表面への細胞の付着
本発明は、表面に陽イオン化合物がグアニジン基を介して固定化されたマイクロキャリアに関する。マイクロキャリアは例えば電荷に基づく相互作用によって細胞を付着させることでき、細胞培養の担体として好適に用いられる。上記化合物は、アルギニン（Ａｒｇ）又はジペプチドのように１又は２個のアミノ酸を含むものでよい。本発明は、ポリカチオン性マイクロキャリアの製造方法であって、１個以上のグアニジン基を含む化合物をエポキシド活性化基材に固定化する段階を含む方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養時に細胞を付着及び維持することができるマイクロキャリアの分野に関する。具体的には、本発明は、細胞の付着を促進する化合物でコートされた多孔質基材からなるマイクロキャリアに関する。本発明は、かかるマイクロキャリアの製造法並びに細胞培養法も包含する。
【背景技術】
【０００２】
生体細胞の増殖を促進させるためのマイクロキャリア担体の使用は、変化に富んだ長い歴史をもつ。使用可能な量の細胞増殖を達成するための初期の系としては、シャーレ及びフラスコが挙げられる。培養表面積の増大によって単位装置容積当たりの細胞生産量を増加させる努力は大型トレイの使用に結実した。こうした初期の細胞増殖系の幾つかは、病院や大学などにおける小規模な労働集約性の高い細胞培養法で足りる用途には依然使用されている。
【０００３】
しかし、大規模プロセスに関しては代替法が必要とされる。一般的な細胞培養法はローラーボトル系である。基本的に、ローラーボトルは少量の栄養培地を収容すべく構成された円筒形容器である。動作中、ローラーボトルはその縦軸を中心にゆっくりと回転してボトルの内面全体が絶えず栄養培地で濡れるようにし、そこで細胞増殖が達成される。かかる複数のローラーボトルはローラーラックで作動できる。
【０００４】
もう一つの一般的方法はマイクロキャリア系である。最近、メンブラン系のような他の技術も導入されているが、マイクロキャリア系は依然として足場依存性細胞の増殖を経済的に有益な生産速度で達成できる細胞培養法として最も広く使用されていると思われる。このようにして大量培養を達成することは、ローラーボトルその他の公知の系のように繰返しによるものよりも優れている。さらに、マイクロキャリアバイオリアクター系は足場依存性細胞の自動化大量培養に十分適している。
【０００５】
マイクロキャリアの開発が始まったのは、懸濁培養での足場依存性細胞の増殖にデキストランビーズを基材として使用できることが実証された１９６０年代後半である。当初のマイクロキャリアはジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）のようなありふれた陽イオン型強塩基イオン交換基の使用に基づくものであった。爾来、ガラス、ポリスチレンプラスチック、アクリルアミド、固形コラーゲン、多孔質コラーゲン、セルロース及び液体フルオロカーボンを始めとする多種多様な材料がマイクロキャリアとして成功裏に使用されている。
【０００６】
表面に１以上の接着性ペプチドが共有結合又は非共有結合で結合したマイクロキャリアも提案されている。例えば、米国特許第４５７８０７９号（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）には、基材に固定化したときに細胞の付着を促進する組成物の例が開示されている。開示された組成物はフィブロネクチンタンパク質の小断片であり、具体的にはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列が１個以上の他のアミノ酸に結合したポリペプチド断片である。したがって、開示されたテトラペプチド組成物はフィブロネクチンと実質的に同じ細胞付着活性を有し、その活性は生体分子特異的な親和性相互作用に基づく。この組成物の明らかな短所はそれが生理活性物質であることであり、これは、例えばプロセス流への浸出のためその存在が医薬品や診断薬産業のような用途には不都合な場合があることを意味する。米国特許第４５７８０７９号の特許請求の範囲に記載された断片は、明細書によれば、細胞付着活性を示す従前の断片よりも小さなペプチドを選択的に合成すべく設計された実験で同定されたものである。米国特許第４５７８０７９号には、活性を示す最小断片がこの方法で決定できたと記載されている。さらに、上述の米国特許第４５７８０７９号の継続出願である米国特許第６１８０６１０号には、テトラペプチドが決定基ではあるが、ポリペプチドの至適サイズは上記テトラペプチドを含んだヘキサペプチド程度であると結論付けられている。
【０００７】
クロマトグラフィーなどにおいて、所望の標的分子と相互作用する基を与えるのに単一のアミノ酸を使用できることも知られている。例えば、弱陰イオン交換体Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））は、アミノ酸Ａｒｇが主にそのα−アミノ基を介して粒状アガロースマトリックスに結合したものからなる。このように、Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）はクロマトグラフィーゲルとして市販されており、その平均粒径は概してマイクロキャリアに必要な粒径よりも格段に小さい。
【０００８】
マイクロキャリアの細胞付着特性を促進する他のコーティングも提案されている。具体例はＣｙｔｏｄｅｘ（商標）１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））であり、細胞を静電的に結合することが知られているポリカチオン性コーティングであるジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）セルロースで架橋デキストラン基材をコートしたものからなる。しかし、細胞の付着及び増殖特性は、平板効率の低い細胞や分化又は感受性細胞型など、あらゆる細胞型に最適なわけではない。そこで、別のタイプの改良マイクロキャリアの必要性が依然として存在する。
【０００９】
細胞付着特性をさらに向上させるため、一段と複雑な化合物でコートされたマイクロキャリアが提案されている。具体例はＣｙｔｏｄｅｘ（商標）３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））であって、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）１と同様に架橋デキストラン基材からなるが、酸変性ブタコラーゲンの層でコートしたものである。しかし、哺乳類由来のコラーゲンのため用途によってはＣｙｔｏｄｅｘ（商標）３の使用が制限されかねない。
【００１０】
米国特許第６２１４６１８号は細胞培養用のマイクロキャリアビーズの分野に関するものであり、具体的には、かかる製品で動物タンパク質を避けるといういう課題に関する。提案された解決策は、表面にトリメチルアミンを有するスチレンコポリマーからなるマイクロキャリアビーズであり、ビーズを細胞培養に適したものとするため酸性溶液中で洗浄したものである。
【００１１】
米国特許第６３７８５２７号（Ｃｈｏｎｄｒｏｓ社）は、軟骨修復のため患者から軟骨細胞を採取し、迅速に増殖させ、患者に移植する外科的処置法に関する。軟骨細胞を増殖させるため、軟骨細胞を培養し、多糖類誘導体からなる足場に播種して最終的に増殖させるが、該多糖類誘導体はデキストランのような多糖類をポリアミンで架橋して得たものである。具体的には、まず多糖類を酸化してジアルデヒド誘導体とし、次いでこれを無毒性ポリアミドと反応させてイミン架橋を形成し、これをさらに水素化すれば安定なアミン結合が得られる。開示されたマイクロキャリアの利点は、軟骨細胞の増殖及びＩＩ型コラーゲンの形成が可能となることである。もう一つの利点は、生体外で利用すると、マイクロキャリアが無毒成分に分解し、その場に軟骨細胞が残って軟骨組織が形成されることである。
【特許文献１】米国特許第４５７８０７９号明細書
【特許文献２】米国特許第６１８０６１０号明細書
【特許文献３】米国特許第６２１４６１８号明細書
【特許文献４】米国特許第６３７８５２７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
細胞培養のための代替及び／又は改良マイクロキャリア並びにかかるマイクロキャリアの新規製造方法に対するニーズが依然として存在することは明らかである。また、細胞とその他の表面との相互作用を向上させるというさらに一般的なニーズも存在する。かかる表面としては、創薬スクリーニングや生理活性化合物の研究、細胞表面受容体の研究、環境汚染物質のモニタリングのような様々な用途に用いられる分析表面が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一態様は、細胞の付着及び細胞培養が可能な新規マイクロキャリアを提供することである。これは、本発明では、陽イオン化合物をグアニジン基を介して表面に固定化したマイクロキャリアによって達成でき、例えば電荷に基づく相互作用による。
【００１４】
本発明の別の態様は、細胞の付着及び培養のためのマイクロキャリアであって、哺乳類由来の生成物を全く含んでいないものを提供することである。
【００１５】
本発明の別の態様は、細胞の付着及び培養のためのマイクロキャリアであって、毒性及び夾雑物の制御が容易なものを提供することである。
【００１６】
本発明の追加の態様は、細胞付着及び細胞培養が可能な新規ポリカチオン性マイクロキャリアの製造方法を提供することである。これは、本発明では、１個以上のグアニジン基を含む化合物をエポキシド活性化基材表面に接触させて基材表面に固定化する方法によって達成できる。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、生存能をもたらす環境中で陽イオン化合物でコートされた１個以上のマイクロキャリアの表面で細胞を培養する細胞培養法であって、上記細胞が陽イオン性コーティングで与えられるグアニジン基を介してマイクロキャリアに付着している、方法を提供する。
【００１８】
本発明のその他の態様及び利点は以下の詳細な記載から明らかとなろう。
【００１９】
定義
「マイクロキャリア」という用語は、本明細書では、細胞培養を支持するために使用される粒状材料に関する従来通りの意味で用いられる。例えば、本願において「マイクロキャリア」という用語は、細胞付着を可能にする化合物を固定化した基材に対して用いられる。
【００２０】
「ポリカチオン性」マイクロキャリアという用語は、マイクロキャリア表面の正味電荷が正であることを意味する。
【００２１】
「基材」という用語は、キャリアのコア部、つまり、細胞を付着させることのできる材料を意味する。
【００２２】
基材の「表面」という用語には、基材の外表面並びに多孔質の場合は細孔表面が包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の第一の態様は、陽イオン化合物がグアニジン基を介して表面に固定化されているマイクロキャリアに関する。本発明では、「化合物」という用語は、１分子ではなく、ある量の化合物がマイクロキャリアの表面に固定化されていることを意味する。このように複数の化合物分子が（好ましくはコーティングとして）各マイクロキャリアに固定化されているので、各マイクロキャリアは正の正味電荷を呈し、そのため「ポリカチオン性」と呼ぶことができる。
【００２４】
一実施形態では、本発明のマイクロキャリアは、陽イオン化合物と細胞との電荷に基づく相互作用によって細胞を付着させることができる。これに関して、「付着」という用語は、細胞が生存できるように十分に定着することを意味する。一実施形態では、陽イオン化合物はタンパク質、好ましくはトリプトファン側鎖と相互作用する。別の実施形態では、相互作用は上述の相互作用が複合したものである。
【００２５】
