表面プラズモン共鳴チップ
【課題】固定化物質を安定して固定することができ、製作が容易、低コストであり、かつ、高感度なＳＰＲチップを提供する。
【解決手段】基板１１と、基板１１表面に形成された金属膜１２とを備えており、金属膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に、金属黒が形成されている。金属黒により金属膜上で捕捉される反応系の表面積を増大し、金属膜１２に捕捉される被検物質ａの量を多くすることができる。金属膜１２の表面上にある物質の誘電率が大きく変化するので、共鳴角の変化量も大きくなり、表面プラズモン共鳴チップの感度が向上する。
【解決手段】基板１１と、基板１１表面に形成された金属膜１２とを備えており、金属膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に、金属黒が形成されている。金属黒により金属膜上で捕捉される反応系の表面積を増大し、金属膜１２に捕捉される被検物質ａの量を多くすることができる。金属膜１２の表面上にある物質の誘電率が大きく変化するので、共鳴角の変化量も大きくなり、表面プラズモン共鳴チップの感度が向上する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、表面プラズモン共鳴について簡単に説明する。
図９に示すように、表面プラズモン共鳴とは、プリズム111に金属膜112を蒸着した表面プラズモン共鳴チップ（以下、単にＳＰＲチップＣ３という）において、ＳＰＲチップＣ３のプリズム111側から金属膜112に対して光を全反射条件で入射したときに、その光が金属膜112から染み出して金属膜112の表面から数百nmの領域に生じるエバネッセント波に起因して、金属膜112の表面プラズモンが共鳴励起される現象である。
この共鳴現象の発生の有無は金属膜112に入射される入射光Ｌ１の入射角に依存しており、一定の入射角のときに、エバネッセント波と表面プラズモンの波数が一致し、表面プラズモンが共鳴励起されることにより、反射される反射光Ｌ２の反射光強度が減少する。反射光強度が減少する理由は、金属膜112に照射した光のエネルギーが表面プラズモンの励起に利用されるからである。
【０００３】
共鳴現象が発生する入射光の入射角を共鳴角といい、これはＳＰＲチップＣ３における金属膜112の表面上にある物質の誘電率によって変化するので、この性質を利用して、ＳＰＲチップＣ３を使用して金属膜112の表面上にある特定の物質を検出する技術が開発されている。
例えば、ＳＰＲチップＣ３における金属膜112の表面に、検出目的の物質（以下、被検物質ａという）と結合する固定化物質ｌを固定しておき、このＳＰＲチップＣ３の表面に検出対象となる試料を配置する。そして、金属膜112に対して光を全反射条件の範囲内で入射角度を変えながら入射する。試料中に被検物質ａが存在すれば、被検物質ａと固定化物質ｌとが結合して金属膜112の表面上にある物質の誘電率が変化する。すると、試料中に被検物質ａが存在しない場合に対して、共鳴角が変化するので、被検物質ａの存在の有無を検出することができる。
【０００４】
かかる表面プラズモン共鳴を利用した測定は、生体分子間の相互作用をリアルタイム、非修飾、高感度で検出できることから、様々な目的に適したＳＰＲチップが開発されている（非特許文献１、特許文献１）。
【０００５】
ところで、金属膜の表面積を増大させ、捕捉される被検物質の量を多くすることができれば、その分だけ金属膜の表面上にある物質の誘電率が大きく変化するので、共鳴角の変化量も大きくなり、ＳＰＲチップの感度が向上することが期待される。
非特許文献２には、被検物質であるタンパク質を捕捉する構造体としてナノピラーの配列をシリカで形成し、そのナノピラー構造体を従来のＳＰＲチップの金膜の表面に設置することで、金膜上で捕捉される反応系の表面積を増大させ、ＳＰＲチップの感度を向上させることが記載されている。
【０００６】
その仕組みは以下の通りである。
ＳＰＲチップでは、入射光の金膜上への染み出しにより発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に、固定化物質と被検物質からなる反応系が存在すると共鳴角の変化として検出することができる。このエバネッセント場は、金膜の表面から数百nmの高さまで達するが、従来のＳＰＲチップでは、被検物質は金膜の平坦な表面にのみ捕捉されるため、エバネッセント場の影響が及ぶ範囲の内、金膜の表面から数十nmの領域の変化しか用いられていなかった。
そこで、エバネッセント場の影響が及ぶ全ての範囲を有効に用いるため、570nmの高さを有するピラーを200nm間隔で配列したナノピラー構造体をシリカで形成し、そのナノピラー構造体を従来のＳＰＲチップの金膜の表面に設置した。ナノピラー構造体により金膜上で捕捉される反応系の表面積が増大し、被検物質であるタンパク質を大量に捕捉することができ、ＳＰＲチップの感度を向上させることができるのである。
【０００７】
ここで、ナノピラー構造体に被検物質を捕捉するためは、ナノピラーの側壁に固定化物質を固定する必要がある。
しかし、一般に、金膜にリガンド等の固定化物質を固定する方法は知られており、安定して固定することができるが、ナノピラーの材料であるシリカに固定化物質を固定することは金膜ほど容易ではない。
また、ナノピラーの形成には、半導体の高精度な加工プロセスや、そのための高価な装置が必要で、コストが極めて高くなるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１７４３２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】松下智彦、西川武男、山下英之 「局所ＳＰＲバイオセンサーの研究」 OMRON TECNICS Vol.47，No.1（通巻155号）2006，pp2 - 7
【非特許文献２】Tetsuo Kan, Kiyoshi Matsumoto, Isao Shimoyama 「NANO-PILLAR STRUCTURE FOR SENSITIVITY ENHANCEMENT OF SPR SENSOR」Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference,2009. PP481 - 1484
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記事情に鑑み、固定化物質を安定して固定することができ、製作が容易、低コストであり、かつ、高感度なＳＰＲチップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１発明の表面プラズモン共鳴チップは、光を透過する光透過性素材によって形成された基板と、該基板表面に形成された金属膜とを備えており、前記金属膜に対して前記基板側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に、金属黒が形成されていることを特徴とする。
第２発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１発明において、前記金属膜の表面に前記金属黒が形成されていることを特徴とする。
第３発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１発明において、前記金属黒が形成された金属黒チップを備えており、前記金属黒チップは、前記金属黒が前記金属膜に対向するように設置されていることを特徴とする。
