補体系と相互作用する抗微生物剤
感染を処置するための新規方法によって作用する抗微生物治療剤は、天然または非天然アミノ酸あるいは同様の分子を含むペプチドを含んでいてもよい化合物である。薬剤は微生物の表面と結合することができ、膜攻撃複合体の集合を介して微生物の溶解を引き起こすための生産的に補体を固定し、したがって食作用による微生物の除去の引き金となる。薬剤はＴＦＰＩのフラグメント、例えばＣ末端領域由来であり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載の全ての特許、特許出願、オンライン情報および文献は、その全体を参照により本明細書の一部とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
微生物感染は広範な微生物、例えば細菌、真菌およびウイルスによって引き起こされ、即刻の処置を必要とする軽度乃至生命の危険がある疾患をもたらす。一般的な細菌感染には、肺炎、耳感染、下痢、尿路感染および皮膚障害が含まれる。一般的なウィルス感染には、インフルエンザＡおよびＢ、呼吸器合胞体ウイルス、Ｃ型肝炎および水疱瘡が含まれ、一般的な真菌感染には皮膚障害が含まれる。微生物感染の処置に有効な方法および／または現在のこれらの感染の処置法を改善する必要は当該技術分野において継続して存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の詳細な説明
本出願は感染を処置するための新規方法によって作用する抗微生物治療剤を説明する。治療剤は天然もしくは非天然アミノ酸を含むペプチド、または小分子を含んでいてもよい化合物である。剤は細胞外微生物、例えば細菌、真菌またはウイルス感染細胞に対して有効である。微生物は原核細胞、真核細胞または単細胞である。治療剤は微生物の表面に結合し、そして補体系の成分と相互作用して微生物を殺すことによって作用することができる。１つの態様において、治療剤は補体系の成分と相乗的に相互作用して微生物を殺す。他の態様において治療剤は微生物の表面に結合し、そして微生物をオプソニン化するために補体を生産的に固定する。さらなる態様において、治療剤は微生物の表面に結合し、そして膜攻撃補体（ＭＡＣ）の集合体によって微生物の溶菌を引き起こすために補体を生産的に固定する。これは食作用による微生物の除去を引き起こす。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
かくして本発明は、微生物表面と結合し、微生物を殺すために動物中に存在する補体系の成分（例えばＣ１ｑ成分）と相互作用する、補体系を有する動物における微生物感染の処置用化合物を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
化合物はオプソニン化し、および／または微生物の溶菌を引き起こすことができる。
【０００６】
化合物は動物中に存在する補体系の成分、例えばＣ１ｑと相乗的に作用することができる。したがって、化合物の抗微生物効果は、補体系成分が存在するほうがそれらが存在しないときよりもより大きい。好ましくは、化合物の抗微生物効果はペプチド単独および補体系成分単独の効果を合わせたものよりも大きい。
【０００７】
具体的な興味のある化合物は、以下に詳述する組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）に由来する。さらに、化合物はスクリーニング法によって、例えば補体成分の存在下および不在下で化合物の抗微生物効果を比較することによって、同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログ
ＴＦＰＩは強力な抗凝血剤であり、抗炎症性活性を有する（文献１）。ＴＦＰＩは例えば腫瘍と関連する血管形成を阻害するために使用することができる（文献２）。
【０００９】
タンパク質は複数の主要ドメインを有する：３種のＫｕｎｉｔｚタイプのセリンプロテアーゼ阻害ドメイン（Ｋ１、Ｋ２およびＫ３）、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、およびＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）。Ｋ１ドメインは凝固因子ＶＩＩａ−組織因子（ＴＦ）複合体を阻害する。Ｋ２ドメインは因子Ｘａを阻害する。したがって、セリンプロテアーゼはＫ３と関連しないと考えられていたが、近年の研究ではＴＦＰＩを細胞表面上のＧＰＩ結合受容体（CPI anchored receptor）に結合させる機能を有することが示唆されている（文献３）。ＣＴＤはまた、細胞結合、ヘパリン結合および最適Ｘａ阻害に関与する。
【００１０】
「ＴＦＰＩ」は、本明細書において使用するとき、配列番号１に示す２７６アミノ酸残基、糖なしで約３８，０００ダルトンの分子量を有する成熟セリン糖タンパク質を意味する。天然タンパク質は、糖が存在するとき約４５，４００ダルトンの分子量を有する（文献４）ＴＦＰＩ ｃＤＮＡのクローニングは文献５に記載されている。本発明で使用するＴＦＰＩは非糖化または糖化であり得る。
【００１１】
「ＴＦＰＩアナログ」は、１個以上、例えば１〜８０個のアミノ酸付加または置換（一般的には、タンパク質の天然および好ましくは非ＫｕｎｉｔｚドメインまたはＣ末端位置において保存的である）、１個以上、例えば１〜８０個のアミノ酸欠失（例えばＴＦＰＩフラグメント）、または１個以上の化学基の１個以上のアミノ酸への添加で修飾したＴＦＰＩの誘導体であり、修飾はＴＦＰＩの生物学的活性を破壊しない。破壊されていない活性には、ＴＦＰＩの抗凝血活性および／またはその抗細菌活性、ならびにそのプロトロンビンアッセイにおける活性が含まれ得る。
【００１２】
好ましくはＴＦＰＩアナログは全３個のＫｕｎｉｔｚドメインを含む。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは糖化または非糖化であってよい。
【００１３】
抗細菌活性を維持するために、ＴＦＰＩアナログがＣＴＤ（この領域が抗細菌活性を有する）を保持することが好ましい。典型的には、ＴＦＰＩのほとんどの下流トロンビン切断部位の実質的に全てのアミノ酸下流を保持していることが好ましい（例えば、配列番号１のアミノ酸２５４の下流では残基２５４と２５５の間をトロンビンが切断する）。組成中ＴＦＰＩアナログ分子の数の少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％、≧９９％、またはそれ以上）がＴＦＰＩのアミノ酸２５４と２５５の間に存在するトロンビン切断部位で切断されるべきではない。
【００１４】
好ましいＴＦＰＩアナログは、Ｎ−Ｌ−アラニル−ＴＦＰＩ（ａｌａ−ＴＦＰＩ）であり、このアミノ酸配列は配列番号２に示す。Ａｌａ−ＴＦＰＩはまた、国際薬剤名「ｔｉｆａｃｏｇｉｎ」として知られている。ａｌａ−ＴＦＰＩのアミノ末端アラニン残基をＥ．ｃｏｌｉ発現の改善のためにＴＦＰＩ配列に設計した（文献６）。内因性ＴＦＰＩは分泌され、そしてシグナルペプチドと発現される。アミノ末端メチオニンはシグナルペプチドの一部であり、成熟ＴＦＰＩの一部ではない。他のＴＦＰＩアナログは文献７に記載されている。ＴＦＰＩアナログは、生物学的活性アッセイによって測定したようにＴＦＰＩの活性の測定法をいくつか有する（例えば、下記文献８および９参照）。
【００１５】
ＴＦＰＩは３つのトロンビン切断部位を有する：（ｉ）Ｌｙｓ ８６とＴｈｒ ８７の間、Ｋ１とＫ２の間；（ｉｉ）Ａｒｇ １０７とＧｌｙ １０８の間（Ｋ２の因子Ｘａに対する反応部位）；および（ｉｉｉ）Ｃ末端塩基領域のＬｙｓ ２５４とＴｈｒ ２５５の間。本発明者らはＴＦＰＩの抗細菌活性がＣＴＤ、とりわけ配列番号１のＬｙｓ ２５４とＴｈｒ ２５５の間のトロンビン切断部位の近位および／または下流領域に存在することを見出した。ＣＴＤを欠く切断ＴＦＰＩは血液アッセイにおいてほとんど活性を有さないため、本発明は例えば部位指定突然変異生成によってこのトロンビン切断部位を除去したＴＦＰＩアナログを提供する。これらのアナログのＣＴＤをトロンビンによって切断することはできず、その抗細菌活性を天然ＴＦＰＩよりも長期間保持することができる分子を得る。
【００１６】
かくして本発明は：（１）天然ＴＦＰＩのＣ末端付近で見出されるトロンビン切断部位を欠くＴＦＰＩアナログ；（２）天然アミノ酸のアミノ酸Ｌｙｓ ２５４とＴｈｒ２５５の間に存在するトロンビン切断部位を欠くＴＦＰＩアナログ；（３）（ｉ）少なくとも１つのＫｕｎｉｔｚドメインおよび（ｉｉ）Ｃ末端領域を含むが、もっともＣ末端側のＫｕｎｉｔｚドメインとＣ末端領域の間にトロンビン切断部位を有さないＴＦＰＩアナログ；（４）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むＮ末端ポリペプチドおよびＫｕｎｉｔｚドメインを含まないＣ末端ポリペプチドを与えるようにトロンビンによって切断され得ないＴＦＰＩアナログ；（５）２個未満（すなわち１または０）のＬｙｓ Ｔｈｒジペプチドを含むＴＦＰＩアナログを提供する。
【００１７】
天然切断部位（Ｌｙｓ Ｔｈｒ）を様々な方法で除去することができる。例えばリシンおよび／またはトレオニンを異なるアミノ酸で置換してトロンビンによって認識されないジペプチドを得ることができる。あるいは、リシンおよび／またはトレオニンを除去することができる。さらに他には、１個以上のアミノ酸をリシンとトレオニンの間に挿入することができる。修飾を行った後、ＴＦＰＩアナログをトロンビンと試験消化でインキュベートして天然Ｃ末端切断がもはや起こらないことを確認することができる。
【００１８】
本発明はまた：（１）Ｋｕｎｉｔｚドメイン３を含むがＣ末端ドメインを欠くＴＦＰＩアナログ；（２）Ｃ末端からアミノ酸をｑ個以下切断したＴＦＰＩであるＴＦＰＩアナログ（ｑは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０である）を提供する。ＴＦＰＩのＣ末端切断は既に報告されているが、これは通常Ｋ３の欠失と組合せである。
【００１９】
ポリペプチド
ＴＦＰＩは３個のトロンビン切断部位を有する：（ｉ）Ｌｙｓ ８６とＴｈｒ ８７の間；（ｉｉ）Ａｒｇ １０７とＧｌｙ １０８の間；および（ｉｉｉ）Ｌｙｓ ２５４とＴｈｒ ２５５の間。本発明者らはＴＦＰＩの抗細菌活性がＣ末端塩基領域、とりわけ配列番号１のＬｙｓ ２５４とＴｈｒ２５５の間のトロンビン切断部位の近くおよび／または下流に存在することを見出した。この部位での切断は抗細菌活性を有し、細菌ＬＰＳに結合することができる２２アミノ酸ペプチド（配列番号３）を解放する。かくして本発明は、抗細菌剤として使用するための、細菌感染の処置法において使用するための、そしてかかる感染の処置用医薬の製造において使用するための、ＴＦＰＩのＣＴＤに基づくペプチドを提供する。本発明はさらに、抗微生物剤として使用するための、微生物感染の処置法において使用するための、そしてかかる感染の処置用医薬の製造において使用するための、ＴＦＰＩのＣＴＤに基づくペプチドを提供する。
【００２０】
したがって本発明は：（１）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ペプチド＃１）；（２）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）；（３）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（存在するとき、配列番号３のＮ末端側のアミノ酸がＬｙｓではない）；（４）配列番号３と少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％、またはそれ以上）同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（配列番号３のアミノ酸の少なくとも１個がＤアミノ酸である）；（６）配列番号３のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩではない）；（７）配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端から少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５またはそれ以上）アミノ酸を含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）を提供する。
【００２１】
抗菌活性はまた、ＴＦＰＩのもっともＣ末端側の残基を含まないがＣＴＤに由来するペプチドにおいて見られる。したがって本発明は、配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。ポリペプチドは（例えば配列番号１の）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログのフラグメント自体であってもなくてもよい。
【００２２】
本発明はまた、配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。ポリペプチドはｍ（例えば配列番号１の）ＴＦＰＩのフラグメント自体であってもなくてもよい。好ましい配列番号６のフラグメントはまた、配列番号５のフラグメントである。
【００２３】
本発明はまた、配列番号１のフラグメントを含むポリペプチド（（ａ）フラグメントは配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４）連続アミノ酸を含み、（ｂ）前記ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）を提供する。
【００２４】
本発明はまた：（１）配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ペプチド＃３）；（２）配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）；（３）配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド（存在するとき、配列番号７のＮ末端側のアミノ酸がＬｙｓではない）；（４）配列番号７と少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％、またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド（配列番号７のアミノ酸の少なくとも１個がＤアミノ酸である）；（６）配列番号７のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）を提供する。
【００２５】
本発明はまた：（１）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）；（３）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（存在するとき、配列番号５のＮ末端側のアミノ酸がＬｙｓではない）；（４）配列番号５と少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％、またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（配列番号５のアミノ酸の少なくとも１個がＤアミノ酸である）；（６）配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）を提供する。
【００２６】
本発明はまた：（１）配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ペプチド＃５）；（２）配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）；（３）配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド（存在するとき、配列番号７のＮ末端側のアミノ酸がＬｙｓではない）；（４）配列番号１０と少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％、またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド（配列番号１０のアミノ酸の少なくとも１個がＤアミノ酸である）；（６）配列番号１０のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）を提供する。
【００２７】
これらのポリペプチドは、好ましくはＬＰＳおよび／または細菌と結合することができる。これらのポリペプチドはまた、病原真菌の細胞壁において見出されるマンノタンパク質と結合することができる。ポリペプチドはまた、ウイルス粒子において見出されるタンパク質と結合することができる。
【００２８】
ポリペプチドは好ましくは、２５０アミノ酸以下（例えば２２５、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６以下または５アミノ酸）からなる。５〜９０アミノ酸からなるポリペプチドが好ましい（例えば５〜８０、５〜７０、５〜６０アミノ酸など）。８〜２５アミノ酸からなるポリペプチドがとりわけ好ましい。
【００２９】
ポリペプチドは好ましくは、少なくとも３アミノ酸（例えば少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または少なくとも５０アミノ酸）からなる。
【００３０】
本発明は式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨ
〔式中：Ａはａアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｃはｃアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｂは配列番号３のアミノ酸配列から少なくともｂ連続アミノ酸のフラグメントであるポリペプチド配列であり、ここでｂは３以上（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）である〕
を有するポリペプチドを提供する。
【００３１】
本発明は式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨ
〔式中：Ａはａアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｃはｃアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｂは配列番号５のアミノ酸配列から少なくともｂ連続アミノ酸のフラグメントであるポリペプチド配列であり、ここでｂは３以上（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）である〕
を有するポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明は式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨ
〔式中：Ａはａアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｃはｃアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｂは配列番号７のアミノ酸配列から少なくともｂ連続アミノ酸のフラグメントであるポリペプチド配列であり、ここでｂは３以上（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４）である〕
を有するポリペプチドを提供する。
【００３３】
本発明は式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨ
〔式中：Ａはａアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｃはｃアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｂは配列番号１０のアミノ酸配列から少なくともｂ連続アミノ酸のフラグメントであるポリペプチド配列であり、ここでｂは３以上（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４）である〕
を有するポリペプチドを提供する。
【００３４】
