質量分析用基板および質量分析方法
【課題】高感度な質量分析を行なうことができる質量分析用基板およびそれを用いた質量分析方法を提供する。
【解決手段】レーザーイオン化質量分析に用いる質量分析用基板であって、アニオン種が非炭酸型である層状複水酸化物を有する質量分析用基板および質量分析方法。層状複水酸化物が、下記一般式（１）で表される化合物である。
【解決手段】レーザーイオン化質量分析に用いる質量分析用基板であって、アニオン種が非炭酸型である層状複水酸化物を有する質量分析用基板および質量分析方法。層状複水酸化物が、下記一般式（１）で表される化合物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレーザーイオン化質量分析装置用の質量分析用基板および質量分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質や合成高分子等の分子量の大きな化合物の質量分析法として、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＭＡＬＤＩ）が広く用いられている。
【０００３】
この方法は、測定分子と、マトリックスと呼ばれる比較的低分子量の化合物との混合状態を予め作っておき、その混合物に窒素レーザー（波長：３３７ｎｍ）やＹＡＧレーザー（波長：３５５ｎｍ）等によるレーザーパルスを照射することで、測定分子を非破壊的に脱離、イオン化させることにより、測定分子１分子の質量を測定する方法である。
【０００４】
測定分子の分子量が測定可能になる条件としては、先ず測定分子が１分子単位で単離されることと、単離した測定分子がアニオン若しくはカチオンのイオン化されていることである。ＭＡＬＤＩが他の質量分析手法に比較して特に高分子量タイプの測定分子の質量分析において優れている理由は、マトリックスと測定分子の混合状態において、測定分子同士が凝集することなくマトリックス中に分散されている状態を形成した後に、レーザーパルスによる脱離、イオン化が行われるため、分子量の大きな測定分子でも、１分子の単位で脱離しやすい点である。従って、測定試料の調整においては、測定分子とマトリックスの両方を溶かす溶剤を用いることが必要である。
【０００５】
マトリックス化合物の具体例としては、例えば、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）、９−ニトロアントラセン（９−ｎｉｔｒｏａｎｔｈｒａｃｅｎ）、２，５−ジヒドロキシベンゾイックアッシッド（２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＤＨＢ））、α−シアノ−ヒドロキシシンナミックアッシッド（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ））、または３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシシンナミックアシッド（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ））等の結晶性の低分子化合物を挙げることができる。
【０００６】
このように、ＭＡＬＤＩプロセスにおいては、上述のマトリックス化合物は以下の作用を有するもとの考えられている。
１）測定分子間の凝集を防ぐための媒体、
２）照射されたレーザーパルスを効率的に吸収して熱エネルギーとすることで自らが脱離する、
３）測定分子に対してイオン化を促進させる。
【０００７】
これらの作用のうち、３）においては、測定分子によってはイオン化しにくいものもあり、この場合にはイオン化プロセスは、トリフルオロ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）などの金属塩の添加等により、イオン化が行なわれので、マトリックス自身が必ずしもイオン化を担う必要はない。
【０００８】
従って、マトリックスの作用として最も重要なのは、上述の１）、２）である。ところが、測定分子によっては難溶性の化合物もあるが、このような化合物は、マトリックスと測定分子の均一な混合状態が形成しにくいため、レーザーを照射しても測定分子自身が脱離できないか、脱離しても１分子単位での脱離では無いために、分子量を正確に求めることが困難である。
【０００９】
一方、ＭＡＬＤＩは、核酸や、ペプチド、タンパク質などの生体材料の分析に広く用いられているが、この生体材料においても可溶性は様々である。ペプチドや蛋白質は複数のアミノ酸がアミド結合により結合した分子量の大きな化合物である。このアミノ酸とは中心の炭素原子にアミノ基、カルボキシル基、水素原子及び置換基Ｒが結合した構造をとるが、その性質は置換基Ｒにより変わるため、ペプチドや蛋白質も構成されるアミノ酸成分により、性質が様々である。特に、溶解性においては置換基Ｒが極性の高いものであれば水溶性が上がり、逆にフェニル基（フェニルアラニン）やプロピル基（ロイシン）を含むものの含有量が増えれば、水に対する溶解性は低下する。
【００１０】
更に、蛋白質の場合は翻訳後修飾により、糖質や脂質が結合することにより、仮に蛋白質を構成するアミノ酸自体が同一でも、その性質は変化することが知られている。