第４発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１、第２または第３発明において、前記金属黒は金黒であることを特徴とする。
第５発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１、第２、第３または第４発明において、前記金属黒の表面に被検物質と結合する固定化物質が固定されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
第１発明によれば、エバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に金属黒が形成されているので、金属黒により金属膜上で捕捉される反応系の表面積を増大し、金属膜に捕捉される被検物質の量を多くすることができる。そのため、金属膜の表面上にある物質の誘電率が大きく変化するので、共鳴角の変化量も大きくなり、表面プラズモン共鳴チップの感度が向上する。
第２発明によれば、金属膜の表面に金属黒が形成されているので、この金属黒により金属膜上で捕捉される反応系の表面積が増大し、金属膜に捕捉される被検物質の量を多くすることができる。そのため、表面プラズモン共鳴チップの感度が向上する。
第３発明によれば、金属黒が金属膜に対向するようにとりつけられるので、この金属黒により金属膜上で捕捉される反応系の表面積が増大し、エバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に捕捉される被検物質の量を多くすることができる。そのため、表面プラズモン共鳴チップの感度が向上する。
第４発明によれば、金属黒が金黒であるので、金黒に固定化物質を安定して固定することができる。
第５発明によれば、金属黒の表面に固定化物質が固定されているので、その固定化物質に結合する被検物質を選択的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の第１実施形態に係るＳＰＲチップの説明図である。
【図２】表面プラズモン共鳴現象による共鳴角の変化を説明した図である。
【図３】本発明の第２実施形態に係るＳＰＲチップの説明図である。
【図４】金黒を形成する装置の説明図である。
【図５】電析電流、電析時間ごとの金黒の状態を示すグラフであり、グラフ中の写真は金黒表面の拡大写真である。
【図６】ＳＰＲカーブの試験結果である。
【図７】濃度依存の試験結果である。
【図８】固定化量の試験結果である。
【図９】従来のＳＰＲチップの説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
つぎに、本発明の実施形態を図面に基づき説明する。
（第１実施形態）
図１に示すように、本発明の第１実施形態に係る表面プラズモン共鳴チップ（以下、単にＳＰＲチップＣ１で示す）は、基板１１と、基板１１の表面に形成された金膜１２とから構成されている。
【００１５】
基板１１は、例えば、ガラスや樹脂材料等のように光を透過する材料によって形成された板状の部材である。この基板１１は、その厚さが0.1〜0.5mm程度であるが、この厚さはとくに限定されない。
なお、基板１１は板状の部材に限られず、プリズムや光導波路等でもよい。
【００１６】
金膜１２の表面には金黒が形成されている。この金黒の形成には公知の方法を採用することができ、例えば、金を電析することによって、粒状となった金の微粒子１３を金膜１２の表面にメッキして金黒を形成することができる。
なお、金黒の厚さは、金膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内となるようにすることが好ましい。
【００１７】
金黒は金の微粒子１３が堆積して形成されているので、金膜１２の表面を立体的に複雑な構造とすることができ、金膜１２の表面積を大幅に増大することができる。
【００１８】
上記金黒の表面には、固定化物質ｌが固定されている。固定化物質ｌは金属である金黒に固定されるので、その固定には公知の方法を採用することができる。また、一般に、金に対しては固定化物質ｌを安定して固定できることが知られている。
【００１９】
なお、金黒の表面に固定化される固定化物質ｌと、固定化物質ｌと結合する被検物質ａの組み合わせとしては相互作用し得る物質同士であれば特に限定されない。
固定化物質ｌの具体例としては、生体由来分子、擬似生体膜（脂質二重膜）、ポリマー、錯体、ガス吸着層、細胞、ウイルス粒子等が挙げられる。このうち生体由来分子の例としては、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖、およびこれらの複合体、誘導体、細胞、ウイルス等が挙げられる。
固定化物質ｌとしてのタンパク質とその披検物質ａの組み合わせとしては、抗体と抗原、酵素と基質、レセプターと固定化物質、膜チャネルと固定化物質等が挙げられる。核酸を含んだ組み合わせとしては、核酸同士、核酸と核酸誘導体、アプタマー（結合性核酸）とその結合対象が挙げられる。糖鎖を含んだ組み合わせとしては、糖鎖とレクチンなどの糖鎖認識タンパク質等が挙げられる。細胞を含んだ組み合わせとしては、細胞同士、細胞表層物質とその結合物質、細胞と細胞結合性化合物等が挙げられる。ウイルスを含んだ組み合わせとしては、ウイルスと細胞、ウイルスと抗ウイルス抗体、ウイルスの表層に提示されたペプチドとその結合物質等が挙げられる。
また、固定化物質ｌとその披検物質ａのその他の組み合わせとしては、薬剤とその標的物質、ホルモン性化合物とその作用物質等の低分子化合物と生体関連物質の組み合わせも挙げられる。
金黒の表面に固定化される固定化物質ｌとその被検物質ａの好ましい組み合わせとしては、抗体（若しくはその一部か、その一部を含む分子）とその抗原が挙げられる。
【００２０】
つぎに、本実施形態のＳＰＲチップＣ１を利用して検出目的の被検物質ａを検出する作業を説明する。
まず、本実施形態のＳＰＲチップＣ１として、検出目的の被検物質ａに結合する固定化物質ｌが固定されたものを準備する。そして、被検物質ａを含まない液体等の試料をＳＰＲチップＣ１上に配置した状態で、ＳＰＲチップＣ１に対して基板１１側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射する(図１参照)。そして、全反射条件を保ったまま、入射光Ｌ１の入射角を変化させて、反射光Ｌ２の強度が減衰する入射光Ｌ１の入射角θ１（被検物質ａを含まない試料の共鳴角θ１）を検出する（図２）。
なお、図２において、符号ＲＬ１が、被検物質ａを含まない試料における入射光Ｌ１の入射角に対する反射光強度を示したものである。
【００２１】
ついで、同じＳＰＲチップＣ１上に被検物質ａを含む液体等の試料を配置する。すると、試料に含まれる被検物質ａは固定化物質ｌと結合し、それにより、金膜１２の表面上にある物質の誘電率が変化する。
【００２２】
上記状態において、ＳＰＲチップＣ１に対して、基板１１側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射して、その入射角を変化させていくと、反射光Ｌ２の強度の減衰する入射光Ｌ１の入射角θ２（被検物質ａを含む試料の共鳴角θ２）を検出することができる(図２)。
なお、図２において、符号ＲＬ２が、被検物質ａを含む試料における入射光Ｌ１の入
射角に対する反射光強度を示したものである。
【００２３】
