血管内膜過形成を阻害する方法
本発明は、概して、血管内膜過形成に、そして特に、Ｅ２ＦへのｓｉＲＮＡを使用して血管内膜過形成を阻害する方法に関する。さらに本発明は、そのような方法における使用に適した化合物および組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、仮特許出願第６０／６８６，０４８号（２００５年６月１日出願）への優先権を主張する。
技術分野
本発明は、概して、血管内膜過形成に、そして特に、Ｅ２ＦへのｓｉＲＮＡを使用して血管内膜過形成を阻害する方法に関する。さらに本発明は、そのような方法における使用に適した化合物および組成物に関する。
【０００２】
背景技術
遺伝子発現を特異的に阻害するための１つの方法は、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達による。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）およびリボザイムが含まれる、遺伝子阻害へのアプローチの中で、ｓｉＲＮＡは、遺伝子阻害、標的バリデーション、および療法応用のために現在最も速やかに開発されているアプローチである（１）。ｓｉＲＮＡは、療法応用に十分適しているようである。標的遺伝子のきわめて特異的な阻害に加えて、ｓｉＲＮＡは、低濃度で有効であるので、非特異的な活性による毒性の可能性を低減または一掃する。最近、いくつかの原理検証型の研究により、ｓｉＲＮＡの療法可能性が実証されてきた。これらには、肝炎（２，３）、ウイルス感染症（４，５）、黄斑変性（６）、敗血症（７）、腫瘍の増殖および浸潤（８〜１０）、慢性神経障害疼痛（１１）、および血清コレステロール（１２）の治療が含まれる。上記の研究より明白であることは、ｓｉＲＮＡを特別な細胞種へ標的指向させること、またはそれらを局所へ送達することによって、ｓｉＲＮＡ応答の効率を高める一方で、有害な副作用の可能性がさらに抑えられることである。現在、機能性ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ安定性を高めるだけでなく、標的送達をさらに促進させるｓｉＲＮＡの化学修飾の方法を発見することに集中した努力がある（１２，１３）。
【０００３】
特定の遺伝子をｓｉＲＮＡで沈黙させるためのこれらの標的指向法は、局在化した病理学的血管内膜過形成の治療における魅力的な療法戦略に役立つ。病理学的な血管内膜過形成は、バイパス移植または血管形成術の間に受ける損傷に続いて静脈バイパス移植片と動脈において生じ、大部分は、媒質における血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖と治療される血管の内膜へのそれらの移動によるものである（１４，１５）。そのような増殖は、血管損傷により活性化されるいくつかの増殖刺激性シグナルにより誘導される（１６〜１８）。増殖の増加だけでなく、炎症とケモカインおよびその受容体のアップレギュレーションをもたらす媒質中の細胞のアポトーシスも、この過剰増殖応答を始動させる役割を担うことが示されてきた（１９，２０）。血管細胞のそのような異常な挙動は、心臓血管系疾患の治療のためのバイパス手術および血管形成術の高い長期失敗率をもたらす。実際、外科的手技の洗練化にかかわらず、静脈移植の失敗率は、依然として高い（２１，２２）。これらの失敗は、しばしば、手術または血管形成術による反復処置を要求して、心臓発作や虚血臓器の切断をもたらす場合がある。従って、そのような病原性の細胞プロセスを効果的に阻害する分子戦略の開発がここ２０年にわたる多大な研究と多くの臨床試験の焦点になっている。
【０００４】
転写因子のＥ２Ｆファミリーは、ＤＮＡ複製、細胞周期進行、および細胞運命決定に関与する遺伝子の発現を制御するのに必須の役割を担っている（２３−２８）。今日までに、８種の遺伝子産物（Ｅ２Ｆ１〜８）がＥ２Ｆファミリーのタンパク質を構成し、Ｅ２Ｆ３およびＥ２Ｆ６の追加のイソ型も存在するが、それらの機能は、十分には特性決定されていない（２９〜３２）。配列相同性に基づいて、Ｅ２Ｆタンパク質は、３つの異なるカテゴリーへ分類可能である。Ｅ２Ｆ１〜３は、細胞周期の間に緊密に調節されて、大抵は転写のアクチベーターとして機能する（２６）。Ｅ２Ｆ４とＥ２Ｆ５は、ｐＲｂファミリーメンバーのｐ１３０およびｐ１０７と協奏的に転写のリプレッサーとして機能する（３３）。Ｅ２Ｆ６〜８は、ｐＲｂファミリーのタンパク質から独立した転写リプレッサーとして機能すると考えられている（３０，３１，３４）。さらに、様々なグループからの証拠は、アクチベーターのＥ２Ｆ（Ｅ２Ｆ１〜３）が特異的な機能を有することを示唆する。この機能特異性は、細胞増殖の制御におけるＥ２Ｆ３の役割とアポトーシスの誘導におけるＥ２Ｆ１の役割において最も明白である（３５，３６）。
【０００５】
Ｅ２Ｆ活性が細胞増殖および細胞運命決定を制御することにおいて中心的な役割を担うので、Ｅ２Ｆ活性の阻害は、病理学的な血管内膜過形成と関連した血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）中の細胞プロセスを阻止するのに有効なやり方となる見込みがある。実際、Ｅｃｋｈａｒｔら（４０）による最近の研究は、Ｅ２Ｆ３ノックアウトマウスでは、傷害を受けた動脈において血管内膜過形成が大いに低減されることを証明した。
【０００６】
本発明は、Ｅ２ＦのＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３へ選択的に標的指向するｓｉＲＮＡがＶＳＭＣの増殖およびアポトーシスをｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害する能力、並びに、マウスバイパス移植片モデルにおける血管内膜過形成の発達を低減するその能力について検証するために設計した研究に由来する。本発明は、例えば、バイパス移植または血管形成術より生じる損傷に続いて静脈バイパス移植片や動脈において生じる病理学的な血管内膜過形成を阻害する方法を提供する。
【０００７】
発明の要約
本発明は、概して、血管内膜過形成に、そして特に、Ｅ２ＦへのｓｉＲＮＡを使用して血管内膜過形成を阻害する方法に関する。さらに本発明は、そのような方法における使用に適した化合物および組成物に関する。
【０００８】
本発明の目的および利点は、以下に続く記載より明らかになろう。
発明の詳細な説明
短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が哺乳動物細胞において遺伝子発現を配列特異的なやり方で阻害可能であるという発見は、そのような遺伝子阻害剤をｉｎ ｖｉｖｏで使用する、多くの病理学的状態の治療法の可能性を高めている。以下に続く実施例では、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡが培養状態の静脈一次平滑筋細胞の増殖およびアポトーシスを阻害可能であることを示す。さらに、これらｓｉＲＮＡの静脈移植片への体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）送達は、この移植片のマウス中への外科移植に続く、内因性Ｅ２Ｆ遺伝子のサイレンシングをもたらす。重要なことに、これらの増殖促進性Ｅ２Ｆへ特異的なｓｉＲＮＡの投与は、移植された移植片における血管内膜過形成を有意に低減した。これらの試験結果は、ｓｉＲＮＡが動物のバイパス移植片における血管内膜過形成を制限可能であるという治療原理の検証を確定させる。このように、Ｅ２Ｆ特異的なｓｉＲＮＡは、ヒトにおける末梢および冠状動脈バイパス移植手術に続くこの病理学的プロセスと移植の失敗を阻害するのに有用であることが証明され得るリード化合物の代表になる。
【０００９】
本明細書に記載するのは、アクチベーターＥ２Ｆの選択阻害剤として作用するｓｉＲＮＡの開発である。以下に続く実施例に提示するデータは、これらの阻害剤が療法目的のために標的部位へ効果的に送達可能であることを示す。具体的には、増殖促進性Ｅ２Ｆ（Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３）へ標的指向するｓｉＲＮＡの短期的な局所送達がマウスにおける静脈バイパス移植に続く血管内膜過形成の低減をもたらすことが示される。血管内膜過形成の低減は、これらのｓｉＲＮＡ阻害剤が培養状態の大静脈ＶＳＭＣの増殖およびアポトーシスを阻止する能力と相関した。細胞増殖および細胞運命の制御におけるＥ２Ｆ１の二元的な役割からすれば、Ｅ２Ｆ１またはＥ２Ｆ３のいずれかに抗するｓｉＲＮＡで細胞増殖の阻害が達成された一方で、ＤＮＡ傷害誘発性アポトーシスの阻害がＥ２Ｆ１に抗するｓｉＲＮＡに特異的であったことは、驚きではない。血管内膜過形成をもたらす病理学的な細胞の増殖およびアポトーシスをともに阻害する分子戦略の開発は、多大な研究の焦点になってきた（３７，３９，４２，４３）。実際、最近の報告は、ｉｎ ｖｉｖｏの血管内膜過形成に関連した過剰増殖応答を始動させることに、増殖の増加に加えて、血管傷害に続く培地中の細胞のアポトーシスが関与している可能性があると示唆している（１９）。Ｅ２Ｆ活性は、細胞の増殖だけでなく、増殖刺激シグナルの存在または非存在に依存するかまたはＤＮＡ傷害に応答するアポトーシスに仲介することが可能であるので、Ｅ２Ｆ活性の阻害は、ＶＳＭＣ中の細胞プロセスを阻止するのに有効な方法であることが期待される。
【００１０】
驚くべきことに、Ｅ２Ｆ３ ｓｉＲＮＡは、Ｅ２Ｆ４が存在しているときだけに、ＶＳＭＣ増殖を阻害するのに有効であることが観察された。Ｅ２Ｆ３ ｓｉＲＮＡは、Ｅ２Ｆ４ノックアウトマウスの大静脈に由来するＶＳＭＣにおける細胞増殖のより無効な阻害剤である（図２Ｃ）。この結果は、Ｅ２Ｆ３とＥ２Ｆ４がＶＳＭＣ増殖において反対の役割を担うことを示唆し、Ｅ２Ｆ４（増殖阻止性のＥ２Ｆ）欠乏マウスが動脈傷害に続く血管内膜過形成の増加を明示する一方で、Ｅ２Ｆ３（増殖推進性のＥ２Ｆ）欠乏マウスは、ＷＴ対照マウスに比較して低減された血管内膜過形成を示すという最近の観察に一致している（４０）。同様に、Ｅ２Ｆ１欠乏マウスはまた、これらの実験条件の下で血管内膜過形成の明確な低減を示す。まとめると、これらの試験結果は、Ｅ２Ｆの増殖およびアポトーシス機能だけを特異的に阻止するｓｉＲＮＡのような薬剤が再狭窄を臨床において制限するのにきわめて有効であろうと示唆するのに十分な証拠を提供している。さらに、それらは、様々なＥ２Ｆファミリーメンバーを区別しない阻害剤、例えば、Ｅ２Ｆ３とＥ２Ｆ４の両方の機能を阻害する薬剤は、血管平滑筋細胞増殖と血管内膜過形成を臨床において制御する次善の薬剤となる可能性があることを示す。この解釈に一致した、２つの大規模な無作為化フェーズ３試験は、非選択的なＥ２Ｆ阻害剤、Ｅ２Ｆ ＤＮＡデコイが血管内膜過形成や移植片不全に有意には影響を及ぼさないことを最近実証した（４５）。このように、すべてのＥ２ＦについてのコンセンサスＥ２Ｆ ＤＮＡ結合部位を担うＥ２Ｆ ＤＮＡデコイの臨床効果の不足への１つの説明は、ＤＮＡデコイは増殖刺激性Ｅ２Ｆと増殖抑圧性Ｅ２Ｆの両方の活性を阻害可能であるので、その投与は、Ｅ２Ｆ４活性が非存在であるときにＥ２Ｆ３ ｓｉＲＮＡが細胞増殖を阻害するのにあまり有効でないときに観察されるものに似た表現型をもたらす可能性がある、というものである。
【００１１】
ｓｉＲＮＡの療法応用には、特異性、合成のコスト、送達、および安定性といった技術課題が依然として関連しているが、ｓｉＲＮＡは、遺伝子阻害のために最も速く開発されている療法アプローチである。バイパス手術の治療現場では、上記ハードルの多くが乗り越えられるように思われる。非特異的な毒性を有するｓｉＲＮＡが他のｍＲＮＡに対して非特異的な効果を及ぼす可能性は、ｓｉＲＮＡをバイパス移植片へ直接かつ一過的に体外送達する（これは、潜在的な全身毒性を大いに低減するはずである）ので、大いに低下する。その趣意で、Ｅ２Ｆに抗するｓｉＲＮＡが標的指向されたＥ２Ｆに特異的であることを示した（図１Ｃおよび１Ｄ）。さらに、ｓｉＲＮＡの移植片への体外送達は、治療に求められるｓｉＲＮＡの量を実質的に減らすので、この臨床現場におけるその使用コストを抑えることになる。さらに、ｓｉＲＮＡの安定性をさらに高めて、細胞への送達と組織バイオアベイラビリティを促進するために、精力的な研究が現在実施されている（６，１０，１２，１３）。ｓｉＲＮＡ技術におけるこれらの改善も、心臓および血管外科の現場におけるその使用を促進するはずである。このように、ｓｉＲＮＡの臨床有用性が近い将来に心臓血管手術の現場において評価されることが期待されている。
【００１２】
本発明のいくつかの側面は、以下に続く非限定的な実施例においてより詳しく記載可能である。
実施例
実験の詳細
他に述べなければ、化学品は、いずれもシグマ・アルドリッチ社より購入し、制限酵素は、いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社（ＮＥＢ）より入手して、細胞培養産物は、いずれもＧｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の事業部）より購入した。
【００１３】
細胞培養
一次マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、１０％加熱不活性化胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、３７℃および５％ ＣＯ２で維持した。胸大動脈由来マウスＶＳＭＣの一次培養物を入手して、既報（４７，４８）のように培養した。野生型およびＥ２Ｆ４−／−マウスの大動脈からのＶＳＭＣを４−１０ Ｍｅｄｉｕｍに維持した。
【００１４】
ルシフェラーゼアッセイ
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、１０％胎仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭに維持した。トランスフェクションに先立つ１６時間前に、５ｘ１０４細胞／ウェルを２４ウェルプレートに播いた。既報（４９）のように、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（キアジェン）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ｓｉＲＮＡとレポータープラスミドの同時トランスフェクションを行った。各ウェルで１μｇのＥ２Ｆ１−Ｌｕｃまたはｐ６８−Ｌｕｃ、１ｎｇ ｐＲＬ−ＴＫ（プロメガ）、および、示す場合は、４ｎｇのＨＡ−Ｅ２Ｆ１またはＨＡ−Ｅ２Ｆ３と５０ピコモルｓｉＲＮＡ二重鎖を３６０μｌの最終容量で使用した。トランスフェクションから２４時間後の細胞について、ルシフェラーゼおよびレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）の発現を検定した。各実験は同一３検体で実施した。
