試料の前処理方法及びこれを利用する免疫学的測定方法
種々の多量体が混在する生体試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的測定法により、簡便、迅速かつ正確に測定するための試料の前処理方法の提供。
試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的に測定するためのアディポネクチン測定用試料の前処理方法であって、アディポネクチンを含む試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを作用させることを特徴とする、アディポネクチン測定用試料の前処理方法。
試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的に測定するためのアディポネクチン測定用試料の前処理方法であって、アディポネクチンを含む試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを作用させることを特徴とする、アディポネクチン測定用試料の前処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的測定法により、簡便、迅速かつ正確に測定するための前処理方法及びこれを利用するアディポネクチン総量の免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチン（非特許文献１〜４）は、白色脂肪組織において特異的にかつ最も多く発現している分泌蛋白質のひとつで、２４４個のアミノ酸より成る約３０ｋＤａのＣ１ｑファミリーに属する血漿蛋白質である。
【０００３】
アディポネクチンは、Ｎ末端側のコラーゲン様ドメインとＣ末端側のグロブラー（ｇｌｏｂｕｌａｒ：球状）ドメインからなる単量体が、コラーゲン様ドメイン中のＧｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造により、トリプルヘリックスの３量体を形成した構造をとっている。そして、血中では３量体同士がさらに結合し、種々の多量体を形成して存在していることが報告されている（以下、総称して「種々の多量体」ということがある）。
【０００４】
近年、アディポネクチンはヒト血中に５〜１０μｇ／ｍＬという高濃度で存在し、様々な生理活性を有することが報告されている。特に平滑筋細胞の増殖を抑制することや単球の内皮細胞への接着を抑制することから、動脈硬化の抑制効果があるものと考えられている（非特許文献５）。また、アディポネクチンを２型糖尿病や脂肪萎縮性糖尿病の病態マウスに投与するとインスリン抵抗性と高ＦＦＡ（遊離脂肪酸）血症、高ＴＧ（中性脂肪）血症が改善することから、インスリン感受性ホルモンとして糖尿病の改善効果が報告されている（非特許文献６）。さらに、アディポネクチンの血中濃度が低値の腎不全患者群は心血管合併症発症率が高く、生存率が低下すること、インスリン抵抗性や２型糖尿病を高頻度で発症するピマインディアンの研究において、血中アディポネクチン高値群では２型糖尿病発症が抑制されていることが報告されている（非特許文献７）。
【０００５】
これらの報告より、アディポネクチンは内臓脂肪の過剰蓄積とインスリン抵抗性発症を直接リンクさせる内分泌因子である可能性が示唆され、血中アディポネクチン濃度を測定することは、糖尿病や動脈硬化などの発症予測因子として、生活習慣病の良い指標となる可能性が考えられている。
【０００６】
種々の多量体が混在する血液試料においてアディポネクチンの総量を測定する方法としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下に煮沸して、種々の多量体において立体構造上隠れていた抗体の認識部位を露出させる処理を行った後、免疫学的測定を行う方法（特許文献１）が報告されている。しかしながら、この方法には、煮沸（１００℃）処理のための装置が必要である点、煮沸処理に引き続いて免疫学的測定をする二つの工程を自動化することが実際上困難である点などの問題があった。
【０００７】
また、ＬＩＮＣＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＩＮＣ．から「ＨＵＭＡＮ ＡＤＩＰＯＮＥＣＴＩＮ ＲＩＡ ＫＩＴ（Ｃａｔ．＃ＨＡＤＰ−６１ＨＫ）が市販されているものの、当該キットは、１２５Ｉで標識したマウスアディポネクチンとヒトアディポネクチンを競合させ抗アディポネクチン−ポリクローナル抗体で捕捉する二抗体／ＰＥＧ法を利用していることから、操作が煩雑であり、安全性、特異性や試薬の品質の面に問題がある。競合反応を原理とする本法の特異性を一定にするには、１２５Ｉで標識したマウスアディポネクチン及び種々の多量体ヒトアディポネクチンに対する抗アディポネクチン−ポリクローナル抗体の反応性が一定である必要があるが、前述したように、生体試料中には種々の多量体が混在しており、また各多量体の存在割合も一定でないことから、アディポネクチンの総量を正確に測定できないという問題を内包している。
【０００８】
さらに、ＳＤＳや熱による変性処理をしていない状態の特定の立体構造を保持しているアディポネクチン（特許文献２明細書中では天然型と称している）を認識するモノクローナル抗体とそれを利用した測定方法（特許文献２）も報告されているものの、試料中のアディポネクチンの存在形態（３量体がいくつ、どのように集まっているかなど）によって前記モノクローナル抗体との反応性が異なるため、各多量体の存在割合が一定でない生体試料中のアディポネクチンの総量は正確に測定できないという問題があった。
【０００９】
アディポネクチンの存在形態については、生体試料中のアディポネクチンについての検討ではないものの、リコンビナントのアディポネクチンを用いた検討がある。それによれば、低ｐＨ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）処理（非特許文献８）あるいは、トリプシン処理（非特許文献９）することでアディポネクチンの形態が変わるという報告がなされているが、処理後のアディポネクチンの免疫学的測定についての記載はない。
【００１０】
上記したように、試料中のアディポネクチン総量を免疫学的に測定するには、使用する抗体との反応性を各多量体（３量体及び３量体同士がさらに結合した種々の多量体）間で一定にする前処理が必要であったが、簡便でかつ、前処理に引き続いて免疫学的測定をする二つの工程を自動化することが可能な方法は提案されていなかった。
【特許文献１】特開２０００−３０４７４８公報
【特許文献２】国際公開 ＷＯ０３／０１６９０６公報
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｒｅｒ Ｐ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０， ２６７４６−２６７４９， １９９５
【非特許文献２】Ｈｕ Ｅ．，ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１， １０６９７−１０７０３， １９９６
【非特許文献３】Ｍａｅｄａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２１， ２８６−２８９， １９９６
【非特許文献４】Ｎａｋａｎｏ Ｙ．，ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２０， ８０３−８１２， １９９６
【非特許文献５】Ｏｕｃｈｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０２， １２９６−１３０１， ２０００
【非特許文献６】Ｙａｍａｕｔｃｈｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ７， ９４１−９４６， ２００１
【非特許文献７】Ｌｉｎｄｓａｙ Ｒ．Ｓ， ｅｔ ａｌ， Ｌａｎｃｅｔ， ３６０， ５７−５８， ２００２
【非特許文献８】Ｕｔｐａｌ Ｂ． Ｐａｊｖａｎｉ， ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７８， ９０７３−９０８５， ２００３
【非特許文献９】Ｆｒｕｅｂｉｓ，Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９８， ２００５−２５３１， ２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、３量体及び３量体同士がさらに結合した種々の多量体が混在する生体試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的測定法により、簡便、迅速かつ正確に測定するための前処理方法及びこれを利用するアディポネクチン総量の免疫学的測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、３量体及び３量体同士がさらに結合した種々の多量体を還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つで処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ポリアクリルアミド濃度２−１５％）（以下ＰＡＧＥ（２−１５％）のように表記する）で解析したところ、処理前に存在した種々の多量体の染色バンドが消失もしくは減少するとともに、処理前に存在した染色バンドのいずれよりも低分子側に染色検出されるアディポネクチン由来変換物（以下、変換物という）の出現を確認した。そして、当該変換物が抗アディポネクチン抗体と反応性を有していること、及び抗アディポネクチン抗体を使用して当該変換物を測定できることを確認した。
【００１３】
本発明者らは、上記知見をもとにさらに検討した結果、試料を還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む前処理剤で処理した後、免疫学的測定を行えば、試料を前処理剤とともに煮沸処理することなく、種々の多量体が混在する生体試料中のアディポネクチン総量を測定できることを見い出し本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的に測定するためのアディポネクチン測定用試料の前処理方法であって、アディポネクチンを含む試料に対し、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを加え、試料とともに煮沸することなく作用させることを特徴とする、アディポネクチン測定用試料の前処理方法を提供するものである。
また、本発明は、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む、アディポネクチン総量の免疫学的測定用試料の前処理剤であって試料を煮沸することなく前処理する前処理剤を提供するものである。
また本発明は、アディポネクチンを含む試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを加え、試料とともに煮沸することなく作用させた後、免疫学的にアディポネクチンを測定することを特徴とする、試料中のアディポネクチン総量の測定方法を提供するものである。
さらに本発明は、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む第一試薬とアディポネクチンを測定するための抗体を担持させた不溶性担体を含む第二試薬よりなるアディポネクチン総量の免疫学的測定試薬であって、試料と第一試薬の反応を煮沸することなく行うための免疫学的測定試薬を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、種々の多量体が混在する生体試料中のアディポネクチン総量を簡便、迅速かつ正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒト血清中のアディポネクチンをウエスタンブロティング法により解析した図である。
【図２】ＬＴＩＡ試薬とプロテアーゼ処理したアディポネクチンとの反応性を示した図である。
【図３】ＥＬＩＳＡ試薬とプロテアーゼ処理したアディポネクチンとの反応性を示した図である。
【図４】参考例３においてヒト血清から精製されたアディポネクチンを、ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢにより蛋白染色した泳動像の図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
前述したように、生体試料中のアディポネクチンには種々の多量体が存在し、しかも各多量体の存在割合（比率）は一定でない。このため免疫学的測定の際、測定に使用する抗体と種々の多量体間の反応性が異なることが考えられるが、この場合、特定の多量体が測定されにくくなることが考えられる。また、サンドイッチ免疫測定系において、測定試料中に６量体と３量体が一分子ずつ存在する場合を仮想すると、試料中には９個の単量体が存在するが、測定結果としては、３量体が２分子存在する場合、６量体が２分子存在する場合などを測定結果の上では区別できないことが考えられる。いずれの場合も、アディポネクチンの総量を反映した測定結果を得ることはできない。また、ＳＤＳ共存下、煮沸して多量体を分解する前処理を利用した方法においては、アディポネクチン総量を反映した測定結果が得られるものの、前処理が煩雑であり、引き続いて免疫学的測定を行う、二つの工程を自動化することが困難である。
【００１８】
前記した知見より、本発明者らは、免疫学的測定の際、測定に使用する抗体と測定試料中の種々の多量体との反応性が一定となり、アディポネクチンの総量を反映した測定結果が得られるような一定の形態に、試料を煮沸することなく、種々の多量体が変換されていれば、前記課題が解決できることを見出した。
【００１９】
前記の目的にかなう測定試料中の種々のアディポネクチンの前処理方法として、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つをアディポネクチンを含む試料に加え、試料とともに煮沸することなく作用させる処理方法を挙げることができる。これらの前処理方法によって得られる変換物の性状は各前処理方法間で同一であっても、異なっていても良い。種々の多量体が、すべて単量体である場合、３量体である場合、特定の多量体である場合などを含む。また、前処理により、ある分子量域に収束している変換物であっても良い。別の見方をすれば、免疫学的測定系を構築するために選ばれた抗体が一定の反応性で認識できる性状を有していれば良い。
【００２０】
本発明に使用される試料としては、ヒト、サル、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット及びその他の哺乳動物から得られた血液、尿などの体液、組織抽出液や組織由来の細胞の培養上清液などアディポネクチンの種々の多量体を含有する生体試料が挙げられる。このうち、糖尿病や動脈硬化性疾患に関する情報との関係で注目されている血液（血清・血漿）が好適である。試料の採取方法は、アディポネクチン総量を測定する目的を考慮し、試料中に存在するアディポネクチンに影響を与えない方法であれば使用することが可能である。