【００１１】
分子量が高いものでも上述のＭＡＬＤＩ法を利用することで、溶解性の高いペプチド、アミノ酸の質量分析は多く行われている。
一方で、可溶化剤を用いて水などの溶媒に強制的に溶解（分子分散）させた状態を作ることで、溶解性が低いペプチド、蛋白質を分析する方法がある。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などは固体状のアニオン型界面活性剤で取り扱いも容易であることから生体分子を可溶化させるために広く使用されている。しかし、質量分析においては、測定分子を１分子の単位で単離した状態にする必要があるものの、このＳＤＳのような可溶化剤が測定分子の脱離、イオン化を阻害することが知られている。
【００１２】
ＳＤＳのような可溶化剤は、マトリックス化合物により吸収される波長のレーザー光に対して、殆ど感受性を持たない。すなわち、可溶化剤を用いて不溶性蛋白質分子を分析物とする場合、分析物及びマトリックス化合物以外に、レーザー光には殆ど反応しない可溶化剤が、測定分子周囲に多く存在することになる。この場合、レーザー光により励起されたマトリックス化合物分子の内部エネルギーは、マトリックス化合物分子周辺に存在する可溶化剤分子によって、急速に緩和する。そして、溶液相中で、熱的閉じ込め及び応力閉じ込めによるエネルギー蓄積の機構を実現することができず、効率的な測定分子の熱的脱離を妨げる。すなわち、上記ＭＡＬＤＩにおいて、可溶化剤は、分析物分子のイオン化を阻害するように作用する。それゆえ、これまでのＭＡＬＤＩでは、可溶化剤を用いた不溶性蛋白質の高感度の質量分析が困難になるという問題点がある。
【００１３】
この問題を解決するため、特許文献１には、２種類のレーザー光を有する装置が開示されている。この方法は、マトリックスと可溶化剤のそれぞれに作用するレーザーパルスを照射することで、測定分子の脱離、イオン化を促進させるという発明である。この方法では測定分子の効率的な脱離、イオン化が期待できるものの、特に可溶化剤励起のために自由電子レーザーを用いており、測定装置として大掛かりなものである。そのため、現在広く普及しているＭＡＬＤＩ型の質量分析装置で可溶化剤を用いた試料の質量分析が困難であるという課題を解決していない。
【００１４】
一方、非特許文献１においてはイオン交換樹脂を担持したシリカゲルを測定分子、マトリックス分子混合物に添加する方法が開示されているが、シリカゲルの形状や粒径による質量スペクトルの依存性がある。また、シリカゲルの場合は、界面活性剤の吸着は、イオン交換樹脂の担持量に依存するが、多くの界面活性剤の吸着には限界がある。更に、シリカゲル自体多孔質体であるため、界面活性剤だけではなく、質量分析装置での検出を目的とする測定分子自体をも吸着する可能性があり、まだ確立された方法には至っていない。
【特許文献１】特開２００５−２４３４６６号公報
【非特許文献１】Ｆｕｋｕｚａｗａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７７，５７５０−５７５４（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、レーザーイオン化質量分析において、高感度な質量分析を行なうことができる質量分析用基板および質量分析方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上述の課題に鑑み鋭意検討した結果、可溶化剤として用いられているＳＤＳのようなアニオン型界面活性剤を選択的に吸収する層状複水酸化物（Ｌａｙｅｒｅｄ Ｄｏｕｂｌｅ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）に着目し、質量分子測定試料中のアニオン性可溶化剤の影響を極力抑制しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
上記の課題を解決する質量分析用基板は、レーザーイオン化質量分析に用いる質量分析用基板であって、アニオン種が非炭酸型である層状複水酸化物を有することを特徴とする。
【００１８】
また、上記の課題を解決する質量分析方法は、上記の質量分析用基板上に試料を載置してレーザーを照射する工程を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、アニオン性界面活性剤が含有されている質量分析用の分析試料において、アニオン種が炭酸イオン以外の層状複水酸化物を作用させることで、アニオン性界面活性剤の影響を排除し、高感度な質量分析を行なうことができる質量分析用基板および質量分析方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る質量分析用基板は、レーザーイオン化質量分析に用いる質量分析用基板であって、アニオン種が非炭酸型である層状複水酸化物を有することを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る質量分析方法は、上記の質量分析用基板上に試料を載置してレーザーを照射する工程を有することを特徴とする。
