親水性担体及びシリコーンマトリックスを含む局所用製剤
壊死組織を除去するための活性物質を放出する局所用製剤、並びに前記局所用製剤の作製方法及び使用方法が提供される。前記製剤は、外相内に分散した内相を有することができる。内相は親水性担体及び活性物質であり得る。外相はシリコーンマトリックスであり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、局所皮膚治療用製剤に関するものであり、より詳細には、活性物質の徐放性を提供する、シリコーンマトリックス及び親水性担体を含む製剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シリコーンはアルキルシロキサン又はオルガノシロキサンの化学に基づく化合物であり、医薬用途において賦形剤や加工補助剤として用いられるポリジメチルシロキサンが含まれる。こうした材料のいくつかは薬局方化合物の地位を得ている。制御された薬物送達システム、特に、特定の特性の結合が、製品デザインの要求、即ち生体適合性及び汎用性を満たすのに重要な場合の適用におけるそのようなシリコーン化合物の使用は当該技術分野に公知である。インプラント、挿入物、粘膜接着、経皮、及び局所形態を含めた新規持続薬物送達用途は、シリコーンのユニークで固有の特性を利用する。これら送達システムは、標的領域に対して生物学的に適切な動態を有する活性分子の制御放出を可能にし、従来の経口及び非経口投薬法において一般に観察されるピーク投与量、コンプライアンスの低さ、及び薬物分解のような悪影響を妨げる。
【０００３】
経皮薬物送達システムは、無傷の皮膚に最高７日間接着する薬物含有接着性パッチから成る。パッチのデザインは活性物質の放出を制御し、そして全身活性のために循環システムによって生体の至るところに運ばれる。投入点として皮膚を用いることにより、絆創膏又はフィルム形態と実質的材料（例えばクリーム又はゲル）とから成る局所形態が局部治療（筋肉又は皮膚の疾患）に用いられる。しかしながら、シリコーンマトリックスに分散した生化学物質が皮膚又は創傷に放出されて治癒を促進するこれら経皮薬物送達システムは、創傷包帯剤及び軟膏のような局所包帯剤用途には導入されていない。
【０００４】
したがって、関連技術において、シリコーンの有益な特性を利用して活性物質の徐放性を提供できる製剤に関する必要性が残されている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、シリコーンマトリックス、親水性担体、及び製剤から放出される少なくとも１つの活性物質を含む局所用製剤を提供することによってその必要性を満たすものである。活性物質は、タンパク質、特にヒドロラーゼ及びグルコースオキシダーゼのような酵素であり得る。シリコーンマトリックスは、高分子量ポリジメチルシロキサン、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー、ゲルのような架橋したシリコーンエラストマー（充填剤のないエラストマー）、シリカ強化ゴム又は発泡体、を含むことができ、架橋は、付加及び縮合硬化システム、シリコーン系粘着剤、及びシリコーンポリアミドのようなシリコーン−有機コポリマーを用いて達成される。製剤は、包帯剤、軟膏などを形成するために用いてもよい。
【０００６】
本発明の１つの側面によれば、製剤は、障害組織を含めた皮膚に適用可能な薄いフィルム包帯剤を含むことができる。本発明の他の側面によれば、製剤は、パッチ包帯剤を含む。本発明の更に他の側面によれば、製剤は塗布剤付き包帯の包帯剤を含む。本発明の他の側面によれば、製剤は軟膏を含む。薄いフィルム、パッチ、塗布剤付き包帯、及び軟膏は全て、外科的切開、創傷、又は他の皮膚病変、擦り傷、ひっかき傷、かすり傷、又は他の障害組織の全体を覆うように皮膚に適用することができる。製剤は、液体に対して密閉されることができ、皮膚表面からの感染を引き起こす微生物をブロックする上で有効である。１つの態様では、酵素による創面清掃、血栓形成及び血栓除去、並びにｉｎ ｓｉｔｕペルオキシド及び／又は過酸産生のために、創傷部位でプロテアーゼのような活性物質を製剤から放出させてさまざまな段階で創傷治癒を促進させることができる。
【０００７】
好ましい態様では、局所用製剤は、シリコーンマトリックスの至るところに分散した活性物質を含有する親水性担体の混合物を含む。混合物はシリコーンマトリックスとともに本発明のこの態様の局所用製剤を形成する。親水性担体は例えばプロピレングリコール溶液であり、例えばポリビニルアルコール（「ＰＶＡ」）又はポリビニルピロリドン（「ＰＶＰ」）のような水溶性又は親水性成分と混合することができる。親水性担体と活性物質との混合物は、エマルジョン又は分散液の内相を形成することができ、この内相はシリコーンマトリックス（外相）内に配置されている。したがって、シリコーン系界面活性剤を添加して、内相を非常に小さな液滴に分散又は乳化し、活性物質の放出を促進させることができる。
【０００８】
したがって、本発明の更なる目的は、活性物質の皮膚への制御放出を提供する上で有効な局所用製剤を提供することである。本発明のこの特徴及び他の特徴並びに利点は、以下の発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【０００９】
以下の本発明の好ましい態様の詳細な説明は、添付の図面とともに読むことによって、最も良く理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の１つの側面によれば、シリコーンマトリックスを導入している局所用製剤が提供される。製剤は、シリコーンマトリックスからの活性物質の制御された徐放性放出を有効に提供する。活性物質を親水性担体と混合して、シリコーンマトリックス内に分散した混合物を形成する。活性物質はシリコーンマトリックス内で安定であり、マトリックスから制御可能に及び自由に放出される。
【００１１】
本発明の態様を定義し、記載するために、以下の用語は以後に提示される定義と一致するものとして理解されるであろう。
【００１２】
活性物質はタンパク質、特に酵素を意味するものとして理解されるべきである。
【００１３】
界面活性剤は、非混和液又は液体と、しばしばコロイドサイズの非常に細かい固体粒子との均一で最大の分離を促進するために懸濁媒体に添加される表面活性物質を意味するものとして理解されるべきである。界面活性剤は、湿潤、液体分散媒体での非混和液、液滴、又は細かい固体粒子の効率的な分配、及び粒子の凝集に対する安定化を促進する。界面活性剤は一般に、粒子表面の完全な表面被覆を提供するのに十分な量で分散媒体に添加される。
【００１４】
包帯剤は、分泌物を吸収し、外傷から組織を保護し、医薬を組織へ投与し、環境から組織を保護し、出血を止め、湿潤環境を維持又は提供するため、そしてこれらの組み合わせのために、皮膚、創傷組織、又は病変組織に直接適用するのに好適なさまざまなタイプの被覆剤を意味するものとして理解されるべきである。例えば、包帯剤はフィルム、パッチ、包帯、ゲルなどの形態でよい。
【００１５】
エマルジョンは、１つの液相の、第２液相内への一時的又は永続的分散を意味するものとして理解されるべきである。通常、液体の一方は水又は水溶液であり、他方はオイル又は他の水と非混和性の液体である。通常、第２液は連続相又は外相を意味する。エマルジョンは、分散した液体又は内相が単純な均一液である単純なエマルジョンか、分散した液相が２重エマルジョン若しくは多重エマルジョンのように液相又は固相の不均一な組み合わせである、より複雑なエマルジョンに更に分類することができる。
【００１６】
親水性担体は、活性物質の溶媒として作用する、本発明の製剤の相の少なくとも１つの成分を意味するものとして理解されるべきである。親水性担体は、本発明の態様に用いられるシリコーンマトリックスからの活性物質の放出を補助する。
【００１７】
親水性成分は、本発明の態様において親水性担体と活性物質との混合物に添加される少なくとも１つの成分を意味するものとして理解されるべきである。親水性成分は、本発明の態様に用いるシリコーンマトリックスからの活性物質の放出を補助することもできる。
【００１８】
タンパク質は、天然、合成、及び遺伝子工学的な、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、ヒドロラーゼのような酵素；抗体；ポリペプチド；ペプチド；ホルモン；サイトカイン；成長因子；及び他の生体モジュレーターを意味するものとして理解されるべきである。
【００１９】
軟膏は、皮膚、創傷組織、及び病変組織のような外部に適用するのに好適な半固体製剤を意味するものとして理解されるべきである。
【００２０】
本発明によれば、製剤は、皮膚、創傷組織、及び病変組織に適用され得るさまざまな局所包帯剤に用いることができる。局所包帯剤は、活性物質が放出され、下にある皮膚、創傷組織、及び病変組織に適用されることを可能にする。更に、製剤は軟膏を形成するために用いてもよく、軟膏は、活性物質を放出し、下にある皮膚、創傷組織、又は病変組織に適用されることを可能にする。
【００２１】
好ましい態様によれば、外相又は連続相内に内相又は非混和性分散相を含む製剤が提供される。外相は一般にシリコーンマトリックスを含み、内相は一般に少なくとも１つの活性物質を含有する親水性担体を含む。更に、内相は好適な親水性成分を更に含んでいてもよい。内相及び外相は、本発明の製剤を形成するために好適な方法で混合することができる。例えば、本発明の製剤を形成する際に、高剪断ミキサーを用いて内相と外相を混合することができる。更に、内相と外相を手で混合してもよい。内相の液滴サイズはさまざまでよい。例えば、液滴サイズは約０．１μｍ〜約２０００μｍ、約０．１μｍ〜約１０００μｍ、約０．１μｍ〜約５００μｍ、約０．１μｍ〜約２００μｍ、又は約０．１μｍ〜約１００μｍでよい。
【００２２】
内相は、少なくとも１つの活性物質を含有する好適な親水性担体を含むことができる。本発明の態様では、親水性担体は関連温度で液体であり、好適な溶媒に溶解した固体材料（例えばソルビトール、マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム及びクエン酸）を用いてもよい。例えば、プロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、グリセリン、アルコール、多価アルコール、水、又は他の好適な親水性担体の溶液中に活性物質を含有してもよい。
【００２３】
内相は水溶性及び親水性成分を更に含むことができる。親水性成分は一般に活性物質の溶媒として作用しない。親水性成分は、シリコーンマトリックスからの活性物質の放出速度を高めることができ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ又はＰＶＯＨ）（例えばＣｌａｒｉａｎｔ社、シャーロット、ノースカロライナ州から入手可能なＭｏｗｉｏｌ（登録商標）３−８３のなど）又は例えばＢＡＳＦ社、マウントオリーブ、ニュージャージ州から入手可能なＬｕｖｉｓｋｏｌ（登録商標）Ｋ−３０のようなポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含むことができる。内相溶液は、約３５重量％以下のＰＶＡ水溶液又は約５０重量％以下のＰＶＰ水溶液を含むことができる。本発明の態様では、親水性成分は、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、ポリアクリル酸、アルギン酸誘導体、キトサン誘導体、ゼラチン、ペクチン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、並びに他の好適な親水性の分子及び高分子のような、水で希釈された水性増粘剤であることもできる。ここで、活性物質は水溶性でも非水溶性でもよい。このような分子には、親水性高分子が含まれる。
【００２４】
特定の理論に拘束されることを望まないが、親水性成分が、シリコーンマトリックス内に、活性物質の放出を容易にする孔、割れ目、亀裂、裂溝をつくることも意図される。内相をつくる際に、親水性担体に添加するＰＶＡ又はＰＶＰの量を増加させると、放出する活性物質の割合を増加させることができる。更に、内相の親水性担体量が増加すると、放出する活性物質の割合を増加させることができる。
【００２５】
更に、賦形剤を用いて活性物質を安定化又は生体適合性にすることができ、シリコーンマトリックスからの放出を補助することができる。本発明に用いるためのシリコーン賦形剤は、シリコーンポリエーテル、シリコーンフルイド、ジメチコーン、ジメチコーンコポリオール、ジメチコノール、シリコーンアルキルワックス、シリコーンポリアミドなどを含むことができる。他の可能な賦形剤には、限定されるものではないが、（ポリ）サッカリド誘導体、アクリル酸誘導体、ＰＶＡ誘導体、グリコール、グリセロール、グリセリド誘導体、プロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、グリセリン、アルコール、セルロース誘導体、ポリアクリル酸、アルギン酸誘導体、キトサン誘導体、ゼラチン、ペクチン及び多価アルコールのような親水性有機物が含まれる。
【００２６】
本発明のシリコーンマトリックスは、ＥＰ９６６９７２Ａ１、ＷＯ０１／１９１９０Ａ１、及びＷＯ２００１／２２９２３に記載のような高分子量ポリジメチルシロキサン（ガム系材料に対し１２，５００ｃＳｔ）で構成されていてもよい。
【００２７】
シリコーンマトリックスは、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー、例えばダウ・コーニング（登録商標）９０４０ シリコーンエラストマーブレンド（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）で構成されていてもよい。ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマーは、揮発性シリコーン溶媒（Ｄ５）に処理されたゆるく架橋したポリジメチルシロキサンについて記載する以下の米国特許に記載されている：米国特許第６，２００，５８１号、第６，２３８，６５７号、第６，１７７，０７１号、第６，１６８，７８２号、及び第６，２０７，７１７号。揮発性シリコーン溶媒が蒸発するにつれて、軽く又はゆるく架橋したシリコーンエラストマーは、ペースト状の堅さからエラストマー系シリコーンゲルへと厚くなる。
【００２８】
シリコーンマトリックスは、米国特許第５，１４５，９３７号及び第４，９９１，５７４号、並びにＥＰ０９５５３４７号に記載のような充填剤のないエラストマーで構成されていてもよい。これらの特許は、例えばダウ・コーニング（登録商標）７−９８００ ＳＳＡキット（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）のようなシリコーンゲルの使用について教示する。
【００２９】
あるいは、シリコーンマトリックスは、ＥＰ０４２５１６４号、ＥＰ０５０６２４１号、及び米国特許第５，０１０，１１５号に記載のような（充填剤のない又はシリカで強化された）細胞性エラストマーで構成されていてもよい。これらの特許は、例えばダウ・コーニング（登録商標）７−０１９２ フォーム パートＡ及びパートＢ（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）のようなシリコーンフォームの使用について教示する。更に、シリコーンマトリックスは、付加硬化物（ゲルに類似するがシリカで強化されている）又は縮合硬化物、例えばダウ・コーニング（登録商標）７−５３００ ＦＩＬＭ−ＩＮ−ＰＬＡＣＥ ＣＯＡＴＩＮＧ又はダウ・コーニング（登録商標）７−ＦＣ４２１０ フィルム形成基剤及び硬化剤（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）のようなシリコーンゴムで構成されることができる。
【００３０】
最後に、シリコーンマトリックスは、米国特許第２，７３６，７２１号、第２，８１４，６０１号、第２，８５７，３５６号、第３，５２８，９４０号、及び第６，３３７，０８６号に記載のような、溶媒ベースでも熱溶解性でもよい、シリコーンポリマー中のシリケート樹脂のようなシリコーン系粘着剤（シリコーンＰＳＡ）で構成されていてもよい。これらの特許は、例えばダウ・コーニング（登録商標）ＰＳＡ ７−４４０２（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）のようなシリコーンＰＳＡの使用について教示する。
【００３１】
本発明のシリコーンマトリックスは、親水性担体や活性物質の小さな液滴への分散又は乳化を容易にし、こうしたより小さな液滴がより大きな液滴へと融合するのを妨げる、シリコーン系界面活性剤、例えばダウ・コーニング（登録商標）９０１１ シリコーンエラストマーブレンド（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）を更に含んでいてもよい。例えば、シリコーン系界面活性剤を用いる場合、内相の液滴は約０．１〜５００μｍであり得る。シリコーン系界面活性剤は、本発明の局所包帯剤を形成する際に、好適なエマルジョンを作製するために用いてもよい。更に、本発明の外相は、シリコーンマトリックスを送達するための希釈剤、例えば揮発性シリコーン（即ちＤ５（ダウ・コーニング（登録商標）２４５フルイド）、ＭＤＭ（ダウ・コーニング（登録商標）２００フルイド １ｃＳｔ））、又は有機溶媒（即ちヘプタン又は酢酸エチル）を含んでもよい。
【００３２】
本発明の活性物質は、一般に、親水性担体に導入される酵素などのタンパク質である。活性物質は親水性であり得る。包帯剤への導入に好適な酵素は如何なる酵素でもよい。酵素には、限定されるものではないが、市販のもの、改良型、組換え体、野生型、天然には見られない変異体、及びそれらの混合物が含まれる。例えば、好適な酵素には、ヒドロラーゼ、クチナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、レダクターゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、ペクチナーゼ、ラクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、及びそれらの組み合わせが含まれる。ヒドロラーゼには、限定されるものではないが、プロテアーゼ（細菌性、真菌性、酸性、中性、又はアルカリ性）、アミラーゼ（α又はβ）、リパーゼ、マンナナーゼ、セルラーゼ、コラーゲナーゼ、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００３３】
本発明の製剤に含めるのに好適であると考えられるリパーゼには、英国特許第１，３７２，０３４号に開示されるシュードモナス・スタッツェリ ＡＴＣＣ１９．１５４；米国特許第５，３８９，５３６号に記載されるシュードモナス・メンドシナ、及び米国特許第５，１５３，１３５号に開示されるシュードモナス・シュードアルカリゲネスのようなシュードモナス属の微生物により産生されるものが含まれる。リパーゼには、微生物シュードモナス・フルオレッセンス ＩＡＭ１０５７によって産生されるリパーゼの抗体と陽性の免疫学的交差反応を示すものが更に含まれる。このリパ−ゼは、天野エンザイム株式会社、名古屋、日本から、リパ−ゼＰ「アマノ」の商品名で入手可能である。リパ−ゼには、Ｍ１リパ−ゼ（登録商標）及びＬｉｐｏｍａｘ（登録商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ ＮＶ、デルフト、オランダ）、並びにリポラ−ゼ（登録商標）（ノボザイムズＡ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマーク）が含まれる。リパ−ゼは、通常、シリコーンマトリックス重量に対し、約０．０００１％〜約２％の活性酵素、又は約０．００１ｍｇ／ｇ〜約２０ｍｇ／ｇのレベルでシリコーンマトリックスに導入される。
【００３４】
プロテアーゼは、通常タンパク質又はペプチドのペプチド結合を切断するように作用するカルボニルヒドラーゼである。本明細書において、「プロテアーゼ」とは、天然プロテアーゼ又は組換えプロテアーゼを意味する。天然プロテアーゼには、α−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシルプロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼが含まれる。セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、及び酸プロテアーゼ、並びにエンドプロテアーゼ及びエクソプロテアーゼが含まれる。
【００３５】
プロテアーゼは、動物、植物、又は微生物由来であることができる。例えば、プロテアーゼは、細菌由来のセリンタンパク質分解酵素でよい。精製酵素を用いてもよいし、非精製酵素を用いてもよい。化学的に産生されたプロテアーゼ又は遺伝学的に修飾された変異体は、密接な構造的酵素変異体であるため、定義に含まれる。プロテアーゼの例として特に好ましいのは、バシラス属、例えばバシラス・サチリス、バシラス・レンタス、バシラス・アミロリケファシエンス、及び／又はバシラス・リシェニフォルミスから得た細菌性セリンタンパク質分解酵素、特にサブチラーゼ（ｓｕｂｔｉｌａｓｅ）である。本発明の組成物に含まれると考えられる好適な市販のタンパク質分解酵素には、アルカラーゼ（登録商標）、エスペラーゼ（登録商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（登録商標）、エバラーゼ（登録商標）、カンナーゼ（登録商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）、サビナーゼ（登録商標）、Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、及びＭａｘａｐｅｍ（登録商標）１５（タンパク質操作されたＭａｘａｃａｌ）；ピュラフェクト（登録商標）、プロペラーゼ（登録商標）（タンパク質操作されたピュラフェクト）、並びにサブチリシンＢＰＮ及びＢＰＮ’が含まれる。