【００２１】
本発明の前処理方法、前処理剤、免疫学的測定方法、免疫学的測定試薬に使用される還元剤としては、アディポネクチンのジスルフィド結合を解離できる還元力を有し、免疫学的測定において実質的に影響を与えない物質であれば特に制限することなく使用することができる。例えば、ＤＴＴ（ジチオスレイト−ル）、２−メルカプトエタノール、システアミン、チオグリセロールなどのチオール化合物、水素化ホウ素化合物やホスフィン類などが挙げられる。使用する濃度は、所望の変換物が得られよう適宜選択して決定できる。例えばチオール化合物の場合には、ＤＴＴや２−メルカプトエタノールを使用するのが好ましい。還元剤による処理の条件としては、４〜６０℃、５分〜２４時間が好ましい。
【００２２】
酸又はその塩としては、種々の多量体のアディポネクチンの結合を解離することができる有機酸、無機酸であれば特に制限することなく使用することができる。例えば、酢酸、クエン酸、塩酸、ギ酸、酒石酸、シュウ酸などが挙げられる。使用する濃度は、所望の変換物が得られよう適宜選択して決定できるが、１〜１０００ｍＭが好ましく、１０〜２００ｍＭがさらに好ましい。また、緩衝液として使用することもできる。緩衝液とした際のｐＨとしては、ｐＨ４以下が好ましい。酸又はその塩による処理の条件としては、４〜６０℃、５分〜２４時間が好ましい。
【００２３】
界面活性剤としては、種々の多量体に作用し、免疫学的測定においてアディポネクチン総量を反映する形態に変化させうるものであって、アディポネクチンと特異抗体との反応性を維持することが出来るものであれば、イオン性又は非イオン性などの制限なく使用することができる。なかでも陰イオン性界面活性剤が好ましく、ドデシル硫酸塩等のアルキル硫酸塩やドデシルベンゼンスルホン酸塩等のアルキルベンゼンスルホン酸塩などが好適である。これらの界面活性剤は、単独でも複数を組合わせて使用しても良い。使用濃度は、概ね０．０１〜１０％で使用されるが、０．１〜５％がさらに好ましい。酸又はその塩による処理と組み合わせて使用すると、さらに好ましい。
【００２４】
プロテアーゼとしては、種々の多量体に作用して、種々の多量体を免疫学的測定においてアディポネクチン総量を反映する形態に変化させうるプロテアーゼであれば特に制限することなく使用することができる。使用する濃度も、所望の変換物が得られよう適宜選択して決定できる。プロテアーゼの起源も、微生物由来、動物由来、植物由来など、特に制限はないが、好適には、バチルス属、ストレプトミセス属やアスペルギルス属等の微生物由来のプロテアーゼが使用できる。バチルス属由来のプロテアーゼの市販品の例としては、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｙｐｅＸ（シグマ社）、プロチン（Ｐｒｏｔｉｎ）ＡＣ、プロチン（Ｐｒｏｔｉｎ）ＰＣ（ともに大和化成社）、プロテアーゼＳ「アマノ」（アマノエンザイム社）、スミチームＣＰ（新日本化学工業社）などが挙げられる。ストレプトミセス属由来のプロテアーゼの市販品の例としては、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｙｐｅＸＩＶ（シグマ社）、プロナーゼ（ロシュ社）、アクチナーゼＡＳ（科研製薬社）などが挙げられる。また、アスペルギルス属由来のプロテアーゼの市販品の例としては、プロテアーゼＡ「アマノ」、プロテアーゼＰ「アマノ」、ウマミザイム（いずれもアマノエンザイム社）、スミチームＭＰ（新日本化学工業社）などが挙げられる。これらプロテアーゼは遺伝子組み換え技術によって得られるものであっても差し支えない。また化学修飾を施されていても良い。生体試料のプロテアーゼによる処理の条件は、用いるプロテアーゼによって異なるが、リン酸、トリス、グッド等の緩衝液中、４〜６０℃で、５分〜２４時間行うことが好ましい。プロテアーゼの使用濃度は、反応温度及び反応時間等を考慮して決定されるが、概ね０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲で使用される。
【００２５】
これら還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの使用方法にも特に制限はない。適宜単独又は組み合わせて使用することが可能である。例えば、還元剤や酸を、アディポネクチンを含む試料に作用させた後に、さらにプロテアーゼ処理を行なうことも可能である。また、これら還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの使用にあたっては、これらの物質がアディポネクチンに作用する環境を整えたり、これら物質の保存安定性の向上などを目的として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液などの緩衝成分、種々の多量体には作用しない界面活性剤、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ショ糖、防腐剤（アジ化ナトリウムなど）、塩濃度調整剤（塩化ナトリウムなど）などを適宜添加して使用しても良い。
【００２６】
本発明の免疫学的測定方法に使用される抗体は、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを種々の多量体アディポネクチンに煮沸処理することなく作用させた後、アディポネクチン総量を測定可能なものであれば、特に制限なく使用できる。かかる抗体の内、ポリクローナル抗体は一定の形態となったアディポネクチンに存在する複数のエピトープと特異的に結合する複数の抗体を含むポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体はアディポネクチンを適当な動物、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、マウス、ラットなどの動物に、それ自体公知の手法によって免疫して得ることができる。一方、モノクローナル抗体は、一定の形態となったアディポネクチンに対して特異的に結合する１種類以上の異なるモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、細胞融合技術分野において、それ自体公知の手法を適宜に選択し、また、それらを組み合わせてモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、該細胞株を利用して取得することができる。また、一定の形態となったアディポネクチンに特異的に結合するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、市販品として入手することも可能であり、本発明に使用できる。例えば、Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＧＴ社）、ｒａｂｂｉｔαｈｕ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ−ＰｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ（藤沢薬品工業社、ＢＤ社）、Ｍｏｕｓｅαｈｕ Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ＭｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、抗ヒトＡＣＲＰ３０モノクローナル抗体（ＡＸ７７３、ＡＸ７４１、Ｎｅ，Ｎａ、和光純薬工業社）など、アディポネクチンの形態に応じて適宜利用できる。
【００２７】
本発明に使用される抗体を得るための抗原としては、常法に従い試料から精製、単離したアディポネクチンを使用することができる。還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの少なくともいずれかを含む前処理液で煮沸処理することなく処理したアディポネクチンを用いることもできる。また、該抗原はその蛋白質の遺伝子配列情報に基づき通常の遺伝子工学的手法により組み換え蛋白として製造することもできる。
【００２８】
本発明の免疫学的測定方法としては、一定の形態に変化させたアディポネクチンに対して特異的に結合する抗体を不溶性担体に結合させ、これによって一定の形態に変化させたアディポネクチンを捕捉し、試料中に存在するアディポネクチンの有無の確認（定性）又は定量する方法が使用され、なかでも、ＬＴＩＡ（ラテックス免疫比濁法）、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）などといった方法が挙げられる。このうち、ＬＴＩＡは一定の形態に変化させたアディポネクチンと特異的に結合する抗体を担持させた不溶性担体と一定の形態に変化させたアディポネクチンとを混合することにより一定の形態に変化させたアディポネクチンを介した不溶性担体の架橋（凝集）が起こり、その結果生じる濁りを光学的に測定することでアディポネクチンの有無の確認（定性）又は定量する方法であり、アディポネクチンを簡便、迅速かつ正確に測定するには好ましい。
【００２９】
本発明に使用される不溶性担体としては、通常の免疫学的測定試薬に使用され工業的に大量生産可能な有機系の不溶性担体が使用される。ＬＴＩＡにおいては抗体の吸着性に優れかつ生物学的活性を長期間安定的に保持できるポリスチレン系のラテックス粒子、ＥＬＩＳＡにおいてはポリスチレンなどの９６穴のマイクロプレートが好ましい。
【００３０】
上記不溶性担体の表面に抗体を担持させる手法は種々知られており、本発明において適宜利用できる。例えば、担持（感作）方法として不溶性担体表面に抗体を物理的に吸着させる方法や、官能基を有する不溶性担体表面に既知の方法である物理結合法や化学結合法により抗体を効率的に感作する方法が挙げられる。
【００３１】
抗体を担持させた抗体不溶性担体と一定の形態に変化させたアディポネクチンとの反応は、抗原抗体反応が起こり得る条件であれば、その反応条件は特に限定されない。反応液としては、前処理した後の一定の形態に変化させたアディポネクチンとの抗原抗体反応が起こり得る溶液であればどのようなものでも良い。例えば、ｐＨを制御するための緩衝成分としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など、非特異反応を回避するための界面活性剤や塩化ナトリウムなど、安定化剤としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ショ糖、高分子多糖類など、反応性を制御する前記物質の他にデキストランなどの水溶性多糖類、前処理剤中の還元剤や酸を中和するための中和剤、プロテアーゼの不活性化剤などの添加剤を適宜溶解させても良い。
【００３２】
前記したＬＴＩＡやＥＬＩＳＡにおける検出方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。ＬＴＩＡにおける不溶性担体の凝集程度を測定する方法は特に限定されない。例えば、凝集を定性的ないし半定量的に測定する場合は、既知濃度試料の濁度の程度と測定試料の濁度の程度との比較から、凝集の程度を目視によって判定することも可能である。また、該凝集を定量的に測定する場合は、簡便性及び精度の点からは、光学的に測定することが好ましい。凝集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能である。より具体的には、例えば、いわゆる比濁法（凝集塊の形成を濁度の増加として捕らえる）、粒度分布による測定法（凝集塊の形成を粒度分布ないしは平均粒径の変化として捕らえる）、積分球濁度法（凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する）などの種々の方式が利用可能である。ＥＬＩＳＡにおける酵素標識抗体の酵素活性に由来する、基質と酵素の反応生成物を測定する方法は特に限定されない。例えば、酵素反応生成物固有の波長、例えば４９２ｎｍにおける吸光度として９６穴マイクロプレートリーダーで読み取ることが可能である。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００３４】
実施例及び試験例で用いた試薬及び材料は以下の通りである。
＜試薬及び材料＞
ａ．抗体結合樹脂用洗浄液：０．５Ｍ ＮａＣｌ を含む ０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３−ＮａＯＨ （ｐＨ ８．３）。
ｂ．抗体結合樹脂用溶出液：０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ （ｐＨ ２．５）。
ｃ．抗体結合樹脂用中和液：２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）。
ｄ．ラテックス：平均粒径０．２μｍのポリスチレン粒子ラテックス（固形分１０％（ｗ／ｖ）、積水化学工業社）。
ｅ．抗体担持ラテックス調製用緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）。
ｆ．ブロッキング用緩衝液：２％ ＢＳＡ を含む ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）。
ｇ．ＬＴＩＡ用緩衝液（Ｒ１）：０．１５％ ＢＳＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ を含む ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）。
ｈ．ＥＬＩＳＡ用プレート：９６穴マイクロプレート（ＮＵＮＣ社）。
ｉ．ＥＬＩＳＡ用抗体感作溶液：ＰＢＳ （ｐＨ ７．４）。
ｊ．ＥＬＩＳＡ用緩衝液：１％ ＢＳＡ， ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含む ＰＢＳ （ｐＨ ７．４）。
ｋ．Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ：コスモバイオ社、ＧＴ社、Ｃａｔ Ｎｏ．４２１０６５（抗ヒトアディポネクチン−ポリクローナル抗体の市販品）。
ｌ．ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ：藤沢薬品工業社、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、商品コードＡ１２８２０（抗ヒトアディポネクチン−モノクローナル抗体の市販品）。
ｍ．Ｇｏａｔαｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ標識抗体：コスモバイオ社、ｃａｐｐｌｅ社。
ｎ．ＥＬＩＳＡ用洗浄液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含む ＰＢＳ （ｐＨ ７．４）。
