親和性成熟に基づく抗体最適化方法
本明細書では、抗体の構造／親和性または活性の関連性に基づいて、抗体またはその一部の活性を進化させる親和性成熟の合理的な方法が提供される。得られた親和性成熟抗体は、標的抗原に対し改善された、または最適化された結合親和性を示す。
Notice: Undefined index: DEJ in /mnt/www/gzt_disp.php on line 298
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原に対する１次抗体またはその一部の親和性成熟方法であって、
ａ）対応する型の１次抗体よりも低下した標的抗原に対する活性を示す関連抗体またはその一部を特定するステップであって、関連抗体またはその一部が、関連可変重鎖または関連可変軽鎖を含み、
関連抗体の対応する可変重鎖または可変軽鎖の内の１つが、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖に対する少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を示すが、それに対する１００％の配列同一性を示さない抗体であるか；または
関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じおよび／または少なくとも１つの可変軽鎖をコードする核酸分子のＶkおよびＪkもしくは少なくとも１つのＶlおよびＪl生殖系列セグメントが１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶkおよびＪkもしくはＶlおよびＪl生殖系列セグメントに同じである抗体であるかのいずれかであるステップ；
ｂ）１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列を比較するステップ；
ｃ）１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖内の標的領域を特定するステップであって、標的領域が関連抗体中の同じ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の差異を示す１次抗体中の領域であるステップ；
ｄ）それぞれ、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数の改変抗体を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がその標的領域内で単一アミノ酸残基の置換により改変され、それによりそれぞれの複数の抗体中の標的領域が、１次抗体に比べてアミノ酸の別のアミノ酸への置換を含むステップ；
ｅ）複数の改変抗体のそれぞれを標的抗原に対する活性により選別するステップ；ならびに
ｆ）１次抗体に比較して標的抗原に対する活性増加を示す改変抗体を選択するステップ、を含む方法。
【請求項２】
ｄ）の複数の改変抗体が１次抗体の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することにより産生され、ここで、核酸分子が標的領域中のアミノ酸をコードする１つのコドン含み、このコドンは非改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードし、それにより複数の各核酸分子が単一アミノ酸残基の置換により、標的領域中で改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１次抗体中の標的領域が、関連抗体の対応する領域に比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸差異を示す請求項１に記載の方法。
【請求項４】
関連抗体が１、２、３、４、または５関連抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
活性が、結合、シグナル伝達、分化、遺伝子発現の変化、細胞増殖、アポトーシス、走化性、細胞障害性、癌細胞浸潤、内皮細胞増殖および管形成の中から選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
活性が結合であり、結合が、イムノアッセイ、全細胞パニングおよび表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）の中から選択される方法により評価される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および電気化学発光測定法の中から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
電気化学発光測定法が、メソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗体がＦａｂ型である場合、１次抗体が、１０−４Ｍ未満；１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ；または正確にもしくは約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、またはそれ未満の結合親和性で標的抗原に結合する請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
関連抗体またはその一部が、対応する型の１次抗体より８０％以下の活性；対応する型の１次抗体の５％〜８０％の活性；または対応する型の１次抗体の約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または５％未満の活性もしくは前記数値未満の活性を示す請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
関連抗体が、陰性対照に比べて、同じまたは類似のレベルの標的抗原に対する活性を示す請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
関連抗体が、１次抗体の結合親和性より小さい結合親和性を示し、それによりそのＦａｂ型の関連抗体の結合親和性が１０−４Ｍ以下；１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ；または正確にもしくは約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍまたはそれ未満である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
標的領域が１次抗体の可変重鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
標的領域が１次抗体の可変軽鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
標的領域が１次抗体の可変重鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われ；さらに
別々に、かつ独立に、標的領域が１次抗体の可変軽鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われる、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
対応する関連可変重鎖を含む関連抗体が、対応する関連可変軽鎖を含む関連抗体とは異なる請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
対応する関連可変重鎖を含む関連抗体が、対応する関連可変軽鎖を含む関連抗体と同じである請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖が、対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも８０％以上の配列同一性；対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と８０％〜９９％の配列同一性；または対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも正確にまたは約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示す請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖が、対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも９５％配列同一性を示す請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
関連抗体が、関連可変重鎖または可変軽鎖を含み、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントに同じ抗体である；および／または少なくとも１つのＶkおよびＪkまたは１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶlおよびＪl生殖系列セグメントが、関連抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶkおよびＪkまたはＶlおよびＪl生殖系列セグメントと同じ抗体である請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
関連抗体が、関連可変重鎖または可変軽鎖を含み、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じ遺伝子ファミリー由来の抗体である；および／または少なくとも１つのＶkおよびＪkまたは１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶlおよびＪl生殖系列セグメントが、関連抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶkおよびＪkまたはＶlおよびＪl生殖系列セグメントと同じ遺伝子ファミリー由来の抗体である請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖が、対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも６０％以上の配列同一性；対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と６０％〜９９％の配列同一性；または対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも、もしくは約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示す請求項２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
標的領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の中から選択される請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
標的領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３である請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）１次抗体がコンビナトリアル抗体ライブラリーの選別により特定され；
ｂ）コンビナトリアル抗体ライブラリーが：
ｉ）インフレームでのＶＨ、ＤＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントまたはその一部を組み合わせてＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成するステップ、