ここで、反射光Ｌ２の強度の減衰は入射光Ｌ１によって金膜１２の表面に発生する表面プラズモン共鳴の影響で生じるのであるが、被検物質ａが固定化物質ｌと結合することにより金膜１２の表面上にある物質の誘電率が変化し、反射光Ｌ２の強度が減衰する角度が変化する（図２）。
【００２４】
このため、共鳴角θ１と共鳴角θ２とを比較すれば、被検物質ａが試料中に存在するか否かを確認することができる。
しかも、共鳴角θ１と共鳴角θ２との差の度合いから、被検物質ａの存在の多寡を把握することもできる。
【００２５】
本実施形態においては、金膜１２の表面に金黒が形成されることにより、金膜１２の表面積が増大されているので、金黒に固定される固定化物質ｌの量を、平坦な金膜の場合に比べて多くすることができる。したがって、ＳＰＲチップＣ１は、金膜１２により多くの被検物質ａを捕捉することができる。換言すれば、金黒により形成された立体的に複雑な構造に被検物質ａを捕捉することができるので、金膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に多くの被検物質ａを捕捉することができる。
多くの被検物質ａを捕捉することにより、金膜１２の表面上にある物質の誘電率が大きく変化するので、共鳴角θ１と共鳴角θ２との差の度合も大きくなり、結果としてＳＰＲチップＣ１の感度が向上する。したがって、これまで検出が難しかった低濃度・低分子量の試料の計測に用いることが可能になる。
【００２６】
（第２実施形態）
図３に示すように、本発明の第２実施形態に係るＳＰＲチップＣ２は、基板１１と、基板１１の表面に形成された金属膜１２とから構成された検出チップ１０と、検出チップ１０の金属膜１２の表面に設置された金黒チップ２０とを備えている。
【００２７】
検出チップ１０は公知のＳＰＲチップと同様の構成である。
検出チップ１０の基板１１は、例えば、ガラスや樹脂材料等のように光を透過する材料によって形成された板状の部材である。この基板１１は、その厚さが0.1〜0.5mm程度であるが、この厚さはとくに限定されない。
なお、基板１１は板状の部材に限られず、プリズムや光導波路等でもよい。
【００２８】
検出チップ１０の金属膜１２は、例えば金や銀等の金属を素材とする膜である。第１実施形態のＳＰＲチップＣ１とは異なり、この金属膜１２の表面には金黒が形成されていない。
【００２９】
金黒チップ２０は、基板２１と、基板２１の表面に形成された金膜２２とから構成されている。
基板２１は、ガラス等に限られず、その表面に金膜２２を形成することができるものであれば、その材質を自由に選択することができる。
金膜２２の表面には金の微粒子２３が堆積することにより金黒が形成されている。そして金黒の表面には固定化物質ｌが固定されている。金黒を形成する方法および、固定化物質ｌを固定する方法は、第１実施形態のＳＰＲチップＣ１と同様の方法を採用することができる。
【００３０】
上記金黒チップ２０は、金膜２２の表面に形成された金黒が検出チップ１０の金属膜１２に対向するように設置されている。ここで、検出チップ１０の金属膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に、金黒チップ２０の金黒が位置するように、金黒チップ２０を検出チップ１０に接近させて設置する必要がある。
【００３１】
本実施形態のＳＰＲチップＣ２を利用して検出目的の被検物質ａを検出する作業は、第１実施形態のＳＰＲチップＣ１の場合とほぼ同様である。
まず、本実施形態のＳＰＲチップＣ２として、検出目的の被検物質ａに結合する固定化物質ｌが固定されたものを準備する。そして、被検物質ａを含まない液体等の試料を検出チップ１０と金黒チップ２０との間に流入し、検出チップ１０に対して基板１１側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射する。そして、全反射条件を保ったまま、入射光Ｌ１の入射角を変化させて、反射光Ｌ２の強度が減衰する入射光Ｌ１の入射角θ１（被検物質ａを含まない試料の共鳴角θ１）を検出する（図２）。
【００３２】
ついで、同じＳＰＲチップＣ２において、被検物質ａを含む液体等の試料を検出チップ１０と金黒チップ２０との間に流入する。すると、試料に含まれる被検物質ａは固定化物質ｌと結合し、それにより、金属膜１２の表面上にある物質の誘電率が変化する。
より詳細には、被検物質ａは金黒チップ２０の金膜２２に形成された金黒に捕捉されるのであるが、金黒チップ２０の金黒と検出チップ１０の金属膜１２表面とは近接しているため、捕捉された被検物質ａは、検出チップ１０の金属膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に存在することになる。そのため、結果として金属膜１２の表面上にある物質の誘電率が変化するのである。
【００３３】
上記状態において、検出チップ１０に対して、基板１１側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射して、その入射角を変化させていくと、反射光Ｌ２の強度の減衰する入射光Ｌ１の入射角θ２（被検物質ａを含む試料の共鳴角θ２）を検出することができる（図２）。
【００３４】
ここで、反射光Ｌ２の強度の減衰は入射光Ｌ１によって金属膜１２表面に発生する表面プラズモン共鳴の影響で生じるのであるが、被検物質ａが固定化物質ｌと結合することにより金属膜１２の表面上にある物質の誘電率が変化し、反射光Ｌ２の強度が減衰する角度が変化する。
【００３５】
このため、共鳴角θ１と共鳴角θ２とを比較すれば、被検物質ａが試料中に存在するか否かを確認することができる。
しかも、共鳴角θ１と共鳴角θ２との差の度合いから、被検物質ａの存在の多寡を把握することもできる。
【００３６】
本実施形態においては、金黒チップの金膜２２の表面に金黒が形成されることにより、検出チップ１０の金属膜１２上で捕捉される反応系の表面積が増大されているので、より多くの被検物質ａを捕捉することができる。そのため、ＳＰＲチップＣ２の感度が向上する。
【００３７】
また、第１実施形態のＳＰＲチップＣ１の場合と異なり、本実施形態においては、金黒の厚さを制限する必要はない。例えば、金膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲よりも、金黒を厚くすることができる。
これは、ＳＰＲチップＣ１の構成では、金黒の厚さが一定以上になると、基板１１側から入射する入射光の入射角を変化させたときの反射光強度の変化（以下、単にＳＰＲカーブという）が十分得られないが、ＳＰＲチップＣ２の構成では、基板１１で発生するエバネッセント場により金属膜の表面が平坦なＳＰＲチップと同様に十分なＳＰＲカーブが得られるからである。
【００３８】
（他の実施形態）
上記実施形態では、基板１１、２１の表面に金膜１２、２２を形成し、金膜１２、２２の表面に金黒を形成したが、これに代えて、基板１１、２１の表面に白金膜を形成し、白金膜の表面に白金黒を形成してもよい。また、基板１１、２１の表面に銀膜を形成し、銀膜の表面に銀黒を形成してもよい。ただし、固定化物質ｌの固定の容易さと、安定性から、金黒を選択することが好ましい。
なお、金黒、白金黒、銀黒は、特許請求の範囲に記載の「金属黒」に相当する。金属黒とは、金属材料を電析等することによって、粒状となった金属の微粒子をいう。
【００３９】
つぎに、本発明に係るＳＰＲチップの試験について説明する。なお、以下の試験は、上記第１実施形態のＳＰＲチップＣ１について行った。
【００４０】
（金黒形成）
まず、金膜の表面に金黒を形成する方法について試験を行った。