【００１５】
核抽出物とウェスタンブロット
野生型マウスの大静脈に由来する一次、継代３のＶＳＭＣを６０ｍｍディッシュに５０％集密度で播き、１μＭのスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）、Ｅ２Ｆ３（Ｆ３−２単独、Ｆ３−５単独、Ｆ３−６単独、またはＦ３−１、Ｆ３−５、Ｆ３−６の組合せ（ｓｉＥ２Ｆ３プール））に対する１μＭ ｓｉＲＮＡ、またはＥ２Ｆ１（Ｆ１−５単独、Ｆ１−４単独、Ｆ１−３単独、Ｆ１−２単独、またはＦ１−５、−４、−３、−２の組合せ（ｓｉＥ２Ｆ１プール））に抗する１μＭ ｓｉＲＮＡのいずれかとともにＳｕｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２回トランスフェクトした。１回目のトランスフェクションは細胞を播いてから２４時間後に実施したが、２回目のトランスフェクションは、細胞を播いてから４８時間後に実施した。このトランスフェクションプロトコールは、上記の条件下でトランスフェクション効率を高めることを可能にする。２回目のトランスフェクション後２４時間の間に細胞をそのまま回復させてから、Ｅ２Ｆ１またはＥ２Ｆ３タンパク質の発現レベルを検定した。大静脈ＶＳＭＣの核抽出物を既報（４９）のように調製した。この抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分割し、続いてタンパク質をイムノブロッティングのためにＰＶＤＦ膜上へ移した。イムノブロッティングには以下の一次抗体を利用した：抗Ｅ２Ｆ３ａ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−８７９）、抗Ｅ２Ｆ１（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−２５１）、抗Ｅ２Ｆ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−６３３）、および抗Ｅ２Ｆ４（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−１０８２）。
【００１６】
レスキュー実験に使用の突然変異Ｅ２Ｆ構築体の産生
ｓｉＲＮＡ標的配列は、以下の通りである：Ｆ１−３，ＡＡＧＡＵＣＵＣＣＣＵＵＡＡＧＡＧＣＡＡＡ、およびＦ３−６，ＡＡＧＡＣＵＵＣＡＵＧＵＧＵＡＧＵＵＧＡＵ。
【００１７】
標準的な分子生物学の技術を使用して、Ｅ２Ｆの突然変異体（ｐＣＤＮＡ３−ＨＡＥ２Ｆ１ｍｕｔおよびｐＣＤＮＡ３−ＨＡＥ２Ｆ３ａｍｕｔ）を産生した。簡潔に言えば、突然変異誘発に使用したプライマーは、以下の通りである：
【００１８】
【化１】
【００１９】
Ｅ２Ｆ１ｍｕｔは、ｓｉＲＮＡ Ｆ１−３の効果に対してそれを非感受性にするサイレント点突然変異を収容する。Ｅ２Ｆ３ａｍｕｔは、ｓｉＲＮＡ Ｆ３−６による標的指向を排除するように設計したサイレント点突然変異を収容する。
【００２０】
トランスフェクションアッセイ
野生型またはＥ２Ｆ４−／−マウスの大静脈に由来する一次、継代３のＶＳＭＣを６０ｍｍディッシュに５０％集密度で播き、１μＭのスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）、Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−３、Ｆ１−４、またはＦ１−５）に抗する１μＭ ｓｉＲＮＡ、Ｅ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、またはＦ３−６）に抗する１μＭ ｓｉＲＮＡ、または１μＭのＦ１−３＋４μｇのｐＣＤＮＡ３−ＨＡＥ２Ｆ１、またはＦ３−６＋４μｇのｐＣＤＮＡ３−ＨＡＥ２Ｆ３ａｍｕｔ（Ｒｅｓｃｕｅ）のいずれかとともにＳｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を２４時間使用して２回トランスフェクトした。また、Ｅ２Ｆ６に抗するｓｉＲＮＡを対照（ｓｉＥ２Ｆ６）として細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションに続いて細胞をトリプシン処理して、１２ウェルプレートに約２０，０００細胞／ウェルで播いた。
【００２１】
ＶＳＭＣ増殖（ＤＮＡ合成）アッセイ
野生型および／またはＥ２Ｆ４−／−マウスの大静脈からのトランスフェクトされたＶＳＭＣを
トリプシン処理して、１２ウェルプレートに約２０，０００細胞／ウェルで播いた。次いで、０．５μＭ ＨＵの添加により、細胞を強制的にＧ１／Ｓへ阻止した。２１時間後、ＨＵを欠く培地の添加により細胞をＨＵブロックより解放し、３Ｈ−チミジン（培地１ｍＬにつき１μＣｉ）を含有する培地とともにインキュベートして、ＤＮＡ合成をモニタリングした。３Ｈ−チミジン含有培地の存在下で２４時間のインキュベーションの後で、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（ＶＷＲ ｃａｔ＃ ＶＷ３９２６−２）で１回洗浄し、０．５ｍＬの０．５Ｎ ＮａＯＨ（ＶＷＲ ｃａｔ＃ ＶＷ３２２１−１）に採取して、３Ｈ−チミジン取込みの測定のためにシンチレーションバイアルへ入れた。データは、細胞増殖（％）としてプロットした（ここで１００％細胞増殖は、３Ｈ−チミジン取込み（％）により定義する）。ゲル対照の３Ｈ−チミジン取込みを１００％へ設定した。
【００２２】
ＶＳＭＣアポトーシスアッセイ
野生型マウスの大静脈からのトランスフェクトされたＶＳＭＣを４−１０培地単独（ＷＴ、シスプラチン無し）または１００μＭシスプラチンを含有する４−１０培地で３０時間処理した。次いで、細胞を固定して、切断カスパーゼ３に特異的なＰＥ共役抗体を使用して、活性カスパーゼ３を染色した（製造業者のプロトコールに特定される通り）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。フローサイトメトリー分析を使用して、ＰＥ陽性細胞（％）をアポトーシスの尺度として定量した。アポトーシス（％）は、フローサイトメトリー分析により測定されるＰＥ陽性細胞（％）により定義する。
【００２３】
ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｉＲＮＡ取込みアッセイ
各条件につき３匹のマウスから大静脈を下記のように摘出して、摘出血管を、全部で１μＭのスクランブルｓｉＲＮＡと微量（１００，０００ｃｐｍ）の末端標識３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡを含有するＤＭＥＭにおいて、室温または氷上のいずれかで３０分間インキュベートした。次いで、この血管をＤＭＥＭで３回、ＰＢＭで２回灌流で洗浄した後で、３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡの血管への取込みを定量した。３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡの取込みは、血管をシンチレーション液に入れて、シンチレーションカウンターを使用して３２Ｐを測定することによって定量した。血管内の３２Ｐの量をインプット（１００，０００ｃｐｍ）３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡで割って１００倍することによって取込み（％）を測定した。さらに、２５℃で３０分のインキュベーションに続いて、フェノール：クロロホルムを使用して、血管の１つから３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡを抽出して、非変性アクリルアミドゲル上で分割した。このｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価するために、スクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣＲ）またはＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３へのｓｉＲＮＡ（ｓｉＥ２Ｆ）のいずれかと一緒にすでにインキュベートした静脈移植片の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分割して、その後タンパク質をイムノブロッティングのためにＰＶＤＦ膜へ移した。イムノブロッティングには以下の一次抗体を利用した：抗Ｅ２Ｆ３ａ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−８７９）、抗Ｅ２Ｆ１（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−２５１）、抗Ｅ２Ｆ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−６３３）、および抗Ｅ２Ｆ４（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−１０８２）。
【００２４】
マウスｉｎ ｖｉｖｏ静脈バイパス移植片モデル
マウスの静脈バイパス移植片モデルは、ＺｈａｎｇとＨａｇｅｎら（５０）による既報のように実施した。簡潔に言えば、下大静脈（ＩＶＣ）の０．８ｃｍ切片をドナーマウスより採取して、同系レシピエントの頚動脈へ吻合した。レシピエントマウスにおける移植に先立って、５ナノモルのＳＣＲ ｓｉＲＮＡ、またはＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗する各２．５ナノモルのｓｉＲＮＡの混合物のいずれかを含有するＤＭＥＭ溶液にＩＶＣを室温で３０分間入れた。この間、移植片レシピエントマウスにおいて、左総頚動脈の１０ｍｍ切片を周囲の組織より単離した。この切片を近位および遠位に８−０ナイロン縫合で閉鎖し、２つの動脈切開部を近位と遠位に約０．８ｃｍ離して創出してから、血管を生理食塩水で満たした。２つの固定縫合を各動脈切開部の近位および遠位角で、そして２つの可動縫合を動脈周囲の各１８０°（４〜６の咬合／１８０°）で使用する、ＩＶＣと頚動脈の間の端−側吻合を実施した。ＩＶＣ吻合の間の頚動脈切片を両端で結紮して切断して、それによりＩＶＣ移植片を広げた。次いで、８−０ナイロン結紮を取り出して、飽和した移植片の壁を通る血流を評価することによって、移植片の開存性を決定した。ｓｉＲＮＡを含有する残りのＤＭＥＭ溶液を３０％プルロニックゲル（ＢＡＳＦ）と氷上で混合し、移植の部位へ移して、ここでゲルを重合化させた。次いで、切開部を閉じて、次の２〜３日にわたり、残る核酸をそのままゲルの外から静脈中へ拡散させた。この手順全体は、非外傷性の技術を用いて、９６％の成功率で厳密に実施した。手術時間は、平均して、ＩＶＣ採取について１０分、頚動脈間置移植術について４０分であった。すべての手術手順は、手術顕微鏡（ＷＥＣＫ Ｍｏｄｅｌ ０２９００１，ズーム３．６−１８，Ｊ．Ｋ．Ｈｏｐｐｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用し、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）麻酔を用いて無菌的に実施した。
【００２５】
移植から４週後に移植片を採取した。先の切開部を通して移植片を曝露し、胸腔を開いた。右心房に切込みを入れて、左心室を通すＰＢＳで移植片を灌流した。次いで、１００ｍｍＨｇの一定圧で２０分間、移植片を１０％緩衝化ホルマリンでｉｎ ｓｉｔｕ灌流−固定した。この移植片を摘出して、１０％中性緩衝化ホルマリン中に２４時間入れてから、７０％エタノールへ移した後で、パラフィンに包埋した。移植片の中央から５ミクロンの連続切片を０．５ｍｍごとに取って各移植片につき全部で４つの切片とし、Ｍｉｋａｔ（改良マッソントリクロームおよびベルヘーフエラスチン組織染色液）で染色した。この染色は、コラーゲンを緑色、エラスチンを黒色、細胞質を赤色、核を黒色で同定することを可能にした。
【００２６】
Ｎｉｋｏｎカメラを使用して撮影した４０倍原図拡大像を使用して、組織切片の形態計測分析を実施した。内腔、新生血管内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）、および媒質の周界および領域の測定は、ＩｍａｇｅＴｏｏｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．０，ＵＴＨＳＣＳＡ）を使用するｐｌａｉｎｉｍｅｔｒｙによって実施した。新生血管内膜は、平滑筋細胞の交差したランダムに出現する配向性と、ＶＳＭＣ細胞質の遍在とコラーゲンの相対的な不在により付与される主に赤い色によって同定した。媒質は、ＶＳＭＣの環状配向性と、コラーゲンにより付与される主に緑の色により認めた。この測定を使用して、切片から測定したものと同等な領域および周界の同心円を作成し、これらの円の半径を使用して、各移植片の層の平均厚を計算した。
【００２７】
統計分析
上記の結果は平均±ＳＥとして示す。統計分析は、片側ＡＮＯＶＡを使用して行った。０．０５以下のＰ値を有意差を示すものとみなした。片側ＡＮＯＶＡに加えて、両側不対ｔ検定を行って、各処置群を互いに比較した。ｓｉＥ２Ｆ群は、ＳＣＲおよびゲル対照群と有意に異なっていた（Ｐ＜０．０００１）。ＳＣＲ群は、ゲル対照群と有意に異なってはいなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００２８】
結果
Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡを設計して評価すること
ヒトおよびマウスの増殖促進性Ｅ２Ｆ（Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３）のより強力かつ選択的な阻害剤をｓｉＲＮＡ技術の使用を介して開発するために、マウスとヒトの配列をはじめに並置して、同一性の領域をｓｉＲＮＡ標的指向のために考慮した。次いで、選択した配列をＢＬＡＳＴ処理して、Ｅ２Ｆ標的−特異性および独自性をヒトおよびマウスのゲノムの内部で確認して、各Ｅ２Ｆ標的につき約６種のｓｉＲＮＡを分析用に選択した。
