複合体
【課題】診断薬などの標識物質に使用可能なレベルの高い発光活性を有するイクオリンと抗体との複合体の提供、および、そのイクオリンと抗体との複合体の簡便且つ効率的な製造方法の提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、他の特定のアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とを、該システインを介して結合させ、イクオリンと抗体との複合体を製造する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、他の特定のアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とを、該システインを介して結合させ、イクオリンと抗体との複合体を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質と抗体との複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム結合型発光蛋白質は、カルシウムと特異的に反応し、瞬間発光する蛋白質であり、現在、イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン、ミネオプシン、およびベルボイン等が知られている。これらの発光蛋白質のカルシウムイオンに対する感受性は非常に高く、その発光感度もまた、市販の検出装置においての検出感度が１ピコグラム以下と非常に高いものである。そのため、カルシウム結合型発光蛋白質は、このような特徴を活かし、細胞内カルシウムや血液中の微量カルシウムイオンの検出、定量に用いられている（例えば、非特許文献１を参照）。これらの発光蛋白質は、その発光がカルシウムイオンとの特異的結合によるものであるため、通常の化学発光で問題になるバックグランドがほとんどなく、且つ反応自体が瞬間発光で数秒以内に終了するため、短時間にシグナル対ノイズ比の高い結果を得ることができるという利点を有する。
【０００３】
さらに、その発光反応系は、生物発光と呼ばれる酵素発光反応であり、すべて生体内由来の成分で構成されているため、有害な化学発光物質等（例えばラジオアイソトープや発癌性化合物等）を含んでおらず安全性が高い。このため、当該発光蛋白質は、診断薬等における標識として応用されている。
【０００４】
これらの発光蛋白質を標識として用いる場合、発光蛋白質は、通常、被検体に特異的に結合する物質（以下「結合性物質」と言うことがある。）と発光蛋白質とが化学的に結合した複合体の形で使用される。結合性物質としては、酵素、レクチン、糖蛋白質、ペプチド、薬物、レセプター、抗原、抗体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインA、プロテインG、ホルモン、核酸、および核酸結合蛋白質などが用いられている。
【０００５】
結合性物質と発光蛋白質との化学的な結合反応には、一般的に架橋試薬が用いられている。架橋試薬の中でも、反応基として、アミノ基と特異的に結合するＮＨＳエステルと、スルフヒドリル基と特異的に結合するマレイミド基とを有する架橋試薬は、それを用いた場合、該結合反応時における非特異的な結合や、発光蛋白質もしくは結合性物質同士の重合が起こり難いことから、一般に好ましく使用されている。
【０００６】
このＮＨＳエステルとマレイミド基とを有する架橋試薬（以下「２官能性架橋試薬」と言うことがある。）を用いて、発光蛋白質と結合性物質とを化学的に結合させる方法には以下の３通りがある。
（１）発光蛋白質のアミノ末端またはリジン残基の一級アミンに、２官能性架橋試薬のＮＨＳエステルを反応させ、結合性物質のスルフヒドリル基と２官能性架橋試薬のマレイミド基を反応させて、発光蛋白質と結合性物質とを結合させる方法。
（２）結合性物質のアミノ末端またはリジン残基の一級アミンに、２官能性架橋試薬のＮＨＳエステルを反応させ、発光蛋白質のスルフヒドリル基と２官能性架橋試薬のマレイミド基を反応させて、発光蛋白質と結合性試薬とを結合させる方法。
（３）Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）などのスルフヒドリル活性化剤を用いてスルフヒドリル基をイクオリンのアミノ基に導入し、次いでこのイクオリンを抗体と結合する方法。
【非特許文献１】Blinks, J. R., Wier, W. G., Hess, P., and Prendergast, F.G., Prog. Biophys. Mol. Biol. 40: 1-114
【非特許文献２】Ｔ．Ｅｒｉｋａｋｕ、Ｓ Ｚｅｎｎｏ ａｎｄ Ｓ Ｉｎｏｕｙｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、１７４：１３３１−１３３６
【特許文献１】特表平８−５０６８９７
【特許文献２】特開平１０−２５１３００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述の発光蛋白質と結合性物質とを化学的に結合させる方法のうち、（１）の方法でイクオリンと抗体との複合体（以下、イクオリンと抗体との複合体を「Ａ−Ａ複合体」と言うことがある。）を調製した場合、イクオリンの発光活性が著しく低下し、得られるＡ−Ａ複合体は、診断薬などの標識物質としては感度が低く実用的とは言い難かった。
【０００８】
（２）の方法でイクオリンと抗体との複合体を調製した場合には、イクオリンと抗体との反応性が低く、得えられるＡ−Ａ複合体も発光活性が低いことから、イクオリンと抗体の結合方法としては効率の良い方法であるとは言い難かった。
【０００９】
一方（３）の方法であれば、イクオリンの発光活性を維持したまま、イクオリンと抗体とを結合させることも可能である。しかしながら、この方法は操作が煩雑で工程も多く、時間がかかった。さらに、得られたＡ−Ａ複合体を診断薬などの標識物質として使用するためには、スルフヒドリル基をイクオリンのアミノ基に導入する際に使用したスルフヒドリル活性化剤のうち余剰の未反応スルフヒドリル活性化剤を完全に除去する必要があり、その際、イクオリンや抗体がロスしやすかった。
【００１０】
ことほど左様に、従来技術では診断薬などの標識物質に使用可能な高い発光活性を有するＡ−Ａ複合体を、効率よく簡便に製造することは困難であった。即ち、斯様な状況においては、診断薬などの標識物質に好適な高い発光活性を有するＡ−Ａ複合体と、このＡ−Ａ複合体を効率よく製造する方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合しているＡ−Ａ複合体が、診断薬などの標識物質に使用可能なレベルの高い発光活性を有すること、さらに、前述の組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体とを反応させるＡ−Ａ複合体の製造方法であれば、高い発光活性を有するＡ−Ａ複合体を簡便且つ効率よく得られることなどを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、以下の構成を有する。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合している、イクオリンと抗体との複合体。
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合している、イクオリンと抗体との複合体。
（３）該システインを介しての結合が、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬を介しての結合である、前記第１項または第２項に記載のイクオリンと抗体との複合体。
（４）システインのスルフヒドリル基と反応する官能基がマレイミド基である、前記３項に記載のイクオリンと抗体との複合体。
（５）抗体が、腫瘍の増殖に伴って血清や尿中に増加する腫瘍マーカーを抗原とする抗体である、前記第１項または第２項に記載のイクオリンと抗体との複合体。
【００１３】
（６）前記第１項〜第５項に記載の何れかに記載のイクオリンと抗体との複合体を用いることを特徴とする、抗原測定方法。
（７）前記第１項〜第５項に記載の何れかに記載のイクオリンと抗体との複合体を構成成分とする、抗原測定キット。
【００１４】
（８）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体とを反応させることを特徴とする、イクオリンと抗体との複合体の製造方法。
（９）スルフヒドリル基と反応する官能基を有する抗体がマレイミド基を有する抗体である、前記第８項に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
（１０）スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体が、マレイミド基を有する架橋試薬と抗体とを、モル比で５：１〜１０：１の割合で反応させて得られたものである、前記第８項に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
（１１）マレイミド基を有する架橋試薬と抗体との反応が、１０〜３０℃、０．５〜１時間の反応である、前記第１０項に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
（１２）組換えカルシウム結合型発光蛋白質と、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体との割合が、１：３〜１：５（モル比）の範囲である、前記第８項に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
（１３）組換えカルシウム結合型発光蛋白質と、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体との反応が、４〜２０℃、０．５〜２時間の反応である、前記第８項に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のＡ−Ａ複合体は、診断薬などの標識物質に使用可能なレベルの高い発光活性を有し、抗原の検出や測定などに有効である。本発明のＡ−Ａ複合体の製造方法であれば、高い発光活性を有するＡ−Ａ複合体を簡便且つ効率よく製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的にかつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１７】
１．イクオリンと抗体との複合体
本発明に使用する組換えカルシウム結合型発光蛋白質の１つは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする。配列番号１のアミノ末端から４番目までのアミノ酸は、アミノ酸末端から順に、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒである。アミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたとは、ＶａｌとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれかにシステイン残基が挿入されていることを意味する。
【００１８】
システイン残基が挿入される位置は、上記のＶａｌとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれであっても構わないが、ＬｅｕとＴｈｒの間であることが好ましい。ＬｅｕとＴｈｒの間にシステイン残基が挿入されたアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００１９】
本発明に使用する組換えカルシウム結合型発光蛋白質のもう１つは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする。配列番号２のアミノ末端から６番目までのアミノ酸は、アミノ酸末端から順に、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒである。アミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたとは、ＡｌａとＡｓｎの間、ＡｓｎとＳｅｒの間、ＳｅｒとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれかにシステイン残基が挿入されていることを意味する。
【００２０】
システイン残基が挿入される位置は、上記のＡｌａとＡｓｎの間、ＡｓｎとＳｅｒの間、ＳｅｒとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれであっても構わないが、ＬｅｕとＴｈｒの間であることが好ましい。ＬｅｕとＴｈｒの間にシステイン残基が挿入されたアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、天然型アポイクオリンのアミノ酸配列であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、遺伝子組換え法により生産されたアポイクオリン（以下「変異型アポイクオリン」ということがある。）のアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列へのシステインの導入は、公知の方法で行うことができ、具体的には、特開２００４−０００１４３に記載の方法を挙げることができる。
なお、天然型アポイクオリンと変異型アポイクオリンは、市販品を入手することも可能である。また、天然型アポイクオリンであれば、天然の発光クラゲから抽出、精製して入手することも可能である。変異型アポイクオリンは、発光クラゲからアポイクオリンのｃＤＮＡをクローニングし、そのｃＤＮＡを用い、かつ大腸菌を宿主とし、宿主の菌体内及び菌体外でのアポイクオリンを生産させ、抽出、精製するなどの方法により製造することも可能である。
【００２２】
本発明は、前述の組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと抗体とが、導入されたシステインを介して結合しているＡ−Ａ複合体である。該システインを介した結合であれば、組換えカルシウム結合型発光蛋白質と抗体との結合様式は特に限定されるものではないが、本発明においては、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬が、該システインと結合し、この架橋試薬がさらに抗体と結合している形態であることが好ましい。即ち、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬を介して、組換えカルシウム結合型発光蛋白質と抗体とが結合していることが好ましい。
【００２３】
