視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤
【課題】 視機能障害の改善に有用な視機能障害改善剤、及び視神経細胞の保護に有用な視神経細胞保護剤を提供する。
【解決手段】 視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤はいずれも、プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とする。前記有効成分は、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物又は含水アルコール抽出物であることが好ましい。視機能障害改善剤は、特に視神経細胞の機能低下に起因する視機能障害を改善する。視神経細胞保護剤は、特に網膜神経節細胞に対する保護作用を発揮し、眼疾患に対する治療又は予防に有用である。眼疾患としては、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病のような網膜疾患、又は緑内障などが挙げられる。
【解決手段】 視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤はいずれも、プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とする。前記有効成分は、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物又は含水アルコール抽出物であることが好ましい。視機能障害改善剤は、特に視神経細胞の機能低下に起因する視機能障害を改善する。視神経細胞保護剤は、特に網膜神経節細胞に対する保護作用を発揮し、眼疾患に対する治療又は予防に有用である。眼疾患としては、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病のような網膜疾患、又は緑内障などが挙げられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、視機能障害を改善する視機能障害改善剤、及び視神経細胞を保護することにより眼疾患の治療や予防に用いられる視神経細胞保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜を通って眼球内に入った光は、水晶体により屈折された後に硝子体を通過し、網膜の視神経細胞で受容される。受容された光は、強度や波長などに基づいて視神経細胞内で信号処理された後、視神経を介して脳に伝達され、大脳皮質視覚野で情報処理される。視機能（視覚機能）は、上直筋や下直筋などを含む眼球の調節機能、網膜における信号処理機能、視神経を介した信号伝達機能、大脳皮質視覚野における情報処理機能などに大きく影響を受けることが知られている。また、脳内での情報処理には、上丘、視蓋前域、視床下部などにおける目の方向調節や瞳孔の大きさ調節なども含まれる。視機能障害は、このような視機能に軽度又は重度の障害が発生した場合に引き起こされ、目の疲れ、結膜充血、目のかすみ、目のかゆみ、目の不快感、紫外線などによる眼炎（雪目など）を始めとして、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病のような網膜疾患、又は緑内障などが挙げられる。特に、網膜機能が障害されることにより、重大な眼疾患が引き起こされるケースが多い。
【０００３】
網膜は、外部からの光を受容する機能を有しており、視機能に関して重要な役割を果たしている。構造的には、網膜色素上皮層を始めとして、内網状層、神経節細胞層、神経線維層などの１０層から成る、厚さ０．１〜０．５ｍｍの組織である。内網状層には、アマクリン細胞という神経節細胞突起と対をなしてシナプスを形成する神経細胞が存在している。これは、光の照射開始時と終了時によく応答することから、光強度の検出器として働くと考えられている。神経節細胞層は、網膜の最も内側に存在する神経細胞を備えており、運動視、周辺視、色覚、形態覚などに深く関与している。また、神経線維層は、網膜中心動静脈から分枝した網膜血管を備えており、視神経に酸素及び栄養を供給する役割を担っている。
【０００４】
最近、緑内障において、網膜血流循環障害や視神経軸索輸送障害により、神経節細胞死に起因する神経線維の脱落が生じ、視野障害へと進行することが報告された。このことから、神経節細胞死を予防したり、最小限に抑える治療を行ったりすることが究極的な緑内障の治療につながるという、いわゆる「ニューロプロテクション」という考え方が確立されつつある（例えば非特許文献１参照）。実際、非特許文献２には、高眼圧虚血ラットにおいて網膜神経節細胞層や視神経乳頭の障害が観察されたことが報告されている。さらに、非特許文献３には、メチルセルロース誘発高眼圧ウサギにおいて、１０日間の高眼圧処置後、網膜神経節細胞密度の有意な減少とグリア細胞密度の有意な増加とが認められ、神経節細胞の脱落と細胞の大きさとの間に相関があったことが報告されている。
【０００５】
網膜血管が攣縮、血栓、動脈硬化などの要因により閉塞又は狭窄されると、網膜血流循環に障害が生じ、網膜や視神経への酸素及び栄養の供給が閉ざされる。その結果、細胞のエネルギーが欠乏するとともに、活性酸素（酸化反応）が発生して細胞が不可逆的な障害を受ける。網膜血流循環障害は、網膜疾患の中でも特に重要な位置を占めている。網膜血流循環障害に伴う症状の代表的な例としては、網膜静脈や網膜動脈が閉塞又は狭窄された網膜血管閉塞症、網膜剥離の一因である糖尿病性網膜症、視機能障害が出現する虚血性視神経症が挙げられる。この網膜血流循環障害はさらに、酸素や栄養の供給不足を引き起こして網膜神経節細胞を死に至らしめる。その他の網膜疾患である黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病などにおいても、神経節細胞死が深く関与すると考えられている。
【０００６】
近年、スーパーオキサイドやヒドロキシルラジカルなどのフリーラジカルによって、組織障害が引き起こされることが知られている。もともと生体にはスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）などのフリーラジカルを取り除く機序が存在している。しかしながら、このような機序は、病的過程において産生されたフリーラジカルから十分に組織を保護するようには機能しないため、ラジカルスカベンジャーや抗酸化剤などの治療薬を外部から投与する治療方法が考えられている。事実、ある種のラジカルスカベンジャーや抗酸化剤は、網膜虚血モデルや視神経切断モデルなどにおいて有意な効果を示している（非特許文献４〜６参照）。
【０００７】
さらに、眼疾患における多様な病態には、プログラム化細胞死の一形態であるアポトーシスが関与することが解明されつつある。例えば、虚血−再灌流による網膜障害（非特許文献７参照）、網膜剥離（非特許文献８参照）、網膜色素変性症（非特許文献９，１０参照）、網膜光障害（非特許文献１１参照）、緑内障（非特許文献１２，１３参照）などにおいて、網膜神経節細胞にアポトーシスが生じていることが報告されている。つまり、原因は多様であっても、結果として生じる視機能障害は、視覚情報ネットワークを構成している神経細胞のアポトーシスが原因となっている可能性が高い。
【０００８】
一方、プロポリスとは、ミツバチが樹木の特定部位、主として新芽や蕾及び樹皮から採取したガム質、樹液、植物色素系の物質及び香油などの集合体に、ミツバチ自身の分泌物や蜂ろうなどを混合して作製した暗緑色や褐色から暗褐色を呈した粘着性のある樹脂状の固形天然物質である（日本プロポリス協議会によって１９９５年に定義された）。しかしながら、最近では、植物体組織そのものを主構成成分とするプロポリスの存在が明らかになってきた（非特許文献１４参照）。ミツバチは、プロポリスを巣箱の壁や枠、出入り口などに塗布することにより、巣の補強や修理を行ったり、水や冷気の浸入を防いだりするとともに、他の昆虫（外敵）の侵入や雑菌・ウイルスの繁殖を防いだりしていると考えられている。
【０００９】