本発明において、質量分析用基板上における試料調整において、少なくともＳＤＳ等のアニオン性界面活性剤と、測定試料分子とを含有した溶液に、アニオン種が非炭酸型である層状複水酸化物を作用させることを特徴としている。
【００２２】
前記層状複水酸化物が、下記一般式（１）で表される化合物が料好ましい。
【００２３】
【化１】
【００２４】
（式中、Ｍ２＋はＭｇ２＋，Ｍｎ２＋，Ｎｉ２＋，Ｚｎ２＋から選ばれる金属の２価カチオンを示す。Ｍ３＋はＡｌ３＋，Ｃｒ３＋，Ｆｅ３＋，Ｃｏ３＋から選ばれる金属の３価カチオンを示す。Ａｎ−はＯＨ−、Ｃｌ−、Ｆ−、Ｉ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−，ＳＯ４２‐から選ばれるアニオンを示す。Ｘは０．２以上０．３３以下の数値を示す。ｎはアニオンの負電荷を示す価数である。）
また、前記層状複水酸化物のアニオン種Ａが、よう素アニオンもしくは硝酸イオンであることが好ましい。
【００２５】
前記層状複水酸化物が波長３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の紫外線を吸収することが好ましい。
前記試料に、分子量が５００以下のアニオン性界面活性剤を含有させてレーザーを照射することが好ましい。
【００２６】
本発明において、前記層状複水酸化物は層状構造からなり、該層状構造は、下記一般式（１）で表される化合物
【００２７】
【化２】
【００２８】
が層状に配置して形成されている。２価の金属水酸化物層に３価の金属イオンがランダムに置換固溶化しており、Ｍ３＋の置換量に依存して層の正電荷量が決まる。この正電荷を層間アニオンが中和し、アニオンが占めた残りのスペースはＨ２Ｏが満たしている。
【００２９】
層状複水酸化物と酸成分（アニオン種）が作用すると、アニオン種が、正電荷を帯びている層状複水酸化物のカチオン層との静電的な相互作用のために、層状複水酸化物のカチオン層間へ取り込まれる。
【００３０】
層状複水酸化物によるアニオン種の取り込み作用を応用した例として、ハイドロタルサイト（Ｈｙｄｒｏｔａｌｃｉｔｅ）（Ｍ２＋＝Ｍｇ２＋、Ｍ３＋＝Ａｌ３＋、Ａ２−−＝ＣＯ３２−）を医薬用制酸剤や電子写真装置の放電プロセスで生成する酸成分の吸着剤として電子写真トナーへの添加剤として応用した例が知られている。また、最近では環境浄化を目的とした亜ヒ酸やセレン酸の吸着剤への応用が期待されている。しかしながら、界面活性剤のような分子サイズが無機酸類に比べて大きくなる化合物の場合は、層状複水酸化物の層間への取り込みは、必ずしも容易ではなく、特に層状複水酸化物のアニオン成分：Ａに依存する。特に、天然に存在し、層状複水酸化物として最も一般的な化合物は、ハイドロタルサイト（Ｈｙｄｒｏｔａｌｃｉｔｅ）やパイロオーライト（Ｐｙｒｏａｕｒｉｔｅ）のようなアニオン種が炭酸である化合物であるが、このアニオン種が炭酸である場合には、例え層状複水酸化物にアニオン性界面活性剤を作用させても、層状複水酸化物層間に界面活性剤を取り込むことができない。
【００３１】
本発明者らは、質量分析において、蛋白質の可溶化剤であるアニオン性界面活性剤の影響を除去する目的のためには、層状複水酸化物のアニオン種として炭酸以外の化合物を用いる必要があることを見出した。
【００３２】
層状複水酸化物は、可溶化剤であるアニオン性界面活性剤の影響を除くために用いる。層状複水酸化物のうち、金属イオン（Ｍ）の種類により光学的特性が変わる。本発明においては、３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の紫外線域に、より好ましくは３３０ｎｍ以上３６０ｎｍ以下の紫外線域に層状複水酸化物自身が吸収を有するものがよい。具体的には、Ｍ２＋がＭｎ２＋，Ｎｉ２＋，Ｚｎ２＋であり、Ｍ３＋はＡｌ３＋，Ｆｅ３＋である。またこれらの金属の比率に関わる比率Ｘは、層状複水酸化物の合成の際に用いる原料の比率でコントロールすることが可能である。
【００３３】
アニオン性界面活性剤の取り込みは、層状複水酸化物のカチオン層の電荷がドライビングフォースになると考えられるため、Ｘの値としては０．２から０．３３、好ましくは０．２５から０．３３、より好ましくは０．３から０．３３である。このうように、層状複水酸化物の場合は、一枚の層の電荷的な欠陥が非常に多くあることから、イオン性界面活性剤を表に効率よく吸着できる。
【００３４】
またアニオン種類Ａｎ−については、ＯＨ−、Ｃｌ−、Ｆ−、Ｉ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−，ＳＯ４２−等を挙げることができるが、アニオン性界面活性剤との交換反応の観点から、好ましくはＦ−、Ｉ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−であり、より好ましくはＩ−、ＮＯ３−である。
【００３５】
層状複水酸化物の合成法には、共沈法、均一沈殿法、水熱合成法、イオン交換法等が知られている。特に本発明に用いる層状複水酸化物の合成としては、共沈法若しくはイオン交換法が好ましい。
【００３６】