グラフトによって基材表面に固定化されてコーティングを与える本発明の陽イオン化合物は基本的に非反応性である。これは、実際に細胞を付着させるように作用するが、他の化学種との反応には実質的に関与しないことを意味する。さらに、本発明の化合物は付着細胞にも環境中の他の生体物質にも悪影響をもたないという点で生体適合性である。したがって、この化合物は無毒である。本発明では、細胞の定着としても知られる細胞の「付着」は細胞が培養に十分な程度に強く結合していることを意味する。
【００２６】
周知の通り、細胞は一般に高ｐＨ環境では生存できない。そこで、一実施形態では、本発明のマイクロキャリアはｐＨ７付近の表面を呈する。特定の実施形態では、固定化された陽イオン化合物は基材表面に弱塩基性コーティングを形成する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、固定化化合物は１個以上のアミノ酸を含む。好適な実施形態では、上記化合物に含まれるアミノ酸は、電荷を変化させることができず、しかも自己触媒作用による酸含有基とのアミド結合形成を起こさないことを特徴とする。特定の実施形態では、アミノ酸のアミノ基は反応性であり、カルバメート形成によって電荷を変化させることができる。
【００２８】
一実施形態では、固定化化合物はリジン（Ｌｙｓ）以外の任意のアミノ酸を１個含む。上述のマイクロキャリア表面の弱塩基性コーティングを得るため、化合物は１個以上の塩基性アミノ酸を含んでいてもよい。そこで、好適な実施形態では、化合物はアルギニン（Ａｒｇ）である。本実施形態で得られるマイクロキャリアはＡｒｇの酸性カルボキシレート基のため表面ｐＨが低く、上述の市販ＤＥＡＥコートマイクロキャリアよりも細胞培養に適したｐＨを有する。特定の実施形態は、アルギニン系化合物、好ましくは緩衝性酸性基が結合したアルギニンを固定化したマイクロキャリアである。かかる化合物は一般式Ａｒｇ−Ｘで定義される。式中、Ｘは緩衝性酸性基である。さらに別の実施形態では、化合物は２種以上の異なるアミノ酸からなり、その結果、２種以上の異なるリガンドが基材表面に固定化される。例えば、化合物はアルギニンとアスパラギン酸の混合物からなるものでよい。
【００２９】
別の実施形態では、固定化化合物はジペプチドであるか、或いはジペプチドを含むものである。例えば、一実施形態では、ジペプチドはアルギニン−グルタミン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｕ）又はアルギニン−アスパラギン酸（Ａｒｇ−Ａｓｐ）である。ただし、マイクロキャリアへの細胞付着及び増殖に必要とされる本明細書記載の特性が得られる限り、その他のジペプチドも想定される。特定の実施形態では、緩衝基のような１個以上の別の基をジペプチドに結合させることもできる。
【００３０】
以上要するに、一実施形態では、固定化化合物はＡｒｇのような単一のアミノ酸、ＡｒｇとＡｓｐのような２種類のアミノ酸の混合物、或いはＡｒｇ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ａｓｐ又はＡｒｇ−Ａｒｇのようなジペプチドからなる群から選択される。最良の実施形態では、固定化化合物はＡｒｇのような単一のアミノ酸、及びＡｒｇ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ａｓｐ又はＡｒｇ−Ａｒｇのようなジペプチドからなる群から選択される。
【００３１】
本発明で使用されるアミノ酸及びジペプチドは、Ｍｅｒｃｋ社のような販売元から好適に入手される（アルギニン：Ｍｅｒｃｋ社参照番号７９７；Ａｒｇ−Ｇｌｕ：Ｍｅｒｃｋ社参照番号７９８）。或いは、固相合成法のような周知の組換え又は化学的技術を用いて当業者が容易に調製できる。手短に説明すると、固相合成法は、保護α−アミノ酸を適当な樹脂に結合することによってペプチドのＣ末端から開始される（例えば、米国特許第４２４４９４６号参照）。
【００３２】
このように、本発明のマイクロキャリアの基材に固定化された化合物はアミノ酸１個程度の大きさ、或いはジペプチドを形成するアミノ酸２個程度の大きさである。上掲の米国特許第４５７８０７９号（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）のフィブロネクチンの最小限の断片はテトラペプチドとすべきであり、好ましくはヘキサペプチドであるという結論に照らして、本発明の知見が予測できないことは明らかである。
【００３３】
さらに、本発明のマイクロキャリアに対する細胞付着は明らかに電荷相互作用に基づくものであり、化合物は負に荷電した細胞が付着できるように正に荷電している。この点で、フィブロネクチンと実質的に同じ生体分子特異的親和性に基づく細胞付着活性をもつと記載された上掲の米国特許第４５７８０７９号記載のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのようなフィブロネクチン断片とは異なる。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、固定化化合物はプリン又はプリン混合物を含む。特定の実施形態では、プリンはアデニン又はグアニンである。そこで、化合物はヌクレオチド又はヌクレオチド関連化合物を含んでいてもよい。
【００３５】
各グアニジン基は細胞の結合に役立つ作用をもつので、基材表面に固定化された化合物はリガンドとみなすことができ、その官能基はグアニジン基である。マイクロキャリアの特定の実施形態では、リガンド濃度は０．１〜３．０μｍｏｌ／ｍｇ乾燥マイクロキャリアの範囲内にある。例示的な実施形態では、リガンド濃度は例えば０．２、０．４、０．７、１．２、２．５又は３．０μｍｏｌ／ｍｇ乾燥マイクロキャリアである。固定化化合物がＡｒｇである特定の実施形態では、リガンド濃度は約０．７μｍｏｌ／ｍｇ乾燥マイクロキャリアである。固定化化合物がジペプチドである別の実施形態では、リガンド濃度は略同程度である。本発明のマイクロキャリアの例示的な重量密度は１．０２〜１．０５ｇ／ｃｍ３の範囲内にあるが、用途によってはこれよりも軽い又は重い材料が適していることもある。
【００３６】
好適な実施形態では、本発明のマイクロキャリアの基材は架橋炭水化物であるか、或いはかかる炭水化物から本質的になる。特定の実施形態では、マイクロキャリアは、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラゲナン、ジェラン及びアルギネートからなる群から選択される材料で作られる。そこで、好適な実施形態では、本発明のマイクロキャリアはゲルである。最も好適な実施形態では、マイクロキャリアは、最大限に栄養分を利用できるようにしながら、ビーズ内への細胞増殖を促す多孔質構造を呈する。
【００３７】
本発明のマイクロキャリア材料は逆相懸濁ゲル化のような常法で容易に製造できる（Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ： Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３−３９８（１９６４））。別法では、ベースマトリックスはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））のような市販品である。概して本発明のマイクロキャリアは４０〜３００μｍの平均粒径を呈し、例えば約２３０μｍのように１００〜２５０μｍなどである（０．９％ＮａＣｌ中）。最も好ましい実施形態では、本発明のマイクロキャリアは約１７０μｍ以上である（０．９％ＮａＣｌ中）。
【００３８】
別の実施形態では、本発明のマイクロキャリアは、例えばスチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどの架橋合成ポリマーからなり、化合物の最適な固定化（つまりリガンドの結合）及び細胞培養が実施できるように、それ自体を変性させてもよい。
【００３９】
本発明のマイクロキャリアの最も好適な実施形態では、化合物は第二級アミンを介して基材表面に固定化される。本発明のマイクロキャリアの製造に用いられる方法の詳細については、以下の本発明の第二の態様において説明する。
【００４０】
本発明には、細胞培養のための上記マイクロキャリアの使用も包含される。そこで、本発明の一態様は前述の請求項のいずれか１項に記載されたマイクロキャリア１個以上からなる細胞培養担体である。
【００４１】
本発明の第二の態様は、１個以上のグアニジン基を含む化合物をエポキシド活性化基材表面に接触させて上記化合物を固定化することによるマイクロキャリアの製造方法に関する。エポキシド活性化は、ｐＨ９のような塩基性触媒によるものでも、酸性触媒によるものでもよい。この分野では、基材のエポキシド活性化は周知であり、常用されている固定化技術である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ他によるＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｇｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ａ． Ｋｒｉｓｈｎａ Ｍａｌｌｉａ及びＰａｕｌ Ｋ． Ｓｍｉｔｈ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＩＮＣ， １９９２参照。固定化は最も好適にはｐＨ制御した溶液中で実施される。本発明の方法を用いて製造されたマイクロキャリアの詳細については、本発明の第一の態様に関する上述の記載に見いだすことができよう。
【００４２】
基材は、架橋多糖類からなる基本的に球状の多孔質ビーズなど、上述のマイクロキャリア材料のいずれでもよい。上述のエポキシド活性化の前段階では、炭水化物基材を例えば以下の実施例に記載のようにしてアリル化する。対照的に、基材が合成ポリマーからなるときは、概してアリル基は既に存在しているので、アリル化段階は必要とされない。
【００４３】
固定化された化合物についても本発明の第一の態様において説明した。一実施形態では、固定化化合物はＡｒｇのような単一のアミノ酸、ＡｒｇとＡｓｐのような２種類のアミノ酸の混合物、或いはＡｒｇ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ａｓｐ又はＡｒｇ−Ａｒｇのようなジペプチドからなる群から選択される。最良の実施形態では、固定化化合物はＡｒｇのような単一のアミノ酸、及びＡｒｇ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ａｓｐ又はＡｒｇ−Ａｒｇのようなジペプチドからなる群から選択される。
【００４４】
化合物がジペプチドである場合、カップリングは２種類のアミノ酸を含む溶液からのグラフト反応、つまり最初のアミノ酸と２番目のアミノ酸の段階的カップリングでよい。この種の担体表面に化合物を固定化する方法は当業者に周知である。
【００４５】
本発明の第三の態様は、表面に細胞を付着させる方法であって、１個以上のグアニジン基を含む陽イオン化合物を使用して上記表面に細胞を付着させる方法に関する。一実施形態では、付着は電荷に基づく相互作用をよる。最も好ましい実施形態では、化合物はアルギニン（Ａｒｇ）である。表面は、例えばマイクロキャリア、メンブラン、布、マイクロチップのようなチップ、マイクロキャピラリのようなキャピラリー又は容器の表面でよい。特定の実施形態では、本発明の表面は、細胞付着後に様々な用途に使用できる布の表面である。本発明の方法は、例えば分析目的、生産プロセス、及び／又は火傷の治療用組織で例示されるような医療用途に有用である。
【００４６】
さらに、本発明は、上述の本発明の第三の態様に関して説明した方法を含むハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のための細胞局在化法に関する。
【００４７】