プロポリスは、古くから東欧諸国を中心とした世界中の多くの地域で民間伝承薬として用いられており、数多くの薬理学的効果が明らかにされてきた。これまで、抗菌・抗ウイルス作用（非特許文献１５参照）、活性酸素消去作用（非特許文献１６参照）、抗炎症作用（非特許文献１７参照）、免疫増強・賦活作用（非特許文献１８参照）、肝保護作用（非特許文献１９参照）、抗潰瘍・抗腫瘍作用（非特許文献２０参照）など様々な効果や有効成分の解明も報告されている。また、最近では脳保護作用などについても報告されている（非特許文献２１参照）。
【非特許文献１】眼科，40, 251-273,1998
【非特許文献２】Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 234, 445-451,1996
【非特許文献３】Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 234, S209-S213,1996
【非特許文献４】Ophthalmologica, 212, 268-274, 1998
【非特許文献５】Exp. Eye Res., 64, 559-564, 1997
【非特許文献６】J. Neurosci., 18, 1038-1046, 1998
【非特許文献７】J. Ocul. Pharmacol. Ther., 11, 253-259,1995
【非特許文献８】Arc. Ophthalmol., 113, 880-886,1995
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 974-978,1994
【非特許文献１０】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35, 2693-2699,1994
【非特許文献１１】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37, 775-782,1996
【非特許文献１２】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36, 774-786,1995
【非特許文献１３】Exp. Eye Res., 61, 33-44,1995
【非特許文献１４】FFI Journal, 209, 132-139, 2004
【非特許文献１５】Nat. Med., 52, 518-520
【非特許文献１６】J. Trad., Med., 13, 217-228, 1996
【非特許文献１７】Naturforsch, 49C, 39-43, 1994
【非特許文献１８】Biol., Pharm., Bull., 19, 966-970
【非特許文献１９】Biol., Pharm., Bull., 22, 1237-1239
【非特許文献２０】Anticancer Res., 16, 2669-2672, 1996
【非特許文献２１】Honeybee Science, 22, 62-66, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
視機能や眼疾患に対するプロポリスの影響を明らかにすることは、極めて興味深い課題である。本発明者らは、種々の眼疾患動物モデルや培養細胞を用いて鋭意研究したところ、プロポリスに視神経細胞を保護する作用があることを見出した。そして、これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。本発明の目的とするところは、視機能障害の改善に有用な視機能障害改善剤、及び視神経細胞の保護に有用な視神経細胞保護剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の視機能障害改善剤は、プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とすることを要旨とする。
請求項２に記載の視機能障害改善剤は、請求項１に記載の発明において、視神経細胞の機能低下に起因する視機能障害を改善することを要旨とする。
【００１２】
請求項３に記載の視機能障害改善剤は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記プロポリス抽出物は、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物又は含水アルコール抽出物であることを要旨とする。
【００１３】
請求項４に記載の視神経細胞保護剤は、プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とし、視神経細胞に対する保護作用を有することを要旨とする。
請求項５に記載の視神経細胞保護剤は、請求項４に記載の発明において、前記視神経細胞は網膜神経節細胞であることを要旨とする。
【００１４】
請求項６に記載の視神経細胞保護剤は、請求項４又は請求項５に記載の発明において、眼疾患に対する治療又は予防に用いられることを要旨とする。
請求項７に記載の視神経細胞保護剤は、請求項６に記載の発明において、前記眼疾患は緑内障であることを要旨とする。
【００１５】
請求項８に記載の視神経細胞保護剤は、請求項６に記載の発明において、前記眼疾患は網膜疾患であることを要旨とする。
請求項９に記載の視神経細胞保護剤は、請求項８に記載の発明において、前記網膜疾患は、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症又はレーベル病であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、視機能障害の改善に有用な視機能障害改善剤、及び視神経細胞の保護に有用な視神経細胞保護剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤に具体化した一実施形態について説明する。
本実施形態の視機能障害改善剤は、プロポリス抽出物を有効成分とする。この視機能障害改善剤は、目の疲れ、結膜充血、目のかすみ、目のかゆみ、目の不快感、紫外線などによる眼炎（雪目など）などの生理的な視機能の低下を改善する作用を始めとして、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病のような網膜疾患、又は緑内障などの病的な視機能障害を改善する作用を有する。前記生理的な視機能の低下を改善する作用は、特に、視神経細胞の機能低下に起因する視機能障害の改善に有用である。
【００１８】
本実施形態の視神経細胞保護剤は、プロポリス抽出物を有効成分とする。この視神経細胞保護剤は、視神経細胞を保護することにより、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病のような網膜疾患、又は緑内障などの眼疾患の治療及び予防に用いられる。特に、この視神経細胞保護剤は、視機能障害に起因する眼疾患の治療及び予防に有用である。
【００１９】
プロポリス抽出物としては、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物、有機溶媒抽出物、超臨界抽出物、ミセル化抽出物などが使用可能であるが、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物又は含水アルコール抽出物を使用することが好ましい。アルコール抽出物及び含水アルコール抽出物を調製するために用いられるアルコールは、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノールなどの低級アルコールであることが好ましく、視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤を経口摂取する場合には、エタノールであることが特に好ましい。有機溶媒抽出物を調製するために用いられる有機溶媒としては、アセトンやヘキサンなどの公知の有機溶媒が使用可能である。
【００２０】
プロポリスのアルコール抽出物中には、クロロゲン酸、ｐ−クマル酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、３，４−ジカフェオイルキナ酸、ドルパニン、フラボノイド類、アルテピリンＣ及びバッカリンから選ばれる少なくとも１種の化合物が含まれている。これらの化合物は、これまでに本発明者らの研究（J. Ethnopharmacol. In press, 2005）によって明らかになった構成成分である。