【００３６】
プロテアーゼは、天然にみられないアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体も包含し、このアミノ酸配列は、天然にみられない異なるアミノ酸配列に置換することによって前駆体プロテアーゼから生じ、米国特許第ＲＥ３４，６０６号；第５，７００，６７６号；第５，９７２，６８２号及び／又は第６，４８２，６２８号に記載のように、バシラス・アミロリケファシエンスのサブチリシンの番号付けによるところの＋７６、＋８７、＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５、及び／又は＋２７４から成る群より選択される位置と同等のプロテアーゼ内の位置でアミノ酸残基を異なるアミノ酸に置換することによって前駆体プロテアーゼから生じる。
【００３７】
例示的プロテアーゼ変異体には、米国特許第ＲＥ３４，６０６号に記載のようなバシラス・レンタス由来のサブチリシン変異体が含まれる。以後、これをプロテアーゼＡという。他の好適なプロテアーゼは、米国特許第５，７００，６７６号に記載のような、バシラス・アミロリケファシエンス由来のＹ２１７Ｌ変異体である。以後、これをプロテアーゼＢという。米国特許第６，４８２，６２８号に記載の修飾された細菌性セリンタンパク質分解酵素である、本明細書においてプロテアーゼＣというもの；及び米国特許第５，９７２，６８２号に記載の修飾された細菌性セリンタンパク質分解酵素であるプロテアーゼＤも好適である。米国特許第５，６７７，１６３号に記載のような枯草菌ＬＧ１２も好適である。
【００３８】
本発明の実施に有用な他のプロテアーゼは、サビナーゼ（登録商標）、エスペラーゼ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、ピュラフェクト（登録商標）、ＢＰＮ’、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテアーゼＣ、プロテアーゼＤ、及びそれらの混合物から成る群より選択することができる。プロテアーゼは、一般に、シリコーンマトリックスの約０．０１〜約０．５重量％、又は約０．１〜約１０．０ｍｇ／ｇ、好ましくは約０．１〜約５．０ｍｇ／ｇのレベルで本発明の製剤中に存在する。
【００３９】
本発明は上記の酵素に限定されないことを当業者は理解するであろう。１種以上の活性物質を本発明の局所用製剤に使用できることを当業者は更に理解するであろう。
【００４０】
活性物質は種々の機能を行うことができる。例えば、マトリックスは、局所的に壊死組織を除去し、一般的な創傷清拭をするためのプロテアーゼ及び他の酵素学的創傷清掃剤、血栓形成酵素及び血栓除去酵素、自己殺菌、抗感染、及び治癒促進のためにペルオキシド、過酸、活性酸素種、及び抗接着触媒アンタゴニストを産生する薬剤、並びに皮膚治療のための薬剤などを放出することができる。
【００４１】
本発明の製剤は、好適な量の成分を有することができる。例えば、外相は局所用製剤の約５０．０００％〜約９９．９９９％含めることができる。内相は約０．００１％〜約２．０００％の活性物質及び約０．００１％〜約４９．９９９％の親水性担体を含むことができる。界面活性剤を製剤に添加する場合、界面活性剤は約０．００１％〜約６０．０００％、より一般的には約０．１００％〜約５０．０００％含めることができる。親水性成分を添加する場合、親水性成分は製剤の約０．００１％〜約５０．０００％含めることができ、より一般的には親水性成分は局所用製剤の約５．０００％〜約４０．０００％含めることができる。他の態様では、親水性成分は製剤の約１０．０００％〜約３５．０００％含めることができる。更に他の態様では、親水性成分は製剤の約１５．０００％〜約３５．０００％含めることができる。
【００４２】
本発明の製剤は、活性物質を親水性成分溶液とともに含有するプロピレングリコール溶液のような親水性担体溶液を、回転ミキサーで約１５分間、約３０ｒｐｍで混合して内相を調製することにより作製することができる。シリコーンマトリックスやシリコーン系界面活性剤のような外相の成分は、予め混合して均一な混合物を得る。
【００４３】
内相と外相を個々に調整後、乳化又は分散の機械的操作を行うことができる。好ましくは、内相を外相に添加して、高剪断実験室用ミキサー、即ち角孔高剪断スクリーンを有するＳｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｌ４Ｒ（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社、Ｅａｓｔ Ｌｏｎｇｍｅａｄｏｗ、マサチューセッツ州から入手可能）で激しく撹拌する。こうした高剪断混合により、サイズ分布の非常に狭い直径約０．１〜５０μｍ、約０．１〜１０μｍ、及び約０．１〜５μｍの液滴を生ずる。混合物の撹拌は約５４００ｒｐｍで約９０秒間行うことができる。その後、得られた混合物を硬化させるため好適な容器に移してもよい。容器は、所望のバッチを提供するサイズ及び／又は形状のものであることができる。
【００４４】
あるいは、手で混合して包帯剤を調製することができる。本発明の他の態様によれば、内相と外相を上記のように調製し、内相を外相に添加する。次に、小さなへらで円運動を行うことによって混合物を容器内で約３０秒間激しく撹拌し、包帯剤を形成する。内相と外相を手で混合することにより、直径約１０〜約１０００μｍの内相液滴を生じ得る。
【００４５】
本発明の製剤は、皮膚に適用する前にフィルムに成型してもよいし、製剤がそこで重合する皮膚に直接適用してもよい。皮膚に適用する場合は「塗布剤付き」フィルムを重合し、本発明にしたがい、チューブ、小袋、ロールオン、スプレー、パッチ、包帯などからクリーム又は軟膏として送達してもよい。付加硬化物（ゲルに類似するが、シリカで強化されている）又は縮合硬化物、例えばダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から入手可能なダウ・コーニング（登録商標）７−５３００ ＦＩＬＭ−ＩＮ−ＰＬＡＣＥ ＣＯＡＴＩＮＧなどのシリコーンゴムを外相へ導入することによりフィルムを作製することができる。内相と混合することにより、得られるエマルジョンは硬化可能になり、皮膚に適用したとき重合し、プロテアーゼなどの活性物質を有効に放出する「塗布剤付き」フィルム、パッチ、又は包帯を提供する。エマルジョンを基材上に塗布して所望の厚さを達成することができる。本発明の包帯剤は好適な方法で調整することができ、調整方法は本明細書に記載のものに限定されないことが当業者に理解されるであろう。
【００４６】
本発明の軟膏は、ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から入手可能な、ダウ・コーニング（登録商標）９０４１ シリコーンエラストマーブレンドなどのシリコーンエラストマーと、ダウ・コーニング（登録商標）５２００ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ ＡＩＤなどのシリコーン系界面活性剤とをいっしょに撹拌して外相を形成し、作製することができる。内相は、活性物質溶液とＰＶＡのような親水性担体とをいっしょに混合することにより調製することができる。内相は、一定の撹拌で内相を外相にゆっくり添加することによって外相に導入することができる。
【００４７】
本発明の製剤は、所定の適用のために、活性物質放出速度を最適化するように調製できることが当業者に理解されるであろう。例えば、シリコーンマトリックスは活性物質放出速度を増加又は減少させるように選択することができる。ＰＶＡやＰＶＰのような親水性成分をシリコーンマトリックスに添加することによって活性物質放出速度を増すことができる。同様に、親水性担体の添加量を増加させることにより、活性物質放出速度を増すことができる。例えば、約５０重量％以下の親水性担体を用いて製剤を形成することができる。あるいは、活性物質放出速度を増加させるようにシリコーンマトリックスを選択することができる。例えば、架橋密度の小さいシリコーンマトリックスは、架橋密度の大きいシリコーンマトリックスよりも活性物質放出速度が速いであろう。
【００４８】
活性物質放出速度に影響を与えるために、包帯剤パッチの厚さを変化させてもよい。活性物質放出速度を増加させるには、パッチの厚さを下方に調製することができる。更に、空気に対してより密閉されるように包帯剤を調製することができる。包帯剤の密閉性が増加するにつれて、活性物質放出速度を増加させることができる。
【００４９】
同様に、創傷ベッドのパラメータは、活性物質放出速度を増加させたり減少させたりすることができる。例えば、創傷ベッドの水分量が増加するにつれて、活性物質放出速度も増加させることができる。あるいは、創傷ベッドの温度が上昇するにつれて、活性物質放出速度を増加させることができる。したがって、製剤のさまざまなパラメータは、創傷ベッドと包帯剤又は軟膏の条件との所定のセットに対し、活性物質が所望の放出速度で最適に送達されるように選択することができる。
【００５０】
一般に、製剤は、活性物質の活性が顕著に失われることなく所定の期間保存できる包帯剤又は軟膏を提供するように製剤化する必要がある。例えば、包帯剤又は軟膏は、その活性が、有効な割合よりも多く失われることなく、最大６カ月間、室温で安定であり得る。
【００５１】
上で議論したように、活性物質がシリコーンマトリックスから放出されて壊死組織を除去できるように製剤を調整することができる。製剤は、液体に対して密閉されることができ、この密閉性は、製剤によって覆われた領域の湿潤創傷環境を促進させることができる。湿潤創傷環境は、製剤に覆われた壊死組織の膨潤を可能にし、この膨潤は、活性物質がより有効的且つ選択的に膨潤壊死組織を除去することを可能にする。
【００５２】
本発明の１つの態様によれば、壊死組織を有する創傷周辺の領域に接着剤を適用させることができ、接着剤を用いて、創傷を覆うように製剤を接着させることができる。接着剤は、ダウ・コーニング（登録商標）ＰＳＡ ７−４４０２のような本明細書に記載のシリコーン系粘着剤、ＰＶＡのような親水性担体、及び壊死組織を除去するために選択された活性物質を阻害するように選択され、健常組織を保護する活性物質を含む、シリコーンマトリックスを含むことができる。本明細書に記載のように、活性物質は接着剤から放出されることができる。例えば、創傷を覆う製剤中の活性物質がプロテアーゼを含む場合、接着剤中の活性物質はプロテアーゼインヒビターであり得る。好適なプロテアーゼインヒビターの例としては、限定されるものではないが、セルピン、クニッツ、カザール中に見出されるもののようなセリンプロテアーゼインヒビター、及び白血球のプロテイナーゼ（ｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）類のインヒビターが含まれる。そのような好適なインヒビターは、Ｒ．Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔｓら、プロテイナーゼインヒビターの調節及び調節的役割、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．５（３−４）３８５−４３６（１９９５）に見出される。
【００５３】
本発明がより容易に理解されるために以下の実施例を参照するが、これらは本発明を具体的に示すことを意図したものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００５４】
シリコーンマトリックスからのプロテアーゼの徐放性を評価するために、第１の実験を行った。ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から市販されている、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー組成物（ダウ・コーニング（登録商標）９０４０）及びシリコーン系界面活性剤（ダウ・コーニング（登録商標）９０１１）を用いて、ダウ・コーニング（登録商標）９０４０及びダウ・コーニング（登録商標）９０４０／９０１１シリコーンエラストマー製剤を形成した。プロピレングリコールに溶解させた１．１ｍｇ／ｍｌのバシラス・レンタス由来プロテアーゼＡ保存溶液を２つのダウ・コーニング（登録商標）組成物へ添加した。５ｍｌの保存溶液サンプルを、２０ｇの９０４０製剤、及び１０ｇの９０４０製剤と１０ｇの９０１１製剤とを含む２０ｇの９０４０／９０１１製剤に添加した。酵素保存溶液の代わりに水と、９０４０とを含む対照、及び９０４０／９０１１とを含む対照を調製した。更に、シリコーンマトリックスの成分がプロテアーゼを阻害するか調べるため、等量のダウ・コーニング（登録商標）９０４０酵素製剤又は９０４０／９０１１酵素製剤と、プロテアーゼを含まず水を含む対照とを有する更なるサンプルを調製した。これらの阻害対照は、これらプロテアーゼ不含サンプルからアリコートを取り、酵素製剤サンプルからの等量のアリコートに加えることによって調製し、プロテアーゼ活性の阻害を観察した。次にサンプル物質をフード内で２週間空気乾燥させた。
【００５５】
ダウ・コーニング（登録商標）９０４０／９０１１製剤は薄いフィルムに乾燥させ、ダウ・コーニング９０４０（登録商標）組成物はケークに乾燥させた。Ｎ−スクシニル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）を用いて、Ｄｅｌｍａｒ，Ｅ．Ｇ．ら（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４、３１６−３２０；Ａｃｈｔｓｔｅｔｔｅｒ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ ２０７：４４５−５４（１９８１））に記載のように、プロテアーゼの標準アッセイでサンプルをアッセイした（ｐＨ６．５、２５℃）。アッセイは、ヒューレットパッカード８４５１Ａダイオードアッセイ分光光度計を用いて、４１０ｎｍにて、放出されたプロテアーゼをｍＡｂｓ／分の単位で測定した。この実施例１の結果を以下の表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
これらのデータは、シリコーンマトリックスからの５時間にわたるプロテアーゼの有効な放出を示している。２週間以上乾燥保存した材料からデータを得ている。プロテアーゼ不含シリコーン製剤の対照及び阻害対照を、プロテアーゼ含有シリコーン製剤と同量で同期間インキュベートした。阻害サンプルは、酵素製剤のプロテアーゼ活性よりも低いがほとんど一致したプロテアーゼ活性値を示している。結果は、追加の製剤を酵素サンプルに加えるとわずかに阻害化合物が存在し得ることを示している。
【実施例２】
【００５８】
シリコーンマトリックスからのプロテアーゼの除放性を評価するために、更なる実験を行った。０．８１ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＡのポリエチレングリコール保存溶液の０．５ｍｌアリコートを小さなポリプロピレン製秤量ボートに移した。次に、５．０ｍｌのシリコーンゴム組成物（ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００、ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州）をプロテアーゼ溶液に添加し、添加１５秒以内に混合した。ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００組成物は、「塗布剤付き」フィルム、パッチ、又は包帯としての適用を有することを意図している。次に混合物を３０分間硬化させた。硬化後、１．０ｍｌの蒸留水で混合物を３回洗浄した。上記のように、アリコートに対し、ＳＡＡＰＦｐＮＡアッセイを用いて各洗浄液についてアッセイし、洗浄液中の酵素量を測定した。次に組成物をその側面で１５分間乾燥させ、続いて平らにして更に１５分間乾燥させた。最後に、５．０ｍｌの蒸留水を秤量ボートに加え、数秒間緩やかにグルグルかき混ぜた。０時点に２００μｌのアリコートを取った。１時間ごとに２００μｌ取りながら、秤量ボートを持続的にグルグルかき混ぜた。
【００５９】
この実験の結果を図１に報告する。洗浄液中に９％のプロテアーゼ活性が回収され、４時間で３．８％のプロテアーゼがシリコーンマトリックスから放出された。
【００６０】
直前に記載した方法によって、シュードモナス・メンドシナ由来のリパ−ゼを用いて、ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００ シリコーンゴム組成物のリパーゼ放出を更に試験した。この実験の結果をｍＡｂｓ／分の単位で以下の表２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
洗浄液中に１８％のリパーゼ活性が回収され、９時間で２．２％のリパーゼが放出された。
【００６３】
図２Ａは、ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００ シリコーンゴム溶液からのプロテアーゼＡの放出／送達を表し、図２Ｂは、ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００ シリコーンゴム溶液からのリパ−ゼの放出／送達を表す。図は、添加した酵素のおよそ２〜４％が、長時間にわたり、シリコーンマトリックスから直線的に放出されたことを示している。
【実施例３】
【００６４】
シリコーンマトリックスからのプロテアーゼＡの徐放性に対する親水性添加剤の効果を評価するために、更に他の実験を行った。まず、試験包帯剤、より具体的には、プロテアーゼ含有パッチを、パッチの全量が一定（約２ｇ）であり、且つパッチ内の酵素濃度も一定（パッチ１ｇあたり約０．６ｍｇの薬剤）となるように、小さなペトリ皿（直径およそ３ｃｍ）の中で成型した。パッチは、ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から市販されている、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー組成物（ダウ・コーニング（登録商標）９０４０）及びシリコーン系界面活性剤（ダウ・コーニング（登録商標）９０１１）を含んでいた。また、ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００（シリコーンゴム組成物）も試験した。更に、製剤は、さまざまな量のＰＶＡ、高プロピレングリコールレベルでのＰＶＡ、又は撹拌によって加えたＰＶＰを含有していた。
【００６５】
２つの方法で酵素放出を評価した。第１の方法では、パッチを洗浄し、パッチ表面及びパッチ表面の非常に近くに存在し得る酵素を除去した。約１ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ５．４）を、ペトリ皿の試験パッチ表面に添加した。次に、バッファーを２０秒間グルグルかき混ぜ、分析用にバッファーを静かにエッペンドルフチューブに移した。洗浄工程を３回繰り返し、各洗浄液について酵素活性を測定した。洗浄工程中に放出された全酵素量を示すため、結果をまとめた。図３Ａ〜３Ｃにおいて、この酵素量には０時点が含まれている。
【００６６】
もう１つの方法は洗浄工程を含まない。約５ｍｌの溶解バッファーをピペットで試験パッチ表面に取り、ペトリ皿にフタをして蒸発をなくした。次に、試験パッチと溶解バッファーとを含有するペトリ皿を楕円ミキサー上で約７５ｒｐｍでグルグルかき混ぜ、酵素活性を分析するため、溶解バッファーの１０μｌアリコートを１時間ごとに取り出した。アッセイバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．６）を含有するキュベットに、ピペットでアリコートを直接取り、ＵＶ／可視分光計で酵素活性を測定し、溶解バッファー中の酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。
【００６７】
図３Ａは、さまざまな量のＰＶＡと高ＰＧ（プロピレングリコール）含量を有するダウ・コーニング（登録商標）９０４０／９０１１シリコーンマトリックスからの酵素放出を表す。図３Ａに見られるように、より多量の親水性ＰＶＡをシリコーンマトリックスに加えると、酵素放出速度が増加する。同様に、図３Ｂは、さまざまなＰＶＡレベルで、ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００製剤から放出されたプロテアーゼＡの割合を表す。グラフからわかるように、ＰＶＡ量が増加すると放出速度が増加する。図３Ｃは、さまざまな量のＰＶＰを有するダウ・コーニング（登録商標）９０４０／９０１１シリコーンマトリックスからの酵素の放出を表す。図３Ｃに見られるように、親水性ＰＶＰをシリコーンマトリックスに加えると酵素放出速度が増加する。
【実施例４】
【００６８】
シリコーンマトリックスからのプロテアーゼＢの徐放性に対するシリコーンマトリックスの効果を評価するために、実験を行った。まず、試験包帯剤、より具体的には、プロテアーゼ含有パッチを、パッチの全量が一定（約２ｇ）であり、且つパッチ中の酵素濃度も一定（パッチ１ｇあたり約０．６ｍｇの薬剤）となるように、小さなペトリ皿（直径およそ３ｃｍ）中に成型した。パッチは、ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から市販されている、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー組成物（ダウ・コーニング（登録商標）９０４０）及びシリコーン系界面活性剤（ダウ・コーニング（登録商標）９０１１）を含んでいた。あるいは、パッチは、ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から入手可能な、ダウ・コーニング（登録商標）ＰＳＡ ７−４４０２粘着剤又はダウ・コーニング（登録商標）７−ＦＣ−４２１０細胞性エラストマーを含んでいた。更に、製剤は０％又は２０％のＰＶＡを含有していた。