ｉｉ）インフレームのＶkおよびＪkヒト生殖系列セグメントもしくはその一部、またはＶlおよびＪl生殖系列セグメントもしくはその一部を組み合わせて、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成し、
ステップｉ）およびｉｉ）で、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖk、Ｊk、ＶlまたはＪlの各部分が、抗原結合部位を形成するのに充分なＶＨまたはＶＬもしくはその一部を含む抗体またはその一部を産生するのに充分であるステップ、
ｉｉｉ）ステップｉ）およびｉｉ）を複数回繰り返して、複数の異なる核酸分子の配列を生成するステップ、
ｉｖ）核酸分子を合成して２つのライブラリーを作成し、
第１のライブラリーが、ＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含み；および
第２のライブラリーが、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含むステップ、
ｖ）第１のライブラリー由来および第２のライブラリー由来の核酸分子を細胞中に導入し、これを複数回繰り返して細胞のライブラリーを作成し、各細胞が細胞ライブラリー中の細胞間で相互に異なる組み合わせのＶＨおよびＶＬをコードする核酸分子を含むステップ、および
ｖｉ）細胞を増殖して各細胞中で抗体またはその一部を発現させ、それにより複数の抗体またはその一部を産生し、ライブラリー中の各抗体またはその一部が異なる組み合わせのＶＨおよびＶＬ鎖またはライブラリー中の全ての他の抗体またはその一部から抗原結合部位を形成するのに充分なその一部を含むステップを含む方法により作成され、および
ｃ）ライブラリーの選別を、
ｉ）ライブラリー中の抗体またはその一部を標的タンパク質と接触させ；
ｉｉ）抗体またはその一部の標的タンパク質に対する結合および／または抗体またはその一部が標的タンパク質の機能活性を調節するかどうかを評価し、および
ｉｉｉ）標的タンパク質に対し活性を示す抗体またはその一部を特定する（特定された抗体またはその一部が１次抗体である）ことにより実行する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
関連抗体もまた、コンビナトリアル抗体ライブラリーをステップａ）〜ｃ）に従い選別することにより特定され、それにより、関連抗体が、１次抗体に比べて、標的抗原に対する活性の減少を示す請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ライブラリーがアドレス指定できるライブラリーであり、それにより：
ステップｉｖ）で、合成核酸配列が個別にアドレス指定され、それにより、第１のアドレス指定される核酸ライブラリーおよび第２のアドレス指定される核酸ライブラリーを生成し；
ステップｖ）で、細胞がアドレス指定され、各座位が、アドレス指定される細胞ライブラリー中の全ての他の細胞からのＶＨおよびＶＬの異なる組み合わせをコードする核酸分子を含む細胞を含み；および
ステップｖｉ）で、複数の抗体またはその一部がアドレス指定され：
ライブラリー中の各座位の抗体またはその一部が、同じ抗体であり、また、各および全ての他の座位のものと異なり；および
抗体またはその一部の同一性をそのアドレスにより知ることができる、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
アドレス指定できるライブラリー中の抗体が空間アレイ中に配置され、アレイの各個別座位が異なる抗体メンバーに対応する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
空間アレイがマルチウェルプレートである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アドレス指定できるライブラリー中の抗体が、フィルター、チップ、スライド、ビーズまたはセルロースの中から選択される固体支持体に結合し、異なる抗体メンバーが、その表面に固定された請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
標的抗原が、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸または小分子である請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
標的抗原が、ウイルス、細菌、腫瘍もしくは他の細胞の表面上に発現している、または組換え型タンパク質もしくはペプチドである請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
標的抗原が、治療介入のための標的タンパク質である請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
標的抗原が、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスまたは血管新生に関与する請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
標的抗原が、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、および３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体；ＨＧＦＲとしても知られる）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体）、ＫＩＴ（ｃ−ｋｉｔ受容体）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（繊維芽細胞増殖因子受容体１、２、および４）、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、ＴＥＫ（内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（内皮細胞に存在する受容体型チロシンキナーゼ）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリトロポイエチン産生肝細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ、ＥＰＯ−Ｒ．、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２、ＣＤ４４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦならびにＥＰＯ、の中から選択される請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
標的領域中のサブセットのアミノ酸残基がアミノ酸置換により改変されている請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
標的領域中の１次抗体と関連抗体の間で異なるアミノ酸残基のみが、アミノ酸置換により改変される請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
標的領域中の１次抗体と関連抗体の間の同じアミノ酸残基のみがアミノ酸置換により改変される請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
標的領域中の全てのアミノ酸残基がアミノ酸置換により改変される請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
標的領域中で改変される各アミノ酸残基が、全１９の他のアミノ酸残基、または制限されたそのサブセットに改変される請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
複数の核酸分子が、ＰＣＲ変異誘発、カセット変異導入、部位特異的変異誘発、ランダム点変異誘発、テンプレート含有ウラシルを使った変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを使った変異誘発、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使った変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、および二重鎖切断修復、の中から選択される方法により生成される請求項２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
方複数の核酸分子が、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＮ、ＮＮＹまたはＮＮＲ変異誘発の中から選択される方法により生成される請求項２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
ステップｄ）の前に、
ｇ）１次抗体の系統的変異導入を行うステップで、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数の改変抗体を産生し、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖が、標的領域の単一アミノ酸残基のスキャンアミノ酸残基による置換により改変され、それにより、複数の抗体がそれぞれ、１次抗体に比べ標的領域中にアミノ酸を含む改変抗体であるステップ；
ｈ）標的抗原に対する活性により複数の改変抗体のそれぞれを選別するステップ；および
ｉ）アミノ酸置換不含の１次抗体に比較して、標的抗原に対する活性の保持または増加を示す改変抗体の中から２次抗体を選択し、それにより、ステップｂ）で１次抗体の代わりに２次抗体が使われるステップ、
をさらに含む請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
ステップｇ）で複数の改変抗体が、標的領域を含む改変型の１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することにより産生され、核酸分子が、スキャンアミノ酸をコードしない非改変可変重鎖または可変軽鎖の対応するコドンに比べて、標的領域中のスキャンアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより各複数の核酸分子が、標的領域内の単一アミノ酸残基の同じスキャンアミノ酸残基による置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
対応する型の１次抗体の少なくとも７５％以上の活性；対応する型の１次抗体の少なくとも７５％〜２００％；または、対応する型の１次抗体の少なくとも、もしくは約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％またはそれ以上の活性を示す２次抗体が選択される請求項４３〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
ステップｉ）の後に、２次抗体中で、アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、中性アミノ酸を含むように改変されたアミノ酸残基位置を測定するステップをさらに含む請求項４３〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
スキャンアミノ酸が、アラニン、トレオニン、プロリンおよびグリシンの中から選択される請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
アミノ酸がアラニンである請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
スキャンアミノ酸が非天然アミノ酸である請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