【００２１】
プロポリス抽出物の原料となるプロポリス原塊としては、ブラジルを含む南アメリカ諸国、中国や日本などのアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、オセアニア諸国で採取されるプロポリスなどあらゆる産地のものを使用することができるが、ブラジルのミナスジェライス州原産のグリーン・プロポリス原塊を使用することが特に好ましい。グリーン・プロポリス原塊は、キク科植物のバッカリス・ドラクンクリフォリア（伯名：アレクリン・ド・カンポ）を主たる起源植物としている。
【００２２】
グリーン・プロポリス原塊は、固形分２０％のエキス中のｐ−クマル酸相当量に関し、５％を超えるものであることが好ましく、７％以上のものであることが特に好ましい。なお、前記固形分２０％エキスとは、前記プロポリス原塊を９５％エタノールで抽出した９５％エタノール抽出液であって、当該抽出液に含まれる固形分の濃度（ｗ／ｖ％）が２０％となるように調整されたものを指す。さらに、前記ｐ−クマル酸相当量は、前記固形分２０％エキス中の全固形分をｐ−クマル酸の重量に換算した濃度（ｗ／ｖ％）を指す。
【００２３】
ちなみに、前記ｐ−クマル酸相当量は、（財）日本健康・栄養食品協会のプロポリス食品規格基準（平成１３年１１月１日一部改正）に規定された方法に準じて定量される。即ち、ｐ−クマル酸相当量の定量は、まず、前記固形分２０％エキスを液体クロマトグラフィにて分析し、保持時間３０分までの全ピーク面積を求める。そして、ｐ−クマル酸（精製物）のメタノール溶液を同様に液体クロマトグラフィにて分析し、前記固形分２０％エキスの全ピーク面積をｐ−クマル酸の重量に換算することにより、当該エキスの濃度（ｐ−クマル酸相当量）が求められる。なお、前記液体クロマトグラフィの条件としては、カラム；島津製作所のShim-pack CLC-ODS 6mm×150mm又はその同等品、移動相；メタノール／水／酢酸＝７０／３０／１、流量；１．２ｍｌ／分、温度；５０℃、測定波長；２７５ｎｍが用いられる。
【００２４】
視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤は、健康食品のような飲食品、医薬品、医薬部外品などの用途に利用可能である。視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤をこのような用途に利用する場合の投与経路は、経口及び非経口のいずれでもよい。経口投与の剤型としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、散剤などが挙げられる。非経口投与の剤型としては、点眼剤、注射剤、点鼻剤などが挙げられる。
【００２５】
これらの剤型は、汎用技術により製剤化される。例えば、点眼剤であれば、塩化ナトリウム、濃グリセリンなどの張化剤、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの緩衝化剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの界面活性剤、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウムなどの安定化剤、塩化ベンザルコニウム、パラベンなどの防腐剤などが必要に応じて添加される。なお、点眼剤のｐＨは、眼科製剤に許容される範囲内であれば特に限定されないが、４〜８の範囲であることが好ましい。
【００２６】
投与量は、症状、年令、剤型などによって適宜選択されるが、点眼剤であれば０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）の有効成分を含む点眼剤を１日１回〜数回点眼すればよく、注射剤であれば通常１日０．０００１〜１ｍｇの有効成分を１回又は数回に分けて投与すればよい。また、経口剤であれば通常１日当り１０μｇ〜１ｇの有効成分を１回又は数回に分けて投与すればよい。
【００２７】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 本実施形態の視機能障害改善剤は、プロポリス抽出物を有効成分とする。プロポリス抽出物は、目の疲れ、結膜充血、目のかすみ、目のかゆみ、目の不快感、紫外線などによる眼炎などの生理的な視機能低下を改善する作用を有するとともに、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病のような網膜疾患、又は緑内障などの病的な視機能障害を改善する作用を有する。即ち、本実施形態の視機能障害改善剤は、眼球の調節機能、網膜における信号処理機能、視神経を介した信号伝達機能、大脳皮質視覚野における情報処理機能などの視機能全般に対して良好な影響を与えることから、このような視機能障害の改善に有用である。特に、視神経細胞及びその機能に対して良好な影響を与え得る。
【００２８】
・ 本実施形態の視神経細胞保護剤は、プロポリス抽出物を有効成分とする。プロポリス抽出物は、上述したように病的な視機能障害を改善する作用を有するとともに、視神経細胞に対する保護作用を有するため、このような病的な視機能障害に起因する眼疾患の治療剤及び予防剤として有用である。特に、プロポリス抽出物は、網膜細胞障害における網膜神経節細胞層（ＧＣＬ）の細胞数の減少及び内網状層（ＩＰＬ）の菲薄化をともに抑制することができるうえ、網膜神経節細胞に対し細胞障害抑制作用（細胞死抑制作用及びアポトーシス抑制作用）を発揮することができる（下記実施例参照）。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例を示すが、これらの実施例は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
プロポリスの有用性を検討するべく、グリーン・プロポリス原塊（ミナスジェラス州にて収集）の抽出物について、（１）Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）誘発網膜障害マウスに対する作用（in vivo）、及び（２）ラット網膜神経節細胞障害に対する作用（in vitro）をそれぞれ検討した。
【００３０】
グリーン・プロポリス原塊を公知の方法により水で抽出した水抽出物と、９５％エタノールで抽出したエタノール抽出物とを準備した。なお、今回使用した水抽出物及びエタノール抽出物に共通に含まれる主成分は、クロロゲン酸、ｐ−クマル酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、３,４−ジカフェオイルキナ酸、ドルパニン、フラボノイド類、アルテピリンＣ、バッカリンであった。
【００３１】
（１）ＮＭＤＡ誘発網膜障害マウスに対するプロポリス抽出物の作用
マウスを３％イソフルレンで麻酔した後、１．５％イソフルレンでマウスに対する麻酔を維持した（イソフルレンは、酸素０．５Ｌ／分、笑気１．５Ｌ／分で気化させた）。次に、３２Ｇの注射針を用いてマウスの硝子体内にＮＭＤＡを４０ｎｍｏｌ／ｅｙｅ（２μＬ）の投与量で投与することにより網膜障害を誘発させた。投与７日後にマウスから眼球を摘出した後、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定後、パラフィン包埋、薄切し、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色した病理組織切片（３μｍ厚）を作製した。
【００３２】
溶媒（生理的食塩水）を腹腔内投与してＮＭＤＡ投与を行った群と、溶媒に溶解させた水抽出物を腹腔内投与してＮＭＤＡ投与を行った群とを、それぞれ「溶媒投与群」、「水抽出物投与群」とした。水抽出物及び溶媒の腹腔内投与はいずれも、１００ｍｇ／ｋｇ（０．１ｍＬ／１０ｇ）の投与量を、ＮＭＤＡ投与２日前、１日前、１時間前及び４時間後の計４回、腹腔内投与した。そして、視神経乳頭部が入るように１眼につき９μｍ間隔で６枚作製した病理組織切片から無作為に３切片を選択した後、選択した各切片について、視神経乳頭から左右いずれかの０．２５〜０．７５ｍｍ間の網膜の写真撮影を行い、網膜における神経節細胞層（ＧＣＬ）中の細胞数及び内網状層（ＩＰＬ）の厚さをそれぞれ計測した。なお、全く処置を施していない「正常（未処置）群」のマウスについても同様に、ＧＣＬ中の細胞数及びＩＰＬの厚さを計測した。実験結果を下記表１に示す。なお、表中の値は平均値を示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
