３ＭＭｃｈｒ（ワットマン社製）
材質：セルロース製
厚み：３４０μｍ
重量：１８５ｇ／ｍｍ２
空孔率（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）：２０ｓｅｃ／１００ｍＬ／ｉｎｃｈ２
（酢酸セルロース膜）
商品名Ｃ３００Ａ２９３Ｃ（東洋ろ紙社製）
材質：酢酸セルロース
厚み：１８５μｍ
重量：４０ｇ／ｍｍ２
（血球分離用多孔質膜）
厚み１２００μｍのグラスフィルター（商品名ＡＰ２５：ミリポア社製）を使用した。
前記表３に示すように、グラスフィルターにバリンを含有させていない比較例３−１、３−２では溶血が生じたのに対して、実施例３−１、３−２では共に溶血が起こらなかった。また、実施例３−１は、比較例３−１よりも短い血球展開距離を示し、実施例３−２も、比較例３−２より短い血球展開距離を示した。このことから、前記実施例２と同様に、本実施例の血液保持用具によれば、血球の展開を抑制できるため、血漿のみの展開を増加でき、その回収率を向上できるといえる。なお、前記実施例３−１と３−２とにおいて、血球展開距離が異なるが、これは展開用多孔質膜の種類に起因するものである。
（実施例４、比較例４）
溶血防止剤として、各種濃度（５％、２％、１％）のバリン溶液、２％のロイシン溶液を含有させた以外は、実施例１と同様にして血液保持用具をそれぞれ１０個ずつ作製し、これを用いて血漿を回収し、血漿成分の測定を行った（実施例４）。
比較例４としては、所定濃度（２０％、５％、０％）のグリシン溶液をグラスフィルターに含有させた以外は、前記実施例１と同様にして血液保持用具それぞれ１０個ずつを作製した。
各血液保持用具に全血検体を滴下し、血球分離および血漿展開を行った。血漿の展開後、展開用多孔質膜のうち血漿のみが展開された部分を１０ｍｍ×６ｍｍの大きさに切り出した。この切片を、各溶血防止剤について１０枚集め、これらを直接遠心分離機にかけて（１５，０００ｇ、１０分間）、血漿を回収した。この血漿を試料として各成分量の測定を行った。なお、コントロールとしては、前記全血検体を遠心分離（３０００ｇ、１０分間）して得られた血漿を使用した。
（成分量の測定）
各成分量は、以下に示す市販キットを使用し、それらの使用方法に準じて、自動分析器（商品名：日立７０７０、日立製作所社製）により測定した。各種測定において、ブランクとして精製水を用いた。
１． 高比重リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）
：商品名 リキテック ＨＤＬ−Ｃ（ロシュ社製）
２． アミラーゼ（ＡＭＹ）
：商品名 ＡＭＹ−ＮＰ（デンカ生研社製）
３． アルブミン（ＡＬＢ）
：商品名 クリンメイトアルブミン（第一化学薬品社製）
４． グルタミック−オキサロアセティックトランスアミナーゼ（ＧＯＴ）
：商品名 リキテック ＧＯＴ ＩＦＣＣ（ロシュ社製）
５． ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）
：商品名 γ−ＧＴＰ−Ｊ−ＨＡワコー（和光純薬社製）
６． グルタミック−ピルビックトランスアミナーゼ（ＧＰＴ）
：商品名 リキテック ＧＰＴ ＩＦＣＣ（ロシュ社製）
７． トリグリセライド（ＴＧ）
：商品名 リキテック ＴＧ（ロシュ社製）
８． ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）
：商品名 ＬＤＨ ＩＩ−ＨＡワコー（和光純薬社製）
９． 総タンパク（ＴＰ）
：商品名 ＲＤ総タンパク（ロシュ社製）
１０． 総ビリルビン（Ｔ−Ｂｉｌ）
：商品名 Ｔ−Ｂｉｌ−Ｖ５（アズウェル社製）
１１． クレアチニン（ＣＲＥ）
：商品名 リキテック クレアチニン ＰＡＰ（ロシュ社製）
１２． 総コレステロール（ＴＣ）
：商品名 Ｔ−Ｃｈｏ−ＫＬ（国際試薬社製）
１３． アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）
：商品名 アルカリ性ホスファＩＩ−ＨＲテストワコー（和光純薬社製）
１４． 尿素窒素（ＢＵＮ）
：商品名 尿素窒素ＩＩ−ＨＡテストワコー（和光純薬社製）
１５． 尿酸（ＵＡ）
：商品名 ウリカラー・リキッド尿酸（小野薬品社製）
１６． フルクトサミン（ＦＲＡ）
：商品名 リキテックフルクトサミン（ロシュ社製）
１７． グルコース（Ｇｌｕ）
：商品名 リキテックグルコース（ロシュ社製）
１８． クレアチニンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）
：商品名 ＣＫ Ｅ−ＨＡテストワコー（和光純薬社製）
これらの実施例４および比較例４の結果について、コントロールの測定値を１００％とした場合の相対値（平均％）を下記表４に示す。
前記表４に示すように、グリシン添加の比較例によると、各成分の測定精度にバラツキが見られた。特にＧＧＴについてはコントロールに対する相対値が５０％前後という結果になった。これに対して、バリンまたはロイシンを添加した血液保持用具によれば、各成分ともに優れた測定結果が得られ、特にＧＧＴについても同様に優れた結果をなった。また、実施例４は全て溶血を防止できたが、比較例４においては、５％のグリシン溶液を含有させた血液保持用具について溶血が確認された。また、２０％のグリシン溶液を含有させた比較例４の血液保持用具については、すべての成分項目において、低い相対値を示す結果となった。これは、高グリシン濃度が原因となって血球が萎縮し、その分血漿成分の体積増加が起こり、その結果血漿成分の希釈が生じたためと考えられる。以上の結果から、本発明の血液保持用具によれば、溶血を防止し、かつ、各種成分測定に影響を与えることのないサンプルを調製できるといえる。