標的領域中のサブセットのアミノ酸残基が、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される請求項４３〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
標的領域内の１次抗体と関連抗体の間で異なるアミノ酸残基のみが、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される請求項４４〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
標的領域内の１次抗体と関連抗体の間で同じアミノ酸残基のみが、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
標的領域内の全てのアミノ酸が、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
選択された改変抗体が、１次抗体に比べ、２倍、５倍、１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、１００００倍またはそれ超改善された標的抗原に対する活性を示す請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
改変抗体が１次抗体の結合親和性よりも大きく、また、１ｘ１０−９Ｍ以下；１ｘ１０−９Ｍ〜１ｘ１０−１１Ｍ；または正確に、もしくは約１ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、３ｘ１０−９Ｍ、４ｘ１０−９Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、６ｘ１０−９Ｍ、７ｘ１０−９Ｍ、８ｘ１０−９Ｍ、９ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、３ｘ１０−１０Ｍ、４ｘ１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、６ｘ１０−１０Ｍ、７ｘ１０−１０Ｍ、８ｘ１０−１０Ｍ、９ｘ１０−１０Ｍもしくはそれ未満の結合親和性を示す請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
アミノ酸置換不含の１次抗体に比べて、改変抗体で変得られたアミノ酸改変を測定するステップをさらに含む請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
ステップｇ）で特定された改変抗体が選択され、ステップａ）での、次に続く親和性成熟用の１次抗体として使用されて、反復繰り返される請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
標的領域内の選択改変抗体の１つまたは複数の可変重鎖または１つまたは複数の可変軽鎖の１つまたは複数のアミノ酸置換が組み合わされて、さらなる改変抗体を生成し、それにより、さらなる改変抗体が標的抗原に対する活性により選別され、１次抗体および選択改変抗体に比較して、標的抗原に対する活性の増加を示す改変抗体を特定する請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
１次抗体の可変重鎖にステップａ）〜ｆ）を実行し、それぞれ標的領域にアミノ酸置換を含む１次改変抗体を選択し；
ａ）〜ｆ）１次抗体の可変軽鎖に、独立に、かつ別々にステップａ）〜ｆ）を実行し、それぞれ標的領域にアミノ酸置換を含む２次改変抗体を選択し；
１次改変抗体の可変重鎖を２次改変抗体の可変軽鎖と結合して、それぞれ可変重鎖および可変軽鎖の標的領域内のアミノ酸置換を含む複数の異なる３次改変抗体を生成し；および
標的抗原に対する結合により複数の３次改変抗体をそれぞれ選別し；さらに
１次および２次改変抗体に比較して、標的抗原に対する活性の増加を示す３次改変抗体を選択するステップを含む請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
ステップｆ）で１次改変抗体を選択後：
ｊ）さらなる変異誘発のために、１次改変抗体の可変重鎖または可変軽鎖内の別の異なる領域を選択するステップ；
ｋ）１次改変抗体の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生し、核酸分子が、選択領域中に、１次改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、複数の各核酸分子が単一アミノ酸残基の置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードするステップ；
ｌ）それぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数のさらなる改変抗体を産生し、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がステップｋ）で産生されたものであり、それにより、それぞれ複数の抗体の選択領域が、１次改変抗体に比べて、アミノ酸の異なるアミノ酸への置換を含むステップ；
ｍ）標的抗原に対する結合により、それぞれ複数のさらなる改変抗体を選別するステップ；および
ｎ）１次改変抗体に比べて、標的抗原に対する活性の増加を示すさらなる改変抗体を選択するステップ、
をさらに含む請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
異なる領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の中から選択される請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片、の中から選択される請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
標的抗原に対して抗体またはその一部の親和性成熟を行う方法であって：
ａ）改変型の１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することを含む１次抗体の系統的変異導入を行うステップであって、核酸分子が他のアミノ酸をコードしない非改変可変重鎖または可変軽鎖に対応するコドンに比べて、別のアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、コード化可変重鎖または軽鎖の完全長全体にわたる全ての位置が置換されるように、またはコード化可変重鎖または可変軽鎖の選択領域中の全ての位置が置換されるように、複数の各核酸分子が単一アミノ酸残基を別のアミノ酸への置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードし、また、それにより、各置換が同じアミノ酸残基への置換であるステップ；
ｂ）それぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数の改変抗体を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がステップａ）で産生されたものであり、それにより、それぞれ複数の抗体が、１次抗体に比べて、アミノ酸位置の別のアミノ酸による置換を含むステップ；
ｃ）それぞれ複数の改変抗体を標的抗原に対する活性により選別するステップ；
ｄ）アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、標的抗原に対して活性の保持または増加を示す改変抗体の中から２次抗体を選択するステップ；
ｅ）２次抗体のさらなる変異誘発を行うステップであって、２次抗体の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することを含み、核酸分子が、スキャンアミノ酸位置に、２次抗体中のスキャンアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、各複数の核酸分子が、スキャンアミノ酸位置で単一のアミノ酸残基により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードするステップ；および
ｆ）それぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数のさらなる改変抗体を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がステップｅ）で産生されたものであり、それにより、２次抗体に比べて、スキャンアミノ酸位置が異なるアミノ酸への置換を含むステップ；
ｇ）それぞれ複数のさらなる改変抗体を標的抗原に対する活性により選別するステップ；および
ｈ）１次抗体に比べ、または２次抗体に比べ、標的抗原に対し活性増加を示す３次抗体を選択するステップ、
を含む方法。
【請求項６４】
ステップａ）で、コード化可変重鎖または可変軽鎖の領域中の全ての位置が置換される請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
選択領域が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の中から選択される可変重鎖または可変軽鎖中の相補性決定領域である請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
対応する型の１次抗体の少なくとも７５％以上の活性；対応する型の１次抗体の７５％〜２００％の活性；または対応する型の１次抗体の少なくとも、もしくは約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％もしくはそれ超の活性である２次抗体が選択される請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
ステップｄ）の後ろに、アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、２次抗体でスキャンアミノ酸を含むように改変されるアミノ酸残基位置を測定するステップをさらに含む請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
他のアミノ酸が、アラニン、トレオニン、プロリンおよびグリシンの中から選択される請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
アミノ酸がアラニンである請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
他のアミノ酸が非天然アミノ酸である請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
それぞれ、複数の核酸分子が、単一アミノ酸残基の同じスキャンアミノ酸への置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする請求項６３〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
ステップｅ）で、スキャンアミノ酸位置が、全ての他のアミノ酸残基、または制限されたそのサブセットへのアミノ酸置換によって改変される請求項６３〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
改変が、１次抗体のその位置のスキャンアミノ酸への、または元のアミノ酸へのアミノ酸置換を含まない請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ステップｅ）で産生される複数の核酸分子が、ＰＣＲ変異誘発、カセット変異導入、部位特異的変異誘発、ランダム点変異誘発、テンプレート含有ウラシルを使った変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを使った変異誘発、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使った変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、ならびに二重鎖切断修復、の中から選択される方法により生成される請求項６３〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