【００６９】
２つの方法で酵素放出を評価した。第１の方法では、パッチを洗浄し、パッチ表面及びパッチ表面の非常に近くに存在し得る酵素を除去した。約１ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ５．４）を、ペトリ皿の試験パッチ表面に添加した。次に、バッファーを２０秒間グルグルかき混ぜ、分析用にバッファーをエッペンドルフチューブへ静かに移した。洗浄工程を３回繰り返し、各洗浄液について酵素活性を測定した。洗浄工程のあいだに放出された全酵素量を示すために結果をまとめる。図４において、この酵素量には０時点が含まれている。
【００７０】
もう１つの方法は洗浄工程を含まない。約５ｍｌの溶解バッファーをピペットで試験パッチ表面に取り、ペトリ皿にフタをして蒸発をなくした。次に、試験パッチと溶解バッファーとを含有するペトリ皿を楕円ミキサー上で約７５ｒｐｍでグルグルかき混ぜ、酵素活性を分析するために溶解バッファーの１０μｌのアリコートを１時間ごとに取り出した。アッセイバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．６）を含有するキュベットにアリコートをピペットで直接取り、ＵＶ／可視分光計で酵素活性を測定し、溶解バッファー中の酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。
【００７１】
図４は、この酵素放出試験の結果を表している。グラフからわかるように、ＰＳＡ ７−４４０２マトリックスは最大放出速度を示している。酵素の放出速度はシリコーンマトリックスの架橋密度に影響される。
【実施例５】
【００７２】
酵素放出速度に対するパッチ厚の効果を観察するために実験を行った。プロテアーゼＢ、７−５３００ シリコーン、及びＰＶＡのような他の成分を含有する試験製剤を乳化させた。製剤を、Ｂｌａｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ（ＵＶ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｐｐｌｙ社、シカゴ）を用いてマイラー（登録商標）シート上に塗布した。適用被覆の厚さは、刃とマイラー（登録商標）シートとのあいだのギャップを調整することによって制御した。被覆をそれぞれ１３及び２５μｍにした。被覆を完全に乾燥又は硬化させた後、直径２５ｍｍの試験ディスクをマイラー（登録商標）シートから切り出した。デジタル被覆厚計（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、マンチェスター、ＵＫ）を用いて被覆の最終乾燥厚を測定した。酵素ペイロードを正確に知るために、試験サンプルディスクの最終乾燥重量も測定した。マイラー（登録商標）単独の重量及び厚さを測定し、マイラー（登録商標）上のサンプルのそれから差し引いて、サンプル単独の重量及び厚さを出した。
【００７３】
フランツ型拡散セル（Ａｍｉｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｉｅｇｅｌｓｖｉｌｌｅ、ペンシルバニア州）を用いて酵素放出試験を行った。試験サンプルを拡散セルのトップにマウントし、予め３７℃に温めた１３．７ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）でセルを満たした。拡散セル内部にある空気泡を除去するように注意した。セルの撹拌速度を予め５０ｒｐｍにセットした。０．１ｍｌのサンプルアリコートを定期的な時間間隔で拡散セルから取り出し、酵素活性を分析し、活性酵素濃度をｍｇ／ｍｌの単位で得た。放出酵素の割合も計算した。
【００７４】
図５を参照してわかるように、放出速度はパッチ厚に反比例することがわかった。したがって、酵素の１００％放出は最も薄いパッチで達成された。
【実施例６】
【００７５】
軟膏製剤からのプロテアーゼ放出を試験するために実験を行った。ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から入手可能な、シリコーンエラストマー ダウ・コーニング９０４１及びシリコーン系界面活性剤ダウ・コーニング５２００ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ ＡＩＤを含有する外相を調製することによって、試験軟膏製剤を調製した。プロテアーゼＢ保存溶液を含有する内相を調製した。更に、０又は２０％の４０％ＰＶＡ溶液を有するように内相を調製した。プロテアーゼＢ保存溶液は、活性酵素、ギ酸ナトリウム、塩化カルシウム、水、及びＰＧを含有していた。攪拌機を用いて内相と外相を混合した。軟膏は、軟膏１ｇあたり約３ｍｇの酵素を有していた。
【００７６】
軟膏製剤を調製後、Ｈａｎｓｅｎの軟膏セル（Ｈａｎｓｅｎ、Ｃｈａｔｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）を用いてその放出速度を測定し、製剤の安定性を決定した。およそ０．５ｇの軟膏を軟膏セルの軟膏投薬領域にロードした。０．４５μｍのＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ（登録商標）メンブラン（Ｐａｌｌ社、アナーバー、ミシガン州）を軟膏投薬表面に置き、軟膏セルを密閉した。次に軟膏セルを軟膏セルフラスコ内に置き、フラスコを２５ｍｌのｐＨ５．５バッファー溶液（１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ）で満たし、軟膏セルをバッファー溶液に沈めた。３０℃で試験を行い、へらを用いてバッファーを一定の５０ｒｐｍで撹拌した。１０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１６時間後、及び２４時間後、オートサンプラーで０．５ｍｌアリコートを取り出した。酵素活性をＵＶ／可視分光計で測定し、溶解バッファー中の酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。溶解試験を６回重複して行い、平均量を報告する。
【００７７】
図６によると、ＰＶＡ溶液を加えることにより、２４時間にわたって酵素が軟膏から部分的に放出される。軟膏が、皮膚を局所治療するために使用できる製剤を提供することは図６から明らかである。
【実施例７】
【００７８】
室温で保存した乾燥パッチ内の酵素の安定性を測定するために安定性試験を行った。保存後の酵素の放出は上記実施例で報告した初期放出データに匹敵し、保存のあいだ酵素は安定なままであることを示している。乾燥パッチを０〜６カ月間保存し、適切な時点で酵素放出を測定した。プロテアーゼＡ、９０４０／９０１１ シリコーン、及び他の成分を含有する試験製剤を乳化させた。試験製剤は、乾燥重量３．１２５０ｇのＤＣ−９０４０ シリコーン、乾燥重量３．２５００ｇのＤＣ−９０１１ シリコーン系界面活性剤、２．５ｍｇ／ｇのプロテアーゼＡ、及び乾燥重量４．２０００ｇのＰＶＡを含んでいた。Ｂｌａｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ（ＵＶ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｐｐｌｙ社、シカゴ）を用いて、製剤をマイラー（登録商標）シート上に塗布した。適用被覆の厚さは、刃とマイラー（登録商標）シートとのあいだのギャップを調整することによって制御した。被覆を完全に乾燥又は硬化させた後、直径２５ｍｍの試験ディスクをマイラー（登録商標）シートから切り出した。デジタル被覆厚計（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、マンチェスター、ＵＫ）を用いて被覆の最終乾燥厚を測定したところ、サンプルの厚さはおよそ１００μｍであった。酵素のペイロードを正確に知るために、試験サンプルディスクの最終乾燥重量も測定した。マイラー（登録商標）単独の重量及び厚さを測定し、マイラー（登録商標）上のサンプルのそれから差し引いて、サンプル単独の重量及び厚さを出した。
【００７９】
５０％プロピレングリコール中のプロテアーゼＡ保存溶液（４００ｐｐｍ塩化カルシウムを含有する５０％ギ酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５）を含む対照を調製した。対照を室温で保存し、保持された酵素活性をさまざまな時点で試験した。プロテアーゼＡ酵素は対照溶液中で安定であることが予想される。
【００８０】
自動サンプリング用付属品及び少量溶解キットを備えたＨａｎｓｏｎ（Ｈａｎｓｏｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）の溶解試験機を用いて酵素放出試験を行った。ゴムのりを用いて、サンプル（２５ｍｍ）と同一直径の３／１６”厚ガラスディスクに試験サンプルを固定した。次に、試験サンプル面を上向きにして、サンプルを溶解容器にロードした。２５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）を各サンプル表面に注ぎ、自動サンプラーチューブに沿った撹拌へらを直ちにバッファー内へ下げた。溶解容器にキャップをして蒸発を最小限にし、５０ｒｐｍ台で撹拌を開始した。自動サンプラーは、プログラムされた時点で０．５ｍｌ又は１ｍｌのアリコートを取り出し、上記ＳＡＡＰＦｐＮＡプロテアーゼアッセイでこれらのサンプルの酵素活性を分析し、活性酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。ある場合には、２８０ｎｍの吸収を測定し、適切な吸光係数を適用することにより、各時点の合計タンパク質も測定した。
【００８１】
図７には、０、１、３、及び６カ月間保存した９０４０／９０１１乾燥パッチのプロテアーゼＡの酵素安定性が表されている。各時点での６回の重複の平均からデータポイントを得ている。活性の喪失はシリコーンパッチよりも対照溶液のほうが大きい。したがって、シリコーンパッチは、酵素を保存し、続いて放出する、より安定な手段を提供する。
【実施例８】
【００８２】
室温で保存したＰＳＡ ７−４４０２を有する乾燥パッチ内での酵素の安定性を測定するために安定性試験を実施した。保存後の酵素の放出は上記実施例で報告した初期放出データに匹敵し、保存のあいだ酵素は安定なままであることを示している。乾燥パッチを０〜６カ月間保存し、適切な時点で酵素放出を測定した。プロテアーゼＢ、ＰＳＡ ７−４４０２ シリコーン、及び他の成分を含有する試験製剤を乳化させた。試験製剤は、乾燥重量３３．７５００ｇのＰＳＡ ７−４４０２ シリコーン、乾燥重量２．３５００ｇのＤＣ１９３フルイド（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）、３．８６１２ｍｇ／ｇのプロテアーゼＢ、及び乾燥重量９．４１００ｇのＰＶＡを含む。Ｂｌａｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ（ＵＶ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｐｐｌｙ社、シカゴ）を用いて、製剤をマイラー（登録商標）シート上に塗布した。適用被覆の厚さは、刃とマイラー（登録商標）シートとのあいだのギャップを調整することによって制御した。被覆を完全に乾燥又は硬化させた後、直径２５ｍｍの試験ディスクをマイラー（登録商標）シートから切り出した。デジタル被覆厚計（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、マンチェスター、ＵＫ）を用いて被覆の最終乾燥厚を測定したところ、サンプルの厚さはおよそ１００μｍであった。酵素ペイロードを正確に知るために、試験サンプルディスクの最終乾燥重量も測定した。マイラー（登録商標）単独の重量及び厚さを測定し、マイラー（登録商標）上のサンプルのそれから差し引いて、サンプル単独の重量及び厚さを出した。
【００８３】
５０％プロピレングリコール中のプロテアーゼＢ保存溶液（４００ｐｐｍ塩化カルシウムを含有する５０％ギ酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５）を含む対照を調製した。対照を室温で保存し、保持された酵素活性をさまざまな時点で試験した。プロテアーゼＢ酵素は対照溶液中で安定であると予想される。
【００８４】
自動サンプリング用付属品と少量溶解キットを備えたＨａｎｓｏｎ（Ｈａｎｓｏｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）の溶解試験機を用いて酵素放出試験を行った。ゴムのりを用いて、試験サンプルをサンプル（２５ｍｍ）と同一直径の３／１６”厚ガラスディスクに固定した。次に、試験サンプル面を上向きにして、サンプルを溶解容器にロードした。２５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）を各サンプル表面に注ぎ、自動サンプラーチューブに沿った撹拌へらを直ちにバッファー内に下げた。溶解容器にキャップをして蒸発を最小限にし、５０ｒｐｍ台で撹拌を開始した。自動サンプラーは、０．５ｍｌ又は１ｍｌのアリコートをプログラムされた時点で取り出し、上記ＳＡＡＰＦｐＮＡプロテアーゼアッセイでこれらのサンプルの酵素活性を分析し、活性酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。ある場合には、２８０ｎｍの吸収を測定し、適切な吸光係数を適用することによって、各時点の合計タンパク質も測定した。
【００８５】
図８によると、０、１、３、及び６カ月間保存したＰＳＡ ７−４４０２乾燥パッチのプロテアーゼＢの酵素安定性が表されている。各時点での６回の重複の平均からデータポイントを得ている。シリコーンパッチは、酵素を保存し、続いて放出する安定な手段を提供する。しかしながら、放出されたプロテアーゼＢの割合は、プロテアーゼＢ対照溶液中に保持された活性の割合よりも少ない。
【実施例９】
【００８６】
室温で保存したＰＳＡ ７−４４０１を有する乾燥パッチ内での酵素の安定性を測定するために安定性試験を行った。保存後の酵素の放出は上記実施例で報告した初期放出データに匹敵し、保存のあいだ酵素は安定なままであることを示している。乾燥パッチを０〜３カ月間保存し、適切な時点で酵素放出を測定した。プロテアーゼＢ、ＰＳＡ ７−４４０１ シリコーン、及び他の成分を含有する試験製剤を乳化させた。試験製剤は、乾燥重量３３．９０８８ｇのＰＳＡ ７−４４０１ シリコーン、乾燥重量２．３５００ｇのＤＣ１９３フルイド、３．８７２３ｍｇ／ｇのプロテアーゼＢ、及び乾燥重量９．６１７０ｇのＰＶＡを含む。Ｂｌａｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ（ＵＶ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｐｐｌｙ社、シカゴ）を用いて、製剤をマイラー（登録商標）シート上に塗布した。適用被覆の厚さは、刃とマイラー（登録商標）シートとのあいだのギャップを調整することによって制御した。被覆を完全に乾燥又は硬化させた後、直径２５ｍｍの試験ディスクをマイラー（登録商標）シートから切り出した。デジタル被覆厚計（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、マンチェスター、ＵＫ）を用いて被覆の最終乾燥厚を測定したところ、サンプルの厚さはおよそ１００μｍであった。酵素ペイロードを正確に知るために、試験サンプルディスクの最終乾燥重量も測定した。マイラー（登録商標）単独の重量及び厚さを測定し、マイラー（登録商標）上のサンプルのそれから差し引いて、サンプル単独の重量及び厚さを出した。
【００８７】
５０％プロピレングリコール中のプロテアーゼＢ保存溶液（４００ｐｐｍ塩化カルシウムを含有する５０％ギ酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５）を含む対照を調整した。対照を室温で保存し、保持された酵素活性をさまざまな時点で試験した。
【００８８】
自動サンプリング用付属品と少量溶解キットを備えたＨａｎｓｏｎ（Ｈａｎｓｏｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）の溶解試験機を用いて酵素放出試験を行った。ゴムのりを用いて、試験サンプルをサンプル（２５ｍｍ）と同一直径の３／１６”厚ガラスディスクに固定した。次に、試験サンプル面を上向きにして、サンプルを溶解容器にロードした。２５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）を各サンプルの表面に注ぎ、自動サンプラーチューブに沿った撹拌へらを直ちにバッファーに下げた。溶解容器にキャップをして蒸発を最小限にし、５０ｒｐｍ台で撹拌を開始した。自動サンプラーは、０．５ｍｌ又は１ｍｌのアリコートをプログラムされた時点で取り出し、上記ＳＡＡＰＦｐＮＡプロテアーゼアッセイでこれらのサンプルの酵素活性を分析し、活性酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。ある場合には、２８０ｎｍの吸収を測定し、適切な吸光係数を適用することによって、各時点の合計タンパク質も測定した。
【００８９】
図９によると、０、１、及び３カ月間保存したＰＳＡ ７−４４０１乾燥パッチから放出されたプロテアーゼＢの酵素安定性が表されている。各時点での６回の重複の平均からデータポイントを得ている。シリコーンパッチは、酵素を保存し、続いて放出する安定な手段を提供する。しかしながら、放出されたプロテアーゼＢの割合は、プロテアーゼＢ対照溶液中に保持された活性の割合よりも少ない。
【実施例１０】
【００９０】
室温で保存した７−ＦＣ ４２１０を有する乾燥パッチ内での酵素の安定性を測定するために安定性試験を行った。保存後の酵素の放出は上記実施例で報告した初期放出データに匹敵し、保存のあいだ酵素は安定なままであることを示している。乾燥パッチを０〜１カ月間保存し、適切な時点で酵素放出を測定した。プロテアーゼＢ、７−ＦＣ ４２１０ 基剤及び硬化剤シリコーン、並びに他の成分を含有する試験製剤を乳化させた。試験製剤は、乾燥重量３６．００００ｇの７−ＦＣ ４２１０ 基剤シリコーン、乾燥重量７．２０００ｇの７−ＦＣ ４２１０硬化剤、乾燥重量４．０８０００ｇのＤＣ２２５ ジメチコーンフルイド（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）、４．２００６ｍｇ／ｇのプロテアーゼＢ、及び乾燥重量１２．２８８０ｇのＰＶＡを含んでいた。Ｂｌａｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ（ＵＶ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｐｐｌｙ社、シカゴ）を用いて製剤をマイラー（登録商標）シート上に塗布した。適用被覆の厚さは、刃とマイラー（登録商標）シートとのあいだのギャップを調整することによって制御した。被覆を完全に乾燥又は硬化させた後、直径２５ｍｍの試験ディスクをマイラー（登録商標）シートから切り出した。デジタル被覆厚計（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、マンチェスター、ＵＫ）を用いて被覆の最終乾燥厚を測定したところ、サンプルの厚さはおよそ１００μｍであった。酵素ペイロードを正確に知るために、試験サンプルディスクの最終乾燥重量も測定した。マイラー（登録商標）単独の重量及び厚さを測定し、マイラー（登録商標）上のサンプルのそれから差し引いて、サンプル単独の重量及び厚さを出した。
【００９１】
５０％プロピレングリコール中のプロテアーゼＢ保存溶液（４００ｐｐｍ塩化カルシウムを含有する５０％ギ酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５）を含む対照を調製した。対照を室温で保存し、保持された酵素活性をさまざまな時点で試験した。
【００９２】
自動サンプリング用付属品と少量溶解キットを備えたＨａｎｓｏｎ（Ｈａｎｓｏｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）の溶解試験機を用いて酵素放出試験を行った。ゴムのりを用いて、試験サンプルをサンプル（２５ｍｍ）と同一直径の３／１６”厚ガラスディスクに固定した。次に、試験サンプル面を上向きにして、サンプルを溶解容器内にロードした。２５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）を各サンプルの表面に注ぎ、自動サンプラーチューブに沿った撹拌へらを直ちにバッファー内へ下げた。溶解容器にキャップをして蒸発を最小限にし、５０ｒｐｍ台で撹拌を開始した。自動サンプラーは、０．５ｍｌ又は１ｍｌのアリコートをプログラムされた時点で取り出し、上記ＳＡＡＰＦｐＮＡプロテアーゼアッセイでこれらのサンプルの酵素活性を解析し、活性酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。ある場合には、２８０ｎｍの吸収を測定し、適切な吸光係数を適用することによって、各時点の合計タンパク質も測定した。