表１より、溶媒投与群におけるＧＣＬ中の細胞数及びＩＰＬの厚さはいずれも、正常群と比べて明らかに低下しており、視神経細胞に網膜障害が発生していた。これに対し、水抽出物投与群におけるＧＣＬ中の細胞数及びＩＰＬの厚さはいずれも、溶媒投与群と比べて明らかに増加した。従って、プロポリス抽出物をマウスの腹腔内に投与することで、ＧＣＬ中の細胞数の減少及びＩＰＬの菲薄化がともに顕著に抑制され、結果的に視神経細胞に対する網膜障害の程度が軽減されていた。
【００３５】
（２）ラット網膜神経節細胞障害に対するプロポリスの作用
２−１．レサズリン還元試験による細胞生存率の評価
１０％牛胎児血清アルブミンを含むダルベッコ改変イーグル液体培地（Ｄ−ＭＥＭ）に懸濁したラット網膜神経節細胞を、９６穴マイクロプレートに１穴あたり１０００個の割合で播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で培養した。２４時間培養後、各穴をＤ−ＭＥＭ培地で２回洗浄後、無血清のＤ−ＭＥＭ培地に置き換え、さらにプロポリス抽出物（終濃度０．３〜３μｇ／ｍＬ）又は溶媒（０．１％ジメチィルスルフォキシド含有０．０１Ｍリン酸緩衝塩溶液）を添加し、ＣＯ２インキュベーター中に１時間静置した。
【００３６】
次に、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を終濃度が０．３ｍＭとなるように添加し、２４時間ＣＯ２インキュベーター中に静置することによりＨ２Ｏ２処置を行った。Ｈ２Ｏ２処置２４時間後にレサズリン溶液を８％となるように添加し、３時間ＣＯ２インキュベーター中に静置し、生成したレゾルフィンの蛍光強度を測定した（励起波長：５３０ｎｍ、測定波長：５９０ｎｍ）。溶媒のみを添加してＨ２Ｏ２処置の代わりに溶媒処置を行った群、溶媒のみを添加してＨ２Ｏ２処置を行った群、溶媒に溶解させたプロポリス抽出物を添加してＨ２Ｏ２処置を行った群をそれぞれ「正常群」、「Ｈ２Ｏ２処置群」、「プロポリス抽出物（エタノール抽出物又は水抽出物）処置群」とした。これらの結果について、「正常群」の計側値（蛍光強度）を１００％として下記表２に示す。なお、表中の値は平均値を示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】
表２より、Ｈ２Ｏ２処置群における網膜神経節細胞の生存率は、Ｈ２Ｏ２処置に起因して、正常群と比べて有意に低下した。これに対し、３μｇ／ｍＬの濃度のプロポリス抽出物を添加したプロポリス抽出物処置群の細胞生存率は、いずれもＨ２Ｏ２処置群と比べて有意に増加した。従って、プロポリス抽出物処置は、網膜神経節細胞に対して優れた保護作用を発揮した。ちなみに、水抽出物処置群の生存率がエタノール抽出物処置群よりも若干高い傾向を示していることから、水又はアルコール濃度の低い（例えば５０％未満のアルコール濃度の）含水アルコールにて抽出したプロポリス抽出物に、前記保護作用の高い化合物が高含有されていることが予想される。
【００３９】
２−２．核染色による細胞死の評価
上記２−１と同様に、１０％牛胎児血清アルブミンを含むＤ−ＭＥＭ培地に懸濁したラット網膜神経節細胞を９６穴マイクロプレートに１穴あたり１０００個の割合で播種し、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。２４時間培養後、各培地にヘキスト３３３４２（終濃度８μＭ）及びＹＯ−ＰＲＯ−１色素（終濃度０．１μＭ）を添加し、３０分間ＣＯ２インキュベーター中に静置した。次に、蛍光顕微鏡を通して各穴内の細胞をデジタルカメラ撮影することにより、各蛍光色素によって染色された核を観察した。得られた核染色像より、ヘキスト３３３４２陽性細胞を全細胞、ＹＯ−ＰＲＯ−１陽性細胞を死細胞として、全細胞に占める死細胞の割合（死細胞率（％））を算出した。実験結果を下記表３に示す。なお、表中の値は平均値を示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】
表３より、プロポリス抽出物処置群の死細胞率は、Ｈ２Ｏ２処置群と比べて有意に低下していた。また、ＹＯ−ＰＲＯ−１色素は、アポトーシスを引き起こした細胞の核に特異的に結合する色素であることから、Ｈ２Ｏ２処置に起因する細胞死は、アポトーシスであったことも確認された。従って、プロポリス抽出物は、ラット網膜神経節の培養細胞におけるアポトーシスに対しても著明な抑制作用を発揮した。即ち、プロポリス抽出物は、ラジカル、酸化反応、過酸化脂質などの酸化ストレスに起因して生じる視神経細胞の保護剤、及び網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病などに代表される網膜疾患や緑内障などの眼疾患に対する治療剤として有用であることが確認された。ちなみに、水抽出物処置群の死細胞率がエタノール抽出物処置群よりも明らかに高い傾向を示していたことから、水又はアルコール濃度の低い（例えば５０％未満のアルコール濃度の）含水アルコールにて抽出したプロポリス抽出物に、アポトーシス抑制作用の高い化合物が高含有されていることが予想される。
【００４２】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
視機能障害改善剤は、プロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とするものであってもよい。同様に、視神経細胞保護剤は、プロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とするものであってもよい。なお、プロポリス原塊には、クロロゲン酸、ｐ−クマル酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、３，４−ジカフェオイルキナ酸、ドルパニン、フラボノイド類、アルテピリンＣ及びバッカリンを含む２００〜３００種類の化合物が存在するといわれているが、視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤の有効成分としては、それら全ての化合物から選ばれる少なくとも１種の化合物が含まれるものとする。
【００４３】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 前記プロポリス抽出物は、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物又は含水アルコール抽出物である請求項４から請求項９のいずれか一項に記載の視神経細胞保護剤。
【００４４】
・ プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を含有する飲食品。プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とする医薬品。プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とする医薬部外品。これらの場合、視機能障害の改善及び視神経細胞の保護に優れた効果を発揮することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、視機能障害を改善する視機能障害改善剤、及び視神経細胞を保護することにより眼疾患の治療や予防に用いられる視神経細胞保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜を通って眼球内に入った光は、水晶体により屈折された後に硝子体を通過し、網膜の視神経細胞で受容される。受容された光は、強度や波長などに基づいて視神経細胞内で信号処理された後、視神経を介して脳に伝達され、大脳皮質視覚野で情報処理される。視機能（視覚機能）は、上直筋や下直筋などを含む眼球の調節機能、網膜における信号処理機能、視神経を介した信号伝達機能、大脳皮質視覚野における情報処理機能などに大きく影響を受けることが知られている。また、脳内での情報処理には、上丘、視蓋前域、視床下部などにおける目の方向調節や瞳孔の大きさ調節なども含まれる。視機能障害は、このような視機能に軽度又は重度の障害が発生した場合に引き起こされ、目の疲れ、結膜充血、目のかすみ、目のかゆみ、目の不快感、紫外線などによる眼炎（雪目など）を始めとして、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病のような網膜疾患、又は緑内障などが挙げられる。特に、網膜機能が障害されることにより、重大な眼疾患が引き起こされるケースが多い。