【００２９】
これらＥ２Ｆ特異的ｓｉＲＮＡの培養状態のマウス線維芽細胞における阻害効果を評価するために、脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用する一過性トランスフェクションアッセイを実施して、Ｅ２Ｆ仲介性の転写活性化を測定した。具体的には、Ｅ２Ｆ１またはｐ６８プロモーターのいずれかの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター構築体を、Ｅ２Ｆ１またはＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡの存在または非存在下に、それぞれＥ２Ｆ１（ＨＡ−Ｅ２Ｆ１）またはＥ２Ｆ３（ＨＡ−Ｅ２Ｆ３）発現カセットとともに同時トランスフェクトした（図１）。様々なＥ２Ｆ特異的ｓｉＲＮＡのＥ２Ｆ仲介性トランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に対する阻害効果を、ｓｉＲＮＡのそのＥ２Ｆ相対物およびレポーター構築体との同時トランスフェクションに続くレポーター活性化を測定することによってスコア化した。次に、ウェスタンブロット分析により、Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−２、Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）（図１Ｃ）またはＥ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）（図１Ｄ）に抗するｓｉＲＮＡの大静脈ＶＳＭＣ細胞中への一過性の送達がＥ２Ｆ３およびＥ２Ｆ１の発現を特異的に低減することを実証した。重要にも、Ｅ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡは、Ｅ２Ｆ１タンパク質レベルに効果がなく、Ｅ２Ｆ１に抗するｓｉＲＮＡは、Ｅ２Ｆ３タンパク質レベルに効果がなかった。ｓｉＲＮＡトランスファーの効率を非特異的な蛍光標識ｓｉＲＮＡの同時トランスフェクションにより評価して、＞７５％であることを定量した（データ示さず）。さらに、Ｅ２Ｆ１またはＥ２Ｆ３のいずれかのタンパク質のレベルが低下した、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＶＳＭＣの分析は、培養状態のＶＳＭＣの有意に減少した増殖（３Ｈ−チミジン取込みにより測定する）を生じた（図２ＡおよびＢ）。この効果は、Ｅ２Ｆへの標的指向に特異的であり、標的ｓｉＲＮＡにより分解されない修飾Ｅ２Ｆ１または修飾Ｅ２Ｆ３転写物（それぞれＦ１−３およびＦ１−６）（Ｒｅｓｃｕｅ）のいずれかをコードする遺伝子の同時トランスフェクションにより一部逆転可能であった。この一部逆転の理由は、一次ＶＳＭＣ中のｓｉＲＮＡに対してプラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率がより低いためである（データ示さず）。重要にも、ｓｉＲＮＡの効果は、Ｅ２Ｆ４−／−同腹子より派生した大静脈ＶＳＭＣに比較してＥ２Ｆ４＋／＋大静脈ＶＳＭＣにおいて大きかった（それぞれ、約９０％と約２０％の増殖低下）（図２Ｃ）。この観察事実は、ｉｎ ｖｉｖｏでの動脈傷害に続く再狭窄の発症におけるＥ２Ｆ３およびＥ２Ｆ４の反対する役割を明らかにした最近の知見（４０）と一致している。具体的には、Ｅ２Ｆ４の損失が動脈傷害に続く血管内膜過形成の進行を速めるのに対して、Ｅ２Ｆ３の損失は血管内膜過形成の発達を妨げることが示された。まとめると、上記の知見は、増殖促進性のＥ２ＦであるＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡのような「選択的」Ｅ２Ｆアンタゴニストが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳動物の増殖を阻害するのに、Ｅ２Ｆタンパク質のファミリー全体の非選択的阻害剤より効果的であることが証明可能であるという考えを支援する。
【００３０】
Ｅ２Ｆ１タンパク質のアポトーシスにおける役割があるとして、Ｅ２Ｆ１発現の阻害の、ＶＳＭＣ中のシスプラチン誘発性アポトーシスに対する効果を評価した。Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−３）のレベルが低下した、ｓｉＲＮＡトランスフェクトした大静脈ＶＳＭＣの分析は、培養中のＶＳＭＣの有意に減少したアポトーシス（フローサイトメトリー分析を使用する、切断活性カスパーゼ３の蓄積により測定する）をもたらした（図３）。この効果は、Ｅ２Ｆ１ ｓｉＲＮＡに特異的であり、その標的ｓｉＲＮＡにより分解されない突然変異Ｅ２Ｆ１転写物の同時トランスフェクションにより一部逆転可能であった。さらに、Ｅ２Ｆ３（Ｆ３−２およびＦ３−６）へのｓｉＲＮＡは、スクランブル対照（ＳＣＲ）ｓｉＲＮＡに比較して減少したアポトーシスをもたらさなかった。
【００３１】
ｓｉＲＮＡの静脈移植片におけるｉｎ ｖｉｖｏ取込み
ＲＮＡｉ技術によるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子サイレンシングを達成することへの主要な障害は、送達である。はじめに、静脈移植片におけるｓｉＲＮＡの安定性を評価するために、３匹のマウスより大静脈を摘出して、放射標識ｓｉＲＮＡ（３２Ｐ−ＳＣＲ）とともに３０分間インキュベートした。次いで、この血管より全ＲＮＡを単離して、インタクトｓｉＲＮＡを非変性ＰＡＧＥゲル上で分割した（図４Ａおよび４Ｂ）。次いで、静脈移植片におけるｓｉＲＮＡ取込みの効率を定量するために、摘出した大静脈をｓｉＲＮＡとともに、取込みを可能にする室温でかまたは能動輸送を阻止する氷上のいずれかでｅｘ ｖｉｖｏでインキュベートした（４１）。次いで、移植片を灌流で洗浄した後で、３２Ｐ−ｓｉＲＮＡの血管への取込みを定量した。取込みの分析は、約６８％の標識ｓｉＲＮＡが静脈移植片へ輸送されたことを明らかにした。対照的に、氷上でインキュベートした静脈移植片とは、５％未満のインプットｓｉＲＮＡが結合した（図４Ｃ）。次に、ウェスタンブロット分析により、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３（Ｆ１−３およびＦ３−６の組合せ）に抗するｓｉＲＮＡのマウス静脈移植片への送達が、移植片をマウスに移植して４８時間後に、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３タンパク質の発現を低減することが実証された。重要なことに、Ｆ１−３とＦ３−６は、他のＥ２Ｆファミリーメンバーの発現に対して効果がなかった（Ｅ２Ｆ２およびＥ２Ｆ４のウェスタンを参照のこと）（図４Ｄ）。
【００３２】
マウス静脈バイパス移植片における血管内膜過形成の低減
次に、増殖促進性Ｅ２Ｆ（Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３の組合せ）に抗するｓｉＲＮＡの、静脈バイパス移植のマウスモデルにおける血管内膜過形成の発達に及ぼす効果を評価した。簡潔に言えば、実験条件ごとに１３匹のマウスについて下大静脈から頚動脈性静脈の移植手技を実施した。術後４週間で移植片を採取し、固定し、切片化して、分析用に染色した。移植片切片の分析は、処置を受けなかった対照動物（Ｇｅｌ対照）、並びにスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣＲ）で処置した動物において血管内膜過形成が発達していたことを確認した（図５Ａおよび５Ａ’）。対照的に、Ｅ２Ｆ１とＥ２Ｆ３の両方に抗するｓｉＲＮＡ（それぞれ、Ｆ１−３およびＦ３−６）での静脈移植片の処置は、対照試料と比較したときに、血管内膜過形成の有意な減少をもたらした（図５Ｂおよび５Ｃ）。Ｅ２Ｆに抗するｓｉＲＮＡは、ＳＣＲ対照とＧｅｌ対照の両群へ比較するとき、内膜対内側層の比を約４２％と約５７％、そして内膜比を約３６％と４３％低下させた（Ｐ＜０．０００１）（図５Ｃ，下パネル）。対照的に、Ｅ２Ｆ ｓｉＲＮＡは、内側面積に対して有意な効果がなかった（図５Ｂおよび５Ｃ）。要約すると、上記データは、この静脈バイパス移植のマウスモデルにおいて、ｓｉＲＮＡによるＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３タンパク産生の阻害が血管内膜過形成の発達を有意に低減することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｄ。Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡの、Ｅ２Ｆ仲介性転写活性に対する効果。（図１Ａ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＨＡ−Ｅ２Ｆ１発現ベクター単独、またはＥ２Ｆ１（Ｆ１−２、Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）若しくはＥ２Ｆ３（Ｆ３−２）に抗する合成ｓｉＲＮＡ二重鎖と一緒に、Ｅ２Ｆ１−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトした。（図１Ｂ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＨＡ−Ｅ２Ｆ３発現ベクター単独、またはＥ２Ｆ３（Ｆ３ａ−２、Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）若しくはＥ２Ｆ１（Ｆ１−３）に抗する合成ｓｉＲＮＡ二重鎖と一緒に、ｐ６８−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトした。３回の独立した実験より、ルシフェラーゼ活性をレニラ活性に対して正規化した。脂質ベースの試薬を使用して、マウス大静脈の血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）を、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（対照）または（図１Ｃ）Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−２、Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）若しくは（図１Ｄ）Ｅ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）へのｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡは、単独で、または一緒に（ｓｉＥ２Ｆ３プール、ｓｉＥ２Ｆ１プール）トランスフェクトした。次いで、トランスフェクトした細胞からの核抽出物をＳＤＳアクリルアミドゲル上で分割して、特異抗体でのウェスタンブロッティングによってＥ２Ｆタンパク質の存在を評価した（上パネル）。それぞれの個別ｓｉＲＮＡの標的特異性は、非標的Ｅ２Ｆメンバーのレベルを定量することによって評価した（下パネル）。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｄ。Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡの、Ｅ２Ｆ仲介性転写活性に対する効果。（図１Ａ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＨＡ−Ｅ２Ｆ１発現ベクター単独、またはＥ２Ｆ１（Ｆ１−２、Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）若しくはＥ２Ｆ３（Ｆ３−２）に抗する合成ｓｉＲＮＡ二重鎖と一緒に、Ｅ２Ｆ１−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトした。（図１Ｂ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＨＡ−Ｅ２Ｆ３発現ベクター単独、またはＥ２Ｆ３（Ｆ３ａ−２、Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）若しくはＥ２Ｆ１（Ｆ１−３）に抗する合成ｓｉＲＮＡ二重鎖と一緒に、ｐ６８−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトした。３回の独立した実験より、ルシフェラーゼ活性をレニラ活性に対して正規化した。脂質ベースの試薬を使用して、マウス大静脈の血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）を、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（対照）または（図１Ｃ）Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−２、Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）若しくは（図１Ｄ）Ｅ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）へのｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡは、単独で、または一緒に（ｓｉＥ２Ｆ３プール、ｓｉＥ２Ｆ１プール）トランスフェクトした。次いで、トランスフェクトした細胞からの核抽出物をＳＤＳアクリルアミドゲル上で分割して、特異抗体でのウェスタンブロッティングによってＥ２Ｆタンパク質の存在を評価した（上パネル）。それぞれの個別ｓｉＲＮＡの標的特異性は、非標的Ｅ２Ｆメンバーのレベルを定量することによって評価した（下パネル）。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｃ。異なるＥ２Ｆの欠乏は、ＶＳＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を低減または加速可能である。