共沈法は、目的とする層状複水酸化物の金属成分、Ｍ２＋の塩の水溶液と、Ｍ３＋の塩の水溶液をアルカリ条件下で沈殿させること方法である。ことのとき、これらの金属塩のアニオンは、目的とする層状複水酸化物のアニオン種（例えば、Ｉ−やＮＯ３−など）を用いることになる。また、イオン交換法は、一旦、目的とする金属イオンを用いて炭酸型層状複水酸化物を合成した後に、アニオン種を目的とするものと変換する手法である。
【００３７】
また、層状複水酸化物は合成方法により、その結晶の大きさが異なる。例えば尿素を用いた均一沈殿法では、比較的粒径の大きい結晶を作ることが可能となる。層状複水酸化物の結晶の形態としては燐片状である。本発明において、層状複水酸化物の結晶の大きさとは、この燐片状の厚さ方向ではなく面内方向の直径を指す。本発明においては、大きな粒径である必要はなく寧ろ、アニオン性界面活性剤が層状複水酸化物の層間に入ることを鑑みると、粒径は小さいほうがよく、２００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下がよい。従って、共沈法、若しくはイオン交換法を好適に用いることが出来る。
【００３８】
また、実際の質量分析においては、層状複水酸化物とアニオン型界面活性剤を含有する測定試料とが接触すると、界面活性剤が層状複水酸化物の層間へ取り込まれる。接触方法としては、予め質量分析用基板上に、層状複水酸化物の微結晶を固定化しておく方法や、アニオン性界面活性剤を含む測定試料溶液中に、層状複水酸化物の微結晶を分散させる方法がある。基板に固定する場合、層状複水酸化物の結晶の形態から考えると、基板が全く平坦である場合には、層状複水酸化物の燐片状の結晶は基板面に張り付くように固定される。従って、より効果的なアニオン性界面活性剤の吸着を鑑みた場合には、燐片状の結晶が基板面に対して立っている状態が好ましい。この形態を実現するには、層状複水酸化物を固定する基板として、層状複水酸化物の結晶と同程度の大きさの凹凸を持つ基板がよい。
【００３９】
また、層状複水酸化物体は層構造を有する結晶性の化合物であるが、シリカゲルのような多孔質体ではなく、分子量が１０００以下の界面活性剤程度の比較的分子量の小さい化合物しか取り込めない。このことは、質量分析においては、検出を目的とするタンパクやペプチドといった分子量の大きい分子を層状複水酸化物層間には取り込まず、シリカゲルのような検出を目的とする測定分子自体を固定化する問題はない。
【００４０】
アニオン性界面活性剤を含有する測定試料中には、測定を目的とする試料、測定試料の可溶化剤であるアニオン性界面活性剤のほかＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳにおいて脱離、イオン化を促進する目的で、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）、９−ニトロアントラセン（９−ｎｉｔｒｏａｎｔｈｒａｃｅｎ）、２，５−ジヒドロキシベンゾイックアッシッド（２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＤＨＢ））、α−シアノ−ヒドロキシシンナミックアッシッド（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ））、または３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシシンナミックアシッド（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ））等の従来公知のマトリックス分子を添加することが可能である。本発明においては、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）若しくは９−ニトロアントラセン（９−ｎｉｔｒｏａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）を好適に用いることができる。
【００４１】
更に、本発明ではイオン化促進剤としてトリフルオロ酢酸の金属塩（金属はＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ａｇ）などの金属塩を添加することが可能である。
測定試料溶液の溶剤としては、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパルノール、テトラヒドロフラン等の従来、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定用試料調整に用いられている溶媒を用いることが可能である。
【００４２】
本発明においては、これらの溶媒以外に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いることで、より効率的なアニオン性界面活性剤の取り込みがおこることを見出した。その作用メカニズムついては必ずしも明白ではないが、ＤＭＦを添加することで、層状複水酸化物のカチオン層の間がある程度膨潤し、比較的分子サイズの大きいアニオン性界面活性剤が取り込まれ易くなった可能性を挙げることができる。
【００４３】
また、層状複水酸化物を固定化する基板としては、ある程度の導電性があるものが好ましく、ステンレス、アルミニウムの他、金や白金等の金属、或いはシリコンウエハーやチタニアのような半導体を用いることが可能となる。