【０００３】
網膜は、外部からの光を受容する機能を有しており、視機能に関して重要な役割を果たしている。構造的には、網膜色素上皮層を始めとして、内網状層、神経節細胞層、神経線維層などの１０層から成る、厚さ０．１〜０．５ｍｍの組織である。内網状層には、アマクリン細胞という神経節細胞突起と対をなしてシナプスを形成する神経細胞が存在している。これは、光の照射開始時と終了時によく応答することから、光強度の検出器として働くと考えられている。神経節細胞層は、網膜の最も内側に存在する神経細胞を備えており、運動視、周辺視、色覚、形態覚などに深く関与している。また、神経線維層は、網膜中心動静脈から分枝した網膜血管を備えており、視神経に酸素及び栄養を供給する役割を担っている。
【０００４】
最近、緑内障において、網膜血流循環障害や視神経軸索輸送障害により、神経節細胞死に起因する神経線維の脱落が生じ、視野障害へと進行することが報告された。このことから、神経節細胞死を予防したり、最小限に抑える治療を行ったりすることが究極的な緑内障の治療につながるという、いわゆる「ニューロプロテクション」という考え方が確立されつつある（例えば非特許文献１参照）。実際、非特許文献２には、高眼圧虚血ラットにおいて網膜神経節細胞層や視神経乳頭の障害が観察されたことが報告されている。さらに、非特許文献３には、メチルセルロース誘発高眼圧ウサギにおいて、１０日間の高眼圧処置後、網膜神経節細胞密度の有意な減少とグリア細胞密度の有意な増加とが認められ、神経節細胞の脱落と細胞の大きさとの間に相関があったことが報告されている。
【０００５】
網膜血管が攣縮、血栓、動脈硬化などの要因により閉塞又は狭窄されると、網膜血流循環に障害が生じ、網膜や視神経への酸素及び栄養の供給が閉ざされる。その結果、細胞のエネルギーが欠乏するとともに、活性酸素（酸化反応）が発生して細胞が不可逆的な障害を受ける。網膜血流循環障害は、網膜疾患の中でも特に重要な位置を占めている。網膜血流循環障害に伴う症状の代表的な例としては、網膜静脈や網膜動脈が閉塞又は狭窄された網膜血管閉塞症、網膜剥離の一因である糖尿病性網膜症、視機能障害が出現する虚血性視神経症が挙げられる。この網膜血流循環障害はさらに、酸素や栄養の供給不足を引き起こして網膜神経節細胞を死に至らしめる。その他の網膜疾患である黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病などにおいても、神経節細胞死が深く関与すると考えられている。
【０００６】
近年、スーパーオキサイドやヒドロキシルラジカルなどのフリーラジカルによって、組織障害が引き起こされることが知られている。もともと生体にはスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）などのフリーラジカルを取り除く機序が存在している。しかしながら、このような機序は、病的過程において産生されたフリーラジカルから十分に組織を保護するようには機能しないため、ラジカルスカベンジャーや抗酸化剤などの治療薬を外部から投与する治療方法が考えられている。事実、ある種のラジカルスカベンジャーや抗酸化剤は、網膜虚血モデルや視神経切断モデルなどにおいて有意な効果を示している（非特許文献４〜６参照）。
【０００７】
さらに、眼疾患における多様な病態には、プログラム化細胞死の一形態であるアポトーシスが関与することが解明されつつある。例えば、虚血−再灌流による網膜障害（非特許文献７参照）、網膜剥離（非特許文献８参照）、網膜色素変性症（非特許文献９，１０参照）、網膜光障害（非特許文献１１参照）、緑内障（非特許文献１２，１３参照）などにおいて、網膜神経節細胞にアポトーシスが生じていることが報告されている。つまり、原因は多様であっても、結果として生じる視機能障害は、視覚情報ネットワークを構成している神経細胞のアポトーシスが原因となっている可能性が高い。
【０００８】
一方、プロポリスとは、ミツバチが樹木の特定部位、主として新芽や蕾及び樹皮から採取したガム質、樹液、植物色素系の物質及び香油などの集合体に、ミツバチ自身の分泌物や蜂ろうなどを混合して作製した暗緑色や褐色から暗褐色を呈した粘着性のある樹脂状の固形天然物質である（日本プロポリス協議会によって１９９５年に定義された）。しかしながら、最近では、植物体組織そのものを主構成成分とするプロポリスの存在が明らかになってきた（非特許文献１４参照）。ミツバチは、プロポリスを巣箱の壁や枠、出入り口などに塗布することにより、巣の補強や修理を行ったり、水や冷気の浸入を防いだりするとともに、他の昆虫（外敵）の侵入や雑菌・ウイルスの繁殖を防いだりしていると考えられている。
【０００９】
プロポリスは、古くから東欧諸国を中心とした世界中の多くの地域で民間伝承薬として用いられており、数多くの薬理学的効果が明らかにされてきた。これまで、抗菌・抗ウイルス作用（非特許文献１５参照）、活性酸素消去作用（非特許文献１６参照）、抗炎症作用（非特許文献１７参照）、免疫増強・賦活作用（非特許文献１８参照）、肝保護作用（非特許文献１９参照）、抗潰瘍・抗腫瘍作用（非特許文献２０参照）など様々な効果や有効成分の解明も報告されている。また、最近では脳保護作用などについても報告されている（非特許文献２１参照）。
【非特許文献１】眼科，40, 251-273,1998
【非特許文献２】Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 234, 445-451,1996
【非特許文献３】Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 234, S209-S213,1996
【非特許文献４】Ophthalmologica, 212, 268-274, 1998
【非特許文献５】Exp. Eye Res., 64, 559-564, 1997
【非特許文献６】J. Neurosci., 18, 1038-1046, 1998
【非特許文献７】J. Ocul. Pharmacol. Ther., 11, 253-259,1995
【非特許文献８】Arc. Ophthalmol., 113, 880-886,1995
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 974-978,1994
【非特許文献１０】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35, 2693-2699,1994
【非特許文献１１】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37, 775-782,1996
【非特許文献１２】Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36, 774-786,1995
【非特許文献１３】Exp. Eye Res., 61, 33-44,1995
【非特許文献１４】FFI Journal, 209, 132-139, 2004
【非特許文献１５】Nat. Med., 52, 518-520
【非特許文献１６】J. Trad., Med., 13, 217-228, 1996
【非特許文献１７】Naturforsch, 49C, 39-43, 1994
【非特許文献１８】Biol., Pharm., Bull., 19, 966-970
【非特許文献１９】Biol., Pharm., Bull., 22, 1237-1239