ステップｅ）で産生される複数の核酸分子が、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＮ、ＮＮＹまたはＮＮＲ変異誘発、の中から選択される方法により生成される請求項６３〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
活性が、結合、シグナル伝達、分化、遺伝子発現の変化、細胞増殖、アポトーシス、走化性、細胞障害性、癌細胞浸潤、内皮細胞増殖および管形成、の中から選択される請求項６３〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
活性が結合であり、イムノアッセイ、全細胞パニングおよび表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）の中から選択される方法により結合が評価される請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および電気化学発光測定法の中から選択される請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
電気化学発光測定法がメソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）である請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
標的抗原が、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸または小分子である請求項６３〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
標的抗原が、ウイルス、細菌、腫瘍または他の細胞の表面上に発現している、または組換え型タンパク質もしくはペプチドである請求項６３〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
標的抗原が、治療介入用の標的タンパク質である請求項６３〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
標的抗原が、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスまたは血管新生に関与する請求項６３〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
標的抗原が、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、および３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体；ＨＧＦＲとしても知られる）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体）、ＫＩＴ（ｃ−ｋｉｔ受容体）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（繊維芽細胞増殖因子受容体１、２、および４）、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、ＴＥＫ（内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（内皮細胞に存在する受容体型チロシンキナーゼ）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリトロポイエチン産生肝細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ、ＥＰＯ−Ｒ．、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２、ＣＤ４４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦならびにＥＰＯ、の中から選択される請求項６３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
抗体がＦａｂ型の場合、１次抗体が、１０−４Ｍ未満；１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ；または正確にもしくは約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、またはそれ未満の結合親和性で標的抗原に結合する請求項６３〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
系統的変異導入を１次抗体の可変重鎖内で行い、そこからステップａ）〜ｈ）を行う請求項６３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
系統的変異導入を１次抗体の可変軽鎖内で行い、そこからステップａ）〜ｈ）を行う請求項６３〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
系統的変異導入を１次抗体の可変重鎖内で行い、そこからステップａ）〜ｈ）を行い；および
別々に、かつ独立に、系統的変異導入を１次抗体の可変軽鎖内で行い、そこからステップａ）〜ｈ）を行う、
請求項６３〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
３次抗体が、１次抗体または２次抗体に比べて、標的抗原に対し少なくとも２倍改善された活性；１次抗体または２次抗体に比べて、標的抗原に対し２倍〜１００００倍または２倍〜１０００倍改善された活性；または１次抗体または２次抗体に比べて、標的抗原に対し少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、１００００倍またはそれ超の改善された活性を示す請求項６３〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
３次抗体が、１次抗体の結合親和性よりも大きな結合親和性、および１ｘ１０−９Ｍ未満；１ｘ１０−９Ｍ〜１ｘ１０−１１Ｍ；または正確に、もしくは約１ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、３ｘ１０−９Ｍ、４ｘ１０−９Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、６ｘ１０−９Ｍ、７ｘ１０−９Ｍ、８ｘ１０−９Ｍ、９ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、３ｘ１０−１０Ｍ、４ｘ１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、６ｘ１０−１０Ｍ、７ｘ１０−１０Ｍ、８ｘ１０−１０Ｍ、９ｘ１０−１０Ｍもしくはそれ未満の結合親和性を示す請求項６３〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、３次抗体で変えられたアミノ酸改変を測定するステップをさらに含む請求項６３〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
ステップｈ）で特定された３次抗体が、ステップａ）で、それのさらなる成熟のために１次抗体として選択および使用され、それにより、改変されるアミノ酸残基がその後のこの方法の繰り返しによりこれ以上改変されない、反復繰り返される請求項６３〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
選択３次抗体の１つまたは複数の可変重鎖または１つまたは複数の可変軽鎖内の１つまたは複数のアミノ酸置換が組み合わされて、さらなる改変抗体を生成し、それにより、さらなる改変抗体が標的抗原に対する活性により選別され、１次抗体、２次抗体および選択３次抗体に比べて、標的抗原に対して活性増加を示すさらなる改変抗体を特定する請求項６３〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
１次抗体の可変重鎖にステップａ）〜ｈ）を行い、対応する１次抗体の可変重鎖に比べて、それぞれ、可変重鎖内にアミノ酸置換を含む３次抗体を選択するステップ；
独立に、かつ、別々に、１次抗体の可変軽鎖にステップａ）〜ｈ）を行い、対応する１次抗体の可変軽鎖に比べて、それぞれ、可変軽鎖内にアミノ酸置換を含む別の３次抗体を選択するステップ；
３次抗体の可変重鎖を別の３次抗体の可変軽鎖と組み合わせて、対応する１次抗体の可変重鎖および可変軽鎖に比べて、それぞれ、可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸置換を含む複数の異なるさらなる改変抗体を生成するステップ；
複数のさらなる改変抗体を標的抗原に対する結合により選別するステップ；および
１次抗体、２次抗体、および３次抗体に比べて、標的抗原に対する活性の増加を示す４次抗体を選択するステップ、
を含む請求項６３〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
ステップｈ）の３次抗体選択ステップの後ろに、
ｉ）さらなる変異誘発のために、３次抗体の可変重鎖または可変軽鎖内の別の異なる領域を選択するステップ；
ｊ）３次抗体の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生するステップであって、核酸分子が、選択領域中に、１次改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、それぞれ複数の核酸分子が、選択領域で単一のアミノ酸残基の置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードしているステップ；
ｋ）それぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数のさらなる改変抗体を産生するステップであって、可変重鎖または可変軽鎖の少なくとも１つがステップｊ）で産生されたものであり、それにより、選択領域が、３次抗体に比べ、それぞれ複数の抗体がアミノ酸の異なるアミノ酸への置換を含むステップ；
ｌ）複数のさらなる改変抗体を標的抗原に対する結合により選別するステップ；および
ｍ）３次抗体に比べて、標的抗原に対する活性の増加を示すさらなる改変抗体を選択するステップ、
をさらに含む請求項６３〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
異なる領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の中から選択される請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片、の中から選択される請求項６３〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
標的抗原に対する１次抗体またはその一部の親和性成熟方法であって、
ａ）対応する型の１次抗体よりも低下した標的抗原に対する活性を示す関連抗体またはその一部を特定するステップであって、関連抗体またはその一部が、関連可変重鎖または関連可変軽鎖を含み、
関連抗体の対応する可変重鎖または可変軽鎖の内の１つが、１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖に対する少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を示すが、それに対する１００％の配列同一性を示さない抗体であるか；または