本発明に使用される抗体は特に限定されるものではない。腫瘍マーカーやホルモンなどといったヒトや動植物の生体内微量成分や、環境中の微量汚染物質など、これまで様々な物質を抗原とする抗体が市販されており、測定したい被検体を抗原とする抗体を適宜必要に応じて使用することができる。
【００２４】
中でも、腫瘍の増殖に伴って血清や尿中に増加する腫瘍マーカーとしては、胎児性抗原、ＣＡ１９−９、シリアルＬｅｘ−ｉ抗原、シリアルＴｎ抗原、チミジンキナーゼ活性、組織ポリペプチド抗原、塩基性フェトプロテイン、免疫抑制酸性蛋白、ＣＡ７２−４、ＣＡ１２５、ＤＵＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、エラスターゼ１、ＢＣＡ−２２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ抗原、サイトケラチン１９フラグメント、前立腺特異抗原、γ−セミノプロテイン、前立腺酸性フォスファターゼ、α−フェトプロテイン、ＡＦＰレクチン分画、ＰＩＶＫＡ−II、神経特異エノラーゼ、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＣＡ１３０、Ｉ型コラーゲン−Ｃ−テロペプチドなど、各器官における腫瘍の生成に伴って特異的に増加するマーカーがこれまでに知られている。これらは市販されており、血清あるいは尿中の該マーカーを測定する上での標準物質として適宜利用することができる。更に、これらを抗原とする種々のクラスあるいはサブクラスからなる抗体が市販されており、これらを適宜使用してＡ−Ａ複合体を作製することができる。
【００２５】
システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬は、特に限定されるものではないが、具体的には、Ｎ-（４‐[ｐ-アジドサリシルアミド]ブチル）-３´-２´ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、１，４−ジ-（３´-[２´ピリジルジチオ]プロピオンアミド）ブタン、１，６−ヘキサン-ビス-ビニルスルホン（ＨＢＶＳ）、スクシンイミジル３-（ブロモアセタミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、Ｎ-スクシンイミジル３-（２-ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ-（α‐マレイミドアセトキシ）-スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣのスルホン化誘導体（スルホ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ＭＢＳのスルホン化誘導体（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、ＳＭＰＢのスルホン化誘導体（スルホ−ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル−６−（Ｎ−マレイミド−ｎ−ヘキサノエート）、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテート、ビス−（マレイミド）メチルエステル、およびビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）などを挙げることができる。本発明においては、その中でもスルフヒドリル基と反応する官能基としてマレイミド基を有する架橋試薬が好ましい。
【００２６】
２．抗原測定方法
本発明のＡ−Ａ複合体は、高い発光強度を維持したまま抗体と結合していることから、例えばイムノアッセイにおける抗原の検出や測定に好適に用いることができる。本発明の抗原の測定方法は、通常の方法によって行うことができる。具体的には、本発明のＡ−Ａ複合体を抗原に結合させ、カルシウムイオンによって発光させることにより抗原を検出することができる。
【００２７】
３．抗原測定キット
本発明の抗原測定キットは、本発明のＡ−Ａを構成成分とするものであれば、それ以外の構成成分は特に限定されるものではない。本発明のキットには、さらにセレンテラジンもしくはその誘導体を含んでいてもよい。本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、バッファー、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。
【００２８】
４．イクオリンと抗体との複合体の製造方法
本発明のＡ−Ａ複合体の製造方法は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する抗体とを反応させることを特徴とするものである。
【００２９】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、および配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質は、先の「１．イクオリンと抗体との複合体」において述べたものを用いればよい。
【００３０】
スルフヒドリル基と反応する官能基を有する抗体（以下「スルフヒドリル反応性抗体」と言うことがある。）は、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する物質と抗体とが化学反応により結合することにより、スルフヒドリル基と反応する官能基を具備するに至った抗体である。本発明においてスルフヒドリル反応性抗体は、特に限定されるものではないが、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬と抗体とが化学的に結合したものを挙げることができる。なお、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬と抗体とは、先の「１．イクオリンと抗体との複合体」において述べたものを用いればよい。
【００３１】
スルフヒドリル反応性抗体の製造方法は、特に限定されるものではないが、具体例として、マレイミド基を有する架橋試薬を用いた場合について説明する。マレイミド基を有する架橋試薬と抗体とを反応させる際の割合は、モル比で５：１〜２０：１、より好ましくは５：１〜１０：１の割合で反応させることが好ましい。この比率で反応させることにより、架橋試薬の非特異的な結合も少なく、マレイミド基を有する架橋試薬が抗体に効率よく結合するため好ましい。また、その際の反応温度と時間は、好ましくは４〜３０℃、０．５〜１８時間、特に好ましくは１０〜３０℃、０．５〜１時間である。この温度でこの時間反応することにより、短時間で効率よく、架橋試薬と抗体を結合させることができる。
【００３２】
組換えカルシウム結合型発光蛋白質とスルフヒドリル反応性抗体との反応条件は、特に限定されるものではないが、反応の際の組換えカルシウム結合型発光蛋白質とスルフヒドリル反応性抗体との割合は、モル比で１：１〜１０：１、より好ましくは３：１〜５：１の範囲であることが好ましい。この比率で反応させることにより、スルフヒドリル反応性抗体とカルシウム結合型発光蛋白質が効率よく結合する。また、その際の反応温度と時間は、好ましくは４〜３０℃、０．５〜１８時間、特に好ましくは４〜２０℃、０．５〜２時間である。この温度でこの時間反応することにより短時間で効率よく、スルフヒドリル反応性抗体とカルシウム結合型発光蛋白質を結合させることができる。
【００３３】
以下、実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本実施例において「％」は、特に断りが無い限り「重量％」を意味する。
【実施例】
【００３４】
実験例１：システイン導入アポイクオリンの製造
（１）システイン導入アポイクオリン発現ベクターの構築
先ず、ＰＣＲ法により、天然型アポイクオリンのＮ−末端のValがAla-Asn-Serで置換された変異型アポイクオリンの発現ベクターpiP-HE（Inouye et al., J. Biochem., 105(1989): 473-477 参照）から、アポイクオリン遺伝子のＮ−末端近傍にある制限酵素部位EcoRIが欠失したpiP-HEΔEを構築した。
次いで、piP-HEΔEを用いて、変異型アポイクオリンのＮ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステイン残基をＰＣＲ法で導入することにより、システイン挿入イクオリン遺伝子発現ベクターpiP-HE-Cys4を構築した。その具体的な構築プロセスの概略を図１に示す。
【００３５】
１）piP-HEΔEプラスミドの調製
０.１μgのpiP-HEプラスミドをテンプレートとし、ＰＣＲプライマーとしてOmpA1-XbaI（5'TGG-AAC-TCT-AGA-TAA-CGA-GGG-CAA-AAA 3', SEQ ID NO：3）およびOmpA1-HindIII（5'TCC-AAG-CTT-GGA-GTT-CGC-GGC-CTG 3', SEQ ID NO：4）を、各１μｇ用いた。
DNA Thermal Cycler（Perkin-Elmer社製）およびAmpli Taq DNAポリメラーゼを含むGeneAmp ＰＣＲ試薬キット（宝酒造社製）を用いて制限酵素XbaＩとHindIIIサイトとOmpAシグナル配列を含み、EcoRＩサイトを欠失したフラグメントをＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）でフラグメントを分離、制限酵素XbaIとHindIIIで消化を行い、制限酵素部位EcoRIを欠失したXbaI-HindIIIフラグメントを取得した。一方、piP-HEプラスミドを制限酵素XbaIとHindIIIで消化し、アポイクオリン遺伝子を含むベクター部分をＤＮＡ精製キット（キアゲン社製）で単離した。これを増幅したXbaI-HindIIIフラグメントと連結し、このようにして得られたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ８３株を形質転換した。形質転換体の中から、EcoRI部位を欠失したpiP-HEΔEプラスミドを単離した。遺伝子配列の確認は、Taq DyeDeoxy Termintor Cycle sequencing Kit（Applied Biosytems 社製）およびＤＮＡ ３７７ シークエンサー（Applied Biosytems 社製）を用いて決定した。EcoRI部位のみが欠失し、アミノ酸配列はもとの変異型と同一であった。
【００３６】
２）piP-HE-Cys4プラスミドの調製
０.１μgのpiP-HEΔEプラスミドをテンプレートとし、プライマーとしてCys4-AQ (5'GGC-AAG-CTT-TGT-ACT-AGT-GAC-TTC-GAC-AAC-CCA-AGA-TGG 3', SEQ ID NO：5)および630EcoRI-AQ (5'GCC-GAA-TTC-ATC-AGT-GTT-TTA-TTC-AAA 3', SEQ ID NO：6) を各１μg用いて、GeneAmp PCR 試薬キット（宝酒造社製）により制限酵素EcoRＩおよびHindIIIサイトを含む変異型アポイクオリンのＮ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステイン残基を有するフラグメントをＰＣＲ増幅した後、精製キット（キアゲン社製）でフラグメントを分離し、次いで制限酵素HindIIIとEcoRIで消化して、変異型アポイクオリンのＮ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステイン残基を有するHindIII-EcoRIフラグメントを取得した。一方、piP-HEΔEプラスミドを制限酵素HindIIIとEcoRIで消化した後、プロモーターおよびOmpAシグナルペプチドを含むベクター側を単離した。次いで、これをHindIII-EcoRIフラグメントと連結し、このようにして得られたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ８３株を形質転換した。形質転換体の中から、Ｎ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステインが導入された変異型アポイクオリン発現するpiP-HE-Cys4プラスミドを単離した。塩基配列を、Taq DyeDeoxy Termintor Cycle sequencing Kit (Applied Biosytems 社製)およびＤＮＡ ３７７ シークエンサー（Applied Biosytems 社製）を用いて決定し、このシステイン導入アポイクオリン（以下「Ｃｙｓ４−アポイクオリン」と言うことがある。）遺伝子を確認した。このＣｙｓ４−アポイクオリンのアミノ酸配列は配列番号４で示したものである。
【００３７】
（２）システイン導入アポイクオリン生産株の分離
宿主として大腸菌ＷＡ８０２株を使用し、実施例１で作製した組換えプラスミドpiP-HE-Cys4を発現ベクターとし、常法により形質転換を実施した。形質転換体２０株をＬＢ（水１Ｌ中、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ，ｐＨ７.２）寒天培地にて３０℃で一晩培養した後、５mLのアンピシリン含有（５０μg／mL）ＬＢ液体培地に植菌し、さらに３７℃で１６時間培養した。次いで、最も高い発光活性を有する菌株、即ち最も高いＣｙｓ４−アポイクオリン産生菌株を選択し、高発光活性を有する菌株を大量培養用の種株とした。
【００３８】
（３）システイン導入アポイクオリン産生菌株の培養
Ｃｙｓ４−アポイクオリン産生菌株を３０℃で一晩培養後、５０mLのアンピシリン含有（５０μg／mL）ＬＢ液体培地に植菌した。さらに３０℃で８時間培養した後、新鮮ＬＢ液体培地２Ｌに移し、３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。菌体と培養液を低速遠心分離（５０００×ｇ）により分離した。菌体、培養液は両者とも発現したアポイクオリンを含むためそれぞれ保存し、Ｃｙｓ４−アポイクオリン精製の出発材料とした。
【００３９】
（４）菌体からのシステイン導入イクオリンの再生および精製
集菌した菌体は、還元剤のジチオスレイトール（和光純薬社製）２００mgを含む４００mLの緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）に懸濁した。菌体を氷冷下で２分間超音波破砕処理して破砕した後、２０分間遠心分離（１２０００×ｇ）して上澄み液を集めた。少量のメタノールに溶解した化学合成セレンテラジンを、Ｃｙｓ４−アポイクオリンの１.２倍のモル濃度になるように、上記の上澄み液に添加し、４℃で５時間以上放置した。得られた上澄み液を直ちに、カラム緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア製、直径２cm×１０cm）に吸着させ、２８０nmでの溶出液の吸光度が０.０５以下になるまで０.１Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液でカラムを洗浄した。次いで、カラムに吸着した未再生Ｃｙｓ４−アポイクオリンと再生Ｃｙｓ４−イクオリンの両者を含む画分を０.１Ｍ〜０.４Ｍ−ＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出した。