図４に示すように、まず基板１１の表面にクロムおよび金をこの順番で蒸着し金膜１２を形成した。ここで、クロムは金をガラスでできた基板１１の表面に密着性よく付けるために用いられている。クロムの厚さは3nm、金の厚さは22nmとした。なお、クロムの代わりにチタンを用いてもよい。
つぎに、金膜１２の表面にＰＤＭＳ樹脂で形成した枠３１を設置する。枠３１内には、83mMol/lのNa(AuCl4)と1.58mMol/lのPb(CH3COO)2の混合溶液を150μl注入した。そして、作用電極３２を金膜１２の表面に設置し、対電極３３および参照電極３４を溶液中に投入し、ガルバノスタット３５で作用電極３２に電位を加えて電析した。
そうすると、金膜１２の表面に粒状となった金の微粒子１３がメッキされ、金黒が形成された。
【００４１】
図５に示すように、金黒の状態は、ガルバノスタット３５で供給する電流と、電析する時間によって変化することが分かった。
より詳細には、電流を-10μAとした場合には、微粒子１３の大きさがあまり変化しないまま、電析時間の経過にしたがって金黒の厚さが厚くなった。また、電流を-50μAとした場合には、電析時間の経過にしたがって微粒子１３が大きく成長した。
【００４２】
（ＳＰＲカーブ）
つぎに、ＳＰＲカーブを測定した。
測定は、上記方法で金黒を形成したＳＰＲチップのうち、電析電流と電析時間の異なる実施例１、２、３と、金黒を形成していない比較例１を用いて行った。それぞれの電析電流および電析時間は表１に示すとおりである。なお、いずれのＳＰＲチップも、固定化物質を固定しておらず、被検物質を捕捉していない。また、比較例１のみ、クロムの厚さを5nm、金の厚さを45nmとした。
【表１】
【００４３】
図６に示すように、実施例１、２、３のいずれにおいても、比較例１と同様にＳＰＲカーブを得ることができた。つまり、金黒が金膜の表面に形成されたとしても表面プラズモン共鳴が起こることが確認された。
したがって、本発明に係るＳＰＲチップを用いて、被検物質が試料中に存在するか否か、および、被検物質の存在の多寡を測定できることが確認された。
なお、実施例１、２、３の共鳴角の値が比較例１の共鳴角の値に比べて大きいのは、金黒が形成されることにより、金膜の表面上にある物質の誘電率が変化しているからである。
【００４４】
（濃度依存）
つぎに、上記実施例１、２、３と、比較例１を用いて、スクロースを含有しない水、およびスクロースを含有する水をＳＰＲチップ上に配置した状態で、それぞれの共鳴角を測定した。
【００４５】
図７に示すように、実施例１、２、３および比較例１のいずれにおいても、スクロースを含有しない水が配置された状態の共鳴角よりも、スクロースを１０％含有する水が配置された状態の共鳴角の方が、大きくなっていることが分かる。
これより、本発明に係るＳＰＲチップにおいても、従来のＳＰＲチップと同様に金膜の表面上にある液体の誘電率の変化を測定できることが分かった。
【００４６】
（固定化量）
つぎに、ＳＰＲチップに固定化物質を固定化できる量（以下、単に固定化量という）の試験について説明する。
試験は、金膜の厚さおよび金黒の厚さを変えた実施例４、５と、金黒を形成していない比較例２を用いて行った。それぞれの、クロム、金および金黒の厚さは表２に記載するとおりである。
【表２】
【００４７】
上記の実施例４、５、および比較例２のＳＰＲチップを３枚ずつ用意し、それぞれの金膜の表面にタンパク質を固定化した。金膜の表面にタンパク質を固定するために、以下の処理を行った。
まず、金膜の表面に自己組織化単分子膜
(Self-assembled Monolayer: SAM)を形成した。より詳細には、ジスルフィド基を持つ4,4'-Dithiodibutyric
acid(DDA)のエタノール溶液を10μMol/l入れたガラスシャーレ内に、上記ＳＰＲチップを３０分浸漬することでSAMを形成した。SMAを形成することにより、SAM上にはカルボキシル基(-COOH)が形成される。
つぎに、0.4Mol/lの 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide
hydrochloride (EDC)と、0.1Mol/lの N-hydroxysuccimide
(NHS)との混合水溶液を金膜の表面に5分間接触させた。これにより、SAM上のカルボキシル基を、より反応性の高い活性エステル（NHS基）の形に変換した。
不安定な活性エステルは、タンパク質の持つアミノ基部分と自動的に縮合して共有結合を形成する性質を有する。そこで、金膜にタンパク質溶液を接触させて、金膜の表面にタンパク質を固定した。
【００４８】
上記の実施例４、５、および比較例２のＳＰＲチップのそれぞれについて、タンパク質の固定化の前後においてＳＰＲカーブを測定し、共鳴角の変化の値を測定し、図８に示すグラフを得た。なお、図８においては、各条件（実施例４、５、および比較例２）ごとに、３枚のチップの共鳴角の差の平均値を採用し、３枚のチップの共鳴角の差の標準偏差を誤差とした。
図８より、実施例４、５は、比較例２に比べて、多くのタンパク質を固定化できたことが分かる。これは、金黒により金膜の表面積が増大したからである。これより、本発明に係るＳＰＲチップは多くの固定化物質を固定でき、従来のＳＰＲチップに比べて感度が向上することが推測される。
【００４９】
また、実施例５は実施例４に比べて、共鳴角の変化が大きいことから、多くのタンパク質を固定できたことが分かる。すなわち、金黒の厚さが厚い方が、より金膜の表面積が増大し、より多くの固定化物質を固定できるということが分かる。したがって、ＳＰＲが検出できる厚さの範囲内では、金黒の厚さが厚い方が、ＳＰＲチップの感度が向上するということが推測される。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の表面プラズモン共鳴チップは、生体分子間の相互作用をリアルタイム、非修飾、高感度で検出することに使用することができる。
【符号の説明】
【００５１】
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３ ＳＰＲチップ
Ｌ１ 入射光
Ｌ２ 反射光
１１ 基板
１２ 金膜
１３ 微粒子
２０ 金黒チップ
２１ 基板
２２ 金膜
２３ 微粒子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、表面プラズモン共鳴について簡単に説明する。
図９に示すように、表面プラズモン共鳴とは、プリズム111に金属膜112を蒸着した表面プラズモン共鳴チップ（以下、単にＳＰＲチップＣ３という）において、ＳＰＲチップＣ３のプリズム111側から金属膜112に対して光を全反射条件で入射したときに、その光が金属膜112から染み出して金属膜112の表面から数百nmの領域に生じるエバネッセント波に起因して、金属膜112の表面プラズモンが共鳴励起される現象である。
この共鳴現象の発生の有無は金属膜112に入射される入射光Ｌ１の入射角に依存しており、一定の入射角のときに、エバネッセント波と表面プラズモンの波数が一致し、表面プラズモンが共鳴励起されることにより、反射される反射光Ｌ２の反射光強度が減少する。反射光強度が減少する理由は、金属膜112に照射した光のエネルギーが表面プラズモンの励起に利用されるからである。
【０００３】
共鳴現象が発生する入射光の入射角を共鳴角といい、これはＳＰＲチップＣ３における金属膜112の表面上にある物質の誘電率によって変化するので、この性質を利用して、ＳＰＲチップＣ３を使用して金属膜112の表面上にある特定の物質を検出する技術が開発されている。