【非特許文献２０】Anticancer Res., 16, 2669-2672, 1996
【非特許文献２１】Honeybee Science, 22, 62-66, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
視機能や眼疾患に対するプロポリスの影響を明らかにすることは、極めて興味深い課題である。本発明者らは、種々の眼疾患動物モデルや培養細胞を用いて鋭意研究したところ、プロポリスに視神経細胞を保護する作用があることを見出した。そして、これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。本発明の目的とするところは、視機能障害の改善に有用な視機能障害改善剤、及び視神経細胞の保護に有用な視神経細胞保護剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の視機能障害改善剤は、プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とすることを要旨とする。
請求項２に記載の視機能障害改善剤は、請求項１に記載の発明において、視神経細胞の機能低下に起因する視機能障害を改善することを要旨とする。
【００１２】
請求項３に記載の視機能障害改善剤は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記プロポリス抽出物は、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物又は含水アルコール抽出物であることを要旨とする。
【００１３】
請求項４に記載の視神経細胞保護剤は、プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とし、視神経細胞に対する保護作用を有することを要旨とする。
請求項５に記載の視神経細胞保護剤は、請求項４に記載の発明において、前記視神経細胞は網膜神経節細胞であることを要旨とする。
【００１４】
請求項６に記載の視神経細胞保護剤は、請求項４又は請求項５に記載の発明において、眼疾患に対する治療又は予防に用いられることを要旨とする。
請求項７に記載の視神経細胞保護剤は、請求項６に記載の発明において、前記眼疾患は緑内障であることを要旨とする。
【００１５】
請求項８に記載の視神経細胞保護剤は、請求項６に記載の発明において、前記眼疾患は網膜疾患であることを要旨とする。
請求項９に記載の視神経細胞保護剤は、請求項８に記載の発明において、前記網膜疾患は、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症又はレーベル病であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、視機能障害の改善に有用な視機能障害改善剤、及び視神経細胞の保護に有用な視神経細胞保護剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤に具体化した一実施形態について説明する。
本実施形態の視機能障害改善剤は、プロポリス抽出物を有効成分とする。この視機能障害改善剤は、目の疲れ、結膜充血、目のかすみ、目のかゆみ、目の不快感、紫外線などによる眼炎（雪目など）などの生理的な視機能の低下を改善する作用を始めとして、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病のような網膜疾患、又は緑内障などの病的な視機能障害を改善する作用を有する。前記生理的な視機能の低下を改善する作用は、特に、視神経細胞の機能低下に起因する視機能障害の改善に有用である。
【００１８】
本実施形態の視神経細胞保護剤は、プロポリス抽出物を有効成分とする。この視神経細胞保護剤は、視神経細胞を保護することにより、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病のような網膜疾患、又は緑内障などの眼疾患の治療及び予防に用いられる。特に、この視神経細胞保護剤は、視機能障害に起因する眼疾患の治療及び予防に有用である。
【００１９】
プロポリス抽出物としては、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物、有機溶媒抽出物、超臨界抽出物、ミセル化抽出物などが使用可能であるが、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物又は含水アルコール抽出物を使用することが好ましい。アルコール抽出物及び含水アルコール抽出物を調製するために用いられるアルコールは、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノールなどの低級アルコールであることが好ましく、視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤を経口摂取する場合には、エタノールであることが特に好ましい。有機溶媒抽出物を調製するために用いられる有機溶媒としては、アセトンやヘキサンなどの公知の有機溶媒が使用可能である。
【００２０】
プロポリスのアルコール抽出物中には、クロロゲン酸、ｐ−クマル酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、３，４−ジカフェオイルキナ酸、ドルパニン、フラボノイド類、アルテピリンＣ及びバッカリンから選ばれる少なくとも１種の化合物が含まれている。これらの化合物は、これまでに本発明者らの研究（J. Ethnopharmacol. In press, 2005）によって明らかになった構成成分である。
【００２１】
プロポリス抽出物の原料となるプロポリス原塊としては、ブラジルを含む南アメリカ諸国、中国や日本などのアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、オセアニア諸国で採取されるプロポリスなどあらゆる産地のものを使用することができるが、ブラジルのミナスジェライス州原産のグリーン・プロポリス原塊を使用することが特に好ましい。グリーン・プロポリス原塊は、キク科植物のバッカリス・ドラクンクリフォリア（伯名：アレクリン・ド・カンポ）を主たる起源植物としている。
【００２２】
グリーン・プロポリス原塊は、固形分２０％のエキス中のｐ−クマル酸相当量に関し、５％を超えるものであることが好ましく、７％以上のものであることが特に好ましい。なお、前記固形分２０％エキスとは、前記プロポリス原塊を９５％エタノールで抽出した９５％エタノール抽出液であって、当該抽出液に含まれる固形分の濃度（ｗ／ｖ％）が２０％となるように調整されたものを指す。さらに、前記ｐ−クマル酸相当量は、前記固形分２０％エキス中の全固形分をｐ−クマル酸の重量に換算した濃度（ｗ／ｖ％）を指す。
【００２３】
ちなみに、前記ｐ−クマル酸相当量は、（財）日本健康・栄養食品協会のプロポリス食品規格基準（平成１３年１１月１日一部改正）に規定された方法に準じて定量される。即ち、ｐ−クマル酸相当量の定量は、まず、前記固形分２０％エキスを液体クロマトグラフィにて分析し、保持時間３０分までの全ピーク面積を求める。そして、ｐ−クマル酸（精製物）のメタノール溶液を同様に液体クロマトグラフィにて分析し、前記固形分２０％エキスの全ピーク面積をｐ−クマル酸の重量に換算することにより、当該エキスの濃度（ｐ−クマル酸相当量）が求められる。なお、前記液体クロマトグラフィの条件としては、カラム；島津製作所のShim-pack CLC-ODS 6mm×150mm又はその同等品、移動相；メタノール／水／酢酸＝７０／３０／１、流量；１．２ｍｌ／分、温度；５０℃、測定波長；２７５ｎｍが用いられる。
【００２４】
視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤は、健康食品のような飲食品、医薬品、医薬部外品などの用途に利用可能である。視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤をこのような用途に利用する場合の投与経路は、経口及び非経口のいずれでもよい。経口投与の剤型としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、散剤などが挙げられる。非経口投与の剤型としては、点眼剤、注射剤、点鼻剤などが挙げられる。