【００４４】
また、アニオン性界面活性剤としては、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルアミド硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルアミドリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩、アルキロイルアルキルタウリン塩、Ｎ−長鎖アシルアミノ酸塩等が挙げられ、スルホコハク酸塩としては、オレイン酸アミドスルホコハク酸塩、ポリオキシエチレンスルホコハク酸塩、スルホコハク酸アルキル塩、スルホコハク酸ポリオキシエチレンアルキロイルエタノールアミド塩等の従来公知のものを用いることが可能であるが、取り扱いの容易性や、層状複水酸化物への取り込みやすさ、水溶性を考慮すると分子量が５００以下のものが好ましい。具体的には、アルキル硫酸塩のうちアルキル鎖の炭素数が８から１６程度で、金属がＬｉ、Ｎａ、Ｋのアルカリ金属である化合物が好ましい。
【００４５】
本発明の質量分析方法に用いることができる試料は、膜蛋白質、膜蛋白質の膜中ドメインペプチド鎖等の脂溶性化合物、合成高分子が挙げられる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
＜合成例１＞
以下の手法に従い、２価金属：、Ｍ２＋＝Ｍｇ２＋、３価金属：Ｍ３＋＝Ａｌ３＋、アニオン種：ＮＯ３−である硝酸型のＭｇ／Ａｌ系層状複水酸化物を合成した。
【００４７】
硝酸マグネシウム六水和物及び硝酸アルミニウム六水和物（共にキシダ化学製、特級）をマグネシウム：アルミニウムのモル比が２：１になるように重量を調整し、これらを窒素バブリングさせながら、純水に溶解させた。このとき、金属イオンの総量が１ｍｏｌ／ｄｍ３になるように調整する。得た混合液４５０ｃｍ３を、窒素バブリングさせながら０．５ｍｏｌ／ｄｍ３硝酸ナトリウム水溶液２００ｃｍ３に滴下し加えた。このとき、溶液のｐＨが約１０に保たれるように３ｍｏｌ／ｄｍ３水酸化ナトリウム水溶液も同時に滴下した。一時間ほど掛けて全ての混合溶液を加えた後、２０度、１８時間攪拌し、沈殿物としてＡｌ−Ｍｎ型層状複水酸化物を得た。得たＡｌ−Ｍｎ型層状複水酸化物を５０℃の窒素条件下にて乾燥した。
【００４８】
生成物を酸性水溶液中にて溶解し、ＩＣＰ組成分析を行った結果、この複水酸化物はおおよそ［Ｍｇ２＋０．６７Ａｌ３＋０．３３（ＯＨ）２］０．３３＋［ＮＯ３−］０．３３−である。
【００４９】
図１は、合成例１で得られたＭｇ−Ａｌの硝酸型層状複水酸化物の粉末Ｘ線回折を示す図である。図１の粉末のＸ線回折分析の結果、基本面間隔が約０．８９ｎｍ（８．９Å）の層状物質であることから、層間のアニオン種は硝酸イオンであることが明らかとなった。また、ＳＥＭによる観察の結果、生成物は板状の形態をしており、その径がおおよそ２０から３００ｎｍの結晶が多く観察された。
【００５０】
＜合成例２＞
以下の手法に従い、２価金属：、Ｍ２＋＝Ｍｎ２＋、３価金属：Ｍ３＋＝Ａｌ３＋、アニオン種：ＮＯ３−である硝酸型のＭｎ／Ａｌ系層状複水酸化物を合成した。
【００５１】
硝酸マンガン六水和物及び硝酸アルミニウム六水和物（共にキシダ化学製、特級）をニッケル：マンガンのモル比が２：１になるように重量を調整し、これらを窒素バブリングさせながら、純水に溶解させた。このとき、金属イオンの総量が１ｍｏｌ／ｄｍ３になるように調整する。得た混合液４５０ｃｍ３を、窒素バブリングさせながら０．５ｍｏｌ／ｄｍ３硝酸ナトリウム水溶液２００ｃｍ３に滴下し加えた。このとき、溶液のｐＨが約１０に保たれるように３ｍｏｌ／ｄｍ３水酸化ナトリウム水溶液も同時に滴下した。一時間ほど掛けて全ての混合溶液を加えた後、２０度、１８時間攪拌し、沈殿物としてＡｌ−Ｍｎ型層状複水酸化物を得た。得たＡｌ−Ｍｎ型層状複水酸化物を５０℃の窒素条件下にて乾燥した。
【００５２】
生成物を酸性水溶液中にて溶解し、ＩＣＰ組成分析を行った結果、この複水酸化物はおおよそ［Ｍｎ２＋０．６７Ａｌ３＋０．３３（ＯＨ）２］０．３３＋［ＮＯ３−］０．３３−である。
【００５３】
図２は、合成例２で得られたＭｎ−Ａｌの硝酸型層状複水酸化物の粉末Ｘ線回折を示す図である。図２の粉末のＸ線回折分析の結果、基本面間隔が約０．８９ｎｍ（８．９Å）の層状物質であることから、層間のアニオン種は硝酸イオンであることが明らかとなった。また、ＳＥＭによる観察の結果、生成物は板状の形態をしており、その径がおおよそ１５０から２００ｎｍの結晶が多く観察された。
【００５４】
＜実施例１＞
合成例１で得られた硝酸型のＭｇ／Ａｌ系層状複水酸化物：０．１ｇをエタノール１ｇへ添加し、超音波洗浄器にて超音波を３分照射して分散した。この分散液を、ステンレス製の質量分析基板の上に３μＬ滴下して溶剤を乾燥させた。
【００５５】
次いで、２ｗｔ％の濃度となるようにドデシル硫酸ナトリウムを溶解した水溶液を用いて、アンジオテンシン（分子量：１３００）が１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度になるように測定試料溶液を調整した。この溶液を、層状複水酸化物分散液を滴下・乾燥した部分に１μＬ滴下し、乾燥した。