【００９３】
図１０によると、０及び１カ月間保存した７−ＦＣ ４２１０乾燥パッチから放出されたプロテアーゼＢの酵素安定性が表されている。各時点での６回の重複の平均からデータポイントを得ている。シリコーンパッチは、酵素を保存し、続いて放出する安定な手段を提供する。しかしながら、放出されたプロテアーゼＢの割合は、プロテアーゼＢ対照溶液中に保持された活性の割合よりも少ない。
【実施例１１】
【００９４】
創面清掃に好適な酵素の有効性を試験するために、不要な痂皮をｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして用いた。痂皮とは、創傷又は壊疽から取れたかさぶたの死滅組織である。酵素は、外科用メス又は他の鋭敏な手術器具を利用する鋭い創面清掃のための設備が限られ又は使用できない患者に、創傷の鋭い創面清掃の代替方法を提供する。ヒト糖尿病患者に生じる脚の壊疽の鋭い創面清掃から不要な痂皮を得た。
【００９５】
創面清掃当日に２枚の大きな痂皮片を得、２片に分けた。更に、２片をそれぞれ３つの部分に細かく分けた。３×３の細かいメッシュガーゼパッドを６枚のペトリ皿のそれぞれに入れ、ペトリ皿を秤量した。痂皮の１部分を各ガーゼパッド上に置き、ペトリ皿を再秤量した。ペトリ皿とガーゼの重量を、ペトリ皿、ガーゼ及び痂皮の重量から差し引いて、痂皮の乾燥重量を得た。２０ｍｌの市販のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をそれぞれのペトリ皿に加えた。６枚のペトリ皿のうちの２枚を、ＰＢＳと最初の２片の痂皮のそれぞれに由来する痂皮サンプルのみを有する対照とした。６枚のペトリ皿のうちの次の２枚の中のＰＢＳは、２０ｍｌのＰＢＳ中に２５０μｇのヒストリチクス菌由来のタンパク質分解コラーゲナーゼ（シグマ）を含有した。最後の２枚のペトリ皿の中のＰＢＳ溶液は、それぞれ２０ｍｌのＰＢＳ中に２５０μｇのＧｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のプロテアーゼＢサブチリシン酵素を含有した。
【００９６】
次に、痂皮を有するガーゼパッドを、ＰＢＳ溶液中に４８時間浸した。４８時間後、サンプルを検査し、４枚の酵素サンプルペトリ皿のそれぞれと同一の、２０ｍｌのＰＢＳ中に２５０μｇの酵素サンプルを含む各ペトリ皿に、２度目の２０ｍｌ量ＰＢＳを加えた。更に４８時間の浸漬後、各ペトリ皿の痂皮を、新しいペトリ皿中の新しい３×３ガーゼパッドに移した。ペトリ皿を秤量した。
【００９７】
表３に、６つのサンプルの重量変化を示す。全てのサンプルは、おそらく痂皮が液体を吸収したために膨張して、９６時間後には重くなっていた。コラーゲナーゼサンプルは、おそらく痂皮の分解により、重量増加の割合が低かった。プロテアーゼサンプルも、おそらく痂皮の分解により、重量増加の割合が低かった。
【００９８】
【表３】
【００９９】
痂皮の構造的完全性における変化の目視観察を９６時間に行い、分解を確認した。プロテアーゼ処理サンプルでは、痂皮がいくぶんゼラチン状になり、ある場合には、ＰＢＳで洗浄すると、痂皮が完全に分解した。対照とコラーゲナーゼで処理した痂皮サンプルは、ゼラチン化せず、ＰＢＳで洗浄しても分解しなかった。
【０１００】
本発明の範囲を逸脱することなくさまざまな改変がなされ得ることが当業者には明らかであり、明細書に記載されたものに限定することを意図するものではない。
【実施例１２】
【０１０１】
創面清掃に好適な多くの酵素の有効性を比較するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を行った。脚の糖尿病性壊疽の痂皮及び模擬洗浄を用いて創傷条件を模倣した。以下のプロトコールにしたがい実験を行った。
【０１０２】
フタ付きの小さなペトリ皿にラベルして秤量した。次に、２インチ四方のガーゼパッドを各ペトリ皿に加え、ペトリ皿を再秤量した。次に、脚の糖尿病性壊疽の痂皮を、ナイフ又はハサミを用いて視覚的に同等の部分に分けた。ペトリ皿中のガーゼパッド上のサンプルを試験秤量した。サンプルの差が互いに１０％又は０．１ｇ以内である場合は次の工程を行った。サンプルの差が互いに１０％又は０．１ｇ以内でない場合は、１０％又は０．１ｇ以内になるまで重量に基づいて再区分化した。
【０１０３】
次に、ペトリ皿中のガーゼパッド上の痂皮を秤量した。ＰＢＳ溶液（０．００２％アジ化ナトリウムを添加したダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）中の適量の酵素をガーゼパッドに加え、２５０μｇの酵素を導入した。１０ｍｌのＰＢＳ溶液を直ちに加えた。ペトリ皿にカバーをして滅菌フードに移した。理想的には、この１０ｍｌのＰＢＳナトリウムは、適切な混合を保証するために、酵素がガーゼパッドに吸収された地点に加える必要がある。ペトリ皿を滅菌フード内で４８時間、室温でインキュベートした。
【０１０４】
４８時間後、パッドを排水（パッドをペトリ皿の側面に接触させて過剰の液体を排出する）し、滅菌フィルターフラスコ内の０．２２μｍフィルターに移して真空にし、解放した。パッドは乾燥してフィルターに接着していた。ペトリ皿中の残存反応混合物１ｍｌを取り、４８時間におけるＡ２８０解析のためにエッペンドルフチューブに入れた。
【０１０５】
エッペンドルフチューブ内のサンプルを、サンプルの吸収が直線状の０．０〜２．０吸収単位の範囲になるまでＰＢＳ溶液で希釈し、Ａ２８０解析を行った。アマシャム・バイオサイエンス Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３１００ｐｒｏ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を用いて、２８０ｎｍで解析を行った。Ａ２８０解析は、酵素が痂皮を加水分解し、遊離アミノ酸又は可溶性ペプチドを、加水分解された痂皮から残存反応混合物へ放出するかどうかの指標を提供する。
【０１０６】
サンプルがガーゼパッドから洗浄除去されないようにして、３０ｍｌのＰＢＳ溶液を痂皮サンプルに注いだ。ガーゼパッド及び痂皮サンプルをフィルターフラスコから取り出し、第２のラベルしたペトリ皿に入れた。洗浄液をボトル内に保存し、ボトルにねじぶたをした。フィルターユニットを廃棄した。この洗浄工程は、酵素適用中及び適用後の創傷の洗浄をまねた。
【０１０７】
酵素の第２の適用が提供された。適量の酵素をガーゼパッドに加えて２５０μｇの酵素を導入した。１０ｍｌのＰＢＳ溶液を、酵素がガーゼに吸収された地点の近傍に直ちに加えた。ペトリ皿にカバーをして滅菌フードに移した。ペトリ皿を更に４８時間インキュベートした。
【０１０８】
４８時間後、パッドを排水（パッドをペトリ皿の側面に接触させて過剰の液体を排出する）し、滅菌フィルターフラスコ内の０．２２μｍフィルターに移して真空にし、解放した。パッドは乾燥してフィルターに接着していた。ペトリ皿中の残存反応混合物１ｍｌを取り、９６時間におけるＡ２８０解析のためにエッペンドルフチューブに入れた。
【０１０９】
サンプルがガーゼパッドから洗浄除去されないようにして、３０ｍｌのＰＢＳ溶液を痂皮サンプルに注いだ。ガーゼパッド及び痂皮サンプルをフィルターフラスコから取り出し、第３のラベルして秤量したペトリ皿に入れた。洗浄液をボトル内に保存し、ボトルにねじぶたをした。フィルターユニットを廃棄した。
【０１１０】
ガーゼパッドを有するペトリ皿をフード内に一晩放置し、その後秤量した。ガーゼ＋痂皮の重量を計算した。ガーゼパッド＋痂皮を、更に２４時間後に再秤量した。
【０１１１】
ＰＢＳ及び痂皮サンプルのみのブランクについて実験を行った。ヒストリチクス菌由来のタンパク質分解コラーゲナーゼ（シグマ）を用いた。更に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のプロテアーゼＢサブチリシン酵素を用いた。
【０１１２】
表４に、サンプルに酵素と洗浄を供した前後の痂皮サンプルの重量を示す。表からわかるように、プロテアーゼＢは、最も効率的に痂皮を分解したようである。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
表５は、残存反応混合物の４８時間及び９６時間におけるＡ２８０解析の結果を示す。表からわかるように、より多くの遊離アミノ酸がプロテアーゼＢサンプル中に存在していた。したがって、プロテアーゼＢは、痂皮の分解に、より効率的なようである。
【０１１５】
【表５】
【実施例１３】
【０１１６】
実施例１２に概説したようにして更なる実験を行った。ＰＢＳ及び痂皮サンプルのみのブランクについて実験を行った。ヒストリチクム菌由来のタンパク質分解コラーゲナーゼ（シグマ）を用いた。更に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のプロテアーゼＢサブチリシン酵素を用いた。
【０１１７】
表６は、残存反応混合物の４８時間及び９６時間におけるＡ２８０解析の結果を示す。表からわかるように、より多くの遊離アミノ酸がプロテアーゼＢサンプル中に存在していた。したがって、プロテアーゼＢは、痂皮の分解に、より効率的なようである。
【０１１８】
【表６】
【実施例１４】
【０１１９】
実施例１２に概説したようにして更なる実験を行った。ＰＢＳ及び痂皮サンプルのみのブランクについて実験を行った。Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のプロテアーゼＢサブチリシン酵素を用いた。更に、本明細書に援用される米国特許第５，６７７，１６３号に記載の枯草菌ＬＧ１２を用いた。
【０１２０】
表７に、残存反応混合物の４８時間及び９６時間におけるＡ２８０解析の結果を示す。表からわかるように、より多くの遊離アミノ酸がＬＧ１２溶液中に存在していた。したがって、ＬＧ１２は、痂皮の分解に、より効率的なようである。
【０１２１】
【表７】
【実施例１５】
【０１２２】
プロテアーゼＢ及び７−５３００ シリコーンを含有するウエハーを実施例５にしたがい調製した。更に、７−５３００ シリコーンを含む対照ウエハーを調製した。ウエハーを１．６％カゼインアガー培地プレート上におき、３７℃で１時間インキュベートした。プロテアーゼＢを含有するウエハーはスキムミルクを加水分解し、アガーが消失した。対照ウエハーはスキムミルクを溶解せず、消失を示さなかった。
【実施例１６】
【０１２３】
プロテアーゼＢ及びＰＳＡ７−４４０２ シリコーンを含有するパッチを実施例８にしたがい調製した。パッチを１３カ月間室温で保存した。パッチを１．６％カゼインアガー培地プレート上におき、３７℃で１時間インキュベートした。パッチはスキムミルクを加水分解し、少量のアガーが消失した。次に、プレートを３７℃で一晩インキュベートしたところ、パッチは更にスキムミルクを加水分解して、実施例１５の７−５３００ プロテアーゼＢパッチとほぼ同量の消失を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、本発明の態様による製剤からのプロテアーゼ徐放性放出のチャートである。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の態様による製剤からのプロテアーゼの放出／送達を示すチャートである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の態様による製剤からのリパーゼの放出／送達を示すチャートである。
【図３Ａ】図３Ａは、さまざまな量の親水性成分を有する製剤からのプロテアーゼ放出を示すチャートである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、さまざまな量の親水性成分を有する製剤からのプロテアーゼ放出を示すチャートである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、さまざまな量の親水性成分を有する製剤からのプロテアーゼ放出を示すチャートである。
【図４】図４は、さまざまなシリコーンマトリックスを有する製剤からのプロテアーゼ放出速度を示すチャートである。
【図５】図５は、さまざまな厚さのパッチを有する製剤からのプロテアーゼ放出速度を示すチャートである。
【図６】図６は、本発明の態様による軟膏製剤からのプロテアーゼ放出を示すチャートである。
【図７】図７は、本発明の態様による製剤におけるプロテアーゼの安定性を示すチャートである。
【図８】図８は、本発明の他の態様による製剤におけるプロテアーゼの安定性を示すチャートである。
【図９】図９は、本発明の更に他の態様による製剤におけるプロテアーゼの安定性を示すチャートである。
【図１０】図１０は、本発明の態様による製剤におけるプロテアーゼの安定性を示すチャートである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、局所皮膚治療用製剤に関するものであり、より詳細には、活性物質の徐放性を提供する、シリコーンマトリックス及び親水性担体を含む製剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シリコーンはアルキルシロキサン又はオルガノシロキサンの化学に基づく化合物であり、医薬用途において賦形剤や加工補助剤として用いられるポリジメチルシロキサンが含まれる。こうした材料のいくつかは薬局方化合物の地位を得ている。制御された薬物送達システム、特に、特定の特性の結合が、製品デザインの要求、即ち生体適合性及び汎用性を満たすのに重要な場合の適用におけるそのようなシリコーン化合物の使用は当該技術分野に公知である。インプラント、挿入物、粘膜接着、経皮、及び局所形態を含めた新規持続薬物送達用途は、シリコーンのユニークで固有の特性を利用する。これら送達システムは、標的領域に対して生物学的に適切な動態を有する活性分子の制御放出を可能にし、従来の経口及び非経口投薬法において一般に観察されるピーク投与量、コンプライアンスの低さ、及び薬物分解のような悪影響を妨げる。
【０００３】
経皮薬物送達システムは、無傷の皮膚に最高７日間接着する薬物含有接着性パッチから成る。パッチのデザインは活性物質の放出を制御し、そして全身活性のために循環システムによって生体の至るところに運ばれる。投入点として皮膚を用いることにより、絆創膏又はフィルム形態と実質的材料（例えばクリーム又はゲル）とから成る局所形態が局部治療（筋肉又は皮膚の疾患）に用いられる。しかしながら、シリコーンマトリックスに分散した生化学物質が皮膚又は創傷に放出されて治癒を促進するこれら経皮薬物送達システムは、創傷包帯剤及び軟膏のような局所包帯剤用途には導入されていない。
【０００４】
したがって、関連技術において、シリコーンの有益な特性を利用して活性物質の徐放性を提供できる製剤に関する必要性が残されている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、シリコーンマトリックス、親水性担体、及び製剤から放出される少なくとも１つの活性物質を含む局所用製剤を提供することによってその必要性を満たすものである。活性物質は、タンパク質、特にヒドロラーゼ及びグルコースオキシダーゼのような酵素であり得る。シリコーンマトリックスは、高分子量ポリジメチルシロキサン、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー、ゲルのような架橋したシリコーンエラストマー（充填剤のないエラストマー）、シリカ強化ゴム又は発泡体、を含むことができ、架橋は、付加及び縮合硬化システム、シリコーン系粘着剤、及びシリコーンポリアミドのようなシリコーン−有機コポリマーを用いて達成される。製剤は、包帯剤、軟膏などを形成するために用いてもよい。
【０００６】
本発明の１つの側面によれば、製剤は、障害組織を含めた皮膚に適用可能な薄いフィルム包帯剤を含むことができる。本発明の他の側面によれば、製剤は、パッチ包帯剤を含む。本発明の更に他の側面によれば、製剤は塗布剤付き包帯の包帯剤を含む。本発明の他の側面によれば、製剤は軟膏を含む。薄いフィルム、パッチ、塗布剤付き包帯、及び軟膏は全て、外科的切開、創傷、又は他の皮膚病変、擦り傷、ひっかき傷、かすり傷、又は他の障害組織の全体を覆うように皮膚に適用することができる。製剤は、液体に対して密閉されることができ、皮膚表面からの感染を引き起こす微生物をブロックする上で有効である。１つの態様では、酵素による創面清掃、血栓形成及び血栓除去、並びにｉｎ ｓｉｔｕペルオキシド及び／又は過酸産生のために、創傷部位でプロテアーゼのような活性物質を製剤から放出させてさまざまな段階で創傷治癒を促進させることができる。
【０００７】
好ましい態様では、局所用製剤は、シリコーンマトリックスの至るところに分散した活性物質を含有する親水性担体の混合物を含む。混合物はシリコーンマトリックスとともに本発明のこの態様の局所用製剤を形成する。親水性担体は例えばプロピレングリコール溶液であり、例えばポリビニルアルコール（「ＰＶＡ」）又はポリビニルピロリドン（「ＰＶＰ」）のような水溶性又は親水性成分と混合することができる。親水性担体と活性物質との混合物は、エマルジョン又は分散液の内相を形成することができ、この内相はシリコーンマトリックス（外相）内に配置されている。したがって、シリコーン系界面活性剤を添加して、内相を非常に小さな液滴に分散又は乳化し、活性物質の放出を促進させることができる。
【０００８】
したがって、本発明の更なる目的は、活性物質の皮膚への制御放出を提供する上で有効な局所用製剤を提供することである。本発明のこの特徴及び他の特徴並びに利点は、以下の発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【０００９】
以下の本発明の好ましい態様の詳細な説明は、添付の図面とともに読むことによって、最も良く理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の１つの側面によれば、シリコーンマトリックスを導入している局所用製剤が提供される。製剤は、シリコーンマトリックスからの活性物質の制御された徐放性放出を有効に提供する。活性物質を親水性担体と混合して、シリコーンマトリックス内に分散した混合物を形成する。活性物質はシリコーンマトリックス内で安定であり、マトリックスから制御可能に及び自由に放出される。
【００１１】
本発明の態様を定義し、記載するために、以下の用語は以後に提示される定義と一致するものとして理解されるであろう。
【００１２】
活性物質はタンパク質、特に酵素を意味するものとして理解されるべきである。
【００１３】
界面活性剤は、非混和液又は液体と、しばしばコロイドサイズの非常に細かい固体粒子との均一で最大の分離を促進するために懸濁媒体に添加される表面活性物質を意味するものとして理解されるべきである。界面活性剤は、湿潤、液体分散媒体での非混和液、液滴、又は細かい固体粒子の効率的な分配、及び粒子の凝集に対する安定化を促進する。界面活性剤は一般に、粒子表面の完全な表面被覆を提供するのに十分な量で分散媒体に添加される。
【００１４】
包帯剤は、分泌物を吸収し、外傷から組織を保護し、医薬を組織へ投与し、環境から組織を保護し、出血を止め、湿潤環境を維持又は提供するため、そしてこれらの組み合わせのために、皮膚、創傷組織、又は病変組織に直接適用するのに好適なさまざまなタイプの被覆剤を意味するものとして理解されるべきである。例えば、包帯剤はフィルム、パッチ、包帯、ゲルなどの形態でよい。
【００１５】
エマルジョンは、１つの液相の、第２液相内への一時的又は永続的分散を意味するものとして理解されるべきである。通常、液体の一方は水又は水溶液であり、他方はオイル又は他の水と非混和性の液体である。通常、第２液は連続相又は外相を意味する。エマルジョンは、分散した液体又は内相が単純な均一液である単純なエマルジョンか、分散した液相が２重エマルジョン若しくは多重エマルジョンのように液相又は固相の不均一な組み合わせである、より複雑なエマルジョンに更に分類することができる。
【００１６】
親水性担体は、活性物質の溶媒として作用する、本発明の製剤の相の少なくとも１つの成分を意味するものとして理解されるべきである。親水性担体は、本発明の態様に用いられるシリコーンマトリックスからの活性物質の放出を補助する。
【００１７】
親水性成分は、本発明の態様において親水性担体と活性物質との混合物に添加される少なくとも１つの成分を意味するものとして理解されるべきである。親水性成分は、本発明の態様に用いるシリコーンマトリックスからの活性物質の放出を補助することもできる。
【００１８】
タンパク質は、天然、合成、及び遺伝子工学的な、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、ヒドロラーゼのような酵素；抗体；ポリペプチド；ペプチド；ホルモン；サイトカイン；成長因子；及び他の生体モジュレーターを意味するものとして理解されるべきである。
【００１９】
軟膏は、皮膚、創傷組織、及び病変組織のような外部に適用するのに好適な半固体製剤を意味するものとして理解されるべきである。
【００２０】
本発明によれば、製剤は、皮膚、創傷組織、及び病変組織に適用され得るさまざまな局所包帯剤に用いることができる。局所包帯剤は、活性物質が放出され、下にある皮膚、創傷組織、及び病変組織に適用されることを可能にする。更に、製剤は軟膏を形成するために用いてもよく、軟膏は、活性物質を放出し、下にある皮膚、創傷組織、又は病変組織に適用されることを可能にする。
【００２１】
好ましい態様によれば、外相又は連続相内に内相又は非混和性分散相を含む製剤が提供される。外相は一般にシリコーンマトリックスを含み、内相は一般に少なくとも１つの活性物質を含有する親水性担体を含む。更に、内相は好適な親水性成分を更に含んでいてもよい。内相及び外相は、本発明の製剤を形成するために好適な方法で混合することができる。例えば、本発明の製剤を形成する際に、高剪断ミキサーを用いて内相と外相を混合することができる。更に、内相と外相を手で混合してもよい。内相の液滴サイズはさまざまでよい。例えば、液滴サイズは約０．１μｍ〜約２０００μｍ、約０．１μｍ〜約１０００μｍ、約０．１μｍ〜約５００μｍ、約０．１μｍ〜約２００μｍ、又は約０．１μｍ〜約１００μｍでよい。