値ａは一般的に少なくとも１（例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００等）である。値ｃは一般的に少なくとも１（例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００等）である。ａ＋ｃの値は少なくとも１（例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００等）である。ａ＋ｃの値が最大１０００（例えば最大９００、８００、７００、６００、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２）であることが好ましい。
【００３５】
−Ａ−のアミノ酸配列は典型的に、配列番号２の配列−Ｂ−のＮ末端であるａアミノ酸とｍ％未満の配列同一を共有する。−Ｃ−のアミノ酸配列は典型的には、本発明の抗体の配列番号２可変領域（例えば配列番号２）の配列−Ｂ−のＣ末端であるｂアミノ酸とｎ％未満配列同一を共有する。一般的に、値ｍおよびｎはともに６０未満（例えば５０、４０、３０、２０、１０またはそれ未満）である。値ｍおよびｎは互いに同一または異なっていてよい。
【００３６】
本発明の態様において、ポリペプチドは配列番号４からならない、これはＨｅｍｂｒｏｕｇｈらによって文献１０において抗腫瘍および抗血管形成活性を有するが抗細菌活性を有さないと記載されている。
【００３７】
本発明のポリペプチドは配列番号３、５、６、７および１０と同一の配列を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。これらのポリペプチドにはホモログ、オルトログ、対立遺伝子多型および突然変異が含まれる。ポリペプチド間の同一を、好ましくはＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に備えられているＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムによって、ギャップオープンペナルティ＝１２およびギャップエクステンションペナルティ＝１のパラメーターでアファインギャップサーチを使用して測定する。
【００３８】
これらのポリペプチドは、配列番号３、５、６、７および１０と比較して、１個以上（例えば１、２、３、４、５、６等）の連続アミノ酸置換、すなわち関連側鎖を有する他のものでの１アミノ酸置換を含んでいてもよい。遺伝的にコード化アミノ酸は一般に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわちリシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電荷極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはともに芳香族性アミノ酸と分類されることもある。一般に、これらのファミリー内での１アミノ酸置換は生物学的活性に大きな影響がない。さらに、ポリペプチドは標準配列と比較して１個以上（例えば１、２、３、４、５、６等）の１アミノ酸欠失を有し得る。さらに、ポリペプチドには標準配列と比較して１以上（例えば１、２、３、４、５、６等）の挿入を含み得る。
【００３９】
本発明のポリペプチドを様々な方法、例えば化学合成（全体または一部）、プロテアーゼを使用したＴＦＰＩの消化、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物からの（例えば組換え発現からの）精製等によって製造することができる。＜４０アミノ酸長のペプチドの好ましい製造法にはインビトロ化学合成が含まれる（文献１１、１２）。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学に基づく方法（文献１３）のような固相ペプチド合成がとりわけ好ましい。酵素的合成（文献１４）はまた、一部または全体で使用することができる。化学合成に代えて、生物合成を使用することができる、例えばポリペプチドを翻訳によって製造することができる。これはインビトロまたはインビボで行うことができる。生物学的方法は、一般にＬ−アミノ酸を利用したポリペプチドの生産に限定されるが、翻訳機構の操作（例えばアミノアシルｔＲＮＡ分子の）を使用してＤ−アミノ酸（または他の非天然アミノ酸、例えばヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニン等）の導入を行うことができる（文献１５）。しかし、Ｄ−アミノ酸が含まれる場合、化学合成を使用することがこの好ましい。本発明のポリペプチドはＣ末端および／またはＮ末端に共有結合修飾を有することがある。
【００４０】
本発明のポリペプチドは様々な形態（例えば天然、融合、糖化、非糖化、脂質化、非脂質化、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化、非ミリストイル化、モノマー、マルチマー、粒子、変性等）を取り得る。
【００４１】
本発明のポリペプチドは好ましくは、純粋または実質的に純粋な、すなわち実質的に他のポリペプチドを含まない（例えば天然由来のポリペプチドを含まない）形態で提供され、そして一般的に少なくとも約５０％（重量）純粋、および通常少なくとも約９０％純粋であり、すなわち約５０％未満、より好ましくは約１０％未満（例えば５％未満）の組成が他の発現ポリペプチドである。
【００４２】
本発明のポリペプチドは固体支持体に結合し得る。本発明のポリペプチドは検出可能なラベル（例えば放射性または蛍光ラベル、またはビオチンラベル）を含み得る。
【００４３】
「ポリペプチド」なる用語は任意の長さのアミノ酸ポリマーを意味する。ポリマーは直鎖、分枝鎖または環状であり得て、それは修飾アミノ酸を含んでいてもよく、そしてそれは非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、天然または介入によって；例えば、ジスルフィド結合形成、糖化、脂質化、アセチル化、リン酸化またはあらゆる他の操作または修飾、例えばラベリング成分との共役によって修飾されているアミノ酸ポリマーを含む。また、この定義に含まれるものは例えば、１個以上のアミノ酸のアナログ（例えば非天然アミノ酸等が含まれる）ならびに当業者に既知の他の修飾を含むポリペプチドである。ポリペプチドは一本鎖または関連鎖として存在し得る。
【００４４】
本発明は１以上の配列−Ｘ−Ｙ−または−Ｙ−Ｘ−または−Ｘ−Ｘ−（式中、−Ｘ−は上記定義のアミノ酸配列であり、そして−Ｙ−は上記定義の配列ではない）を含むポリペプチドを提供する、すなわち本発明は融合タンパク質を提供する。例えば本発明は、−Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｙ２−、またはＸ１−Ｘ２−Ｙ１または−Ｘ１−Ｘ２−等を提供する。本発明の１つの態様において、Ｙは例えば配列番号１４または１５に見られるようなＮ末端リーダー配列である。さらなる態様においてＹは配列番号１６または１７に見られるようなＣ末端Ｔヘルパー配列である。
【００４５】
本発明は本発明のポリペプチドを生産するための方法であって、本発明の宿主細胞をポリペプチド発現を誘導する条件下で培養することを含む方法を提供する。
【００４６】
本発明は本発明のポリペプチドを生産するための方法であって、ポリペプチドを一部または全部化学的方法を使用して合成することを含む方法を提供する。
【００４７】
Ｃ末端ポリぺプチドとＴＦＰＩの組合せ
ＴＦＰＩは抗凝固作用を有し、それはまた潜在的に有害な内毒素シグナル伝達を妨害する。さらに、本明細書に記載のとおり、それはＣ末端ドメインによって媒介される抗微生物効果、例えば抗細菌効果を有する。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの抗真菌効果を増強するため、ＴＦＰＩ（またはＴＦＰＩアナログ）を上記定義のＴＦＰＩのＣ末端に由来するポリペプチドと共に投与することができる。あるいは、またはさらに、上記定義のＴＦＰＩのＣ末端に由来するポリペプチドの抗微生物効果を増強するために、それらをＴＦＰＩおよび／またはＴＦＰＩアナログと共に投与することができる。
【００４８】
したがって本発明は：（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、および本発明の抗微生物ポリペプチドを含む医薬組成物；（２）同時、個別または逐次投与のためのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、および本発明の抗微生物ポリペプチド；（３）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、および本発明の抗微生物ポリペプチドの同時、個別または逐次投与を含む患者の処置法；（４）本発明の抗微生物ポリペプチドの投与を受けた患者にＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを投与することを含む患者の処置法；（４）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与を受けた患者に本発明の抗微生物ポリペプチドを投与することを含む患者の処置法を提供する。抗微生物は好ましくは抗細菌である。
【００４９】
したがって本発明は：（１）本発明の抗微生物ポリペプチド、およびＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む医薬組成物；（２）同時、個別または逐次投与のための本発明の抗微生物化合物、およびＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ；（３）本発明の抗微生物化合物、およびＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの同時、個別または逐次投与を含む患者の処置法；（４）本発明の抗微生物化合物の投与を受けた患者にＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを投与することを含む患者の処置法；（４）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与を受けた患者に本発明の抗微生物化合物を投与することを含む患者の処置法を提供する。
【００５０】
これらの組合せで使用されるＴＦＰＩアナログには、Ｃ末端由来抗微生物ポリペプチドまたは抗細菌ポリペプチドが含まれるか、または欠く。したがってＴＦＰＩは、上記の通り、ｑ以下のＣ末端を欠く。
【００５１】
薬剤設計およびペプチド模倣物
本発明のポリペプチドはそれら自体が抗微生物剤として有用である。しかし、それらは抗微生物学的活性を（一般的にまたは特異的に）改善するために、またはバイオアベイラビリティー、毒性、代謝性、薬物動力学等のような薬理学的に重要な特徴を改善するために精錬され得る。ポリペプチドはしたがって、さらなる研究および精錬のためのリード化合物として使用され得る。
【００５２】
本発明のポリペプチドはペプチド模倣物分子を設計するために使用することができる（文献１６〜２１）。ペプチド模倣物技術はトロンビン阻害剤の設計に成功裏に使用された（文献２２、２３）。これらは典型的には、本発明のポリペプチドに対して等比体積であるが、それらのペプチド結合の１個以上を欠く。例えば、重要なアミノ酸副鎖を保持したままペプチド主鎖を非ペプチド主鎖で置換することができる。ペプチド模倣物分子には糖アミノ酸が含まれ得る（文献２４）。ペプトイドを使用することができる。
【００５３】
ペプチド模倣物分子の設計を補助するため、ファーマコフォア（すなわち活性に関する具体的な特徴を発現する化学的特徴および３Ｄ制約）をペプチドについて定義することができる。ファーマコフォアには好ましくは、表面アクセス可能な特徴、より好ましくは水素結合ドナーおよびアクセプター、荷電／イオン化基、および／または疎水性パッチを含む。これらは活性の付与における相対的な重要度に基づいて重み付けをすることができる（文献２５）
【００５４】
ファーマコフォアをＣＡＴＡＬＹＳＴ（ＨｙｐｏＧｅｎまたはＨｉｐＨｏｐを含む）、ＣＥＲＩＵＳ２のようなソフトウェアを使用するか、または本発明のポリペプチドの既知のコンホメーションから手で構成することによって決定することができる。ファーマコフォアを使用して、ＣＡＴＡＬＹＳＴのようなプログラムを使用して構造ライブラリをスクリーニングすることができる。受容体と相互作用する化学基と最大の空間的一致を得る構造データベースにおける候補分子の方向を調査するＣＬＩＸプログラムを使用することもできる。
【００５５】
結合表面またはファーマコフォアを官能基（例えばプロトン、ヒドロキシル基、アミン基、疎水性基）または小分子フラグメントの好ましい相互作用位置をマッピングするために使用することができる。対応する官能基が本発明のポリペプチドと実質的に同じ空間的関係に位置する化合物を新規に設計することができる。
【００５６】
官能基は正しいサイズおよび構造を有する架橋フラグメントまたは官能基を好ましい方向に支持するフレームワークを使用して一つの化合物に結合することができ、したがって本発明のペプチド模倣物化合物を提供する。この方法での官能基の結合を手作業で行うことができるので、おそらくＱＵＡＮＴＡまたはＳＹＢＹＬのようなソフトウェアの助けによって、自動または半自動新規設計アプローチを使用することもできる、例えば：
−ＭＣＳＳ／ＨＯＯＫ（文献２６、２７）、これは複数の官能基をデータベースから得た分子テンプレートと結合する。
【００５７】
−ＬＵＤＩ（文献２８）、これは理想的にはリガンドによって満たされる相互作用のポイントを計算し、受容体と相互作用するそれらの能力に基づいて結合部位にフラグメントを位置させ、そしてそれらをリガンドを製造するために連結する。
【００５８】
−ＭＣＤＬＮＧ（文献２９）、これは受容体結合部位を一般原子の最密充てん配置で満たし、そして原子タイプ、位置、結合配列および他の特徴をランダムに変化させてＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ法を使用する。
【００５９】
−ＧＲＯＷ（文献３０）これは最初の“種”フラグメント（手動または自動で置く）で開始してリガンドを外側へ成長させる。
【００６０】
−ＳＰＲＯＵＴ（文献３１）、このセットには：結合ポケット中の好ましい水素結合および疎水性領域を同定するモジュール（ＨＩＰＰＯモジュール）；構造生成のための出発フラグメントを形成するため、標的部位で官能基およびそれらの位置を選択するモジュール（ＥｌｅＦＡｎＴ）；増殖スペーサーフラグメントによって出発フラグメントでの結合ポケットの立体障害を満たす骨格を生成し、得られた部分骨格を結合するモジュール（ＳＰＩＤｅＲ）；ヘテロ原子を骨格に置換して受容体部位のものと相補的な静電気的特徴を有する分子を生成するモジュール（ＭＡＲＡＢＯＵ）が含まれる。解をＡＬＬｉｇａＴＯＲモジュールを使用して集合させ、採点することができる。
【００６１】
−ＣＡＶＥＡＴ（文献３２）、これは結合ユニットを設計して非環式分子を抑制する。
【００６２】
−ＬＥＡＰＦＲＯＧ（文献３３）、これは小さい段階的な構造の変化を作成し、新規化合物の結合エネルギーを速やかに評価することによってリガンドを評価する。変化は結合エネルギーの変化に基づいて継続または廃棄され、そして構造は受容体との相互エネルギーを増加させ続ける。
【００６３】
−ＧＲＯＵＰＢＵＩＬＤ（文献３４）、これは一般的な有機テンプレートのライブラリーおよびリガンドと受容体間の非結合相互作用の完全な経験的力場の描写を使用して、化学的に合理的な構造を有し、かつ受容体結合部位に立体的および静電気的に相補的特徴を有するリガンドを構築する。
【００６４】
−ＲＡＳＳＥ（文献３５）
【００６５】
これらの方法は関連化合物を同定する。これらの化合物を新規に設計することができ、既知の化合物であり得て、または既知の化合物に基づくものであり得る。化合物はそれ自体有用であってもよく、またはそれらは、結合親和性または他の薬理学的に重要な特徴（例えばバイオアベイラビリティー、毒性、代謝性、薬物動力学等）を改善するためのさらなる医薬的精錬に使用することができるプロトタイプ（すなわちリード化合物）であり得る。
【００６６】
個々に有用な化合物同様、構造ベース設計技術によってｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計されたペプチド模倣物も“伝統的な”ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法のための化合物ライブラリーを示唆するために使用することができる。リガンドにおいて重要な医薬的主題を同定し、抗微生物学的活性についてスクリーニングするための化合物ライブラリ（例えばコンビナトリアルライブラリ）において模倣することができる。
【００６７】
本発明は：（ｉ）これらの薬剤設計法を使用して同定された化合物；（ｉｉ）医薬として使用するための、これらの薬剤設計法を使用して同定された化合物（ｉｉｉ）抗細菌のような抗微生物剤の製造における、これらの薬剤設計法を使用して同定された化合物の使用；および（ｉｖ）細菌のような微生物感染を有する患者の処置法であって、有効量のこれらの薬剤設計法を使用して同定された化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００６８】
治療法および組成物
本発明は：（ａ）本発明の化合物、ポリペプチド、および／またはペプチド模倣物；および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本発明の組成物は微生物感染を発症する危険があるかまたは有すると診断された患者の処置に、あるいは患者の１人または群の、感染を重度の感染に進行させる危険を低減するために使用する。
【００６９】
成分（ａ）は組成物の有効成分であり、そしてこれは治療上有効量、すなわち患者内での微生物の増殖および／または生存を阻害するのに有効な量、および好ましくは微生物感染を削除するのに有効な量で存在する。正確な患者にとって有効な量は、体格および健康状態、感染の性質および程度、および投与に選択する組成物または組成物の組合せに依存する。有効量を通常の実験によって決定することができ、医師の判断のうちである。本発明の目的のために、有効な投与量は一般的に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。ポリペプチドを利用した医薬組成物は、当該技術分野で既知である。ポリペプチドは塩形および／またはエステルの組成物を含み得る。
【００７０】
「薬学的に許容される担体」には、それ自体組成物を投与される固体に有害な抗体の生産を誘導しないあらゆる担体が含まれる。適当な担体は、典型的には、巨大な、緩やかに代謝されるマクロ分子、例えばタンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ショ糖、トレハロース、ラクトースおよび脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）である。かかる担体は当業者に周知である。
【００７１】
医薬組成物を当該技術分野で既知の方法で投与することができる。これには、限定されないが、局所投与および静脈内、エアロゾル、皮下、および筋肉内経路が含まれていてよい。医薬組成物を１個の用量または複数用量で得ることができる。
【００７２】
微生物感染は、１種の微生物で、または複数種の微生物であり得る。２種以上の細菌、ウイルスまたは真菌のいずれかによる感染の組合せであり得る。微生物感染が細菌からもたらされるとき、それはグラム陽性菌および／またはグラム陰性菌であり得る。典型的な重度の感染に関与するグラム陰性菌には、Escherichia coli、Bacteroides fragilis、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella種、Enterobacter種、およびProteus種が含まれる。典型的な重度の感染に関与するグラム陽性には、Streptococcus Pneumoniae、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Enterococcus種、Streptococcus agalactiaeおよびStreptococcus pyogenesが含まれる。重度の真菌感染には、Candida albicans、Candida glabrata、Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Cryptococcus neoformansおよびFusarium種が含まれる。ウィルス感染はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペス、ヒト乳頭腫ウイルス、肝炎ウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、インフルエンザ、およびヒトＴ細胞白血病ウイルスが関与し得る。寄生原虫感染は、Trypanosoma cruzi、およびLeishmania、Giardia、EntamoebaおよびPlasmodium種が関与し得る。