【００４０】
再生Ｃｙｓ４−イクオリンと未再生Ｃｙｓ４−アポイクオリンとの分離は、ブチルセファロース４ファーストフローゲルクロマトグラフィーによって、次のように実施した。
Ｑ−セファロースカラムから溶出したオレンジ色の溶出液に、最終濃度が２Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加した。添加後、不溶性画分を遠心分離により除去した。次いで、２Ｍ 硫酸アンモニウムを含む上述のカラム緩衝液で平衡化したブチルセファロース４ファーストフロー（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２cm×８cm）にその上澄み液を加え、硫酸アンモニウムの２Ｍ〜１Ｍの直線濃度勾配により溶出し、発光活性を有する、即ち再生Ｃｙｓ４−イクオリンを含むオレンジ色画分を収集した。一方、未再生のＣｙｓ４−アポイクオリンはカラム緩衝液でのみ溶出された。
【００４１】
精製画分の純度検定は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実施した。その結果、精製画分について分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターで測定した結果、９８％以上であった。精製蛋白質濃度をウシ血清アルブミンを標品としてBradford法（バイオラッド社製）により決定したところ、２Ｌの培養菌体からの高純度Ｃｙｓ４−イクオリン収量は４４.６mgであった。
【００４２】
（５）培養液からのシステイン導入イクオリンの再生および精製
培養液から純度９８％以上のアポイクオリンを取得し、実験例４に従ってイクオリンに再生し、精製した。精製されたイクオリンを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、実験例４で得られたものと同じであった。培養液２Ｌから高純度Ｃｙｓ４−イクオリン１０.４mgが得られた。
【００４３】
実験例２：Ａ−Ａ複合体の製造−１（システイン導入イクオリンと抗−ＡＦＰ抗体との複合体）
（１）スルフヒドリル反応性抗体の製造（抗−ＡＦＰ抗体とマレイミド基を有する架橋試薬との結合）
５３４μｇ（３ｎｍｏｌ）の抗−ＡＦＰ抗体(日本医学臨床検査研究所製、クローンＮｏ．１Ｄ５、サブクラスＩｇＧ１−κ、以下「１Ｄ５」と言うことがある。)を、２００μｌの０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む６６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、以降「緩衝液Ａ」と記載）に溶解したものに、緩衝液Ａにて１ｍＭに調製したスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ、ＰＩＥＲＣＥ社）を１５μｌ（スルホ−ＳＭＣＣ １５ｎｍｏｌ、混合条件１：１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／５）加えたもの、３０μｌ（スルホ−ＳＭＣＣ ３０ｎｍｏｌ、混合条件２：１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／１０）加えたもの、３００μｌ（スルホ−ＳＭＣＣ ３００ｎｍｏｌ、混合条件３：１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／１００）加えたものの３種類を準備し、それぞれ４℃にて２時間反応させた。反応後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を、それぞれに２μｌ（１００ｎｍｏｌ）加え２５℃にて１０分以上静置して、反応を停止した。未反応のスルホ−ＳＭＣＣをアミコンウルトラ−４スピンカラム（ミリポア社製、分画分子量１０，０００）を用いて４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心して（日立製作所製、ＣＲ２０Ｂ２）除去し、抗−ＡＦＰ抗体とマレイミド基を有する架橋試薬との結合体（以下「マレイミド化１Ｄ５」と言うことがある。）を３種類得た。混合条件１で得られたものをマレイミド化１Ｄ５−１、混合条件２で得られたものをマレイミド化１Ｄ５−２、混合条件３で得られたものをマレイミド化１Ｄ５−３とした。なお、Ｅ１％２８０ｎｍ＝１４から算出したマレイミド化１Ｄ５−２の回収率は８４．６％（４５４μｇ）であった。
【００４４】
（２）システイン導入イクオリンとスルフヒドリル反応性抗体（マレイミド化１Ｄ５−１〜３）との反応
実験例１で製造したシステイン導入イクオリンを7.5nmolになるように緩衝液Ａにて希釈、調製した。これを、マレイミド化１Ｄ５−１〜３ ９０μｌ（１．５ｎｍｏｌ）のそれぞれに加え、４℃にて一晩反応させた。反応後、それぞれに１０ｍＭシステイン水溶液を２μｌ（２０ｎｍｏｌ）加え、システイン導入イクオリンとマレイミド化１Ｄ５との複合体（以下「ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５」と言うことがある。）を３種類得た。なお、マレイミド化１Ｄ５−１を用いて得られたものをＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−１、マレイミド化１Ｄ５−２を用いて得られたものをＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−２、マレイミド化１Ｄ５−３を用いて得られたものをＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−３とした。
３種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５とも発光活性の低下はほとんど起こらず、いずれも９６％の発光活性を保持していた。得られた３種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を１２％分離ゲル（テフコ社製）を用いて還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。結果を図２に示す。
【００４５】
システイン導入イクオリン（２１ｋＤａ）と１Ｄ５由来のＨ鎖（５５ｋＤａ）が結合してできたと思われる７５ｋＤａに主なバンドが観察されたが、ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５の種類（１Ｄ５とスルホ−ＳＭＣＣとの混合比率）によってバンドの濃さが異なり、１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／５で反応させた場合、７５ｋＤａのバンドは薄く、Ａ−Ａ複合体の形成量が少ないことが示された。また、１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／１００で反応させた場合、非特異な結合によるものと思われるバンドが高分子量側に見られた。１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／１０で反応させた場合、７５ｋＤａに濃いバンドが確認でき、非特異な結合と思われるバンドも少なく、ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５が多量に形成されていることが示された。
【００４６】
（３）３種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５によるＡＦＰの生物発光イムノアッセイ
１）抗−ＡＦＰ抗体のコーティング
抗−ＡＦＰ抗体（クローンＮｏ．６Ｄ２、サブクラスＩｇＧ２ａ−κ、日本医学臨床検査研究所、以下「６Ｄ２」と言うことがある。）を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて５μｇ／ｍｌに調製し、９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＃４３７７９６）に１００μｌ／ウェル分注し、室温にて一晩静置してコートした。
【００４７】
２）ポストコーティング
静置後、炭酸緩衝液を除去し、１％牛血清アルブミン（フラクションＶ、生化学工業）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ・２Ｎａ、同仁化学研究所）、０．０５％アジ化ナトリウム（和光純薬工業）を含む１５０ｍＭ ＮａＣｌ（和光純薬工業）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（和光純薬工業）（以降ＴＢＳと記載）（以降ポストコーティング溶液と記載）を２００μｌ／ウェル分注、４℃にて一晩静置した。
【００４８】
３）ＡＦＰとＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５の反応
ポストコーティング溶液を捨て、よく洗浄した後、１０％ブロックエース（大日本製薬）、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＢＳ（以降希釈液と記載）で１１０μｇ／ｍｌ ＡＦＰ（Ｄａｋｏ）を１２．５ｎｇ／ｍｌに希釈、５０μｌ／ウェル分注し、更に希釈液で５０００〜１００００倍に希釈したＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を５０μｌ／ウェル分注後、３０℃にて１時間静置した。
【００４９】
４）イクオリンによる発光の測定
静置後、反応液を捨て、よく洗浄した後、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）にて、５０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００μｌ／ウェル注入して発光強度を０．１秒間隔で５秒間測定し、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）を算出した。
【００５０】
３種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによるＩｍａｘとシグナル（ＡＦＰ１２．５ｎｇ／ｍｌ）／ノイズ（ＡＦＰ０ｎｇ／ｍｌ）比（Ｓ／Ｎ比）を表１に示した。Ｉｍａｘが高くＳ／Ｎ比がよい、抗体：スルホ−ＳＭＣＣ＝１：１０で反応させた場合が、Ａ−Ａ複合体調製時の混合条件として適していることが示された。また、抗体：スルホ−ＳＭＣＣ＝１：５で反応させた場合でもＳ／Ｎ比は１：１０で反応させた場合とほぼ同等のレベルを維持しており、１：５でもＡ−Ａ複合体としてイムノアッセイ系で機能することが示された。
【００５１】
【表１】
【００５２】
実験例３：Ａ−Ａ複合体の製造２（システイン導入イクオリンと抗−ＡＦＰ抗体との複合体）
（１）スルフヒドリル反応性抗体の製造（抗−ＡＦＰ抗体とマレイミド基を有する架橋試薬との結合）
５３４μｇ（３ｎｍｏｌ）の１Ｄ５を、２００μｌの緩衝液Ａに溶解したものを２本準備し、緩衝液Ａにて１ｍＭに調製したスルホ−ＳＭＣＣを３０μｌ（３０ｎｍｏｌ、１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／１０）加え、そのうち１本を２０℃にて３０分間反応させ、もう一方を４℃にて２時間反応させた。反応後、それぞれに５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を２μｌ（１００ｎｍｏｌ）加え、２５℃にて１０分以上静置して、反応を停止した。次いで、アミコンウルトラ−４スピンカラム（ミリポア社製、分画分子量１０，０００）を用いて４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心し（日立製作所製、ＣＲ２０Ｂ２）、未反応のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを除去し、２種類のマレイミド化１Ｄ５を得た。２０℃、３０分反応させて得られたものをマレイミド化１Ｄ５−４、４℃にて２時間反応させて得られたものをマレイミド化１Ｄ５−５とした。なお、Ｅ１％２８０ｎｍ＝１４から算出したマレイミド化１Ｄ５−５の回収率は８４．６％（４５４μｇ）であった。
【００５３】
（２）システイン導入イクオリンとスルフヒドリル反応性担体（マレイミド活性化１Ｄ５）との反応
マレイミド化１Ｄ５−４ ９０μｌ（１．５ｎｍｏｌ）とマレイミド化１Ｄ５−５ ９０μｌ（１．５ｎｍｏｌ）に、実験例１で製造したシステイン導入イクオリンを7.5nmolになるように緩衝液Ａにて希釈、調製したものをそれぞれ加え、マレイミド化１Ｄ５−４を用いた方は４℃にて２時間反応させ、マレイミド化１Ｄ５−５を用いた方は４℃にて一晩反応させた。反応後、それぞれに１０ｍＭシステインを２μｌ（２０ｎｍｏｌ）加えた。その後、アミコンウルトラ−４スピンカラム（分画分子量１００，０００）を用いて、４℃、６０００ｒｐｍにて５分間遠心し、未反応のシステイン導入イクオリンを除去し、２種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を得た。なお、マレイミド化１Ｄ５−４を用いて得られたものをＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４、マレイミド化１Ｄ５−５を用いて得られたものをＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−５とした。
２種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５とも発光活性の低下はほとんど起こらず、いずれも９６％の発光活性を保持していた。
【００５４】
（３）２種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５によるＡＦＰの生物発光イムノアッセイ
１）抗−ＡＦＰ抗体のコーティング
６Ｄ２を０．０５％ アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて５μｇ／ｍｌに調製し、９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＃４３７７９６） に１００μｌ／ウェル分注し、室温にて一晩静置してコートした。