【００５６】
さらに、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）のエタノール溶液（５ｗｔ％）を層状複水酸化物−測定試料の上に滴下、乾燥させた。
この試料基板を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（ＲＥＦＬＥＸ−ＩＩＩ、ブルカー・ダルトンクス製）に装着し、カチオン検出モードにて測定を行った。図３は分子量約１３００のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す図である。
【００５７】
＜比較例１＞
ステンレス製の質量分析基板の上に２ｗｔ％の濃度となるようにドデシル硫酸ナトリウムを溶解した水溶液を用いて、分子量約１３００ｇ／ｍｏｌのペプチドが１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度になるように測定試料溶液を調整した。この溶液を、層状複水酸化物分散液を滴下・乾燥した部分に１μＬ滴下した、乾燥した。
【００５８】
さらに、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）のエタノール溶液（５ｗｔ％）を層状複水酸化物−測定試料の上に滴下、乾燥させた。
この試料基板を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（ＲＥＦＬＥＸ−ＩＩＩ、ブルカー・ダルトンクス製）に装着し、カチオン検出モードにて測定を行った。図３に分子量約１３００のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す。
【００５９】
＜実施例２＞
合成例１で得られた硝酸型のＭｎ／Ａｌ系層状複水酸化物：０．１ｇをエタノール１ｇへ添加し、超音波洗浄器にて超音波を３分照射して分散した。この分散液を、ステンレス製の質量分析基板の上に３μＬ滴下して溶剤を乾燥させた。
【００６０】
次いで、２ｗｔ％の濃度となるようにドデシル硫酸ナトリウムを溶解した水溶液を用いて、分子量が約１７６０ｇ／ｍｏｌのペプチドを１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度になるように調整した測定試料溶液を準備した。この溶液を、層状複水酸化物分散液を滴下・乾燥した部分に１μＬ滴下した、乾燥した。
【００６１】
さらに、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）のエタノール溶液（５ｗｔ％）を層状複水酸化物−測定試料の上に滴下し、乾燥させた。
この試料基板を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（ＲＥＦＬＥＸ−ＩＩＩ、ブルカー・ダルトニクス製）に装着し、カチオン検出モードにて測定を行った。図４は分子量約１７６０のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す図である。
【００６２】
＜比較例２＞
ステンレス製の質量分析基板の上に２ｗｔ％の濃度となるようにドデシル硫酸ナトリウムを溶解した水溶液を用いて、分子量が約１７６０ｇ／ｍｏｌのペプチドを１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度になるように調整した測定試料溶液を準備した。この溶液を、層状複水酸化物分散液を滴下・乾燥した部分に１μＬ滴下した、乾燥した。
さらに、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）のエタノール溶液（５ｗｔ％）を１μＬとり層状複水酸化物−測定試料の上に滴下、乾燥させた。
【００６３】
この試料基板を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（ＲＥＦＬＥＸ−ＩＩＩ、ブルカー・ダルトンクス製）に装着し、カチオン検出モードにて測定を行った。図４に分子量約１７６０のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す。
【００６４】
＜参考例＞
分子量が約１７６０ｇ／ｍｏｌのペプチドを１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度になるように調整した測定試料水溶液を準備した。この溶液を、ステンレス製の質量分析基板の上に１μＬ滴下した、乾燥した。
【００６５】
さらに、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）のエタノール溶液（５ｗｔ％）を層状複水酸化物−測定試料の上に、１μＬ滴下・乾燥させた。
【００６６】
この試料基板を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（ＲＥＦＬＥＸ−ＩＩＩ、ブルカー・ダルトンクス製）に装着し、カチオン検出モードにて測定を行った。図４に分子量約１７６０のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す。