【００７３】
微生物感染には例えば、肺炎、耳感染、下痢、尿路感染、皮膚障害、局所および粘膜ならびに播種性侵襲性真菌感染が含まれる。
【００７４】
本発明の組成物はさらに、とりわけ複数の投与フォーマットにパッケージされているとき、さらなる抗菌剤を含んでいてもよい。
【００７５】
本発明はまた、微生物感染を発症する危険があるか、または有すると診断された患者の処置用医薬の製造における本発明の化合物およびポリペプチドの使用を提供する。
【００７６】
処置に好ましい患者は子供（例えば幼児または乳児）、１０代および大人を含むヒトである。
【００７７】
一般
「含む」なる用語は、「含んでいる」および「からなる」を包含し、例えばＸを「含む」組成物は排他的にＸからなることもあり、あるいは別のものを含む、例えばＸ＋Ｙであり得る。
【００７８】
数値ｘに関する「約」なる用語は例えばｘ±１０％を意味する。必要であれば、用語「約」を削除することができる。
【００７９】
「実質的」なる用語は、「完全な」を排除しない、例えばＹを「実質的に含まない」組成物はＹを完全に含まなくてもよい。必要であれば、「実質的」なる用語を本発明の定義から削除することができる。
【００８０】
配列の同一割合はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムを使用して、ギャップオープンペナルティーを１２、そしてギャップエクステンションペナルティを２、ＢＬＯＳＵＭマトリックスを６２としてアフィンギャップサーチを使用して、決定することができる。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムは文献３６に記載されている。
【００８１】
上記のとおり、本発明の核酸およびポリペプチドには以下の配列が含まれ得る：
（ａ）配列表に記載の配列と同一（すなわち同一率１００％）のもの；
（ｂ）配列表に記載の配列と同一の配列を共有するもの；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と比較して、離れた位置または連続して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の１ヌクレオチドまたはアミノ酸置換（欠失、挿入、置換）を有するもの；および
（ｄ）対アラインメントアルゴリズムを用いて配列表から特定の配列を整列させたとき、最初（Ｎ末端または５’）から終わり（Ｃ末端または３’）まで移動するｘモノマー（アミノ酸またはヌクレオチド）の移動窓を、（ｐ＞ｘのとき）ｐモノマーに伸長するアラインメントについてｐ−ｘ＋１が当該窓に存在するように、各窓が少なくともｘ・ｙ同一整列モノマーを有する：ここでｘは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０から選択され、ｙは０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され；そしてｘ・ｙが整数ではないときそれは最も近い整数に切り上げる。好ましい対アラインメントアルゴリズムは初期パラメーター（例えばＧａｐオープニングペナルティ＝１０．０、およびＧａｐエクステンションペナルティ＝０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２をスコアするマトリックスを使用する）を用いたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム（文献３７）である。このアルゴリズムは簡便には、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルツールで実行される。
【００８２】
本発明の核酸およびポリペプチドはさらに、これらの配列（ａ）〜（ｄ）のＮ末端／５’および／またはＣ末端／３’にさらなる配列を有し得る。
【００８３】
「微生物性」および「微生物」なる用語は、細菌、ウイルスおよび真菌を含む全ての微生物を包含する。
【００８４】
「動物」なる用語はヒトを含むあらゆる動物界のメンバーを意味する。本発明の化合物は補体系を有する動物に有用である。
【００８５】
本発明の実施には、別段の指示がない限り、当該技術分野に含まれる常套の化学的、生物学的、分子生物学的、免疫学的、および薬学的方法を使用する。かかる技術は文献に十分に説明されており、例えば文献３９〜４６等を参照する。
【００８６】
補体系は、標的細胞の細胞膜を破壊することによって、またはオプソニン化を増加させることによって微生物性病原を生物から排除する手助けをする、免疫系の生化学カスケードである。古典的な補体経路はＣ１複合体（Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓからなる）の活性化によって開始される。活性化にはＣ１ｑ分子のコンホメーション変化を含んでいてもよく、これはＣ１ｒセリンプロテアーゼ分子の活性化および続くＣ１ｓの切断を導く。得られたＣ１複合体はＣ２およびＣ４に結合し、Ｃ２ｂおよびＣ４ｂを切断によって製造することができる。別の補体経路は直接病原の表面でのＣ３加水分解によって開始される。レクチン補体経路は古典的な経路と類似であるが、オプソニン、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）およびフィコリンをＣ１ｑの代わりに有する。補体の細胞溶解最終生成物はＣ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９からなる膜攻撃複合体（ＭＡＣ）である。ＭＡＣは標的細胞の浸透溶解を引き起こす膜透過チャンネルを形成する。本発明の化合物は補体またはＣ１ｑのようなその成分と相互作用することができる。
【００８７】
図面の簡単な説明
図１はタンパク質分解性消化ＴＦＰＩの全血中での細菌殺傷活性を示す。ＴＦＰＩをプラスミン、トロンビン（１Ａ）、エラスターゼ（１Ｂ）またはカテプシンＧ（１Ｃ）でタンパク質分解した。カテプシンＧでタンパク質分解したＴＦＰＩは、カテプシンＧ単独または全ＴＦＰＩと比較して最も高い抗菌活性を示した。
【００８８】
図２はタンパク質分解のインキュベーション時間の増加が抗細菌活性の上昇をもたらすことを示す。２Ａは時間に対するタンパク質分解消化物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示し、２Ｂは消化物の抗細菌活性の上昇を示す。２Ｃは殺傷がカテプシンＧによるものではないことを示す。
【００８９】
図３は消化によって生じた主要なプロトリティック（protolytic）フラグメントを示す。ＴＦＰＩをカテプシンＧで消化し、ゲルろ過フラクションを回収した。
【００９０】
図４はＴＦＰＩタンパク質分解後ゲルろ過フラクションの抗細菌活性を示す。
【００９１】
図５はゲルろ過を１ＭのＮａＣｌの存在下で行ったときのゲルろ過フラクションを示す。
【００９２】
図６は脱塩後１Ｍ ＮａＣｌゲルろ過フラクションを示し（６Ａ）、そしてカラムからの抗細菌活性の快復を示す（６Ｂ）。６Ｃは６Ａに示した純粋なＴＦＰＩフラグメントの抗細菌活性を示す。
【００９３】
図７はＮ末端配列および抗細菌活性を有するゲルろ過フラクションのバンドからの質量分析について選択したペプチドを示す。
【００９４】
図８は抗細菌活性が活性な補体に依存することを示す。８Ａおよび８Ｂは熱不活性化あるいは血漿（Ａ）または血清（Ｂ）によって殺傷活性が減少することを示す。８Ｃはコブラ毒因子によっても殺傷活性が減少することを示す。８Ｄは血清中のペプチドの殺傷活性が全血におけるそれと類似していることを示す。
【００９５】
図９は古典的な補体経路がＴＦＰＩペプチドの抗細菌活性に必須であることを示す。
【００９６】
図１０は蛍光ラベルペプチドの細菌への結合を示し、そして結合がヘパリンの存在によって阻害されることを示す。図１０Ａ−１０Ｄは１０００×、蛍光；図１０Ｅ−１０Ｈは１０００×、白色光である。
【００９７】
図１１はＴＦＰＩの抗細菌活性にとってＴＦＰＩのＣ末端領域の重要性を示す。
【実施例】
【００９８】
実施例
本発明はとりわけ有利な態様を記載している下記実施例の説明によって例示する。しかし、これらの態様は例示であって、いかなる方法においても本発明を限定するように構成されていない。
【００９９】
下記実施例において、全ての外来性ＴＦＰＩはＴＦＰＩアナログ、ａｌａ−ＴＦＰＩである。
【０１００】
実施例１． タンパク質分解性ＴＦＰＩの抗菌効果
実験Ｉ
ＴＦＰＩをα−トロンビン、プラスミン、エラスターゼおよびカテプシンＧと、１０％血液中でインキュベートし、下記のとおり大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７に対する細菌殺傷活性について試験した。組換えＴＦＰＩ ５μＭ（別段の指示がない限り）をプラスミン（１００ｎＭ、レーン３）およびα−トロンビン（１００ｎＭ、レーン７；１μＭ、レーン８）（Ａ）、エラスターゼ（１００ｎＭ、レーン３および４）（Ｂ）、ならびにカテプシンＧ（１００ｎＭ、レーン４；１μＭ、レーン５、６および７）と、（Ｃ）全体積１８０μｌで処理した。ＴＦＰＩを含む反応物をフェノールレッドなしＲＰＭＩ １６４０、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５（ＲＰＭＩ）、４０μｌ ＰＢＳ中３０００ＣＦＵ 大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７および２０μｌ ＲＰＭＩ中希釈酵素で希釈した。体積をＲＰＭＩで調節した。サンプルを１５〜３０分間プレインキュベートした後、最終体積２００μｌまで抗凝固剤を含まない新鮮な血液を加えた。対照はＲＰＭＩ中１０％血液、ＴＦＰＩ １、２および５μＭ、およびそれぞれの濃度で酵素のみであった。サンプルを４時間、３７℃で５％ＣＯ２と湿潤インキュベーター中でインキュベートし、連続希釈物をＴｒｙｐｔａｓｅ大豆カンテンプレートに播種した。細菌コロニー数を、一晩３７℃でインキュベーション後に測定した。全実験条件は２連で行う。データは平均のコロニー数を示す。
【０１０１】
実験ＩＩ
ＴＦＰＩをカテプシンＧを使用してタンパク質分解的に消化し、下記の通り１０％血液の存在下での大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７に対する細菌殺傷活性について試験した。製剤バッファー（３００ｍＭ Ｌ−アルギニン、５ｍＭ メチオニン、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）中１０ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩ（１．２ｍｇ）をカテプシンＧ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中）１０μＭで処理し、１μｌおよび１８μｌのアリコートを５日にわたって取った。１μｌアリコートを１０〜２０％グリシンゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で分析した。
【０１０２】
図２Ａに示すとおり、５日間ＴＦＰＩのカテプシンＧでのインキュベーションは部分消化をもたらした（M, Prestained Standard; S, start of digestion）。
【０１０３】
１８μｌのアリコートを１０μＭ ＴＦＰＩに、４４５μｌのフェノールレッドなしＲＰＭＩ １６４０、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５（ＲＰＭＩ）で希釈し、４０μｌ ＰＢＳ、１０％非凝固血液中３０００ＣＦＵ 大腸菌を含む２００μｌの反応物中５μＭの最終濃度でアッセイし、ＲＰＭＩで最終体積に調節した。陰性対照はＲＰＭＩ中１０％血液、ＴＦＰＩ ５μＭおよびカテプシンＧ ４００ｎＭであった。抗凝固剤を含まない血液を新たに抜き取り、最終成分として反応物に加えた。サンプルを上記の通り操作した。
【０１０４】
図１および２に示すとおり、消化したＴＦＰＩは細菌増殖を阻害し、時間に対して活性が増加した。カテプシンＧおよび未消化ＴＦＰＩは同様の活性を示さなかった。したがって、ＴＦＰＩのフラグメンテーションは新規活性の解放をもたらす。
【０１０５】
実験ＩＩＩ
ＴＦＰＩタンパク質分解性フラグメントの活性領域を定義するために、ＴＦＰＩを分取スケールで消化し、下記のとおりＲＰＭＩ中ゲルろ過に供した。ＴＦＰＩ（１２ｍｇまたは２３ｍｇ）を上記の通りカテプシンＧで２日間消化し、平行サンプルをHiload Superdex 30 16/60カラムでＲＰＭＩ中、あるいは最終濃度１Ｍとなるように固体として加えたＮａＣｌを含むＲＰＭＩ中で、ゲルろ過によって分画した。１ｍｌ分画を回収し、１６％トリシンゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分析した。
【０１０６】
図３および５はＲＰＭＩおよび１Ｍ ＮａＣｌを含むＲＰＭＩでそれぞれ得られた分離物を示す。図３と図５を比較すると理解できるように、フラグメント１〜フラグメント３の改善された分離物が１Ｍ ＮａＣｌ中で得られ、フラグメント２が１Ｍ ＮａＣｌ中フラクションの定義の数中のみで溶出する。
【０１０７】
分画を下記の通り細菌殺傷活性について試験した：ＲＰＭＩ中ゲルろ過に由来する分画のアリコート １００μｌを、上記の通り反応物 ２００μｌに直接加え、細菌コロニーの増殖に対する効果をアッセイした。１Ｍ ＮａＣｌを含む分画を、１ＫＤａのカットオフを有するＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓを使用してＲＰＭＩ中で約１５５ｍＭのＮａＣｌ、および６００μｌの分画サイズに脱塩した。図６Ａに示すものは１Ｍ ＮａＣｌ中ゲルろ過に由来する分画である。アリコート ２５μｌまたは１００μｌの分画を上記の通り反応物 ２００μｌに加えて、細菌生存に対する効果をアッセイした。
【０１０８】
図４から理解できるとおり、ＲＰＭＩ中でゲルろ過した後、アッセイした全分画は細菌殺傷アッセイにおいてごくわずかな活性のみを示す。対照的に、図６Ｂに示すとおり、１Ｍ ＮａＣｌ中ゲルろ過に由来する分画のいくつかは強力な細菌殺傷活性を示す。最高の活性は分画２１および２２において見られる。分画２７および２８は高濃度で加えたとき（４倍増加分画体積）弱い活性を示した。このデータは消化したＴＦＰＩは抗菌活性を含むことを示す。
【０１０９】
実験ＩＶ
図６Ａに示したフラグメント１、２および３をさらに精製した。簡潔に述べると、Ｍｏｎｏ−Ｓカラムを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ中０．５Ｍ〜１Ｍ ＮａＣｌグラジエント、ｐＨ７でのカチオン交換のために使用して、フラグメント１および２を精製した。Ｍｏｎｏ−Ｑカラムを５０ｍＭ〜１Ｍ ＮａＣｌグラジエントでのアニオン交換のために使用してフラグメント３を精製した。１ｍｌの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で上記の通り分析した。精製フラグメントを上記の通りＲＰＭＩにバッファー交換し、細菌殺傷活性についてアッセイした。
【０１１０】
図６Ｃに示すとおり、ＴＦＰＩのＣ末端由来の精製したフラグメントは細菌殺傷活性を有する。低濃度（１：２希釈）のフラグメント１（ａａ１６１／１６５−２７６と同定；レーン１、２、３）は低い活性レベルを示した。フラグメント２（１８３−２６９／２７６と同定、レーン４）はフラグメント１（レーン２、比較ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって決定）と同じ濃度で同様の活性を示す。フラグメント３（ａａ１−９０と同定）は活性がない。
【０１１１】
実施例２． ＴＦＰＩタンパク質分解性フラグメントのＮ末端配列決定
【０１１２】
生物学的に活性なフラグメントの分子同一性を同定するために、ゲルろ過分画２１、２３および２５に由来する特定のタンパク質分解性バンドを単離し、下記のとおりＮ末端配列決定に供した。分画のアリコートを１６％トリシンゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離し、１０ｍＭ ＣＡＰＳ、１０％メタノール、（ｐＨ１１）中でＰＶＤＦ膜にブロッティングした。膜を４０％ メタノール中０．０２５％ Coomassie Brilliant Blue Gで１分間染色し、５０％メタノールの複数回交換で３０分間脱染色し、興味のあるバンドを図７の箱に記載の通りに切り出した。質量分析をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを使用してこれらの分画に対して行った。
【０１１３】
Ｎ末端配列決定の結果は、抗細菌活性を有する分画はＴＦＰＩのＣ末端領域に由来するフラグメントを含んでいることを示した。結果は下記の通りである：分画２１のＮ末端配列決定によって同定した主要な種はアミノ酸１６１および１６５で開始しており、分画２３はアミノ酸１で開始しており、そして分画２５ではアミノ酸１８３で開始している。これらの結果および質量分析によって同定した種を要約する。
【０１１４】
示した結果を合わせて考えると、活性な分画中の主要なタンパク質種はＴＦＰＩのＣ末端ドメインに由来し、アミノ酸１６１−２６９、アミノ酸１６５−２６９、アミノ酸１８３−２７６およびアミノ酸１８３−２６９を含む。ＴＦＰＩのＮ末端に由来するフラグメント（アミノ酸１−９０）はまた、同じ分画中で見出されるが不活性である。
【表１】
【０１１５】
実施例３： ＴＦＰＩのＣ末端領域の重要性
ＬＰＳの存在下でＩＬ−６分泌を誘導するＴＦＰＩの能力を、ＴＦＰＩならびに（ｉ）ＴＦＰＩの１〜１６１残基を有するＴＦＰＩ１−１６１；（ｉｉ）変異Ｋ１を有するＴＦＰＩ；（ｉｉｉ）変異Ｋ２を有するＴＦＰＩ；（ｉｖ）変異Ｋ１およびＫ２を有するＴＦＰＩを含むＴＦＰＩアナログを使用して試験した。
【０１１６】
希釈し、新たに採血した全血をグラム陰性菌の細胞壁由来のＬＰＳとインキュベートすると、サイトカインカスケードが数時間以内に誘導される。図１１ａに示すとおり、Ｋ２ドメインまたは１６２〜２７６アミノ酸（Ｃ末端ドメインを含む領域）の欠失はＩＬ−６分泌誘導能の喪失をもたらす。このことから、Ｋ２ドメインおよびＴＦＰＩのＣ末端１／３部分がこの活性に必要であると結論づけられる。
【０１１７】
図１１ｂは同様の実験の結果を示す。ａｌａ−ＴＦＰＩのＩＬ−６誘導能はＫ３ドメインのみを欠失しているＤｅｓ−Ｋ３−ＴＦＰＩと極めてよく似ている。対照的に、１６１ａａまたは２５２ａａを残すＣ末端の切断によって陰性対照である緑蛍光タンパク質と同様のＩＬ−６誘導プロファイルを有する分子を得る。したがって、ＩＬ−６誘導能はＴＦＰＩのＣ末端である残基２５２の下流のアミノ酸に含まれ得る。
【０１１８】
ＴＦＰＩの２２末端アミノ酸（すなわち配列番号３）からなるペプチドをＬＰＳの存在下におけるＩＬ−６アッセイで試験した。図１１ｃに示すとおり、ペプチド含有物はペプチドおよびＬＰＳ用量依存方法において、ＬＰＳのサイトカイン生産効果を完全に逆転する。したがって、このペプチドはＬＰＳの内毒素活性を中和することができる。
【０１１９】
図１１ｄは２２マーを大腸菌Ｏ１８ａｃ：Ｋ１：Ｈ７（ＡＴＣＣ）とインキュベートした結果を示す。ＩＬ−６誘導アッセイにおいて、生存細菌の接種材料を希釈した全血に加えた。２２マーは用量依存的に細菌生存を減少させた。このことは細菌コロニーの増殖の抑制の抑制によって示された。３００ｎＭのペプチドで全細菌を殺害した。
【０１２０】
したがって、２２マーはＬＰＳを中和することができ、そして生存細菌に対する直接殺菌効果を有する。これらの活性は、細菌感染に対する防御の先天性免疫応答の一部であり得る。アッセイはＴＦＰＩの作用メカニズムの局面を明らかにし、そして内毒素を中和し、血清と細胞受容体の相互作用を妨げることによって細菌感染の進行を調節することができる分子としてのＴＦＰＩおよびそのアナログを示す。この活性は敗血症の初期段階、または抗菌剤での処置後の内毒素放出の後に、重要な役割を果たし得る。ＬＰＳの高血清レベルは感染性ショックを有する患者の致命的な結果と関連している（文献４７）。
【０１２１】
実施例４． ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドの抗菌効果
実験Ｉ
ＴＦＰＩのＣ末端ドメインに存在する殺菌活性について試験するためにペプチドを設計した。活性をグラム陰性（大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７． ＡＴＣＣ ７００９７３）菌に対して、１０％血液の存在下で上記の通り測定した。対照は１０％血液および１００ｎＭのチファコギンを有するＲＰＭＩであった。生物学的活性を細菌コロニーの減少から、上記のとおり測定した。
【０１２２】