関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じおよび／または少なくとも１つの可変軽鎖をコードする核酸分子のＶkおよびＪkもしくは少なくとも１つのＶlおよびＪl生殖系列セグメントが１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶkおよびＪkもしくはＶlおよびＪl生殖系列セグメントに同じである抗体であるかのいずれかであるステップ；
ｂ）１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列を比較するステップ；
ｃ）１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖内の標的領域を特定するステップであって、標的領域が関連抗体中の同じ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の差異を示す１次抗体中の領域であるステップ；
ｄ）それぞれ、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数の改変抗体を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がその標的領域内で単一アミノ酸残基の置換により改変され、それによりそれぞれの複数の抗体中の標的領域が、１次抗体に比べてアミノ酸の別のアミノ酸への置換を含むステップ；
ｅ）複数の改変抗体のそれぞれを標的抗原に対する活性により選別するステップ；ならびに
ｆ）１次抗体に比較して標的抗原に対する活性増加を示す改変抗体を選択するステップ、を含む方法。
【請求項２】
ｄ）の複数の改変抗体が１次抗体の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することにより産生され、ここで、核酸分子が標的領域中のアミノ酸をコードする１つのコドン含み、このコドンは非改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードし、それにより複数の各核酸分子が単一アミノ酸残基の置換により、標的領域中で改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１次抗体中の標的領域が、関連抗体の対応する領域に比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸差異を示す請求項１に記載の方法。
【請求項４】
関連抗体が１、２、３、４、または５関連抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
活性が、結合、シグナル伝達、分化、遺伝子発現の変化、細胞増殖、アポトーシス、走化性、細胞障害性、癌細胞浸潤、内皮細胞増殖および管形成の中から選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
活性が結合であり、結合が、イムノアッセイ、全細胞パニングおよび表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）の中から選択される方法により評価される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および電気化学発光測定法の中から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
電気化学発光測定法が、メソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗体がＦａｂ型である場合、１次抗体が、１０−４Ｍ未満；１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ；または正確にもしくは約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、またはそれ未満の結合親和性で標的抗原に結合する請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
関連抗体またはその一部が、対応する型の１次抗体より８０％以下の活性；対応する型の１次抗体の５％〜８０％の活性；または対応する型の１次抗体の約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または５％未満の活性もしくは前記数値未満の活性を示す請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
関連抗体が、陰性対照に比べて、同じまたは類似のレベルの標的抗原に対する活性を示す請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
関連抗体が、１次抗体の結合親和性より小さい結合親和性を示し、それによりそのＦａｂ型の関連抗体の結合親和性が１０−４Ｍ以下；１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ；または正確にもしくは約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍまたはそれ未満である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
標的領域が１次抗体の可変重鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
標的領域が１次抗体の可変軽鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
標的領域が１次抗体の可変重鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われ；さらに
別々に、かつ独立に、標的領域が１次抗体の可変軽鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われる、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
対応する関連可変重鎖を含む関連抗体が、対応する関連可変軽鎖を含む関連抗体とは異なる請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
対応する関連可変重鎖を含む関連抗体が、対応する関連可変軽鎖を含む関連抗体と同じである請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖が、対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも８０％以上の配列同一性；対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と８０％〜９９％の配列同一性；または対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも正確にまたは約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示す請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖が、対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも９５％配列同一性を示す請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
関連抗体が、関連可変重鎖または可変軽鎖を含み、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントに同じ抗体である；および／または少なくとも１つのＶkおよびＪkまたは１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶlおよびＪl生殖系列セグメントが、関連抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶkおよびＪkまたはＶlおよびＪl生殖系列セグメントと同じ抗体である請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
関連抗体が、関連可変重鎖または可変軽鎖を含み、１次抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、関連抗体の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じ遺伝子ファミリー由来の抗体である；および／または少なくとも１つのＶkおよびＪkまたは１次抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶlおよびＪl生殖系列セグメントが、関連抗体の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶkおよびＪkまたはＶlおよびＪl生殖系列セグメントと同じ遺伝子ファミリー由来の抗体である請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖が、対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも６０％以上の配列同一性；対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と６０％〜９９％の配列同一性；または対応する関連抗体の関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも、もしくは約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示す請求項２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
標的領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の中から選択される請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
標的領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３である請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）１次抗体がコンビナトリアル抗体ライブラリーの選別により特定され；
ｂ）コンビナトリアル抗体ライブラリーが：
ｉ）インフレームでのＶＨ、ＤＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントまたはその一部を組み合わせてＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成するステップ、
ｉｉ）インフレームのＶkおよびＪkヒト生殖系列セグメントもしくはその一部、またはＶlおよびＪl生殖系列セグメントもしくはその一部を組み合わせて、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成し、
ステップｉ）およびｉｉ）で、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖk、Ｊk、ＶlまたはＪlの各部分が、抗原結合部位を形成するのに充分なＶＨまたはＶＬもしくはその一部を含む抗体またはその一部を産生するのに充分であるステップ、
ｉｉｉ）ステップｉ）およびｉｉ）を複数回繰り返して、複数の異なる核酸分子の配列を生成するステップ、
ｉｖ）核酸分子を合成して２つのライブラリーを作成し、
第１のライブラリーが、ＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含み；および