例えば、ＳＰＲチップＣ３における金属膜112の表面に、検出目的の物質（以下、被検物質ａという）と結合する固定化物質ｌを固定しておき、このＳＰＲチップＣ３の表面に検出対象となる試料を配置する。そして、金属膜112に対して光を全反射条件の範囲内で入射角度を変えながら入射する。試料中に被検物質ａが存在すれば、被検物質ａと固定化物質ｌとが結合して金属膜112の表面上にある物質の誘電率が変化する。すると、試料中に被検物質ａが存在しない場合に対して、共鳴角が変化するので、被検物質ａの存在の有無を検出することができる。
【０００４】
かかる表面プラズモン共鳴を利用した測定は、生体分子間の相互作用をリアルタイム、非修飾、高感度で検出できることから、様々な目的に適したＳＰＲチップが開発されている（非特許文献１、特許文献１）。
【０００５】
ところで、金属膜の表面積を増大させ、捕捉される被検物質の量を多くすることができれば、その分だけ金属膜の表面上にある物質の誘電率が大きく変化するので、共鳴角の変化量も大きくなり、ＳＰＲチップの感度が向上することが期待される。
非特許文献２には、被検物質であるタンパク質を捕捉する構造体としてナノピラーの配列をシリカで形成し、そのナノピラー構造体を従来のＳＰＲチップの金膜の表面に設置することで、金膜上で捕捉される反応系の表面積を増大させ、ＳＰＲチップの感度を向上させることが記載されている。
【０００６】
その仕組みは以下の通りである。
ＳＰＲチップでは、入射光の金膜上への染み出しにより発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に、固定化物質と被検物質からなる反応系が存在すると共鳴角の変化として検出することができる。このエバネッセント場は、金膜の表面から数百nmの高さまで達するが、従来のＳＰＲチップでは、被検物質は金膜の平坦な表面にのみ捕捉されるため、エバネッセント場の影響が及ぶ範囲の内、金膜の表面から数十nmの領域の変化しか用いられていなかった。
そこで、エバネッセント場の影響が及ぶ全ての範囲を有効に用いるため、570nmの高さを有するピラーを200nm間隔で配列したナノピラー構造体をシリカで形成し、そのナノピラー構造体を従来のＳＰＲチップの金膜の表面に設置した。ナノピラー構造体により金膜上で捕捉される反応系の表面積が増大し、被検物質であるタンパク質を大量に捕捉することができ、ＳＰＲチップの感度を向上させることができるのである。
【０００７】
ここで、ナノピラー構造体に被検物質を捕捉するためは、ナノピラーの側壁に固定化物質を固定する必要がある。
しかし、一般に、金膜にリガンド等の固定化物質を固定する方法は知られており、安定して固定することができるが、ナノピラーの材料であるシリカに固定化物質を固定することは金膜ほど容易ではない。
また、ナノピラーの形成には、半導体の高精度な加工プロセスや、そのための高価な装置が必要で、コストが極めて高くなるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１７４３２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】松下智彦、西川武男、山下英之 「局所ＳＰＲバイオセンサーの研究」 OMRON TECNICS Vol.47，No.1（通巻155号）2006，pp2 - 7
【非特許文献２】Tetsuo Kan, Kiyoshi Matsumoto, Isao Shimoyama 「NANO-PILLAR STRUCTURE FOR SENSITIVITY ENHANCEMENT OF SPR SENSOR」Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference,2009. PP481 - 1484
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記事情に鑑み、固定化物質を安定して固定することができ、製作が容易、低コストであり、かつ、高感度なＳＰＲチップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１発明の表面プラズモン共鳴チップは、光を透過する光透過性素材によって形成された基板と、該基板表面に形成された金属膜とを備えており、前記金属膜に対して前記基板側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に、金属黒が形成されていることを特徴とする。
第２発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１発明において、前記金属膜の表面に前記金属黒が形成されていることを特徴とする。
第３発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１発明において、前記金属黒が形成された金属黒チップを備えており、前記金属黒チップは、前記金属黒が前記金属膜に対向するように設置されていることを特徴とする。
第４発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１、第２または第３発明において、前記金属黒は金黒であることを特徴とする。
第５発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１、第２、第３または第４発明において、前記金属黒の表面に被検物質と結合する固定化物質が固定されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
第１発明によれば、エバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に金属黒が形成されているので、金属黒により金属膜上で捕捉される反応系の表面積を増大し、金属膜に捕捉される被検物質の量を多くすることができる。そのため、金属膜の表面上にある物質の誘電率が大きく変化するので、共鳴角の変化量も大きくなり、表面プラズモン共鳴チップの感度が向上する。
第２発明によれば、金属膜の表面に金属黒が形成されているので、この金属黒により金属膜上で捕捉される反応系の表面積が増大し、金属膜に捕捉される被検物質の量を多くすることができる。そのため、表面プラズモン共鳴チップの感度が向上する。
第３発明によれば、金属黒が金属膜に対向するようにとりつけられるので、この金属黒により金属膜上で捕捉される反応系の表面積が増大し、エバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に捕捉される被検物質の量を多くすることができる。そのため、表面プラズモン共鳴チップの感度が向上する。
第４発明によれば、金属黒が金黒であるので、金黒に固定化物質を安定して固定することができる。
第５発明によれば、金属黒の表面に固定化物質が固定されているので、その固定化物質に結合する被検物質を選択的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の第１実施形態に係るＳＰＲチップの説明図である。
【図２】表面プラズモン共鳴現象による共鳴角の変化を説明した図である。
【図３】本発明の第２実施形態に係るＳＰＲチップの説明図である。
【図４】金黒を形成する装置の説明図である。
【図５】電析電流、電析時間ごとの金黒の状態を示すグラフであり、グラフ中の写真は金黒表面の拡大写真である。
【図６】ＳＰＲカーブの試験結果である。
【図７】濃度依存の試験結果である。
【図８】固定化量の試験結果である。