本発明の第四の態様は、生存能をもたらす環境中で陽イオン化合物でコートされた１個以上のマイクロキャリアの表面で細胞を培養する細胞培養方法であって、上記細胞が陽イオン性コーティングで与えられるグアニジン基を介してマイクロキャリアに付着している方法に関する。一実施形態では、細胞の付着は電荷に基づく相互作用によるものである。最も好適な実施形態では、マイクロキャリアは上述の通りである。これに関して、生存能もたらすという用語が各細胞型について適当な温度、栄養分の供給その他のパラメータを維持することを意味していることは当業者には自明であろう。したがって、細胞が付着したマイクロキャリアは、好ましくは温度制御し、撹拌しながら、適当な容器中で溶解又は懸濁状態に維持される。本発明で培養される細胞は真核細胞でも原核細胞でもよいが、好ましくは、例えば組換え細胞系のような哺乳類細胞、植物細胞などの真核細胞である。一実施形態では、細胞は、初代培養細胞や類上皮形態の細胞のような真の足場依存性細胞である。特に好適な実施形態では、細胞は平板効率の低い細胞、或いは肝細胞や内分泌細胞のような分化又は感受性細胞型である。以下の実施例では、本発明のこの態様をＶｅｒｏ細胞として知られる線維芽細胞系を用いて例示するが、これはアフリカミドリザル腎臓由来の完全に足場依存性の線維芽細胞である。
【００４８】
一実施形態では、本発明の方法はマイクロキャリアから生存細胞を回収する追加段階を含む。一実施形態では、後段で、培養細胞を分析及び／又は医療目的に用いる。別の実施形態では、後段で、培養細胞をウイルス、細菌、カビ、真菌、藻類の培養の支持に使用する。この実施形態はワクチンの製造その他の用途に関連したプロセスで有益である。
【００４９】
最後に、本発明は魚由来のゼラチンを表面に固定化したマイクロキャリアに関する。ゼラチンは物質の複雑な混合物であるが、そのタンパク質は大量の陽イオン性ペプチド及び若干のタンパク質を有していると考えられる。魚ゼラチンを固定化する基材は、上述の本発明の第一の態様に関して挙げたもののいずれでもよい。かかるマイクロキャリアには哺乳類タンパク質が存在しないので、本発明のこの態様は市販のＣｙｔｏｄｅｘ（商標）３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））マイクロキャリアから見ると有利である。さらに、ゼラチンは細胞の増殖を促進する増殖因子を与える可能性があるし、マイクロキャリアが互いに又は培養容器表面と衝突したときに付着細胞を機械的に保護する可能性がある。
【００５０】
図面の詳細な説明
図１は実施例１に記載の本発明のマイクロキャリアでのＶｅｒｏ細胞の培養における細胞数の経時的変化を示す。図１では、細胞数（細胞数／ｍｌ懸濁液）をＹ軸に示し、時間をＸ軸に示す。約１６８時間で、本発明を用いた培養例を示す一番上の線（菱形）は約１．４０×１０６に達するのに対して、その時点で、市販の架橋デキストラン粒子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））である比較用Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）１は約８．００×１０５に達し、もう一つの比較例であるＣｙｔｏｄｅｘ（商標）３（三角形）、つまりゼラチンコーティングを有する市販の架橋デキストラン粒子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））は１．００×１０６に僅かに及ばない。このように、図１は本発明のマイクロキャリアが市販のマイクロキャリアよりも基本的に高い細胞数をもたらし、生産性を高めることを明瞭に示している。
【００５１】
図２は実施例２に記載の本発明のマイクロキャリアでのＶｅｒｏ細胞の培養における細胞数の経時的変化を示す。図２に示すグラフは、菱形の点が実施例２記載のマイクロキャリアで得られた結果を示すこと以外は、図１と同様である。この図も、本発明のマイクロキャリアが市販の製品に比べて生産性が大幅に向上することを示している。
【実施例】
【００５２】
本発明の実施例は例示を目的としたものにすぎず、特許請求の範囲に記載された発明を限定するものではない。本明細書で引用した文献はすべて援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００５３】
実施例１
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−５０ Ｆｉｎｅのアリル化
乾燥Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−５０ Ｆｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））３２ｇをガラス容器中で３８８ｍｌの水と混合し、１時間放置して膨潤させた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−５０ Ｆｉｎｅの膨潤度は約１２ｍｌ／ｇ乾燥重量である。
【００５４】
膨潤ゲルを機械式撹拌子を備えた三口丸底フラスコに移した。攪拌しながら４４ｇのＮａ２ＳＯ４を丸底フラスコに添加した。スラリーを３０℃に加熱し、３０℃に１．５時間維持した。８０ｍｌのＮａＯＨ（５０％（ｗ／ｗ））と０．６ｇのＮａＢＨ４を添加した。スラリーを５０℃に加熱した。８０ｍｌのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を添加した。反応を５０℃で一晩続けた。
【００５５】
酢酸（６０％（ｗ／ｗ））を添加してｐＨ６．５〜７．５に中和することによって反応を停止した。ガラス濾過器でゲルを４ゲル体積の水、３ゲル体積のエタノール、最後に６ゲル体積の水で洗浄した。
【００５６】
Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ社のＡＢＵ９３ Ｔｒｉｂｕｒｅｔｔｅで常法に従って０．１Ｍ ＡｇＮＯ３を用いてアリル含量を求めた。アリル含量は１０１μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【００５７】
アリル化Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ５０ Ｆｉｎｅのアルギニンカップリング
アリル化ゲル２５０ｍｌを撹拌子を備えた三口丸底フラスコに移した。６３ｍｌの水と１０．３ｇのＮａＡｃ・３Ｈ２Ｏを添加した。持続的な黄色が得られるまで臭素水を滴下した。反応を５分間続けた。黄色味が消失するまでギ酸ナトリウムを添加することによって反応を停止した。スラリーを３０分間撹拌した。次いでゲルをガラス濾過器で乾式吸引した。
【００５８】
２５１ｍｌの水と３６．９ｇのＬ−アルギニンの溶液を入れた丸底フラスコに、ゲルを添加した。スラリーを４５℃に加熱し、ｐＨをＮａＯＨ（５０％（ｗ／ｗ））でｐＨ１１．４に調節した。３０分後及び６０分後にｐＨを測定してｐＨ１１．４に調節した。反応を４５℃で一晩続けた。
【００５９】
ガラス濾過器でゲルを１ゲル体積の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）と１ゲル体積の０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）で交互に計８サイクル洗浄した。最後に、ゲルを８ゲル体積の水で洗浄した。
【００６０】
Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ社のＡＢＵ９３ Ｔｒｉｂｕｒｅｔｔｅで常法に従って０．１Ｍ ＨＣｌを用いて塩素イオン容量を求めた。塩素イオン容量は０．５８μｍｏｌ／ｍｇ乾燥ゲルであった。
【００６１】
実施例２
アリル化Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ５０ Ｆｉｎｅのアルギニンカップリング
実施例１で得たアリル化Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ５０ Ｆｉｎｅを５０ｍｌ、１２．５ｍｌの水と２．０６ｇのＮａＡｃ・３Ｈ２Ｏ、５０ｍｌの水と７．３３ｇのＬ−アルギニンを使用した点以外は、実施例１と同様である。
【００６２】
Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ社のＡＢＵ９３ Ｔｒｉｂｕｒｅｔｔｅで常法に従って０．１Ｍ ＨＣｌを用いて塩素イオン容量を求めた。塩素イオン容量は０．５８μｍｏｌ／ｍｇ乾燥ゲルであった。
【００６３】
実施例３
３．１：各種培養系でのＶｅｒｏ細胞の培養
様々なタイプのマイクロキャリア（Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）担体）を以下に述べる通り同じように作製した。これらの条件下、集密層は約１×１０５細胞／ｃｍ２を意味し、播種用に長期間培養したときの臨界細胞数は１〜２×１０４細胞／ｃｍ２である。これらはＴ型フラスコについてのものである。
【００６４】
操作はすべてパイロジェンフリーの材料を用いて、無菌条件下のフード下で行った。培地は常に３７℃、ｐＨ約７．２に保った。
【００６５】
３．１．１：Ｔ型フラスコ中でのＶｅｒｏ細胞の培養
Ｔ型フラスコ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）ΔＳｕｒｆａｃｅ；Ｎｕｎｃ社製）中のＶｅｒｏ細胞単層の場合、トリプシン又はキレート剤であるエチレンジアミン四酢酸を用いて細胞を剥離させた。
【００６６】
まず上清を廃液瓶に捨て、細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）で１回洗浄した。次に、以下の表１に記載の通りトリプシン／ＥＤＴＡをＴ型フラスコに添加して細胞層全体に分布させた。
【００６７】
【表１】
室温で数分間インキュベートした後、Ｔ型フラスコを叩いて細胞を剥離させ、その直後に、トリプシン阻害剤を表１に記載の通り添加した。次に、馴化培地を添加した（表１参照）。次いで細胞を分割比で分けた。Ｖｅｒｏ細胞を１：３の比（培養表面に基づく所要体積で計算）で毎週２回継代した。
【００６８】
細胞を９％（ｖ／ｖ）ＣＯ２及び３７℃の加湿雰囲気のインキュベータ内で培養した。
【００６９】
３．１．２：ローラーボトル中でのＶｅｒｏ細胞の培養
８５０ｃｍ２ローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の播種には１７５ｃｍ２ Ｔ型フラスコ中の集密培養を使用した。細胞は上記３．１．１に記載の通り剥離させた。細胞を２００ｍｌの馴化培地に再懸濁し、ローラーボトルに移した。ローラーを１２０ｍｌ滅菌ＣＯ２と共に通気し、０．２ｒｐｍのローラー装置で３７℃で培養した。
【００７０】
ローラー培養からの細胞を剥離するときの手順は同様である。上清を廃液瓶に捨て、細胞層をＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）で１回洗浄した。このＰＢＳも廃液瓶に捨て、表２記載の体積のトリプシン／ＥＤＴＡを添加した。
【００７１】
【表２】
室温で数分間インキュベートした後、ローラーを叩いて細胞を剥がし、阻害剤を表２に記載の通り添加した。細胞を馴化培地に再懸濁した（表２参照）。次いで細胞浮遊液を幾つかのローラーに分注し、培地で２００ｍｌまで希釈し、各ローラーに１２０ｍｌの滅菌ＣＯ２を添加した。細胞は３７℃、回転速度０．２ｒｐｍで培養した。
【００７２】
３．１．３：ＥＤＴＡによるＶｅｒｏ細胞の剥離
マイクロキャリア培養の播種には細胞をＥＤＴＡ法で表面から剥離すべきである。
【００７３】
０．０２％（ｗ／ｗ）ＥＤＴＡ溶液は０．１６％（ｗ／ｗ）原液から滅菌ＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）に希釈し、水浴中で３７℃に加温した。集密細胞層の上清を捨て、細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）で１回洗浄した。細胞を表３に示すように３．１．１及び３．１．２に記載の通り剥離させた。
【００７４】
【表３】
ＥＤＴＡは培地の二価イオンと錯形成するので、阻害剤を添加する必要はない。表１又は表３に記載の通り同量の培地を添加した。