（図２Ａ）マウス大静脈のＶＳＭＣを、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ）またはいずれかのＥ２Ｆ１（Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）へのｓｉＲＮＡ単独で、またはその標的ｓｉＲＮＡ、Ｆ１−３により分解されない突然変異転写物を産生するＥ２Ｆ１レスキュー構築体（Ｒｅｓｃｕｅ）と一緒にトランスフェクトした。次いで、０．５μＭヒドロキシ尿素（ＨＵ）の添加により、細胞をＧ１／Ｓ境界で同期化した。２１時間後、細胞をＨＵ阻止から解放し、血清と３Ｈ−チミジンを含有する培地の添加によって、細胞周期に再び入るように刺激した。血清添加後２４時間で細胞を溶解させ、シンチレーションカウンターを使用して、３Ｈ−チミジン取込みを分析した。図２Ｂ）マウス大静脈のＶＳＭＣを、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ）またはいずれかのＥ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）へのｓｉＲＮＡ単独で、またはその標的ｓｉＲＮＡ、Ｆ３−６により分解されない突然変異転写物を産生するＥ２Ｆ３レスキュー構築体（Ｒｅｓｃｕｅ）と一緒にトランスフェクトした。（図２Ｃ）ＷＴまたはＥ２Ｆ４−／−マウスの大静脈からのＶＳＭＣを上記のようにトランスフェクトした。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｃ。異なるＥ２Ｆの欠乏は、ＶＳＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を低減または加速可能である。（図２Ａ）マウス大静脈のＶＳＭＣを、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ）またはいずれかのＥ２Ｆ１（Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）へのｓｉＲＮＡ単独で、またはその標的ｓｉＲＮＡ、Ｆ１−３により分解されない突然変異転写物を産生するＥ２Ｆ１レスキュー構築体（Ｒｅｓｃｕｅ）と一緒にトランスフェクトした。次いで、０．５μＭヒドロキシ尿素（ＨＵ）の添加により、細胞をＧ１／Ｓ境界で同期化した。２１時間後、細胞をＨＵ阻止から解放し、血清と３Ｈ−チミジンを含有する培地の添加によって、細胞周期に再び入るように刺激した。血清添加後２４時間で細胞を溶解させ、シンチレーションカウンターを使用して、３Ｈ−チミジン取込みを分析した。図２Ｂ）マウス大静脈のＶＳＭＣを、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ）またはいずれかのＥ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）へのｓｉＲＮＡ単独で、またはその標的ｓｉＲＮＡ、Ｆ３−６により分解されない突然変異転写物を産生するＥ２Ｆ３レスキュー構築体（Ｒｅｓｃｕｅ）と一緒にトランスフェクトした。（図２Ｃ）ＷＴまたはＥ２Ｆ４−／−マウスの大静脈からのＶＳＭＣを上記のようにトランスフェクトした。
【図３】Ｅ２Ｆ１の欠乏は、ＶＳＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシスを低減可能である。マウス大静脈のＶＳＭＣを、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ）、Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−３）またはＥ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−６）の一方へのｓｉＲＮＡ、またはＦ１−３のいずれかで、Ｅ２Ｆ１レスキュー構築体と一緒にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１００μＭシスプラチンで３０時間処理した。次いで、細胞を固定して、切断カスパーゼ３に特異的なＰＥ共役抗体を使用して、活性カスパーゼ３を染色した。フローサイトメトリー分析を使用して、ＰＥ陽性細胞（％）を定量した。
【図４】図４Ａ〜４Ｄ。静脈移植片におけるｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ取込み。（図４Ａ）移植血管におけるｓｉＲＮＡの送達を評価するための実験アプローチの概略図。（図４Ｂ）ｓｉＲＮＡ安定性の評価。ＷＴマウスの３つの静脈移植片を３２Ｐ−スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｉＲＮＡとともに２５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、移植片を灌流で洗浄し、２回凍結融解させて組織を壊して、フェノール：クロロホルムを使用してｓｉＲＮＡを抽出した。引き続き、標識化したｓｉＲＮＡを非変性アクリルアミドゲル上で分割して、分解の程度を評価した。（図４Ｃ）ｓｉＲＮＡ取込みの評価。マウスから大静脈を摘出し、全部で５ナノモルのスクランブルｓｉＲＮＡと微量（１００，０００ｃｐｍ）の末端標識３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡを含有するＤＭＥＭにおいて、室温または氷上のいずれかで３０分間インキュベートした。次いで、この血管を灌流で洗浄した後で、３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡの血管への取込みを定量した。血管内の３２Ｐの量をインプット（１００，０００ｃｐｍ）３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡで割って１００倍することによって取込み（％）を測定した。（図４Ｄ）ｓｉＲＮＡ処理後のＥ２Ｆタンパク産物。スクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣＲ）またはＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３へのｓｉＲＮＡ（ｓｉＥ２Ｆ）のいずれかと一緒にすでにインキュベートした静脈移植片の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分割して、その後タンパク質をイムノブロッティングのためにＰＶＤＦ膜へ移した。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｃ。Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡは、静脈バイパス移植片において血管内膜過形成を低減する。（図５Ａ）（左）プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ゲル単独（Ｇｅｌ対照）、（中央）非特異的なスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣＲ）、および（右）Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡ（ｓｉＥ２Ｆ）で処理した、移植後２８日のマウス静脈移植片からの断面を示す顕微鏡写真。Ｇｅｌ対照とＳＣＲ処理２８日移植片における静脈ＶＳＭ血管内膜過形成は高度に細胞性であり、結合組織マトリックスに散在する平滑筋細胞より構成される。ｓｉＥ２Ｆの２８日移植片の血管壁は、わずかな細胞層の厚さしかない。（改良マッソントリクロームおよびベルヘーフエラスチン染色）。（図５Ａ’）血管内膜層の厚さを示す、図５Ａの囲み領域の４０倍拡大図。（図５Ｂ）ｓｉＲＮＡなし（Ｇｅｌ；プルロニックゲル対照）、５ナノモルの対照ｓｉＲＮＡ（ＳＲＣ）、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗する各２．５ナノモルのｓｉＲＮＡ（２’ＯＨ ｓｉＲＮＡ）のいずれかで処理したマウス。血管の内膜層（Ｉｎｔｉｍａ）および内側層（Ｍｅｄｉａ）の領域を表す。内膜比（血管内膜の面積を血管の全面積で割ったもの）をバイパス移植後２８日目に決定した。（図５Ｃ）図５Ｂのデータを阻害（％）としてプロットした（ここでは、ゲル対照群を血管内膜過形成の１００％阻害に設定する）。各バーは、１３匹のマウスの平均測定値を表す。内膜比は、Ｅ２Ｆに抗するｓｉＲＮＡでの処理の後で、約４２％低減される（Ｐ＜０．０００１）。内膜厚も約４４％低減される（Ｐ＝０．０００３）が、内側の厚さでは有意な変化を観察しない（Ｐ＝０．８７２７）。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｃ。Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡは、静脈バイパス移植片において血管内膜過形成を低減する。（図５Ａ）（左）プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ゲル単独（Ｇｅｌ対照）、（中央）非特異的なスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣＲ）、および（右）Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡ（ｓｉＥ２Ｆ）で処理した、移植後２８日のマウス静脈移植片からの断面を示す顕微鏡写真。Ｇｅｌ対照とＳＣＲ処理２８日移植片における静脈ＶＳＭ血管内膜過形成は高度に細胞性であり、結合組織マトリックスに散在する平滑筋細胞より構成される。ｓｉＥ２Ｆの２８日移植片の血管壁は、わずかな細胞層の厚さしかない。（改良マッソントリクロームおよびベルヘーフエラスチン染色）。（図５Ａ’）血管内膜層の厚さを示す、図５Ａの囲み領域の４０倍拡大図。（図５Ｂ）ｓｉＲＮＡなし（Ｇｅｌ；プルロニックゲル対照）、５ナノモルの対照ｓｉＲＮＡ（ＳＲＣ）、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗する各２．５ナノモルのｓｉＲＮＡ（２’ＯＨ ｓｉＲＮＡ）のいずれかで処理したマウス。血管の内膜層（Ｉｎｔｉｍａ）および内側層（Ｍｅｄｉａ）の領域を表す。内膜比（血管内膜の面積を血管の全面積で割ったもの）をバイパス移植後２８日目に決定した。（図５Ｃ）図５Ｂのデータを阻害（％）としてプロットした（ここでは、ゲル対照群を血管内膜過形成の１００％阻害に設定する）。各バーは、１３匹のマウスの平均測定値を表す。内膜比は、Ｅ２Ｆに抗するｓｉＲＮＡでの処理の後で、約４２％低減される（Ｐ＜０．０００１）。内膜厚も約４４％低減される（Ｐ＝０．０００３）が、内側の厚さでは有意な変化を観察しない（Ｐ＝０．８７２７）。
【００３４】
【表１−１】
【００３５】
【表１−２】
【００３６】
【表１−３】
【００３７】
【表１−４】
【００３８】
【表１−５】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、仮特許出願第６０／６８６，０４８号（２００５年６月１日出願）への優先権を主張する。
技術分野
本発明は、概して、血管内膜過形成に、そして特に、Ｅ２ＦへのｓｉＲＮＡを使用して血管内膜過形成を阻害する方法に関する。さらに本発明は、そのような方法における使用に適した化合物および組成物に関する。
【０００２】
背景技術
遺伝子発現を特異的に阻害するための１つの方法は、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達による。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）およびリボザイムが含まれる、遺伝子阻害へのアプローチの中で、ｓｉＲＮＡは、遺伝子阻害、標的バリデーション、および療法応用のために現在最も速やかに開発されているアプローチである（１）。ｓｉＲＮＡは、療法応用に十分適しているようである。標的遺伝子のきわめて特異的な阻害に加えて、ｓｉＲＮＡは、低濃度で有効であるので、非特異的な活性による毒性の可能性を低減または一掃する。最近、いくつかの原理検証型の研究により、ｓｉＲＮＡの療法可能性が実証されてきた。これらには、肝炎（２，３）、ウイルス感染症（４，５）、黄斑変性（６）、敗血症（７）、腫瘍の増殖および浸潤（８〜１０）、慢性神経障害疼痛（１１）、および血清コレステロール（１２）の治療が含まれる。上記の研究より明白であることは、ｓｉＲＮＡを特別な細胞種へ標的指向させること、またはそれらを局所へ送達することによって、ｓｉＲＮＡ応答の効率を高める一方で、有害な副作用の可能性がさらに抑えられることである。現在、機能性ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ安定性を高めるだけでなく、標的送達をさらに促進させるｓｉＲＮＡの化学修飾の方法を発見することに集中した努力がある（１２，１３）。
【０００３】
特定の遺伝子をｓｉＲＮＡで沈黙させるためのこれらの標的指向法は、局在化した病理学的血管内膜過形成の治療における魅力的な療法戦略に役立つ。病理学的な血管内膜過形成は、バイパス移植または血管形成術の間に受ける損傷に続いて静脈バイパス移植片と動脈において生じ、大部分は、媒質における血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖と治療される血管の内膜へのそれらの移動によるものである（１４，１５）。そのような増殖は、血管損傷により活性化されるいくつかの増殖刺激性シグナルにより誘導される（１６〜１８）。増殖の増加だけでなく、炎症とケモカインおよびその受容体のアップレギュレーションをもたらす媒質中の細胞のアポトーシスも、この過剰増殖応答を始動させる役割を担うことが示されてきた（１９，２０）。血管細胞のそのような異常な挙動は、心臓血管系疾患の治療のためのバイパス手術および血管形成術の高い長期失敗率をもたらす。実際、外科的手技の洗練化にかかわらず、静脈移植の失敗率は、依然として高い（２１，２２）。これらの失敗は、しばしば、手術または血管形成術による反復処置を要求して、心臓発作や虚血臓器の切断をもたらす場合がある。従って、そのような病原性の細胞プロセスを効果的に阻害する分子戦略の開発がここ２０年にわたる多大な研究と多くの臨床試験の焦点になっている。
【０００４】