【００２２】
内相は、少なくとも１つの活性物質を含有する好適な親水性担体を含むことができる。本発明の態様では、親水性担体は関連温度で液体であり、好適な溶媒に溶解した固体材料（例えばソルビトール、マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム及びクエン酸）を用いてもよい。例えば、プロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、グリセリン、アルコール、多価アルコール、水、又は他の好適な親水性担体の溶液中に活性物質を含有してもよい。
【００２３】
内相は水溶性及び親水性成分を更に含むことができる。親水性成分は一般に活性物質の溶媒として作用しない。親水性成分は、シリコーンマトリックスからの活性物質の放出速度を高めることができ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ又はＰＶＯＨ）（例えばＣｌａｒｉａｎｔ社、シャーロット、ノースカロライナ州から入手可能なＭｏｗｉｏｌ（登録商標）３−８３のなど）又は例えばＢＡＳＦ社、マウントオリーブ、ニュージャージ州から入手可能なＬｕｖｉｓｋｏｌ（登録商標）Ｋ−３０のようなポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含むことができる。内相溶液は、約３５重量％以下のＰＶＡ水溶液又は約５０重量％以下のＰＶＰ水溶液を含むことができる。本発明の態様では、親水性成分は、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、ポリアクリル酸、アルギン酸誘導体、キトサン誘導体、ゼラチン、ペクチン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、並びに他の好適な親水性の分子及び高分子のような、水で希釈された水性増粘剤であることもできる。ここで、活性物質は水溶性でも非水溶性でもよい。このような分子には、親水性高分子が含まれる。
【００２４】
特定の理論に拘束されることを望まないが、親水性成分が、シリコーンマトリックス内に、活性物質の放出を容易にする孔、割れ目、亀裂、裂溝をつくることも意図される。内相をつくる際に、親水性担体に添加するＰＶＡ又はＰＶＰの量を増加させると、放出する活性物質の割合を増加させることができる。更に、内相の親水性担体量が増加すると、放出する活性物質の割合を増加させることができる。
【００２５】
更に、賦形剤を用いて活性物質を安定化又は生体適合性にすることができ、シリコーンマトリックスからの放出を補助することができる。本発明に用いるためのシリコーン賦形剤は、シリコーンポリエーテル、シリコーンフルイド、ジメチコーン、ジメチコーンコポリオール、ジメチコノール、シリコーンアルキルワックス、シリコーンポリアミドなどを含むことができる。他の可能な賦形剤には、限定されるものではないが、（ポリ）サッカリド誘導体、アクリル酸誘導体、ＰＶＡ誘導体、グリコール、グリセロール、グリセリド誘導体、プロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、グリセリン、アルコール、セルロース誘導体、ポリアクリル酸、アルギン酸誘導体、キトサン誘導体、ゼラチン、ペクチン及び多価アルコールのような親水性有機物が含まれる。
【００２６】
本発明のシリコーンマトリックスは、ＥＰ９６６９７２Ａ１、ＷＯ０１／１９１９０Ａ１、及びＷＯ２００１／２２９２３に記載のような高分子量ポリジメチルシロキサン（ガム系材料に対し１２，５００ｃＳｔ）で構成されていてもよい。
【００２７】
シリコーンマトリックスは、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー、例えばダウ・コーニング（登録商標）９０４０ シリコーンエラストマーブレンド（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）で構成されていてもよい。ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマーは、揮発性シリコーン溶媒（Ｄ５）に処理されたゆるく架橋したポリジメチルシロキサンについて記載する以下の米国特許に記載されている：米国特許第６，２００，５８１号、第６，２３８，６５７号、第６，１７７，０７１号、第６，１６８，７８２号、及び第６，２０７，７１７号。揮発性シリコーン溶媒が蒸発するにつれて、軽く又はゆるく架橋したシリコーンエラストマーは、ペースト状の堅さからエラストマー系シリコーンゲルへと厚くなる。
【００２８】
シリコーンマトリックスは、米国特許第５，１４５，９３７号及び第４，９９１，５７４号、並びにＥＰ０９５５３４７号に記載のような充填剤のないエラストマーで構成されていてもよい。これらの特許は、例えばダウ・コーニング（登録商標）７−９８００ ＳＳＡキット（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）のようなシリコーンゲルの使用について教示する。
【００２９】
あるいは、シリコーンマトリックスは、ＥＰ０４２５１６４号、ＥＰ０５０６２４１号、及び米国特許第５，０１０，１１５号に記載のような（充填剤のない又はシリカで強化された）細胞性エラストマーで構成されていてもよい。これらの特許は、例えばダウ・コーニング（登録商標）７−０１９２ フォーム パートＡ及びパートＢ（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）のようなシリコーンフォームの使用について教示する。更に、シリコーンマトリックスは、付加硬化物（ゲルに類似するがシリカで強化されている）又は縮合硬化物、例えばダウ・コーニング（登録商標）７−５３００ ＦＩＬＭ−ＩＮ−ＰＬＡＣＥ ＣＯＡＴＩＮＧ又はダウ・コーニング（登録商標）７−ＦＣ４２１０ フィルム形成基剤及び硬化剤（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）のようなシリコーンゴムで構成されることができる。
【００３０】
最後に、シリコーンマトリックスは、米国特許第２，７３６，７２１号、第２，８１４，６０１号、第２，８５７，３５６号、第３，５２８，９４０号、及び第６，３３７，０８６号に記載のような、溶媒ベースでも熱溶解性でもよい、シリコーンポリマー中のシリケート樹脂のようなシリコーン系粘着剤（シリコーンＰＳＡ）で構成されていてもよい。これらの特許は、例えばダウ・コーニング（登録商標）ＰＳＡ ７−４４０２（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）のようなシリコーンＰＳＡの使用について教示する。
【００３１】
本発明のシリコーンマトリックスは、親水性担体や活性物質の小さな液滴への分散又は乳化を容易にし、こうしたより小さな液滴がより大きな液滴へと融合するのを妨げる、シリコーン系界面活性剤、例えばダウ・コーニング（登録商標）９０１１ シリコーンエラストマーブレンド（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）を更に含んでいてもよい。例えば、シリコーン系界面活性剤を用いる場合、内相の液滴は約０．１〜５００μｍであり得る。シリコーン系界面活性剤は、本発明の局所包帯剤を形成する際に、好適なエマルジョンを作製するために用いてもよい。更に、本発明の外相は、シリコーンマトリックスを送達するための希釈剤、例えば揮発性シリコーン（即ちＤ５（ダウ・コーニング（登録商標）２４５フルイド）、ＭＤＭ（ダウ・コーニング（登録商標）２００フルイド １ｃＳｔ））、又は有機溶媒（即ちヘプタン又は酢酸エチル）を含んでもよい。
【００３２】
本発明の活性物質は、一般に、親水性担体に導入される酵素などのタンパク質である。活性物質は親水性であり得る。包帯剤への導入に好適な酵素は如何なる酵素でもよい。酵素には、限定されるものではないが、市販のもの、改良型、組換え体、野生型、天然には見られない変異体、及びそれらの混合物が含まれる。例えば、好適な酵素には、ヒドロラーゼ、クチナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、レダクターゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、ペクチナーゼ、ラクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、及びそれらの組み合わせが含まれる。ヒドロラーゼには、限定されるものではないが、プロテアーゼ（細菌性、真菌性、酸性、中性、又はアルカリ性）、アミラーゼ（α又はβ）、リパーゼ、マンナナーゼ、セルラーゼ、コラーゲナーゼ、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００３３】
本発明の製剤に含めるのに好適であると考えられるリパーゼには、英国特許第１，３７２，０３４号に開示されるシュードモナス・スタッツェリ ＡＴＣＣ１９．１５４；米国特許第５，３８９，５３６号に記載されるシュードモナス・メンドシナ、及び米国特許第５，１５３，１３５号に開示されるシュードモナス・シュードアルカリゲネスのようなシュードモナス属の微生物により産生されるものが含まれる。リパーゼには、微生物シュードモナス・フルオレッセンス ＩＡＭ１０５７によって産生されるリパーゼの抗体と陽性の免疫学的交差反応を示すものが更に含まれる。このリパ−ゼは、天野エンザイム株式会社、名古屋、日本から、リパ−ゼＰ「アマノ」の商品名で入手可能である。リパ−ゼには、Ｍ１リパ−ゼ（登録商標）及びＬｉｐｏｍａｘ（登録商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ ＮＶ、デルフト、オランダ）、並びにリポラ−ゼ（登録商標）（ノボザイムズＡ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、デンマーク）が含まれる。リパ−ゼは、通常、シリコーンマトリックス重量に対し、約０．０００１％〜約２％の活性酵素、又は約０．００１ｍｇ／ｇ〜約２０ｍｇ／ｇのレベルでシリコーンマトリックスに導入される。
【００３４】
プロテアーゼは、通常タンパク質又はペプチドのペプチド結合を切断するように作用するカルボニルヒドラーゼである。本明細書において、「プロテアーゼ」とは、天然プロテアーゼ又は組換えプロテアーゼを意味する。天然プロテアーゼには、α−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシルプロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼが含まれる。セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、及び酸プロテアーゼ、並びにエンドプロテアーゼ及びエクソプロテアーゼが含まれる。
【００３５】
プロテアーゼは、動物、植物、又は微生物由来であることができる。例えば、プロテアーゼは、細菌由来のセリンタンパク質分解酵素でよい。精製酵素を用いてもよいし、非精製酵素を用いてもよい。化学的に産生されたプロテアーゼ又は遺伝学的に修飾された変異体は、密接な構造的酵素変異体であるため、定義に含まれる。プロテアーゼの例として特に好ましいのは、バシラス属、例えばバシラス・サチリス、バシラス・レンタス、バシラス・アミロリケファシエンス、及び／又はバシラス・リシェニフォルミスから得た細菌性セリンタンパク質分解酵素、特にサブチラーゼ（ｓｕｂｔｉｌａｓｅ）である。本発明の組成物に含まれると考えられる好適な市販のタンパク質分解酵素には、アルカラーゼ（登録商標）、エスペラーゼ（登録商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（登録商標）、エバラーゼ（登録商標）、カンナーゼ（登録商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）、サビナーゼ（登録商標）、Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、及びＭａｘａｐｅｍ（登録商標）１５（タンパク質操作されたＭａｘａｃａｌ）；ピュラフェクト（登録商標）、プロペラーゼ（登録商標）（タンパク質操作されたピュラフェクト）、並びにサブチリシンＢＰＮ及びＢＰＮ’が含まれる。
【００３６】
プロテアーゼは、天然にみられないアミノ酸配列を有するプロテアーゼ変異体も包含し、このアミノ酸配列は、天然にみられない異なるアミノ酸配列に置換することによって前駆体プロテアーゼから生じ、米国特許第ＲＥ３４，６０６号；第５，７００，６７６号；第５，９７２，６８２号及び／又は第６，４８２，６２８号に記載のように、バシラス・アミロリケファシエンスのサブチリシンの番号付けによるところの＋７６、＋８７、＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５、及び／又は＋２７４から成る群より選択される位置と同等のプロテアーゼ内の位置でアミノ酸残基を異なるアミノ酸に置換することによって前駆体プロテアーゼから生じる。
【００３７】
例示的プロテアーゼ変異体には、米国特許第ＲＥ３４，６０６号に記載のようなバシラス・レンタス由来のサブチリシン変異体が含まれる。以後、これをプロテアーゼＡという。他の好適なプロテアーゼは、米国特許第５，７００，６７６号に記載のような、バシラス・アミロリケファシエンス由来のＹ２１７Ｌ変異体である。以後、これをプロテアーゼＢという。米国特許第６，４８２，６２８号に記載の修飾された細菌性セリンタンパク質分解酵素である、本明細書においてプロテアーゼＣというもの；及び米国特許第５，９７２，６８２号に記載の修飾された細菌性セリンタンパク質分解酵素であるプロテアーゼＤも好適である。米国特許第５，６７７，１６３号に記載のような枯草菌ＬＧ１２も好適である。
【００３８】
本発明の実施に有用な他のプロテアーゼは、サビナーゼ（登録商標）、エスペラーゼ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、ピュラフェクト（登録商標）、ＢＰＮ’、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテアーゼＣ、プロテアーゼＤ、及びそれらの混合物から成る群より選択することができる。プロテアーゼは、一般に、シリコーンマトリックスの約０．０１〜約０．５重量％、又は約０．１〜約１０．０ｍｇ／ｇ、好ましくは約０．１〜約５．０ｍｇ／ｇのレベルで本発明の製剤中に存在する。
【００３９】
本発明は上記の酵素に限定されないことを当業者は理解するであろう。１種以上の活性物質を本発明の局所用製剤に使用できることを当業者は更に理解するであろう。
【００４０】
活性物質は種々の機能を行うことができる。例えば、マトリックスは、局所的に壊死組織を除去し、一般的な創傷清拭をするためのプロテアーゼ及び他の酵素学的創傷清掃剤、血栓形成酵素及び血栓除去酵素、自己殺菌、抗感染、及び治癒促進のためにペルオキシド、過酸、活性酸素種、及び抗接着触媒アンタゴニストを産生する薬剤、並びに皮膚治療のための薬剤などを放出することができる。
【００４１】
本発明の製剤は、好適な量の成分を有することができる。例えば、外相は局所用製剤の約５０．０００％〜約９９．９９９％含めることができる。内相は約０．００１％〜約２．０００％の活性物質及び約０．００１％〜約４９．９９９％の親水性担体を含むことができる。界面活性剤を製剤に添加する場合、界面活性剤は約０．００１％〜約６０．０００％、より一般的には約０．１００％〜約５０．０００％含めることができる。親水性成分を添加する場合、親水性成分は製剤の約０．００１％〜約５０．０００％含めることができ、より一般的には親水性成分は局所用製剤の約５．０００％〜約４０．０００％含めることができる。他の態様では、親水性成分は製剤の約１０．０００％〜約３５．０００％含めることができる。更に他の態様では、親水性成分は製剤の約１５．０００％〜約３５．０００％含めることができる。
【００４２】
本発明の製剤は、活性物質を親水性成分溶液とともに含有するプロピレングリコール溶液のような親水性担体溶液を、回転ミキサーで約１５分間、約３０ｒｐｍで混合して内相を調製することにより作製することができる。シリコーンマトリックスやシリコーン系界面活性剤のような外相の成分は、予め混合して均一な混合物を得る。
【００４３】
内相と外相を個々に調整後、乳化又は分散の機械的操作を行うことができる。好ましくは、内相を外相に添加して、高剪断実験室用ミキサー、即ち角孔高剪断スクリーンを有するＳｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｌ４Ｒ（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社、Ｅａｓｔ Ｌｏｎｇｍｅａｄｏｗ、マサチューセッツ州から入手可能）で激しく撹拌する。こうした高剪断混合により、サイズ分布の非常に狭い直径約０．１〜５０μｍ、約０．１〜１０μｍ、及び約０．１〜５μｍの液滴を生ずる。混合物の撹拌は約５４００ｒｐｍで約９０秒間行うことができる。その後、得られた混合物を硬化させるため好適な容器に移してもよい。容器は、所望のバッチを提供するサイズ及び／又は形状のものであることができる。
【００４４】
あるいは、手で混合して包帯剤を調製することができる。本発明の他の態様によれば、内相と外相を上記のように調製し、内相を外相に添加する。次に、小さなへらで円運動を行うことによって混合物を容器内で約３０秒間激しく撹拌し、包帯剤を形成する。内相と外相を手で混合することにより、直径約１０〜約１０００μｍの内相液滴を生じ得る。
【００４５】
本発明の製剤は、皮膚に適用する前にフィルムに成型してもよいし、製剤がそこで重合する皮膚に直接適用してもよい。皮膚に適用する場合は「塗布剤付き」フィルムを重合し、本発明にしたがい、チューブ、小袋、ロールオン、スプレー、パッチ、包帯などからクリーム又は軟膏として送達してもよい。付加硬化物（ゲルに類似するが、シリカで強化されている）又は縮合硬化物、例えばダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から入手可能なダウ・コーニング（登録商標）７−５３００ ＦＩＬＭ−ＩＮ−ＰＬＡＣＥ ＣＯＡＴＩＮＧなどのシリコーンゴムを外相へ導入することによりフィルムを作製することができる。内相と混合することにより、得られるエマルジョンは硬化可能になり、皮膚に適用したとき重合し、プロテアーゼなどの活性物質を有効に放出する「塗布剤付き」フィルム、パッチ、又は包帯を提供する。エマルジョンを基材上に塗布して所望の厚さを達成することができる。本発明の包帯剤は好適な方法で調整することができ、調整方法は本明細書に記載のものに限定されないことが当業者に理解されるであろう。
【００４６】
本発明の軟膏は、ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から入手可能な、ダウ・コーニング（登録商標）９０４１ シリコーンエラストマーブレンドなどのシリコーンエラストマーと、ダウ・コーニング（登録商標）５２００ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ ＡＩＤなどのシリコーン系界面活性剤とをいっしょに撹拌して外相を形成し、作製することができる。内相は、活性物質溶液とＰＶＡのような親水性担体とをいっしょに混合することにより調製することができる。内相は、一定の撹拌で内相を外相にゆっくり添加することによって外相に導入することができる。
【００４７】
本発明の製剤は、所定の適用のために、活性物質放出速度を最適化するように調製できることが当業者に理解されるであろう。例えば、シリコーンマトリックスは活性物質放出速度を増加又は減少させるように選択することができる。ＰＶＡやＰＶＰのような親水性成分をシリコーンマトリックスに添加することによって活性物質放出速度を増すことができる。同様に、親水性担体の添加量を増加させることにより、活性物質放出速度を増すことができる。例えば、約５０重量％以下の親水性担体を用いて製剤を形成することができる。あるいは、活性物質放出速度を増加させるようにシリコーンマトリックスを選択することができる。例えば、架橋密度の小さいシリコーンマトリックスは、架橋密度の大きいシリコーンマトリックスよりも活性物質放出速度が速いであろう。
【００４８】
活性物質放出速度に影響を与えるために、包帯剤パッチの厚さを変化させてもよい。活性物質放出速度を増加させるには、パッチの厚さを下方に調製することができる。更に、空気に対してより密閉されるように包帯剤を調製することができる。包帯剤の密閉性が増加するにつれて、活性物質放出速度を増加させることができる。
【００４９】
同様に、創傷ベッドのパラメータは、活性物質放出速度を増加させたり減少させたりすることができる。例えば、創傷ベッドの水分量が増加するにつれて、活性物質放出速度も増加させることができる。あるいは、創傷ベッドの温度が上昇するにつれて、活性物質放出速度を増加させることができる。したがって、製剤のさまざまなパラメータは、創傷ベッドと包帯剤又は軟膏の条件との所定のセットに対し、活性物質が所望の放出速度で最適に送達されるように選択することができる。
【００５０】
一般に、製剤は、活性物質の活性が顕著に失われることなく所定の期間保存できる包帯剤又は軟膏を提供するように製剤化する必要がある。例えば、包帯剤又は軟膏は、その活性が、有効な割合よりも多く失われることなく、最大６カ月間、室温で安定であり得る。