【００６７】
図３及び図４に示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルから明らかなように、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）による信号強度の低下は、非炭酸型層状複水酸化物により大きく回復することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の質量分析用基板は、アニオン性界面活性剤が含有されている質量分析用の分析試料において、アニオン種が炭酸イオン以外の層状複水酸化物を作用させることで、アニオン性界面活性剤の影響を排除し、高感度な質量分析を行なうことができるので、質量分析に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】合成例１で得られたＭｇ−Ａｌの硝酸型層状複水酸化物の粉末Ｘ線回折を示す図である。
【図２】合成例２で得られたＭｎ−Ａｌの硝酸型層状複水酸化物の粉末Ｘ線回折を示す図である。
【図３】分子量約１３００のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す図である。
【図４】分子量約１７６０のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はレーザーイオン化質量分析装置用の質量分析用基板および質量分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質や合成高分子等の分子量の大きな化合物の質量分析法として、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＭＡＬＤＩ）が広く用いられている。
【０００３】
この方法は、測定分子と、マトリックスと呼ばれる比較的低分子量の化合物との混合状態を予め作っておき、その混合物に窒素レーザー（波長：３３７ｎｍ）やＹＡＧレーザー（波長：３５５ｎｍ）等によるレーザーパルスを照射することで、測定分子を非破壊的に脱離、イオン化させることにより、測定分子１分子の質量を測定する方法である。
【０００４】
測定分子の分子量が測定可能になる条件としては、先ず測定分子が１分子単位で単離されることと、単離した測定分子がアニオン若しくはカチオンのイオン化されていることである。ＭＡＬＤＩが他の質量分析手法に比較して特に高分子量タイプの測定分子の質量分析において優れている理由は、マトリックスと測定分子の混合状態において、測定分子同士が凝集することなくマトリックス中に分散されている状態を形成した後に、レーザーパルスによる脱離、イオン化が行われるため、分子量の大きな測定分子でも、１分子の単位で脱離しやすい点である。従って、測定試料の調整においては、測定分子とマトリックスの両方を溶かす溶剤を用いることが必要である。
【０００５】
マトリックス化合物の具体例としては、例えば、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）、９−ニトロアントラセン（９−ｎｉｔｒｏａｎｔｈｒａｃｅｎ）、２，５−ジヒドロキシベンゾイックアッシッド（２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＤＨＢ））、α−シアノ−ヒドロキシシンナミックアッシッド（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ））、または３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシシンナミックアシッド（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ））等の結晶性の低分子化合物を挙げることができる。
【０００６】
このように、ＭＡＬＤＩプロセスにおいては、上述のマトリックス化合物は以下の作用を有するもとの考えられている。
１）測定分子間の凝集を防ぐための媒体、
２）照射されたレーザーパルスを効率的に吸収して熱エネルギーとすることで自らが脱離する、
３）測定分子に対してイオン化を促進させる。
【０００７】
これらの作用のうち、３）においては、測定分子によってはイオン化しにくいものもあり、この場合にはイオン化プロセスは、トリフルオロ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）などの金属塩の添加等により、イオン化が行なわれので、マトリックス自身が必ずしもイオン化を担う必要はない。
【０００８】
従って、マトリックスの作用として最も重要なのは、上述の１）、２）である。ところが、測定分子によっては難溶性の化合物もあるが、このような化合物は、マトリックスと測定分子の均一な混合状態が形成しにくいため、レーザーを照射しても測定分子自身が脱離できないか、脱離しても１分子単位での脱離では無いために、分子量を正確に求めることが困難である。
【０００９】