２２マー（配列番号３；ペプチド＃１）の抗菌効果をスクランブル対照ペプチド（配列番号８；ペプチド＃２）、ならびに１３アミノ酸がさらに上流にシフトしたＮ末端および８アミノ酸が上流にシフトしたＣ末端を有するＴＦＰＩフラグメント（すなわち配列番号７；ペプチド＃３）と比較した。ペプチド＃３は天然ＴＦＰＩの配列番号３の上流に位置するトロンビン切断部位に含まれる。ペプチド＃１と＃３の１４マーオーバーラップは配列番号５である。ペプチド＃５（配列番号１０）はペプチド＃３のアミノ酸およびさらにペプチド＃１のＣ末端８アミノ酸を含む。配列およびそれらの対応するペプチド数を下記に示す：
【表２】
【０１２３】
＃１、＃２、および＃３の３つのペプチドを水で最終アッセイ濃度である１０倍に希釈し、細菌と４時間、３μＭ、３００ｎＭ、１００ｎＭおよび１０ｎＭの最終濃度でインキュベートした。大腸菌を３０００ＣＦＵ／２００μｌで使用した。生存コロニー数を上記実施例１のとおりに測定した。表１に示すとおり、ペプチド＃１および＃３は共に、Ｏ１８ａｃ：Ｋ１：Ｈ７大腸菌株に対して活性であった。ペプチド＃３はペプチド＃１よりも、３０００ｎＭで血液とインキュベートしたとき得られる細菌の合計殺傷において良好な活性を示し、これはトロンビン切断部位での切断が不活性化であることを示唆した。全長ＴＦＰＩはこれらのアッセイで試験した濃度ではグラム陰性菌に対して活性を有さない。表２はペプチド＃３およびペプチド＃５の３００ｎＭ、１００ｎＭおよび１０ｎＭに連続希釈した後の生物学的活性を示す。ペプチド＃５の活性は同様であるが、ペプチド＃３と比較してわずかに減少する。
【０１２４】
【表３】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【表４】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１２５】
実験ＩＩ
ペプチド＃３を通常ヒト血清を対照として使用して大腸菌のさらなる株について３μＭでの活性について試験した。表３に示すとおり、大腸菌Ｏ２ａ、２ｂ：Ｋ５（Ｌ）：Ｈ４（ＡＴＣＣ ２３５００）およびＯ７：Ｋ１（Ｌ）：ＮＭ （ＡＴＣＣ ２３５０３）はペプチド＃３によって、大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７と同様の方法で影響された。
【表５】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１２６】
実験ＩＩＩ
ペプチド＃１、＃３および＃４を、血液なしでの大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７に対する活性について試験した。ペプチドを３μＭでアッセイした。同じ血液およびＴＦＰＩ対照が実験Ｉに含まれている。
【表６】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１２７】
血液なしでは、ペプチドは大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７にほとんど抗菌活性を示さなかった。表４に示すとおり、大腸菌生存に対するペプチドの影響は、３０００ｎＭであっても増殖培地のみのものと同様であった。対照的に、既知の抗菌ペプチドＬＬ３７（ペプチド＃４；配列番号９）はこの濃度で細菌の完全阻害を示した。したがって、ＴＦＰＩ由来ペプチドは、血液中に見出される因子と共に作用してそれらの抗菌効果を得ることができる。
【０１２８】
実験ＩＶ
ペプチド＃１（配列番号３）、ペプチド＃２（配列番号８）、ペプチド＃３（配列番号７）およびペプチド＃４（配列番号９）の抗菌効果を下記アッセイでさらに評価した。
【０１２９】
時間依存性：ペプチドを３０００ＣＦＵの大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７と、記載の最終濃度で１０％血液の存在下で２００μｌの反応を３つ平行して、上記の通りインキュベートした。１０％血液を含むＲＰＭＩを陰性対照として使用した。１、３または５時間インキュベーションした後、連続希釈物をカンテンプレートに播き、サンプルを細菌性増光かについてアッセイした。表５は、クリアランスが１時間では見られなかったが３および５時間後のペプチド＃１、＃３および＃４によって示されたように、細菌クリアランスの時間依存性を示す。ペプチドの細菌生存に対する効果は試験した時間によって増加する。また、ペプチド＃３はインキュベーションの３および５時間の両方でペプチド＃１よりも高い活性を示した。
【表７】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１３０】
ペプチド＃１（配列番号３）、ペプチド＃２（配列番号８）、ペプチド＃３（配列番号７）およびペプチド＃４（配列番号９）の抗菌効果をさらに下記アッセイで評価した。
【０１３１】
キャパシティー：表６は細菌滴定による細菌クリアランスのキャパシティーを示す。これらの実験では様々な濃度の大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７（３×１０３、３×１０４または３×１０５ＣＦＵ／２００μｌ）を３μＭまたは１００ｎＭペプチド＃３で、ＲＰＭＩ／１０％血液中で試み、希釈前３または５時間インキュベートし、播種した。簡潔に述べると、細菌を記載の４０μｌ ＰＢＳ中ＣＦＵに希釈し、反応を２００μｌの最終体積で上記のとおり評価し、３７℃でインキュベートした。反応物の連続希釈液を播き、一晩インキュベーション後のコロニー数を測定した。３時間で、ペプチド＃３は使用した全ＣＦＵで効果を示した。５時間で、高ＣＦＵ培養物に対する効果が認識できず、殺傷活性の滴定およびキャパシティーを超える高ＣＦＵ培養物であることを示す。
【表８】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１３２】
実施例５． 細菌殺傷活性は活性成分に依存する
実験Ｉ
図８Ａに示すとおり、ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドは、血液の無細胞分画（血漿または血清）と組み合わせたときにグラム陰性菌グラム陰性（大腸菌Ｏ１７：Ｋ１：Ｈ７）に対する生物学的活性を有する。図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは活性が血漿または血清を５６℃で３０分間熱処理することによって、およびコブラ毒因子（ＣＶＦ）で処理することによって消失し得ることを示す。ＣＶＦは全ての終末補体成分の減少によって溶解作用を媒介する補体を血清から枯渇させる（文献４８）。図８Ｃにおいて、この結果は血清を１０Ｕまたは１ＵのＣＶＦで下記の通りに処理した実験について示している：１００Ｕ／ｍｌおよび１０Ｕ／ｍｌのＣＶＦの原液をＰＢＳで希釈して製造した。血清を室温で３０分間、１０：１の比でＣＶＦ原液で処理した。対照反応として、ＲＰＭＩを１０Ｕ／ｍｌ ＣＶＦで処理し、血清をＣＶＦなしで室温で平行してインキュベートした。処理した血清を上記の１０％血液の全反応体積で使用した。未処理血清の反応物に１０％ＣＶＦ処理ＲＰＭＩを補った。対照はペプチド＃３が未処理血清または３０分室温でＣＶＦなしでインキュベートした血清において活性であることを示す。ペプチド＃３の活性は１０Ｕ／ｍｌのＣＶＦで処理した血清において消失し、したがって溶解活性を媒介する補体が消失した。１Ｕ／ｍｌのＣＶＦで、ペプチド＃３との組合せでの殺傷活性はなお存在しており、このことは低濃度は補体活性を消失させるのには十分ではないことを示唆している。
【０１３３】
大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７は補体媒介殺傷に抵抗性を付与すると考えられているポリシアル酸Ｋ１カプセルを有する（文献４９）。このデータはＴＦＰＩ由来のカチオン性ペプチドが抵抗性を変化させることができることを示す。
【０１３４】
実験ＩＩ
血清中の細菌殺傷活性が血液中のものを代理するかどうかを評価するため、ペプチド＃１、＃２、＃３、および＃５を３μＭ、３００ｎＭおよび３０ｎＭに連続希釈した。対照として、血清および３００ｎＭ ＴＦＰＩを含む血清を含めた。図８Ｄに示すとおり、ペプチド＃３は血清と組み合わせてもっとも強い効果を有し、次いでペプチド＃５、そしてペプチド＃１は顕著に減少した活性を有する。ペプチド＃２は不活性である。血清中のペプチド活性は血液中で観察されたもの（実施例４、実験Ｉ、表２参照）と同じ程度である。
【０１３５】
実験ＩＩＩ
カテプシンＧ消化ｒＴＦＰＩが血清成分と組合せで作用するかどうかを評価するため、５μＭの最終濃度の消化したｒＴＦＰＩを血液２０μｌまたは血清４０μｌでの細菌殺傷アッセイに参加させた。ペプチド＃３を平行サンプルとして使用した。対照レーンはペプチドまたはｒＴＦＰＩの添加なしでの血液または血清サンプルを示す。表７に示すとおり、プロテアーゼ消化ＴＦＰＩは、ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドと同様に、血清成分と共に作用する。
【表９】
【０１３６】
実施例６． 細菌殺傷活性に含まれる補体因子の同定
実験Ｉ
ペプチド＃３との相乗効果の具体的な標的を同定するため、一つの補体成分を損耗したか欠く血清を使用して細菌殺傷実験を行った。Ｃ３、Ｃ１ｑ−、Ｃ２−、Ｃ６−、およびＣ９を欠くヒト血清、Ｃ４を欠くモルモット血清（遺伝的欠失動物由来）および通常ヒト血清を購入した。実験を上記の通り行った。図９Ａ〜Ｄは補体因子Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ２、Ｃ９を欠くか、またはＣ４を欠く血清を個別に試験した実験結果を示す。これらの実験は上記補体因子の除去または欠損はペプチド＃３の細菌殺傷活性の喪失をもたらすことを示した。注目すべきことに、ほとんどの欠失血清はわずかに殺傷活性が残っているが、Ｃ４欠損血清は完全に細菌殺傷活性を失っており、このことは補体因子の不完全な除去が活性の残存を引き起こし得ることを示唆している。さらに、精製Ｃ１タンパク質複合体または因子Ｃ４をそれぞれの反応物に適当な生理的濃度でもどすと、殺傷活性が回復する（図９ＣおよびＤ）。Ｃ１ｑについて１１７μｇ／ｍｌ、およびＣ４について３１０μｇ／ｍｌの推定血清濃度で、反応を２．３４μｇのＣ１複合体および６μｇの因子Ｃ４をそれぞれ補った。因子Ｃ１ｑは伝統的補体経路のイニシエーターである（文献５０）。因子Ｃ６（Ｃ６ｂ、Ｃ６の酵素的切断の後Ｃ６ａおよびＣ６ｂに）およびＣ９は膜攻撃複合体の構造成分であり、これは補体による食作用から独立した殺傷に関与する溶解孔を形成する。したがって、ペプチド＃３はいくつかの方法で伝統的補体経路と相互作用し、そしてペプチド＃３関連補体殺傷は膜攻撃複合体の形成に依存していると考えられる。
【０１３７】
実験ＩＩ
Ｃ１複合体の活性化はＣ１ｒおよびＣ１ｓのＣａ２＋依存的結合に依存しているが、レクチンおよび他の経路はＣａ２＋から独立しており、全補体経路はＭｇ２＋に依存している。観察された細菌殺傷活性のメディエーターとしての伝統的補体経路の同定をさらに支持するため、５ｍＭのＭｇＣｌ２を補った１０ｍＭのＥＧＴＡ中でキレート化実験を行った。表８に示すとおり、ペプチド＃３は１０ｍＭ ＥＧＴＡおよび５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む血清中での細菌殺傷活性を有さないが、単純血清中の対照実験では活性であった。
【表１０】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１３８】
実施例７． ペプチド結合部位の同定
実験Ｉ
２つのヘパリン結合部位はＴＦＰＩのＣ末端に位置し、ヘパリン相互作用は臨床研究で発見されている（文献５１）。したがって、ヘパリンと細菌殺傷活性の関係について評価するために実験を設計した。ペプチド＃１および＃３を、上記のとおり３μＭで、ヘパリンまたは低分子量ヘパリン ３Ｕ／ｍｌおよび０．３Ｕ／ｍｌの存在下または非存在下で使用した。さらに、対照は平行反応で同じ条件で処理した血液であった。未断片化ヘパリン ０．３Ｕ／ｍｌはペプチドの細菌殺傷活性の一部消失（データ示さず）、および３Ｕ／ｍｌはこの活性を消失させた（表９参照）。表９のデータは０．３Ｕ／ｍＬの低分子量ヘパリンの存在下では強く妨げ、そして３Ｕ／ｍＬでは殺傷活性が消失することを示す。これはＴＦＰＩのＣ末端のヘパリン結合部位の相互作用がペプチドの生物学的活性に必要であることを示唆している。
【表１１】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１３９】
実験ＩＩ
ＴＦＰＩのＣ末端とＬＰＳの相互作用は記載されている（文献５２）。ペプチド＃３と細菌細胞表面の直接相互作用を示すため、蛍光標識ペプチドを増殖細菌株と、増殖濃度のヘパリンの存在下または非存在下でインキュベートした。実験の詳細は下記の通りである：大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７（１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）の凍結株を１：５でＬＢ増殖培地で希釈し、４０分間３７℃でインキュベートした。アリコート ０．７ｍｌ（３×１０８ＣＦＵ）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で２回洗浄し、１０％熱活性化血清を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１００μｌで再懸濁した。未断片化ヘパリンを１０倍の濃度で加え、３０、３および０．３Ｕ／ｍｌとするか、または除き、そしてサンプルを３０分間室温でインキュベートした。Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）５５５ Ｄｙｅ−タグ化ペプチド＃３を１００倍（１μｌ）濃度で加えて３００ｎＭとし、そして暗所で５分間インキュベートした。サンプルを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド２００μｌで再懸濁し、暗所で１５分間インキュベートした。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で洗浄した後、サンプルを１００〜３００μｌで再懸濁し、１０μｌをカバーグラスに乗せ、空気乾燥した。カバーグラスにスライドグラスを、マウント培地と共に乗せた。顕微鏡分析を、ＡｘｉｏＣａｍカメラを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００反転蛍光顕微鏡を使用して行った。
【０１４０】
図１０に示すとおり、蛍光標識ペプチド＃３とヘパリンなしでインキュベートした細菌は結合を示す（Ａ）。０．３Ｕ／ｍｌ ヘパリンでは、蛍光シグナルが減少し（Ｂ）、３０および３Ｕ／ｍｌ ヘパリンでは結合が消失する（ＣおよびＤ）。図１０Ｅ〜１０Ｈは対応するＮｏｍａｒｓｋｉイメージを示す。
【０１４１】
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【０００１】
本明細書に記載の全ての特許、特許出願、オンライン情報および文献は、その全体を参照により本明細書の一部とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
微生物感染は広範な微生物、例えば細菌、真菌およびウイルスによって引き起こされ、即刻の処置を必要とする軽度乃至生命の危険がある疾患をもたらす。一般的な細菌感染には、肺炎、耳感染、下痢、尿路感染および皮膚障害が含まれる。一般的なウィルス感染には、インフルエンザＡおよびＢ、呼吸器合胞体ウイルス、Ｃ型肝炎および水疱瘡が含まれ、一般的な真菌感染には皮膚障害が含まれる。微生物感染の処置に有効な方法および／または現在のこれらの感染の処置法を改善する必要は当該技術分野において継続して存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の詳細な説明
本出願は感染を処置するための新規方法によって作用する抗微生物治療剤を説明する。治療剤は天然もしくは非天然アミノ酸を含むペプチド、または小分子を含んでいてもよい化合物である。剤は細胞外微生物、例えば細菌、真菌またはウイルス感染細胞に対して有効である。微生物は原核細胞、真核細胞または単細胞である。治療剤は微生物の表面に結合し、そして補体系の成分と相互作用して微生物を殺すことによって作用することができる。１つの態様において、治療剤は補体系の成分と相乗的に相互作用して微生物を殺す。他の態様において治療剤は微生物の表面に結合し、そして微生物をオプソニン化するために補体を生産的に固定する。さらなる態様において、治療剤は微生物の表面に結合し、そして膜攻撃補体（ＭＡＣ）の集合体によって微生物の溶菌を引き起こすために補体を生産的に固定する。これは食作用による微生物の除去を引き起こす。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
かくして本発明は、微生物表面と結合し、微生物を殺すために動物中に存在する補体系の成分（例えばＣ１ｑ成分）と相互作用する、補体系を有する動物における微生物感染の処置用化合物を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
化合物はオプソニン化し、および／または微生物の溶菌を引き起こすことができる。
【０００６】
化合物は動物中に存在する補体系の成分、例えばＣ１ｑと相乗的に作用することができる。したがって、化合物の抗微生物効果は、補体系成分が存在するほうがそれらが存在しないときよりもより大きい。好ましくは、化合物の抗微生物効果はペプチド単独および補体系成分単独の効果を合わせたものよりも大きい。
【０００７】
具体的な興味のある化合物は、以下に詳述する組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）に由来する。さらに、化合物はスクリーニング法によって、例えば補体成分の存在下および不在下で化合物の抗微生物効果を比較することによって、同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログ
ＴＦＰＩは強力な抗凝血剤であり、抗炎症性活性を有する（文献１）。ＴＦＰＩは例えば腫瘍と関連する血管形成を阻害するために使用することができる（文献２）。
【０００９】
タンパク質は複数の主要ドメインを有する：３種のＫｕｎｉｔｚタイプのセリンプロテアーゼ阻害ドメイン（Ｋ１、Ｋ２およびＫ３）、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、およびＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）。Ｋ１ドメインは凝固因子ＶＩＩａ−組織因子（ＴＦ）複合体を阻害する。Ｋ２ドメインは因子Ｘａを阻害する。したがって、セリンプロテアーゼはＫ３と関連しないと考えられていたが、近年の研究ではＴＦＰＩを細胞表面上のＧＰＩ結合受容体（CPI anchored receptor）に結合させる機能を有することが示唆されている（文献３）。ＣＴＤはまた、細胞結合、ヘパリン結合および最適Ｘａ阻害に関与する。
【００１０】
「ＴＦＰＩ」は、本明細書において使用するとき、配列番号１に示す２７６アミノ酸残基、糖なしで約３８，０００ダルトンの分子量を有する成熟セリン糖タンパク質を意味する。天然タンパク質は、糖が存在するとき約４５，４００ダルトンの分子量を有する（文献４）ＴＦＰＩ ｃＤＮＡのクローニングは文献５に記載されている。本発明で使用するＴＦＰＩは非糖化または糖化であり得る。
【００１１】
「ＴＦＰＩアナログ」は、１個以上、例えば１〜８０個のアミノ酸付加または置換（一般的には、タンパク質の天然および好ましくは非ＫｕｎｉｔｚドメインまたはＣ末端位置において保存的である）、１個以上、例えば１〜８０個のアミノ酸欠失（例えばＴＦＰＩフラグメント）、または１個以上の化学基の１個以上のアミノ酸への添加で修飾したＴＦＰＩの誘導体であり、修飾はＴＦＰＩの生物学的活性を破壊しない。破壊されていない活性には、ＴＦＰＩの抗凝血活性および／またはその抗細菌活性、ならびにそのプロトロンビンアッセイにおける活性が含まれ得る。
【００１２】
好ましくはＴＦＰＩアナログは全３個のＫｕｎｉｔｚドメインを含む。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは糖化または非糖化であってよい。
【００１３】