【００５５】
２）ポストコーティング
静置後、炭酸緩衝液を除去し、ポストコーティング溶液を２００μｌ／ウェル分注、４℃にて一晩静置した。
【００５６】
３）ＡＦＰとＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５の反応
ポストコーティング溶液を捨て、よく洗浄した後、希釈液で１１０μｇ／ｍｌ ＡＦＰ（Ｄａｋｏ）を１２．５ｎｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌ／ウェル分注し、更に希釈液で５０００〜１００００倍に希釈したＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を５０μｌ／ウェル分注後、３０℃にて１時間静置した。
【００５７】
４）イクオリンによる発光の測定
静置後、反応液を捨て、よく洗浄した後、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）にて、５０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００μｌ／ウェル注入して発光強度を０．１秒間隔で５秒間測定し、最大発光強度値を算出した。
【００５８】
２種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによるＩｍａｘとシグナル（ＡＦＰ１２．５ｎｇ／ｍｌ）／ノイズ（ＡＦＰ０ｎｇ／ｍｌ）比（Ｓ／Ｎ比）を表２に示した。どちらの反応条件で調製したＡ−Ａ複合体においても、Ｉｍａｘが高くＳ／Ｎ比がよい結果が得られ、反応温度を上げることで、より短い反応時間でＡ−Ａ複合体を調製することができることが示された。
【００５９】
【表２】
【００６０】
実験例４：Ａ−Ａ複合体を用いた生物発光イムノアッセイによるＡＦＰの定量
（１）ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４によるＡＦＰの生物発光イムノアッセイ
１）抗−ＡＦＰ抗体のコーティング
実験例３に記載の方法の準じて６Ｄ２のコーティングを行った。
２）ポストコーティング
実験例３に記載の方法の準じてポストコーティングを行った。
３）ＡＦＰとＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４の反応
ポストコーティング溶液を捨て、よく洗浄した後、希釈液で１１０μｇ／ｍｌ ＡＦＰ（Ｄａｋｏ）を希釈、１０ｐｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌまでの希釈系列を作製し、５０μｌ／ウェル分注し、更に希釈液で２１ｎｇ／ｍｌに調製したＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を５０μｌ／ウェル分注後、３０℃にて１時間静置した。
４）イクオリンによる発光の測定
実験例３に記載の方法の準じて発光の測定を行った。ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによるスタンダードカーブを図３に示した。その結果、ＡＦＰの検出限界は１０−２ｎｇ／ｍｌ、ダイナミックレンジは１０−２〜１０２ｎｇ／ｍｌを示した。バックグランドが低く抑えられており、高感度なイムノアッセイに優れていることが示された。
【００６１】
実験例５：Ａ−Ａ複合体の製造３（スルフヒドリル基導入イクオリンと抗−ＡＦＰ抗体との複合体）
（１）スルフヒドリル基導入イクオリンの製造
緩衝液Ａ １５μｌに溶解したイクオリン４４０μｇ（２０ｎｍｏｌ、チッソ株式会社製）に、ジメチルスルホキシド（和光純薬）にて１００ｍＭに調製したＮ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ、ＰＩＥＲＣＥ社）を２μｌ（２００ｎｍｏｌ）加え、緩衝液Ａにて全量として５００μｌとし、２５℃にて３０分反応させた。反応後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を２μｌ（１００ｎｍｏｌ）加え、２５℃にて１０分以上静置して反応を停止した。次いで、アミコンウルトラ−４スピンカラム（分画分子量１０，０００）を用いて、４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心し、未反応のＳＡＴＡを除去し、ＳＡＴＡ修飾イクオリンを得た。イクオリン活性から算出した回収率は７２．７％であった。
【００６２】
３１９μｇ（１４．５ｎｍｏｌ）のＳＡＴＡ修飾イクオリンが溶解した５００μｌの緩衝液Ａに、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５Ｍのヒドロキシルアミンが溶解した緩衝液Ａを２５μｌ加え、２５℃にて２時間反応させ、スルフヒドリル基の保護基である、Ｎ-ヒドロキシアセトアミドを脱保護した。反応後、アミコンウルトラ−４スピンカラム（分画分子量１０，０００）を用いて４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心して、ヒドロキシルアミンと脱保護基を除去、スルフヒドリル基導入イクオリンを得た。イクオリン活性から算出した最終的な回収率は５２．５％であった。
【００６３】
（２）スルフヒドリル反応性抗体（マレイミド化１Ｄ５）の製造
５３４μｇ（３ｎｍｏｌ）の１Ｄ５を、２００μｌの緩衝液Ａに溶解した。そこへ緩衝液Ａにて１０ｍＭに調製したスルホ−ＳＭＣＣを３０μｌ（３０ｎｍｏｌ）加えて、４℃にて２時間反応させた。反応後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を２μｌ（１００ｎｍｏｌ）加え、２５℃にて１０分以上静置して、反応を停止した。次いで、アミコンウルトラ−４スピンカラム（ミリポア社製、分画分子量１０，０００）を用いて４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心し（日立製作所製、ＣＲ２０Ｂ２）、未反応のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを除去し、マレイミド化１Ｄ５を得た。このようにして得られたマレイミド化１Ｄ５の、Ｅ１％２８０ｎｍ＝１４から算出した回収率は８４．６％（４５４μｇ）であった。
【００６４】
（３）スルフヒドリル基導入イクオリンとスルフヒドリル反応性抗体（マレイミド化１Ｄ５）との反応
マレイミド化１Ｄ５ ９０μｌ（１．５ｎｍｏｌ）に、緩衝液Ａに溶解したスルフヒドリル基導入イクオリン（７．５ｎｍｏｌ）を加え、４℃にて一晩反応させた。反応後、１０ｍＭシステインを２μｌ（２０ｎｍｏｌ）加えた。その後、アミコンウルトラ−４スピンカラム（分画分子量１００，０００）を用いて、４℃、６０００ｒｐｍにて５分間遠心して、未反応のスルフヒドリル基導入イクオリンを除去し、Ａ−Ａ複合体（以下「ＡＱ−ＮＳ−１Ｄ５」言うことがある。）を得た。得られたＡＱ−ＮＳ−１Ｄ５を１２％分離ゲル（ＴＥＦＣＯ）を用い、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した結果、スルフヒドリル基導入イクオリン（２１ｋＤａ）と１Ｄ５由来のＨ鎖（５５ｋＤａ）が結合してできたと思われる７５ｋＤａに主なバンドが観察され、ＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５が形成されていることが確認された。
【００６５】
（４）ＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５によるＡＦＰの生物発光イムノアッセイ
１）抗−ＡＦＰ抗体のコーティング
実験例３に記載の方法の準じて６Ｄ２のコーティングを行った。
２）ポストコーティング
実験例３に記載の方法の準じてポストコーティングを行った。
３）ＡＦＰとＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５の反応
ポストコーティング溶液を捨て、よく洗浄した後、希釈液で１１０μｇ／ｍｌ ＡＦＰを希釈、１０ｐｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌまでの希釈系列を作製し、５０μｌ／ウェル分注し、更に希釈液で４０ｎｇ／ｍｌに調製したＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５を５０μｌ／ウェル分注後、３０℃にて１時間静置した。
４）イクオリンによる発光の測定
実験例３に記載の方法の準じて発光の測定を行った。ＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによるスタンダードカーブを図３に示した。その結果、ＡＦＰの検出限界は１０−２ｎｇ／ｍｌ、ダイナミックレンジは１０−２〜１０２ｎｇ／ｍｌを示し、ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４とほぼ同等のスペックを示した。
【００６６】
システイン導入イクオリンを用いて作製したＡ−Ａ複合体においても、ＡＦＰの生物発光イムノアッセイの測定で、スルフヒドリル基導入イクオリンを用いたイクオリン−抗体複合体とほとんど一致する標準曲線が描かれ、従来までのスルフヒドリル基導入イクオリンと比べても、全く遜色なくイムノアッセイの系に応用できることが示された。また、スルフヒドリル基導入イクオリンは、スルフヒドリル基の導入工程において、イクオリンの回収率が５２．５％と低く、Ａ−Ａ複合体調製工程において、イクオリンへのスルフヒドリル基導入工程が増えるだけではなく、更にイクオリンをロスしてしまうという結果が示され、該導入工程を必要としない、システイン導入イクオリンは、この点で優位であるといえることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合している本発明のＡ−Ａ複合体は、高い発光活性を有することから、診断薬などの標識物質に好ましく使用することができる。また、前述の組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体とを反応させる本発明のＡ−Ａ複合体の製造方法であれば、従来のイクオリンにスルフヒドリル基を導入する工程がなくとも、Ａ−Ａ複合体が作製でき、工程や時間を軽減できるだけではなく、イクオリンや抗体のロスも軽減できる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】システイン挿入イクオリン発現ベクターの構築プロセスを示す概略図。
【図２】抗体とマレイミド基導入架橋試薬の混合モル比を変更してＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を作製した時のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。
【図３】ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４とＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによるスタンダードカーブ。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
［配列番号：１］天然型アポイクオリンのアミノ酸配列。
［配列番号：２］変異型アポイクオリンのアミノ酸配列。
［配列番号：３］システインが導入された天然型アポイクオリンのアミノ酸配列。
［配列番号：４］システインが導入された変異型アポイクオリンのアミノ酸配列。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質と抗体との複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム結合型発光蛋白質は、カルシウムと特異的に反応し、瞬間発光する蛋白質であり、現在、イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン、ミネオプシン、およびベルボイン等が知られている。これらの発光蛋白質のカルシウムイオンに対する感受性は非常に高く、その発光感度もまた、市販の検出装置においての検出感度が１ピコグラム以下と非常に高いものである。そのため、カルシウム結合型発光蛋白質は、このような特徴を活かし、細胞内カルシウムや血液中の微量カルシウムイオンの検出、定量に用いられている（例えば、非特許文献１を参照）。これらの発光蛋白質は、その発光がカルシウムイオンとの特異的結合によるものであるため、通常の化学発光で問題になるバックグランドがほとんどなく、且つ反応自体が瞬間発光で数秒以内に終了するため、短時間にシグナル対ノイズ比の高い結果を得ることができるという利点を有する。
【０００３】
さらに、その発光反応系は、生物発光と呼ばれる酵素発光反応であり、すべて生体内由来の成分で構成されているため、有害な化学発光物質等（例えばラジオアイソトープや発癌性化合物等）を含んでおらず安全性が高い。このため、当該発光蛋白質は、診断薬等における標識として応用されている。
【０００４】
これらの発光蛋白質を標識として用いる場合、発光蛋白質は、通常、被検体に特異的に結合する物質（以下「結合性物質」と言うことがある。）と発光蛋白質とが化学的に結合した複合体の形で使用される。結合性物質としては、酵素、レクチン、糖蛋白質、ペプチド、薬物、レセプター、抗原、抗体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインA、プロテインG、ホルモン、核酸、および核酸結合蛋白質などが用いられている。
【０００５】
結合性物質と発光蛋白質との化学的な結合反応には、一般的に架橋試薬が用いられている。架橋試薬の中でも、反応基として、アミノ基と特異的に結合するＮＨＳエステルと、スルフヒドリル基と特異的に結合するマレイミド基とを有する架橋試薬は、それを用いた場合、該結合反応時における非特異的な結合や、発光蛋白質もしくは結合性物質同士の重合が起こり難いことから、一般に好ましく使用されている。
【０００６】
このＮＨＳエステルとマレイミド基とを有する架橋試薬（以下「２官能性架橋試薬」と言うことがある。）を用いて、発光蛋白質と結合性物質とを化学的に結合させる方法には以下の３通りがある。
（１）発光蛋白質のアミノ末端またはリジン残基の一級アミンに、２官能性架橋試薬のＮＨＳエステルを反応させ、結合性物質のスルフヒドリル基と２官能性架橋試薬のマレイミド基を反応させて、発光蛋白質と結合性物質とを結合させる方法。
（２）結合性物質のアミノ末端またはリジン残基の一級アミンに、２官能性架橋試薬のＮＨＳエステルを反応させ、発光蛋白質のスルフヒドリル基と２官能性架橋試薬のマレイミド基を反応させて、発光蛋白質と結合性試薬とを結合させる方法。