ｏ．ＥＬＩＳＡ用緩衝液２：１％ ＢＳＡ， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含む ＰＢＳ （ｐＨ ７．４）。
【００３５】
参考例１． 大腸菌リコンビナント マウスグロブラーアディポネクチン（ｒＭｇＡｄ）の調製
マウスアディポネクチンの遺伝子配列（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃Ｕ３７２２２）のグロブラードメイン配列（１０４−２４７残基相当）を６×Ｈｉｓ タグを含むｐＱＥ３０ベクターのＢａｍＨＩ、 ＨｉｎｄＩＩＩに挿入し、大腸菌に組み込んだ。リコンビナント マウスグロブラーアディポネクチン（ｒＭｇＡｄ）を発現した大腸菌からのｒＭｇＡｄの精製は以下で行った。すなわち、大腸菌の可溶画分をＮｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ社）に４℃、１６時間添加してｒＭｇＡｄを結合させた後、イミダゾールにより段階的に溶出させ、アディポネクチンを含む画分を回収し、３日間ＰＢＳで透析を行なった。得られたｒＭｇＡｄの蛋白質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ を用いて求めた。
【００３６】
参考例２． 抗ｒＭｇＡｄ抗体の調製
前記１により得られたｒＭｇＡｄの５０μｇを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、２匹のウサギにそれぞれ２週間おきに６回免疫して抗血清を作製した。抗血清中の特異抗体（ＩｇＧ）の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を用いて常法により行なった（抗ｒＭｇＡｄ抗体） 。
【００３７】
参考例３． ヒト血中由来アディポネクチン（ｍＡｄ）の精製
前記参考例２で作製した抗ｒＭｇＡｄ抗体 ５００ｍｇをＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（アマシャム バイオサイエンス社）５０ｍＬに結合させ抗ｒＭｇＡｄ抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂を作製した。ヒト血清 ２．５Ｌを抗ｒＭｇＡｄ抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂に添加し、抗体結合樹脂用洗浄液で十分洗浄した後、抗体結合樹脂用溶出液でヒト血清アディポネクチン（ｍＡｄ）画分を溶出し、溶出画分に抗体結合樹脂用中和液を１／１０容量添加して中和した。さらに中和した溶出画分を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂に添加し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂への非吸着画分を精製ｍＡｄとして回収し、「ヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」（大塚製薬社）によりアディポネクチン含量を測定した。
【００３８】
参考例４． 抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体の作製
前記参考例３で得た精製ｍＡｄ２０μｇを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、各２匹のマウスに２週間おきに３又は４回免疫を行った後、さらに細胞融合３日前に再投与した。当該免疫したマウスより脾臓細胞を摘出し、ポリエチレングリコールを用いた常法により、Ｐ３Ｕ１ミエローマ細胞と細胞融合を行った。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞の選択は、ＥＬＩＳＡ法によりｍＡｄとの反応性の高いウエルを選択し、ついで限界希釈法にて選択する常法により行なった。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体は、選択した融合細胞をプリスタン処理したマウス腹空内に投与し腹水として回収した。腹水からの特異抗体（ＩｇＧ）の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を用いて常法により行なった。上記により認識番号；６４４０１−６４４１１で識別される１１のモノクローナル抗体産生融合細胞とモノクローナル抗体が得られた。
【００３９】
参考例５． 抗体感作ラテックスの調製
ラテックス液１容に抗体担持ラテックス調製用緩衝液４容を混合し希釈ラテックス液を調製した。一方、抗ｒＭｇＡｄ抗体あるいは抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）を１ｍｇ／ｍＬとなるように抗体担持ラテックス調製用緩衝液で希釈し希釈抗体液を調製した。前記希釈ラテックス液１容を攪拌しながら、前記２種類の希釈抗体液１容を別個に添加・混合し、さらに攪拌の後、ブロッキング用緩衝液２容を追加添加し、攪拌を続けた。得られた抗体感作ラテックスそれぞれを抗ｒＭｇＡｄ抗体担持ラテックス原液及び抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）担持ラテックス原液とした。
【００４０】
（試験例１）ヒト血清中の多量体アディポネクチンのウェスタンブロッティングによる解析
健常者８名から得た血清０．２μＬそれぞれを、ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、セミドライブロッティングでＰＶＤＦ膜に転写後、免疫染色を行なった。免疫染色の手順は以下である。先ず、転写後の膜を５％ スキムミルク及び０．１％ ＮａＮ３を含むＰＢＳ液（ｐＨ７．４）でブロッキングした後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳ液で洗浄し、市販の抗ヒトアディポネクチン−モノクローナル抗体（ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ；藤沢薬品工業社、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）１μｇ／ｍＬを室温で１時間反応させた。次いで、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ液（ｐＨ７．４）で十分に洗浄した後、Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ ｋｉｔ （Ｍｏｕｓｅ） 及びＤＡＢ基質キット（フナコシ社）を用いて発色させた。以上の結果、主要なバンドとして３種のバンドが染色検出された。これより血中に存在する種々の多量体アディポネクチンは、主に３種類存在することが判明した（図１）。これら３種の染色バンドに相当するアディポネクチンを泳動像の上部（高分子側）から、「ＨＭＷ−Ａｄ」、「ＭＭＷ−Ａｄ」及び「ＬＭＷ−Ａｄ」画分とした。
【００４１】
実施例１ 精製ｍＡｄの還元剤、酸又はその塩及びプロテアーゼによる処理
参考例３で得た精製ｍＡｄを試料として、還元剤、酸又はその塩及びプロテアーゼを、単独又は組合せて作用させて処理し、精製ｍＡｄの形態変化を観察した。
【００４２】
１）還元剤、酸処理
精製ｍＡｄを含む５０ｍＭ の各種緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、酢酸ナトリウム ｐＨ３．０及びｐＨ４．０）について、還元剤として１０ｍＭ ＤＴＴ非添加あるいは添加の条件で、３７℃で６０分間加温した。処理後の液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢにより蛋白染色した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、ＤＴＴ非添加（処理条件１）の染色像を対照として、各処理条件における、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した（表１）。
【００４３】
その結果、還元剤非添加の処理条件では、ｐＨ３．０及びｐＨ４．０の酢酸ナトリウム緩衝液（処理条件３、５）においてＨＭＷ−Ａｄ画分の染色バンドが消失し、ＭＭＷ−Ａｄ画分の増加が確認された。還元剤添加の処理条件では、ｐＨ３．０及びｐＨ４．０の酢酸ナトリウム緩衝液 （処理条件４、６）では、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄの３画分すべての染色バンドが消失するとともに、各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．５）（処理条件２）では、各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認されたが、ＨＭＷ−Ａｄ画分が完全に消失しなかった。
【００４４】
以上より、多量体アディポネクチン（ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ）に還元剤、酸又はその塩を作用させると、多量体アデイポネクチンより新たな変換物が生じることが確認された。上記処理により生成した変換物は、３量体アディポネクチンであると推定された。
【００４５】
【表１】
【００４６】
２）プロテアーゼ処理
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、精製ｍＡｄ及び各種プロテアーゼ（いずれも市販品）を添加し、３７℃で６０分間加温した。処理後の液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢにより蛋白染色した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．５）、ＤＴＴ非添加（処理条件１）の染色像を対照として、各処理条件における、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した（表２）。
【００４７】
処理条件７〜９では、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄの３画分すべての染色バンドが消失するとともに、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。処理条件１０〜１２では、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄ画分は消失し、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。このとき、ＨＭＷ−Ａｄ画分の染色バンドに変化は見られなかった。
【００４８】
以上より、多量体アディポネクチン（ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ）にプロテアーゼを作用させると、多量体アデイポネクチンより新たな変換物を生じることが確認された。これら変換物のＰＡＧＥ（２−１５％）での染色バンドの検出位置は、作用させたプロテアーゼにより異なるものの、３０〜４２ｋＤａの範囲にあった。
また、処理条件１０〜１２のプロテアーゼに関しては、酸又はその塩による処理を行ない、ＨＭＷ−Ａｄ画分をＭＭＷ−Ａｄ画分に変換させた後、プロテアーゼ処理を行うことで、すべての画分について新たな変換物への変換が可能であることがわかった。
【００４９】
【表２】
【００５０】
実施例２ ラテックス試薬と各アディポネクチンとの反応性
プロテアーゼ処理した精製ｍＡｄを、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／５、１／２５倍希釈し検体とした。また、参考例５で調製したそれぞれのラテックス原液を抗体担持ラテックス調製用緩衝液で１／１０倍に希釈したものを試薬２として測定に用い、検体量：１０μＬ、試薬１（ＬＴＩＡ用緩衝液（Ｒ１））：１００μＬ、試薬２：１００μＬ、測定波長：５７０ｎｍ、測光ポイント：１８−３４の測定条件で生化学自動分析装置日立７１７０形（日立製作所社）を用いて測定した。測定結果を図２に示す。
【００５１】
抗ｒＭｇＡｄ抗体及び抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）のラテックス試薬それぞれが、プロチン（Ｐｒｏｔｉｎ）ＡＣ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＴｙｐｅＸのプロテアーゼで処理したヒト血清アディポネクチンの濃度に依存して吸光度が変化した。
【００５２】
プロチン（Ｐｒｏｔｉｎ）ＡＣ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＴｙｐｅＸのプロテアーゼは多量体アディポネクチンを、抗ｒＭｇＡｄ抗体及び抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）が認識する抗体認識部位を保持した状態で、新たな変換物に変換しうることが判明し、試料中のアディポネクチン総量を測定するための前処理に使用できることが確認された。
【００５３】
実施例３ ＥＬＩＳＡ試薬と各アディポネクチンとの反応性
ＥＬＩＳＡ用プレートにＧｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ又は抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）をＥＬＩＳＡ用抗体感作溶液で１μｇ／ｍ Ｌに希釈した後、感作した。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でブロッキング後、プロテアーゼ処理したｍＡｄをＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／２、１／２０、１／２００倍希釈して得た検体を、室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／１００００倍希釈した抗ｒＭｇＡｄ抗体液を室温で１時間反応させた後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／１０００倍希釈したＧｏａｔαｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ標識抗体液を室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄後、ＴＭＢ（テトラメチルベンチジン）と過酸化水素を用いたＨＲＰの酵素反応により発色させ、２Ｎ 硫酸を添加して反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を図３に示す。
【００５４】
抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）と抗ｒＭｇＡｄ抗体の組合わせ及びＧｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙと抗ｒＭｇＡｄ抗体の組合わせのＥＬＩＳＡ試薬は、プロチン（Ｐｒｏｔｉｎ）ＡＣ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＴｙｐｅＸのプロテアーゼで処理したヒト血清アディポネクチンの濃度に依存して吸光度が変化した。
【００５５】
プロチン（Ｐｔｏｔｉｎ）ＡＣ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＴｙｐｅＸのプロテアーゼは、多量体アディポネクチンを、Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ、抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）及び抗ｒＭｇＡｄ抗体が認識する抗体認識部位を保持した状態で、新たな変換物に変換しうることが判明し、試料中のアディポネクチン総量を測定するための前処理に使用できることが確認された。
【００５６】
（試験例２）ヒト血中由来多量体アディポネクチンの解析
参考例３に準じて新たに調製した精製ｍＡｄを、ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により蛋白染色した（図４）。さらに試験例１と同様の操作により、市販の抗ヒトアディポネクチン−モノクローナル抗体（ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ）を用いて免疫染色を行った。染色像を解析した結果、ヒト血清から精製された多量体アディポネクチンは、試験例１で確認された３種類以外に、量的に少ないものの、もう１種類検出され、少なくとも４種類存在することが判明した。これら４種のＣＢＢ染色バンドに相当するアディポネクチンを泳動像の上部（高分子側）から、「ＨＭＷ−Ａｄ」、「ＭＭＷ−Ａｄ」、「ＬＭＷ−Ａｄ」及び「ＵＬＭＷ−Ａｄ」画分とした。
【００５７】
実施例４ 精製ｍＡｄの還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼによる処理
試験例２で解析された精製ｍＡｄを試料として、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼを、単独又は組み合わせて作用させて処理し、精製ｍＡｄの形態変化を観察した。
【００５８】
１） 還元剤、酸処理の組み合わせ
精製ｍＡｄを含む１００ｍＭ の各種緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、クエン酸ナトリウム ｐＨ３．０〜６．０）について、還元剤として１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール非添加あるいは添加の条件で、３７℃で３０分間加温した。処理後の液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢにより蛋白染色した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、２−メルカプトエタノール非添加（処理条件１３）の染色像を対照として、各処理条件における、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＵＬＭＷ−Ａｄ各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した（表３）。
【００５９】
その結果、還元剤非添加の処理条件では、ｐＨ４．０以上のクエン酸ナトリウム緩衝液（処理条件１５，１７，１９）においてＨＭＷ−Ａｄ画分の染色バンドがクエン酸ナトリウム緩衝液の酸性化と共に消失傾向示し、ＭＭＷ−Ａｄ画分の増加が確認された。更に、ｐＨ３．０（処理条件２１）では、ＵＬＭＷ−Ａｄより泳動距離が長い変換物である染色バンドが新たに認められた。一方、還元剤添加の処理条件では、ｐＨ６．０以上で（処理条件１４，１６）では、ＨＭＷ−Ａｄの染色バンドが残存したが、ｐＨ５．０及び４．０の処理条件１８，２０では、すべての画分の染色バンドが消失し、ＵＬＭＷ−Ａｄとほぼ同じ位置に、ブロードな染色バンドが新たに認められた。又、ｐＨ３．０（処理条件２２）では、処理条件２１とほぼ同じ位置に、ブロードな変換物のバンドが新たに認められた。
【００６０】
以上より、多量体アディポネクチン（ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＵＬＭＷ−Ａｄ）に還元剤、酸又はその塩を作用させると、多量体アデイポネクチンより新たな変換物が生じることが確認された。処理条件２１で生成した変換物は２量体、還元剤を添加した条件（１４，１６，１８，２０）で生成した変換物は３量体、さらに処理条件２２で生成した変換物は、１量体であると、それぞれ推定された。さらに、染色バンド切り出しによる解析では、ＵＬＭＷ−Ａｄは３量体、そして、ＬＭＷ−Ａｄはアルブミンが結合している３量体アディポネクチンであることが確認された。
【００６１】
【表３】
【００６２】
２）プロテアーゼ処理
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、精製ｍＡｄ及び各種プロテアーゼ（いずれも市販品）を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で６０分間加温した。処理後の液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢにより蛋白染色した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．５）、ＤＴＴ非添加（処理条件１）の染色像を対照として、各処理条件における、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＵＬＭＷ−Ａｄの各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した（表４）。
【００６３】
処理条件２３〜２５では、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＵＬＭＷ−Ａｄの４画分すべての染色バンドが消失するとともに、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。処理条件２６〜２８では、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄ画分は消失し、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。このとき、ＨＭＷ−Ａｄ画分の染色バンドに変化は見られなかった。
【００６４】
以上より、多量体アディポネクチン（ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＵＬＭＷ−Ａｄ）にプロテアーゼを作用させると、多量体アデイポネクチンより新たな変換物を生じることが確認された。これら変換物のＰＡＧＥ（２−１５％）での染色バンドの検出位置は、作用させたプロテアーゼにより異なるものの、３０〜４２ｋＤａの範囲にあった。これらの変換物のゲル切り出しによるアミノ酸分析結果から、グロブラーアディポネクチンであることが判明している。
また、処理条件２６〜２８のプロテアーゼに関しては、酸又はその塩による処理を行ない、ＨＭＷ−Ａｄ画分をＭＭＷ−Ａｄ画分に変換させた後、プロテアーゼ処理を行うことで、すべての画分について新たな変換物への変換が可能であることがわかった。
【００６５】
【表４】
【００６６】
実施例５ 酸処理、界面活性剤を組み合わせた血中アディポネクチン総量の測定
（１） 前処理液の調製
酸処理の条件として１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を選び、ここに市販されている各種界面活性剤を添加した。添加する界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤として、ＳＤＳ及びネオペレックスＦ６５（花王社製）、陽イオン性界面活性剤としては、コータミン２４Ｐ及びコータミン８６Ｐ（花王社製）、非イオン性界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＴｗｅｅｎ ２０を用いた。添加濃度は、ＳＤＳが２％である他は、すべて０．５％とした。
（２） 検体の処理
８名のボランティアから採取された各血清検体１０μＬに、上述した各種前処理液を４９０μＬ添加し十分に攪拌した後、煮沸しないで、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で５２５０倍希釈した。効果を比較するため、前記各血清１０μＬに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８， ２％ＳＤＳ）溶液４９０μＬを前処理液として添加し十分に攪拌した後、煮沸処理し、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で５２５０倍希釈し対照とした。濃度をもとめるための標準品として、試験例２で解析された精製ｍＡｄを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８， ２％ＳＤＳ）溶液にて煮沸処理し、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で希釈系列を作成したものを用いた。
（３） アディポネクチン総量測定
ＥＬＩＳＡ用プレートに抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０５）をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した後、感作した。次に、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２でブロッキング後、前記標準品及び血清処理液を添加し、室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で２０００倍希釈したＢｉｏｔｉｎ標識抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０４）を室温で１時間反応させた後、さらに、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で２０００倍希釈したＨＲＰ−Ａｖｉｄｉｎを添加し、室温で３０分間反応させた。ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄し、ＯＰＤ発色液（２ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミン塩酸塩、０．０２％過酸化水素を含む、２５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）により発色させ、停止液（１．５Ｎ硫酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を添加して反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸収を測定した。標準品の発色値から、各前処理液による血清中のアディポネクチン総量（濃度）を換算し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８， ２％ＳＤＳ）溶液による煮沸処理した条件を対照にして、相関分析を行った（表５）。
【００６７】
その結果、界面活性剤無添加の酸処理条件では、相関係数は良好であったが、回帰式の傾きが０．４５となり、対照の換算値に対して低値となっていることが確認された。界面活性剤を共存させた場合、相関係数が向上するとともに、対照の換算値に測定値が近似する傾向が確認された。特に、陰イオン性界面活性剤を共存させた場合、その効果は顕著であり、本発明の前処理方法を使用すれば、試料を煮沸することなく、試料中のアディポネクチン総量の測定が可能であることが判明した。
【００６８】
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的測定法により、簡便、迅速かつ正確に測定するための前処理方法及びこれを利用するアディポネクチン総量の免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチン（非特許文献１〜４）は、白色脂肪組織において特異的にかつ最も多く発現している分泌蛋白質のひとつで、２４４個のアミノ酸より成る約３０ｋＤａのＣ１ｑファミリーに属する血漿蛋白質である。
【０００３】
アディポネクチンは、Ｎ末端側のコラーゲン様ドメインとＣ末端側のグロブラー（ｇｌｏｂｕｌａｒ：球状）ドメインからなる単量体が、コラーゲン様ドメイン中のＧｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造により、トリプルヘリックスの３量体を形成した構造をとっている。そして、血中では３量体同士がさらに結合し、種々の多量体を形成して存在していることが報告されている（以下、総称して「種々の多量体」ということがある）。
【０００４】
近年、アディポネクチンはヒト血中に５〜１０μｇ／ｍＬという高濃度で存在し、様々な生理活性を有することが報告されている。特に平滑筋細胞の増殖を抑制することや単球の内皮細胞への接着を抑制することから、動脈硬化の抑制効果があるものと考えられている（非特許文献５）。また、アディポネクチンを２型糖尿病や脂肪萎縮性糖尿病の病態マウスに投与するとインスリン抵抗性と高ＦＦＡ（遊離脂肪酸）血症、高ＴＧ（中性脂肪）血症が改善することから、インスリン感受性ホルモンとして糖尿病の改善効果が報告されている（非特許文献６）。さらに、アディポネクチンの血中濃度が低値の腎不全患者群は心血管合併症発症率が高く、生存率が低下すること、インスリン抵抗性や２型糖尿病を高頻度で発症するピマインディアンの研究において、血中アディポネクチン高値群では２型糖尿病発症が抑制されていることが報告されている（非特許文献７）。
【０００５】
これらの報告より、アディポネクチンは内臓脂肪の過剰蓄積とインスリン抵抗性発症を直接リンクさせる内分泌因子である可能性が示唆され、血中アディポネクチン濃度を測定することは、糖尿病や動脈硬化などの発症予測因子として、生活習慣病の良い指標となる可能性が考えられている。
【０００６】
種々の多量体が混在する血液試料においてアディポネクチンの総量を測定する方法としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下に煮沸して、種々の多量体において立体構造上隠れていた抗体の認識部位を露出させる処理を行った後、免疫学的測定を行う方法（特許文献１）が報告されている。しかしながら、この方法には、煮沸（１００℃）処理のための装置が必要である点、煮沸処理に引き続いて免疫学的測定をする二つの工程を自動化することが実際上困難である点などの問題があった。