【００２５】
これらの剤型は、汎用技術により製剤化される。例えば、点眼剤であれば、塩化ナトリウム、濃グリセリンなどの張化剤、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの緩衝化剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの界面活性剤、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウムなどの安定化剤、塩化ベンザルコニウム、パラベンなどの防腐剤などが必要に応じて添加される。なお、点眼剤のｐＨは、眼科製剤に許容される範囲内であれば特に限定されないが、４〜８の範囲であることが好ましい。
【００２６】
投与量は、症状、年令、剤型などによって適宜選択されるが、点眼剤であれば０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）の有効成分を含む点眼剤を１日１回〜数回点眼すればよく、注射剤であれば通常１日０．０００１〜１ｍｇの有効成分を１回又は数回に分けて投与すればよい。また、経口剤であれば通常１日当り１０μｇ〜１ｇの有効成分を１回又は数回に分けて投与すればよい。
【００２７】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 本実施形態の視機能障害改善剤は、プロポリス抽出物を有効成分とする。プロポリス抽出物は、目の疲れ、結膜充血、目のかすみ、目のかゆみ、目の不快感、紫外線などによる眼炎などの生理的な視機能低下を改善する作用を有するとともに、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病のような網膜疾患、又は緑内障などの病的な視機能障害を改善する作用を有する。即ち、本実施形態の視機能障害改善剤は、眼球の調節機能、網膜における信号処理機能、視神経を介した信号伝達機能、大脳皮質視覚野における情報処理機能などの視機能全般に対して良好な影響を与えることから、このような視機能障害の改善に有用である。特に、視神経細胞及びその機能に対して良好な影響を与え得る。
【００２８】
・ 本実施形態の視神経細胞保護剤は、プロポリス抽出物を有効成分とする。プロポリス抽出物は、上述したように病的な視機能障害を改善する作用を有するとともに、視神経細胞に対する保護作用を有するため、このような病的な視機能障害に起因する眼疾患の治療剤及び予防剤として有用である。特に、プロポリス抽出物は、網膜細胞障害における網膜神経節細胞層（ＧＣＬ）の細胞数の減少及び内網状層（ＩＰＬ）の菲薄化をともに抑制することができるうえ、網膜神経節細胞に対し細胞障害抑制作用（細胞死抑制作用及びアポトーシス抑制作用）を発揮することができる（下記実施例参照）。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例を示すが、これらの実施例は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
プロポリスの有用性を検討するべく、グリーン・プロポリス原塊（ミナスジェラス州にて収集）の抽出物について、（１）Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）誘発網膜障害マウスに対する作用（in vivo）、及び（２）ラット網膜神経節細胞障害に対する作用（in vitro）をそれぞれ検討した。
【００３０】
グリーン・プロポリス原塊を公知の方法により水で抽出した水抽出物と、９５％エタノールで抽出したエタノール抽出物とを準備した。なお、今回使用した水抽出物及びエタノール抽出物に共通に含まれる主成分は、クロロゲン酸、ｐ−クマル酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、３,４−ジカフェオイルキナ酸、ドルパニン、フラボノイド類、アルテピリンＣ、バッカリンであった。
【００３１】
（１）ＮＭＤＡ誘発網膜障害マウスに対するプロポリス抽出物の作用
マウスを３％イソフルレンで麻酔した後、１．５％イソフルレンでマウスに対する麻酔を維持した（イソフルレンは、酸素０．５Ｌ／分、笑気１．５Ｌ／分で気化させた）。次に、３２Ｇの注射針を用いてマウスの硝子体内にＮＭＤＡを４０ｎｍｏｌ／ｅｙｅ（２μＬ）の投与量で投与することにより網膜障害を誘発させた。投与７日後にマウスから眼球を摘出した後、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定後、パラフィン包埋、薄切し、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色した病理組織切片（３μｍ厚）を作製した。
【００３２】
溶媒（生理的食塩水）を腹腔内投与してＮＭＤＡ投与を行った群と、溶媒に溶解させた水抽出物を腹腔内投与してＮＭＤＡ投与を行った群とを、それぞれ「溶媒投与群」、「水抽出物投与群」とした。水抽出物及び溶媒の腹腔内投与はいずれも、１００ｍｇ／ｋｇ（０．１ｍＬ／１０ｇ）の投与量を、ＮＭＤＡ投与２日前、１日前、１時間前及び４時間後の計４回、腹腔内投与した。そして、視神経乳頭部が入るように１眼につき９μｍ間隔で６枚作製した病理組織切片から無作為に３切片を選択した後、選択した各切片について、視神経乳頭から左右いずれかの０．２５〜０．７５ｍｍ間の網膜の写真撮影を行い、網膜における神経節細胞層（ＧＣＬ）中の細胞数及び内網状層（ＩＰＬ）の厚さをそれぞれ計測した。なお、全く処置を施していない「正常（未処置）群」のマウスについても同様に、ＧＣＬ中の細胞数及びＩＰＬの厚さを計測した。実験結果を下記表１に示す。なお、表中の値は平均値を示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
表１より、溶媒投与群におけるＧＣＬ中の細胞数及びＩＰＬの厚さはいずれも、正常群と比べて明らかに低下しており、視神経細胞に網膜障害が発生していた。これに対し、水抽出物投与群におけるＧＣＬ中の細胞数及びＩＰＬの厚さはいずれも、溶媒投与群と比べて明らかに増加した。従って、プロポリス抽出物をマウスの腹腔内に投与することで、ＧＣＬ中の細胞数の減少及びＩＰＬの菲薄化がともに顕著に抑制され、結果的に視神経細胞に対する網膜障害の程度が軽減されていた。
【００３５】
（２）ラット網膜神経節細胞障害に対するプロポリスの作用
２−１．レサズリン還元試験による細胞生存率の評価
１０％牛胎児血清アルブミンを含むダルベッコ改変イーグル液体培地（Ｄ−ＭＥＭ）に懸濁したラット網膜神経節細胞を、９６穴マイクロプレートに１穴あたり１０００個の割合で播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で培養した。２４時間培養後、各穴をＤ−ＭＥＭ培地で２回洗浄後、無血清のＤ−ＭＥＭ培地に置き換え、さらにプロポリス抽出物（終濃度０．３〜３μｇ／ｍＬ）又は溶媒（０．１％ジメチィルスルフォキシド含有０．０１Ｍリン酸緩衝塩溶液）を添加し、ＣＯ２インキュベーター中に１時間静置した。
【００３６】
次に、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を終濃度が０．３ｍＭとなるように添加し、２４時間ＣＯ２インキュベーター中に静置することによりＨ２Ｏ２処置を行った。Ｈ２Ｏ２処置２４時間後にレサズリン溶液を８％となるように添加し、３時間ＣＯ２インキュベーター中に静置し、生成したレゾルフィンの蛍光強度を測定した（励起波長：５３０ｎｍ、測定波長：５９０ｎｍ）。溶媒のみを添加してＨ２Ｏ２処置の代わりに溶媒処置を行った群、溶媒のみを添加してＨ２Ｏ２処置を行った群、溶媒に溶解させたプロポリス抽出物を添加してＨ２Ｏ２処置を行った群をそれぞれ「正常群」、「Ｈ２Ｏ２処置群」、「プロポリス抽出物（エタノール抽出物又は水抽出物）処置群」とした。これらの結果について、「正常群」の計側値（蛍光強度）を１００％として下記表２に示す。なお、表中の値は平均値を示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】