第２のライブラリーが、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含むステップ、
ｖ）第１のライブラリー由来および第２のライブラリー由来の核酸分子を細胞中に導入し、これを複数回繰り返して細胞のライブラリーを作成し、各細胞が細胞ライブラリー中の細胞間で相互に異なる組み合わせのＶＨおよびＶＬをコードする核酸分子を含むステップ、および
ｖｉ）細胞を増殖して各細胞中で抗体またはその一部を発現させ、それにより複数の抗体またはその一部を産生し、ライブラリー中の各抗体またはその一部が異なる組み合わせのＶＨおよびＶＬ鎖またはライブラリー中の全ての他の抗体またはその一部から抗原結合部位を形成するのに充分なその一部を含むステップを含む方法により作成され、および
ｃ）ライブラリーの選別を、
ｉ）ライブラリー中の抗体またはその一部を標的タンパク質と接触させ；
ｉｉ）抗体またはその一部の標的タンパク質に対する結合および／または抗体またはその一部が標的タンパク質の機能活性を調節するかどうかを評価し、および
ｉｉｉ）標的タンパク質に対し活性を示す抗体またはその一部を特定する（特定された抗体またはその一部が１次抗体である）ことにより実行する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
関連抗体もまた、コンビナトリアル抗体ライブラリーをステップａ）〜ｃ）に従い選別することにより特定され、それにより、関連抗体が、１次抗体に比べて、標的抗原に対する活性の減少を示す請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ライブラリーがアドレス指定できるライブラリーであり、それにより：
ステップｉｖ）で、合成核酸配列が個別にアドレス指定され、それにより、第１のアドレス指定される核酸ライブラリーおよび第２のアドレス指定される核酸ライブラリーを生成し；
ステップｖ）で、細胞がアドレス指定され、各座位が、アドレス指定される細胞ライブラリー中の全ての他の細胞からのＶＨおよびＶＬの異なる組み合わせをコードする核酸分子を含む細胞を含み；および
ステップｖｉ）で、複数の抗体またはその一部がアドレス指定され：
ライブラリー中の各座位の抗体またはその一部が、同じ抗体であり、また、各および全ての他の座位のものと異なり；および
抗体またはその一部の同一性をそのアドレスにより知ることができる、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
アドレス指定できるライブラリー中の抗体が空間アレイ中に配置され、アレイの各個別座位が異なる抗体メンバーに対応する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
空間アレイがマルチウェルプレートである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アドレス指定できるライブラリー中の抗体が、フィルター、チップ、スライド、ビーズまたはセルロースの中から選択される固体支持体に結合し、異なる抗体メンバーが、その表面に固定された請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
標的抗原が、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸または小分子である請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
標的抗原が、ウイルス、細菌、腫瘍もしくは他の細胞の表面上に発現している、または組換え型タンパク質もしくはペプチドである請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
標的抗原が、治療介入のための標的タンパク質である請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
標的抗原が、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスまたは血管新生に関与する請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
標的抗原が、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、および３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体；ＨＧＦＲとしても知られる）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体）、ＫＩＴ（ｃ−ｋｉｔ受容体）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（繊維芽細胞増殖因子受容体１、２、および４）、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、ＴＥＫ（内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（内皮細胞に存在する受容体型チロシンキナーゼ）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリトロポイエチン産生肝細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ、ＥＰＯ−Ｒ．、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２、ＣＤ４４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦならびにＥＰＯ、の中から選択される請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
標的領域中のサブセットのアミノ酸残基がアミノ酸置換により改変されている請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
標的領域中の１次抗体と関連抗体の間で異なるアミノ酸残基のみが、アミノ酸置換により改変される請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
標的領域中の１次抗体と関連抗体の間の同じアミノ酸残基のみがアミノ酸置換により改変される請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
標的領域中の全てのアミノ酸残基がアミノ酸置換により改変される請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
標的領域中で改変される各アミノ酸残基が、全１９の他のアミノ酸残基、または制限されたそのサブセットに改変される請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
複数の核酸分子が、ＰＣＲ変異誘発、カセット変異導入、部位特異的変異誘発、ランダム点変異誘発、テンプレート含有ウラシルを使った変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを使った変異誘発、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使った変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、および二重鎖切断修復、の中から選択される方法により生成される請求項２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
方複数の核酸分子が、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＮ、ＮＮＹまたはＮＮＲ変異誘発の中から選択される方法により生成される請求項２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
ステップｄ）の前に、
ｇ）１次抗体の系統的変異導入を行うステップで、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数の改変抗体を産生し、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖が、標的領域の単一アミノ酸残基のスキャンアミノ酸残基による置換により改変され、それにより、複数の抗体がそれぞれ、１次抗体に比べ標的領域中にアミノ酸を含む改変抗体であるステップ；
ｈ）標的抗原に対する活性により複数の改変抗体のそれぞれを選別するステップ；および
ｉ）アミノ酸置換不含の１次抗体に比較して、標的抗原に対する活性の保持または増加を示す改変抗体の中から２次抗体を選択し、それにより、ステップｂ）で１次抗体の代わりに２次抗体が使われるステップ、
をさらに含む請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
ステップｇ）で複数の改変抗体が、標的領域を含む改変型の１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することにより産生され、核酸分子が、スキャンアミノ酸をコードしない非改変可変重鎖または可変軽鎖の対応するコドンに比べて、標的領域中のスキャンアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより各複数の核酸分子が、標的領域内の単一アミノ酸残基の同じスキャンアミノ酸残基による置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
対応する型の１次抗体の少なくとも７５％以上の活性；対応する型の１次抗体の少なくとも７５％〜２００％；または、対応する型の１次抗体の少なくとも、もしくは約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％またはそれ以上の活性を示す２次抗体が選択される請求項４３〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
ステップｉ）の後に、２次抗体中で、アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、中性アミノ酸を含むように改変されたアミノ酸残基位置を測定するステップをさらに含む請求項４３〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
スキャンアミノ酸が、アラニン、トレオニン、プロリンおよびグリシンの中から選択される請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
アミノ酸がアラニンである請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
スキャンアミノ酸が非天然アミノ酸である請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
標的領域中のサブセットのアミノ酸残基が、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される請求項４３〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
標的領域内の１次抗体と関連抗体の間で異なるアミノ酸残基のみが、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される請求項４４〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
標的領域内の１次抗体と関連抗体の間で同じアミノ酸残基のみが、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