転写因子のＥ２Ｆファミリーは、ＤＮＡ複製、細胞周期進行、および細胞運命決定に関与する遺伝子の発現を制御するのに必須の役割を担っている（２３−２８）。今日までに、８種の遺伝子産物（Ｅ２Ｆ１〜８）がＥ２Ｆファミリーのタンパク質を構成し、Ｅ２Ｆ３およびＥ２Ｆ６の追加のイソ型も存在するが、それらの機能は、十分には特性決定されていない（２９〜３２）。配列相同性に基づいて、Ｅ２Ｆタンパク質は、３つの異なるカテゴリーへ分類可能である。Ｅ２Ｆ１〜３は、細胞周期の間に緊密に調節されて、大抵は転写のアクチベーターとして機能する（２６）。Ｅ２Ｆ４とＥ２Ｆ５は、ｐＲｂファミリーメンバーのｐ１３０およびｐ１０７と協奏的に転写のリプレッサーとして機能する（３３）。Ｅ２Ｆ６〜８は、ｐＲｂファミリーのタンパク質から独立した転写リプレッサーとして機能すると考えられている（３０，３１，３４）。さらに、様々なグループからの証拠は、アクチベーターのＥ２Ｆ（Ｅ２Ｆ１〜３）が特異的な機能を有することを示唆する。この機能特異性は、細胞増殖の制御におけるＥ２Ｆ３の役割とアポトーシスの誘導におけるＥ２Ｆ１の役割において最も明白である（３５，３６）。
【０００５】
Ｅ２Ｆ活性が細胞増殖および細胞運命決定を制御することにおいて中心的な役割を担うので、Ｅ２Ｆ活性の阻害は、病理学的な血管内膜過形成と関連した血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）中の細胞プロセスを阻止するのに有効なやり方となる見込みがある。実際、Ｅｃｋｈａｒｔら（４０）による最近の研究は、Ｅ２Ｆ３ノックアウトマウスでは、傷害を受けた動脈において血管内膜過形成が大いに低減されることを証明した。
【０００６】
本発明は、Ｅ２ＦのＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３へ選択的に標的指向するｓｉＲＮＡがＶＳＭＣの増殖およびアポトーシスをｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害する能力、並びに、マウスバイパス移植片モデルにおける血管内膜過形成の発達を低減するその能力について検証するために設計した研究に由来する。本発明は、例えば、バイパス移植または血管形成術より生じる損傷に続いて静脈バイパス移植片や動脈において生じる病理学的な血管内膜過形成を阻害する方法を提供する。
【０００７】
発明の要約
本発明は、概して、血管内膜過形成に、そして特に、Ｅ２ＦへのｓｉＲＮＡを使用して血管内膜過形成を阻害する方法に関する。さらに本発明は、そのような方法における使用に適した化合物および組成物に関する。
【０００８】
本発明の目的および利点は、以下に続く記載より明らかになろう。
発明の詳細な説明
短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が哺乳動物細胞において遺伝子発現を配列特異的なやり方で阻害可能であるという発見は、そのような遺伝子阻害剤をｉｎ ｖｉｖｏで使用する、多くの病理学的状態の治療法の可能性を高めている。以下に続く実施例では、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡが培養状態の静脈一次平滑筋細胞の増殖およびアポトーシスを阻害可能であることを示す。さらに、これらｓｉＲＮＡの静脈移植片への体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）送達は、この移植片のマウス中への外科移植に続く、内因性Ｅ２Ｆ遺伝子のサイレンシングをもたらす。重要なことに、これらの増殖促進性Ｅ２Ｆへ特異的なｓｉＲＮＡの投与は、移植された移植片における血管内膜過形成を有意に低減した。これらの試験結果は、ｓｉＲＮＡが動物のバイパス移植片における血管内膜過形成を制限可能であるという治療原理の検証を確定させる。このように、Ｅ２Ｆ特異的なｓｉＲＮＡは、ヒトにおける末梢および冠状動脈バイパス移植手術に続くこの病理学的プロセスと移植の失敗を阻害するのに有用であることが証明され得るリード化合物の代表になる。
【０００９】
本明細書に記載するのは、アクチベーターＥ２Ｆの選択阻害剤として作用するｓｉＲＮＡの開発である。以下に続く実施例に提示するデータは、これらの阻害剤が療法目的のために標的部位へ効果的に送達可能であることを示す。具体的には、増殖促進性Ｅ２Ｆ（Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３）へ標的指向するｓｉＲＮＡの短期的な局所送達がマウスにおける静脈バイパス移植に続く血管内膜過形成の低減をもたらすことが示される。血管内膜過形成の低減は、これらのｓｉＲＮＡ阻害剤が培養状態の大静脈ＶＳＭＣの増殖およびアポトーシスを阻止する能力と相関した。細胞増殖および細胞運命の制御におけるＥ２Ｆ１の二元的な役割からすれば、Ｅ２Ｆ１またはＥ２Ｆ３のいずれかに抗するｓｉＲＮＡで細胞増殖の阻害が達成された一方で、ＤＮＡ傷害誘発性アポトーシスの阻害がＥ２Ｆ１に抗するｓｉＲＮＡに特異的であったことは、驚きではない。血管内膜過形成をもたらす病理学的な細胞の増殖およびアポトーシスをともに阻害する分子戦略の開発は、多大な研究の焦点になってきた（３７，３９，４２，４３）。実際、最近の報告は、ｉｎ ｖｉｖｏの血管内膜過形成に関連した過剰増殖応答を始動させることに、増殖の増加に加えて、血管傷害に続く培地中の細胞のアポトーシスが関与している可能性があると示唆している（１９）。Ｅ２Ｆ活性は、細胞の増殖だけでなく、増殖刺激シグナルの存在または非存在に依存するかまたはＤＮＡ傷害に応答するアポトーシスに仲介することが可能であるので、Ｅ２Ｆ活性の阻害は、ＶＳＭＣ中の細胞プロセスを阻止するのに有効な方法であることが期待される。
【００１０】
驚くべきことに、Ｅ２Ｆ３ ｓｉＲＮＡは、Ｅ２Ｆ４が存在しているときだけに、ＶＳＭＣ増殖を阻害するのに有効であることが観察された。Ｅ２Ｆ３ ｓｉＲＮＡは、Ｅ２Ｆ４ノックアウトマウスの大静脈に由来するＶＳＭＣにおける細胞増殖のより無効な阻害剤である（図２Ｃ）。この結果は、Ｅ２Ｆ３とＥ２Ｆ４がＶＳＭＣ増殖において反対の役割を担うことを示唆し、Ｅ２Ｆ４（増殖阻止性のＥ２Ｆ）欠乏マウスが動脈傷害に続く血管内膜過形成の増加を明示する一方で、Ｅ２Ｆ３（増殖推進性のＥ２Ｆ）欠乏マウスは、ＷＴ対照マウスに比較して低減された血管内膜過形成を示すという最近の観察に一致している（４０）。同様に、Ｅ２Ｆ１欠乏マウスはまた、これらの実験条件の下で血管内膜過形成の明確な低減を示す。まとめると、これらの試験結果は、Ｅ２Ｆの増殖およびアポトーシス機能だけを特異的に阻止するｓｉＲＮＡのような薬剤が再狭窄を臨床において制限するのにきわめて有効であろうと示唆するのに十分な証拠を提供している。さらに、それらは、様々なＥ２Ｆファミリーメンバーを区別しない阻害剤、例えば、Ｅ２Ｆ３とＥ２Ｆ４の両方の機能を阻害する薬剤は、血管平滑筋細胞増殖と血管内膜過形成を臨床において制御する次善の薬剤となる可能性があることを示す。この解釈に一致した、２つの大規模な無作為化フェーズ３試験は、非選択的なＥ２Ｆ阻害剤、Ｅ２Ｆ ＤＮＡデコイが血管内膜過形成や移植片不全に有意には影響を及ぼさないことを最近実証した（４５）。このように、すべてのＥ２ＦについてのコンセンサスＥ２Ｆ ＤＮＡ結合部位を担うＥ２Ｆ ＤＮＡデコイの臨床効果の不足への１つの説明は、ＤＮＡデコイは増殖刺激性Ｅ２Ｆと増殖抑圧性Ｅ２Ｆの両方の活性を阻害可能であるので、その投与は、Ｅ２Ｆ４活性が非存在であるときにＥ２Ｆ３ ｓｉＲＮＡが細胞増殖を阻害するのにあまり有効でないときに観察されるものに似た表現型をもたらす可能性がある、というものである。
【００１１】
ｓｉＲＮＡの療法応用には、特異性、合成のコスト、送達、および安定性といった技術課題が依然として関連しているが、ｓｉＲＮＡは、遺伝子阻害のために最も速く開発されている療法アプローチである。バイパス手術の治療現場では、上記ハードルの多くが乗り越えられるように思われる。非特異的な毒性を有するｓｉＲＮＡが他のｍＲＮＡに対して非特異的な効果を及ぼす可能性は、ｓｉＲＮＡをバイパス移植片へ直接かつ一過的に体外送達する（これは、潜在的な全身毒性を大いに低減するはずである）ので、大いに低下する。その趣意で、Ｅ２Ｆに抗するｓｉＲＮＡが標的指向されたＥ２Ｆに特異的であることを示した（図１Ｃおよび１Ｄ）。さらに、ｓｉＲＮＡの移植片への体外送達は、治療に求められるｓｉＲＮＡの量を実質的に減らすので、この臨床現場におけるその使用コストを抑えることになる。さらに、ｓｉＲＮＡの安定性をさらに高めて、細胞への送達と組織バイオアベイラビリティを促進するために、精力的な研究が現在実施されている（６，１０，１２，１３）。ｓｉＲＮＡ技術におけるこれらの改善も、心臓および血管外科の現場におけるその使用を促進するはずである。このように、ｓｉＲＮＡの臨床有用性が近い将来に心臓血管手術の現場において評価されることが期待されている。
【００１２】
本発明のいくつかの側面は、以下に続く非限定的な実施例においてより詳しく記載可能である。
実施例
実験の詳細
他に述べなければ、化学品は、いずれもシグマ・アルドリッチ社より購入し、制限酵素は、いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社（ＮＥＢ）より入手して、細胞培養産物は、いずれもＧｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の事業部）より購入した。
【００１３】
細胞培養
一次マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、１０％加熱不活性化胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、３７℃および５％ ＣＯ２で維持した。胸大動脈由来マウスＶＳＭＣの一次培養物を入手して、既報（４７，４８）のように培養した。野生型およびＥ２Ｆ４−／−マウスの大動脈からのＶＳＭＣを４−１０ Ｍｅｄｉｕｍに維持した。
【００１４】
ルシフェラーゼアッセイ
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、１０％胎仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭに維持した。トランスフェクションに先立つ１６時間前に、５ｘ１０４細胞／ウェルを２４ウェルプレートに播いた。既報（４９）のように、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（キアジェン）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ｓｉＲＮＡとレポータープラスミドの同時トランスフェクションを行った。各ウェルで１μｇのＥ２Ｆ１−Ｌｕｃまたはｐ６８−Ｌｕｃ、１ｎｇ ｐＲＬ−ＴＫ（プロメガ）、および、示す場合は、４ｎｇのＨＡ−Ｅ２Ｆ１またはＨＡ−Ｅ２Ｆ３と５０ピコモルｓｉＲＮＡ二重鎖を３６０μｌの最終容量で使用した。トランスフェクションから２４時間後の細胞について、ルシフェラーゼおよびレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）の発現を検定した。各実験は同一３検体で実施した。
【００１５】
核抽出物とウェスタンブロット
野生型マウスの大静脈に由来する一次、継代３のＶＳＭＣを６０ｍｍディッシュに５０％集密度で播き、１μＭのスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）、Ｅ２Ｆ３（Ｆ３−２単独、Ｆ３−５単独、Ｆ３−６単独、またはＦ３−１、Ｆ３−５、Ｆ３−６の組合せ（ｓｉＥ２Ｆ３プール））に対する１μＭ ｓｉＲＮＡ、またはＥ２Ｆ１（Ｆ１−５単独、Ｆ１−４単独、Ｆ１−３単独、Ｆ１−２単独、またはＦ１−５、−４、−３、−２の組合せ（ｓｉＥ２Ｆ１プール））に抗する１μＭ ｓｉＲＮＡのいずれかとともにＳｕｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２回トランスフェクトした。１回目のトランスフェクションは細胞を播いてから２４時間後に実施したが、２回目のトランスフェクションは、細胞を播いてから４８時間後に実施した。このトランスフェクションプロトコールは、上記の条件下でトランスフェクション効率を高めることを可能にする。２回目のトランスフェクション後２４時間の間に細胞をそのまま回復させてから、Ｅ２Ｆ１またはＥ２Ｆ３タンパク質の発現レベルを検定した。大静脈ＶＳＭＣの核抽出物を既報（４９）のように調製した。この抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分割し、続いてタンパク質をイムノブロッティングのためにＰＶＤＦ膜上へ移した。イムノブロッティングには以下の一次抗体を利用した：抗Ｅ２Ｆ３ａ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−８７９）、抗Ｅ２Ｆ１（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−２５１）、抗Ｅ２Ｆ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−６３３）、および抗Ｅ２Ｆ４（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−１０８２）。
【００１６】
レスキュー実験に使用の突然変異Ｅ２Ｆ構築体の産生
ｓｉＲＮＡ標的配列は、以下の通りである：Ｆ１−３，ＡＡＧＡＵＣＵＣＣＣＵＵＡＡＧＡＧＣＡＡＡ、およびＦ３−６，ＡＡＧＡＣＵＵＣＡＵＧＵＧＵＡＧＵＵＧＡＵ。
【００１７】
標準的な分子生物学の技術を使用して、Ｅ２Ｆの突然変異体（ｐＣＤＮＡ３−ＨＡＥ２Ｆ１ｍｕｔおよびｐＣＤＮＡ３−ＨＡＥ２Ｆ３ａｍｕｔ）を産生した。簡潔に言えば、突然変異誘発に使用したプライマーは、以下の通りである：
【００１８】
【化１】
【００１９】
Ｅ２Ｆ１ｍｕｔは、ｓｉＲＮＡ Ｆ１−３の効果に対してそれを非感受性にするサイレント点突然変異を収容する。Ｅ２Ｆ３ａｍｕｔは、ｓｉＲＮＡ Ｆ３−６による標的指向を排除するように設計したサイレント点突然変異を収容する。
【００２０】
トランスフェクションアッセイ