【００７５】
次いで細胞浮遊液を幾つかの容器に分注し、３．１．１及び３．１．２に記載の通り培養した。
【００７６】
３．２：スピナーフラスコ中のマイクロキャリアでのＶｅｒｏ細胞の培養
操作はすべて無菌でパイロジェンフリーの条件下のフード内で行った。
【００７７】
３．２．１：撹拌培養用マイクロキャリアの平衡化及び投与量
少なくとも式１の体積のマイクロキャリアを５０ｍｌ試験管に入れた。キャリアを沈降させた後、ＰＢＳを除去して、同量の培地で置き換えた。キャリアを再懸濁して沈降させた後、培地も除去した。この手順を４回繰り返した。最終的に、ＰＢＳについての希釈係数は１０よりも高くすべきである。
【００７８】
【数１】
最後の洗浄段階及びキャリア沈降の後、培地をピペットで吸い取って最終体積の５０％が沈降マイクロキャリアとなるようにした。この懸濁液から、式２に示す体積をスピナーに移した。
【００７９】
【数２】
培地とキャリアの入ったスピナーをインキュベータ（３７℃、９％（ｖ／ｖ）ＣＯ２）内で一晩平衡化した。
【００８０】
３．２．２：撹拌培養の播種
細胞は３．１．１及び３．１．２に記載の１７５ｃｍ２ Ｔ型フラスコ又は８５０ｃｍ２ ローラーボトルのいずれかで培養した。細胞はＥＤＴＡ法（３．１．３参照）でローラーから剥離させた。様々な培養フラスコから細胞をプールし、播種作業中３７℃に保った。実験でのフラスコの数は式３で計算した。
【００８１】
【数３】
全細胞濃度及び生存率はトリパンブルー染色法で推計した。
【００８２】
スピナー当たりの播種体積は式４で計算した。
【００８３】
【数４】
すべての実験で４０ｍｌの最終培養体積を選択したが、これはスピナー当たり気体雰囲気約２００ｍｌのヘッドスペースを意味する（１２５ｍｌフラスコ；Ｔｅｃｈｎｅ社製）。
【００８４】
播種のため、スピナーを慎重に円形に動かし、クラッパに磁気撹拌子を固定した。種細胞をキャリア懸濁液に２０秒以内で滴下した。この作業後、培養液を０ｒｐｍで２５分間及び３５ｒｐｍで５分間という間欠的撹拌プロフィルによって、３７℃で６時間スピナープラットホーム（Ｃｅｌｌｓｐｉｎ；Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上で混合した。その後、培養液を新鮮な培地で４０ｍｌまで希釈して３５ｒｐｍでの連続撹拌を開始した。この時点で、第１の試料を採取した（３．２．３参照）。サンプリングは２４時間ごとに行った。
【００８５】
４８時間後、２０ｍｌの培地を交換し、各スピナーに混合気体（７５％Ｎ２、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２；スピナー当たりの気体交換量７５０ｍｌ；Ｌｉｎｄｅ社製）を通気した。この瞬間から、２４時間ごとに培地交換と通気を行った。
【００８６】
３．２．３：スピナー培養液のサンプリング
３．２．３．１：細胞濃度の推計）
ルーチンサンプリングのため、放出された核の計数による細胞濃度を用いた。この方法ではマイクロキャアで増殖した細胞を低張液中でインキュベートし、溶解によって放出された核をこの溶液（マイクロキャリア細胞培養液；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製；２０００）中のクリスタルバイオレットで染色した。
【００８７】
スピナー培養液から１．５ｍｌの均質試料を採取した。この試料の１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、キャリアを重力で沈降させた。全試料体積（１．５ｍｌ）の０．５ｍｌは写真用であった（３．２．３．２参照）。その後、上清をピペットで吸引した。推定細胞濃度に応じて、クリスタルバイオレット溶液０．５ｍｌ又は１．０ｍｌ（３．３．１参照）をチューブに入れ、試料をボルテックスして混合した。この試料を時々ボルテックスしながら、３７℃で１時間インキュベートした。
【００８８】
インキュベーション終了後、放出された核を血球計算盤でカウントし、細胞濃度を計算した（式５）。
【００８９】
これらの試料は４℃で１週間安定であった。
【００９０】
【数５】
３．２．３．２：マイクロキャリア培養液の写真撮影
３．２．３．１に記載の通りサンプリングを行い、試料の０．５ｍｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。キャリアを重力で沈降させた後、上清を吸引し、ヘマトキシリン溶液０．２５ｍｌ（３．３．２参照）をキャリアに加えて慎重に混合した。チューブを室温で数時間（２時間以上、好ましくは一晩）インキュベートした。顕微鏡観察のため、各３０μｌの試料を９６ウェルプレート（カタログ番号：２６９６２０；Ｎｕｎｃ社製）のウェルに移し、顕微鏡のデジタルカメラで写真撮影した。
【００９１】
３．３：溶液
３．３．１：放出された核の計数用クリスタルバイオレット溶液
【００９２】
【表４】
溶液は濾紙で濾過し、４℃で保存した。
【００９３】
３．３．２：ヘマトキシリンによるマイクロキャリアの染色
【００９４】
【表５】
室温で９００ｍｌの逆浸透水に溶解し、室温で一晩撹拌した。撹拌後、以下の物質を溶液に加えた。
【００９５】
【表６】
溶液を逆浸透水で１０００ｍｌに調整し、濾紙で濾過した。溶液は６℃で保存したが、２年以内に使用すべきである。
【００９６】
３．３．３：細胞剥離用トリプシン溶液
【００９７】
【表７】
ＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）に溶解し、０．２μｍフィルターで濾過して滅菌した。溶液は４℃又は−２０℃のいずれかで保存した。
【００９８】
３．３．４：細胞剥離用トリプシン阻害剤
【００９９】
【表８】
ＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）に溶解し、０．２μｍフィルターで濾過して滅菌した。溶液は４℃又は−２０℃のいずれかで保存した。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】実施例１に記載の本発明に係るマイクロキャリアでのＶｅｒｏ細胞の培養における細胞数の経時的変化を示す図。
【図２】実施例２に記載の本発明に係るマイクロキャリアでのＶｅｒｏ細胞の培養における細胞数の経時的変化を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養時に細胞を付着及び維持することができるマイクロキャリアの分野に関する。具体的には、本発明は、細胞の付着を促進する化合物でコートされた多孔質基材からなるマイクロキャリアに関する。本発明は、かかるマイクロキャリアの製造法並びに細胞培養法も包含する。
【背景技術】
【０００２】
生体細胞の増殖を促進させるためのマイクロキャリア担体の使用は、変化に富んだ長い歴史をもつ。使用可能な量の細胞増殖を達成するための初期の系としては、シャーレ及びフラスコが挙げられる。培養表面積の増大によって単位装置容積当たりの細胞生産量を増加させる努力は大型トレイの使用に結実した。こうした初期の細胞増殖系の幾つかは、病院や大学などにおける小規模な労働集約性の高い細胞培養法で足りる用途には依然使用されている。
【０００３】
しかし、大規模プロセスに関しては代替法が必要とされる。一般的な細胞培養法はローラーボトル系である。基本的に、ローラーボトルは少量の栄養培地を収容すべく構成された円筒形容器である。動作中、ローラーボトルはその縦軸を中心にゆっくりと回転してボトルの内面全体が絶えず栄養培地で濡れるようにし、そこで細胞増殖が達成される。かかる複数のローラーボトルはローラーラックで作動できる。
【０００４】
もう一つの一般的方法はマイクロキャリア系である。最近、メンブラン系のような他の技術も導入されているが、マイクロキャリア系は依然として足場依存性細胞の増殖を経済的に有益な生産速度で達成できる細胞培養法として最も広く使用されていると思われる。このようにして大量培養を達成することは、ローラーボトルその他の公知の系のように繰返しによるものよりも優れている。さらに、マイクロキャリアバイオリアクター系は足場依存性細胞の自動化大量培養に十分適している。
【０００５】
マイクロキャリアの開発が始まったのは、懸濁培養での足場依存性細胞の増殖にデキストランビーズを基材として使用できることが実証された１９６０年代後半である。当初のマイクロキャリアはジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）のようなありふれた陽イオン型強塩基イオン交換基の使用に基づくものであった。爾来、ガラス、ポリスチレンプラスチック、アクリルアミド、固形コラーゲン、多孔質コラーゲン、セルロース及び液体フルオロカーボンを始めとする多種多様な材料がマイクロキャリアとして成功裏に使用されている。
【０００６】
表面に１以上の接着性ペプチドが共有結合又は非共有結合で結合したマイクロキャリアも提案されている。例えば、米国特許第４５７８０７９号（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）には、基材に固定化したときに細胞の付着を促進する組成物の例が開示されている。開示された組成物はフィブロネクチンタンパク質の小断片であり、具体的にはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列が１個以上の他のアミノ酸に結合したポリペプチド断片である。したがって、開示されたテトラペプチド組成物はフィブロネクチンと実質的に同じ細胞付着活性を有し、その活性は生体分子特異的な親和性相互作用に基づく。この組成物の明らかな短所はそれが生理活性物質であることであり、これは、例えばプロセス流への浸出のためその存在が医薬品や診断薬産業のような用途には不都合な場合があることを意味する。米国特許第４５７８０７９号の特許請求の範囲に記載された断片は、明細書によれば、細胞付着活性を示す従前の断片よりも小さなペプチドを選択的に合成すべく設計された実験で同定されたものである。米国特許第４５７８０７９号には、活性を示す最小断片がこの方法で決定できたと記載されている。さらに、上述の米国特許第４５７８０７９号の継続出願である米国特許第６１８０６１０号には、テトラペプチドが決定基ではあるが、ポリペプチドの至適サイズは上記テトラペプチドを含んだヘキサペプチド程度であると結論付けられている。
【０００７】
クロマトグラフィーなどにおいて、所望の標的分子と相互作用する基を与えるのに単一のアミノ酸を使用できることも知られている。例えば、弱陰イオン交換体Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））は、アミノ酸Ａｒｇが主にそのα−アミノ基を介して粒状アガロースマトリックスに結合したものからなる。このように、Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）はクロマトグラフィーゲルとして市販されており、その平均粒径は概してマイクロキャリアに必要な粒径よりも格段に小さい。
【０００８】
マイクロキャリアの細胞付着特性を促進する他のコーティングも提案されている。具体例はＣｙｔｏｄｅｘ（商標）１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））であり、細胞を静電的に結合することが知られているポリカチオン性コーティングであるジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）セルロースで架橋デキストラン基材をコートしたものからなる。しかし、細胞の付着及び増殖特性は、平板効率の低い細胞や分化又は感受性細胞型など、あらゆる細胞型に最適なわけではない。そこで、別のタイプの改良マイクロキャリアの必要性が依然として存在する。
【０００９】