標的領域内の全てのアミノ酸が、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変される請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
選択された改変抗体が、１次抗体に比べ、２倍、５倍、１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、１００００倍またはそれ超改善された標的抗原に対する活性を示す請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
改変抗体が１次抗体の結合親和性よりも大きく、また、１ｘ１０−９Ｍ以下；１ｘ１０−９Ｍ〜１ｘ１０−１１Ｍ；または正確に、もしくは約１ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、３ｘ１０−９Ｍ、４ｘ１０−９Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、６ｘ１０−９Ｍ、７ｘ１０−９Ｍ、８ｘ１０−９Ｍ、９ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、３ｘ１０−１０Ｍ、４ｘ１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、６ｘ１０−１０Ｍ、７ｘ１０−１０Ｍ、８ｘ１０−１０Ｍ、９ｘ１０−１０Ｍもしくはそれ未満の結合親和性を示す請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
アミノ酸置換不含の１次抗体に比べて、改変抗体で変得られたアミノ酸改変を測定するステップをさらに含む請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
ステップｇ）で特定された改変抗体が選択され、ステップａ）での、次に続く親和性成熟用の１次抗体として使用されて、反復繰り返される請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
標的領域内の選択改変抗体の１つまたは複数の可変重鎖または１つまたは複数の可変軽鎖の１つまたは複数のアミノ酸置換が組み合わされて、さらなる改変抗体を生成し、それにより、さらなる改変抗体が標的抗原に対する活性により選別され、１次抗体および選択改変抗体に比較して、標的抗原に対する活性の増加を示す改変抗体を特定する請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
１次抗体の可変重鎖にステップａ）〜ｆ）を実行し、それぞれ標的領域にアミノ酸置換を含む１次改変抗体を選択し；
ａ）〜ｆ）１次抗体の可変軽鎖に、独立に、かつ別々にステップａ）〜ｆ）を実行し、それぞれ標的領域にアミノ酸置換を含む２次改変抗体を選択し；
１次改変抗体の可変重鎖を２次改変抗体の可変軽鎖と結合して、それぞれ可変重鎖および可変軽鎖の標的領域内のアミノ酸置換を含む複数の異なる３次改変抗体を生成し；および
標的抗原に対する結合により複数の３次改変抗体をそれぞれ選別し；さらに
１次および２次改変抗体に比較して、標的抗原に対する活性の増加を示す３次改変抗体を選択するステップを含む請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
ステップｆ）で１次改変抗体を選択後：
ｊ）さらなる変異誘発のために、１次改変抗体の可変重鎖または可変軽鎖内の別の異なる領域を選択するステップ；
ｋ）１次改変抗体の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生し、核酸分子が、選択領域中に、１次改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、複数の各核酸分子が単一アミノ酸残基の置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードするステップ；
ｌ）それぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数のさらなる改変抗体を産生し、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がステップｋ）で産生されたものであり、それにより、それぞれ複数の抗体の選択領域が、１次改変抗体に比べて、アミノ酸の異なるアミノ酸への置換を含むステップ；
ｍ）標的抗原に対する結合により、それぞれ複数のさらなる改変抗体を選別するステップ；および
ｎ）１次改変抗体に比べて、標的抗原に対する活性の増加を示すさらなる改変抗体を選択するステップ、
をさらに含む請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
異なる領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の中から選択される請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片、の中から選択される請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
標的抗原に対して抗体またはその一部の親和性成熟を行う方法であって：
ａ）改変型の１次抗体の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することを含む１次抗体の系統的変異導入を行うステップであって、核酸分子が他のアミノ酸をコードしない非改変可変重鎖または可変軽鎖に対応するコドンに比べて、別のアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、コード化可変重鎖または軽鎖の完全長全体にわたる全ての位置が置換されるように、またはコード化可変重鎖または可変軽鎖の選択領域中の全ての位置が置換されるように、複数の各核酸分子が単一アミノ酸残基を別のアミノ酸への置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードし、また、それにより、各置換が同じアミノ酸残基への置換であるステップ；
ｂ）それぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数の改変抗体を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がステップａ）で産生されたものであり、それにより、それぞれ複数の抗体が、１次抗体に比べて、アミノ酸位置の別のアミノ酸による置換を含むステップ；
ｃ）それぞれ複数の改変抗体を標的抗原に対する活性により選別するステップ；
ｄ）アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、標的抗原に対して活性の保持または増加を示す改変抗体の中から２次抗体を選択するステップ；
ｅ）２次抗体のさらなる変異誘発を行うステップであって、２次抗体の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することを含み、核酸分子が、スキャンアミノ酸位置に、２次抗体中のスキャンアミノ酸とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、各複数の核酸分子が、スキャンアミノ酸位置で単一のアミノ酸残基により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードするステップ；および
ｆ）それぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数のさらなる改変抗体を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がステップｅ）で産生されたものであり、それにより、２次抗体に比べて、スキャンアミノ酸位置が異なるアミノ酸への置換を含むステップ；
ｇ）それぞれ複数のさらなる改変抗体を標的抗原に対する活性により選別するステップ；および
ｈ）１次抗体に比べ、または２次抗体に比べ、標的抗原に対し活性増加を示す３次抗体を選択するステップ、
を含む方法。
【請求項６４】
ステップａ）で、コード化可変重鎖または可変軽鎖の領域中の全ての位置が置換される請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
選択領域が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の中から選択される可変重鎖または可変軽鎖中の相補性決定領域である請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
対応する型の１次抗体の少なくとも７５％以上の活性；対応する型の１次抗体の７５％〜２００％の活性；または対応する型の１次抗体の少なくとも、もしくは約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％もしくはそれ超の活性である２次抗体が選択される請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
ステップｄ）の後ろに、アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、２次抗体でスキャンアミノ酸を含むように改変されるアミノ酸残基位置を測定するステップをさらに含む請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
他のアミノ酸が、アラニン、トレオニン、プロリンおよびグリシンの中から選択される請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
アミノ酸がアラニンである請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
他のアミノ酸が非天然アミノ酸である請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
それぞれ、複数の核酸分子が、単一アミノ酸残基の同じスキャンアミノ酸への置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードする請求項６３〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
ステップｅ）で、スキャンアミノ酸位置が、全ての他のアミノ酸残基、または制限されたそのサブセットへのアミノ酸置換によって改変される請求項６３〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
改変が、１次抗体のその位置のスキャンアミノ酸への、または元のアミノ酸へのアミノ酸置換を含まない請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ステップｅ）で産生される複数の核酸分子が、ＰＣＲ変異誘発、カセット変異導入、部位特異的変異誘発、ランダム点変異誘発、テンプレート含有ウラシルを使った変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを使った変異誘発、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使った変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、ならびに二重鎖切断修復、の中から選択される方法により生成される請求項６３〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
ステップｅ）で産生される複数の核酸分子が、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＮ、ＮＮＹまたはＮＮＲ変異誘発、の中から選択される方法により生成される請求項６３〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