【産業上の利用可能性】
以上のように、本発明の血球分離膜によれば、血球の溶血を防止しつつ、血球と血清または血漿とを分離することができるため、効率よく血清または血漿サンプルを調製できる。また、これによって調製したサンプルは、各種成分の測定系への影響が少ないため、高精度な測定が可能になる。このため、本発明の血球分離膜および血液保持用具は、例えば、前述のような臨床医療等の分野において有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中の血清または血漿と血球とを分離する多孔質膜を含み、
前記多孔質膜が、疎水性アミノカルボン酸、シルク由来のタンパク質、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸およびヘパリンからなる群から選択された少なくとも一つの溶血防止剤を含有する血球分離膜。
【請求項２】
疎水性アミノカルボン酸が、疎水性アミノ酸である請求の範囲１記載の血球分離膜。
【請求項３】
疎水性アミノ酸が、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンからなる群から選択された少なくとも一つのアミノ酸である請求の範囲２記載の血球分離膜。
【請求項４】
前記多孔質膜が、バリン、ロイシン、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸およびシルクエッセンスからなる群から選択された少なくとも一つの溶血防止剤を含有する請求の範囲１記載の血球分離膜。
【請求項５】
前記溶血防止剤の含有量が、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり１ｍｇ〜５０ｍｇの範囲である請求の範囲１〜４のいずれか一項に記載の血球分離膜。
【請求項６】
前記多孔質膜が、グラスフィルター、および、厚み方向に平均孔径が連続的または不連続的に小さくなる孔径分布の非対称性多孔質膜の少なくとも一方である請求の範囲１〜５のいずれか一項に記載の血球分離膜。
【請求項７】
前記非対称性多孔質膜の材質が、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレンおよびポリアリールヒドラジドからなる群から選択された少なくとも一つの樹脂である請求の範囲６記載の血球分離膜。
【請求項８】
前記非対称性多孔質膜において、その最大孔径が３０〜３００μｍの範囲であり、その最小孔径が１〜３０μｍの範囲である請求の範囲６または７記載の血球分離膜。
【請求項９】
血球分離膜の少なくとも一方の表面側に前記溶血防止剤が含有されている請求の範囲１〜８のいずれか一項に記載の血球分離膜。
【請求項１０】
血液中の血球を分離する血球分離部と、血液中の血清または血漿を展開する展開部とを有し、前記血液分離部が、前記請求の範囲１〜９のいずれか一項に記載の血球分離膜である血液保持用具。
【請求項１１】
前記展開部の上に前記血球分離部が積層されている請求の範囲１０記載の血液保持用具。
【請求項１２】
前記展開部が、多孔質膜である請求の範囲１０〜１１のいずれか一項に記載の血液保持用具。
【請求項１３】
血液分離膜が血球分離部と展開部とを備えている請求の範囲１０記載の血液保持用具。
【請求項１４】
前記多孔質膜の材質が、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレンおよびポリアリールヒドラジドからなる群から選択された少なくとも一つの樹脂である請求の範囲１２記載の血液保持用具。
【請求項１５】
前記血球分離部が非対称性多孔質膜であり、前記非対称性多孔質膜がさらに前記展開部を有し、前記非対称性多孔質膜において、前記血球分離部と前記展開部とが面方向に位置し、血液を供給する側が前記血球分離部であり、前記供給した血液の展開方向に沿って下流側が展開部である請求の範囲１０記載の血液保持用具。
【請求項１６】
前記血球分離部が非対称性多孔質膜であり、前記非対称性多孔質膜がさらに前記展開部を有し、前記非対称性多孔質膜において、前記血球分離部と前記展開部とが面方向に位置し、前記血球分離部と前記展開部との間であって前記非対称性多孔質膜の幅方向に、血球が通過できない孔径の孔のみからなる血球遮断部が形成されている請求の範囲１５記載の血液保持用具。
【請求項１７】
前記非対称性多孔質膜において、前記幅方向に溝が形成され、前記溝の底面からこの底面に対応する非対称性多孔質膜表面までの間の部分が、血球遮断部である請求の範囲１６記載の血液保持用具。
【請求項１８】
前記展開部が、さらに疎水性アミノカルボン酸、シルク由来のタンパク質、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸およびヘパリンからなる群から選択された少なくとも一つの溶血防止剤を含有する請求の範囲１０〜１７のいずれか一項に記載の血液保持用具。
【請求項１９】
前記展開部に分析試薬を含有させた試薬部が形成されている請求の範囲１０〜１８のいずれか一項に記載の血液保持用具。
【請求項２０】
さらに、試薬を含有する試薬層を備える請求の範囲１０〜１９のいずれか一項に記載の血液保持用具。
【請求項１】
血液中の血清または血漿と血球とを分離する多孔質膜を含み、