細胞付着特性をさらに向上させるため、一段と複雑な化合物でコートされたマイクロキャリアが提案されている。具体例はＣｙｔｏｄｅｘ（商標）３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））であって、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）１と同様に架橋デキストラン基材からなるが、酸変性ブタコラーゲンの層でコートしたものである。しかし、哺乳類由来のコラーゲンのため用途によってはＣｙｔｏｄｅｘ（商標）３の使用が制限されかねない。
【００１０】
米国特許第６２１４６１８号は細胞培養用のマイクロキャリアビーズの分野に関するものであり、具体的には、かかる製品で動物タンパク質を避けるといういう課題に関する。提案された解決策は、表面にトリメチルアミンを有するスチレンコポリマーからなるマイクロキャリアビーズであり、ビーズを細胞培養に適したものとするため酸性溶液中で洗浄したものである。
【００１１】
米国特許第６３７８５２７号（Ｃｈｏｎｄｒｏｓ社）は、軟骨修復のため患者から軟骨細胞を採取し、迅速に増殖させ、患者に移植する外科的処置法に関する。軟骨細胞を増殖させるため、軟骨細胞を培養し、多糖類誘導体からなる足場に播種して最終的に増殖させるが、該多糖類誘導体はデキストランのような多糖類をポリアミンで架橋して得たものである。具体的には、まず多糖類を酸化してジアルデヒド誘導体とし、次いでこれを無毒性ポリアミドと反応させてイミン架橋を形成し、これをさらに水素化すれば安定なアミン結合が得られる。開示されたマイクロキャリアの利点は、軟骨細胞の増殖及びＩＩ型コラーゲンの形成が可能となることである。もう一つの利点は、生体外で利用すると、マイクロキャリアが無毒成分に分解し、その場に軟骨細胞が残って軟骨組織が形成されることである。
【特許文献１】米国特許第４５７８０７９号明細書
【特許文献２】米国特許第６１８０６１０号明細書
【特許文献３】米国特許第６２１４６１８号明細書
【特許文献４】米国特許第６３７８５２７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
細胞培養のための代替及び／又は改良マイクロキャリア並びにかかるマイクロキャリアの新規製造方法に対するニーズが依然として存在することは明らかである。また、細胞とその他の表面との相互作用を向上させるというさらに一般的なニーズも存在する。かかる表面としては、創薬スクリーニングや生理活性化合物の研究、細胞表面受容体の研究、環境汚染物質のモニタリングのような様々な用途に用いられる分析表面が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一態様は、細胞の付着及び細胞培養が可能な新規マイクロキャリアを提供することである。これは、本発明では、陽イオン化合物をグアニジン基を介して表面に固定化したマイクロキャリアによって達成でき、例えば電荷に基づく相互作用による。
【００１４】
本発明の別の態様は、細胞の付着及び培養のためのマイクロキャリアであって、哺乳類由来の生成物を全く含んでいないものを提供することである。
【００１５】
本発明の別の態様は、細胞の付着及び培養のためのマイクロキャリアであって、毒性及び夾雑物の制御が容易なものを提供することである。
【００１６】
本発明の追加の態様は、細胞付着及び細胞培養が可能な新規ポリカチオン性マイクロキャリアの製造方法を提供することである。これは、本発明では、１個以上のグアニジン基を含む化合物をエポキシド活性化基材表面に接触させて基材表面に固定化する方法によって達成できる。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、生存能をもたらす環境中で陽イオン化合物でコートされた１個以上のマイクロキャリアの表面で細胞を培養する細胞培養法であって、上記細胞が陽イオン性コーティングで与えられるグアニジン基を介してマイクロキャリアに付着している、方法を提供する。
【００１８】
本発明のその他の態様及び利点は以下の詳細な記載から明らかとなろう。
【００１９】
定義
「マイクロキャリア」という用語は、本明細書では、細胞培養を支持するために使用される粒状材料に関する従来通りの意味で用いられる。例えば、本願において「マイクロキャリア」という用語は、細胞付着を可能にする化合物を固定化した基材に対して用いられる。
【００２０】
「ポリカチオン性」マイクロキャリアという用語は、マイクロキャリア表面の正味電荷が正であることを意味する。
【００２１】
「基材」という用語は、キャリアのコア部、つまり、細胞を付着させることのできる材料を意味する。
【００２２】
基材の「表面」という用語には、基材の外表面並びに多孔質の場合は細孔表面が包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の第一の態様は、陽イオン化合物がグアニジン基を介して表面に固定化されているマイクロキャリアに関する。本発明では、「化合物」という用語は、１分子ではなく、ある量の化合物がマイクロキャリアの表面に固定化されていることを意味する。このように複数の化合物分子が（好ましくはコーティングとして）各マイクロキャリアに固定化されているので、各マイクロキャリアは正の正味電荷を呈し、そのため「ポリカチオン性」と呼ぶことができる。
【００２４】
一実施形態では、本発明のマイクロキャリアは、陽イオン化合物と細胞との電荷に基づく相互作用によって細胞を付着させることができる。これに関して、「付着」という用語は、細胞が生存できるように十分に定着することを意味する。一実施形態では、陽イオン化合物はタンパク質、好ましくはトリプトファン側鎖と相互作用する。別の実施形態では、相互作用は上述の相互作用が複合したものである。
【００２５】
グラフトによって基材表面に固定化されてコーティングを与える本発明の陽イオン化合物は基本的に非反応性である。これは、実際に細胞を付着させるように作用するが、他の化学種との反応には実質的に関与しないことを意味する。さらに、本発明の化合物は付着細胞にも環境中の他の生体物質にも悪影響をもたないという点で生体適合性である。したがって、この化合物は無毒である。本発明では、細胞の定着としても知られる細胞の「付着」は細胞が培養に十分な程度に強く結合していることを意味する。
【００２６】
周知の通り、細胞は一般に高ｐＨ環境では生存できない。そこで、一実施形態では、本発明のマイクロキャリアはｐＨ７付近の表面を呈する。特定の実施形態では、固定化された陽イオン化合物は基材表面に弱塩基性コーティングを形成する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、固定化化合物は１個以上のアミノ酸を含む。好適な実施形態では、上記化合物に含まれるアミノ酸は、電荷を変化させることができず、しかも自己触媒作用による酸含有基とのアミド結合形成を起こさないことを特徴とする。特定の実施形態では、アミノ酸のアミノ基は反応性であり、カルバメート形成によって電荷を変化させることができる。
【００２８】
一実施形態では、固定化化合物はリジン（Ｌｙｓ）以外の任意のアミノ酸を１個含む。上述のマイクロキャリア表面の弱塩基性コーティングを得るため、化合物は１個以上の塩基性アミノ酸を含んでいてもよい。そこで、好適な実施形態では、化合物はアルギニン（Ａｒｇ）である。本実施形態で得られるマイクロキャリアはＡｒｇの酸性カルボキシレート基のため表面ｐＨが低く、上述の市販ＤＥＡＥコートマイクロキャリアよりも細胞培養に適したｐＨを有する。特定の実施形態は、アルギニン系化合物、好ましくは緩衝性酸性基が結合したアルギニンを固定化したマイクロキャリアである。かかる化合物は一般式Ａｒｇ−Ｘで定義される。式中、Ｘは緩衝性酸性基である。さらに別の実施形態では、化合物は２種以上の異なるアミノ酸からなり、その結果、２種以上の異なるリガンドが基材表面に固定化される。例えば、化合物はアルギニンとアスパラギン酸の混合物からなるものでよい。
【００２９】
別の実施形態では、固定化化合物はジペプチドであるか、或いはジペプチドを含むものである。例えば、一実施形態では、ジペプチドはアルギニン−グルタミン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｕ）又はアルギニン−アスパラギン酸（Ａｒｇ−Ａｓｐ）である。ただし、マイクロキャリアへの細胞付着及び増殖に必要とされる本明細書記載の特性が得られる限り、その他のジペプチドも想定される。特定の実施形態では、緩衝基のような１個以上の別の基をジペプチドに結合させることもできる。
【００３０】
以上要するに、一実施形態では、固定化化合物はＡｒｇのような単一のアミノ酸、ＡｒｇとＡｓｐのような２種類のアミノ酸の混合物、或いはＡｒｇ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ａｓｐ又はＡｒｇ−Ａｒｇのようなジペプチドからなる群から選択される。最良の実施形態では、固定化化合物はＡｒｇのような単一のアミノ酸、及びＡｒｇ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ａｓｐ又はＡｒｇ−Ａｒｇのようなジペプチドからなる群から選択される。
【００３１】
本発明で使用されるアミノ酸及びジペプチドは、Ｍｅｒｃｋ社のような販売元から好適に入手される（アルギニン：Ｍｅｒｃｋ社参照番号７９７；Ａｒｇ−Ｇｌｕ：Ｍｅｒｃｋ社参照番号７９８）。或いは、固相合成法のような周知の組換え又は化学的技術を用いて当業者が容易に調製できる。手短に説明すると、固相合成法は、保護α−アミノ酸を適当な樹脂に結合することによってペプチドのＣ末端から開始される（例えば、米国特許第４２４４９４６号参照）。
【００３２】
このように、本発明のマイクロキャリアの基材に固定化された化合物はアミノ酸１個程度の大きさ、或いはジペプチドを形成するアミノ酸２個程度の大きさである。上掲の米国特許第４５７８０７９号（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）のフィブロネクチンの最小限の断片はテトラペプチドとすべきであり、好ましくはヘキサペプチドであるという結論に照らして、本発明の知見が予測できないことは明らかである。
【００３３】
さらに、本発明のマイクロキャリアに対する細胞付着は明らかに電荷相互作用に基づくものであり、化合物は負に荷電した細胞が付着できるように正に荷電している。この点で、フィブロネクチンと実質的に同じ生体分子特異的親和性に基づく細胞付着活性をもつと記載された上掲の米国特許第４５７８０７９号記載のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐのようなフィブロネクチン断片とは異なる。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、固定化化合物はプリン又はプリン混合物を含む。特定の実施形態では、プリンはアデニン又はグアニンである。そこで、化合物はヌクレオチド又はヌクレオチド関連化合物を含んでいてもよい。
【００３５】
各グアニジン基は細胞の結合に役立つ作用をもつので、基材表面に固定化された化合物はリガンドとみなすことができ、その官能基はグアニジン基である。マイクロキャリアの特定の実施形態では、リガンド濃度は０．１〜３．０μｍｏｌ／ｍｇ乾燥マイクロキャリアの範囲内にある。例示的な実施形態では、リガンド濃度は例えば０．２、０．４、０．７、１．２、２．５又は３．０μｍｏｌ／ｍｇ乾燥マイクロキャリアである。固定化化合物がＡｒｇである特定の実施形態では、リガンド濃度は約０．７μｍｏｌ／ｍｇ乾燥マイクロキャリアである。固定化化合物がジペプチドである別の実施形態では、リガンド濃度は略同程度である。本発明のマイクロキャリアの例示的な重量密度は１．０２〜１．０５ｇ／ｃｍ３の範囲内にあるが、用途によってはこれよりも軽い又は重い材料が適していることもある。
【００３６】