【図９】従来のＳＰＲチップの説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
つぎに、本発明の実施形態を図面に基づき説明する。
（第１実施形態）
図１に示すように、本発明の第１実施形態に係る表面プラズモン共鳴チップ（以下、単にＳＰＲチップＣ１で示す）は、基板１１と、基板１１の表面に形成された金膜１２とから構成されている。
【００１５】
基板１１は、例えば、ガラスや樹脂材料等のように光を透過する材料によって形成された板状の部材である。この基板１１は、その厚さが0.1〜0.5mm程度であるが、この厚さはとくに限定されない。
なお、基板１１は板状の部材に限られず、プリズムや光導波路等でもよい。
【００１６】
金膜１２の表面には金黒が形成されている。この金黒の形成には公知の方法を採用することができ、例えば、金を電析することによって、粒状となった金の微粒子１３を金膜１２の表面にメッキして金黒を形成することができる。
なお、金黒の厚さは、金膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内となるようにすることが好ましい。
【００１７】
金黒は金の微粒子１３が堆積して形成されているので、金膜１２の表面を立体的に複雑な構造とすることができ、金膜１２の表面積を大幅に増大することができる。
【００１８】
上記金黒の表面には、固定化物質ｌが固定されている。固定化物質ｌは金属である金黒に固定されるので、その固定には公知の方法を採用することができる。また、一般に、金に対しては固定化物質ｌを安定して固定できることが知られている。
【００１９】
なお、金黒の表面に固定化される固定化物質ｌと、固定化物質ｌと結合する被検物質ａの組み合わせとしては相互作用し得る物質同士であれば特に限定されない。
固定化物質ｌの具体例としては、生体由来分子、擬似生体膜（脂質二重膜）、ポリマー、錯体、ガス吸着層、細胞、ウイルス粒子等が挙げられる。このうち生体由来分子の例としては、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖、およびこれらの複合体、誘導体、細胞、ウイルス等が挙げられる。
固定化物質ｌとしてのタンパク質とその披検物質ａの組み合わせとしては、抗体と抗原、酵素と基質、レセプターと固定化物質、膜チャネルと固定化物質等が挙げられる。核酸を含んだ組み合わせとしては、核酸同士、核酸と核酸誘導体、アプタマー（結合性核酸）とその結合対象が挙げられる。糖鎖を含んだ組み合わせとしては、糖鎖とレクチンなどの糖鎖認識タンパク質等が挙げられる。細胞を含んだ組み合わせとしては、細胞同士、細胞表層物質とその結合物質、細胞と細胞結合性化合物等が挙げられる。ウイルスを含んだ組み合わせとしては、ウイルスと細胞、ウイルスと抗ウイルス抗体、ウイルスの表層に提示されたペプチドとその結合物質等が挙げられる。
また、固定化物質ｌとその披検物質ａのその他の組み合わせとしては、薬剤とその標的物質、ホルモン性化合物とその作用物質等の低分子化合物と生体関連物質の組み合わせも挙げられる。
金黒の表面に固定化される固定化物質ｌとその被検物質ａの好ましい組み合わせとしては、抗体（若しくはその一部か、その一部を含む分子）とその抗原が挙げられる。
【００２０】
つぎに、本実施形態のＳＰＲチップＣ１を利用して検出目的の被検物質ａを検出する作業を説明する。
まず、本実施形態のＳＰＲチップＣ１として、検出目的の被検物質ａに結合する固定化物質ｌが固定されたものを準備する。そして、被検物質ａを含まない液体等の試料をＳＰＲチップＣ１上に配置した状態で、ＳＰＲチップＣ１に対して基板１１側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射する(図１参照)。そして、全反射条件を保ったまま、入射光Ｌ１の入射角を変化させて、反射光Ｌ２の強度が減衰する入射光Ｌ１の入射角θ１（被検物質ａを含まない試料の共鳴角θ１）を検出する（図２）。
なお、図２において、符号ＲＬ１が、被検物質ａを含まない試料における入射光Ｌ１の入射角に対する反射光強度を示したものである。
【００２１】
ついで、同じＳＰＲチップＣ１上に被検物質ａを含む液体等の試料を配置する。すると、試料に含まれる被検物質ａは固定化物質ｌと結合し、それにより、金膜１２の表面上にある物質の誘電率が変化する。
【００２２】
上記状態において、ＳＰＲチップＣ１に対して、基板１１側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射して、その入射角を変化させていくと、反射光Ｌ２の強度の減衰する入射光Ｌ１の入射角θ２（被検物質ａを含む試料の共鳴角θ２）を検出することができる(図２)。
なお、図２において、符号ＲＬ２が、被検物質ａを含む試料における入射光Ｌ１の入
射角に対する反射光強度を示したものである。
【００２３】
ここで、反射光Ｌ２の強度の減衰は入射光Ｌ１によって金膜１２の表面に発生する表面プラズモン共鳴の影響で生じるのであるが、被検物質ａが固定化物質ｌと結合することにより金膜１２の表面上にある物質の誘電率が変化し、反射光Ｌ２の強度が減衰する角度が変化する（図２）。
【００２４】
このため、共鳴角θ１と共鳴角θ２とを比較すれば、被検物質ａが試料中に存在するか否かを確認することができる。
しかも、共鳴角θ１と共鳴角θ２との差の度合いから、被検物質ａの存在の多寡を把握することもできる。
【００２５】
本実施形態においては、金膜１２の表面に金黒が形成されることにより、金膜１２の表面積が増大されているので、金黒に固定される固定化物質ｌの量を、平坦な金膜の場合に比べて多くすることができる。したがって、ＳＰＲチップＣ１は、金膜１２により多くの被検物質ａを捕捉することができる。換言すれば、金黒により形成された立体的に複雑な構造に被検物質ａを捕捉することができるので、金膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に多くの被検物質ａを捕捉することができる。
多くの被検物質ａを捕捉することにより、金膜１２の表面上にある物質の誘電率が大きく変化するので、共鳴角θ１と共鳴角θ２との差の度合も大きくなり、結果としてＳＰＲチップＣ１の感度が向上する。したがって、これまで検出が難しかった低濃度・低分子量の試料の計測に用いることが可能になる。
【００２６】
（第２実施形態）
図３に示すように、本発明の第２実施形態に係るＳＰＲチップＣ２は、基板１１と、基板１１の表面に形成された金属膜１２とから構成された検出チップ１０と、検出チップ１０の金属膜１２の表面に設置された金黒チップ２０とを備えている。
【００２７】
検出チップ１０は公知のＳＰＲチップと同様の構成である。
検出チップ１０の基板１１は、例えば、ガラスや樹脂材料等のように光を透過する材料によって形成された板状の部材である。この基板１１は、その厚さが0.1〜0.5mm程度であるが、この厚さはとくに限定されない。
なお、基板１１は板状の部材に限られず、プリズムや光導波路等でもよい。
【００２８】
検出チップ１０の金属膜１２は、例えば金や銀等の金属を素材とする膜である。第１実施形態のＳＰＲチップＣ１とは異なり、この金属膜１２の表面には金黒が形成されていない。
【００２９】
金黒チップ２０は、基板２１と、基板２１の表面に形成された金膜２２とから構成されている。
基板２１は、ガラス等に限られず、その表面に金膜２２を形成することができるものであれば、その材質を自由に選択することができる。