野生型またはＥ２Ｆ４−／−マウスの大静脈に由来する一次、継代３のＶＳＭＣを６０ｍｍディッシュに５０％集密度で播き、１μＭのスクランブルｓｉＲＮＡ（対照）、Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−３、Ｆ１−４、またはＦ１−５）に抗する１μＭ ｓｉＲＮＡ、Ｅ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、またはＦ３−６）に抗する１μＭ ｓｉＲＮＡ、または１μＭのＦ１−３＋４μｇのｐＣＤＮＡ３−ＨＡＥ２Ｆ１、またはＦ３−６＋４μｇのｐＣＤＮＡ３−ＨＡＥ２Ｆ３ａｍｕｔ（Ｒｅｓｃｕｅ）のいずれかとともにＳｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を２４時間使用して２回トランスフェクトした。また、Ｅ２Ｆ６に抗するｓｉＲＮＡを対照（ｓｉＥ２Ｆ６）として細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションに続いて細胞をトリプシン処理して、１２ウェルプレートに約２０，０００細胞／ウェルで播いた。
【００２１】
ＶＳＭＣ増殖（ＤＮＡ合成）アッセイ
野生型および／またはＥ２Ｆ４−／−マウスの大静脈からのトランスフェクトされたＶＳＭＣを
トリプシン処理して、１２ウェルプレートに約２０，０００細胞／ウェルで播いた。次いで、０．５μＭ ＨＵの添加により、細胞を強制的にＧ１／Ｓへ阻止した。２１時間後、ＨＵを欠く培地の添加により細胞をＨＵブロックより解放し、３Ｈ−チミジン（培地１ｍＬにつき１μＣｉ）を含有する培地とともにインキュベートして、ＤＮＡ合成をモニタリングした。３Ｈ−チミジン含有培地の存在下で２４時間のインキュベーションの後で、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（ＶＷＲ ｃａｔ＃ ＶＷ３９２６−２）で１回洗浄し、０．５ｍＬの０．５Ｎ ＮａＯＨ（ＶＷＲ ｃａｔ＃ ＶＷ３２２１−１）に採取して、３Ｈ−チミジン取込みの測定のためにシンチレーションバイアルへ入れた。データは、細胞増殖（％）としてプロットした（ここで１００％細胞増殖は、３Ｈ−チミジン取込み（％）により定義する）。ゲル対照の３Ｈ−チミジン取込みを１００％へ設定した。
【００２２】
ＶＳＭＣアポトーシスアッセイ
野生型マウスの大静脈からのトランスフェクトされたＶＳＭＣを４−１０培地単独（ＷＴ、シスプラチン無し）または１００μＭシスプラチンを含有する４−１０培地で３０時間処理した。次いで、細胞を固定して、切断カスパーゼ３に特異的なＰＥ共役抗体を使用して、活性カスパーゼ３を染色した（製造業者のプロトコールに特定される通り）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。フローサイトメトリー分析を使用して、ＰＥ陽性細胞（％）をアポトーシスの尺度として定量した。アポトーシス（％）は、フローサイトメトリー分析により測定されるＰＥ陽性細胞（％）により定義する。
【００２３】
ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｉＲＮＡ取込みアッセイ
各条件につき３匹のマウスから大静脈を下記のように摘出して、摘出血管を、全部で１μＭのスクランブルｓｉＲＮＡと微量（１００，０００ｃｐｍ）の末端標識３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡを含有するＤＭＥＭにおいて、室温または氷上のいずれかで３０分間インキュベートした。次いで、この血管をＤＭＥＭで３回、ＰＢＭで２回灌流で洗浄した後で、３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡの血管への取込みを定量した。３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡの取込みは、血管をシンチレーション液に入れて、シンチレーションカウンターを使用して３２Ｐを測定することによって定量した。血管内の３２Ｐの量をインプット（１００，０００ｃｐｍ）３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡで割って１００倍することによって取込み（％）を測定した。さらに、２５℃で３０分のインキュベーションに続いて、フェノール：クロロホルムを使用して、血管の１つから３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡを抽出して、非変性アクリルアミドゲル上で分割した。このｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価するために、スクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣＲ）またはＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３へのｓｉＲＮＡ（ｓｉＥ２Ｆ）のいずれかと一緒にすでにインキュベートした静脈移植片の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分割して、その後タンパク質をイムノブロッティングのためにＰＶＤＦ膜へ移した。イムノブロッティングには以下の一次抗体を利用した：抗Ｅ２Ｆ３ａ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−８７９）、抗Ｅ２Ｆ１（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−２５１）、抗Ｅ２Ｆ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−６３３）、および抗Ｅ２Ｆ４（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳＣ−１０８２）。
【００２４】
マウスｉｎ ｖｉｖｏ静脈バイパス移植片モデル
マウスの静脈バイパス移植片モデルは、ＺｈａｎｇとＨａｇｅｎら（５０）による既報のように実施した。簡潔に言えば、下大静脈（ＩＶＣ）の０．８ｃｍ切片をドナーマウスより採取して、同系レシピエントの頚動脈へ吻合した。レシピエントマウスにおける移植に先立って、５ナノモルのＳＣＲ ｓｉＲＮＡ、またはＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗する各２．５ナノモルのｓｉＲＮＡの混合物のいずれかを含有するＤＭＥＭ溶液にＩＶＣを室温で３０分間入れた。この間、移植片レシピエントマウスにおいて、左総頚動脈の１０ｍｍ切片を周囲の組織より単離した。この切片を近位および遠位に８−０ナイロン縫合で閉鎖し、２つの動脈切開部を近位と遠位に約０．８ｃｍ離して創出してから、血管を生理食塩水で満たした。２つの固定縫合を各動脈切開部の近位および遠位角で、そして２つの可動縫合を動脈周囲の各１８０°（４〜６の咬合／１８０°）で使用する、ＩＶＣと頚動脈の間の端−側吻合を実施した。ＩＶＣ吻合の間の頚動脈切片を両端で結紮して切断して、それによりＩＶＣ移植片を広げた。次いで、８−０ナイロン結紮を取り出して、飽和した移植片の壁を通る血流を評価することによって、移植片の開存性を決定した。ｓｉＲＮＡを含有する残りのＤＭＥＭ溶液を３０％プルロニックゲル（ＢＡＳＦ）と氷上で混合し、移植の部位へ移して、ここでゲルを重合化させた。次いで、切開部を閉じて、次の２〜３日にわたり、残る核酸をそのままゲルの外から静脈中へ拡散させた。この手順全体は、非外傷性の技術を用いて、９６％の成功率で厳密に実施した。手術時間は、平均して、ＩＶＣ採取について１０分、頚動脈間置移植術について４０分であった。すべての手術手順は、手術顕微鏡（ＷＥＣＫ Ｍｏｄｅｌ ０２９００１，ズーム３．６−１８，Ｊ．Ｋ．Ｈｏｐｐｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用し、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内）麻酔を用いて無菌的に実施した。
【００２５】
移植から４週後に移植片を採取した。先の切開部を通して移植片を曝露し、胸腔を開いた。右心房に切込みを入れて、左心室を通すＰＢＳで移植片を灌流した。次いで、１００ｍｍＨｇの一定圧で２０分間、移植片を１０％緩衝化ホルマリンでｉｎ ｓｉｔｕ灌流−固定した。この移植片を摘出して、１０％中性緩衝化ホルマリン中に２４時間入れてから、７０％エタノールへ移した後で、パラフィンに包埋した。移植片の中央から５ミクロンの連続切片を０．５ｍｍごとに取って各移植片につき全部で４つの切片とし、Ｍｉｋａｔ（改良マッソントリクロームおよびベルヘーフエラスチン組織染色液）で染色した。この染色は、コラーゲンを緑色、エラスチンを黒色、細胞質を赤色、核を黒色で同定することを可能にした。
【００２６】
Ｎｉｋｏｎカメラを使用して撮影した４０倍原図拡大像を使用して、組織切片の形態計測分析を実施した。内腔、新生血管内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）、および媒質の周界および領域の測定は、ＩｍａｇｅＴｏｏｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．０，ＵＴＨＳＣＳＡ）を使用するｐｌａｉｎｉｍｅｔｒｙによって実施した。新生血管内膜は、平滑筋細胞の交差したランダムに出現する配向性と、ＶＳＭＣ細胞質の遍在とコラーゲンの相対的な不在により付与される主に赤い色によって同定した。媒質は、ＶＳＭＣの環状配向性と、コラーゲンにより付与される主に緑の色により認めた。この測定を使用して、切片から測定したものと同等な領域および周界の同心円を作成し、これらの円の半径を使用して、各移植片の層の平均厚を計算した。
【００２７】
統計分析
上記の結果は平均±ＳＥとして示す。統計分析は、片側ＡＮＯＶＡを使用して行った。０．０５以下のＰ値を有意差を示すものとみなした。片側ＡＮＯＶＡに加えて、両側不対ｔ検定を行って、各処置群を互いに比較した。ｓｉＥ２Ｆ群は、ＳＣＲおよびゲル対照群と有意に異なっていた（Ｐ＜０．０００１）。ＳＣＲ群は、ゲル対照群と有意に異なってはいなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００２８】
結果
Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡを設計して評価すること
ヒトおよびマウスの増殖促進性Ｅ２Ｆ（Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３）のより強力かつ選択的な阻害剤をｓｉＲＮＡ技術の使用を介して開発するために、マウスとヒトの配列をはじめに並置して、同一性の領域をｓｉＲＮＡ標的指向のために考慮した。次いで、選択した配列をＢＬＡＳＴ処理して、Ｅ２Ｆ標的−特異性および独自性をヒトおよびマウスのゲノムの内部で確認して、各Ｅ２Ｆ標的につき約６種のｓｉＲＮＡを分析用に選択した。
【００２９】
これらＥ２Ｆ特異的ｓｉＲＮＡの培養状態のマウス線維芽細胞における阻害効果を評価するために、脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用する一過性トランスフェクションアッセイを実施して、Ｅ２Ｆ仲介性の転写活性化を測定した。具体的には、Ｅ２Ｆ１またはｐ６８プロモーターのいずれかの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター構築体を、Ｅ２Ｆ１またはＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡの存在または非存在下に、それぞれＥ２Ｆ１（ＨＡ−Ｅ２Ｆ１）またはＥ２Ｆ３（ＨＡ−Ｅ２Ｆ３）発現カセットとともに同時トランスフェクトした（図１）。様々なＥ２Ｆ特異的ｓｉＲＮＡのＥ２Ｆ仲介性トランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に対する阻害効果を、ｓｉＲＮＡのそのＥ２Ｆ相対物およびレポーター構築体との同時トランスフェクションに続くレポーター活性化を測定することによってスコア化した。次に、ウェスタンブロット分析により、Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−２、Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）（図１Ｃ）またはＥ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）（図１Ｄ）に抗するｓｉＲＮＡの大静脈ＶＳＭＣ細胞中への一過性の送達がＥ２Ｆ３およびＥ２Ｆ１の発現を特異的に低減することを実証した。重要にも、Ｅ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡは、Ｅ２Ｆ１タンパク質レベルに効果がなく、Ｅ２Ｆ１に抗するｓｉＲＮＡは、Ｅ２Ｆ３タンパク質レベルに効果がなかった。ｓｉＲＮＡトランスファーの効率を非特異的な蛍光標識ｓｉＲＮＡの同時トランスフェクションにより評価して、＞７５％であることを定量した（データ示さず）。さらに、Ｅ２Ｆ１またはＥ２Ｆ３のいずれかのタンパク質のレベルが低下した、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＶＳＭＣの分析は、培養状態のＶＳＭＣの有意に減少した増殖（３Ｈ−チミジン取込みにより測定する）を生じた（図２ＡおよびＢ）。この効果は、Ｅ２Ｆへの標的指向に特異的であり、標的ｓｉＲＮＡにより分解されない修飾Ｅ２Ｆ１または修飾Ｅ２Ｆ３転写物（それぞれＦ１−３およびＦ１−６）（Ｒｅｓｃｕｅ）のいずれかをコードする遺伝子の同時トランスフェクションにより一部逆転可能であった。この一部逆転の理由は、一次ＶＳＭＣ中のｓｉＲＮＡに対してプラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率がより低いためである（データ示さず）。重要にも、ｓｉＲＮＡの効果は、Ｅ２Ｆ４−／−同腹子より派生した大静脈ＶＳＭＣに比較してＥ２Ｆ４＋／＋大静脈ＶＳＭＣにおいて大きかった（それぞれ、約９０％と約２０％の増殖低下）（図２Ｃ）。この観察事実は、ｉｎ ｖｉｖｏでの動脈傷害に続く再狭窄の発症におけるＥ２Ｆ３およびＥ２Ｆ４の反対する役割を明らかにした最近の知見（４０）と一致している。具体的には、Ｅ２Ｆ４の損失が動脈傷害に続く血管内膜過形成の進行を速めるのに対して、Ｅ２Ｆ３の損失は血管内膜過形成の発達を妨げることが示された。まとめると、上記の知見は、増殖促進性のＥ２ＦであるＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡのような「選択的」Ｅ２Ｆアンタゴニストが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳動物の増殖を阻害するのに、Ｅ２Ｆタンパク質のファミリー全体の非選択的阻害剤より効果的であることが証明可能であるという考えを支援する。