【００５１】
上で議論したように、活性物質がシリコーンマトリックスから放出されて壊死組織を除去できるように製剤を調整することができる。製剤は、液体に対して密閉されることができ、この密閉性は、製剤によって覆われた領域の湿潤創傷環境を促進させることができる。湿潤創傷環境は、製剤に覆われた壊死組織の膨潤を可能にし、この膨潤は、活性物質がより有効的且つ選択的に膨潤壊死組織を除去することを可能にする。
【００５２】
本発明の１つの態様によれば、壊死組織を有する創傷周辺の領域に接着剤を適用させることができ、接着剤を用いて、創傷を覆うように製剤を接着させることができる。接着剤は、ダウ・コーニング（登録商標）ＰＳＡ ７−４４０２のような本明細書に記載のシリコーン系粘着剤、ＰＶＡのような親水性担体、及び壊死組織を除去するために選択された活性物質を阻害するように選択され、健常組織を保護する活性物質を含む、シリコーンマトリックスを含むことができる。本明細書に記載のように、活性物質は接着剤から放出されることができる。例えば、創傷を覆う製剤中の活性物質がプロテアーゼを含む場合、接着剤中の活性物質はプロテアーゼインヒビターであり得る。好適なプロテアーゼインヒビターの例としては、限定されるものではないが、セルピン、クニッツ、カザール中に見出されるもののようなセリンプロテアーゼインヒビター、及び白血球のプロテイナーゼ（ｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）類のインヒビターが含まれる。そのような好適なインヒビターは、Ｒ．Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔｓら、プロテイナーゼインヒビターの調節及び調節的役割、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．５（３−４）３８５−４３６（１９９５）に見出される。
【００５３】
本発明がより容易に理解されるために以下の実施例を参照するが、これらは本発明を具体的に示すことを意図したものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００５４】
シリコーンマトリックスからのプロテアーゼの徐放性を評価するために、第１の実験を行った。ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から市販されている、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー組成物（ダウ・コーニング（登録商標）９０４０）及びシリコーン系界面活性剤（ダウ・コーニング（登録商標）９０１１）を用いて、ダウ・コーニング（登録商標）９０４０及びダウ・コーニング（登録商標）９０４０／９０１１シリコーンエラストマー製剤を形成した。プロピレングリコールに溶解させた１．１ｍｇ／ｍｌのバシラス・レンタス由来プロテアーゼＡ保存溶液を２つのダウ・コーニング（登録商標）組成物へ添加した。５ｍｌの保存溶液サンプルを、２０ｇの９０４０製剤、及び１０ｇの９０４０製剤と１０ｇの９０１１製剤とを含む２０ｇの９０４０／９０１１製剤に添加した。酵素保存溶液の代わりに水と、９０４０とを含む対照、及び９０４０／９０１１とを含む対照を調製した。更に、シリコーンマトリックスの成分がプロテアーゼを阻害するか調べるため、等量のダウ・コーニング（登録商標）９０４０酵素製剤又は９０４０／９０１１酵素製剤と、プロテアーゼを含まず水を含む対照とを有する更なるサンプルを調製した。これらの阻害対照は、これらプロテアーゼ不含サンプルからアリコートを取り、酵素製剤サンプルからの等量のアリコートに加えることによって調製し、プロテアーゼ活性の阻害を観察した。次にサンプル物質をフード内で２週間空気乾燥させた。
【００５５】
ダウ・コーニング（登録商標）９０４０／９０１１製剤は薄いフィルムに乾燥させ、ダウ・コーニング９０４０（登録商標）組成物はケークに乾燥させた。Ｎ−スクシニル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）を用いて、Ｄｅｌｍａｒ，Ｅ．Ｇ．ら（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４、３１６−３２０；Ａｃｈｔｓｔｅｔｔｅｒ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ ２０７：４４５−５４（１９８１））に記載のように、プロテアーゼの標準アッセイでサンプルをアッセイした（ｐＨ６．５、２５℃）。アッセイは、ヒューレットパッカード８４５１Ａダイオードアッセイ分光光度計を用いて、４１０ｎｍにて、放出されたプロテアーゼをｍＡｂｓ／分の単位で測定した。この実施例１の結果を以下の表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
これらのデータは、シリコーンマトリックスからの５時間にわたるプロテアーゼの有効な放出を示している。２週間以上乾燥保存した材料からデータを得ている。プロテアーゼ不含シリコーン製剤の対照及び阻害対照を、プロテアーゼ含有シリコーン製剤と同量で同期間インキュベートした。阻害サンプルは、酵素製剤のプロテアーゼ活性よりも低いがほとんど一致したプロテアーゼ活性値を示している。結果は、追加の製剤を酵素サンプルに加えるとわずかに阻害化合物が存在し得ることを示している。
【実施例２】
【００５８】
シリコーンマトリックスからのプロテアーゼの除放性を評価するために、更なる実験を行った。０．８１ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＡのポリエチレングリコール保存溶液の０．５ｍｌアリコートを小さなポリプロピレン製秤量ボートに移した。次に、５．０ｍｌのシリコーンゴム組成物（ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００、ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州）をプロテアーゼ溶液に添加し、添加１５秒以内に混合した。ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００組成物は、「塗布剤付き」フィルム、パッチ、又は包帯としての適用を有することを意図している。次に混合物を３０分間硬化させた。硬化後、１．０ｍｌの蒸留水で混合物を３回洗浄した。上記のように、アリコートに対し、ＳＡＡＰＦｐＮＡアッセイを用いて各洗浄液についてアッセイし、洗浄液中の酵素量を測定した。次に組成物をその側面で１５分間乾燥させ、続いて平らにして更に１５分間乾燥させた。最後に、５．０ｍｌの蒸留水を秤量ボートに加え、数秒間緩やかにグルグルかき混ぜた。０時点に２００μｌのアリコートを取った。１時間ごとに２００μｌ取りながら、秤量ボートを持続的にグルグルかき混ぜた。
【００５９】
この実験の結果を図１に報告する。洗浄液中に９％のプロテアーゼ活性が回収され、４時間で３．８％のプロテアーゼがシリコーンマトリックスから放出された。
【００６０】
直前に記載した方法によって、シュードモナス・メンドシナ由来のリパ−ゼを用いて、ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００ シリコーンゴム組成物のリパーゼ放出を更に試験した。この実験の結果をｍＡｂｓ／分の単位で以下の表２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
洗浄液中に１８％のリパーゼ活性が回収され、９時間で２．２％のリパーゼが放出された。
【００６３】
図２Ａは、ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００ シリコーンゴム溶液からのプロテアーゼＡの放出／送達を表し、図２Ｂは、ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００ シリコーンゴム溶液からのリパ−ゼの放出／送達を表す。図は、添加した酵素のおよそ２〜４％が、長時間にわたり、シリコーンマトリックスから直線的に放出されたことを示している。
【実施例３】
【００６４】
シリコーンマトリックスからのプロテアーゼＡの徐放性に対する親水性添加剤の効果を評価するために、更に他の実験を行った。まず、試験包帯剤、より具体的には、プロテアーゼ含有パッチを、パッチの全量が一定（約２ｇ）であり、且つパッチ内の酵素濃度も一定（パッチ１ｇあたり約０．６ｍｇの薬剤）となるように、小さなペトリ皿（直径およそ３ｃｍ）の中で成型した。パッチは、ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から市販されている、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー組成物（ダウ・コーニング（登録商標）９０４０）及びシリコーン系界面活性剤（ダウ・コーニング（登録商標）９０１１）を含んでいた。また、ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００（シリコーンゴム組成物）も試験した。更に、製剤は、さまざまな量のＰＶＡ、高プロピレングリコールレベルでのＰＶＡ、又は撹拌によって加えたＰＶＰを含有していた。
【００６５】
２つの方法で酵素放出を評価した。第１の方法では、パッチを洗浄し、パッチ表面及びパッチ表面の非常に近くに存在し得る酵素を除去した。約１ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ５．４）を、ペトリ皿の試験パッチ表面に添加した。次に、バッファーを２０秒間グルグルかき混ぜ、分析用にバッファーを静かにエッペンドルフチューブに移した。洗浄工程を３回繰り返し、各洗浄液について酵素活性を測定した。洗浄工程中に放出された全酵素量を示すため、結果をまとめた。図３Ａ〜３Ｃにおいて、この酵素量には０時点が含まれている。
【００６６】
もう１つの方法は洗浄工程を含まない。約５ｍｌの溶解バッファーをピペットで試験パッチ表面に取り、ペトリ皿にフタをして蒸発をなくした。次に、試験パッチと溶解バッファーとを含有するペトリ皿を楕円ミキサー上で約７５ｒｐｍでグルグルかき混ぜ、酵素活性を分析するため、溶解バッファーの１０μｌアリコートを１時間ごとに取り出した。アッセイバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．６）を含有するキュベットに、ピペットでアリコートを直接取り、ＵＶ／可視分光計で酵素活性を測定し、溶解バッファー中の酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。
【００６７】
図３Ａは、さまざまな量のＰＶＡと高ＰＧ（プロピレングリコール）含量を有するダウ・コーニング（登録商標）９０４０／９０１１シリコーンマトリックスからの酵素放出を表す。図３Ａに見られるように、より多量の親水性ＰＶＡをシリコーンマトリックスに加えると、酵素放出速度が増加する。同様に、図３Ｂは、さまざまなＰＶＡレベルで、ダウ・コーニング（登録商標）７−５３００製剤から放出されたプロテアーゼＡの割合を表す。グラフからわかるように、ＰＶＡ量が増加すると放出速度が増加する。図３Ｃは、さまざまな量のＰＶＰを有するダウ・コーニング（登録商標）９０４０／９０１１シリコーンマトリックスからの酵素の放出を表す。図３Ｃに見られるように、親水性ＰＶＰをシリコーンマトリックスに加えると酵素放出速度が増加する。
【実施例４】
【００６８】
シリコーンマトリックスからのプロテアーゼＢの徐放性に対するシリコーンマトリックスの効果を評価するために、実験を行った。まず、試験包帯剤、より具体的には、プロテアーゼ含有パッチを、パッチの全量が一定（約２ｇ）であり、且つパッチ中の酵素濃度も一定（パッチ１ｇあたり約０．６ｍｇの薬剤）となるように、小さなペトリ皿（直径およそ３ｃｍ）中に成型した。パッチは、ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から市販されている、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー組成物（ダウ・コーニング（登録商標）９０４０）及びシリコーン系界面活性剤（ダウ・コーニング（登録商標）９０１１）を含んでいた。あるいは、パッチは、ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から入手可能な、ダウ・コーニング（登録商標）ＰＳＡ ７−４４０２粘着剤又はダウ・コーニング（登録商標）７−ＦＣ−４２１０細胞性エラストマーを含んでいた。更に、製剤は０％又は２０％のＰＶＡを含有していた。
【００６９】
２つの方法で酵素放出を評価した。第１の方法では、パッチを洗浄し、パッチ表面及びパッチ表面の非常に近くに存在し得る酵素を除去した。約１ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ５．４）を、ペトリ皿の試験パッチ表面に添加した。次に、バッファーを２０秒間グルグルかき混ぜ、分析用にバッファーをエッペンドルフチューブへ静かに移した。洗浄工程を３回繰り返し、各洗浄液について酵素活性を測定した。洗浄工程のあいだに放出された全酵素量を示すために結果をまとめる。図４において、この酵素量には０時点が含まれている。
【００７０】
もう１つの方法は洗浄工程を含まない。約５ｍｌの溶解バッファーをピペットで試験パッチ表面に取り、ペトリ皿にフタをして蒸発をなくした。次に、試験パッチと溶解バッファーとを含有するペトリ皿を楕円ミキサー上で約７５ｒｐｍでグルグルかき混ぜ、酵素活性を分析するために溶解バッファーの１０μｌのアリコートを１時間ごとに取り出した。アッセイバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．６）を含有するキュベットにアリコートをピペットで直接取り、ＵＶ／可視分光計で酵素活性を測定し、溶解バッファー中の酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。
【００７１】
図４は、この酵素放出試験の結果を表している。グラフからわかるように、ＰＳＡ ７−４４０２マトリックスは最大放出速度を示している。酵素の放出速度はシリコーンマトリックスの架橋密度に影響される。
【実施例５】
【００７２】
酵素放出速度に対するパッチ厚の効果を観察するために実験を行った。プロテアーゼＢ、７−５３００ シリコーン、及びＰＶＡのような他の成分を含有する試験製剤を乳化させた。製剤を、Ｂｌａｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ（ＵＶ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｐｐｌｙ社、シカゴ）を用いてマイラー（登録商標）シート上に塗布した。適用被覆の厚さは、刃とマイラー（登録商標）シートとのあいだのギャップを調整することによって制御した。被覆をそれぞれ１３及び２５μｍにした。被覆を完全に乾燥又は硬化させた後、直径２５ｍｍの試験ディスクをマイラー（登録商標）シートから切り出した。デジタル被覆厚計（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、マンチェスター、ＵＫ）を用いて被覆の最終乾燥厚を測定した。酵素ペイロードを正確に知るために、試験サンプルディスクの最終乾燥重量も測定した。マイラー（登録商標）単独の重量及び厚さを測定し、マイラー（登録商標）上のサンプルのそれから差し引いて、サンプル単独の重量及び厚さを出した。
【００７３】
フランツ型拡散セル（Ａｍｉｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｉｅｇｅｌｓｖｉｌｌｅ、ペンシルバニア州）を用いて酵素放出試験を行った。試験サンプルを拡散セルのトップにマウントし、予め３７℃に温めた１３．７ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）でセルを満たした。拡散セル内部にある空気泡を除去するように注意した。セルの撹拌速度を予め５０ｒｐｍにセットした。０．１ｍｌのサンプルアリコートを定期的な時間間隔で拡散セルから取り出し、酵素活性を分析し、活性酵素濃度をｍｇ／ｍｌの単位で得た。放出酵素の割合も計算した。
【００７４】
図５を参照してわかるように、放出速度はパッチ厚に反比例することがわかった。したがって、酵素の１００％放出は最も薄いパッチで達成された。
【実施例６】
【００７５】
軟膏製剤からのプロテアーゼ放出を試験するために実験を行った。ダウ・コーニング社（ミッドランド、ミシガン州）から入手可能な、シリコーンエラストマー ダウ・コーニング９０４１及びシリコーン系界面活性剤ダウ・コーニング５２００ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ ＡＩＤを含有する外相を調製することによって、試験軟膏製剤を調製した。プロテアーゼＢ保存溶液を含有する内相を調製した。更に、０又は２０％の４０％ＰＶＡ溶液を有するように内相を調製した。プロテアーゼＢ保存溶液は、活性酵素、ギ酸ナトリウム、塩化カルシウム、水、及びＰＧを含有していた。攪拌機を用いて内相と外相を混合した。軟膏は、軟膏１ｇあたり約３ｍｇの酵素を有していた。
【００７６】
軟膏製剤を調製後、Ｈａｎｓｅｎの軟膏セル（Ｈａｎｓｅｎ、Ｃｈａｔｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）を用いてその放出速度を測定し、製剤の安定性を決定した。およそ０．５ｇの軟膏を軟膏セルの軟膏投薬領域にロードした。０．４５μｍのＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ（登録商標）メンブラン（Ｐａｌｌ社、アナーバー、ミシガン州）を軟膏投薬表面に置き、軟膏セルを密閉した。次に軟膏セルを軟膏セルフラスコ内に置き、フラスコを２５ｍｌのｐＨ５．５バッファー溶液（１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ）で満たし、軟膏セルをバッファー溶液に沈めた。３０℃で試験を行い、へらを用いてバッファーを一定の５０ｒｐｍで撹拌した。１０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１６時間後、及び２４時間後、オートサンプラーで０．５ｍｌアリコートを取り出した。酵素活性をＵＶ／可視分光計で測定し、溶解バッファー中の酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。溶解試験を６回重複して行い、平均量を報告する。
【００７７】
図６によると、ＰＶＡ溶液を加えることにより、２４時間にわたって酵素が軟膏から部分的に放出される。軟膏が、皮膚を局所治療するために使用できる製剤を提供することは図６から明らかである。
【実施例７】
【００７８】
室温で保存した乾燥パッチ内の酵素の安定性を測定するために安定性試験を行った。保存後の酵素の放出は上記実施例で報告した初期放出データに匹敵し、保存のあいだ酵素は安定なままであることを示している。乾燥パッチを０〜６カ月間保存し、適切な時点で酵素放出を測定した。プロテアーゼＡ、９０４０／９０１１ シリコーン、及び他の成分を含有する試験製剤を乳化させた。試験製剤は、乾燥重量３．１２５０ｇのＤＣ−９０４０ シリコーン、乾燥重量３．２５００ｇのＤＣ−９０１１ シリコーン系界面活性剤、２．５ｍｇ／ｇのプロテアーゼＡ、及び乾燥重量４．２０００ｇのＰＶＡを含んでいた。Ｂｌａｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ（ＵＶ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｐｐｌｙ社、シカゴ）を用いて、製剤をマイラー（登録商標）シート上に塗布した。適用被覆の厚さは、刃とマイラー（登録商標）シートとのあいだのギャップを調整することによって制御した。被覆を完全に乾燥又は硬化させた後、直径２５ｍｍの試験ディスクをマイラー（登録商標）シートから切り出した。デジタル被覆厚計（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、マンチェスター、ＵＫ）を用いて被覆の最終乾燥厚を測定したところ、サンプルの厚さはおよそ１００μｍであった。酵素のペイロードを正確に知るために、試験サンプルディスクの最終乾燥重量も測定した。マイラー（登録商標）単独の重量及び厚さを測定し、マイラー（登録商標）上のサンプルのそれから差し引いて、サンプル単独の重量及び厚さを出した。
【００７９】
５０％プロピレングリコール中のプロテアーゼＡ保存溶液（４００ｐｐｍ塩化カルシウムを含有する５０％ギ酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５）を含む対照を調製した。対照を室温で保存し、保持された酵素活性をさまざまな時点で試験した。プロテアーゼＡ酵素は対照溶液中で安定であることが予想される。
【００８０】