前記多孔質膜が、疎水性アミノカルボン酸、シルク由来のタンパク質、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸およびヘパリンからなる群から選択された少なくとも一つの溶血防止剤を含有する血球分離膜。
【請求項２】
疎水性アミノカルボン酸が、疎水性アミノ酸である請求の範囲１記載の血球分離膜。
【請求項３】
疎水性アミノ酸が、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンからなる群から選択された少なくとも一つのアミノ酸である請求の範囲２記載の血球分離膜。
【請求項４】
前記多孔質膜が、バリン、ロイシン、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸およびシルクエッセンスからなる群から選択された少なくとも一つの溶血防止剤を含有する請求の範囲１記載の血球分離膜。
【請求項５】
前記溶血防止剤の含有量が、前記多孔質膜の体積（ｃｍ３）当たり１ｍｇ〜５０ｍｇの範囲である請求の範囲１〜４のいずれか一項に記載の血球分離膜。
【請求項６】
前記多孔質膜が、グラスフィルター、および、厚み方向に平均孔径が連続的または不連続的に小さくなる孔径分布の非対称性多孔質膜の少なくとも一方である請求の範囲１〜５のいずれか一項に記載の血球分離膜。
【請求項７】
前記非対称性多孔質膜の材質が、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレンおよびポリアリールヒドラジドからなる群から選択された少なくとも一つの樹脂である請求の範囲６記載の血球分離膜。
【請求項８】
前記非対称性多孔質膜において、その最大孔径が３０〜３００μｍの範囲であり、その最小孔径が１〜３０μｍの範囲である請求の範囲６または７記載の血球分離膜。
【請求項９】
血球分離膜の少なくとも一方の表面側に前記溶血防止剤が含有されている請求の範囲１〜８のいずれか一項に記載の血球分離膜。
【請求項１０】
血液中の血球を分離する血球分離部と、血液中の血清または血漿を展開する展開部とを有し、前記血液分離部が、前記請求の範囲１〜９のいずれか一項に記載の血球分離膜である血液保持用具。
【請求項１１】
前記展開部の上に前記血球分離部が積層されている請求の範囲１０記載の血液保持用具。
【請求項１２】
前記展開部が、多孔質膜である請求の範囲１０〜１１のいずれか一項に記載の血液保持用具。
【請求項１３】
血液分離膜が血球分離部と展開部とを備えている請求の範囲１０記載の血液保持用具。
【請求項１４】
前記多孔質膜の材質が、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレンおよびポリアリールヒドラジドからなる群から選択された少なくとも一つの樹脂である請求の範囲１２記載の血液保持用具。
【請求項１５】
前記血球分離部が非対称性多孔質膜であり、前記非対称性多孔質膜がさらに前記展開部を有し、前記非対称性多孔質膜において、前記血球分離部と前記展開部とが面方向に位置し、血液を供給する側が前記血球分離部であり、前記供給した血液の展開方向に沿って下流側が展開部である請求の範囲１０記載の血液保持用具。
【請求項１６】
前記血球分離部が非対称性多孔質膜であり、前記非対称性多孔質膜がさらに前記展開部を有し、前記非対称性多孔質膜において、前記血球分離部と前記展開部とが面方向に位置し、前記血球分離部と前記展開部との間であって前記非対称性多孔質膜の幅方向に、血球が通過できない孔径の孔のみからなる血球遮断部が形成されている請求の範囲１５記載の血液保持用具。
【請求項１７】
前記非対称性多孔質膜において、前記幅方向に溝が形成され、前記溝の底面からこの底面に対応する非対称性多孔質膜表面までの間の部分が、血球遮断部である請求の範囲１６記載の血液保持用具。
【請求項１８】
前記展開部が、さらに疎水性アミノカルボン酸、シルク由来のタンパク質、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ、ε−アミノヘキサン酸、トラネキサム酸およびヘパリンからなる群から選択された少なくとも一つの溶血防止剤を含有する請求の範囲１０〜１７のいずれか一項に記載の血液保持用具。
【請求項１９】
前記展開部に分析試薬を含有させた試薬部が形成されている請求の範囲１０〜１８のいずれか一項に記載の血液保持用具。
【請求項２０】
さらに、試薬を含有する試薬層を備える請求の範囲１０〜１９のいずれか一項に記載の血液保持用具。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３８５２
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【発行日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３６５３（Ｐ２００５−５０３６５３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３０１７
【国際出願日】平成１６年３月９日（２００４．３．９）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【発行日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３０１７
【国際出願日】平成１６年３月９日（２００４．３．９）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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