（３）Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）などのスルフヒドリル活性化剤を用いてスルフヒドリル基をイクオリンのアミノ基に導入し、次いでこのイクオリンを抗体と結合する方法。
【非特許文献１】Blinks, J. R., Wier, W. G., Hess, P., and Prendergast, F.G., Prog. Biophys. Mol. Biol. 40: 1-114
【非特許文献２】Ｔ．Ｅｒｉｋａｋｕ、Ｓ Ｚｅｎｎｏ ａｎｄ Ｓ Ｉｎｏｕｙｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、１７４：１３３１−１３３６
【特許文献１】特表平８−５０６８９７
【特許文献２】特開平１０−２５１３００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述の発光蛋白質と結合性物質とを化学的に結合させる方法のうち、（１）の方法でイクオリンと抗体との複合体（以下、イクオリンと抗体との複合体を「Ａ−Ａ複合体」と言うことがある。）を調製した場合、イクオリンの発光活性が著しく低下し、得られるＡ−Ａ複合体は、診断薬などの標識物質としては感度が低く実用的とは言い難かった。
【０００８】
（２）の方法でイクオリンと抗体との複合体を調製した場合には、イクオリンと抗体との反応性が低く、得えられるＡ−Ａ複合体も発光活性が低いことから、イクオリンと抗体の結合方法としては効率の良い方法であるとは言い難かった。
【０００９】
一方（３）の方法であれば、イクオリンの発光活性を維持したまま、イクオリンと抗体とを結合させることも可能である。しかしながら、この方法は操作が煩雑で工程も多く、時間がかかった。さらに、得られたＡ−Ａ複合体を診断薬などの標識物質として使用するためには、スルフヒドリル基をイクオリンのアミノ基に導入する際に使用したスルフヒドリル活性化剤のうち余剰の未反応スルフヒドリル活性化剤を完全に除去する必要があり、その際、イクオリンや抗体がロスしやすかった。
【００１０】
ことほど左様に、従来技術では診断薬などの標識物質に使用可能な高い発光活性を有するＡ−Ａ複合体を、効率よく簡便に製造することは困難であった。即ち、斯様な状況においては、診断薬などの標識物質に好適な高い発光活性を有するＡ−Ａ複合体と、このＡ−Ａ複合体を効率よく製造する方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合しているＡ−Ａ複合体が、診断薬などの標識物質に使用可能なレベルの高い発光活性を有すること、さらに、前述の組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体とを反応させるＡ−Ａ複合体の製造方法であれば、高い発光活性を有するＡ−Ａ複合体を簡便且つ効率よく得られることなどを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、以下の構成を有する。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合している、イクオリンと抗体との複合体。
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合している、イクオリンと抗体との複合体。
（３）該システインを介しての結合が、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬を介しての結合である、前記第１項または第２項に記載のイクオリンと抗体との複合体。
（４）システインのスルフヒドリル基と反応する官能基がマレイミド基である、前記３項に記載のイクオリンと抗体との複合体。
（５）抗体が、腫瘍の増殖に伴って血清や尿中に増加する腫瘍マーカーを抗原とする抗体である、前記第１項または第２項に記載のイクオリンと抗体との複合体。
【００１３】
（６）前記第１項〜第５項に記載の何れかに記載のイクオリンと抗体との複合体を用いることを特徴とする、抗原測定方法。
（７）前記第１項〜第５項に記載の何れかに記載のイクオリンと抗体との複合体を構成成分とする、抗原測定キット。
【００１４】
（８）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体とを反応させることを特徴とする、イクオリンと抗体との複合体の製造方法。
（９）スルフヒドリル基と反応する官能基を有する抗体がマレイミド基を有する抗体である、前記第８項に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
（１０）スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体が、マレイミド基を有する架橋試薬と抗体とを、モル比で５：１〜１０：１の割合で反応させて得られたものである、前記第８項に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
（１１）マレイミド基を有する架橋試薬と抗体との反応が、１０〜３０℃、０．５〜１時間の反応である、前記第１０項に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
（１２）組換えカルシウム結合型発光蛋白質と、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体との割合が、１：３〜１：５（モル比）の範囲である、前記第８項に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
（１３）組換えカルシウム結合型発光蛋白質と、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体との反応が、４〜２０℃、０．５〜２時間の反応である、前記第８項に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のＡ−Ａ複合体は、診断薬などの標識物質に使用可能なレベルの高い発光活性を有し、抗原の検出や測定などに有効である。本発明のＡ−Ａ複合体の製造方法であれば、高い発光活性を有するＡ−Ａ複合体を簡便且つ効率よく製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的にかつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１７】
１．イクオリンと抗体との複合体
本発明に使用する組換えカルシウム結合型発光蛋白質の１つは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする。配列番号１のアミノ末端から４番目までのアミノ酸は、アミノ酸末端から順に、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒである。アミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたとは、ＶａｌとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれかにシステイン残基が挿入されていることを意味する。
【００１８】
システイン残基が挿入される位置は、上記のＶａｌとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれであっても構わないが、ＬｅｕとＴｈｒの間であることが好ましい。ＬｅｕとＴｈｒの間にシステイン残基が挿入されたアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００１９】
本発明に使用する組換えカルシウム結合型発光蛋白質のもう１つは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする。配列番号２のアミノ末端から６番目までのアミノ酸は、アミノ酸末端から順に、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒである。アミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたとは、ＡｌａとＡｓｎの間、ＡｓｎとＳｅｒの間、ＳｅｒとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれかにシステイン残基が挿入されていることを意味する。
【００２０】
システイン残基が挿入される位置は、上記のＡｌａとＡｓｎの間、ＡｓｎとＳｅｒの間、ＳｅｒとＬｙｓの間、ＬｙｓとＬｅｕの間、ＬｅｕとＴｈｒの間のいずれであっても構わないが、ＬｅｕとＴｈｒの間であることが好ましい。ＬｅｕとＴｈｒの間にシステイン残基が挿入されたアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、天然型アポイクオリンのアミノ酸配列であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、遺伝子組換え法により生産されたアポイクオリン（以下「変異型アポイクオリン」ということがある。）のアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列へのシステインの導入は、公知の方法で行うことができ、具体的には、特開２００４−０００１４３に記載の方法を挙げることができる。
なお、天然型アポイクオリンと変異型アポイクオリンは、市販品を入手することも可能である。また、天然型アポイクオリンであれば、天然の発光クラゲから抽出、精製して入手することも可能である。変異型アポイクオリンは、発光クラゲからアポイクオリンのｃＤＮＡをクローニングし、そのｃＤＮＡを用い、かつ大腸菌を宿主とし、宿主の菌体内及び菌体外でのアポイクオリンを生産させ、抽出、精製するなどの方法により製造することも可能である。
【００２２】
本発明は、前述の組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと抗体とが、導入されたシステインを介して結合しているＡ−Ａ複合体である。該システインを介した結合であれば、組換えカルシウム結合型発光蛋白質と抗体との結合様式は特に限定されるものではないが、本発明においては、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬が、該システインと結合し、この架橋試薬がさらに抗体と結合している形態であることが好ましい。即ち、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬を介して、組換えカルシウム結合型発光蛋白質と抗体とが結合していることが好ましい。
【００２３】
本発明に使用される抗体は特に限定されるものではない。腫瘍マーカーやホルモンなどといったヒトや動植物の生体内微量成分や、環境中の微量汚染物質など、これまで様々な物質を抗原とする抗体が市販されており、測定したい被検体を抗原とする抗体を適宜必要に応じて使用することができる。
【００２４】
中でも、腫瘍の増殖に伴って血清や尿中に増加する腫瘍マーカーとしては、胎児性抗原、ＣＡ１９−９、シリアルＬｅｘ−ｉ抗原、シリアルＴｎ抗原、チミジンキナーゼ活性、組織ポリペプチド抗原、塩基性フェトプロテイン、免疫抑制酸性蛋白、ＣＡ７２−４、ＣＡ１２５、ＤＵＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、エラスターゼ１、ＢＣＡ−２２５、ＣＡ１５−３、ＳＣＣ抗原、サイトケラチン１９フラグメント、前立腺特異抗原、γ−セミノプロテイン、前立腺酸性フォスファターゼ、α−フェトプロテイン、ＡＦＰレクチン分画、ＰＩＶＫＡ−II、神経特異エノラーゼ、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＣＡ１３０、Ｉ型コラーゲン−Ｃ−テロペプチドなど、各器官における腫瘍の生成に伴って特異的に増加するマーカーがこれまでに知られている。これらは市販されており、血清あるいは尿中の該マーカーを測定する上での標準物質として適宜利用することができる。更に、これらを抗原とする種々のクラスあるいはサブクラスからなる抗体が市販されており、これらを適宜使用してＡ−Ａ複合体を作製することができる。
【００２５】
システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬は、特に限定されるものではないが、具体的には、Ｎ-（４‐[ｐ-アジドサリシルアミド]ブチル）-３´-２´ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、１，４−ジ-（３´-[２´ピリジルジチオ]プロピオンアミド）ブタン、１，６−ヘキサン-ビス-ビニルスルホン（ＨＢＶＳ）、スクシンイミジル３-（ブロモアセタミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、Ｎ-スクシンイミジル３-（２-ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ-（α‐マレイミドアセトキシ）-スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣのスルホン化誘導体（スルホ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ＭＢＳのスルホン化誘導体（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、ＳＭＰＢのスルホン化誘導体（スルホ−ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル−６−（Ｎ−マレイミド−ｎ−ヘキサノエート）、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテート、ビス−（マレイミド）メチルエステル、およびビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）などを挙げることができる。本発明においては、その中でもスルフヒドリル基と反応する官能基としてマレイミド基を有する架橋試薬が好ましい。
【００２６】
２．抗原測定方法
本発明のＡ−Ａ複合体は、高い発光強度を維持したまま抗体と結合していることから、例えばイムノアッセイにおける抗原の検出や測定に好適に用いることができる。本発明の抗原の測定方法は、通常の方法によって行うことができる。具体的には、本発明のＡ−Ａ複合体を抗原に結合させ、カルシウムイオンによって発光させることにより抗原を検出することができる。
【００２７】
３．抗原測定キット