自動サンプリング用付属品及び少量溶解キットを備えたＨａｎｓｏｎ（Ｈａｎｓｏｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）の溶解試験機を用いて酵素放出試験を行った。ゴムのりを用いて、サンプル（２５ｍｍ）と同一直径の３／１６”厚ガラスディスクに試験サンプルを固定した。次に、試験サンプル面を上向きにして、サンプルを溶解容器にロードした。２５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）を各サンプル表面に注ぎ、自動サンプラーチューブに沿った撹拌へらを直ちにバッファー内へ下げた。溶解容器にキャップをして蒸発を最小限にし、５０ｒｐｍ台で撹拌を開始した。自動サンプラーは、プログラムされた時点で０．５ｍｌ又は１ｍｌのアリコートを取り出し、上記ＳＡＡＰＦｐＮＡプロテアーゼアッセイでこれらのサンプルの酵素活性を分析し、活性酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。ある場合には、２８０ｎｍの吸収を測定し、適切な吸光係数を適用することにより、各時点の合計タンパク質も測定した。
【００８１】
図７には、０、１、３、及び６カ月間保存した９０４０／９０１１乾燥パッチのプロテアーゼＡの酵素安定性が表されている。各時点での６回の重複の平均からデータポイントを得ている。活性の喪失はシリコーンパッチよりも対照溶液のほうが大きい。したがって、シリコーンパッチは、酵素を保存し、続いて放出する、より安定な手段を提供する。
【実施例８】
【００８２】
室温で保存したＰＳＡ ７−４４０２を有する乾燥パッチ内での酵素の安定性を測定するために安定性試験を実施した。保存後の酵素の放出は上記実施例で報告した初期放出データに匹敵し、保存のあいだ酵素は安定なままであることを示している。乾燥パッチを０〜６カ月間保存し、適切な時点で酵素放出を測定した。プロテアーゼＢ、ＰＳＡ ７−４４０２ シリコーン、及び他の成分を含有する試験製剤を乳化させた。試験製剤は、乾燥重量３３．７５００ｇのＰＳＡ ７−４４０２ シリコーン、乾燥重量２．３５００ｇのＤＣ１９３フルイド（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）、３．８６１２ｍｇ／ｇのプロテアーゼＢ、及び乾燥重量９．４１００ｇのＰＶＡを含む。Ｂｌａｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ（ＵＶ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｐｐｌｙ社、シカゴ）を用いて、製剤をマイラー（登録商標）シート上に塗布した。適用被覆の厚さは、刃とマイラー（登録商標）シートとのあいだのギャップを調整することによって制御した。被覆を完全に乾燥又は硬化させた後、直径２５ｍｍの試験ディスクをマイラー（登録商標）シートから切り出した。デジタル被覆厚計（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、マンチェスター、ＵＫ）を用いて被覆の最終乾燥厚を測定したところ、サンプルの厚さはおよそ１００μｍであった。酵素ペイロードを正確に知るために、試験サンプルディスクの最終乾燥重量も測定した。マイラー（登録商標）単独の重量及び厚さを測定し、マイラー（登録商標）上のサンプルのそれから差し引いて、サンプル単独の重量及び厚さを出した。
【００８３】
５０％プロピレングリコール中のプロテアーゼＢ保存溶液（４００ｐｐｍ塩化カルシウムを含有する５０％ギ酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５）を含む対照を調製した。対照を室温で保存し、保持された酵素活性をさまざまな時点で試験した。プロテアーゼＢ酵素は対照溶液中で安定であると予想される。
【００８４】
自動サンプリング用付属品と少量溶解キットを備えたＨａｎｓｏｎ（Ｈａｎｓｏｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）の溶解試験機を用いて酵素放出試験を行った。ゴムのりを用いて、試験サンプルをサンプル（２５ｍｍ）と同一直径の３／１６”厚ガラスディスクに固定した。次に、試験サンプル面を上向きにして、サンプルを溶解容器にロードした。２５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）を各サンプル表面に注ぎ、自動サンプラーチューブに沿った撹拌へらを直ちにバッファー内に下げた。溶解容器にキャップをして蒸発を最小限にし、５０ｒｐｍ台で撹拌を開始した。自動サンプラーは、０．５ｍｌ又は１ｍｌのアリコートをプログラムされた時点で取り出し、上記ＳＡＡＰＦｐＮＡプロテアーゼアッセイでこれらのサンプルの酵素活性を分析し、活性酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。ある場合には、２８０ｎｍの吸収を測定し、適切な吸光係数を適用することによって、各時点の合計タンパク質も測定した。
【００８５】
図８によると、０、１、３、及び６カ月間保存したＰＳＡ ７−４４０２乾燥パッチのプロテアーゼＢの酵素安定性が表されている。各時点での６回の重複の平均からデータポイントを得ている。シリコーンパッチは、酵素を保存し、続いて放出する安定な手段を提供する。しかしながら、放出されたプロテアーゼＢの割合は、プロテアーゼＢ対照溶液中に保持された活性の割合よりも少ない。
【実施例９】
【００８６】
室温で保存したＰＳＡ ７−４４０１を有する乾燥パッチ内での酵素の安定性を測定するために安定性試験を行った。保存後の酵素の放出は上記実施例で報告した初期放出データに匹敵し、保存のあいだ酵素は安定なままであることを示している。乾燥パッチを０〜３カ月間保存し、適切な時点で酵素放出を測定した。プロテアーゼＢ、ＰＳＡ ７−４４０１ シリコーン、及び他の成分を含有する試験製剤を乳化させた。試験製剤は、乾燥重量３３．９０８８ｇのＰＳＡ ７−４４０１ シリコーン、乾燥重量２．３５００ｇのＤＣ１９３フルイド、３．８７２３ｍｇ／ｇのプロテアーゼＢ、及び乾燥重量９．６１７０ｇのＰＶＡを含む。Ｂｌａｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ（ＵＶ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｐｐｌｙ社、シカゴ）を用いて、製剤をマイラー（登録商標）シート上に塗布した。適用被覆の厚さは、刃とマイラー（登録商標）シートとのあいだのギャップを調整することによって制御した。被覆を完全に乾燥又は硬化させた後、直径２５ｍｍの試験ディスクをマイラー（登録商標）シートから切り出した。デジタル被覆厚計（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、マンチェスター、ＵＫ）を用いて被覆の最終乾燥厚を測定したところ、サンプルの厚さはおよそ１００μｍであった。酵素ペイロードを正確に知るために、試験サンプルディスクの最終乾燥重量も測定した。マイラー（登録商標）単独の重量及び厚さを測定し、マイラー（登録商標）上のサンプルのそれから差し引いて、サンプル単独の重量及び厚さを出した。
【００８７】
５０％プロピレングリコール中のプロテアーゼＢ保存溶液（４００ｐｐｍ塩化カルシウムを含有する５０％ギ酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５）を含む対照を調整した。対照を室温で保存し、保持された酵素活性をさまざまな時点で試験した。
【００８８】
自動サンプリング用付属品と少量溶解キットを備えたＨａｎｓｏｎ（Ｈａｎｓｏｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）の溶解試験機を用いて酵素放出試験を行った。ゴムのりを用いて、試験サンプルをサンプル（２５ｍｍ）と同一直径の３／１６”厚ガラスディスクに固定した。次に、試験サンプル面を上向きにして、サンプルを溶解容器にロードした。２５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）を各サンプルの表面に注ぎ、自動サンプラーチューブに沿った撹拌へらを直ちにバッファーに下げた。溶解容器にキャップをして蒸発を最小限にし、５０ｒｐｍ台で撹拌を開始した。自動サンプラーは、０．５ｍｌ又は１ｍｌのアリコートをプログラムされた時点で取り出し、上記ＳＡＡＰＦｐＮＡプロテアーゼアッセイでこれらのサンプルの酵素活性を分析し、活性酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。ある場合には、２８０ｎｍの吸収を測定し、適切な吸光係数を適用することによって、各時点の合計タンパク質も測定した。
【００８９】
図９によると、０、１、及び３カ月間保存したＰＳＡ ７−４４０１乾燥パッチから放出されたプロテアーゼＢの酵素安定性が表されている。各時点での６回の重複の平均からデータポイントを得ている。シリコーンパッチは、酵素を保存し、続いて放出する安定な手段を提供する。しかしながら、放出されたプロテアーゼＢの割合は、プロテアーゼＢ対照溶液中に保持された活性の割合よりも少ない。
【実施例１０】
【００９０】
室温で保存した７−ＦＣ ４２１０を有する乾燥パッチ内での酵素の安定性を測定するために安定性試験を行った。保存後の酵素の放出は上記実施例で報告した初期放出データに匹敵し、保存のあいだ酵素は安定なままであることを示している。乾燥パッチを０〜１カ月間保存し、適切な時点で酵素放出を測定した。プロテアーゼＢ、７−ＦＣ ４２１０ 基剤及び硬化剤シリコーン、並びに他の成分を含有する試験製剤を乳化させた。試験製剤は、乾燥重量３６．００００ｇの７−ＦＣ ４２１０ 基剤シリコーン、乾燥重量７．２０００ｇの７−ＦＣ ４２１０硬化剤、乾燥重量４．０８０００ｇのＤＣ２２５ ジメチコーンフルイド（ダウ・コーニング社、ミッドランド、ミシガン州から入手可能）、４．２００６ｍｇ／ｇのプロテアーゼＢ、及び乾燥重量１２．２８８０ｇのＰＶＡを含んでいた。Ｂｌａｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｏｒ（ＵＶ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｕｐｐｌｙ社、シカゴ）を用いて製剤をマイラー（登録商標）シート上に塗布した。適用被覆の厚さは、刃とマイラー（登録商標）シートとのあいだのギャップを調整することによって制御した。被覆を完全に乾燥又は硬化させた後、直径２５ｍｍの試験ディスクをマイラー（登録商標）シートから切り出した。デジタル被覆厚計（Ｅｌｃｏｍｅｔｅｒ、マンチェスター、ＵＫ）を用いて被覆の最終乾燥厚を測定したところ、サンプルの厚さはおよそ１００μｍであった。酵素ペイロードを正確に知るために、試験サンプルディスクの最終乾燥重量も測定した。マイラー（登録商標）単独の重量及び厚さを測定し、マイラー（登録商標）上のサンプルのそれから差し引いて、サンプル単独の重量及び厚さを出した。
【００９１】
５０％プロピレングリコール中のプロテアーゼＢ保存溶液（４００ｐｐｍ塩化カルシウムを含有する５０％ギ酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５）を含む対照を調製した。対照を室温で保存し、保持された酵素活性をさまざまな時点で試験した。
【００９２】
自動サンプリング用付属品と少量溶解キットを備えたＨａｎｓｏｎ（Ｈａｎｓｏｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）の溶解試験機を用いて酵素放出試験を行った。ゴムのりを用いて、試験サンプルをサンプル（２５ｍｍ）と同一直径の３／１６”厚ガラスディスクに固定した。次に、試験サンプル面を上向きにして、サンプルを溶解容器内にロードした。２５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）を各サンプルの表面に注ぎ、自動サンプラーチューブに沿った撹拌へらを直ちにバッファー内へ下げた。溶解容器にキャップをして蒸発を最小限にし、５０ｒｐｍ台で撹拌を開始した。自動サンプラーは、０．５ｍｌ又は１ｍｌのアリコートをプログラムされた時点で取り出し、上記ＳＡＡＰＦｐＮＡプロテアーゼアッセイでこれらのサンプルの酵素活性を解析し、活性酵素濃度をｍｇ／ｍｌで得た。ある場合には、２８０ｎｍの吸収を測定し、適切な吸光係数を適用することによって、各時点の合計タンパク質も測定した。
【００９３】
図１０によると、０及び１カ月間保存した７−ＦＣ ４２１０乾燥パッチから放出されたプロテアーゼＢの酵素安定性が表されている。各時点での６回の重複の平均からデータポイントを得ている。シリコーンパッチは、酵素を保存し、続いて放出する安定な手段を提供する。しかしながら、放出されたプロテアーゼＢの割合は、プロテアーゼＢ対照溶液中に保持された活性の割合よりも少ない。
【実施例１１】
【００９４】
創面清掃に好適な酵素の有効性を試験するために、不要な痂皮をｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして用いた。痂皮とは、創傷又は壊疽から取れたかさぶたの死滅組織である。酵素は、外科用メス又は他の鋭敏な手術器具を利用する鋭い創面清掃のための設備が限られ又は使用できない患者に、創傷の鋭い創面清掃の代替方法を提供する。ヒト糖尿病患者に生じる脚の壊疽の鋭い創面清掃から不要な痂皮を得た。
【００９５】
創面清掃当日に２枚の大きな痂皮片を得、２片に分けた。更に、２片をそれぞれ３つの部分に細かく分けた。３×３の細かいメッシュガーゼパッドを６枚のペトリ皿のそれぞれに入れ、ペトリ皿を秤量した。痂皮の１部分を各ガーゼパッド上に置き、ペトリ皿を再秤量した。ペトリ皿とガーゼの重量を、ペトリ皿、ガーゼ及び痂皮の重量から差し引いて、痂皮の乾燥重量を得た。２０ｍｌの市販のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をそれぞれのペトリ皿に加えた。６枚のペトリ皿のうちの２枚を、ＰＢＳと最初の２片の痂皮のそれぞれに由来する痂皮サンプルのみを有する対照とした。６枚のペトリ皿のうちの次の２枚の中のＰＢＳは、２０ｍｌのＰＢＳ中に２５０μｇのヒストリチクス菌由来のタンパク質分解コラーゲナーゼ（シグマ）を含有した。最後の２枚のペトリ皿の中のＰＢＳ溶液は、それぞれ２０ｍｌのＰＢＳ中に２５０μｇのＧｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のプロテアーゼＢサブチリシン酵素を含有した。
【００９６】
次に、痂皮を有するガーゼパッドを、ＰＢＳ溶液中に４８時間浸した。４８時間後、サンプルを検査し、４枚の酵素サンプルペトリ皿のそれぞれと同一の、２０ｍｌのＰＢＳ中に２５０μｇの酵素サンプルを含む各ペトリ皿に、２度目の２０ｍｌ量ＰＢＳを加えた。更に４８時間の浸漬後、各ペトリ皿の痂皮を、新しいペトリ皿中の新しい３×３ガーゼパッドに移した。ペトリ皿を秤量した。
【００９７】
表３に、６つのサンプルの重量変化を示す。全てのサンプルは、おそらく痂皮が液体を吸収したために膨張して、９６時間後には重くなっていた。コラーゲナーゼサンプルは、おそらく痂皮の分解により、重量増加の割合が低かった。プロテアーゼサンプルも、おそらく痂皮の分解により、重量増加の割合が低かった。
【００９８】
【表３】
【００９９】
痂皮の構造的完全性における変化の目視観察を９６時間に行い、分解を確認した。プロテアーゼ処理サンプルでは、痂皮がいくぶんゼラチン状になり、ある場合には、ＰＢＳで洗浄すると、痂皮が完全に分解した。対照とコラーゲナーゼで処理した痂皮サンプルは、ゼラチン化せず、ＰＢＳで洗浄しても分解しなかった。
【０１００】
本発明の範囲を逸脱することなくさまざまな改変がなされ得ることが当業者には明らかであり、明細書に記載されたものに限定することを意図するものではない。
【実施例１２】
【０１０１】
創面清掃に好適な多くの酵素の有効性を比較するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を行った。脚の糖尿病性壊疽の痂皮及び模擬洗浄を用いて創傷条件を模倣した。以下のプロトコールにしたがい実験を行った。
【０１０２】
フタ付きの小さなペトリ皿にラベルして秤量した。次に、２インチ四方のガーゼパッドを各ペトリ皿に加え、ペトリ皿を再秤量した。次に、脚の糖尿病性壊疽の痂皮を、ナイフ又はハサミを用いて視覚的に同等の部分に分けた。ペトリ皿中のガーゼパッド上のサンプルを試験秤量した。サンプルの差が互いに１０％又は０．１ｇ以内である場合は次の工程を行った。サンプルの差が互いに１０％又は０．１ｇ以内でない場合は、１０％又は０．１ｇ以内になるまで重量に基づいて再区分化した。
【０１０３】
次に、ペトリ皿中のガーゼパッド上の痂皮を秤量した。ＰＢＳ溶液（０．００２％アジ化ナトリウムを添加したダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社）中の適量の酵素をガーゼパッドに加え、２５０μｇの酵素を導入した。１０ｍｌのＰＢＳ溶液を直ちに加えた。ペトリ皿にカバーをして滅菌フードに移した。理想的には、この１０ｍｌのＰＢＳナトリウムは、適切な混合を保証するために、酵素がガーゼパッドに吸収された地点に加える必要がある。ペトリ皿を滅菌フード内で４８時間、室温でインキュベートした。
【０１０４】
４８時間後、パッドを排水（パッドをペトリ皿の側面に接触させて過剰の液体を排出する）し、滅菌フィルターフラスコ内の０．２２μｍフィルターに移して真空にし、解放した。パッドは乾燥してフィルターに接着していた。ペトリ皿中の残存反応混合物１ｍｌを取り、４８時間におけるＡ２８０解析のためにエッペンドルフチューブに入れた。
【０１０５】
エッペンドルフチューブ内のサンプルを、サンプルの吸収が直線状の０．０〜２．０吸収単位の範囲になるまでＰＢＳ溶液で希釈し、Ａ２８０解析を行った。アマシャム・バイオサイエンス Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３１００ｐｒｏ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を用いて、２８０ｎｍで解析を行った。Ａ２８０解析は、酵素が痂皮を加水分解し、遊離アミノ酸又は可溶性ペプチドを、加水分解された痂皮から残存反応混合物へ放出するかどうかの指標を提供する。
【０１０６】
サンプルがガーゼパッドから洗浄除去されないようにして、３０ｍｌのＰＢＳ溶液を痂皮サンプルに注いだ。ガーゼパッド及び痂皮サンプルをフィルターフラスコから取り出し、第２のラベルしたペトリ皿に入れた。洗浄液をボトル内に保存し、ボトルにねじぶたをした。フィルターユニットを廃棄した。この洗浄工程は、酵素適用中及び適用後の創傷の洗浄をまねた。
【０１０７】
酵素の第２の適用が提供された。適量の酵素をガーゼパッドに加えて２５０μｇの酵素を導入した。１０ｍｌのＰＢＳ溶液を、酵素がガーゼに吸収された地点の近傍に直ちに加えた。ペトリ皿にカバーをして滅菌フードに移した。ペトリ皿を更に４８時間インキュベートした。
【０１０８】
４８時間後、パッドを排水（パッドをペトリ皿の側面に接触させて過剰の液体を排出する）し、滅菌フィルターフラスコ内の０．２２μｍフィルターに移して真空にし、解放した。パッドは乾燥してフィルターに接着していた。ペトリ皿中の残存反応混合物１ｍｌを取り、９６時間におけるＡ２８０解析のためにエッペンドルフチューブに入れた。
【０１０９】
サンプルがガーゼパッドから洗浄除去されないようにして、３０ｍｌのＰＢＳ溶液を痂皮サンプルに注いだ。ガーゼパッド及び痂皮サンプルをフィルターフラスコから取り出し、第３のラベルして秤量したペトリ皿に入れた。洗浄液をボトル内に保存し、ボトルにねじぶたをした。フィルターユニットを廃棄した。
【０１１０】
ガーゼパッドを有するペトリ皿をフード内に一晩放置し、その後秤量した。ガーゼ＋痂皮の重量を計算した。ガーゼパッド＋痂皮を、更に２４時間後に再秤量した。
【０１１１】
ＰＢＳ及び痂皮サンプルのみのブランクについて実験を行った。ヒストリチクス菌由来のタンパク質分解コラーゲナーゼ（シグマ）を用いた。更に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のプロテアーゼＢサブチリシン酵素を用いた。
【０１１２】
表４に、サンプルに酵素と洗浄を供した前後の痂皮サンプルの重量を示す。表からわかるように、プロテアーゼＢは、最も効率的に痂皮を分解したようである。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
表５は、残存反応混合物の４８時間及び９６時間におけるＡ２８０解析の結果を示す。表からわかるように、より多くの遊離アミノ酸がプロテアーゼＢサンプル中に存在していた。したがって、プロテアーゼＢは、痂皮の分解に、より効率的なようである。
【０１１５】
【表５】
【実施例１３】
【０１１６】
実施例１２に概説したようにして更なる実験を行った。ＰＢＳ及び痂皮サンプルのみのブランクについて実験を行った。ヒストリチクム菌由来のタンパク質分解コラーゲナーゼ（シグマ）を用いた。更に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のプロテアーゼＢサブチリシン酵素を用いた。
【０１１７】
表６は、残存反応混合物の４８時間及び９６時間におけるＡ２８０解析の結果を示す。表からわかるように、より多くの遊離アミノ酸がプロテアーゼＢサンプル中に存在していた。したがって、プロテアーゼＢは、痂皮の分解に、より効率的なようである。
【０１１８】
【表６】
【実施例１４】
【０１１９】
実施例１２に概説したようにして更なる実験を行った。ＰＢＳ及び痂皮サンプルのみのブランクについて実験を行った。Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のプロテアーゼＢサブチリシン酵素を用いた。更に、本明細書に援用される米国特許第５，６７７，１６３号に記載の枯草菌ＬＧ１２を用いた。
【０１２０】
表７に、残存反応混合物の４８時間及び９６時間におけるＡ２８０解析の結果を示す。表からわかるように、より多くの遊離アミノ酸がＬＧ１２溶液中に存在していた。したがって、ＬＧ１２は、痂皮の分解に、より効率的なようである。
【０１２１】
【表７】
【実施例１５】