好適な実施形態では、本発明のマイクロキャリアの基材は架橋炭水化物であるか、或いはかかる炭水化物から本質的になる。特定の実施形態では、マイクロキャリアは、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラゲナン、ジェラン及びアルギネートからなる群から選択される材料で作られる。そこで、好適な実施形態では、本発明のマイクロキャリアはゲルである。最も好適な実施形態では、マイクロキャリアは、最大限に栄養分を利用できるようにしながら、ビーズ内への細胞増殖を促す多孔質構造を呈する。
【００３７】
本発明のマイクロキャリア材料は逆相懸濁ゲル化のような常法で容易に製造できる（Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ： Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３−３９８（１９６４））。別法では、ベースマトリックスはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））のような市販品である。概して本発明のマイクロキャリアは４０〜３００μｍの平均粒径を呈し、例えば約２３０μｍのように１００〜２５０μｍなどである（０．９％ＮａＣｌ中）。最も好ましい実施形態では、本発明のマイクロキャリアは約１７０μｍ以上である（０．９％ＮａＣｌ中）。
【００３８】
別の実施形態では、本発明のマイクロキャリアは、例えばスチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどの架橋合成ポリマーからなり、化合物の最適な固定化（つまりリガンドの結合）及び細胞培養が実施できるように、それ自体を変性させてもよい。
【００３９】
本発明のマイクロキャリアの最も好適な実施形態では、化合物は第二級アミンを介して基材表面に固定化される。本発明のマイクロキャリアの製造に用いられる方法の詳細については、以下の本発明の第二の態様において説明する。
【００４０】
本発明には、細胞培養のための上記マイクロキャリアの使用も包含される。そこで、本発明の一態様は前述の請求項のいずれか１項に記載されたマイクロキャリア１個以上からなる細胞培養担体である。
【００４１】
本発明の第二の態様は、１個以上のグアニジン基を含む化合物をエポキシド活性化基材表面に接触させて上記化合物を固定化することによるマイクロキャリアの製造方法に関する。エポキシド活性化は、ｐＨ９のような塩基性触媒によるものでも、酸性触媒によるものでもよい。この分野では、基材のエポキシド活性化は周知であり、常用されている固定化技術である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ他によるＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｇｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ａ． Ｋｒｉｓｈｎａ Ｍａｌｌｉａ及びＰａｕｌ Ｋ． Ｓｍｉｔｈ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＩＮＣ， １９９２参照。固定化は最も好適にはｐＨ制御した溶液中で実施される。本発明の方法を用いて製造されたマイクロキャリアの詳細については、本発明の第一の態様に関する上述の記載に見いだすことができよう。
【００４２】
基材は、架橋多糖類からなる基本的に球状の多孔質ビーズなど、上述のマイクロキャリア材料のいずれでもよい。上述のエポキシド活性化の前段階では、炭水化物基材を例えば以下の実施例に記載のようにしてアリル化する。対照的に、基材が合成ポリマーからなるときは、概してアリル基は既に存在しているので、アリル化段階は必要とされない。
【００４３】
固定化された化合物についても本発明の第一の態様において説明した。一実施形態では、固定化化合物はＡｒｇのような単一のアミノ酸、ＡｒｇとＡｓｐのような２種類のアミノ酸の混合物、或いはＡｒｇ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ａｓｐ又はＡｒｇ−Ａｒｇのようなジペプチドからなる群から選択される。最良の実施形態では、固定化化合物はＡｒｇのような単一のアミノ酸、及びＡｒｇ−Ｇｌｕ、Ａｒｇ−Ａｓｐ又はＡｒｇ−Ａｒｇのようなジペプチドからなる群から選択される。
【００４４】
化合物がジペプチドである場合、カップリングは２種類のアミノ酸を含む溶液からのグラフト反応、つまり最初のアミノ酸と２番目のアミノ酸の段階的カップリングでよい。この種の担体表面に化合物を固定化する方法は当業者に周知である。
【００４５】
本発明の第三の態様は、表面に細胞を付着させる方法であって、１個以上のグアニジン基を含む陽イオン化合物を使用して上記表面に細胞を付着させる方法に関する。一実施形態では、付着は電荷に基づく相互作用をよる。最も好ましい実施形態では、化合物はアルギニン（Ａｒｇ）である。表面は、例えばマイクロキャリア、メンブラン、布、マイクロチップのようなチップ、マイクロキャピラリのようなキャピラリー又は容器の表面でよい。特定の実施形態では、本発明の表面は、細胞付着後に様々な用途に使用できる布の表面である。本発明の方法は、例えば分析目的、生産プロセス、及び／又は火傷の治療用組織で例示されるような医療用途に有用である。
【００４６】
さらに、本発明は、上述の本発明の第三の態様に関して説明した方法を含むハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のための細胞局在化法に関する。
【００４７】
本発明の第四の態様は、生存能をもたらす環境中で陽イオン化合物でコートされた１個以上のマイクロキャリアの表面で細胞を培養する細胞培養方法であって、上記細胞が陽イオン性コーティングで与えられるグアニジン基を介してマイクロキャリアに付着している方法に関する。一実施形態では、細胞の付着は電荷に基づく相互作用によるものである。最も好適な実施形態では、マイクロキャリアは上述の通りである。これに関して、生存能もたらすという用語が各細胞型について適当な温度、栄養分の供給その他のパラメータを維持することを意味していることは当業者には自明であろう。したがって、細胞が付着したマイクロキャリアは、好ましくは温度制御し、撹拌しながら、適当な容器中で溶解又は懸濁状態に維持される。本発明で培養される細胞は真核細胞でも原核細胞でもよいが、好ましくは、例えば組換え細胞系のような哺乳類細胞、植物細胞などの真核細胞である。一実施形態では、細胞は、初代培養細胞や類上皮形態の細胞のような真の足場依存性細胞である。特に好適な実施形態では、細胞は平板効率の低い細胞、或いは肝細胞や内分泌細胞のような分化又は感受性細胞型である。以下の実施例では、本発明のこの態様をＶｅｒｏ細胞として知られる線維芽細胞系を用いて例示するが、これはアフリカミドリザル腎臓由来の完全に足場依存性の線維芽細胞である。
【００４８】
一実施形態では、本発明の方法はマイクロキャリアから生存細胞を回収する追加段階を含む。一実施形態では、後段で、培養細胞を分析及び／又は医療目的に用いる。別の実施形態では、後段で、培養細胞をウイルス、細菌、カビ、真菌、藻類の培養の支持に使用する。この実施形態はワクチンの製造その他の用途に関連したプロセスで有益である。
【００４９】
最後に、本発明は魚由来のゼラチンを表面に固定化したマイクロキャリアに関する。ゼラチンは物質の複雑な混合物であるが、そのタンパク質は大量の陽イオン性ペプチド及び若干のタンパク質を有していると考えられる。魚ゼラチンを固定化する基材は、上述の本発明の第一の態様に関して挙げたもののいずれでもよい。かかるマイクロキャリアには哺乳類タンパク質が存在しないので、本発明のこの態様は市販のＣｙｔｏｄｅｘ（商標）３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））マイクロキャリアから見ると有利である。さらに、ゼラチンは細胞の増殖を促進する増殖因子を与える可能性があるし、マイクロキャリアが互いに又は培養容器表面と衝突したときに付着細胞を機械的に保護する可能性がある。
【００５０】
図面の詳細な説明
図１は実施例１に記載の本発明のマイクロキャリアでのＶｅｒｏ細胞の培養における細胞数の経時的変化を示す。図１では、細胞数（細胞数／ｍｌ懸濁液）をＹ軸に示し、時間をＸ軸に示す。約１６８時間で、本発明を用いた培養例を示す一番上の線（菱形）は約１．４０×１０６に達するのに対して、その時点で、市販の架橋デキストラン粒子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））である比較用Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）１は約８．００×１０５に達し、もう一つの比較例であるＣｙｔｏｄｅｘ（商標）３（三角形）、つまりゼラチンコーティングを有する市販の架橋デキストラン粒子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））は１．００×１０６に僅かに及ばない。このように、図１は本発明のマイクロキャリアが市販のマイクロキャリアよりも基本的に高い細胞数をもたらし、生産性を高めることを明瞭に示している。
【００５１】
図２は実施例２に記載の本発明のマイクロキャリアでのＶｅｒｏ細胞の培養における細胞数の経時的変化を示す。図２に示すグラフは、菱形の点が実施例２記載のマイクロキャリアで得られた結果を示すこと以外は、図１と同様である。この図も、本発明のマイクロキャリアが市販の製品に比べて生産性が大幅に向上することを示している。
【実施例】
【００５２】
本発明の実施例は例示を目的としたものにすぎず、特許請求の範囲に記載された発明を限定するものではない。本明細書で引用した文献はすべて援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００５３】
実施例１
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−５０ Ｆｉｎｅのアリル化
乾燥Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−５０ Ｆｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））３２ｇをガラス容器中で３８８ｍｌの水と混合し、１時間放置して膨潤させた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−５０ Ｆｉｎｅの膨潤度は約１２ｍｌ／ｇ乾燥重量である。
【００５４】
膨潤ゲルを機械式撹拌子を備えた三口丸底フラスコに移した。攪拌しながら４４ｇのＮａ２ＳＯ４を丸底フラスコに添加した。スラリーを３０℃に加熱し、３０℃に１．５時間維持した。８０ｍｌのＮａＯＨ（５０％（ｗ／ｗ））と０．６ｇのＮａＢＨ４を添加した。スラリーを５０℃に加熱した。８０ｍｌのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を添加した。反応を５０℃で一晩続けた。
【００５５】
酢酸（６０％（ｗ／ｗ））を添加してｐＨ６．５〜７．５に中和することによって反応を停止した。ガラス濾過器でゲルを４ゲル体積の水、３ゲル体積のエタノール、最後に６ゲル体積の水で洗浄した。
【００５６】
Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ社のＡＢＵ９３ Ｔｒｉｂｕｒｅｔｔｅで常法に従って０．１Ｍ ＡｇＮＯ３を用いてアリル含量を求めた。アリル含量は１０１μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【００５７】
アリル化Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ５０ Ｆｉｎｅのアルギニンカップリング
アリル化ゲル２５０ｍｌを撹拌子を備えた三口丸底フラスコに移した。６３ｍｌの水と１０．３ｇのＮａＡｃ・３Ｈ２Ｏを添加した。持続的な黄色が得られるまで臭素水を滴下した。反応を５分間続けた。黄色味が消失するまでギ酸ナトリウムを添加することによって反応を停止した。スラリーを３０分間撹拌した。次いでゲルをガラス濾過器で乾式吸引した。