本発明の抗原測定キットは、本発明のＡ−Ａを構成成分とするものであれば、それ以外の構成成分は特に限定されるものではない。本発明のキットには、さらにセレンテラジンもしくはその誘導体を含んでいてもよい。本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、バッファー、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。
【００２８】
４．イクオリンと抗体との複合体の製造方法
本発明のＡ−Ａ複合体の製造方法は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する抗体とを反応させることを特徴とするものである。
【００２９】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、および配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質は、先の「１．イクオリンと抗体との複合体」において述べたものを用いればよい。
【００３０】
スルフヒドリル基と反応する官能基を有する抗体（以下「スルフヒドリル反応性抗体」と言うことがある。）は、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する物質と抗体とが化学反応により結合することにより、スルフヒドリル基と反応する官能基を具備するに至った抗体である。本発明においてスルフヒドリル反応性抗体は、特に限定されるものではないが、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬と抗体とが化学的に結合したものを挙げることができる。なお、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬と抗体とは、先の「１．イクオリンと抗体との複合体」において述べたものを用いればよい。
【００３１】
スルフヒドリル反応性抗体の製造方法は、特に限定されるものではないが、具体例として、マレイミド基を有する架橋試薬を用いた場合について説明する。マレイミド基を有する架橋試薬と抗体とを反応させる際の割合は、モル比で５：１〜２０：１、より好ましくは５：１〜１０：１の割合で反応させることが好ましい。この比率で反応させることにより、架橋試薬の非特異的な結合も少なく、マレイミド基を有する架橋試薬が抗体に効率よく結合するため好ましい。また、その際の反応温度と時間は、好ましくは４〜３０℃、０．５〜１８時間、特に好ましくは１０〜３０℃、０．５〜１時間である。この温度でこの時間反応することにより、短時間で効率よく、架橋試薬と抗体を結合させることができる。
【００３２】
組換えカルシウム結合型発光蛋白質とスルフヒドリル反応性抗体との反応条件は、特に限定されるものではないが、反応の際の組換えカルシウム結合型発光蛋白質とスルフヒドリル反応性抗体との割合は、モル比で１：１〜１０：１、より好ましくは３：１〜５：１の範囲であることが好ましい。この比率で反応させることにより、スルフヒドリル反応性抗体とカルシウム結合型発光蛋白質が効率よく結合する。また、その際の反応温度と時間は、好ましくは４〜３０℃、０．５〜１８時間、特に好ましくは４〜２０℃、０．５〜２時間である。この温度でこの時間反応することにより短時間で効率よく、スルフヒドリル反応性抗体とカルシウム結合型発光蛋白質を結合させることができる。
【００３３】
以下、実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本実施例において「％」は、特に断りが無い限り「重量％」を意味する。
【実施例】
【００３４】
実験例１：システイン導入アポイクオリンの製造
（１）システイン導入アポイクオリン発現ベクターの構築
先ず、ＰＣＲ法により、天然型アポイクオリンのＮ−末端のValがAla-Asn-Serで置換された変異型アポイクオリンの発現ベクターpiP-HE（Inouye et al., J. Biochem., 105(1989): 473-477 参照）から、アポイクオリン遺伝子のＮ−末端近傍にある制限酵素部位EcoRIが欠失したpiP-HEΔEを構築した。
次いで、piP-HEΔEを用いて、変異型アポイクオリンのＮ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステイン残基をＰＣＲ法で導入することにより、システイン挿入イクオリン遺伝子発現ベクターpiP-HE-Cys4を構築した。その具体的な構築プロセスの概略を図１に示す。
【００３５】
１）piP-HEΔEプラスミドの調製
０.１μgのpiP-HEプラスミドをテンプレートとし、ＰＣＲプライマーとしてOmpA1-XbaI（5'TGG-AAC-TCT-AGA-TAA-CGA-GGG-CAA-AAA 3', SEQ ID NO：3）およびOmpA1-HindIII（5'TCC-AAG-CTT-GGA-GTT-CGC-GGC-CTG 3', SEQ ID NO：4）を、各１μｇ用いた。
DNA Thermal Cycler（Perkin-Elmer社製）およびAmpli Taq DNAポリメラーゼを含むGeneAmp ＰＣＲ試薬キット（宝酒造社製）を用いて制限酵素XbaＩとHindIIIサイトとOmpAシグナル配列を含み、EcoRＩサイトを欠失したフラグメントをＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）でフラグメントを分離、制限酵素XbaIとHindIIIで消化を行い、制限酵素部位EcoRIを欠失したXbaI-HindIIIフラグメントを取得した。一方、piP-HEプラスミドを制限酵素XbaIとHindIIIで消化し、アポイクオリン遺伝子を含むベクター部分をＤＮＡ精製キット（キアゲン社製）で単離した。これを増幅したXbaI-HindIIIフラグメントと連結し、このようにして得られたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ８３株を形質転換した。形質転換体の中から、EcoRI部位を欠失したpiP-HEΔEプラスミドを単離した。遺伝子配列の確認は、Taq DyeDeoxy Termintor Cycle sequencing Kit（Applied Biosytems 社製）およびＤＮＡ ３７７ シークエンサー（Applied Biosytems 社製）を用いて決定した。EcoRI部位のみが欠失し、アミノ酸配列はもとの変異型と同一であった。
【００３６】
２）piP-HE-Cys4プラスミドの調製
０.１μgのpiP-HEΔEプラスミドをテンプレートとし、プライマーとしてCys4-AQ (5'GGC-AAG-CTT-TGT-ACT-AGT-GAC-TTC-GAC-AAC-CCA-AGA-TGG 3', SEQ ID NO：5)および630EcoRI-AQ (5'GCC-GAA-TTC-ATC-AGT-GTT-TTA-TTC-AAA 3', SEQ ID NO：6) を各１μg用いて、GeneAmp PCR 試薬キット（宝酒造社製）により制限酵素EcoRＩおよびHindIIIサイトを含む変異型アポイクオリンのＮ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステイン残基を有するフラグメントをＰＣＲ増幅した後、精製キット（キアゲン社製）でフラグメントを分離し、次いで制限酵素HindIIIとEcoRIで消化して、変異型アポイクオリンのＮ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステイン残基を有するHindIII-EcoRIフラグメントを取得した。一方、piP-HEΔEプラスミドを制限酵素HindIIIとEcoRIで消化した後、プロモーターおよびOmpAシグナルペプチドを含むベクター側を単離した。次いで、これをHindIII-EcoRIフラグメントと連結し、このようにして得られたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ８３株を形質転換した。形質転換体の中から、Ｎ−末端から５番目のＬｅｕと６番目のＴｈｒとの間にシステインが導入された変異型アポイクオリン発現するpiP-HE-Cys4プラスミドを単離した。塩基配列を、Taq DyeDeoxy Termintor Cycle sequencing Kit (Applied Biosytems 社製)およびＤＮＡ ３７７ シークエンサー（Applied Biosytems 社製）を用いて決定し、このシステイン導入アポイクオリン（以下「Ｃｙｓ４−アポイクオリン」と言うことがある。）遺伝子を確認した。このＣｙｓ４−アポイクオリンのアミノ酸配列は配列番号４で示したものである。
【００３７】
（２）システイン導入アポイクオリン生産株の分離
宿主として大腸菌ＷＡ８０２株を使用し、実施例１で作製した組換えプラスミドpiP-HE-Cys4を発現ベクターとし、常法により形質転換を実施した。形質転換体２０株をＬＢ（水１Ｌ中、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ，ｐＨ７.２）寒天培地にて３０℃で一晩培養した後、５mLのアンピシリン含有（５０μg／mL）ＬＢ液体培地に植菌し、さらに３７℃で１６時間培養した。次いで、最も高い発光活性を有する菌株、即ち最も高いＣｙｓ４−アポイクオリン産生菌株を選択し、高発光活性を有する菌株を大量培養用の種株とした。
【００３８】
（３）システイン導入アポイクオリン産生菌株の培養
Ｃｙｓ４−アポイクオリン産生菌株を３０℃で一晩培養後、５０mLのアンピシリン含有（５０μg／mL）ＬＢ液体培地に植菌した。さらに３０℃で８時間培養した後、新鮮ＬＢ液体培地２Ｌに移し、３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。菌体と培養液を低速遠心分離（５０００×ｇ）により分離した。菌体、培養液は両者とも発現したアポイクオリンを含むためそれぞれ保存し、Ｃｙｓ４−アポイクオリン精製の出発材料とした。
【００３９】
（４）菌体からのシステイン導入イクオリンの再生および精製
集菌した菌体は、還元剤のジチオスレイトール（和光純薬社製）２００mgを含む４００mLの緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）に懸濁した。菌体を氷冷下で２分間超音波破砕処理して破砕した後、２０分間遠心分離（１２０００×ｇ）して上澄み液を集めた。少量のメタノールに溶解した化学合成セレンテラジンを、Ｃｙｓ４−アポイクオリンの１.２倍のモル濃度になるように、上記の上澄み液に添加し、４℃で５時間以上放置した。得られた上澄み液を直ちに、カラム緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６）で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア製、直径２cm×１０cm）に吸着させ、２８０nmでの溶出液の吸光度が０.０５以下になるまで０.１Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液でカラムを洗浄した。次いで、カラムに吸着した未再生Ｃｙｓ４−アポイクオリンと再生Ｃｙｓ４−イクオリンの両者を含む画分を０.１Ｍ〜０.４Ｍ−ＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出した。
【００４０】
再生Ｃｙｓ４−イクオリンと未再生Ｃｙｓ４−アポイクオリンとの分離は、ブチルセファロース４ファーストフローゲルクロマトグラフィーによって、次のように実施した。
Ｑ−セファロースカラムから溶出したオレンジ色の溶出液に、最終濃度が２Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加した。添加後、不溶性画分を遠心分離により除去した。次いで、２Ｍ 硫酸アンモニウムを含む上述のカラム緩衝液で平衡化したブチルセファロース４ファーストフロー（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２cm×８cm）にその上澄み液を加え、硫酸アンモニウムの２Ｍ〜１Ｍの直線濃度勾配により溶出し、発光活性を有する、即ち再生Ｃｙｓ４−イクオリンを含むオレンジ色画分を収集した。一方、未再生のＣｙｓ４−アポイクオリンはカラム緩衝液でのみ溶出された。
【００４１】
精製画分の純度検定は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実施した。その結果、精製画分について分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターで測定した結果、９８％以上であった。精製蛋白質濃度をウシ血清アルブミンを標品としてBradford法（バイオラッド社製）により決定したところ、２Ｌの培養菌体からの高純度Ｃｙｓ４−イクオリン収量は４４.６mgであった。
【００４２】
（５）培養液からのシステイン導入イクオリンの再生および精製
培養液から純度９８％以上のアポイクオリンを取得し、実験例４に従ってイクオリンに再生し、精製した。精製されたイクオリンを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、実験例４で得られたものと同じであった。培養液２Ｌから高純度Ｃｙｓ４−イクオリン１０.４mgが得られた。
【００４３】
実験例２：Ａ−Ａ複合体の製造−１（システイン導入イクオリンと抗−ＡＦＰ抗体との複合体）
（１）スルフヒドリル反応性抗体の製造（抗−ＡＦＰ抗体とマレイミド基を有する架橋試薬との結合）
５３４μｇ（３ｎｍｏｌ）の抗−ＡＦＰ抗体(日本医学臨床検査研究所製、クローンＮｏ．１Ｄ５、サブクラスＩｇＧ１−κ、以下「１Ｄ５」と言うことがある。)を、２００μｌの０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む６６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、以降「緩衝液Ａ」と記載）に溶解したものに、緩衝液Ａにて１ｍＭに調製したスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ、ＰＩＥＲＣＥ社）を１５μｌ（スルホ−ＳＭＣＣ １５ｎｍｏｌ、混合条件１：１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／５）加えたもの、３０μｌ（スルホ−ＳＭＣＣ ３０ｎｍｏｌ、混合条件２：１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／１０）加えたもの、３００μｌ（スルホ−ＳＭＣＣ ３００ｎｍｏｌ、混合条件３：１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／１００）加えたものの３種類を準備し、それぞれ４℃にて２時間反応させた。反応後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を、それぞれに２μｌ（１００ｎｍｏｌ）加え２５℃にて１０分以上静置して、反応を停止した。未反応のスルホ−ＳＭＣＣをアミコンウルトラ−４スピンカラム（ミリポア社製、分画分子量１０，０００）を用いて４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心して（日立製作所製、ＣＲ２０Ｂ２）除去し、抗−ＡＦＰ抗体とマレイミド基を有する架橋試薬との結合体（以下「マレイミド化１Ｄ５」と言うことがある。）を３種類得た。混合条件１で得られたものをマレイミド化１Ｄ５−１、混合条件２で得られたものをマレイミド化１Ｄ５−２、混合条件３で得られたものをマレイミド化１Ｄ５−３とした。なお、Ｅ１％２８０ｎｍ＝１４から算出したマレイミド化１Ｄ５−２の回収率は８４．６％（４５４μｇ）であった。