【０１２２】
プロテアーゼＢ及び７−５３００ シリコーンを含有するウエハーを実施例５にしたがい調製した。更に、７−５３００ シリコーンを含む対照ウエハーを調製した。ウエハーを１．６％カゼインアガー培地プレート上におき、３７℃で１時間インキュベートした。プロテアーゼＢを含有するウエハーはスキムミルクを加水分解し、アガーが消失した。対照ウエハーはスキムミルクを溶解せず、消失を示さなかった。
【実施例１６】
【０１２３】
プロテアーゼＢ及びＰＳＡ７−４４０２ シリコーンを含有するパッチを実施例８にしたがい調製した。パッチを１３カ月間室温で保存した。パッチを１．６％カゼインアガー培地プレート上におき、３７℃で１時間インキュベートした。パッチはスキムミルクを加水分解し、少量のアガーが消失した。次に、プレートを３７℃で一晩インキュベートしたところ、パッチは更にスキムミルクを加水分解して、実施例１５の７−５３００ プロテアーゼＢパッチとほぼ同量の消失を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、本発明の態様による製剤からのプロテアーゼ徐放性放出のチャートである。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の態様による製剤からのプロテアーゼの放出／送達を示すチャートである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の態様による製剤からのリパーゼの放出／送達を示すチャートである。
【図３Ａ】図３Ａは、さまざまな量の親水性成分を有する製剤からのプロテアーゼ放出を示すチャートである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、さまざまな量の親水性成分を有する製剤からのプロテアーゼ放出を示すチャートである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、さまざまな量の親水性成分を有する製剤からのプロテアーゼ放出を示すチャートである。
【図４】図４は、さまざまなシリコーンマトリックスを有する製剤からのプロテアーゼ放出速度を示すチャートである。
【図５】図５は、さまざまな厚さのパッチを有する製剤からのプロテアーゼ放出速度を示すチャートである。
【図６】図６は、本発明の態様による軟膏製剤からのプロテアーゼ放出を示すチャートである。
【図７】図７は、本発明の態様による製剤におけるプロテアーゼの安定性を示すチャートである。
【図８】図８は、本発明の他の態様による製剤におけるプロテアーゼの安定性を示すチャートである。
【図９】図９は、本発明の更に他の態様による製剤におけるプロテアーゼの安定性を示すチャートである。
【図１０】図１０は、本発明の態様による製剤におけるプロテアーゼの安定性を示すチャートである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内相及び外相を含む局所用製剤であって：内相は外相内に分散しており；内相は、少なくとも１つの親水性担体及び壊死組織を除去するために外相から放出可能な少なくとも１つの活性物質を含み；外相はシリコーンマトリックスを含み；皮膚に適用したときに湿潤環境を促進させるために液体に対して密閉されている、前記局所用製剤。
【請求項２】
少なくとも１つの活性物質が親水性である、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項３】
内相は外相内に分散している液滴で構成され、液滴の直径は約０．１〜約２０００μｍ、又は約０．１〜約１０００μｍ、又は約０．１〜約５００μｍである、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項４】
液滴の直径が約０．１〜約２００μｍ、又は約０．１〜約１００μｍ、又は約０．１〜約５０μｍ、又は約０．１〜約１０μｍ、又は約０．１〜約５μｍである、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項５】
少なくとも１つの親水性担体が、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、グリセリン、アルコール、多価アルコール、及び水、並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項６】
少なくとも１つの親水性担体がポリプロピレングリコールを含む、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項７】
少なくとも１つの親水性担体が局所用製剤の約５０重量％以下で含まれる、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項８】
少なくとも１つの活性物質が、ヒドロラーゼ、クチナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、レダクターゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、ペクチナーゼ、ラクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ポリペプチド、抗体、ペプチド、ホルモン、サイトカイン、及び成長因子、並びにそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素を含む、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項９】
少なくとも１つの活性物質が少なくとも１つのヒドロラーゼを含む、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項１０】
ヒドロラーゼがリパーゼ及びプロテアーゼから選択される、請求項９に記載の局所用製剤。
【請求項１１】
プロテアーゼが、サブチリシンプロテアーゼ、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、又はＬＧ１２から選択される、請求項１０に記載の局所用製剤。
【請求項１２】
ヒドロラーゼがリパーゼを含み、リパーゼがシリコーンマトリックスの約０．０００１〜約０．２重量％で含まれる、請求項９に記載の局所用製剤。
【請求項１３】
ヒドロラーゼがプロテアーゼを含み、プロテアーゼ濃度が局所用製剤の約０．１〜約５．０ｍｇ／ｇである、請求項９に記載の局所用製剤。
【請求項１４】
内相が少なくとも１つの親水性成分を更に含む、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項１５】
少なくとも１つの親水性成分が、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項１４に記載の局所用製剤。
【請求項１６】
少なくとも１つの親水性成分が、内相の約５０重量％以下、又は約３５重量％以下で含まれる、請求項１５に記載の局所用製剤。
【請求項１７】
少なくとも１つの親水性成分が、局所用製剤の約５〜約４０重量％、又は約１０〜約３５重量％、又は約１５〜約３５重量％で含まれる、請求項１４に記載の局所用製剤。
【請求項１８】
少なくとも１つの親水性成分が、水性増粘剤を含む、請求項１４に記載の局所用製剤。
【請求項１９】
シリコーンマトリックスが、高分子量ポリジメチルシロキサン、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー、充填剤のないエラストマー、細胞性エラストマー、シリコーンゴム、シリコーン系粘着剤、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項２０】
外相がシリコーン系界面活性剤を更に含む、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項２１】
内相及び外相が、局所用製剤が局所包帯剤を構成するように選択され、局所包帯剤はパッチを構成する、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項２２】
パッチの厚さが約２５μｍ以下である、請求項２１に記載の局所用製剤。
【請求項２３】
外相がゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマーを含む、請求項２１に記載の局所用製剤。
【請求項２４】
内相がプロピレングリコール及びプロテアーゼを含む、請求項２３に記載の局所用製剤。
【請求項２５】
内相が、ポリビニルアルコール及びポリビニルプロピレンから選択される親水性成分を更に含む、請求項２４に記載の局所用製剤。
【請求項２６】
内相及び外相が、局所用製剤が局所包帯剤を構成するように選択され、局所包帯剤は塗布剤付きフィルムを構成する、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項２７】
外相がシリコーンゴムを含む、請求項２６に記載の局所用製剤。
【請求項２８】
内相及び外相が、局所用製剤が軟膏を構成するように選択される、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項２９】
外相が、少なくとも１つのシリコーンエラストマー及び少なくとも１つのシリコーン系界面活性剤を含む、請求項２８に記載の局所用製剤。
【請求項３０】
内相が活性物質及びプロピレングリコールを含む、請求項２９に記載の局所用製剤。
【請求項３１】
内相がポリビニルアルコールを更に含む、請求項３０に記載の局所用製剤。
【請求項３２】
活性物質を局所的に提供する方法であって：
内相及び外相を含む、液体に対して密閉された局所用製剤を提供し、ここで、内相は外相内に分散しており、内相は少なくとも１つの親水性担体及び壊死組織を除去するために外相から放出可能な少なくとも１つの活性物質を含み、外相はシリコーンマトリックスを含む；
活性物質がシリコーンマトリックスから患者の皮膚に局所的に放出されるように局所用製剤を患者の皮膚に接触させる、
ことを含む、前記方法。
【請求項３３】
内相は親水性成分を更に含み、親水性成分は、活性物質が所望の速度でシリコーンマトリックスから放出されるように選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
局所用製剤は厚みを有するパッチを構成し、パッチの厚さは、活性物質が所望の速度でシリコーンマトリックスから放出されるように選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
液体に対する密閉性は、局所用製剤に覆われた壊死組織の膨潤を可能にする湿潤環境を促進させて、壊死組織が膨潤し；そして、シリコーンマトリックスから放出される活性物質は、膨潤した壊死組織を選択的に除去する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
内相及び外相を含む第２の局所用製剤を提供し、ここで、内相は外相内に分散しており、内相は少なくとも１つの親水性担体と壊死組織を除去するために選択された活性物質を阻害するように選択された少なくとも１つの第２の活性物質とを含み、外相はシリコーン接着剤を含むシリコーンマトリックスを含む；
第２の局所用製剤を、患者の皮膚にある創傷周辺の皮膚におき；そして
局所用製剤を第２の局所用製剤に接触させることによって局所用製剤を創傷に接着させ、創傷周辺の患者の皮膚は、壊死組織を除去するために選択された活性物質から保護される、
ことを更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項１】
内相及び外相を含む局所用製剤であって：内相は外相内に分散しており；内相は、少なくとも１つの親水性担体及び壊死組織を除去するために外相から放出可能な少なくとも１つの活性物質を含み；外相はシリコーンマトリックスを含み；皮膚に適用したときに湿潤環境を促進させるために液体に対して密閉されている、前記局所用製剤。
【請求項２】
少なくとも１つの活性物質が親水性である、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項３】
内相は外相内に分散している液滴で構成され、液滴の直径は約０．１〜約２０００μｍ、又は約０．１〜約１０００μｍ、又は約０．１〜約５００μｍである、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項４】
液滴の直径が約０．１〜約２００μｍ、又は約０．１〜約１００μｍ、又は約０．１〜約５０μｍ、又は約０．１〜約１０μｍ、又は約０．１〜約５μｍである、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項５】
少なくとも１つの親水性担体が、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、グリセリン、アルコール、多価アルコール、及び水、並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項６】
少なくとも１つの親水性担体がポリプロピレングリコールを含む、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項７】
少なくとも１つの親水性担体が局所用製剤の約５０重量％以下で含まれる、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項８】
少なくとも１つの活性物質が、ヒドロラーゼ、クチナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、レダクターゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、ペクチナーゼ、ラクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ポリペプチド、抗体、ペプチド、ホルモン、サイトカイン、及び成長因子、並びにそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの酵素を含む、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項９】
少なくとも１つの活性物質が少なくとも１つのヒドロラーゼを含む、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項１０】
ヒドロラーゼがリパーゼ及びプロテアーゼから選択される、請求項９に記載の局所用製剤。
【請求項１１】
プロテアーゼが、サブチリシンプロテアーゼ、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、又はＬＧ１２から選択される、請求項１０に記載の局所用製剤。
【請求項１２】
ヒドロラーゼがリパーゼを含み、リパーゼがシリコーンマトリックスの約０．０００１〜約０．２重量％で含まれる、請求項９に記載の局所用製剤。
【請求項１３】
ヒドロラーゼがプロテアーゼを含み、プロテアーゼ濃度が局所用製剤の約０．１〜約５．０ｍｇ／ｇである、請求項９に記載の局所用製剤。
【請求項１４】
内相が少なくとも１つの親水性成分を更に含む、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項１５】
少なくとも１つの親水性成分が、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項１４に記載の局所用製剤。
【請求項１６】
少なくとも１つの親水性成分が、内相の約５０重量％以下、又は約３５重量％以下で含まれる、請求項１５に記載の局所用製剤。
【請求項１７】
少なくとも１つの親水性成分が、局所用製剤の約５〜約４０重量％、又は約１０〜約３５重量％、又は約１５〜約３５重量％で含まれる、請求項１４に記載の局所用製剤。
【請求項１８】
少なくとも１つの親水性成分が、水性増粘剤を含む、請求項１４に記載の局所用製剤。
【請求項１９】
シリコーンマトリックスが、高分子量ポリジメチルシロキサン、ゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマー、充填剤のないエラストマー、細胞性エラストマー、シリコーンゴム、シリコーン系粘着剤、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項２０】
外相がシリコーン系界面活性剤を更に含む、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項２１】
内相及び外相が、局所用製剤が局所包帯剤を構成するように選択され、局所包帯剤はパッチを構成する、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項２２】
パッチの厚さが約２５μｍ以下である、請求項２１に記載の局所用製剤。
【請求項２３】
外相がゆるく又は軽く架橋したシリコーンエラストマーを含む、請求項２１に記載の局所用製剤。
【請求項２４】
内相がプロピレングリコール及びプロテアーゼを含む、請求項２３に記載の局所用製剤。
【請求項２５】
内相が、ポリビニルアルコール及びポリビニルプロピレンから選択される親水性成分を更に含む、請求項２４に記載の局所用製剤。
【請求項２６】
内相及び外相が、局所用製剤が局所包帯剤を構成するように選択され、局所包帯剤は塗布剤付きフィルムを構成する、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項２７】
外相がシリコーンゴムを含む、請求項２６に記載の局所用製剤。
【請求項２８】
内相及び外相が、局所用製剤が軟膏を構成するように選択される、請求項１に記載の局所用製剤。
【請求項２９】
外相が、少なくとも１つのシリコーンエラストマー及び少なくとも１つのシリコーン系界面活性剤を含む、請求項２８に記載の局所用製剤。
【請求項３０】
内相が活性物質及びプロピレングリコールを含む、請求項２９に記載の局所用製剤。
【請求項３１】
内相がポリビニルアルコールを更に含む、請求項３０に記載の局所用製剤。
【請求項３２】
活性物質を局所的に提供する方法であって：
内相及び外相を含む、液体に対して密閉された局所用製剤を提供し、ここで、内相は外相内に分散しており、内相は少なくとも１つの親水性担体及び壊死組織を除去するために外相から放出可能な少なくとも１つの活性物質を含み、外相はシリコーンマトリックスを含む；
活性物質がシリコーンマトリックスから患者の皮膚に局所的に放出されるように局所用製剤を患者の皮膚に接触させる、
ことを含む、前記方法。
【請求項３３】
内相は親水性成分を更に含み、親水性成分は、活性物質が所望の速度でシリコーンマトリックスから放出されるように選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
局所用製剤は厚みを有するパッチを構成し、パッチの厚さは、活性物質が所望の速度でシリコーンマトリックスから放出されるように選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
液体に対する密閉性は、局所用製剤に覆われた壊死組織の膨潤を可能にする湿潤環境を促進させて、壊死組織が膨潤し；そして、シリコーンマトリックスから放出される活性物質は、膨潤した壊死組織を選択的に除去する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
内相及び外相を含む第２の局所用製剤を提供し、ここで、内相は外相内に分散しており、内相は少なくとも１つの親水性担体と壊死組織を除去するために選択された活性物質を阻害するように選択された少なくとも１つの第２の活性物質とを含み、外相はシリコーン接着剤を含むシリコーンマトリックスを含む；
第２の局所用製剤を、患者の皮膚にある創傷周辺の皮膚におき；そして
局所用製剤を第２の局所用製剤に接触させることによって局所用製剤を創傷に接着させ、創傷周辺の患者の皮膚は、壊死組織を除去するために選択された活性物質から保護される、
ことを更に含む、請求項３５に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５０５１０７（Ｐ２００７−５０５１０７Ａ）
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６０８９（Ｐ２００６−５２６０８９）
【出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６２１８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２５５４８
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５０００４１００８）ダウ・コーニング・コーポレーション (2)
【出願人】（３９８０５６５０６）ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１３日（２００４．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６２１８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２５５４８
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５０００４１００８）ダウ・コーニング・コーポレーション (2)
【出願人】（３９８０５６５０６）ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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