抗細菌活性を維持するために、ＴＦＰＩアナログがＣＴＤ（この領域が抗細菌活性を有する）を保持することが好ましい。典型的には、ＴＦＰＩのほとんどの下流トロンビン切断部位の実質的に全てのアミノ酸下流を保持していることが好ましい（例えば、配列番号１のアミノ酸２５４の下流では残基２５４と２５５の間をトロンビンが切断する）。組成中ＴＦＰＩアナログ分子の数の少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％、≧９９％、またはそれ以上）がＴＦＰＩのアミノ酸２５４と２５５の間に存在するトロンビン切断部位で切断されるべきではない。
【００１４】
好ましいＴＦＰＩアナログは、Ｎ−Ｌ−アラニル−ＴＦＰＩ（ａｌａ−ＴＦＰＩ）であり、このアミノ酸配列は配列番号２に示す。Ａｌａ−ＴＦＰＩはまた、国際薬剤名「ｔｉｆａｃｏｇｉｎ」として知られている。ａｌａ−ＴＦＰＩのアミノ末端アラニン残基をＥ．ｃｏｌｉ発現の改善のためにＴＦＰＩ配列に設計した（文献６）。内因性ＴＦＰＩは分泌され、そしてシグナルペプチドと発現される。アミノ末端メチオニンはシグナルペプチドの一部であり、成熟ＴＦＰＩの一部ではない。他のＴＦＰＩアナログは文献７に記載されている。ＴＦＰＩアナログは、生物学的活性アッセイによって測定したようにＴＦＰＩの活性の測定法をいくつか有する（例えば、下記文献８および９参照）。
【００１５】
ＴＦＰＩは３つのトロンビン切断部位を有する：（ｉ）Ｌｙｓ ８６とＴｈｒ ８７の間、Ｋ１とＫ２の間；（ｉｉ）Ａｒｇ １０７とＧｌｙ １０８の間（Ｋ２の因子Ｘａに対する反応部位）；および（ｉｉｉ）Ｃ末端塩基領域のＬｙｓ ２５４とＴｈｒ ２５５の間。本発明者らはＴＦＰＩの抗細菌活性がＣＴＤ、とりわけ配列番号１のＬｙｓ ２５４とＴｈｒ ２５５の間のトロンビン切断部位の近位および／または下流領域に存在することを見出した。ＣＴＤを欠く切断ＴＦＰＩは血液アッセイにおいてほとんど活性を有さないため、本発明は例えば部位指定突然変異生成によってこのトロンビン切断部位を除去したＴＦＰＩアナログを提供する。これらのアナログのＣＴＤをトロンビンによって切断することはできず、その抗細菌活性を天然ＴＦＰＩよりも長期間保持することができる分子を得る。
【００１６】
かくして本発明は：（１）天然ＴＦＰＩのＣ末端付近で見出されるトロンビン切断部位を欠くＴＦＰＩアナログ；（２）天然アミノ酸のアミノ酸Ｌｙｓ ２５４とＴｈｒ２５５の間に存在するトロンビン切断部位を欠くＴＦＰＩアナログ；（３）（ｉ）少なくとも１つのＫｕｎｉｔｚドメインおよび（ｉｉ）Ｃ末端領域を含むが、もっともＣ末端側のＫｕｎｉｔｚドメインとＣ末端領域の間にトロンビン切断部位を有さないＴＦＰＩアナログ；（４）Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むＮ末端ポリペプチドおよびＫｕｎｉｔｚドメインを含まないＣ末端ポリペプチドを与えるようにトロンビンによって切断され得ないＴＦＰＩアナログ；（５）２個未満（すなわち１または０）のＬｙｓ Ｔｈｒジペプチドを含むＴＦＰＩアナログを提供する。
【００１７】
天然切断部位（Ｌｙｓ Ｔｈｒ）を様々な方法で除去することができる。例えばリシンおよび／またはトレオニンを異なるアミノ酸で置換してトロンビンによって認識されないジペプチドを得ることができる。あるいは、リシンおよび／またはトレオニンを除去することができる。さらに他には、１個以上のアミノ酸をリシンとトレオニンの間に挿入することができる。修飾を行った後、ＴＦＰＩアナログをトロンビンと試験消化でインキュベートして天然Ｃ末端切断がもはや起こらないことを確認することができる。
【００１８】
本発明はまた：（１）Ｋｕｎｉｔｚドメイン３を含むがＣ末端ドメインを欠くＴＦＰＩアナログ；（２）Ｃ末端からアミノ酸をｑ個以下切断したＴＦＰＩであるＴＦＰＩアナログ（ｑは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０である）を提供する。ＴＦＰＩのＣ末端切断は既に報告されているが、これは通常Ｋ３の欠失と組合せである。
【００１９】
ポリペプチド
ＴＦＰＩは３個のトロンビン切断部位を有する：（ｉ）Ｌｙｓ ８６とＴｈｒ ８７の間；（ｉｉ）Ａｒｇ １０７とＧｌｙ １０８の間；および（ｉｉｉ）Ｌｙｓ ２５４とＴｈｒ ２５５の間。本発明者らはＴＦＰＩの抗細菌活性がＣ末端塩基領域、とりわけ配列番号１のＬｙｓ ２５４とＴｈｒ２５５の間のトロンビン切断部位の近くおよび／または下流に存在することを見出した。この部位での切断は抗細菌活性を有し、細菌ＬＰＳに結合することができる２２アミノ酸ペプチド（配列番号３）を解放する。かくして本発明は、抗細菌剤として使用するための、細菌感染の処置法において使用するための、そしてかかる感染の処置用医薬の製造において使用するための、ＴＦＰＩのＣＴＤに基づくペプチドを提供する。本発明はさらに、抗微生物剤として使用するための、微生物感染の処置法において使用するための、そしてかかる感染の処置用医薬の製造において使用するための、ＴＦＰＩのＣＴＤに基づくペプチドを提供する。
【００２０】
したがって本発明は：（１）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ペプチド＃１）；（２）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）；（３）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（存在するとき、配列番号３のＮ末端側のアミノ酸がＬｙｓではない）；（４）配列番号３と少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％、またはそれ以上）同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（配列番号３のアミノ酸の少なくとも１個がＤアミノ酸である）；（６）配列番号３のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩではない）；（７）配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端から少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５またはそれ以上）アミノ酸を含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）を提供する。
【００２１】
抗菌活性はまた、ＴＦＰＩのもっともＣ末端側の残基を含まないがＣＴＤに由来するペプチドにおいて見られる。したがって本発明は、配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。ポリペプチドは（例えば配列番号１の）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログのフラグメント自体であってもなくてもよい。
【００２２】
本発明はまた、配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。ポリペプチドはｍ（例えば配列番号１の）ＴＦＰＩのフラグメント自体であってもなくてもよい。好ましい配列番号６のフラグメントはまた、配列番号５のフラグメントである。
【００２３】
本発明はまた、配列番号１のフラグメントを含むポリペプチド（（ａ）フラグメントは配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４）連続アミノ酸を含み、（ｂ）前記ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）を提供する。
【００２４】
本発明はまた：（１）配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ペプチド＃３）；（２）配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）；（３）配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド（存在するとき、配列番号７のＮ末端側のアミノ酸がＬｙｓではない）；（４）配列番号７と少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％、またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド（配列番号７のアミノ酸の少なくとも１個がＤアミノ酸である）；（６）配列番号７のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）を提供する。
【００２５】
本発明はまた：（１）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）；（３）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（存在するとき、配列番号５のＮ末端側のアミノ酸がＬｙｓではない）；（４）配列番号５と少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％、またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（配列番号５のアミノ酸の少なくとも１個がＤアミノ酸である）；（６）配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）を提供する。
【００２６】
本発明はまた：（１）配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチド（ペプチド＃５）；（２）配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）；（３）配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド（存在するとき、配列番号７のＮ末端側のアミノ酸がＬｙｓではない）；（４）配列番号１０と少なくとも５０％（例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％、またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）配列番号１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド（配列番号１０のアミノ酸の少なくとも１個がＤアミノ酸である）；（６）配列番号１０のアミノ酸配列の少なくとも３（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）連続アミノ酸のフラグメントを含むポリペプチド（当該ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではない）を提供する。
【００２７】
これらのポリペプチドは、好ましくはＬＰＳおよび／または細菌と結合することができる。これらのポリペプチドはまた、病原真菌の細胞壁において見出されるマンノタンパク質と結合することができる。ポリペプチドはまた、ウイルス粒子において見出されるタンパク質と結合することができる。
【００２８】
ポリペプチドは好ましくは、２５０アミノ酸以下（例えば２２５、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６以下または５アミノ酸）からなる。５〜９０アミノ酸からなるポリペプチドが好ましい（例えば５〜８０、５〜７０、５〜６０アミノ酸など）。８〜２５アミノ酸からなるポリペプチドがとりわけ好ましい。
【００２９】
ポリペプチドは好ましくは、少なくとも３アミノ酸（例えば少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または少なくとも５０アミノ酸）からなる。
【００３０】
本発明は式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨ
〔式中：Ａはａアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｃはｃアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｂは配列番号３のアミノ酸配列から少なくともｂ連続アミノ酸のフラグメントであるポリペプチド配列であり、ここでｂは３以上（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）である〕
を有するポリペプチドを提供する。
【００３１】
本発明は式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨ
〔式中：Ａはａアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｃはｃアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｂは配列番号５のアミノ酸配列から少なくともｂ連続アミノ酸のフラグメントであるポリペプチド配列であり、ここでｂは３以上（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１）である〕
を有するポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明は式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨ
〔式中：Ａはａアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｃはｃアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｂは配列番号７のアミノ酸配列から少なくともｂ連続アミノ酸のフラグメントであるポリペプチド配列であり、ここでｂは３以上（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４）である〕
を有するポリペプチドを提供する。
【００３３】
本発明は式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨ
〔式中：Ａはａアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｃはｃアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｂは配列番号１０のアミノ酸配列から少なくともｂ連続アミノ酸のフラグメントであるポリペプチド配列であり、ここでｂは３以上（例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４）である〕
を有するポリペプチドを提供する。
【００３４】
値ａは一般的に少なくとも１（例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００等）である。値ｃは一般的に少なくとも１（例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００等）である。ａ＋ｃの値は少なくとも１（例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００等）である。ａ＋ｃの値が最大１０００（例えば最大９００、８００、７００、６００、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２）であることが好ましい。
【００３５】
−Ａ−のアミノ酸配列は典型的に、配列番号２の配列−Ｂ−のＮ末端であるａアミノ酸とｍ％未満の配列同一を共有する。−Ｃ−のアミノ酸配列は典型的には、本発明の抗体の配列番号２可変領域（例えば配列番号２）の配列−Ｂ−のＣ末端であるｂアミノ酸とｎ％未満配列同一を共有する。一般的に、値ｍおよびｎはともに６０未満（例えば５０、４０、３０、２０、１０またはそれ未満）である。値ｍおよびｎは互いに同一または異なっていてよい。
【００３６】
本発明の態様において、ポリペプチドは配列番号４からならない、これはＨｅｍｂｒｏｕｇｈらによって文献１０において抗腫瘍および抗血管形成活性を有するが抗細菌活性を有さないと記載されている。
【００３７】
本発明のポリペプチドは配列番号３、５、６、７および１０と同一の配列を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。これらのポリペプチドにはホモログ、オルトログ、対立遺伝子多型および突然変異が含まれる。ポリペプチド間の同一を、好ましくはＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に備えられているＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムによって、ギャップオープンペナルティ＝１２およびギャップエクステンションペナルティ＝１のパラメーターでアファインギャップサーチを使用して測定する。
【００３８】
これらのポリペプチドは、配列番号３、５、６、７および１０と比較して、１個以上（例えば１、２、３、４、５、６等）の連続アミノ酸置換、すなわち関連側鎖を有する他のものでの１アミノ酸置換を含んでいてもよい。遺伝的にコード化アミノ酸は一般に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわちリシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非電荷極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはともに芳香族性アミノ酸と分類されることもある。一般に、これらのファミリー内での１アミノ酸置換は生物学的活性に大きな影響がない。さらに、ポリペプチドは標準配列と比較して１個以上（例えば１、２、３、４、５、６等）の１アミノ酸欠失を有し得る。さらに、ポリペプチドには標準配列と比較して１以上（例えば１、２、３、４、５、６等）の挿入を含み得る。
【００３９】
本発明のポリペプチドを様々な方法、例えば化学合成（全体または一部）、プロテアーゼを使用したＴＦＰＩの消化、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物からの（例えば組換え発現からの）精製等によって製造することができる。＜４０アミノ酸長のペプチドの好ましい製造法にはインビトロ化学合成が含まれる（文献１１、１２）。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学に基づく方法（文献１３）のような固相ペプチド合成がとりわけ好ましい。酵素的合成（文献１４）はまた、一部または全体で使用することができる。化学合成に代えて、生物合成を使用することができる、例えばポリペプチドを翻訳によって製造することができる。これはインビトロまたはインビボで行うことができる。生物学的方法は、一般にＬ−アミノ酸を利用したポリペプチドの生産に限定されるが、翻訳機構の操作（例えばアミノアシルｔＲＮＡ分子の）を使用してＤ−アミノ酸（または他の非天然アミノ酸、例えばヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニン等）の導入を行うことができる（文献１５）。しかし、Ｄ−アミノ酸が含まれる場合、化学合成を使用することがこの好ましい。本発明のポリペプチドはＣ末端および／またはＮ末端に共有結合修飾を有することがある。
【００４０】
本発明のポリペプチドは様々な形態（例えば天然、融合、糖化、非糖化、脂質化、非脂質化、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化、非ミリストイル化、モノマー、マルチマー、粒子、変性等）を取り得る。
【００４１】
本発明のポリペプチドは好ましくは、純粋または実質的に純粋な、すなわち実質的に他のポリペプチドを含まない（例えば天然由来のポリペプチドを含まない）形態で提供され、そして一般的に少なくとも約５０％（重量）純粋、および通常少なくとも約９０％純粋であり、すなわち約５０％未満、より好ましくは約１０％未満（例えば５％未満）の組成が他の発現ポリペプチドである。
【００４２】
本発明のポリペプチドは固体支持体に結合し得る。本発明のポリペプチドは検出可能なラベル（例えば放射性または蛍光ラベル、またはビオチンラベル）を含み得る。
【００４３】
「ポリペプチド」なる用語は任意の長さのアミノ酸ポリマーを意味する。ポリマーは直鎖、分枝鎖または環状であり得て、それは修飾アミノ酸を含んでいてもよく、そしてそれは非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、天然または介入によって；例えば、ジスルフィド結合形成、糖化、脂質化、アセチル化、リン酸化またはあらゆる他の操作または修飾、例えばラベリング成分との共役によって修飾されているアミノ酸ポリマーを含む。また、この定義に含まれるものは例えば、１個以上のアミノ酸のアナログ（例えば非天然アミノ酸等が含まれる）ならびに当業者に既知の他の修飾を含むポリペプチドである。ポリペプチドは一本鎖または関連鎖として存在し得る。