金膜２２の表面には金の微粒子２３が堆積することにより金黒が形成されている。そして金黒の表面には固定化物質ｌが固定されている。金黒を形成する方法および、固定化物質ｌを固定する方法は、第１実施形態のＳＰＲチップＣ１と同様の方法を採用することができる。
【００３０】
上記金黒チップ２０は、金膜２２の表面に形成された金黒が検出チップ１０の金属膜１２に対向するように設置されている。ここで、検出チップ１０の金属膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に、金黒チップ２０の金黒が位置するように、金黒チップ２０を検出チップ１０に接近させて設置する必要がある。
【００３１】
本実施形態のＳＰＲチップＣ２を利用して検出目的の被検物質ａを検出する作業は、第１実施形態のＳＰＲチップＣ１の場合とほぼ同様である。
まず、本実施形態のＳＰＲチップＣ２として、検出目的の被検物質ａに結合する固定化物質ｌが固定されたものを準備する。そして、被検物質ａを含まない液体等の試料を検出チップ１０と金黒チップ２０との間に流入し、検出チップ１０に対して基板１１側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射する。そして、全反射条件を保ったまま、入射光Ｌ１の入射角を変化させて、反射光Ｌ２の強度が減衰する入射光Ｌ１の入射角θ１（被検物質ａを含まない試料の共鳴角θ１）を検出する（図２）。
【００３２】
ついで、同じＳＰＲチップＣ２において、被検物質ａを含む液体等の試料を検出チップ１０と金黒チップ２０との間に流入する。すると、試料に含まれる被検物質ａは固定化物質ｌと結合し、それにより、金属膜１２の表面上にある物質の誘電率が変化する。
より詳細には、被検物質ａは金黒チップ２０の金膜２２に形成された金黒に捕捉されるのであるが、金黒チップ２０の金黒と検出チップ１０の金属膜１２表面とは近接しているため、捕捉された被検物質ａは、検出チップ１０の金属膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に存在することになる。そのため、結果として金属膜１２の表面上にある物質の誘電率が変化するのである。
【００３３】
上記状態において、検出チップ１０に対して、基板１１側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射して、その入射角を変化させていくと、反射光Ｌ２の強度の減衰する入射光Ｌ１の入射角θ２（被検物質ａを含む試料の共鳴角θ２）を検出することができる（図２）。
【００３４】
ここで、反射光Ｌ２の強度の減衰は入射光Ｌ１によって金属膜１２表面に発生する表面プラズモン共鳴の影響で生じるのであるが、被検物質ａが固定化物質ｌと結合することにより金属膜１２の表面上にある物質の誘電率が変化し、反射光Ｌ２の強度が減衰する角度が変化する。
【００３５】
このため、共鳴角θ１と共鳴角θ２とを比較すれば、被検物質ａが試料中に存在するか否かを確認することができる。
しかも、共鳴角θ１と共鳴角θ２との差の度合いから、被検物質ａの存在の多寡を把握することもできる。
【００３６】
本実施形態においては、金黒チップの金膜２２の表面に金黒が形成されることにより、検出チップ１０の金属膜１２上で捕捉される反応系の表面積が増大されているので、より多くの被検物質ａを捕捉することができる。そのため、ＳＰＲチップＣ２の感度が向上する。
【００３７】
また、第１実施形態のＳＰＲチップＣ１の場合と異なり、本実施形態においては、金黒の厚さを制限する必要はない。例えば、金膜１２に対して基板１１側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲よりも、金黒を厚くすることができる。
これは、ＳＰＲチップＣ１の構成では、金黒の厚さが一定以上になると、基板１１側から入射する入射光の入射角を変化させたときの反射光強度の変化（以下、単にＳＰＲカーブという）が十分得られないが、ＳＰＲチップＣ２の構成では、基板１１で発生するエバネッセント場により金属膜の表面が平坦なＳＰＲチップと同様に十分なＳＰＲカーブが得られるからである。
【００３８】
（他の実施形態）
上記実施形態では、基板１１、２１の表面に金膜１２、２２を形成し、金膜１２、２２の表面に金黒を形成したが、これに代えて、基板１１、２１の表面に白金膜を形成し、白金膜の表面に白金黒を形成してもよい。また、基板１１、２１の表面に銀膜を形成し、銀膜の表面に銀黒を形成してもよい。ただし、固定化物質ｌの固定の容易さと、安定性から、金黒を選択することが好ましい。
なお、金黒、白金黒、銀黒は、特許請求の範囲に記載の「金属黒」に相当する。金属黒とは、金属材料を電析等することによって、粒状となった金属の微粒子をいう。
【００３９】
つぎに、本発明に係るＳＰＲチップの試験について説明する。なお、以下の試験は、上記第１実施形態のＳＰＲチップＣ１について行った。
【００４０】
（金黒形成）
まず、金膜の表面に金黒を形成する方法について試験を行った。
図４に示すように、まず基板１１の表面にクロムおよび金をこの順番で蒸着し金膜１２を形成した。ここで、クロムは金をガラスでできた基板１１の表面に密着性よく付けるために用いられている。クロムの厚さは3nm、金の厚さは22nmとした。なお、クロムの代わりにチタンを用いてもよい。
つぎに、金膜１２の表面にＰＤＭＳ樹脂で形成した枠３１を設置する。枠３１内には、83mMol/lのNa(AuCl4)と1.58mMol/lのPb(CH3COO)2の混合溶液を150μl注入した。そして、作用電極３２を金膜１２の表面に設置し、対電極３３および参照電極３４を溶液中に投入し、ガルバノスタット３５で作用電極３２に電位を加えて電析した。
そうすると、金膜１２の表面に粒状となった金の微粒子１３がメッキされ、金黒が形成された。
【００４１】
図５に示すように、金黒の状態は、ガルバノスタット３５で供給する電流と、電析する時間によって変化することが分かった。
より詳細には、電流を-10μAとした場合には、微粒子１３の大きさがあまり変化しないまま、電析時間の経過にしたがって金黒の厚さが厚くなった。また、電流を-50μAとした場合には、電析時間の経過にしたがって微粒子１３が大きく成長した。
【００４２】
（ＳＰＲカーブ）
つぎに、ＳＰＲカーブを測定した。
測定は、上記方法で金黒を形成したＳＰＲチップのうち、電析電流と電析時間の異なる実施例１、２、３と、金黒を形成していない比較例１を用いて行った。それぞれの電析電流および電析時間は表１に示すとおりである。なお、いずれのＳＰＲチップも、固定化物質を固定しておらず、被検物質を捕捉していない。また、比較例１のみ、クロムの厚さを5nm、金の厚さを45nmとした。
【表１】
【００４３】
図６に示すように、実施例１、２、３のいずれにおいても、比較例１と同様にＳＰＲカーブを得ることができた。つまり、金黒が金膜の表面に形成されたとしても表面プラズモン共鳴が起こることが確認された。
したがって、本発明に係るＳＰＲチップを用いて、被検物質が試料中に存在するか否か、および、被検物質の存在の多寡を測定できることが確認された。
なお、実施例１、２、３の共鳴角の値が比較例１の共鳴角の値に比べて大きいのは、金黒が形成されることにより、金膜の表面上にある物質の誘電率が変化しているからである。
【００４４】
（濃度依存）
つぎに、上記実施例１、２、３と、比較例１を用いて、スクロースを含有しない水、およびスクロースを含有する水をＳＰＲチップ上に配置した状態で、それぞれの共鳴角を測定した。
【００４５】