活性が、結合、シグナル伝達、分化、遺伝子発現の変化、細胞増殖、アポトーシス、走化性、細胞障害性、癌細胞浸潤、内皮細胞増殖および管形成、の中から選択される請求項６３〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
活性が結合であり、イムノアッセイ、全細胞パニングおよび表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）の中から選択される方法により結合が評価される請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および電気化学発光測定法の中から選択される請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
電気化学発光測定法がメソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）である請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
標的抗原が、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸または小分子である請求項６３〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
標的抗原が、ウイルス、細菌、腫瘍または他の細胞の表面上に発現している、または組換え型タンパク質もしくはペプチドである請求項６３〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
標的抗原が、治療介入用の標的タンパク質である請求項６３〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
標的抗原が、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスまたは血管新生に関与する請求項６３〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
標的抗原が、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、および３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体；ＨＧＦＲとしても知られる）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体）、ＫＩＴ（ｃ−ｋｉｔ受容体）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（繊維芽細胞増殖因子受容体１、２、および４）、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ ｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、ＴＥＫ（内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（内皮細胞に存在する受容体型チロシンキナーゼ）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリトロポイエチン産生肝細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ、ＥＰＯ−Ｒ．、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２、ＣＤ４４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦならびにＥＰＯ、の中から選択される請求項６３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
抗体がＦａｂ型の場合、１次抗体が、１０−４Ｍ未満；１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ；または正確にもしくは約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、またはそれ未満の結合親和性で標的抗原に結合する請求項６３〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
系統的変異導入を１次抗体の可変重鎖内で行い、そこからステップａ）〜ｈ）を行う請求項６３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
系統的変異導入を１次抗体の可変軽鎖内で行い、そこからステップａ）〜ｈ）を行う請求項６３〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
系統的変異導入を１次抗体の可変重鎖内で行い、そこからステップａ）〜ｈ）を行い；および
別々に、かつ独立に、系統的変異導入を１次抗体の可変軽鎖内で行い、そこからステップａ）〜ｈ）を行う、
請求項６３〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
３次抗体が、１次抗体または２次抗体に比べて、標的抗原に対し少なくとも２倍改善された活性；１次抗体または２次抗体に比べて、標的抗原に対し２倍〜１００００倍または２倍〜１０００倍改善された活性；または１次抗体または２次抗体に比べて、標的抗原に対し少なくとも２倍、５倍、１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、１００００倍またはそれ超の改善された活性を示す請求項６３〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
３次抗体が、１次抗体の結合親和性よりも大きな結合親和性、および１ｘ１０−９Ｍ未満；１ｘ１０−９Ｍ〜１ｘ１０−１１Ｍ；または正確に、もしくは約１ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、３ｘ１０−９Ｍ、４ｘ１０−９Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、６ｘ１０−９Ｍ、７ｘ１０−９Ｍ、８ｘ１０−９Ｍ、９ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、３ｘ１０−１０Ｍ、４ｘ１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、６ｘ１０−１０Ｍ、７ｘ１０−１０Ｍ、８ｘ１０−１０Ｍ、９ｘ１０−１０Ｍもしくはそれ未満の結合親和性を示す請求項６３〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、３次抗体で変えられたアミノ酸改変を測定するステップをさらに含む請求項６３〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
ステップｈ）で特定された３次抗体が、ステップａ）で、それのさらなる成熟のために１次抗体として選択および使用され、それにより、改変されるアミノ酸残基がその後のこの方法の繰り返しによりこれ以上改変されない、反復繰り返される請求項６３〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
選択３次抗体の１つまたは複数の可変重鎖または１つまたは複数の可変軽鎖内の１つまたは複数のアミノ酸置換が組み合わされて、さらなる改変抗体を生成し、それにより、さらなる改変抗体が標的抗原に対する活性により選別され、１次抗体、２次抗体および選択３次抗体に比べて、標的抗原に対して活性増加を示すさらなる改変抗体を特定する請求項６３〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
１次抗体の可変重鎖にステップａ）〜ｈ）を行い、対応する１次抗体の可変重鎖に比べて、それぞれ、可変重鎖内にアミノ酸置換を含む３次抗体を選択するステップ；
独立に、かつ、別々に、１次抗体の可変軽鎖にステップａ）〜ｈ）を行い、対応する１次抗体の可変軽鎖に比べて、それぞれ、可変軽鎖内にアミノ酸置換を含む別の３次抗体を選択するステップ；
３次抗体の可変重鎖を別の３次抗体の可変軽鎖と組み合わせて、対応する１次抗体の可変重鎖および可変軽鎖に比べて、それぞれ、可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸置換を含む複数の異なるさらなる改変抗体を生成するステップ；
複数のさらなる改変抗体を標的抗原に対する結合により選別するステップ；および
１次抗体、２次抗体、および３次抗体に比べて、標的抗原に対する活性の増加を示す４次抗体を選択するステップ、
を含む請求項６３〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
ステップｈ）の３次抗体選択ステップの後ろに、
ｉ）さらなる変異誘発のために、３次抗体の可変重鎖または可変軽鎖内の別の異なる領域を選択するステップ；
ｊ）３次抗体の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生するステップであって、核酸分子が、選択領域中に、１次改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、それぞれ複数の核酸分子が、選択領域で単一のアミノ酸残基の置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードしているステップ；
ｋ）それぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数のさらなる改変抗体を産生するステップであって、可変重鎖または可変軽鎖の少なくとも１つがステップｊ）で産生されたものであり、それにより、選択領域が、３次抗体に比べ、それぞれ複数の抗体がアミノ酸の異なるアミノ酸への置換を含むステップ；
ｌ）複数のさらなる改変抗体を標的抗原に対する結合により選別するステップ；および
ｍ）３次抗体に比べて、標的抗原に対する活性の増加を示すさらなる改変抗体を選択するステップ、
をさらに含む請求項６３〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
異なる領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の中から選択される請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片、の中から選択される請求項６３〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５１０１６４（Ｐ２０１３−５１０１６４Ａ）
【公表日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３７９９４（Ｐ２０１２−５３７９９４）
【出願日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５４８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５６９９７
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（５１１１１０７０６）ファブラス エルエルシー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５４８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５６９９７
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（５１１１１０７０６）ファブラス エルエルシー (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]