【００３０】
Ｅ２Ｆ１タンパク質のアポトーシスにおける役割があるとして、Ｅ２Ｆ１発現の阻害の、ＶＳＭＣ中のシスプラチン誘発性アポトーシスに対する効果を評価した。Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−３）のレベルが低下した、ｓｉＲＮＡトランスフェクトした大静脈ＶＳＭＣの分析は、培養中のＶＳＭＣの有意に減少したアポトーシス（フローサイトメトリー分析を使用する、切断活性カスパーゼ３の蓄積により測定する）をもたらした（図３）。この効果は、Ｅ２Ｆ１ ｓｉＲＮＡに特異的であり、その標的ｓｉＲＮＡにより分解されない突然変異Ｅ２Ｆ１転写物の同時トランスフェクションにより一部逆転可能であった。さらに、Ｅ２Ｆ３（Ｆ３−２およびＦ３−６）へのｓｉＲＮＡは、スクランブル対照（ＳＣＲ）ｓｉＲＮＡに比較して減少したアポトーシスをもたらさなかった。
【００３１】
ｓｉＲＮＡの静脈移植片におけるｉｎ ｖｉｖｏ取込み
ＲＮＡｉ技術によるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子サイレンシングを達成することへの主要な障害は、送達である。はじめに、静脈移植片におけるｓｉＲＮＡの安定性を評価するために、３匹のマウスより大静脈を摘出して、放射標識ｓｉＲＮＡ（３２Ｐ−ＳＣＲ）とともに３０分間インキュベートした。次いで、この血管より全ＲＮＡを単離して、インタクトｓｉＲＮＡを非変性ＰＡＧＥゲル上で分割した（図４Ａおよび４Ｂ）。次いで、静脈移植片におけるｓｉＲＮＡ取込みの効率を定量するために、摘出した大静脈をｓｉＲＮＡとともに、取込みを可能にする室温でかまたは能動輸送を阻止する氷上のいずれかでｅｘ ｖｉｖｏでインキュベートした（４１）。次いで、移植片を灌流で洗浄した後で、３２Ｐ−ｓｉＲＮＡの血管への取込みを定量した。取込みの分析は、約６８％の標識ｓｉＲＮＡが静脈移植片へ輸送されたことを明らかにした。対照的に、氷上でインキュベートした静脈移植片とは、５％未満のインプットｓｉＲＮＡが結合した（図４Ｃ）。次に、ウェスタンブロット分析により、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３（Ｆ１−３およびＦ３−６の組合せ）に抗するｓｉＲＮＡのマウス静脈移植片への送達が、移植片をマウスに移植して４８時間後に、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３タンパク質の発現を低減することが実証された。重要なことに、Ｆ１−３とＦ３−６は、他のＥ２Ｆファミリーメンバーの発現に対して効果がなかった（Ｅ２Ｆ２およびＥ２Ｆ４のウェスタンを参照のこと）（図４Ｄ）。
【００３２】
マウス静脈バイパス移植片における血管内膜過形成の低減
次に、増殖促進性Ｅ２Ｆ（Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３の組合せ）に抗するｓｉＲＮＡの、静脈バイパス移植のマウスモデルにおける血管内膜過形成の発達に及ぼす効果を評価した。簡潔に言えば、実験条件ごとに１３匹のマウスについて下大静脈から頚動脈性静脈の移植手技を実施した。術後４週間で移植片を採取し、固定し、切片化して、分析用に染色した。移植片切片の分析は、処置を受けなかった対照動物（Ｇｅｌ対照）、並びにスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣＲ）で処置した動物において血管内膜過形成が発達していたことを確認した（図５Ａおよび５Ａ’）。対照的に、Ｅ２Ｆ１とＥ２Ｆ３の両方に抗するｓｉＲＮＡ（それぞれ、Ｆ１−３およびＦ３−６）での静脈移植片の処置は、対照試料と比較したときに、血管内膜過形成の有意な減少をもたらした（図５Ｂおよび５Ｃ）。Ｅ２Ｆに抗するｓｉＲＮＡは、ＳＣＲ対照とＧｅｌ対照の両群へ比較するとき、内膜対内側層の比を約４２％と約５７％、そして内膜比を約３６％と４３％低下させた（Ｐ＜０．０００１）（図５Ｃ，下パネル）。対照的に、Ｅ２Ｆ ｓｉＲＮＡは、内側面積に対して有意な効果がなかった（図５Ｂおよび５Ｃ）。要約すると、上記データは、この静脈バイパス移植のマウスモデルにおいて、ｓｉＲＮＡによるＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３タンパク産生の阻害が血管内膜過形成の発達を有意に低減することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｄ。Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡの、Ｅ２Ｆ仲介性転写活性に対する効果。（図１Ａ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＨＡ−Ｅ２Ｆ１発現ベクター単独、またはＥ２Ｆ１（Ｆ１−２、Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）若しくはＥ２Ｆ３（Ｆ３−２）に抗する合成ｓｉＲＮＡ二重鎖と一緒に、Ｅ２Ｆ１−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトした。（図１Ｂ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＨＡ−Ｅ２Ｆ３発現ベクター単独、またはＥ２Ｆ３（Ｆ３ａ−２、Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）若しくはＥ２Ｆ１（Ｆ１−３）に抗する合成ｓｉＲＮＡ二重鎖と一緒に、ｐ６８−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトした。３回の独立した実験より、ルシフェラーゼ活性をレニラ活性に対して正規化した。脂質ベースの試薬を使用して、マウス大静脈の血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）を、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（対照）または（図１Ｃ）Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−２、Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）若しくは（図１Ｄ）Ｅ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）へのｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡは、単独で、または一緒に（ｓｉＥ２Ｆ３プール、ｓｉＥ２Ｆ１プール）トランスフェクトした。次いで、トランスフェクトした細胞からの核抽出物をＳＤＳアクリルアミドゲル上で分割して、特異抗体でのウェスタンブロッティングによってＥ２Ｆタンパク質の存在を評価した（上パネル）。それぞれの個別ｓｉＲＮＡの標的特異性は、非標的Ｅ２Ｆメンバーのレベルを定量することによって評価した（下パネル）。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｄ。Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡの、Ｅ２Ｆ仲介性転写活性に対する効果。（図１Ａ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＨＡ−Ｅ２Ｆ１発現ベクター単独、またはＥ２Ｆ１（Ｆ１−２、Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）若しくはＥ２Ｆ３（Ｆ３−２）に抗する合成ｓｉＲＮＡ二重鎖と一緒に、Ｅ２Ｆ１−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトした。（図１Ｂ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＨＡ−Ｅ２Ｆ３発現ベクター単独、またはＥ２Ｆ３（Ｆ３ａ−２、Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）若しくはＥ２Ｆ１（Ｆ１−３）に抗する合成ｓｉＲＮＡ二重鎖と一緒に、ｐ６８−ｌｕｃレポータープラスミドでトランスフェクトした。３回の独立した実験より、ルシフェラーゼ活性をレニラ活性に対して正規化した。脂質ベースの試薬を使用して、マウス大静脈の血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）を、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（対照）または（図１Ｃ）Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−２、Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）若しくは（図１Ｄ）Ｅ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）へのｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡは、単独で、または一緒に（ｓｉＥ２Ｆ３プール、ｓｉＥ２Ｆ１プール）トランスフェクトした。次いで、トランスフェクトした細胞からの核抽出物をＳＤＳアクリルアミドゲル上で分割して、特異抗体でのウェスタンブロッティングによってＥ２Ｆタンパク質の存在を評価した（上パネル）。それぞれの個別ｓｉＲＮＡの標的特異性は、非標的Ｅ２Ｆメンバーのレベルを定量することによって評価した（下パネル）。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｃ。異なるＥ２Ｆの欠乏は、ＶＳＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を低減または加速可能である。（図２Ａ）マウス大静脈のＶＳＭＣを、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ）またはいずれかのＥ２Ｆ１（Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）へのｓｉＲＮＡ単独で、またはその標的ｓｉＲＮＡ、Ｆ１−３により分解されない突然変異転写物を産生するＥ２Ｆ１レスキュー構築体（Ｒｅｓｃｕｅ）と一緒にトランスフェクトした。次いで、０．５μＭヒドロキシ尿素（ＨＵ）の添加により、細胞をＧ１／Ｓ境界で同期化した。２１時間後、細胞をＨＵ阻止から解放し、血清と３Ｈ−チミジンを含有する培地の添加によって、細胞周期に再び入るように刺激した。血清添加後２４時間で細胞を溶解させ、シンチレーションカウンターを使用して、３Ｈ−チミジン取込みを分析した。図２Ｂ）マウス大静脈のＶＳＭＣを、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ）またはいずれかのＥ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）へのｓｉＲＮＡ単独で、またはその標的ｓｉＲＮＡ、Ｆ３−６により分解されない突然変異転写物を産生するＥ２Ｆ３レスキュー構築体（Ｒｅｓｃｕｅ）と一緒にトランスフェクトした。（図２Ｃ）ＷＴまたはＥ２Ｆ４−／−マウスの大静脈からのＶＳＭＣを上記のようにトランスフェクトした。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｃ。異なるＥ２Ｆの欠乏は、ＶＳＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を低減または加速可能である。（図２Ａ）マウス大静脈のＶＳＭＣを、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ）またはいずれかのＥ２Ｆ１（Ｆ１−３、Ｆ１−４、Ｆ１−５）へのｓｉＲＮＡ単独で、またはその標的ｓｉＲＮＡ、Ｆ１−３により分解されない突然変異転写物を産生するＥ２Ｆ１レスキュー構築体（Ｒｅｓｃｕｅ）と一緒にトランスフェクトした。次いで、０．５μＭヒドロキシ尿素（ＨＵ）の添加により、細胞をＧ１／Ｓ境界で同期化した。２１時間後、細胞をＨＵ阻止から解放し、血清と３Ｈ−チミジンを含有する培地の添加によって、細胞周期に再び入るように刺激した。血清添加後２４時間で細胞を溶解させ、シンチレーションカウンターを使用して、３Ｈ−チミジン取込みを分析した。図２Ｂ）マウス大静脈のＶＳＭＣを、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ）またはいずれかのＥ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−５、Ｆ３−６）へのｓｉＲＮＡ単独で、またはその標的ｓｉＲＮＡ、Ｆ３−６により分解されない突然変異転写物を産生するＥ２Ｆ３レスキュー構築体（Ｒｅｓｃｕｅ）と一緒にトランスフェクトした。（図２Ｃ）ＷＴまたはＥ２Ｆ４−／−マウスの大静脈からのＶＳＭＣを上記のようにトランスフェクトした。
【図３】Ｅ２Ｆ１の欠乏は、ＶＳＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシスを低減可能である。マウス大静脈のＶＳＭＣを、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒ）、Ｅ２Ｆ１（Ｆ１−３）またはＥ２Ｆ３（Ｆ３−２、Ｆ３−６）の一方へのｓｉＲＮＡ、またはＦ１−３のいずれかで、Ｅ２Ｆ１レスキュー構築体と一緒にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１００μＭシスプラチンで３０時間処理した。次いで、細胞を固定して、切断カスパーゼ３に特異的なＰＥ共役抗体を使用して、活性カスパーゼ３を染色した。フローサイトメトリー分析を使用して、ＰＥ陽性細胞（％）を定量した。