【００４４】
（２）システイン導入イクオリンとスルフヒドリル反応性抗体（マレイミド化１Ｄ５−１〜３）との反応
実験例１で製造したシステイン導入イクオリンを7.5nmolになるように緩衝液Ａにて希釈、調製した。これを、マレイミド化１Ｄ５−１〜３ ９０μｌ（１．５ｎｍｏｌ）のそれぞれに加え、４℃にて一晩反応させた。反応後、それぞれに１０ｍＭシステイン水溶液を２μｌ（２０ｎｍｏｌ）加え、システイン導入イクオリンとマレイミド化１Ｄ５との複合体（以下「ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５」と言うことがある。）を３種類得た。なお、マレイミド化１Ｄ５−１を用いて得られたものをＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−１、マレイミド化１Ｄ５−２を用いて得られたものをＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−２、マレイミド化１Ｄ５−３を用いて得られたものをＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−３とした。
３種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５とも発光活性の低下はほとんど起こらず、いずれも９６％の発光活性を保持していた。得られた３種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を１２％分離ゲル（テフコ社製）を用いて還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。結果を図２に示す。
【００４５】
システイン導入イクオリン（２１ｋＤａ）と１Ｄ５由来のＨ鎖（５５ｋＤａ）が結合してできたと思われる７５ｋＤａに主なバンドが観察されたが、ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５の種類（１Ｄ５とスルホ−ＳＭＣＣとの混合比率）によってバンドの濃さが異なり、１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／５で反応させた場合、７５ｋＤａのバンドは薄く、Ａ−Ａ複合体の形成量が少ないことが示された。また、１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／１００で反応させた場合、非特異な結合によるものと思われるバンドが高分子量側に見られた。１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／１０で反応させた場合、７５ｋＤａに濃いバンドが確認でき、非特異な結合と思われるバンドも少なく、ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５が多量に形成されていることが示された。
【００４６】
（３）３種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５によるＡＦＰの生物発光イムノアッセイ
１）抗−ＡＦＰ抗体のコーティング
抗−ＡＦＰ抗体（クローンＮｏ．６Ｄ２、サブクラスＩｇＧ２ａ−κ、日本医学臨床検査研究所、以下「６Ｄ２」と言うことがある。）を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて５μｇ／ｍｌに調製し、９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＃４３７７９６）に１００μｌ／ウェル分注し、室温にて一晩静置してコートした。
【００４７】
２）ポストコーティング
静置後、炭酸緩衝液を除去し、１％牛血清アルブミン（フラクションＶ、生化学工業）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ・２Ｎａ、同仁化学研究所）、０．０５％アジ化ナトリウム（和光純薬工業）を含む１５０ｍＭ ＮａＣｌ（和光純薬工業）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（和光純薬工業）（以降ＴＢＳと記載）（以降ポストコーティング溶液と記載）を２００μｌ／ウェル分注、４℃にて一晩静置した。
【００４８】
３）ＡＦＰとＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５の反応
ポストコーティング溶液を捨て、よく洗浄した後、１０％ブロックエース（大日本製薬）、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＢＳ（以降希釈液と記載）で１１０μｇ／ｍｌ ＡＦＰ（Ｄａｋｏ）を１２．５ｎｇ／ｍｌに希釈、５０μｌ／ウェル分注し、更に希釈液で５０００〜１００００倍に希釈したＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を５０μｌ／ウェル分注後、３０℃にて１時間静置した。
【００４９】
４）イクオリンによる発光の測定
静置後、反応液を捨て、よく洗浄した後、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）にて、５０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００μｌ／ウェル注入して発光強度を０．１秒間隔で５秒間測定し、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）を算出した。
【００５０】
３種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによるＩｍａｘとシグナル（ＡＦＰ１２．５ｎｇ／ｍｌ）／ノイズ（ＡＦＰ０ｎｇ／ｍｌ）比（Ｓ／Ｎ比）を表１に示した。Ｉｍａｘが高くＳ／Ｎ比がよい、抗体：スルホ−ＳＭＣＣ＝１：１０で反応させた場合が、Ａ−Ａ複合体調製時の混合条件として適していることが示された。また、抗体：スルホ−ＳＭＣＣ＝１：５で反応させた場合でもＳ／Ｎ比は１：１０で反応させた場合とほぼ同等のレベルを維持しており、１：５でもＡ−Ａ複合体としてイムノアッセイ系で機能することが示された。
【００５１】
【表１】
【００５２】
実験例３：Ａ−Ａ複合体の製造２（システイン導入イクオリンと抗−ＡＦＰ抗体との複合体）
（１）スルフヒドリル反応性抗体の製造（抗−ＡＦＰ抗体とマレイミド基を有する架橋試薬との結合）
５３４μｇ（３ｎｍｏｌ）の１Ｄ５を、２００μｌの緩衝液Ａに溶解したものを２本準備し、緩衝液Ａにて１ｍＭに調製したスルホ−ＳＭＣＣを３０μｌ（３０ｎｍｏｌ、１Ｄ５／スルホ−ＳＭＣＣ＝１／１０）加え、そのうち１本を２０℃にて３０分間反応させ、もう一方を４℃にて２時間反応させた。反応後、それぞれに５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を２μｌ（１００ｎｍｏｌ）加え、２５℃にて１０分以上静置して、反応を停止した。次いで、アミコンウルトラ−４スピンカラム（ミリポア社製、分画分子量１０，０００）を用いて４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心し（日立製作所製、ＣＲ２０Ｂ２）、未反応のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを除去し、２種類のマレイミド化１Ｄ５を得た。２０℃、３０分反応させて得られたものをマレイミド化１Ｄ５−４、４℃にて２時間反応させて得られたものをマレイミド化１Ｄ５−５とした。なお、Ｅ１％２８０ｎｍ＝１４から算出したマレイミド化１Ｄ５−５の回収率は８４．６％（４５４μｇ）であった。
【００５３】
（２）システイン導入イクオリンとスルフヒドリル反応性担体（マレイミド活性化１Ｄ５）との反応
マレイミド化１Ｄ５−４ ９０μｌ（１．５ｎｍｏｌ）とマレイミド化１Ｄ５−５ ９０μｌ（１．５ｎｍｏｌ）に、実験例１で製造したシステイン導入イクオリンを7.5nmolになるように緩衝液Ａにて希釈、調製したものをそれぞれ加え、マレイミド化１Ｄ５−４を用いた方は４℃にて２時間反応させ、マレイミド化１Ｄ５−５を用いた方は４℃にて一晩反応させた。反応後、それぞれに１０ｍＭシステインを２μｌ（２０ｎｍｏｌ）加えた。その後、アミコンウルトラ−４スピンカラム（分画分子量１００，０００）を用いて、４℃、６０００ｒｐｍにて５分間遠心し、未反応のシステイン導入イクオリンを除去し、２種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を得た。なお、マレイミド化１Ｄ５−４を用いて得られたものをＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４、マレイミド化１Ｄ５−５を用いて得られたものをＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−５とした。
２種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５とも発光活性の低下はほとんど起こらず、いずれも９６％の発光活性を保持していた。
【００５４】
（３）２種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５によるＡＦＰの生物発光イムノアッセイ
１）抗−ＡＦＰ抗体のコーティング
６Ｄ２を０．０５％ アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて５μｇ／ｍｌに調製し、９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＃４３７７９６） に１００μｌ／ウェル分注し、室温にて一晩静置してコートした。
【００５５】
２）ポストコーティング
静置後、炭酸緩衝液を除去し、ポストコーティング溶液を２００μｌ／ウェル分注、４℃にて一晩静置した。
【００５６】
３）ＡＦＰとＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５の反応
ポストコーティング溶液を捨て、よく洗浄した後、希釈液で１１０μｇ／ｍｌ ＡＦＰ（Ｄａｋｏ）を１２．５ｎｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌ／ウェル分注し、更に希釈液で５０００〜１００００倍に希釈したＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を５０μｌ／ウェル分注後、３０℃にて１時間静置した。
【００５７】
４）イクオリンによる発光の測定
静置後、反応液を捨て、よく洗浄した後、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）にて、５０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００μｌ／ウェル注入して発光強度を０．１秒間隔で５秒間測定し、最大発光強度値を算出した。
【００５８】
２種類のＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによるＩｍａｘとシグナル（ＡＦＰ１２．５ｎｇ／ｍｌ）／ノイズ（ＡＦＰ０ｎｇ／ｍｌ）比（Ｓ／Ｎ比）を表２に示した。どちらの反応条件で調製したＡ−Ａ複合体においても、Ｉｍａｘが高くＳ／Ｎ比がよい結果が得られ、反応温度を上げることで、より短い反応時間でＡ−Ａ複合体を調製することができることが示された。
【００５９】
【表２】
【００６０】
実験例４：Ａ−Ａ複合体を用いた生物発光イムノアッセイによるＡＦＰの定量
（１）ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４によるＡＦＰの生物発光イムノアッセイ
１）抗−ＡＦＰ抗体のコーティング
実験例３に記載の方法の準じて６Ｄ２のコーティングを行った。
２）ポストコーティング
実験例３に記載の方法の準じてポストコーティングを行った。
３）ＡＦＰとＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４の反応
ポストコーティング溶液を捨て、よく洗浄した後、希釈液で１１０μｇ／ｍｌ ＡＦＰ（Ｄａｋｏ）を希釈、１０ｐｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌまでの希釈系列を作製し、５０μｌ／ウェル分注し、更に希釈液で２１ｎｇ／ｍｌに調製したＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を５０μｌ／ウェル分注後、３０℃にて１時間静置した。
４）イクオリンによる発光の測定
実験例３に記載の方法の準じて発光の測定を行った。ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによるスタンダードカーブを図３に示した。その結果、ＡＦＰの検出限界は１０−２ｎｇ／ｍｌ、ダイナミックレンジは１０−２〜１０２ｎｇ／ｍｌを示した。バックグランドが低く抑えられており、高感度なイムノアッセイに優れていることが示された。
【００６１】
実験例５：Ａ−Ａ複合体の製造３（スルフヒドリル基導入イクオリンと抗−ＡＦＰ抗体との複合体）
（１）スルフヒドリル基導入イクオリンの製造
緩衝液Ａ １５μｌに溶解したイクオリン４４０μｇ（２０ｎｍｏｌ、チッソ株式会社製）に、ジメチルスルホキシド（和光純薬）にて１００ｍＭに調製したＮ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ、ＰＩＥＲＣＥ社）を２μｌ（２００ｎｍｏｌ）加え、緩衝液Ａにて全量として５００μｌとし、２５℃にて３０分反応させた。反応後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を２μｌ（１００ｎｍｏｌ）加え、２５℃にて１０分以上静置して反応を停止した。次いで、アミコンウルトラ−４スピンカラム（分画分子量１０，０００）を用いて、４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心し、未反応のＳＡＴＡを除去し、ＳＡＴＡ修飾イクオリンを得た。イクオリン活性から算出した回収率は７２．７％であった。