【００５８】
２５１ｍｌの水と３６．９ｇのＬ−アルギニンの溶液を入れた丸底フラスコに、ゲルを添加した。スラリーを４５℃に加熱し、ｐＨをＮａＯＨ（５０％（ｗ／ｗ））でｐＨ１１．４に調節した。３０分後及び６０分後にｐＨを測定してｐＨ１１．４に調節した。反応を４５℃で一晩続けた。
【００５９】
ガラス濾過器でゲルを１ゲル体積の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）と１ゲル体積の０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）で交互に計８サイクル洗浄した。最後に、ゲルを８ゲル体積の水で洗浄した。
【００６０】
Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ社のＡＢＵ９３ Ｔｒｉｂｕｒｅｔｔｅで常法に従って０．１Ｍ ＨＣｌを用いて塩素イオン容量を求めた。塩素イオン容量は０．５８μｍｏｌ／ｍｇ乾燥ゲルであった。
【００６１】
実施例２
アリル化Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ５０ Ｆｉｎｅのアルギニンカップリング
実施例１で得たアリル化Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ５０ Ｆｉｎｅを５０ｍｌ、１２．５ｍｌの水と２．０６ｇのＮａＡｃ・３Ｈ２Ｏ、５０ｍｌの水と７．３３ｇのＬ−アルギニンを使用した点以外は、実施例１と同様である。
【００６２】
Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ社のＡＢＵ９３ Ｔｒｉｂｕｒｅｔｔｅで常法に従って０．１Ｍ ＨＣｌを用いて塩素イオン容量を求めた。塩素イオン容量は０．５８μｍｏｌ／ｍｇ乾燥ゲルであった。
【００６３】
実施例３
３．１：各種培養系でのＶｅｒｏ細胞の培養
様々なタイプのマイクロキャリア（Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）担体）を以下に述べる通り同じように作製した。これらの条件下、集密層は約１×１０５細胞／ｃｍ２を意味し、播種用に長期間培養したときの臨界細胞数は１〜２×１０４細胞／ｃｍ２である。これらはＴ型フラスコについてのものである。
【００６４】
操作はすべてパイロジェンフリーの材料を用いて、無菌条件下のフード下で行った。培地は常に３７℃、ｐＨ約７．２に保った。
【００６５】
３．１．１：Ｔ型フラスコ中でのＶｅｒｏ細胞の培養
Ｔ型フラスコ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）ΔＳｕｒｆａｃｅ；Ｎｕｎｃ社製）中のＶｅｒｏ細胞単層の場合、トリプシン又はキレート剤であるエチレンジアミン四酢酸を用いて細胞を剥離させた。
【００６６】
まず上清を廃液瓶に捨て、細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）で１回洗浄した。次に、以下の表１に記載の通りトリプシン／ＥＤＴＡをＴ型フラスコに添加して細胞層全体に分布させた。
【００６７】
【表１】
室温で数分間インキュベートした後、Ｔ型フラスコを叩いて細胞を剥離させ、その直後に、トリプシン阻害剤を表１に記載の通り添加した。次に、馴化培地を添加した（表１参照）。次いで細胞を分割比で分けた。Ｖｅｒｏ細胞を１：３の比（培養表面に基づく所要体積で計算）で毎週２回継代した。
【００６８】
細胞を９％（ｖ／ｖ）ＣＯ２及び３７℃の加湿雰囲気のインキュベータ内で培養した。
【００６９】
３．１．２：ローラーボトル中でのＶｅｒｏ細胞の培養
８５０ｃｍ２ローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の播種には１７５ｃｍ２ Ｔ型フラスコ中の集密培養を使用した。細胞は上記３．１．１に記載の通り剥離させた。細胞を２００ｍｌの馴化培地に再懸濁し、ローラーボトルに移した。ローラーを１２０ｍｌ滅菌ＣＯ２と共に通気し、０．２ｒｐｍのローラー装置で３７℃で培養した。
【００７０】
ローラー培養からの細胞を剥離するときの手順は同様である。上清を廃液瓶に捨て、細胞層をＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）で１回洗浄した。このＰＢＳも廃液瓶に捨て、表２記載の体積のトリプシン／ＥＤＴＡを添加した。
【００７１】
【表２】
室温で数分間インキュベートした後、ローラーを叩いて細胞を剥がし、阻害剤を表２に記載の通り添加した。細胞を馴化培地に再懸濁した（表２参照）。次いで細胞浮遊液を幾つかのローラーに分注し、培地で２００ｍｌまで希釈し、各ローラーに１２０ｍｌの滅菌ＣＯ２を添加した。細胞は３７℃、回転速度０．２ｒｐｍで培養した。
【００７２】
３．１．３：ＥＤＴＡによるＶｅｒｏ細胞の剥離
マイクロキャリア培養の播種には細胞をＥＤＴＡ法で表面から剥離すべきである。
【００７３】
０．０２％（ｗ／ｗ）ＥＤＴＡ溶液は０．１６％（ｗ／ｗ）原液から滅菌ＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）に希釈し、水浴中で３７℃に加温した。集密細胞層の上清を捨て、細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）で１回洗浄した。細胞を表３に示すように３．１．１及び３．１．２に記載の通り剥離させた。
【００７４】
【表３】
ＥＤＴＡは培地の二価イオンと錯形成するので、阻害剤を添加する必要はない。表１又は表３に記載の通り同量の培地を添加した。
【００７５】
次いで細胞浮遊液を幾つかの容器に分注し、３．１．１及び３．１．２に記載の通り培養した。
【００７６】
３．２：スピナーフラスコ中のマイクロキャリアでのＶｅｒｏ細胞の培養
操作はすべて無菌でパイロジェンフリーの条件下のフード内で行った。
【００７７】
３．２．１：撹拌培養用マイクロキャリアの平衡化及び投与量
少なくとも式１の体積のマイクロキャリアを５０ｍｌ試験管に入れた。キャリアを沈降させた後、ＰＢＳを除去して、同量の培地で置き換えた。キャリアを再懸濁して沈降させた後、培地も除去した。この手順を４回繰り返した。最終的に、ＰＢＳについての希釈係数は１０よりも高くすべきである。
【００７８】
【数１】
最後の洗浄段階及びキャリア沈降の後、培地をピペットで吸い取って最終体積の５０％が沈降マイクロキャリアとなるようにした。この懸濁液から、式２に示す体積をスピナーに移した。
【００７９】
【数２】
培地とキャリアの入ったスピナーをインキュベータ（３７℃、９％（ｖ／ｖ）ＣＯ２）内で一晩平衡化した。
【００８０】
３．２．２：撹拌培養の播種
細胞は３．１．１及び３．１．２に記載の１７５ｃｍ２ Ｔ型フラスコ又は８５０ｃｍ２ ローラーボトルのいずれかで培養した。細胞はＥＤＴＡ法（３．１．３参照）でローラーから剥離させた。様々な培養フラスコから細胞をプールし、播種作業中３７℃に保った。実験でのフラスコの数は式３で計算した。
【００８１】
【数３】
全細胞濃度及び生存率はトリパンブルー染色法で推計した。
【００８２】
スピナー当たりの播種体積は式４で計算した。
【００８３】
【数４】
すべての実験で４０ｍｌの最終培養体積を選択したが、これはスピナー当たり気体雰囲気約２００ｍｌのヘッドスペースを意味する（１２５ｍｌフラスコ；Ｔｅｃｈｎｅ社製）。
【００８４】
播種のため、スピナーを慎重に円形に動かし、クラッパに磁気撹拌子を固定した。種細胞をキャリア懸濁液に２０秒以内で滴下した。この作業後、培養液を０ｒｐｍで２５分間及び３５ｒｐｍで５分間という間欠的撹拌プロフィルによって、３７℃で６時間スピナープラットホーム（Ｃｅｌｌｓｐｉｎ；Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上で混合した。その後、培養液を新鮮な培地で４０ｍｌまで希釈して３５ｒｐｍでの連続撹拌を開始した。この時点で、第１の試料を採取した（３．２．３参照）。サンプリングは２４時間ごとに行った。
【００８５】
４８時間後、２０ｍｌの培地を交換し、各スピナーに混合気体（７５％Ｎ２、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２；スピナー当たりの気体交換量７５０ｍｌ；Ｌｉｎｄｅ社製）を通気した。この瞬間から、２４時間ごとに培地交換と通気を行った。
【００８６】
３．２．３：スピナー培養液のサンプリング
３．２．３．１：細胞濃度の推計）
ルーチンサンプリングのため、放出された核の計数による細胞濃度を用いた。この方法ではマイクロキャアで増殖した細胞を低張液中でインキュベートし、溶解によって放出された核をこの溶液（マイクロキャリア細胞培養液；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製；２０００）中のクリスタルバイオレットで染色した。
【００８７】
スピナー培養液から１．５ｍｌの均質試料を採取した。この試料の１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、キャリアを重力で沈降させた。全試料体積（１．５ｍｌ）の０．５ｍｌは写真用であった（３．２．３．２参照）。その後、上清をピペットで吸引した。推定細胞濃度に応じて、クリスタルバイオレット溶液０．５ｍｌ又は１．０ｍｌ（３．３．１参照）をチューブに入れ、試料をボルテックスして混合した。この試料を時々ボルテックスしながら、３７℃で１時間インキュベートした。
【００８８】
インキュベーション終了後、放出された核を血球計算盤でカウントし、細胞濃度を計算した（式５）。
【００８９】
これらの試料は４℃で１週間安定であった。
【００９０】
【数５】
３．２．３．２：マイクロキャリア培養液の写真撮影
３．２．３．１に記載の通りサンプリングを行い、試料の０．５ｍｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。キャリアを重力で沈降させた後、上清を吸引し、ヘマトキシリン溶液０．２５ｍｌ（３．３．２参照）をキャリアに加えて慎重に混合した。チューブを室温で数時間（２時間以上、好ましくは一晩）インキュベートした。顕微鏡観察のため、各３０μｌの試料を９６ウェルプレート（カタログ番号：２６９６２０；Ｎｕｎｃ社製）のウェルに移し、顕微鏡のデジタルカメラで写真撮影した。
【００９１】
３．３：溶液
３．３．１：放出された核の計数用クリスタルバイオレット溶液
【００９２】
【表４】
溶液は濾紙で濾過し、４℃で保存した。
【００９３】
３．３．２：ヘマトキシリンによるマイクロキャリアの染色
【００９４】
【表５】
室温で９００ｍｌの逆浸透水に溶解し、室温で一晩撹拌した。撹拌後、以下の物質を溶液に加えた。
【００９５】
【表６】
溶液を逆浸透水で１０００ｍｌに調整し、濾紙で濾過した。溶液は６℃で保存したが、２年以内に使用すべきである。
【００９６】
３．３．３：細胞剥離用トリプシン溶液
【００９７】
【表７】
ＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）に溶解し、０．２μｍフィルターで濾過して滅菌した。溶液は４℃又は−２０℃のいずれかで保存した。
【００９８】
３．３．４：細胞剥離用トリプシン阻害剤
【００９９】
【表８】
ＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）に溶解し、０．２μｍフィルターで濾過して滅菌した。溶液は４℃又は−２０℃のいずれかで保存した。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】実施例１に記載の本発明に係るマイクロキャリアでのＶｅｒｏ細胞の培養における細胞数の経時的変化を示す図。