表２より、Ｈ２Ｏ２処置群における網膜神経節細胞の生存率は、Ｈ２Ｏ２処置に起因して、正常群と比べて有意に低下した。これに対し、３μｇ／ｍＬの濃度のプロポリス抽出物を添加したプロポリス抽出物処置群の細胞生存率は、いずれもＨ２Ｏ２処置群と比べて有意に増加した。従って、プロポリス抽出物処置は、網膜神経節細胞に対して優れた保護作用を発揮した。ちなみに、水抽出物処置群の生存率がエタノール抽出物処置群よりも若干高い傾向を示していることから、水又はアルコール濃度の低い（例えば５０％未満のアルコール濃度の）含水アルコールにて抽出したプロポリス抽出物に、前記保護作用の高い化合物が高含有されていることが予想される。
【００３９】
２−２．核染色による細胞死の評価
上記２−１と同様に、１０％牛胎児血清アルブミンを含むＤ−ＭＥＭ培地に懸濁したラット網膜神経節細胞を９６穴マイクロプレートに１穴あたり１０００個の割合で播種し、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。２４時間培養後、各培地にヘキスト３３３４２（終濃度８μＭ）及びＹＯ−ＰＲＯ−１色素（終濃度０．１μＭ）を添加し、３０分間ＣＯ２インキュベーター中に静置した。次に、蛍光顕微鏡を通して各穴内の細胞をデジタルカメラ撮影することにより、各蛍光色素によって染色された核を観察した。得られた核染色像より、ヘキスト３３３４２陽性細胞を全細胞、ＹＯ−ＰＲＯ−１陽性細胞を死細胞として、全細胞に占める死細胞の割合（死細胞率（％））を算出した。実験結果を下記表３に示す。なお、表中の値は平均値を示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】
表３より、プロポリス抽出物処置群の死細胞率は、Ｈ２Ｏ２処置群と比べて有意に低下していた。また、ＹＯ−ＰＲＯ−１色素は、アポトーシスを引き起こした細胞の核に特異的に結合する色素であることから、Ｈ２Ｏ２処置に起因する細胞死は、アポトーシスであったことも確認された。従って、プロポリス抽出物は、ラット網膜神経節の培養細胞におけるアポトーシスに対しても著明な抑制作用を発揮した。即ち、プロポリス抽出物は、ラジカル、酸化反応、過酸化脂質などの酸化ストレスに起因して生じる視神経細胞の保護剤、及び網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病などに代表される網膜疾患や緑内障などの眼疾患に対する治療剤として有用であることが確認された。ちなみに、水抽出物処置群の死細胞率がエタノール抽出物処置群よりも明らかに高い傾向を示していたことから、水又はアルコール濃度の低い（例えば５０％未満のアルコール濃度の）含水アルコールにて抽出したプロポリス抽出物に、アポトーシス抑制作用の高い化合物が高含有されていることが予想される。
【００４２】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
視機能障害改善剤は、プロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とするものであってもよい。同様に、視神経細胞保護剤は、プロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とするものであってもよい。なお、プロポリス原塊には、クロロゲン酸、ｐ−クマル酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、３，４−ジカフェオイルキナ酸、ドルパニン、フラボノイド類、アルテピリンＣ及びバッカリンを含む２００〜３００種類の化合物が存在するといわれているが、視機能障害改善剤及び視神経細胞保護剤の有効成分としては、それら全ての化合物から選ばれる少なくとも１種の化合物が含まれるものとする。
【００４３】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 前記プロポリス抽出物は、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物又は含水アルコール抽出物である請求項４から請求項９のいずれか一項に記載の視神経細胞保護剤。
【００４４】
・ プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を含有する飲食品。プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とする医薬品。プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とする医薬部外品。これらの場合、視機能障害の改善及び視神経細胞の保護に優れた効果を発揮することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とする視機能障害改善剤。
【請求項２】
視神経細胞の機能低下に起因する視機能障害を改善する請求項１に記載の視機能障害改善剤。
【請求項３】
前記プロポリス抽出物は、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物又は含水アルコール抽出物である請求項１又は請求項２に記載の視機能障害改善剤。
【請求項４】
プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とし、視神経細胞に対する保護作用を有する視神経細胞保護剤。
【請求項５】
前記視神経細胞は網膜神経節細胞である請求項４に記載の視神経細胞保護剤。
【請求項６】
眼疾患に対する治療又は予防に用いられる請求項４又は請求項５に記載の視神経細胞保護剤。
【請求項７】
前記眼疾患は緑内障である請求項６に記載の視神経細胞保護剤。
【請求項８】
前記眼疾患は網膜疾患である請求項６に記載の視神経細胞保護剤。
【請求項９】
前記網膜疾患は、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症又はレーベル病である請求項８に記載の視神経細胞保護剤。
【請求項１】
プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とする視機能障害改善剤。
【請求項２】
視神経細胞の機能低下に起因する視機能障害を改善する請求項１に記載の視機能障害改善剤。
【請求項３】
前記プロポリス抽出物は、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物又は含水アルコール抽出物である請求項１又は請求項２に記載の視機能障害改善剤。
【請求項４】
プロポリス抽出物又はプロポリス原塊に含まれる化合物を有効成分とし、視神経細胞に対する保護作用を有する視神経細胞保護剤。
【請求項５】
前記視神経細胞は網膜神経節細胞である請求項４に記載の視神経細胞保護剤。
【請求項６】
眼疾患に対する治療又は予防に用いられる請求項４又は請求項５に記載の視神経細胞保護剤。
【請求項７】
前記眼疾患は緑内障である請求項６に記載の視神経細胞保護剤。
【請求項８】
前記眼疾患は網膜疾患である請求項６に記載の視神経細胞保護剤。
【請求項９】
前記網膜疾患は、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症又はレーベル病である請求項８に記載の視神経細胞保護剤。
【公開番号】特開２００６−２４８９４６（Ｐ２００６−２４８９４６Ａ）
【公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−６５９７０（Ｐ２００５−６５９７０）
【出願日】平成１７年３月９日（２００５．３．９）
【出願人】（５９１０４５４７１）アピ株式会社 (59)
【出願人】（５９７１１２４７２）財団法人岐阜県研究開発財団 (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月９日（２００５．３．９）
【出願人】（５９１０４５４７１）アピ株式会社 (59)
【出願人】（５９７１１２４７２）財団法人岐阜県研究開発財団 (25)
【Ｆターム（参考）】
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