【０００７】
また、ＬＩＮＣＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＩＮＣ．から「ＨＵＭＡＮ ＡＤＩＰＯＮＥＣＴＩＮ ＲＩＡ ＫＩＴ（Ｃａｔ．＃ＨＡＤＰ−６１ＨＫ）が市販されているものの、当該キットは、１２５Ｉで標識したマウスアディポネクチンとヒトアディポネクチンを競合させ抗アディポネクチン−ポリクローナル抗体で捕捉する二抗体／ＰＥＧ法を利用していることから、操作が煩雑であり、安全性、特異性や試薬の品質の面に問題がある。競合反応を原理とする本法の特異性を一定にするには、１２５Ｉで標識したマウスアディポネクチン及び種々の多量体ヒトアディポネクチンに対する抗アディポネクチン−ポリクローナル抗体の反応性が一定である必要があるが、前述したように、生体試料中には種々の多量体が混在しており、また各多量体の存在割合も一定でないことから、アディポネクチンの総量を正確に測定できないという問題を内包している。
【０００８】
さらに、ＳＤＳや熱による変性処理をしていない状態の特定の立体構造を保持しているアディポネクチン（特許文献２明細書中では天然型と称している）を認識するモノクローナル抗体とそれを利用した測定方法（特許文献２）も報告されているものの、試料中のアディポネクチンの存在形態（３量体がいくつ、どのように集まっているかなど）によって前記モノクローナル抗体との反応性が異なるため、各多量体の存在割合が一定でない生体試料中のアディポネクチンの総量は正確に測定できないという問題があった。
【０００９】
アディポネクチンの存在形態については、生体試料中のアディポネクチンについての検討ではないものの、リコンビナントのアディポネクチンを用いた検討がある。それによれば、低ｐＨ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）処理（非特許文献８）あるいは、トリプシン処理（非特許文献９）することでアディポネクチンの形態が変わるという報告がなされているが、処理後のアディポネクチンの免疫学的測定についての記載はない。
【００１０】
上記したように、試料中のアディポネクチン総量を免疫学的に測定するには、使用する抗体との反応性を各多量体（３量体及び３量体同士がさらに結合した種々の多量体）間で一定にする前処理が必要であったが、簡便でかつ、前処理に引き続いて免疫学的測定をする二つの工程を自動化することが可能な方法は提案されていなかった。
【特許文献１】特開２０００−３０４７４８公報
【特許文献２】国際公開 ＷＯ０３／０１６９０６公報
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｒｅｒ Ｐ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０， ２６７４６−２６７４９， １９９５
【非特許文献２】Ｈｕ Ｅ．，ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１， １０６９７−１０７０３， １９９６
【非特許文献３】Ｍａｅｄａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２１， ２８６−２８９， １９９６
【非特許文献４】Ｎａｋａｎｏ Ｙ．，ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２０， ８０３−８１２， １９９６
【非特許文献５】Ｏｕｃｈｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １０２， １２９６−１３０１， ２０００
【非特許文献６】Ｙａｍａｕｔｃｈｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ７， ９４１−９４６， ２００１
【非特許文献７】Ｌｉｎｄｓａｙ Ｒ．Ｓ， ｅｔ ａｌ， Ｌａｎｃｅｔ， ３６０， ５７−５８， ２００２
【非特許文献８】Ｕｔｐａｌ Ｂ． Ｐａｊｖａｎｉ， ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７８， ９０７３−９０８５， ２００３
【非特許文献９】Ｆｒｕｅｂｉｓ，Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９８， ２００５−２５３１， ２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、３量体及び３量体同士がさらに結合した種々の多量体が混在する生体試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的測定法により、簡便、迅速かつ正確に測定するための前処理方法及びこれを利用するアディポネクチン総量の免疫学的測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、３量体及び３量体同士がさらに結合した種々の多量体を還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つで処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ポリアクリルアミド濃度２−１５％）（以下ＰＡＧＥ（２−１５％）のように表記する）で解析したところ、処理前に存在した種々の多量体の染色バンドが消失もしくは減少するとともに、処理前に存在した染色バンドのいずれよりも低分子側に染色検出されるアディポネクチン由来変換物（以下、変換物という）の出現を確認した。そして、当該変換物が抗アディポネクチン抗体と反応性を有していること、及び抗アディポネクチン抗体を使用して当該変換物を測定できることを確認した。
【００１３】
本発明者らは、上記知見をもとにさらに検討した結果、試料を還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む前処理剤で処理した後、免疫学的測定を行えば、試料を前処理剤とともに煮沸処理することなく、種々の多量体が混在する生体試料中のアディポネクチン総量を測定できることを見い出し本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的に測定するためのアディポネクチン測定用試料の前処理方法であって、アディポネクチンを含む試料に対し、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを加え、試料とともに煮沸することなく作用させることを特徴とする、アディポネクチン測定用試料の前処理方法を提供するものである。
また、本発明は、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む、アディポネクチン総量の免疫学的測定用試料の前処理剤であって試料を煮沸することなく前処理する前処理剤を提供するものである。
また本発明は、アディポネクチンを含む試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを加え、試料とともに煮沸することなく作用させた後、免疫学的にアディポネクチンを測定することを特徴とする、試料中のアディポネクチン総量の測定方法を提供するものである。
さらに本発明は、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む第一試薬とアディポネクチンを測定するための抗体を担持させた不溶性担体を含む第二試薬よりなるアディポネクチン総量の免疫学的測定試薬であって、試料と第一試薬の反応を煮沸することなく行うための免疫学的測定試薬を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、種々の多量体が混在する生体試料中のアディポネクチン総量を簡便、迅速かつ正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒト血清中のアディポネクチンをウエスタンブロティング法により解析した図である。
【図２】ＬＴＩＡ試薬とプロテアーゼ処理したアディポネクチンとの反応性を示した図である。
【図３】ＥＬＩＳＡ試薬とプロテアーゼ処理したアディポネクチンとの反応性を示した図である。
【図４】参考例３においてヒト血清から精製されたアディポネクチンを、ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢにより蛋白染色した泳動像の図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
前述したように、生体試料中のアディポネクチンには種々の多量体が存在し、しかも各多量体の存在割合（比率）は一定でない。このため免疫学的測定の際、測定に使用する抗体と種々の多量体間の反応性が異なることが考えられるが、この場合、特定の多量体が測定されにくくなることが考えられる。また、サンドイッチ免疫測定系において、測定試料中に６量体と３量体が一分子ずつ存在する場合を仮想すると、試料中には９個の単量体が存在するが、測定結果としては、３量体が２分子存在する場合、６量体が２分子存在する場合などを測定結果の上では区別できないことが考えられる。いずれの場合も、アディポネクチンの総量を反映した測定結果を得ることはできない。また、ＳＤＳ共存下、煮沸して多量体を分解する前処理を利用した方法においては、アディポネクチン総量を反映した測定結果が得られるものの、前処理が煩雑であり、引き続いて免疫学的測定を行う、二つの工程を自動化することが困難である。
【００１８】
前記した知見より、本発明者らは、免疫学的測定の際、測定に使用する抗体と測定試料中の種々の多量体との反応性が一定となり、アディポネクチンの総量を反映した測定結果が得られるような一定の形態に、試料を煮沸することなく、種々の多量体が変換されていれば、前記課題が解決できることを見出した。
【００１９】
前記の目的にかなう測定試料中の種々のアディポネクチンの前処理方法として、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つをアディポネクチンを含む試料に加え、試料とともに煮沸することなく作用させる処理方法を挙げることができる。これらの前処理方法によって得られる変換物の性状は各前処理方法間で同一であっても、異なっていても良い。種々の多量体が、すべて単量体である場合、３量体である場合、特定の多量体である場合などを含む。また、前処理により、ある分子量域に収束している変換物であっても良い。別の見方をすれば、免疫学的測定系を構築するために選ばれた抗体が一定の反応性で認識できる性状を有していれば良い。
【００２０】
本発明に使用される試料としては、ヒト、サル、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット及びその他の哺乳動物から得られた血液、尿などの体液、組織抽出液や組織由来の細胞の培養上清液などアディポネクチンの種々の多量体を含有する生体試料が挙げられる。このうち、糖尿病や動脈硬化性疾患に関する情報との関係で注目されている血液（血清・血漿）が好適である。試料の採取方法は、アディポネクチン総量を測定する目的を考慮し、試料中に存在するアディポネクチンに影響を与えない方法であれば使用することが可能である。
【００２１】
本発明の前処理方法、前処理剤、免疫学的測定方法、免疫学的測定試薬に使用される還元剤としては、アディポネクチンのジスルフィド結合を解離できる還元力を有し、免疫学的測定において実質的に影響を与えない物質であれば特に制限することなく使用することができる。例えば、ＤＴＴ（ジチオスレイト−ル）、２−メルカプトエタノール、システアミン、チオグリセロールなどのチオール化合物、水素化ホウ素化合物やホスフィン類などが挙げられる。使用する濃度は、所望の変換物が得られよう適宜選択して決定できる。例えばチオール化合物の場合には、ＤＴＴや２−メルカプトエタノールを使用するのが好ましい。還元剤による処理の条件としては、４〜６０℃、５分〜２４時間が好ましい。
【００２２】
酸又はその塩としては、種々の多量体のアディポネクチンの結合を解離することができる有機酸、無機酸であれば特に制限することなく使用することができる。例えば、酢酸、クエン酸、塩酸、ギ酸、酒石酸、シュウ酸などが挙げられる。使用する濃度は、所望の変換物が得られよう適宜選択して決定できるが、１〜１０００ｍＭが好ましく、１０〜２００ｍＭがさらに好ましい。また、緩衝液として使用することもできる。緩衝液とした際のｐＨとしては、ｐＨ４以下が好ましい。酸又はその塩による処理の条件としては、４〜６０℃、５分〜２４時間が好ましい。
【００２３】
界面活性剤としては、種々の多量体に作用し、免疫学的測定においてアディポネクチン総量を反映する形態に変化させうるものであって、アディポネクチンと特異抗体との反応性を維持することが出来るものであれば、イオン性又は非イオン性などの制限なく使用することができる。なかでも陰イオン性界面活性剤が好ましく、ドデシル硫酸塩等のアルキル硫酸塩やドデシルベンゼンスルホン酸塩等のアルキルベンゼンスルホン酸塩などが好適である。これらの界面活性剤は、単独でも複数を組合わせて使用しても良い。使用濃度は、概ね０．０１〜１０％で使用されるが、０．１〜５％がさらに好ましい。酸又はその塩による処理と組み合わせて使用すると、さらに好ましい。
【００２４】
プロテアーゼとしては、種々の多量体に作用して、種々の多量体を免疫学的測定においてアディポネクチン総量を反映する形態に変化させうるプロテアーゼであれば特に制限することなく使用することができる。使用する濃度も、所望の変換物が得られよう適宜選択して決定できる。プロテアーゼの起源も、微生物由来、動物由来、植物由来など、特に制限はないが、好適には、バチルス属、ストレプトミセス属やアスペルギルス属等の微生物由来のプロテアーゼが使用できる。バチルス属由来のプロテアーゼの市販品の例としては、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｙｐｅＸ（シグマ社）、プロチン（Ｐｒｏｔｉｎ）ＡＣ、プロチン（Ｐｒｏｔｉｎ）ＰＣ（ともに大和化成社）、プロテアーゼＳ「アマノ」（アマノエンザイム社）、スミチームＣＰ（新日本化学工業社）などが挙げられる。ストレプトミセス属由来のプロテアーゼの市販品の例としては、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｙｐｅＸＩＶ（シグマ社）、プロナーゼ（ロシュ社）、アクチナーゼＡＳ（科研製薬社）などが挙げられる。また、アスペルギルス属由来のプロテアーゼの市販品の例としては、プロテアーゼＡ「アマノ」、プロテアーゼＰ「アマノ」、ウマミザイム（いずれもアマノエンザイム社）、スミチームＭＰ（新日本化学工業社）などが挙げられる。これらプロテアーゼは遺伝子組み換え技術によって得られるものであっても差し支えない。また化学修飾を施されていても良い。生体試料のプロテアーゼによる処理の条件は、用いるプロテアーゼによって異なるが、リン酸、トリス、グッド等の緩衝液中、４〜６０℃で、５分〜２４時間行うことが好ましい。プロテアーゼの使用濃度は、反応温度及び反応時間等を考慮して決定されるが、概ね０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲で使用される。