【図２】実施例２に記載の本発明に係るマイクロキャリアでのＶｅｒｏ細胞の培養における細胞数の経時的変化を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン化合物がグアニジン基を介して表面に固定化されているマイクロキャリア。
【請求項２】
陽イオン化合物と細胞との電荷に基づく相互作用によって細胞を付着させることができる、請求項１記載のマイクロキャリア。
【請求項３】
前記陽イオン化合物がマイクロキャリア表面にポリカチオン性コーティングを与える、請求項１又は請求項２記載のマイクロキャリア。
【請求項４】
前記陽イオン化合物がマイクロキャリア表面に弱塩基性コーティングを与える、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項５】
前記陽イオン化合物が１又は２個のアミノ酸を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項６】
前記陽イオン化合物がアルギニン（Ａｒｇ）からなる、請求項５記載のマイクロキャリア。
【請求項７】
前記陽イオン化合物がジペプチドからなる、請求項５記載のマイクロキャリア。
【請求項８】
前記ジペプチドがアルギニン−グルタミン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｕ）又はアルギニン−アスパラギン酸（Ａｒｇ−Ａｓｐ）である、請求項７記載のマイクロキャリア。
【請求項９】
前記陽イオン化合物が第二級アミンを介してマイクロキャリア表面に固定化されている、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項１０】
当該マイクロキャリアが架橋炭水化物からなる、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載のマイクロキャリア１個以上からなる、細胞培養担体。
【請求項１２】
１個以上のグアニジン基を含む化合物をエポキシド活性化基材表面に接触させて上記化合物をグアニジン基を介して基材表面に固定化する段階を含む、マイクロキャリアの製造方法。
【請求項１３】
前記化合物が１又は２個のアミノ酸を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物がアルギニン（Ａｒｇ）からなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物がジペプチドからなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が１個以上のヌクレオチドを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記基材が架橋炭水化物である、請求項１２乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
当該方法で製造されるマイクロキャリアが請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載されたものである、請求項１２乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
表面に細胞を付着させる方法であって、１個以上のグアニジン基を含む陽イオン化合物を使用して上記表面に細胞を付着させる方法。
【請求項２０】
前記付着が電荷に基づく相互作用によるものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記陽イオン化合物がアルギニン（Ａｒｇ）からなる、請求項１９又は請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記表面が、マイクロキャリア、メンブラン、布、スライド、チップ、キャピラリー又は容器の表面である、請求項１９乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞の付着が分析又は生産の目的で行われる、請求項１９乃至請求項２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の方法を利用する、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のための細胞局在化法。
【請求項２５】
生存能をもたらす環境中で陽イオン化合物でコートされた１個以上のマイクロキャリアの表面で細胞を培養する細胞培養方法であって、上記細胞が陽イオン性コーティングで与えられるグアニジン基を介してマイクロキャリアに付着している、方法。
【請求項２６】
前記細胞の付着が電荷に基づく相互作用によるものである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記陽イオン化合物がアルギニン（Ａｒｇ）からなる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記マイクロキャリアから生存細胞を回収する段階をさらに含む、請求項２６又は請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
分析及び／又は医療の目的で細胞を使用する段階をさらに含む、請求項２６又は請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
ウイルス、細菌、カビ、真菌又は藻類の培養の支持に使用する段階をさらに含む、請求項２５記載の方法。
【請求項１】
陽イオン化合物がグアニジン基を介して表面に固定化されているマイクロキャリア。
【請求項２】
陽イオン化合物と細胞との電荷に基づく相互作用によって細胞を付着させることができる、請求項１記載のマイクロキャリア。
【請求項３】
前記陽イオン化合物がマイクロキャリア表面にポリカチオン性コーティングを与える、請求項１又は請求項２記載のマイクロキャリア。
【請求項４】
前記陽イオン化合物がマイクロキャリア表面に弱塩基性コーティングを与える、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項５】
前記陽イオン化合物が１又は２個のアミノ酸を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項６】
前記陽イオン化合物がアルギニン（Ａｒｇ）からなる、請求項５記載のマイクロキャリア。
【請求項７】
前記陽イオン化合物がジペプチドからなる、請求項５記載のマイクロキャリア。
【請求項８】
前記ジペプチドがアルギニン−グルタミン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｕ）又はアルギニン−アスパラギン酸（Ａｒｇ−Ａｓｐ）である、請求項７記載のマイクロキャリア。
【請求項９】
前記陽イオン化合物が第二級アミンを介してマイクロキャリア表面に固定化されている、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項１０】
当該マイクロキャリアが架橋炭水化物からなる、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載のマイクロキャリア１個以上からなる、細胞培養担体。
【請求項１２】
１個以上のグアニジン基を含む化合物をエポキシド活性化基材表面に接触させて上記化合物をグアニジン基を介して基材表面に固定化する段階を含む、マイクロキャリアの製造方法。
【請求項１３】
前記化合物が１又は２個のアミノ酸を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物がアルギニン（Ａｒｇ）からなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物がジペプチドからなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が１個以上のヌクレオチドを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記基材が架橋炭水化物である、請求項１２乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
当該方法で製造されるマイクロキャリアが請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載されたものである、請求項１２乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
表面に細胞を付着させる方法であって、１個以上のグアニジン基を含む陽イオン化合物を使用して上記表面に細胞を付着させる方法。
【請求項２０】
前記付着が電荷に基づく相互作用によるものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記陽イオン化合物がアルギニン（Ａｒｇ）からなる、請求項１９又は請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記表面が、マイクロキャリア、メンブラン、布、スライド、チップ、キャピラリー又は容器の表面である、請求項１９乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞の付着が分析又は生産の目的で行われる、請求項１９乃至請求項２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
請求項１９乃至請求項２３のいずれか１項記載の方法を利用する、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のための細胞局在化法。
【請求項２５】
生存能をもたらす環境中で陽イオン化合物でコートされた１個以上のマイクロキャリアの表面で細胞を培養する細胞培養方法であって、上記細胞が陽イオン性コーティングで与えられるグアニジン基を介してマイクロキャリアに付着している、方法。
【請求項２６】
前記細胞の付着が電荷に基づく相互作用によるものである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記陽イオン化合物がアルギニン（Ａｒｇ）からなる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記マイクロキャリアから生存細胞を回収する段階をさらに含む、請求項２６又は請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
分析及び／又は医療の目的で細胞を使用する段階をさらに含む、請求項２６又は請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
ウイルス、細菌、カビ、真菌又は藻類の培養の支持に使用する段階をさらに含む、請求項２５記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５３７９８３（Ｐ２００７−５３７９８３Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３２２３２（Ｐ２００６−５３２２３２）
【出願日】平成１６年１０月５日（２００４．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／００１４１４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３３１４６
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月５日（２００４．１０．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／００１４１４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３３１４６
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]