【００４４】
本発明は１以上の配列−Ｘ−Ｙ−または−Ｙ−Ｘ−または−Ｘ−Ｘ−（式中、−Ｘ−は上記定義のアミノ酸配列であり、そして−Ｙ−は上記定義の配列ではない）を含むポリペプチドを提供する、すなわち本発明は融合タンパク質を提供する。例えば本発明は、−Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−Ｙ２−、またはＸ１−Ｘ２−Ｙ１または−Ｘ１−Ｘ２−等を提供する。本発明の１つの態様において、Ｙは例えば配列番号１４または１５に見られるようなＮ末端リーダー配列である。さらなる態様においてＹは配列番号１６または１７に見られるようなＣ末端Ｔヘルパー配列である。
【００４５】
本発明は本発明のポリペプチドを生産するための方法であって、本発明の宿主細胞をポリペプチド発現を誘導する条件下で培養することを含む方法を提供する。
【００４６】
本発明は本発明のポリペプチドを生産するための方法であって、ポリペプチドを一部または全部化学的方法を使用して合成することを含む方法を提供する。
【００４７】
Ｃ末端ポリぺプチドとＴＦＰＩの組合せ
ＴＦＰＩは抗凝固作用を有し、それはまた潜在的に有害な内毒素シグナル伝達を妨害する。さらに、本明細書に記載のとおり、それはＣ末端ドメインによって媒介される抗微生物効果、例えば抗細菌効果を有する。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの抗真菌効果を増強するため、ＴＦＰＩ（またはＴＦＰＩアナログ）を上記定義のＴＦＰＩのＣ末端に由来するポリペプチドと共に投与することができる。あるいは、またはさらに、上記定義のＴＦＰＩのＣ末端に由来するポリペプチドの抗微生物効果を増強するために、それらをＴＦＰＩおよび／またはＴＦＰＩアナログと共に投与することができる。
【００４８】
したがって本発明は：（１）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、および本発明の抗微生物ポリペプチドを含む医薬組成物；（２）同時、個別または逐次投与のためのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、および本発明の抗微生物ポリペプチド；（３）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、および本発明の抗微生物ポリペプチドの同時、個別または逐次投与を含む患者の処置法；（４）本発明の抗微生物ポリペプチドの投与を受けた患者にＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを投与することを含む患者の処置法；（４）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与を受けた患者に本発明の抗微生物ポリペプチドを投与することを含む患者の処置法を提供する。抗微生物は好ましくは抗細菌である。
【００４９】
したがって本発明は：（１）本発明の抗微生物ポリペプチド、およびＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む医薬組成物；（２）同時、個別または逐次投与のための本発明の抗微生物化合物、およびＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ；（３）本発明の抗微生物化合物、およびＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの同時、個別または逐次投与を含む患者の処置法；（４）本発明の抗微生物化合物の投与を受けた患者にＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを投与することを含む患者の処置法；（４）ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与を受けた患者に本発明の抗微生物化合物を投与することを含む患者の処置法を提供する。
【００５０】
これらの組合せで使用されるＴＦＰＩアナログには、Ｃ末端由来抗微生物ポリペプチドまたは抗細菌ポリペプチドが含まれるか、または欠く。したがってＴＦＰＩは、上記の通り、ｑ以下のＣ末端を欠く。
【００５１】
薬剤設計およびペプチド模倣物
本発明のポリペプチドはそれら自体が抗微生物剤として有用である。しかし、それらは抗微生物学的活性を（一般的にまたは特異的に）改善するために、またはバイオアベイラビリティー、毒性、代謝性、薬物動力学等のような薬理学的に重要な特徴を改善するために精錬され得る。ポリペプチドはしたがって、さらなる研究および精錬のためのリード化合物として使用され得る。
【００５２】
本発明のポリペプチドはペプチド模倣物分子を設計するために使用することができる（文献１６〜２１）。ペプチド模倣物技術はトロンビン阻害剤の設計に成功裏に使用された（文献２２、２３）。これらは典型的には、本発明のポリペプチドに対して等比体積であるが、それらのペプチド結合の１個以上を欠く。例えば、重要なアミノ酸副鎖を保持したままペプチド主鎖を非ペプチド主鎖で置換することができる。ペプチド模倣物分子には糖アミノ酸が含まれ得る（文献２４）。ペプトイドを使用することができる。
【００５３】
ペプチド模倣物分子の設計を補助するため、ファーマコフォア（すなわち活性に関する具体的な特徴を発現する化学的特徴および３Ｄ制約）をペプチドについて定義することができる。ファーマコフォアには好ましくは、表面アクセス可能な特徴、より好ましくは水素結合ドナーおよびアクセプター、荷電／イオン化基、および／または疎水性パッチを含む。これらは活性の付与における相対的な重要度に基づいて重み付けをすることができる（文献２５）
【００５４】
ファーマコフォアをＣＡＴＡＬＹＳＴ（ＨｙｐｏＧｅｎまたはＨｉｐＨｏｐを含む）、ＣＥＲＩＵＳ２のようなソフトウェアを使用するか、または本発明のポリペプチドの既知のコンホメーションから手で構成することによって決定することができる。ファーマコフォアを使用して、ＣＡＴＡＬＹＳＴのようなプログラムを使用して構造ライブラリをスクリーニングすることができる。受容体と相互作用する化学基と最大の空間的一致を得る構造データベースにおける候補分子の方向を調査するＣＬＩＸプログラムを使用することもできる。
【００５５】
結合表面またはファーマコフォアを官能基（例えばプロトン、ヒドロキシル基、アミン基、疎水性基）または小分子フラグメントの好ましい相互作用位置をマッピングするために使用することができる。対応する官能基が本発明のポリペプチドと実質的に同じ空間的関係に位置する化合物を新規に設計することができる。
【００５６】
官能基は正しいサイズおよび構造を有する架橋フラグメントまたは官能基を好ましい方向に支持するフレームワークを使用して一つの化合物に結合することができ、したがって本発明のペプチド模倣物化合物を提供する。この方法での官能基の結合を手作業で行うことができるので、おそらくＱＵＡＮＴＡまたはＳＹＢＹＬのようなソフトウェアの助けによって、自動または半自動新規設計アプローチを使用することもできる、例えば：
−ＭＣＳＳ／ＨＯＯＫ（文献２６、２７）、これは複数の官能基をデータベースから得た分子テンプレートと結合する。
【００５７】
−ＬＵＤＩ（文献２８）、これは理想的にはリガンドによって満たされる相互作用のポイントを計算し、受容体と相互作用するそれらの能力に基づいて結合部位にフラグメントを位置させ、そしてそれらをリガンドを製造するために連結する。
【００５８】
−ＭＣＤＬＮＧ（文献２９）、これは受容体結合部位を一般原子の最密充てん配置で満たし、そして原子タイプ、位置、結合配列および他の特徴をランダムに変化させてＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ法を使用する。
【００５９】
−ＧＲＯＷ（文献３０）これは最初の“種”フラグメント（手動または自動で置く）で開始してリガンドを外側へ成長させる。
【００６０】
−ＳＰＲＯＵＴ（文献３１）、このセットには：結合ポケット中の好ましい水素結合および疎水性領域を同定するモジュール（ＨＩＰＰＯモジュール）；構造生成のための出発フラグメントを形成するため、標的部位で官能基およびそれらの位置を選択するモジュール（ＥｌｅＦＡｎＴ）；増殖スペーサーフラグメントによって出発フラグメントでの結合ポケットの立体障害を満たす骨格を生成し、得られた部分骨格を結合するモジュール（ＳＰＩＤｅＲ）；ヘテロ原子を骨格に置換して受容体部位のものと相補的な静電気的特徴を有する分子を生成するモジュール（ＭＡＲＡＢＯＵ）が含まれる。解をＡＬＬｉｇａＴＯＲモジュールを使用して集合させ、採点することができる。
【００６１】
−ＣＡＶＥＡＴ（文献３２）、これは結合ユニットを設計して非環式分子を抑制する。
【００６２】
−ＬＥＡＰＦＲＯＧ（文献３３）、これは小さい段階的な構造の変化を作成し、新規化合物の結合エネルギーを速やかに評価することによってリガンドを評価する。変化は結合エネルギーの変化に基づいて継続または廃棄され、そして構造は受容体との相互エネルギーを増加させ続ける。
【００６３】
−ＧＲＯＵＰＢＵＩＬＤ（文献３４）、これは一般的な有機テンプレートのライブラリーおよびリガンドと受容体間の非結合相互作用の完全な経験的力場の描写を使用して、化学的に合理的な構造を有し、かつ受容体結合部位に立体的および静電気的に相補的特徴を有するリガンドを構築する。
【００６４】
−ＲＡＳＳＥ（文献３５）
【００６５】
これらの方法は関連化合物を同定する。これらの化合物を新規に設計することができ、既知の化合物であり得て、または既知の化合物に基づくものであり得る。化合物はそれ自体有用であってもよく、またはそれらは、結合親和性または他の薬理学的に重要な特徴（例えばバイオアベイラビリティー、毒性、代謝性、薬物動力学等）を改善するためのさらなる医薬的精錬に使用することができるプロトタイプ（すなわちリード化合物）であり得る。
【００６６】
個々に有用な化合物同様、構造ベース設計技術によってｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計されたペプチド模倣物も“伝統的な”ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法のための化合物ライブラリーを示唆するために使用することができる。リガンドにおいて重要な医薬的主題を同定し、抗微生物学的活性についてスクリーニングするための化合物ライブラリ（例えばコンビナトリアルライブラリ）において模倣することができる。
【００６７】
本発明は：（ｉ）これらの薬剤設計法を使用して同定された化合物；（ｉｉ）医薬として使用するための、これらの薬剤設計法を使用して同定された化合物（ｉｉｉ）抗細菌のような抗微生物剤の製造における、これらの薬剤設計法を使用して同定された化合物の使用；および（ｉｖ）細菌のような微生物感染を有する患者の処置法であって、有効量のこれらの薬剤設計法を使用して同定された化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００６８】
治療法および組成物
本発明は：（ａ）本発明の化合物、ポリペプチド、および／またはペプチド模倣物；および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本発明の組成物は微生物感染を発症する危険があるかまたは有すると診断された患者の処置に、あるいは患者の１人または群の、感染を重度の感染に進行させる危険を低減するために使用する。
【００６９】
成分（ａ）は組成物の有効成分であり、そしてこれは治療上有効量、すなわち患者内での微生物の増殖および／または生存を阻害するのに有効な量、および好ましくは微生物感染を削除するのに有効な量で存在する。正確な患者にとって有効な量は、体格および健康状態、感染の性質および程度、および投与に選択する組成物または組成物の組合せに依存する。有効量を通常の実験によって決定することができ、医師の判断のうちである。本発明の目的のために、有効な投与量は一般的に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。ポリペプチドを利用した医薬組成物は、当該技術分野で既知である。ポリペプチドは塩形および／またはエステルの組成物を含み得る。
【００７０】
「薬学的に許容される担体」には、それ自体組成物を投与される固体に有害な抗体の生産を誘導しないあらゆる担体が含まれる。適当な担体は、典型的には、巨大な、緩やかに代謝されるマクロ分子、例えばタンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ショ糖、トレハロース、ラクトースおよび脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）である。かかる担体は当業者に周知である。
【００７１】
医薬組成物を当該技術分野で既知の方法で投与することができる。これには、限定されないが、局所投与および静脈内、エアロゾル、皮下、および筋肉内経路が含まれていてよい。医薬組成物を１個の用量または複数用量で得ることができる。
【００７２】
微生物感染は、１種の微生物で、または複数種の微生物であり得る。２種以上の細菌、ウイルスまたは真菌のいずれかによる感染の組合せであり得る。微生物感染が細菌からもたらされるとき、それはグラム陽性菌および／またはグラム陰性菌であり得る。典型的な重度の感染に関与するグラム陰性菌には、Escherichia coli、Bacteroides fragilis、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella種、Enterobacter種、およびProteus種が含まれる。典型的な重度の感染に関与するグラム陽性には、Streptococcus Pneumoniae、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Enterococcus種、Streptococcus agalactiaeおよびStreptococcus pyogenesが含まれる。重度の真菌感染には、Candida albicans、Candida glabrata、Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Cryptococcus neoformansおよびFusarium種が含まれる。ウィルス感染はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペス、ヒト乳頭腫ウイルス、肝炎ウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、インフルエンザ、およびヒトＴ細胞白血病ウイルスが関与し得る。寄生原虫感染は、Trypanosoma cruzi、およびLeishmania、Giardia、EntamoebaおよびPlasmodium種が関与し得る。
【００７３】
微生物感染には例えば、肺炎、耳感染、下痢、尿路感染、皮膚障害、局所および粘膜ならびに播種性侵襲性真菌感染が含まれる。
【００７４】
本発明の組成物はさらに、とりわけ複数の投与フォーマットにパッケージされているとき、さらなる抗菌剤を含んでいてもよい。
【００７５】
本発明はまた、微生物感染を発症する危険があるか、または有すると診断された患者の処置用医薬の製造における本発明の化合物およびポリペプチドの使用を提供する。
【００７６】
処置に好ましい患者は子供（例えば幼児または乳児）、１０代および大人を含むヒトである。
【００７７】
一般
「含む」なる用語は、「含んでいる」および「からなる」を包含し、例えばＸを「含む」組成物は排他的にＸからなることもあり、あるいは別のものを含む、例えばＸ＋Ｙであり得る。
【００７８】
数値ｘに関する「約」なる用語は例えばｘ±１０％を意味する。必要であれば、用語「約」を削除することができる。
【００７９】
「実質的」なる用語は、「完全な」を排除しない、例えばＹを「実質的に含まない」組成物はＹを完全に含まなくてもよい。必要であれば、「実質的」なる用語を本発明の定義から削除することができる。
【００８０】
配列の同一割合はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムを使用して、ギャップオープンペナルティーを１２、そしてギャップエクステンションペナルティを２、ＢＬＯＳＵＭマトリックスを６２としてアフィンギャップサーチを使用して、決定することができる。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムは文献３６に記載されている。
【００８１】
上記のとおり、本発明の核酸およびポリペプチドには以下の配列が含まれ得る：
（ａ）配列表に記載の配列と同一（すなわち同一率１００％）のもの；
（ｂ）配列表に記載の配列と同一の配列を共有するもの；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と比較して、離れた位置または連続して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の１ヌクレオチドまたはアミノ酸置換（欠失、挿入、置換）を有するもの；および
（ｄ）対アラインメントアルゴリズムを用いて配列表から特定の配列を整列させたとき、最初（Ｎ末端または５’）から終わり（Ｃ末端または３’）まで移動するｘモノマー（アミノ酸またはヌクレオチド）の移動窓を、（ｐ＞ｘのとき）ｐモノマーに伸長するアラインメントについてｐ−ｘ＋１が当該窓に存在するように、各窓が少なくともｘ・ｙ同一整列モノマーを有する：ここでｘは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０から選択され、ｙは０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され；そしてｘ・ｙが整数ではないときそれは最も近い整数に切り上げる。好ましい対アラインメントアルゴリズムは初期パラメーター（例えばＧａｐオープニングペナルティ＝１０．０、およびＧａｐエクステンションペナルティ＝０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２をスコアするマトリックスを使用する）を用いたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム（文献３７）である。このアルゴリズムは簡便には、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルツールで実行される。
【００８２】
本発明の核酸およびポリペプチドはさらに、これらの配列（ａ）〜（ｄ）のＮ末端／５’および／またはＣ末端／３’にさらなる配列を有し得る。
【００８３】
「微生物性」および「微生物」なる用語は、細菌、ウイルスおよび真菌を含む全ての微生物を包含する。
【００８４】
「動物」なる用語はヒトを含むあらゆる動物界のメンバーを意味する。本発明の化合物は補体系を有する動物に有用である。
【００８５】
本発明の実施には、別段の指示がない限り、当該技術分野に含まれる常套の化学的、生物学的、分子生物学的、免疫学的、および薬学的方法を使用する。かかる技術は文献に十分に説明されており、例えば文献３９〜４６等を参照する。
【００８６】
補体系は、標的細胞の細胞膜を破壊することによって、またはオプソニン化を増加させることによって微生物性病原を生物から排除する手助けをする、免疫系の生化学カスケードである。古典的な補体経路はＣ１複合体（Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓからなる）の活性化によって開始される。活性化にはＣ１ｑ分子のコンホメーション変化を含んでいてもよく、これはＣ１ｒセリンプロテアーゼ分子の活性化および続くＣ１ｓの切断を導く。得られたＣ１複合体はＣ２およびＣ４に結合し、Ｃ２ｂおよびＣ４ｂを切断によって製造することができる。別の補体経路は直接病原の表面でのＣ３加水分解によって開始される。レクチン補体経路は古典的な経路と類似であるが、オプソニン、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）およびフィコリンをＣ１ｑの代わりに有する。補体の細胞溶解最終生成物はＣ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９からなる膜攻撃複合体（ＭＡＣ）である。ＭＡＣは標的細胞の浸透溶解を引き起こす膜透過チャンネルを形成する。本発明の化合物は補体またはＣ１ｑのようなその成分と相互作用することができる。
【００８７】
図面の簡単な説明