【図４】図４Ａ〜４Ｄ。静脈移植片におけるｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ取込み。（図４Ａ）移植血管におけるｓｉＲＮＡの送達を評価するための実験アプローチの概略図。（図４Ｂ）ｓｉＲＮＡ安定性の評価。ＷＴマウスの３つの静脈移植片を３２Ｐ−スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｉＲＮＡとともに２５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、移植片を灌流で洗浄し、２回凍結融解させて組織を壊して、フェノール：クロロホルムを使用してｓｉＲＮＡを抽出した。引き続き、標識化したｓｉＲＮＡを非変性アクリルアミドゲル上で分割して、分解の程度を評価した。（図４Ｃ）ｓｉＲＮＡ取込みの評価。マウスから大静脈を摘出し、全部で５ナノモルのスクランブルｓｉＲＮＡと微量（１００，０００ｃｐｍ）の末端標識３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡを含有するＤＭＥＭにおいて、室温または氷上のいずれかで３０分間インキュベートした。次いで、この血管を灌流で洗浄した後で、３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡの血管への取込みを定量した。血管内の３２Ｐの量をインプット（１００，０００ｃｐｍ）３２Ｐ−スクランブルｓｉＲＮＡで割って１００倍することによって取込み（％）を測定した。（図４Ｄ）ｓｉＲＮＡ処理後のＥ２Ｆタンパク産物。スクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣＲ）またはＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３へのｓｉＲＮＡ（ｓｉＥ２Ｆ）のいずれかと一緒にすでにインキュベートした静脈移植片の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分割して、その後タンパク質をイムノブロッティングのためにＰＶＤＦ膜へ移した。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｃ。Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡは、静脈バイパス移植片において血管内膜過形成を低減する。（図５Ａ）（左）プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ゲル単独（Ｇｅｌ対照）、（中央）非特異的なスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣＲ）、および（右）Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡ（ｓｉＥ２Ｆ）で処理した、移植後２８日のマウス静脈移植片からの断面を示す顕微鏡写真。Ｇｅｌ対照とＳＣＲ処理２８日移植片における静脈ＶＳＭ血管内膜過形成は高度に細胞性であり、結合組織マトリックスに散在する平滑筋細胞より構成される。ｓｉＥ２Ｆの２８日移植片の血管壁は、わずかな細胞層の厚さしかない。（改良マッソントリクロームおよびベルヘーフエラスチン染色）。（図５Ａ’）血管内膜層の厚さを示す、図５Ａの囲み領域の４０倍拡大図。（図５Ｂ）ｓｉＲＮＡなし（Ｇｅｌ；プルロニックゲル対照）、５ナノモルの対照ｓｉＲＮＡ（ＳＲＣ）、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗する各２．５ナノモルのｓｉＲＮＡ（２’ＯＨ ｓｉＲＮＡ）のいずれかで処理したマウス。血管の内膜層（Ｉｎｔｉｍａ）および内側層（Ｍｅｄｉａ）の領域を表す。内膜比（血管内膜の面積を血管の全面積で割ったもの）をバイパス移植後２８日目に決定した。（図５Ｃ）図５Ｂのデータを阻害（％）としてプロットした（ここでは、ゲル対照群を血管内膜過形成の１００％阻害に設定する）。各バーは、１３匹のマウスの平均測定値を表す。内膜比は、Ｅ２Ｆに抗するｓｉＲＮＡでの処理の後で、約４２％低減される（Ｐ＜０．０００１）。内膜厚も約４４％低減される（Ｐ＝０．０００３）が、内側の厚さでは有意な変化を観察しない（Ｐ＝０．８７２７）。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｃ。Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡは、静脈バイパス移植片において血管内膜過形成を低減する。（図５Ａ）（左）プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ゲル単独（Ｇｅｌ対照）、（中央）非特異的なスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣＲ）、および（右）Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗するｓｉＲＮＡ（ｓｉＥ２Ｆ）で処理した、移植後２８日のマウス静脈移植片からの断面を示す顕微鏡写真。Ｇｅｌ対照とＳＣＲ処理２８日移植片における静脈ＶＳＭ血管内膜過形成は高度に細胞性であり、結合組織マトリックスに散在する平滑筋細胞より構成される。ｓｉＥ２Ｆの２８日移植片の血管壁は、わずかな細胞層の厚さしかない。（改良マッソントリクロームおよびベルヘーフエラスチン染色）。（図５Ａ’）血管内膜層の厚さを示す、図５Ａの囲み領域の４０倍拡大図。（図５Ｂ）ｓｉＲＮＡなし（Ｇｅｌ；プルロニックゲル対照）、５ナノモルの対照ｓｉＲＮＡ（ＳＲＣ）、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３に抗する各２．５ナノモルのｓｉＲＮＡ（２’ＯＨ ｓｉＲＮＡ）のいずれかで処理したマウス。血管の内膜層（Ｉｎｔｉｍａ）および内側層（Ｍｅｄｉａ）の領域を表す。内膜比（血管内膜の面積を血管の全面積で割ったもの）をバイパス移植後２８日目に決定した。（図５Ｃ）図５Ｂのデータを阻害（％）としてプロットした（ここでは、ゲル対照群を血管内膜過形成の１００％阻害に設定する）。各バーは、１３匹のマウスの平均測定値を表す。内膜比は、Ｅ２Ｆに抗するｓｉＲＮＡでの処理の後で、約４２％低減される（Ｐ＜０．０００１）。内膜厚も約４４％低減される（Ｐ＝０．０００３）が、内側の厚さでは有意な変化を観察しない（Ｐ＝０．８７２７）。
【００３４】
【表１−１】
【００３５】
【表１−２】
【００３６】
【表１−３】
【００３７】
【表１−４】
【００３８】
【表１−５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における静脈移植片中の血管内膜過形成を阻害する方法であって、前記阻害をもたらすのに十分な量のＥ２Ｆ１若しくはＥ２Ｆ３特異的な干渉性ＲＮＡを前記移植片へ送達することを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記哺乳動物がバイパス移植手術の患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物が末梢若しくは冠状動脈バイパス移植手術の患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記干渉性ＲＮＡがＥ２Ｆ１特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記干渉性ＲＮＡが短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記干渉性ＲＮＡを前記移植片へ体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）送達する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記干渉性ＲＮＡがＥ２Ｆ４を阻害しない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物の血管平滑筋細胞の増殖を阻害する方法であって、前記阻害をもたらすのに十分な量のＥ２Ｆ１若しくはＥ２Ｆ３特異的な干渉性ＲＮＡを前記細胞へ送達することを含んでなる、前記方法。
【請求項９】
Ｅ２Ｆ１特異的な干渉性ＲＮＡを送達する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞のＤＮＡ傷害誘発性アポトーシスを阻害することをさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記干渉性ＲＮＡがＥ２Ｆ４を阻害しない、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
バイパス移植または血管形成術の間に受ける損傷に続く、患者における病理学的な血管内膜過形成を阻害する方法であって、Ｅ２Ｆの増殖性およびアポトーシス機能を特異的に阻止する薬剤の有効量を送達することを含んでなる、前記方法。
【請求項１４】
前記薬剤がＥ２Ｆ１若しくはＥ２Ｆ３特異的なｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記損傷をバイパス移植の間に受ける、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤を前記移植片へ体外で投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤がＥ２Ｆ４を阻害しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
Ｅ２Ｆ１若しくはＥ２Ｆ３特異的なｓｉＲＮＡ。
【請求項１９】
請求項１８に記載の前記ｓｉＲＮＡと担体を含んでなる組成物。
【請求項１】
哺乳動物における静脈移植片中の血管内膜過形成を阻害する方法であって、前記阻害をもたらすのに十分な量のＥ２Ｆ１若しくはＥ２Ｆ３特異的な干渉性ＲＮＡを前記移植片へ送達することを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記哺乳動物がバイパス移植手術の患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物が末梢若しくは冠状動脈バイパス移植手術の患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記干渉性ＲＮＡがＥ２Ｆ１特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記干渉性ＲＮＡが短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記干渉性ＲＮＡを前記移植片へ体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）送達する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記干渉性ＲＮＡがＥ２Ｆ４を阻害しない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物の血管平滑筋細胞の増殖を阻害する方法であって、前記阻害をもたらすのに十分な量のＥ２Ｆ１若しくはＥ２Ｆ３特異的な干渉性ＲＮＡを前記細胞へ送達することを含んでなる、前記方法。
【請求項９】
Ｅ２Ｆ１特異的な干渉性ＲＮＡを送達する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞のＤＮＡ傷害誘発性アポトーシスを阻害することをさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記干渉性ＲＮＡがＥ２Ｆ４を阻害しない、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
バイパス移植または血管形成術の間に受ける損傷に続く、患者における病理学的な血管内膜過形成を阻害する方法であって、Ｅ２Ｆの増殖性およびアポトーシス機能を特異的に阻止する薬剤の有効量を送達することを含んでなる、前記方法。
【請求項１４】
前記薬剤がＥ２Ｆ１若しくはＥ２Ｆ３特異的なｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記損傷をバイパス移植の間に受ける、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤を前記移植片へ体外で投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤がＥ２Ｆ４を阻害しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
Ｅ２Ｆ１若しくはＥ２Ｆ３特異的なｓｉＲＮＡ。
【請求項１９】
請求項１８に記載の前記ｓｉＲＮＡと担体を含んでなる組成物。
【図１−１】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【公表番号】特表２００８−５４５７４９（Ｐ２００８−５４５７４９Ａ）
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１４８１８（Ｐ２００８−５１４８１８）
【出願日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２１１５４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３０７１６
【国際公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【出願人】（５０７１８９６６６）デューク ユニバーシティ (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２１１５４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３０７１６
【国際公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【出願人】（５０７１８９６６６）デューク ユニバーシティ (25)
【Ｆターム（参考）】
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