【００２５】
これら還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの使用方法にも特に制限はない。適宜単独又は組み合わせて使用することが可能である。例えば、還元剤や酸を、アディポネクチンを含む試料に作用させた後に、さらにプロテアーゼ処理を行なうことも可能である。また、これら還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの使用にあたっては、これらの物質がアディポネクチンに作用する環境を整えたり、これら物質の保存安定性の向上などを目的として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液などの緩衝成分、種々の多量体には作用しない界面活性剤、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ショ糖、防腐剤（アジ化ナトリウムなど）、塩濃度調整剤（塩化ナトリウムなど）などを適宜添加して使用しても良い。
【００２６】
本発明の免疫学的測定方法に使用される抗体は、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを種々の多量体アディポネクチンに煮沸処理することなく作用させた後、アディポネクチン総量を測定可能なものであれば、特に制限なく使用できる。かかる抗体の内、ポリクローナル抗体は一定の形態となったアディポネクチンに存在する複数のエピトープと特異的に結合する複数の抗体を含むポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体はアディポネクチンを適当な動物、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、マウス、ラットなどの動物に、それ自体公知の手法によって免疫して得ることができる。一方、モノクローナル抗体は、一定の形態となったアディポネクチンに対して特異的に結合する１種類以上の異なるモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、細胞融合技術分野において、それ自体公知の手法を適宜に選択し、また、それらを組み合わせてモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、該細胞株を利用して取得することができる。また、一定の形態となったアディポネクチンに特異的に結合するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、市販品として入手することも可能であり、本発明に使用できる。例えば、Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＧＴ社）、ｒａｂｂｉｔαｈｕ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ−ＰｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ（藤沢薬品工業社、ＢＤ社）、Ｍｏｕｓｅαｈｕ Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ＭｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、抗ヒトＡＣＲＰ３０モノクローナル抗体（ＡＸ７７３、ＡＸ７４１、Ｎｅ，Ｎａ、和光純薬工業社）など、アディポネクチンの形態に応じて適宜利用できる。
【００２７】
本発明に使用される抗体を得るための抗原としては、常法に従い試料から精製、単離したアディポネクチンを使用することができる。還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの少なくともいずれかを含む前処理液で煮沸処理することなく処理したアディポネクチンを用いることもできる。また、該抗原はその蛋白質の遺伝子配列情報に基づき通常の遺伝子工学的手法により組み換え蛋白として製造することもできる。
【００２８】
本発明の免疫学的測定方法としては、一定の形態に変化させたアディポネクチンに対して特異的に結合する抗体を不溶性担体に結合させ、これによって一定の形態に変化させたアディポネクチンを捕捉し、試料中に存在するアディポネクチンの有無の確認（定性）又は定量する方法が使用され、なかでも、ＬＴＩＡ（ラテックス免疫比濁法）、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）などといった方法が挙げられる。このうち、ＬＴＩＡは一定の形態に変化させたアディポネクチンと特異的に結合する抗体を担持させた不溶性担体と一定の形態に変化させたアディポネクチンとを混合することにより一定の形態に変化させたアディポネクチンを介した不溶性担体の架橋（凝集）が起こり、その結果生じる濁りを光学的に測定することでアディポネクチンの有無の確認（定性）又は定量する方法であり、アディポネクチンを簡便、迅速かつ正確に測定するには好ましい。
【００２９】
本発明に使用される不溶性担体としては、通常の免疫学的測定試薬に使用され工業的に大量生産可能な有機系の不溶性担体が使用される。ＬＴＩＡにおいては抗体の吸着性に優れかつ生物学的活性を長期間安定的に保持できるポリスチレン系のラテックス粒子、ＥＬＩＳＡにおいてはポリスチレンなどの９６穴のマイクロプレートが好ましい。
【００３０】
上記不溶性担体の表面に抗体を担持させる手法は種々知られており、本発明において適宜利用できる。例えば、担持（感作）方法として不溶性担体表面に抗体を物理的に吸着させる方法や、官能基を有する不溶性担体表面に既知の方法である物理結合法や化学結合法により抗体を効率的に感作する方法が挙げられる。
【００３１】
抗体を担持させた抗体不溶性担体と一定の形態に変化させたアディポネクチンとの反応は、抗原抗体反応が起こり得る条件であれば、その反応条件は特に限定されない。反応液としては、前処理した後の一定の形態に変化させたアディポネクチンとの抗原抗体反応が起こり得る溶液であればどのようなものでも良い。例えば、ｐＨを制御するための緩衝成分としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など、非特異反応を回避するための界面活性剤や塩化ナトリウムなど、安定化剤としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ショ糖、高分子多糖類など、反応性を制御する前記物質の他にデキストランなどの水溶性多糖類、前処理剤中の還元剤や酸を中和するための中和剤、プロテアーゼの不活性化剤などの添加剤を適宜溶解させても良い。
【００３２】
前記したＬＴＩＡやＥＬＩＳＡにおける検出方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。ＬＴＩＡにおける不溶性担体の凝集程度を測定する方法は特に限定されない。例えば、凝集を定性的ないし半定量的に測定する場合は、既知濃度試料の濁度の程度と測定試料の濁度の程度との比較から、凝集の程度を目視によって判定することも可能である。また、該凝集を定量的に測定する場合は、簡便性及び精度の点からは、光学的に測定することが好ましい。凝集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能である。より具体的には、例えば、いわゆる比濁法（凝集塊の形成を濁度の増加として捕らえる）、粒度分布による測定法（凝集塊の形成を粒度分布ないしは平均粒径の変化として捕らえる）、積分球濁度法（凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する）などの種々の方式が利用可能である。ＥＬＩＳＡにおける酵素標識抗体の酵素活性に由来する、基質と酵素の反応生成物を測定する方法は特に限定されない。例えば、酵素反応生成物固有の波長、例えば４９２ｎｍにおける吸光度として９６穴マイクロプレートリーダーで読み取ることが可能である。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００３４】
実施例及び試験例で用いた試薬及び材料は以下の通りである。
＜試薬及び材料＞
ａ．抗体結合樹脂用洗浄液：０．５Ｍ ＮａＣｌ を含む ０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３−ＮａＯＨ （ｐＨ ８．３）。
ｂ．抗体結合樹脂用溶出液：０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ （ｐＨ ２．５）。
ｃ．抗体結合樹脂用中和液：２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）。
ｄ．ラテックス：平均粒径０．２μｍのポリスチレン粒子ラテックス（固形分１０％（ｗ／ｖ）、積水化学工業社）。
ｅ．抗体担持ラテックス調製用緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）。
ｆ．ブロッキング用緩衝液：２％ ＢＳＡ を含む ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）。
ｇ．ＬＴＩＡ用緩衝液（Ｒ１）：０．１５％ ＢＳＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ を含む ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）。
ｈ．ＥＬＩＳＡ用プレート：９６穴マイクロプレート（ＮＵＮＣ社）。
ｉ．ＥＬＩＳＡ用抗体感作溶液：ＰＢＳ （ｐＨ ７．４）。
ｊ．ＥＬＩＳＡ用緩衝液：１％ ＢＳＡ， ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含む ＰＢＳ （ｐＨ ７．４）。
ｋ．Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ：コスモバイオ社、ＧＴ社、Ｃａｔ Ｎｏ．４２１０６５（抗ヒトアディポネクチン−ポリクローナル抗体の市販品）。
ｌ．ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ：藤沢薬品工業社、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、商品コードＡ１２８２０（抗ヒトアディポネクチン−モノクローナル抗体の市販品）。
ｍ．Ｇｏａｔαｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ標識抗体：コスモバイオ社、ｃａｐｐｌｅ社。
ｎ．ＥＬＩＳＡ用洗浄液：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含む ＰＢＳ （ｐＨ ７．４）。
ｏ．ＥＬＩＳＡ用緩衝液２：１％ ＢＳＡ， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含む ＰＢＳ （ｐＨ ７．４）。
【００３５】
参考例１． 大腸菌リコンビナント マウスグロブラーアディポネクチン（ｒＭｇＡｄ）の調製
マウスアディポネクチンの遺伝子配列（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃Ｕ３７２２２）のグロブラードメイン配列（１０４−２４７残基相当）を６×Ｈｉｓ タグを含むｐＱＥ３０ベクターのＢａｍＨＩ、 ＨｉｎｄＩＩＩに挿入し、大腸菌に組み込んだ。リコンビナント マウスグロブラーアディポネクチン（ｒＭｇＡｄ）を発現した大腸菌からのｒＭｇＡｄの精製は以下で行った。すなわち、大腸菌の可溶画分をＮｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ社）に４℃、１６時間添加してｒＭｇＡｄを結合させた後、イミダゾールにより段階的に溶出させ、アディポネクチンを含む画分を回収し、３日間ＰＢＳで透析を行なった。得られたｒＭｇＡｄの蛋白質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ を用いて求めた。
【００３６】
参考例２． 抗ｒＭｇＡｄ抗体の調製
前記１により得られたｒＭｇＡｄの５０μｇを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、２匹のウサギにそれぞれ２週間おきに６回免疫して抗血清を作製した。抗血清中の特異抗体（ＩｇＧ）の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を用いて常法により行なった（抗ｒＭｇＡｄ抗体） 。
【００３７】
参考例３． ヒト血中由来アディポネクチン（ｍＡｄ）の精製
前記参考例２で作製した抗ｒＭｇＡｄ抗体 ５００ｍｇをＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（アマシャム バイオサイエンス社）５０ｍＬに結合させ抗ｒＭｇＡｄ抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂を作製した。ヒト血清 ２．５Ｌを抗ｒＭｇＡｄ抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂に添加し、抗体結合樹脂用洗浄液で十分洗浄した後、抗体結合樹脂用溶出液でヒト血清アディポネクチン（ｍＡｄ）画分を溶出し、溶出画分に抗体結合樹脂用中和液を１／１０容量添加して中和した。さらに中和した溶出画分を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂に添加し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂への非吸着画分を精製ｍＡｄとして回収し、「ヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」（大塚製薬社）によりアディポネクチン含量を測定した。
【００３８】
参考例４． 抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体の作製
前記参考例３で得た精製ｍＡｄ２０μｇを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、各２匹のマウスに２週間おきに３又は４回免疫を行った後、さらに細胞融合３日前に再投与した。当該免疫したマウスより脾臓細胞を摘出し、ポリエチレングリコールを用いた常法により、Ｐ３Ｕ１ミエローマ細胞と細胞融合を行った。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞の選択は、ＥＬＩＳＡ法によりｍＡｄとの反応性の高いウエルを選択し、ついで限界希釈法にて選択する常法により行なった。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体は、選択した融合細胞をプリスタン処理したマウス腹空内に投与し腹水として回収した。腹水からの特異抗体（ＩｇＧ）の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を用いて常法により行なった。上記により認識番号；６４４０１−６４４１１で識別される１１のモノクローナル抗体産生融合細胞とモノクローナル抗体が得られた。