図７に示すように、実施例１、２、３および比較例１のいずれにおいても、スクロースを含有しない水が配置された状態の共鳴角よりも、スクロースを１０％含有する水が配置された状態の共鳴角の方が、大きくなっていることが分かる。
これより、本発明に係るＳＰＲチップにおいても、従来のＳＰＲチップと同様に金膜の表面上にある液体の誘電率の変化を測定できることが分かった。
【００４６】
（固定化量）
つぎに、ＳＰＲチップに固定化物質を固定化できる量（以下、単に固定化量という）の試験について説明する。
試験は、金膜の厚さおよび金黒の厚さを変えた実施例４、５と、金黒を形成していない比較例２を用いて行った。それぞれの、クロム、金および金黒の厚さは表２に記載するとおりである。
【表２】
【００４７】
上記の実施例４、５、および比較例２のＳＰＲチップを３枚ずつ用意し、それぞれの金膜の表面にタンパク質を固定化した。金膜の表面にタンパク質を固定するために、以下の処理を行った。
まず、金膜の表面に自己組織化単分子膜
(Self-assembled Monolayer: SAM)を形成した。より詳細には、ジスルフィド基を持つ4,4'-Dithiodibutyric
acid(DDA)のエタノール溶液を10μMol/l入れたガラスシャーレ内に、上記ＳＰＲチップを３０分浸漬することでSAMを形成した。SMAを形成することにより、SAM上にはカルボキシル基(-COOH)が形成される。
つぎに、0.4Mol/lの 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide
hydrochloride (EDC)と、0.1Mol/lの N-hydroxysuccimide
(NHS)との混合水溶液を金膜の表面に5分間接触させた。これにより、SAM上のカルボキシル基を、より反応性の高い活性エステル（NHS基）の形に変換した。
不安定な活性エステルは、タンパク質の持つアミノ基部分と自動的に縮合して共有結合を形成する性質を有する。そこで、金膜にタンパク質溶液を接触させて、金膜の表面にタンパク質を固定した。
【００４８】
上記の実施例４、５、および比較例２のＳＰＲチップのそれぞれについて、タンパク質の固定化の前後においてＳＰＲカーブを測定し、共鳴角の変化の値を測定し、図８に示すグラフを得た。なお、図８においては、各条件（実施例４、５、および比較例２）ごとに、３枚のチップの共鳴角の差の平均値を採用し、３枚のチップの共鳴角の差の標準偏差を誤差とした。
図８より、実施例４、５は、比較例２に比べて、多くのタンパク質を固定化できたことが分かる。これは、金黒により金膜の表面積が増大したからである。これより、本発明に係るＳＰＲチップは多くの固定化物質を固定でき、従来のＳＰＲチップに比べて感度が向上することが推測される。
【００４９】
また、実施例５は実施例４に比べて、共鳴角の変化が大きいことから、多くのタンパク質を固定できたことが分かる。すなわち、金黒の厚さが厚い方が、より金膜の表面積が増大し、より多くの固定化物質を固定できるということが分かる。したがって、ＳＰＲが検出できる厚さの範囲内では、金黒の厚さが厚い方が、ＳＰＲチップの感度が向上するということが推測される。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の表面プラズモン共鳴チップは、生体分子間の相互作用をリアルタイム、非修飾、高感度で検出することに使用することができる。
【符号の説明】
【００５１】
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３ ＳＰＲチップ
Ｌ１ 入射光
Ｌ２ 反射光
１１ 基板
１２ 金膜
１３ 微粒子
２０ 金黒チップ
２１ 基板
２２ 金膜
２３ 微粒子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を透過する光透過性素材によって形成された基板と、
該基板表面に形成された金属膜とを備えており、
前記金属膜に対して前記基板側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に、金属黒が形成されている
ことを特徴とする表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項２】
前記金属膜の表面に前記金属黒が形成されている
ことを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項３】
前記金属黒が形成された金属黒チップを備えており、
前記金属黒チップは、前記金属黒が前記金属膜に対向するように設置されている
ことを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項４】
前記金属黒は金黒である
ことを特徴とする請求項１、２または３記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項５】
前記金属黒の表面に被検物質と結合する固定化物質が固定されている
ことを特徴とする請求項１、２、３または４記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項１】
光を透過する光透過性素材によって形成された基板と、
該基板表面に形成された金属膜とを備えており、
前記金属膜に対して前記基板側から光を照射したときに発生するエバネッセント場の影響が及ぶ範囲内に、金属黒が形成されている
ことを特徴とする表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項２】
前記金属膜の表面に前記金属黒が形成されている
ことを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項３】
前記金属黒が形成された金属黒チップを備えており、
前記金属黒チップは、前記金属黒が前記金属膜に対向するように設置されている
ことを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項４】
前記金属黒は金黒である
ことを特徴とする請求項１、２または３記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項５】
前記金属黒の表面に被検物質と結合する固定化物質が固定されている
ことを特徴とする請求項１、２、３または４記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図８】
【図９】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図８】
【図９】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−８３１８５（Ｐ２０１２−８３１８５Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２９３７６（Ｐ２０１０−２２９３７６）
【出願日】平成２２年１０月１２日（２０１０．１０．１２）
【出願人】（３０４０２８３４６）国立大学法人 香川大学 (285)
【出願人】（３９００００５９４）株式会社レクザム (64)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１２日（２０１０．１０．１２）
【出願人】（３０４０２８３４６）国立大学法人 香川大学 (285)
【出願人】（３９００００５９４）株式会社レクザム (64)
【Ｆターム（参考）】
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