図１はタンパク質分解性消化ＴＦＰＩの全血中での細菌殺傷活性を示す。ＴＦＰＩをプラスミン、トロンビン（１Ａ）、エラスターゼ（１Ｂ）またはカテプシンＧ（１Ｃ）でタンパク質分解した。カテプシンＧでタンパク質分解したＴＦＰＩは、カテプシンＧ単独または全ＴＦＰＩと比較して最も高い抗菌活性を示した。
【００８８】
図２はタンパク質分解のインキュベーション時間の増加が抗細菌活性の上昇をもたらすことを示す。２Ａは時間に対するタンパク質分解消化物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示し、２Ｂは消化物の抗細菌活性の上昇を示す。２Ｃは殺傷がカテプシンＧによるものではないことを示す。
【００８９】
図３は消化によって生じた主要なプロトリティック（protolytic）フラグメントを示す。ＴＦＰＩをカテプシンＧで消化し、ゲルろ過フラクションを回収した。
【００９０】
図４はＴＦＰＩタンパク質分解後ゲルろ過フラクションの抗細菌活性を示す。
【００９１】
図５はゲルろ過を１ＭのＮａＣｌの存在下で行ったときのゲルろ過フラクションを示す。
【００９２】
図６は脱塩後１Ｍ ＮａＣｌゲルろ過フラクションを示し（６Ａ）、そしてカラムからの抗細菌活性の快復を示す（６Ｂ）。６Ｃは６Ａに示した純粋なＴＦＰＩフラグメントの抗細菌活性を示す。
【００９３】
図７はＮ末端配列および抗細菌活性を有するゲルろ過フラクションのバンドからの質量分析について選択したペプチドを示す。
【００９４】
図８は抗細菌活性が活性な補体に依存することを示す。８Ａおよび８Ｂは熱不活性化あるいは血漿（Ａ）または血清（Ｂ）によって殺傷活性が減少することを示す。８Ｃはコブラ毒因子によっても殺傷活性が減少することを示す。８Ｄは血清中のペプチドの殺傷活性が全血におけるそれと類似していることを示す。
【００９５】
図９は古典的な補体経路がＴＦＰＩペプチドの抗細菌活性に必須であることを示す。
【００９６】
図１０は蛍光ラベルペプチドの細菌への結合を示し、そして結合がヘパリンの存在によって阻害されることを示す。図１０Ａ−１０Ｄは１０００×、蛍光；図１０Ｅ−１０Ｈは１０００×、白色光である。
【００９７】
図１１はＴＦＰＩの抗細菌活性にとってＴＦＰＩのＣ末端領域の重要性を示す。
【実施例】
【００９８】
実施例
本発明はとりわけ有利な態様を記載している下記実施例の説明によって例示する。しかし、これらの態様は例示であって、いかなる方法においても本発明を限定するように構成されていない。
【００９９】
下記実施例において、全ての外来性ＴＦＰＩはＴＦＰＩアナログ、ａｌａ−ＴＦＰＩである。
【０１００】
実施例１． タンパク質分解性ＴＦＰＩの抗菌効果
実験Ｉ
ＴＦＰＩをα−トロンビン、プラスミン、エラスターゼおよびカテプシンＧと、１０％血液中でインキュベートし、下記のとおり大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７に対する細菌殺傷活性について試験した。組換えＴＦＰＩ ５μＭ（別段の指示がない限り）をプラスミン（１００ｎＭ、レーン３）およびα−トロンビン（１００ｎＭ、レーン７；１μＭ、レーン８）（Ａ）、エラスターゼ（１００ｎＭ、レーン３および４）（Ｂ）、ならびにカテプシンＧ（１００ｎＭ、レーン４；１μＭ、レーン５、６および７）と、（Ｃ）全体積１８０μｌで処理した。ＴＦＰＩを含む反応物をフェノールレッドなしＲＰＭＩ １６４０、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５（ＲＰＭＩ）、４０μｌ ＰＢＳ中３０００ＣＦＵ 大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７および２０μｌ ＲＰＭＩ中希釈酵素で希釈した。体積をＲＰＭＩで調節した。サンプルを１５〜３０分間プレインキュベートした後、最終体積２００μｌまで抗凝固剤を含まない新鮮な血液を加えた。対照はＲＰＭＩ中１０％血液、ＴＦＰＩ １、２および５μＭ、およびそれぞれの濃度で酵素のみであった。サンプルを４時間、３７℃で５％ＣＯ２と湿潤インキュベーター中でインキュベートし、連続希釈物をＴｒｙｐｔａｓｅ大豆カンテンプレートに播種した。細菌コロニー数を、一晩３７℃でインキュベーション後に測定した。全実験条件は２連で行う。データは平均のコロニー数を示す。
【０１０１】
実験ＩＩ
ＴＦＰＩをカテプシンＧを使用してタンパク質分解的に消化し、下記の通り１０％血液の存在下での大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７に対する細菌殺傷活性について試験した。製剤バッファー（３００ｍＭ Ｌ−アルギニン、５ｍＭ メチオニン、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）中１０ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩ（１．２ｍｇ）をカテプシンＧ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中）１０μＭで処理し、１μｌおよび１８μｌのアリコートを５日にわたって取った。１μｌアリコートを１０〜２０％グリシンゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で分析した。
【０１０２】
図２Ａに示すとおり、５日間ＴＦＰＩのカテプシンＧでのインキュベーションは部分消化をもたらした（M, Prestained Standard; S, start of digestion）。
【０１０３】
１８μｌのアリコートを１０μＭ ＴＦＰＩに、４４５μｌのフェノールレッドなしＲＰＭＩ １６４０、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５（ＲＰＭＩ）で希釈し、４０μｌ ＰＢＳ、１０％非凝固血液中３０００ＣＦＵ 大腸菌を含む２００μｌの反応物中５μＭの最終濃度でアッセイし、ＲＰＭＩで最終体積に調節した。陰性対照はＲＰＭＩ中１０％血液、ＴＦＰＩ ５μＭおよびカテプシンＧ ４００ｎＭであった。抗凝固剤を含まない血液を新たに抜き取り、最終成分として反応物に加えた。サンプルを上記の通り操作した。
【０１０４】
図１および２に示すとおり、消化したＴＦＰＩは細菌増殖を阻害し、時間に対して活性が増加した。カテプシンＧおよび未消化ＴＦＰＩは同様の活性を示さなかった。したがって、ＴＦＰＩのフラグメンテーションは新規活性の解放をもたらす。
【０１０５】
実験ＩＩＩ
ＴＦＰＩタンパク質分解性フラグメントの活性領域を定義するために、ＴＦＰＩを分取スケールで消化し、下記のとおりＲＰＭＩ中ゲルろ過に供した。ＴＦＰＩ（１２ｍｇまたは２３ｍｇ）を上記の通りカテプシンＧで２日間消化し、平行サンプルをHiload Superdex 30 16/60カラムでＲＰＭＩ中、あるいは最終濃度１Ｍとなるように固体として加えたＮａＣｌを含むＲＰＭＩ中で、ゲルろ過によって分画した。１ｍｌ分画を回収し、１６％トリシンゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分析した。
【０１０６】
図３および５はＲＰＭＩおよび１Ｍ ＮａＣｌを含むＲＰＭＩでそれぞれ得られた分離物を示す。図３と図５を比較すると理解できるように、フラグメント１〜フラグメント３の改善された分離物が１Ｍ ＮａＣｌ中で得られ、フラグメント２が１Ｍ ＮａＣｌ中フラクションの定義の数中のみで溶出する。
【０１０７】
分画を下記の通り細菌殺傷活性について試験した：ＲＰＭＩ中ゲルろ過に由来する分画のアリコート １００μｌを、上記の通り反応物 ２００μｌに直接加え、細菌コロニーの増殖に対する効果をアッセイした。１Ｍ ＮａＣｌを含む分画を、１ＫＤａのカットオフを有するＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓを使用してＲＰＭＩ中で約１５５ｍＭのＮａＣｌ、および６００μｌの分画サイズに脱塩した。図６Ａに示すものは１Ｍ ＮａＣｌ中ゲルろ過に由来する分画である。アリコート ２５μｌまたは１００μｌの分画を上記の通り反応物 ２００μｌに加えて、細菌生存に対する効果をアッセイした。
【０１０８】
図４から理解できるとおり、ＲＰＭＩ中でゲルろ過した後、アッセイした全分画は細菌殺傷アッセイにおいてごくわずかな活性のみを示す。対照的に、図６Ｂに示すとおり、１Ｍ ＮａＣｌ中ゲルろ過に由来する分画のいくつかは強力な細菌殺傷活性を示す。最高の活性は分画２１および２２において見られる。分画２７および２８は高濃度で加えたとき（４倍増加分画体積）弱い活性を示した。このデータは消化したＴＦＰＩは抗菌活性を含むことを示す。
【０１０９】
実験ＩＶ
図６Ａに示したフラグメント１、２および３をさらに精製した。簡潔に述べると、Ｍｏｎｏ−Ｓカラムを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ中０．５Ｍ〜１Ｍ ＮａＣｌグラジエント、ｐＨ７でのカチオン交換のために使用して、フラグメント１および２を精製した。Ｍｏｎｏ−Ｑカラムを５０ｍＭ〜１Ｍ ＮａＣｌグラジエントでのアニオン交換のために使用してフラグメント３を精製した。１ｍｌの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で上記の通り分析した。精製フラグメントを上記の通りＲＰＭＩにバッファー交換し、細菌殺傷活性についてアッセイした。
【０１１０】
図６Ｃに示すとおり、ＴＦＰＩのＣ末端由来の精製したフラグメントは細菌殺傷活性を有する。低濃度（１：２希釈）のフラグメント１（ａａ１６１／１６５−２７６と同定；レーン１、２、３）は低い活性レベルを示した。フラグメント２（１８３−２６９／２７６と同定、レーン４）はフラグメント１（レーン２、比較ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって決定）と同じ濃度で同様の活性を示す。フラグメント３（ａａ１−９０と同定）は活性がない。
【０１１１】
実施例２． ＴＦＰＩタンパク質分解性フラグメントのＮ末端配列決定
【０１１２】
生物学的に活性なフラグメントの分子同一性を同定するために、ゲルろ過分画２１、２３および２５に由来する特定のタンパク質分解性バンドを単離し、下記のとおりＮ末端配列決定に供した。分画のアリコートを１６％トリシンゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離し、１０ｍＭ ＣＡＰＳ、１０％メタノール、（ｐＨ１１）中でＰＶＤＦ膜にブロッティングした。膜を４０％ メタノール中０．０２５％ Coomassie Brilliant Blue Gで１分間染色し、５０％メタノールの複数回交換で３０分間脱染色し、興味のあるバンドを図７の箱に記載の通りに切り出した。質量分析をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを使用してこれらの分画に対して行った。
【０１１３】
Ｎ末端配列決定の結果は、抗細菌活性を有する分画はＴＦＰＩのＣ末端領域に由来するフラグメントを含んでいることを示した。結果は下記の通りである：分画２１のＮ末端配列決定によって同定した主要な種はアミノ酸１６１および１６５で開始しており、分画２３はアミノ酸１で開始しており、そして分画２５ではアミノ酸１８３で開始している。これらの結果および質量分析によって同定した種を要約する。
【０１１４】
示した結果を合わせて考えると、活性な分画中の主要なタンパク質種はＴＦＰＩのＣ末端ドメインに由来し、アミノ酸１６１−２６９、アミノ酸１６５−２６９、アミノ酸１８３−２７６およびアミノ酸１８３−２６９を含む。ＴＦＰＩのＮ末端に由来するフラグメント（アミノ酸１−９０）はまた、同じ分画中で見出されるが不活性である。
【表１】
【０１１５】
実施例３： ＴＦＰＩのＣ末端領域の重要性
ＬＰＳの存在下でＩＬ−６分泌を誘導するＴＦＰＩの能力を、ＴＦＰＩならびに（ｉ）ＴＦＰＩの１〜１６１残基を有するＴＦＰＩ１−１６１；（ｉｉ）変異Ｋ１を有するＴＦＰＩ；（ｉｉｉ）変異Ｋ２を有するＴＦＰＩ；（ｉｖ）変異Ｋ１およびＫ２を有するＴＦＰＩを含むＴＦＰＩアナログを使用して試験した。
【０１１６】
希釈し、新たに採血した全血をグラム陰性菌の細胞壁由来のＬＰＳとインキュベートすると、サイトカインカスケードが数時間以内に誘導される。図１１ａに示すとおり、Ｋ２ドメインまたは１６２〜２７６アミノ酸（Ｃ末端ドメインを含む領域）の欠失はＩＬ−６分泌誘導能の喪失をもたらす。このことから、Ｋ２ドメインおよびＴＦＰＩのＣ末端１／３部分がこの活性に必要であると結論づけられる。
【０１１７】
図１１ｂは同様の実験の結果を示す。ａｌａ−ＴＦＰＩのＩＬ−６誘導能はＫ３ドメインのみを欠失しているＤｅｓ−Ｋ３−ＴＦＰＩと極めてよく似ている。対照的に、１６１ａａまたは２５２ａａを残すＣ末端の切断によって陰性対照である緑蛍光タンパク質と同様のＩＬ−６誘導プロファイルを有する分子を得る。したがって、ＩＬ−６誘導能はＴＦＰＩのＣ末端である残基２５２の下流のアミノ酸に含まれ得る。
【０１１８】
ＴＦＰＩの２２末端アミノ酸（すなわち配列番号３）からなるペプチドをＬＰＳの存在下におけるＩＬ−６アッセイで試験した。図１１ｃに示すとおり、ペプチド含有物はペプチドおよびＬＰＳ用量依存方法において、ＬＰＳのサイトカイン生産効果を完全に逆転する。したがって、このペプチドはＬＰＳの内毒素活性を中和することができる。
【０１１９】
図１１ｄは２２マーを大腸菌Ｏ１８ａｃ：Ｋ１：Ｈ７（ＡＴＣＣ）とインキュベートした結果を示す。ＩＬ−６誘導アッセイにおいて、生存細菌の接種材料を希釈した全血に加えた。２２マーは用量依存的に細菌生存を減少させた。このことは細菌コロニーの増殖の抑制の抑制によって示された。３００ｎＭのペプチドで全細菌を殺害した。
【０１２０】
したがって、２２マーはＬＰＳを中和することができ、そして生存細菌に対する直接殺菌効果を有する。これらの活性は、細菌感染に対する防御の先天性免疫応答の一部であり得る。アッセイはＴＦＰＩの作用メカニズムの局面を明らかにし、そして内毒素を中和し、血清と細胞受容体の相互作用を妨げることによって細菌感染の進行を調節することができる分子としてのＴＦＰＩおよびそのアナログを示す。この活性は敗血症の初期段階、または抗菌剤での処置後の内毒素放出の後に、重要な役割を果たし得る。ＬＰＳの高血清レベルは感染性ショックを有する患者の致命的な結果と関連している（文献４７）。
【０１２１】
実施例４． ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドの抗菌効果
実験Ｉ
ＴＦＰＩのＣ末端ドメインに存在する殺菌活性について試験するためにペプチドを設計した。活性をグラム陰性（大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７． ＡＴＣＣ ７００９７３）菌に対して、１０％血液の存在下で上記の通り測定した。対照は１０％血液および１００ｎＭのチファコギンを有するＲＰＭＩであった。生物学的活性を細菌コロニーの減少から、上記のとおり測定した。
【０１２２】
２２マー（配列番号３；ペプチド＃１）の抗菌効果をスクランブル対照ペプチド（配列番号８；ペプチド＃２）、ならびに１３アミノ酸がさらに上流にシフトしたＮ末端および８アミノ酸が上流にシフトしたＣ末端を有するＴＦＰＩフラグメント（すなわち配列番号７；ペプチド＃３）と比較した。ペプチド＃３は天然ＴＦＰＩの配列番号３の上流に位置するトロンビン切断部位に含まれる。ペプチド＃１と＃３の１４マーオーバーラップは配列番号５である。ペプチド＃５（配列番号１０）はペプチド＃３のアミノ酸およびさらにペプチド＃１のＣ末端８アミノ酸を含む。配列およびそれらの対応するペプチド数を下記に示す：
【表２】
【０１２３】
＃１、＃２、および＃３の３つのペプチドを水で最終アッセイ濃度である１０倍に希釈し、細菌と４時間、３μＭ、３００ｎＭ、１００ｎＭおよび１０ｎＭの最終濃度でインキュベートした。大腸菌を３０００ＣＦＵ／２００μｌで使用した。生存コロニー数を上記実施例１のとおりに測定した。表１に示すとおり、ペプチド＃１および＃３は共に、Ｏ１８ａｃ：Ｋ１：Ｈ７大腸菌株に対して活性であった。ペプチド＃３はペプチド＃１よりも、３０００ｎＭで血液とインキュベートしたとき得られる細菌の合計殺傷において良好な活性を示し、これはトロンビン切断部位での切断が不活性化であることを示唆した。全長ＴＦＰＩはこれらのアッセイで試験した濃度ではグラム陰性菌に対して活性を有さない。表２はペプチド＃３およびペプチド＃５の３００ｎＭ、１００ｎＭおよび１０ｎＭに連続希釈した後の生物学的活性を示す。ペプチド＃５の活性は同様であるが、ペプチド＃３と比較してわずかに減少する。
【０１２４】
【表３】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【表４】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１２５】
実験ＩＩ
ペプチド＃３を通常ヒト血清を対照として使用して大腸菌のさらなる株について３μＭでの活性について試験した。表３に示すとおり、大腸菌Ｏ２ａ、２ｂ：Ｋ５（Ｌ）：Ｈ４（ＡＴＣＣ ２３５００）およびＯ７：Ｋ１（Ｌ）：ＮＭ （ＡＴＣＣ ２３５０３）はペプチド＃３によって、大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７と同様の方法で影響された。
【表５】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１２６】
実験ＩＩＩ
ペプチド＃１、＃３および＃４を、血液なしでの大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７に対する活性について試験した。ペプチドを３μＭでアッセイした。同じ血液およびＴＦＰＩ対照が実験Ｉに含まれている。
【表６】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１２７】
血液なしでは、ペプチドは大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７にほとんど抗菌活性を示さなかった。表４に示すとおり、大腸菌生存に対するペプチドの影響は、３０００ｎＭであっても増殖培地のみのものと同様であった。対照的に、既知の抗菌ペプチドＬＬ３７（ペプチド＃４；配列番号９）はこの濃度で細菌の完全阻害を示した。したがって、ＴＦＰＩ由来ペプチドは、血液中に見出される因子と共に作用してそれらの抗菌効果を得ることができる。
【０１２８】
実験ＩＶ
ペプチド＃１（配列番号３）、ペプチド＃２（配列番号８）、ペプチド＃３（配列番号７）およびペプチド＃４（配列番号９）の抗菌効果を下記アッセイでさらに評価した。
【０１２９】
時間依存性：ペプチドを３０００ＣＦＵの大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７と、記載の最終濃度で１０％血液の存在下で２００μｌの反応を３つ平行して、上記の通りインキュベートした。１０％血液を含むＲＰＭＩを陰性対照として使用した。１、３または５時間インキュベーションした後、連続希釈物をカンテンプレートに播き、サンプルを細菌性増光かについてアッセイした。表５は、クリアランスが１時間では見られなかったが３および５時間後のペプチド＃１、＃３および＃４によって示されたように、細菌クリアランスの時間依存性を示す。ペプチドの細菌生存に対する効果は試験した時間によって増加する。また、ペプチド＃３はインキュベーションの３および５時間の両方でペプチド＃１よりも高い活性を示した。
【表７】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１３０】
ペプチド＃１（配列番号３）、ペプチド＃２（配列番号８）、ペプチド＃３（配列番号７）およびペプチド＃４（配列番号９）の抗菌効果をさらに下記アッセイで評価した。
【０１３１】
キャパシティー：表６は細菌滴定による細菌クリアランスのキャパシティーを示す。これらの実験では様々な濃度の大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７（３×１０３、３×１０４または３×１０５ＣＦＵ／２００μｌ）を３μＭまたは１００ｎＭペプチド＃３で、ＲＰＭＩ／１０％血液中で試み、希釈前３または５時間インキュベートし、播種した。簡潔に述べると、細菌を記載の４０μｌ ＰＢＳ中ＣＦＵに希釈し、反応を２００μｌの最終体積で上記のとおり評価し、３７℃でインキュベートした。反応物の連続希釈液を播き、一晩インキュベーション後のコロニー数を測定した。３時間で、ペプチド＃３は使用した全ＣＦＵで効果を示した。５時間で、高ＣＦＵ培養物に対する効果が認識できず、殺傷活性の滴定およびキャパシティーを超える高ＣＦＵ培養物であることを示す。
【表８】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１３２】