【００３９】
参考例５． 抗体感作ラテックスの調製
ラテックス液１容に抗体担持ラテックス調製用緩衝液４容を混合し希釈ラテックス液を調製した。一方、抗ｒＭｇＡｄ抗体あるいは抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）を１ｍｇ／ｍＬとなるように抗体担持ラテックス調製用緩衝液で希釈し希釈抗体液を調製した。前記希釈ラテックス液１容を攪拌しながら、前記２種類の希釈抗体液１容を別個に添加・混合し、さらに攪拌の後、ブロッキング用緩衝液２容を追加添加し、攪拌を続けた。得られた抗体感作ラテックスそれぞれを抗ｒＭｇＡｄ抗体担持ラテックス原液及び抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）担持ラテックス原液とした。
【００４０】
（試験例１）ヒト血清中の多量体アディポネクチンのウェスタンブロッティングによる解析
健常者８名から得た血清０．２μＬそれぞれを、ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、セミドライブロッティングでＰＶＤＦ膜に転写後、免疫染色を行なった。免疫染色の手順は以下である。先ず、転写後の膜を５％ スキムミルク及び０．１％ ＮａＮ３を含むＰＢＳ液（ｐＨ７．４）でブロッキングした後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳ液で洗浄し、市販の抗ヒトアディポネクチン−モノクローナル抗体（ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ；藤沢薬品工業社、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）１μｇ／ｍＬを室温で１時間反応させた。次いで、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ液（ｐＨ７．４）で十分に洗浄した後、Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ ｋｉｔ （Ｍｏｕｓｅ） 及びＤＡＢ基質キット（フナコシ社）を用いて発色させた。以上の結果、主要なバンドとして３種のバンドが染色検出された。これより血中に存在する種々の多量体アディポネクチンは、主に３種類存在することが判明した（図１）。これら３種の染色バンドに相当するアディポネクチンを泳動像の上部（高分子側）から、「ＨＭＷ−Ａｄ」、「ＭＭＷ−Ａｄ」及び「ＬＭＷ−Ａｄ」画分とした。
【００４１】
実施例１ 精製ｍＡｄの還元剤、酸又はその塩及びプロテアーゼによる処理
参考例３で得た精製ｍＡｄを試料として、還元剤、酸又はその塩及びプロテアーゼを、単独又は組合せて作用させて処理し、精製ｍＡｄの形態変化を観察した。
【００４２】
１）還元剤、酸処理
精製ｍＡｄを含む５０ｍＭ の各種緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、酢酸ナトリウム ｐＨ３．０及びｐＨ４．０）について、還元剤として１０ｍＭ ＤＴＴ非添加あるいは添加の条件で、３７℃で６０分間加温した。処理後の液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢにより蛋白染色した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、ＤＴＴ非添加（処理条件１）の染色像を対照として、各処理条件における、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した（表１）。
【００４３】
その結果、還元剤非添加の処理条件では、ｐＨ３．０及びｐＨ４．０の酢酸ナトリウム緩衝液（処理条件３、５）においてＨＭＷ−Ａｄ画分の染色バンドが消失し、ＭＭＷ−Ａｄ画分の増加が確認された。還元剤添加の処理条件では、ｐＨ３．０及びｐＨ４．０の酢酸ナトリウム緩衝液 （処理条件４、６）では、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄの３画分すべての染色バンドが消失するとともに、各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．５）（処理条件２）では、各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認されたが、ＨＭＷ−Ａｄ画分が完全に消失しなかった。
【００４４】
以上より、多量体アディポネクチン（ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ）に還元剤、酸又はその塩を作用させると、多量体アデイポネクチンより新たな変換物が生じることが確認された。上記処理により生成した変換物は、３量体アディポネクチンであると推定された。
【００４５】
【表１】
【００４６】
２）プロテアーゼ処理
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、精製ｍＡｄ及び各種プロテアーゼ（いずれも市販品）を添加し、３７℃で６０分間加温した。処理後の液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢにより蛋白染色した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．５）、ＤＴＴ非添加（処理条件１）の染色像を対照として、各処理条件における、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した（表２）。
【００４７】
処理条件７〜９では、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄの３画分すべての染色バンドが消失するとともに、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。処理条件１０〜１２では、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄ画分は消失し、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。このとき、ＨＭＷ−Ａｄ画分の染色バンドに変化は見られなかった。
【００４８】
以上より、多量体アディポネクチン（ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ）にプロテアーゼを作用させると、多量体アデイポネクチンより新たな変換物を生じることが確認された。これら変換物のＰＡＧＥ（２−１５％）での染色バンドの検出位置は、作用させたプロテアーゼにより異なるものの、３０〜４２ｋＤａの範囲にあった。
また、処理条件１０〜１２のプロテアーゼに関しては、酸又はその塩による処理を行ない、ＨＭＷ−Ａｄ画分をＭＭＷ−Ａｄ画分に変換させた後、プロテアーゼ処理を行うことで、すべての画分について新たな変換物への変換が可能であることがわかった。
【００４９】
【表２】
【００５０】
実施例２ ラテックス試薬と各アディポネクチンとの反応性
プロテアーゼ処理した精製ｍＡｄを、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／５、１／２５倍希釈し検体とした。また、参考例５で調製したそれぞれのラテックス原液を抗体担持ラテックス調製用緩衝液で１／１０倍に希釈したものを試薬２として測定に用い、検体量：１０μＬ、試薬１（ＬＴＩＡ用緩衝液（Ｒ１））：１００μＬ、試薬２：１００μＬ、測定波長：５７０ｎｍ、測光ポイント：１８−３４の測定条件で生化学自動分析装置日立７１７０形（日立製作所社）を用いて測定した。測定結果を図２に示す。
【００５１】
抗ｒＭｇＡｄ抗体及び抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）のラテックス試薬それぞれが、プロチン（Ｐｒｏｔｉｎ）ＡＣ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＴｙｐｅＸのプロテアーゼで処理したヒト血清アディポネクチンの濃度に依存して吸光度が変化した。
【００５２】
プロチン（Ｐｒｏｔｉｎ）ＡＣ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＴｙｐｅＸのプロテアーゼは多量体アディポネクチンを、抗ｒＭｇＡｄ抗体及び抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）が認識する抗体認識部位を保持した状態で、新たな変換物に変換しうることが判明し、試料中のアディポネクチン総量を測定するための前処理に使用できることが確認された。
【００５３】
実施例３ ＥＬＩＳＡ試薬と各アディポネクチンとの反応性
ＥＬＩＳＡ用プレートにＧｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ又は抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）をＥＬＩＳＡ用抗体感作溶液で１μｇ／ｍ Ｌに希釈した後、感作した。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でブロッキング後、プロテアーゼ処理したｍＡｄをＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／２、１／２０、１／２００倍希釈して得た検体を、室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／１００００倍希釈した抗ｒＭｇＡｄ抗体液を室温で１時間反応させた後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄、ＥＬＩＳＡ用緩衝液で１／１０００倍希釈したＧｏａｔαｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ標識抗体液を室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用緩衝液でプレートを洗浄後、ＴＭＢ（テトラメチルベンチジン）と過酸化水素を用いたＨＲＰの酵素反応により発色させ、２Ｎ 硫酸を添加して反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を図３に示す。
【００５４】
抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）と抗ｒＭｇＡｄ抗体の組合わせ及びＧｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙと抗ｒＭｇＡｄ抗体の組合わせのＥＬＩＳＡ試薬は、プロチン（Ｐｒｏｔｉｎ）ＡＣ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＴｙｐｅＸのプロテアーゼで処理したヒト血清アディポネクチンの濃度に依存して吸光度が変化した。
【００５５】
プロチン（Ｐｔｏｔｉｎ）ＡＣ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＴｙｐｅＸのプロテアーゼは、多量体アディポネクチンを、Ｇｏａｔαｈｕｍａｎ Ａｃｒｐ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ、抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０１）及び抗ｒＭｇＡｄ抗体が認識する抗体認識部位を保持した状態で、新たな変換物に変換しうることが判明し、試料中のアディポネクチン総量を測定するための前処理に使用できることが確認された。
【００５６】
（試験例２）ヒト血中由来多量体アディポネクチンの解析
参考例３に準じて新たに調製した精製ｍＡｄを、ＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により蛋白染色した（図４）。さらに試験例１と同様の操作により、市販の抗ヒトアディポネクチン−モノクローナル抗体（ｈｕ Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ）を用いて免疫染色を行った。染色像を解析した結果、ヒト血清から精製された多量体アディポネクチンは、試験例１で確認された３種類以外に、量的に少ないものの、もう１種類検出され、少なくとも４種類存在することが判明した。これら４種のＣＢＢ染色バンドに相当するアディポネクチンを泳動像の上部（高分子側）から、「ＨＭＷ−Ａｄ」、「ＭＭＷ−Ａｄ」、「ＬＭＷ−Ａｄ」及び「ＵＬＭＷ−Ａｄ」画分とした。
【００５７】
実施例４ 精製ｍＡｄの還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼによる処理
試験例２で解析された精製ｍＡｄを試料として、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼを、単独又は組み合わせて作用させて処理し、精製ｍＡｄの形態変化を観察した。
【００５８】
１） 還元剤、酸処理の組み合わせ
精製ｍＡｄを含む１００ｍＭ の各種緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、クエン酸ナトリウム ｐＨ３．０〜６．０）について、還元剤として１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール非添加あるいは添加の条件で、３７℃で３０分間加温した。処理後の液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢにより蛋白染色した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、２−メルカプトエタノール非添加（処理条件１３）の染色像を対照として、各処理条件における、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ、ＵＬＭＷ−Ａｄ各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した（表３）。
【００５９】
その結果、還元剤非添加の処理条件では、ｐＨ４．０以上のクエン酸ナトリウム緩衝液（処理条件１５，１７，１９）においてＨＭＷ−Ａｄ画分の染色バンドがクエン酸ナトリウム緩衝液の酸性化と共に消失傾向示し、ＭＭＷ−Ａｄ画分の増加が確認された。更に、ｐＨ３．０（処理条件２１）では、ＵＬＭＷ−Ａｄより泳動距離が長い変換物である染色バンドが新たに認められた。一方、還元剤添加の処理条件では、ｐＨ６．０以上で（処理条件１４，１６）では、ＨＭＷ−Ａｄの染色バンドが残存したが、ｐＨ５．０及び４．０の処理条件１８，２０では、すべての画分の染色バンドが消失し、ＵＬＭＷ−Ａｄとほぼ同じ位置に、ブロードな染色バンドが新たに認められた。又、ｐＨ３．０（処理条件２２）では、処理条件２１とほぼ同じ位置に、ブロードな変換物のバンドが新たに認められた。