【００６２】
３１９μｇ（１４．５ｎｍｏｌ）のＳＡＴＡ修飾イクオリンが溶解した５００μｌの緩衝液Ａに、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５Ｍのヒドロキシルアミンが溶解した緩衝液Ａを２５μｌ加え、２５℃にて２時間反応させ、スルフヒドリル基の保護基である、Ｎ-ヒドロキシアセトアミドを脱保護した。反応後、アミコンウルトラ−４スピンカラム（分画分子量１０，０００）を用いて４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心して、ヒドロキシルアミンと脱保護基を除去、スルフヒドリル基導入イクオリンを得た。イクオリン活性から算出した最終的な回収率は５２．５％であった。
【００６３】
（２）スルフヒドリル反応性抗体（マレイミド化１Ｄ５）の製造
５３４μｇ（３ｎｍｏｌ）の１Ｄ５を、２００μｌの緩衝液Ａに溶解した。そこへ緩衝液Ａにて１０ｍＭに調製したスルホ−ＳＭＣＣを３０μｌ（３０ｎｍｏｌ）加えて、４℃にて２時間反応させた。反応後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）を２μｌ（１００ｎｍｏｌ）加え、２５℃にて１０分以上静置して、反応を停止した。次いで、アミコンウルトラ−４スピンカラム（ミリポア社製、分画分子量１０，０００）を用いて４℃、６０００ｒｐｍにて１５分間遠心し（日立製作所製、ＣＲ２０Ｂ２）、未反応のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを除去し、マレイミド化１Ｄ５を得た。このようにして得られたマレイミド化１Ｄ５の、Ｅ１％２８０ｎｍ＝１４から算出した回収率は８４．６％（４５４μｇ）であった。
【００６４】
（３）スルフヒドリル基導入イクオリンとスルフヒドリル反応性抗体（マレイミド化１Ｄ５）との反応
マレイミド化１Ｄ５ ９０μｌ（１．５ｎｍｏｌ）に、緩衝液Ａに溶解したスルフヒドリル基導入イクオリン（７．５ｎｍｏｌ）を加え、４℃にて一晩反応させた。反応後、１０ｍＭシステインを２μｌ（２０ｎｍｏｌ）加えた。その後、アミコンウルトラ−４スピンカラム（分画分子量１００，０００）を用いて、４℃、６０００ｒｐｍにて５分間遠心して、未反応のスルフヒドリル基導入イクオリンを除去し、Ａ−Ａ複合体（以下「ＡＱ−ＮＳ−１Ｄ５」言うことがある。）を得た。得られたＡＱ−ＮＳ−１Ｄ５を１２％分離ゲル（ＴＥＦＣＯ）を用い、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した結果、スルフヒドリル基導入イクオリン（２１ｋＤａ）と１Ｄ５由来のＨ鎖（５５ｋＤａ）が結合してできたと思われる７５ｋＤａに主なバンドが観察され、ＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５が形成されていることが確認された。
【００６５】
（４）ＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５によるＡＦＰの生物発光イムノアッセイ
１）抗−ＡＦＰ抗体のコーティング
実験例３に記載の方法の準じて６Ｄ２のコーティングを行った。
２）ポストコーティング
実験例３に記載の方法の準じてポストコーティングを行った。
３）ＡＦＰとＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５の反応
ポストコーティング溶液を捨て、よく洗浄した後、希釈液で１１０μｇ／ｍｌ ＡＦＰを希釈、１０ｐｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌまでの希釈系列を作製し、５０μｌ／ウェル分注し、更に希釈液で４０ｎｇ／ｍｌに調製したＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５を５０μｌ／ウェル分注後、３０℃にて１時間静置した。
４）イクオリンによる発光の測定
実験例３に記載の方法の準じて発光の測定を行った。ＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによるスタンダードカーブを図３に示した。その結果、ＡＦＰの検出限界は１０−２ｎｇ／ｍｌ、ダイナミックレンジは１０−２〜１０２ｎｇ／ｍｌを示し、ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４とほぼ同等のスペックを示した。
【００６６】
システイン導入イクオリンを用いて作製したＡ−Ａ複合体においても、ＡＦＰの生物発光イムノアッセイの測定で、スルフヒドリル基導入イクオリンを用いたイクオリン−抗体複合体とほとんど一致する標準曲線が描かれ、従来までのスルフヒドリル基導入イクオリンと比べても、全く遜色なくイムノアッセイの系に応用できることが示された。また、スルフヒドリル基導入イクオリンは、スルフヒドリル基の導入工程において、イクオリンの回収率が５２．５％と低く、Ａ−Ａ複合体調製工程において、イクオリンへのスルフヒドリル基導入工程が増えるだけではなく、更にイクオリンをロスしてしまうという結果が示され、該導入工程を必要としない、システイン導入イクオリンは、この点で優位であるといえることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合している本発明のＡ−Ａ複合体は、高い発光活性を有することから、診断薬などの標識物質に好ましく使用することができる。また、前述の組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体とを反応させる本発明のＡ−Ａ複合体の製造方法であれば、従来のイクオリンにスルフヒドリル基を導入する工程がなくとも、Ａ−Ａ複合体が作製でき、工程や時間を軽減できるだけではなく、イクオリンや抗体のロスも軽減できる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】システイン挿入イクオリン発現ベクターの構築プロセスを示す概略図。
【図２】抗体とマレイミド基導入架橋試薬の混合モル比を変更してＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５を作製した時のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。
【図３】ＡＱ−Ｓ−Ａｂ１Ｄ５−４とＡＱ−ＮＳ−Ａｂ１Ｄ５を用いたＡＦＰの生物発光イムノアッセイによるスタンダードカーブ。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
［配列番号：１］天然型アポイクオリンのアミノ酸配列。
［配列番号：２］変異型アポイクオリンのアミノ酸配列。
［配列番号：３］システインが導入された天然型アポイクオリンのアミノ酸配列。
［配列番号：４］システインが導入された変異型アポイクオリンのアミノ酸配列。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合している、イクオリンと抗体との複合体。
【請求項２】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合している、イクオリンと抗体との複合体。
【請求項３】
システインを介しての結合が、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬を介しての結合である、請求項１または２に記載のイクオリンと抗体との複合体。
【請求項４】
システインのスルフヒドリル基と反応する官能基がマレイミド基である、請求項３に記載のイクオリンと抗体との複合体。
【請求項５】
抗体が、腫瘍の増殖に伴って血清や尿中に増加する腫瘍マーカーを抗原とする抗体である、請求項１または２に記載のイクオリンと抗体との複合体。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の何れかに記載のイクオリンと抗体との複合体を用いることを特徴とする、抗原測定方法。
【請求項７】
請求項１〜５に記載の何れかに記載のイクオリンと抗体との複合体を構成成分とする、抗原測定キット。
【請求項８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する抗体とを反応させることを特徴とする、イクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【請求項９】
スルフヒドリル基と反応する官能基を有する抗体が、マレイミド基を有する抗体である、請求項８に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【請求項１０】
スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体が、マレイミド基を有する架橋試薬と抗体とを、モル比で５：１〜１０：１の割合で反応させて得られたものである、請求項８に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【請求項１１】
マレイミド基を有する架橋試薬と抗体との反応が、１０〜３０℃、０．５〜１時間の反応である、請求項１０に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【請求項１２】
組換えカルシウム結合型発光蛋白質と、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体との割合が、１：３〜１：５（モル比）の範囲である、請求項８に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【請求項１３】
組換えカルシウム結合型発光蛋白質と、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体との反応が、４〜２０℃、０．５〜２時間の反応である、請求項８に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合している、イクオリンと抗体との複合体。
【請求項２】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、抗体とが、該システインを介して結合している、イクオリンと抗体との複合体。
【請求項３】
システインを介しての結合が、システインのスルフヒドリル基と反応する官能基を有する架橋試薬を介しての結合である、請求項１または２に記載のイクオリンと抗体との複合体。
【請求項４】
システインのスルフヒドリル基と反応する官能基がマレイミド基である、請求項３に記載のイクオリンと抗体との複合体。
【請求項５】
抗体が、腫瘍の増殖に伴って血清や尿中に増加する腫瘍マーカーを抗原とする抗体である、請求項１または２に記載のイクオリンと抗体との複合体。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の何れかに記載のイクオリンと抗体との複合体を用いることを特徴とする、抗原測定方法。
【請求項７】
請求項１〜５に記載の何れかに記載のイクオリンと抗体との複合体を構成成分とする、抗原測定キット。
【請求項８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から４番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質、または、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から６番目のアミノ酸残基内に一つのシステインが導入されたアポ蛋白質を構成成分とする組換えカルシウム結合型発光蛋白質のいずれかと、スルフヒドリル基と反応する官能基を有する抗体とを反応させることを特徴とする、イクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【請求項９】
スルフヒドリル基と反応する官能基を有する抗体が、マレイミド基を有する抗体である、請求項８に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【請求項１０】
スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体が、マレイミド基を有する架橋試薬と抗体とを、モル比で５：１〜１０：１の割合で反応させて得られたものである、請求項８に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【請求項１１】
マレイミド基を有する架橋試薬と抗体との反応が、１０〜３０℃、０．５〜１時間の反応である、請求項１０に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【請求項１２】
組換えカルシウム結合型発光蛋白質と、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体との割合が、１：３〜１：５（モル比）の範囲である、請求項８に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【請求項１３】
組換えカルシウム結合型発光蛋白質と、スルフヒドリルと反応する官能基を有する抗体との反応が、４〜２０℃、０．５〜２時間の反応である、請求項８に記載のイクオリンと抗体との複合体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２９７２０３（Ｐ２００８−２９７２０３Ａ）
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１４１２３８（Ｐ２００７−１４１２３８）
【出願日】平成１９年５月２９日（２００７．５．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度独立行政法人 医薬基盤研究所基礎研究推進事業、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２９日（２００７．５．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度独立行政法人 医薬基盤研究所基礎研究推進事業、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【Ｆターム（参考）】
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