実施例５． 細菌殺傷活性は活性成分に依存する
実験Ｉ
図８Ａに示すとおり、ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドは、血液の無細胞分画（血漿または血清）と組み合わせたときにグラム陰性菌グラム陰性（大腸菌Ｏ１７：Ｋ１：Ｈ７）に対する生物学的活性を有する。図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは活性が血漿または血清を５６℃で３０分間熱処理することによって、およびコブラ毒因子（ＣＶＦ）で処理することによって消失し得ることを示す。ＣＶＦは全ての終末補体成分の減少によって溶解作用を媒介する補体を血清から枯渇させる（文献４８）。図８Ｃにおいて、この結果は血清を１０Ｕまたは１ＵのＣＶＦで下記の通りに処理した実験について示している：１００Ｕ／ｍｌおよび１０Ｕ／ｍｌのＣＶＦの原液をＰＢＳで希釈して製造した。血清を室温で３０分間、１０：１の比でＣＶＦ原液で処理した。対照反応として、ＲＰＭＩを１０Ｕ／ｍｌ ＣＶＦで処理し、血清をＣＶＦなしで室温で平行してインキュベートした。処理した血清を上記の１０％血液の全反応体積で使用した。未処理血清の反応物に１０％ＣＶＦ処理ＲＰＭＩを補った。対照はペプチド＃３が未処理血清または３０分室温でＣＶＦなしでインキュベートした血清において活性であることを示す。ペプチド＃３の活性は１０Ｕ／ｍｌのＣＶＦで処理した血清において消失し、したがって溶解活性を媒介する補体が消失した。１Ｕ／ｍｌのＣＶＦで、ペプチド＃３との組合せでの殺傷活性はなお存在しており、このことは低濃度は補体活性を消失させるのには十分ではないことを示唆している。
【０１３３】
大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７は補体媒介殺傷に抵抗性を付与すると考えられているポリシアル酸Ｋ１カプセルを有する（文献４９）。このデータはＴＦＰＩ由来のカチオン性ペプチドが抵抗性を変化させることができることを示す。
【０１３４】
実験ＩＩ
血清中の細菌殺傷活性が血液中のものを代理するかどうかを評価するため、ペプチド＃１、＃２、＃３、および＃５を３μＭ、３００ｎＭおよび３０ｎＭに連続希釈した。対照として、血清および３００ｎＭ ＴＦＰＩを含む血清を含めた。図８Ｄに示すとおり、ペプチド＃３は血清と組み合わせてもっとも強い効果を有し、次いでペプチド＃５、そしてペプチド＃１は顕著に減少した活性を有する。ペプチド＃２は不活性である。血清中のペプチド活性は血液中で観察されたもの（実施例４、実験Ｉ、表２参照）と同じ程度である。
【０１３５】
実験ＩＩＩ
カテプシンＧ消化ｒＴＦＰＩが血清成分と組合せで作用するかどうかを評価するため、５μＭの最終濃度の消化したｒＴＦＰＩを血液２０μｌまたは血清４０μｌでの細菌殺傷アッセイに参加させた。ペプチド＃３を平行サンプルとして使用した。対照レーンはペプチドまたはｒＴＦＰＩの添加なしでの血液または血清サンプルを示す。表７に示すとおり、プロテアーゼ消化ＴＦＰＩは、ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドと同様に、血清成分と共に作用する。
【表９】
【０１３６】
実施例６． 細菌殺傷活性に含まれる補体因子の同定
実験Ｉ
ペプチド＃３との相乗効果の具体的な標的を同定するため、一つの補体成分を損耗したか欠く血清を使用して細菌殺傷実験を行った。Ｃ３、Ｃ１ｑ−、Ｃ２−、Ｃ６−、およびＣ９を欠くヒト血清、Ｃ４を欠くモルモット血清（遺伝的欠失動物由来）および通常ヒト血清を購入した。実験を上記の通り行った。図９Ａ〜Ｄは補体因子Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ２、Ｃ９を欠くか、またはＣ４を欠く血清を個別に試験した実験結果を示す。これらの実験は上記補体因子の除去または欠損はペプチド＃３の細菌殺傷活性の喪失をもたらすことを示した。注目すべきことに、ほとんどの欠失血清はわずかに殺傷活性が残っているが、Ｃ４欠損血清は完全に細菌殺傷活性を失っており、このことは補体因子の不完全な除去が活性の残存を引き起こし得ることを示唆している。さらに、精製Ｃ１タンパク質複合体または因子Ｃ４をそれぞれの反応物に適当な生理的濃度でもどすと、殺傷活性が回復する（図９ＣおよびＤ）。Ｃ１ｑについて１１７μｇ／ｍｌ、およびＣ４について３１０μｇ／ｍｌの推定血清濃度で、反応を２．３４μｇのＣ１複合体および６μｇの因子Ｃ４をそれぞれ補った。因子Ｃ１ｑは伝統的補体経路のイニシエーターである（文献５０）。因子Ｃ６（Ｃ６ｂ、Ｃ６の酵素的切断の後Ｃ６ａおよびＣ６ｂに）およびＣ９は膜攻撃複合体の構造成分であり、これは補体による食作用から独立した殺傷に関与する溶解孔を形成する。したがって、ペプチド＃３はいくつかの方法で伝統的補体経路と相互作用し、そしてペプチド＃３関連補体殺傷は膜攻撃複合体の形成に依存していると考えられる。
【０１３７】
実験ＩＩ
Ｃ１複合体の活性化はＣ１ｒおよびＣ１ｓのＣａ２＋依存的結合に依存しているが、レクチンおよび他の経路はＣａ２＋から独立しており、全補体経路はＭｇ２＋に依存している。観察された細菌殺傷活性のメディエーターとしての伝統的補体経路の同定をさらに支持するため、５ｍＭのＭｇＣｌ２を補った１０ｍＭのＥＧＴＡ中でキレート化実験を行った。表８に示すとおり、ペプチド＃３は１０ｍＭ ＥＧＴＡおよび５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む血清中での細菌殺傷活性を有さないが、単純血清中の対照実験では活性であった。
【表１０】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１３８】
実施例７． ペプチド結合部位の同定
実験Ｉ
２つのヘパリン結合部位はＴＦＰＩのＣ末端に位置し、ヘパリン相互作用は臨床研究で発見されている（文献５１）。したがって、ヘパリンと細菌殺傷活性の関係について評価するために実験を設計した。ペプチド＃１および＃３を、上記のとおり３μＭで、ヘパリンまたは低分子量ヘパリン ３Ｕ／ｍｌおよび０．３Ｕ／ｍｌの存在下または非存在下で使用した。さらに、対照は平行反応で同じ条件で処理した血液であった。未断片化ヘパリン ０．３Ｕ／ｍｌはペプチドの細菌殺傷活性の一部消失（データ示さず）、および３Ｕ／ｍｌはこの活性を消失させた（表９参照）。表９のデータは０．３Ｕ／ｍＬの低分子量ヘパリンの存在下では強く妨げ、そして３Ｕ／ｍＬでは殺傷活性が消失することを示す。これはＴＦＰＩのＣ末端のヘパリン結合部位の相互作用がペプチドの生物学的活性に必要であることを示唆している。
【表１１】
Ｎ．Ｄ．＝検出不可
【０１３９】
実験ＩＩ
ＴＦＰＩのＣ末端とＬＰＳの相互作用は記載されている（文献５２）。ペプチド＃３と細菌細胞表面の直接相互作用を示すため、蛍光標識ペプチドを増殖細菌株と、増殖濃度のヘパリンの存在下または非存在下でインキュベートした。実験の詳細は下記の通りである：大腸菌Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７（１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）の凍結株を１：５でＬＢ増殖培地で希釈し、４０分間３７℃でインキュベートした。アリコート ０．７ｍｌ（３×１０８ＣＦＵ）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で２回洗浄し、１０％熱活性化血清を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１００μｌで再懸濁した。未断片化ヘパリンを１０倍の濃度で加え、３０、３および０．３Ｕ／ｍｌとするか、または除き、そしてサンプルを３０分間室温でインキュベートした。Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）５５５ Ｄｙｅ−タグ化ペプチド＃３を１００倍（１μｌ）濃度で加えて３００ｎＭとし、そして暗所で５分間インキュベートした。サンプルを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド２００μｌで再懸濁し、暗所で１５分間インキュベートした。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で洗浄した後、サンプルを１００〜３００μｌで再懸濁し、１０μｌをカバーグラスに乗せ、空気乾燥した。カバーグラスにスライドグラスを、マウント培地と共に乗せた。顕微鏡分析を、ＡｘｉｏＣａｍカメラを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００反転蛍光顕微鏡を使用して行った。
【０１４０】
図１０に示すとおり、蛍光標識ペプチド＃３とヘパリンなしでインキュベートした細菌は結合を示す（Ａ）。０．３Ｕ／ｍｌ ヘパリンでは、蛍光シグナルが減少し（Ｂ）、３０および３Ｕ／ｍｌ ヘパリンでは結合が消失する（ＣおよびＤ）。図１０Ｅ〜１０Ｈは対応するＮｏｍａｒｓｋｉイメージを示す。
【０１４１】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物表面に結合し、動物中に存在する補体系の成分と相互作用して当該微生物を殺す、補体系を有する動物における微生物感染の処置用化合物。
【請求項２】
該化合物が補体系の成分と相乗的に作用する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
該化合物が動物中に存在する補体系の成分と相乗的に作用して微生物をオプソニン化する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
該化合物が動物中に存在する補体系の成分と相乗的に作用して辺生物の溶菌を起こす、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
微生物が細菌、真菌およびウイルスからなる群のいずれか１個から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
微生物がグラム陰性菌である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
化合物が補体系のＣ１ｑ成分と相乗的に作用する、請求項１〜６に記載の化合物。
【請求項８】
配列番号３、５、７および１０から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号３、５、７および１０のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するペプチド（ただし、ポリペプチドはＴＦＰＩではない）を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
配列番号３、５、７および１０から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３、５、７および１０のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するペプチド（ただし、ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではなく、配列番号３、５、７および１０のＮ末端アミノ酸はＬｙｓではない）を含むポリペプチド。
【請求項１０】
ＬＰＳおよび／または細菌と結合することができる、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
５０アミノ酸以下の請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載の化合物または請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項１３】
さらに抗生物質を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
さらにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを、薬学的に許容される担体と共に含む、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、および請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１６】
医薬として使用するための、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物または請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１７】
哺乳類対象における微生物感染の処置用医薬の製造における、有効量の請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項１８】
微生物感染が細菌感染である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
血液を請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチドおよび細菌性微生物と培養する、微生物クリアランス活性のスクリーニング法。
【請求項２０】
天然ＴＦＰＩのＣ末端付近のトロンビン切断部位を欠く、ＴＦＰＩアナログ。
【請求項２１】
天然ＴＦＰＩのアミノ酸Ｌｙｓ ２５４とＴｈｒ ２５５の間に存在するトロンビン切断部位を欠く、ＴＦＰＩアナログ。
【請求項２２】
（ｉ）少なくとも１個のＫｕｎｉｔｚドメインおよび（ｉｉ）Ｃ末端領域を含み、Ｃ末端側のＫｕｎｉｔｚドメインとＣ末端領域の間にトロンビン切断部位を有していないＴＦＰＩアナログ。
【請求項２３】
Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むＮ末端ポリペプチドおよびＫｕｎｉｔｚドメインを含まないＣ末端ポリペプチド与えるように、トロンビンによって切断され得ないＴＦＰＩアナログ。
【請求項２４】
２個未満のＬｙｓ Ｔｈｒジペプチドを含むＴＦＰＩアナログ。
【請求項２５】
ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン３を含み、ＴＦＰＩのＣ末端ドメインを欠くＴＦＰＩアナログ。
【請求項２６】
Ｃ末端から２３アミノ酸以下を切断したＴＦＰＩである、ＴＦＰＩアナログ。
【請求項１】
微生物表面に結合し、動物中に存在する補体系の成分と相互作用して当該微生物を殺す、補体系を有する動物における微生物感染の処置用化合物。
【請求項２】
該化合物が補体系の成分と相乗的に作用する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
該化合物が動物中に存在する補体系の成分と相乗的に作用して微生物をオプソニン化する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
該化合物が動物中に存在する補体系の成分と相乗的に作用して辺生物の溶菌を起こす、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
微生物が細菌、真菌およびウイルスからなる群のいずれか１個から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
微生物がグラム陰性菌である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
化合物が補体系のＣ１ｑ成分と相乗的に作用する、請求項１〜６に記載の化合物。
【請求項８】
配列番号３、５、７および１０から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号３、５、７および１０のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するペプチド（ただし、ポリペプチドはＴＦＰＩではない）を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
配列番号３、５、７および１０から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３、５、７および１０のいずれかと少なくとも８０％同一性を有するペプチド（ただし、ポリペプチドはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログではなく、配列番号３、５、７および１０のＮ末端アミノ酸はＬｙｓではない）を含むポリペプチド。
【請求項１０】
ＬＰＳおよび／または細菌と結合することができる、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
５０アミノ酸以下の請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載の化合物または請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項１３】
さらに抗生物質を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
さらにＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを、薬学的に許容される担体と共に含む、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、および請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１６】
医薬として使用するための、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物または請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１７】
哺乳類対象における微生物感染の処置用医薬の製造における、有効量の請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項１８】
微生物感染が細菌感染である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
血液を請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチドおよび細菌性微生物と培養する、微生物クリアランス活性のスクリーニング法。
【請求項２０】
天然ＴＦＰＩのＣ末端付近のトロンビン切断部位を欠く、ＴＦＰＩアナログ。
【請求項２１】
天然ＴＦＰＩのアミノ酸Ｌｙｓ ２５４とＴｈｒ ２５５の間に存在するトロンビン切断部位を欠く、ＴＦＰＩアナログ。
【請求項２２】
（ｉ）少なくとも１個のＫｕｎｉｔｚドメインおよび（ｉｉ）Ｃ末端領域を含み、Ｃ末端側のＫｕｎｉｔｚドメインとＣ末端領域の間にトロンビン切断部位を有していないＴＦＰＩアナログ。
【請求項２３】
Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むＮ末端ポリペプチドおよびＫｕｎｉｔｚドメインを含まないＣ末端ポリペプチド与えるように、トロンビンによって切断され得ないＴＦＰＩアナログ。
【請求項２４】
２個未満のＬｙｓ Ｔｈｒジペプチドを含むＴＦＰＩアナログ。
【請求項２５】
ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン３を含み、ＴＦＰＩのＣ末端ドメインを欠くＴＦＰＩアナログ。
【請求項２６】
Ｃ末端から２３アミノ酸以下を切断したＴＦＰＩである、ＴＦＰＩアナログ。
【公表番号】特表２００９−５０２８１０（Ｐ２００９−５０２８１０Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２３０４５（Ｐ２００８−５２３０４５）
【出願日】平成１８年７月２４日（２００６．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２８８０４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１４１９９
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２４日（２００６．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２８８０４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１４１９９
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
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