【００６０】
以上より、多量体アディポネクチン（ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＵＬＭＷ−Ａｄ）に還元剤、酸又はその塩を作用させると、多量体アデイポネクチンより新たな変換物が生じることが確認された。処理条件２１で生成した変換物は２量体、還元剤を添加した条件（１４，１６，１８，２０）で生成した変換物は３量体、さらに処理条件２２で生成した変換物は、１量体であると、それぞれ推定された。さらに、染色バンド切り出しによる解析では、ＵＬＭＷ−Ａｄは３量体、そして、ＬＭＷ−Ａｄはアルブミンが結合している３量体アディポネクチンであることが確認された。
【００６１】
【表３】
【００６２】
２）プロテアーゼ処理
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、精製ｍＡｄ及び各種プロテアーゼ（いずれも市販品）を１ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で６０分間加温した。処理後の液をＰＡＧＥ（２−１５％）にて分離し、ＣＢＢにより蛋白染色した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．５）、ＤＴＴ非添加（処理条件１）の染色像を対照として、各処理条件における、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＵＬＭＷ−Ａｄの各画分に相当するバンドの増減及び新たな変換物バンドの生成を観察した（表４）。
【００６３】
処理条件２３〜２５では、ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＵＬＭＷ−Ａｄの４画分すべての染色バンドが消失するとともに、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。処理条件２６〜２８では、ＵＬＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＭＭＷ−Ａｄ画分は消失し、低分子量域に各画分の変換物である新たな染色バンドの出現が確認された。このとき、ＨＭＷ−Ａｄ画分の染色バンドに変化は見られなかった。
【００６４】
以上より、多量体アディポネクチン（ＨＭＷ−Ａｄ、ＭＭＷ−Ａｄ、ＬＭＷ−Ａｄ及びＵＬＭＷ−Ａｄ）にプロテアーゼを作用させると、多量体アデイポネクチンより新たな変換物を生じることが確認された。これら変換物のＰＡＧＥ（２−１５％）での染色バンドの検出位置は、作用させたプロテアーゼにより異なるものの、３０〜４２ｋＤａの範囲にあった。これらの変換物のゲル切り出しによるアミノ酸分析結果から、グロブラーアディポネクチンであることが判明している。
また、処理条件２６〜２８のプロテアーゼに関しては、酸又はその塩による処理を行ない、ＨＭＷ−Ａｄ画分をＭＭＷ−Ａｄ画分に変換させた後、プロテアーゼ処理を行うことで、すべての画分について新たな変換物への変換が可能であることがわかった。
【００６５】
【表４】
【００６６】
実施例５ 酸処理、界面活性剤を組み合わせた血中アディポネクチン総量の測定
（１） 前処理液の調製
酸処理の条件として１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を選び、ここに市販されている各種界面活性剤を添加した。添加する界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤として、ＳＤＳ及びネオペレックスＦ６５（花王社製）、陽イオン性界面活性剤としては、コータミン２４Ｐ及びコータミン８６Ｐ（花王社製）、非イオン性界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＴｗｅｅｎ ２０を用いた。添加濃度は、ＳＤＳが２％である他は、すべて０．５％とした。
（２） 検体の処理
８名のボランティアから採取された各血清検体１０μＬに、上述した各種前処理液を４９０μＬ添加し十分に攪拌した後、煮沸しないで、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で５２５０倍希釈した。効果を比較するため、前記各血清１０μＬに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８， ２％ＳＤＳ）溶液４９０μＬを前処理液として添加し十分に攪拌した後、煮沸処理し、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で５２５０倍希釈し対照とした。濃度をもとめるための標準品として、試験例２で解析された精製ｍＡｄを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８， ２％ＳＤＳ）溶液にて煮沸処理し、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で希釈系列を作成したものを用いた。
（３） アディポネクチン総量測定
ＥＬＩＳＡ用プレートに抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０５）をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した後、感作した。次に、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２でブロッキング後、前記標準品及び血清処理液を添加し、室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄後、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で２０００倍希釈したＢｉｏｔｉｎ標識抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体（６４４０４）を室温で１時間反応させた後、さらに、ＥＬＩＳＡ用緩衝液２で２０００倍希釈したＨＲＰ−Ａｖｉｄｉｎを添加し、室温で３０分間反応させた。ＥＬＩＳＡ用洗浄液でプレートを洗浄し、ＯＰＤ発色液（２ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミン塩酸塩、０．０２％過酸化水素を含む、２５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）により発色させ、停止液（１．５Ｎ硫酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を添加して反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸収を測定した。標準品の発色値から、各前処理液による血清中のアディポネクチン総量（濃度）を換算し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８， ２％ＳＤＳ）溶液による煮沸処理した条件を対照にして、相関分析を行った（表５）。
【００６７】
その結果、界面活性剤無添加の酸処理条件では、相関係数は良好であったが、回帰式の傾きが０．４５となり、対照の換算値に対して低値となっていることが確認された。界面活性剤を共存させた場合、相関係数が向上するとともに、対照の換算値に測定値が近似する傾向が確認された。特に、陰イオン性界面活性剤を共存させた場合、その効果は顕著であり、本発明の前処理方法を使用すれば、試料を煮沸することなく、試料中のアディポネクチン総量の測定が可能であることが判明した。
【００６８】
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的に測定するためのアディポネクチン測定用試料の前処理方法であって、アディポネクチンを含む試料に対し、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを加え、試料とともに煮沸処理することなく作用させることを特徴とする、アディポネクチン測定用試料の前処理方法。
【請求項２】
免疫学的に測定する方法が、抗アディポネクチン抗体を担持させた不溶性担体を利用する方法である請求項１に記載の前処理方法。
【請求項３】
プロテアーゼが、微生物由来のプロテアーゼ又は遺伝子組み換え技術により得られたプロテアーゼである請求項１又は２に記載の前処理方法。
【請求項４】
微生物が、バチルス属、ストレプトミセス属及びアスペルギルス属からなる群より選ばれる微生物である請求項３に記載の前処理方法。
【請求項５】
還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む、アディポネクチン総量の免疫学的測定用試料の前処理剤であって、試料とともに煮沸処理することなく試料に作用させるための前処理剤。
【請求項６】
免疫学的に測定する方法が、抗アディポネクチン抗体を担持させた不溶性担体を利用する方法である請求項５に記載の前処理剤。
【請求項７】
プロテアーゼが、微生物由来のプロテアーゼ又は遺伝子組み換え技術により得られたプロテアーゼである請求項５又は６に記載の前処理剤。
【請求項８】
微生物が、バチルス属、ストレプトミセス属及びアスペルギルス属からなる群より選ばれる微生物である請求項７項に記載の前処理剤。
【請求項９】
アディポネクチンを含む試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを加え、試料とともに煮沸処理することなく作用させた後、免疫学的にアディポネクチンを測定することを特徴とする、試料中のアディポネクチン総量の測定方法。
【請求項１０】
免疫学的に測定する方法が、抗アディポネクチン抗体を担持させた不溶性担体を利用する方法である請求項９に記載の測定方法。
【請求項１１】
プロテアーゼが、微生物由来のプロテアーゼ又は遺伝子組み換え技術により得られたプロテアーゼである請求項９又は１０に記載の測定方法。
【請求項１２】
微生物が、バチルス属、ストレプトミセス属及びアスペルギルス属からなる群より選ばれる微生物である請求項１１に記載の測定方法。
【請求項１３】
還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む第一試薬とアディポネクチンを測定するための抗体を担持させた不溶性担体を含む第二試薬よりなるアディポネクチン総量の免疫学的測定試薬であって、試料と第一試薬の反応を煮沸することなく行う方法に用いられる該測定試薬。
【請求項１】
試料中のアディポネクチンの総量を免疫学的に測定するためのアディポネクチン測定用試料の前処理方法であって、アディポネクチンを含む試料に対し、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを加え、試料とともに煮沸処理することなく作用させることを特徴とする、アディポネクチン測定用試料の前処理方法。
【請求項２】
免疫学的に測定する方法が、抗アディポネクチン抗体を担持させた不溶性担体を利用する方法である請求項１に記載の前処理方法。
【請求項３】
プロテアーゼが、微生物由来のプロテアーゼ又は遺伝子組み換え技術により得られたプロテアーゼである請求項１又は２に記載の前処理方法。
【請求項４】
微生物が、バチルス属、ストレプトミセス属及びアスペルギルス属からなる群より選ばれる微生物である請求項３に記載の前処理方法。
【請求項５】
還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む、アディポネクチン総量の免疫学的測定用試料の前処理剤であって、試料とともに煮沸処理することなく試料に作用させるための前処理剤。
【請求項６】
免疫学的に測定する方法が、抗アディポネクチン抗体を担持させた不溶性担体を利用する方法である請求項５に記載の前処理剤。
【請求項７】
プロテアーゼが、微生物由来のプロテアーゼ又は遺伝子組み換え技術により得られたプロテアーゼである請求項５又は６に記載の前処理剤。
【請求項８】
微生物が、バチルス属、ストレプトミセス属及びアスペルギルス属からなる群より選ばれる微生物である請求項７項に記載の前処理剤。
【請求項９】
アディポネクチンを含む試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを加え、試料とともに煮沸処理することなく作用させた後、免疫学的にアディポネクチンを測定することを特徴とする、試料中のアディポネクチン総量の測定方法。
【請求項１０】
免疫学的に測定する方法が、抗アディポネクチン抗体を担持させた不溶性担体を利用する方法である請求項９に記載の測定方法。
【請求項１１】
プロテアーゼが、微生物由来のプロテアーゼ又は遺伝子組み換え技術により得られたプロテアーゼである請求項９又は１０に記載の測定方法。
【請求項１２】
微生物が、バチルス属、ストレプトミセス属及びアスペルギルス属からなる群より選ばれる微生物である請求項１１に記載の測定方法。
【請求項１３】
還元剤、酸又はその塩、界面活性剤、及びプロテアーゼの内の少なくとも一つを含む第一試薬とアディポネクチンを測定するための抗体を担持させた不溶性担体を含む第二試薬よりなるアディポネクチン総量の免疫学的測定試薬であって、試料と第一試薬の反応を煮沸することなく行う方法に用いられる該測定試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３８４５８
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【発行日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４７９７（Ｐ２００５−５１４７９７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５２６１
【国際出願日】平成１６年１０月１５日（２００４．１０．１５）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【出願人】（８９９００００２４）株式会社東京大学ＴＬＯ (50)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【発行日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５２６１
【国際出願日】平成１６年１０月１５日（２００４．１０．１５）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【出願人】（８９９００００２４）株式会社東京大学ＴＬＯ (50)
【Ｆターム（参考）】
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