一方、ＭＡＬＤＩは、核酸や、ペプチド、タンパク質などの生体材料の分析に広く用いられているが、この生体材料においても可溶性は様々である。ペプチドや蛋白質は複数のアミノ酸がアミド結合により結合した分子量の大きな化合物である。このアミノ酸とは中心の炭素原子にアミノ基、カルボキシル基、水素原子及び置換基Ｒが結合した構造をとるが、その性質は置換基Ｒにより変わるため、ペプチドや蛋白質も構成されるアミノ酸成分により、性質が様々である。特に、溶解性においては置換基Ｒが極性の高いものであれば水溶性が上がり、逆にフェニル基（フェニルアラニン）やプロピル基（ロイシン）を含むものの含有量が増えれば、水に対する溶解性は低下する。
【００１０】
更に、蛋白質の場合は翻訳後修飾により、糖質や脂質が結合することにより、仮に蛋白質を構成するアミノ酸自体が同一でも、その性質は変化することが知られている。
【００１１】
分子量が高いものでも上述のＭＡＬＤＩ法を利用することで、溶解性の高いペプチド、アミノ酸の質量分析は多く行われている。
一方で、可溶化剤を用いて水などの溶媒に強制的に溶解（分子分散）させた状態を作ることで、溶解性が低いペプチド、蛋白質を分析する方法がある。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などは固体状のアニオン型界面活性剤で取り扱いも容易であることから生体分子を可溶化させるために広く使用されている。しかし、質量分析においては、測定分子を１分子の単位で単離した状態にする必要があるものの、このＳＤＳのような可溶化剤が測定分子の脱離、イオン化を阻害することが知られている。
【００１２】
ＳＤＳのような可溶化剤は、マトリックス化合物により吸収される波長のレーザー光に対して、殆ど感受性を持たない。すなわち、可溶化剤を用いて不溶性蛋白質分子を分析物とする場合、分析物及びマトリックス化合物以外に、レーザー光には殆ど反応しない可溶化剤が、測定分子周囲に多く存在することになる。この場合、レーザー光により励起されたマトリックス化合物分子の内部エネルギーは、マトリックス化合物分子周辺に存在する可溶化剤分子によって、急速に緩和する。そして、溶液相中で、熱的閉じ込め及び応力閉じ込めによるエネルギー蓄積の機構を実現することができず、効率的な測定分子の熱的脱離を妨げる。すなわち、上記ＭＡＬＤＩにおいて、可溶化剤は、分析物分子のイオン化を阻害するように作用する。それゆえ、これまでのＭＡＬＤＩでは、可溶化剤を用いた不溶性蛋白質の高感度の質量分析が困難になるという問題点がある。
【００１３】
この問題を解決するため、特許文献１には、２種類のレーザー光を有する装置が開示されている。この方法は、マトリックスと可溶化剤のそれぞれに作用するレーザーパルスを照射することで、測定分子の脱離、イオン化を促進させるという発明である。この方法では測定分子の効率的な脱離、イオン化が期待できるものの、特に可溶化剤励起のために自由電子レーザーを用いており、測定装置として大掛かりなものである。そのため、現在広く普及しているＭＡＬＤＩ型の質量分析装置で可溶化剤を用いた試料の質量分析が困難であるという課題を解決していない。
【００１４】
一方、非特許文献１においてはイオン交換樹脂を担持したシリカゲルを測定分子、マトリックス分子混合物に添加する方法が開示されているが、シリカゲルの形状や粒径による質量スペクトルの依存性がある。また、シリカゲルの場合は、界面活性剤の吸着は、イオン交換樹脂の担持量に依存するが、多くの界面活性剤の吸着には限界がある。更に、シリカゲル自体多孔質体であるため、界面活性剤だけではなく、質量分析装置での検出を目的とする測定分子自体をも吸着する可能性があり、まだ確立された方法には至っていない。
【特許文献１】特開２００５−２４３４６６号公報
【非特許文献１】Ｆｕｋｕｚａｗａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７７，５７５０−５７５４（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、レーザーイオン化質量分析において、高感度な質量分析を行なうことができる質量分析用基板および質量分析方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上述の課題に鑑み鋭意検討した結果、可溶化剤として用いられているＳＤＳのようなアニオン型界面活性剤を選択的に吸収する層状複水酸化物（Ｌａｙｅｒｅｄ Ｄｏｕｂｌｅ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）に着目し、質量分子測定試料中のアニオン性可溶化剤の影響を極力抑制しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
上記の課題を解決する質量分析用基板は、レーザーイオン化質量分析に用いる質量分析用基板であって、アニオン種が非炭酸型である層状複水酸化物を有することを特徴とする。
【００１８】
また、上記の課題を解決する質量分析方法は、上記の質量分析用基板上に試料を載置してレーザーを照射する工程を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、アニオン性界面活性剤が含有されている質量分析用の分析試料において、アニオン種が炭酸イオン以外の層状複水酸化物を作用させることで、アニオン性界面活性剤の影響を排除し、高感度な質量分析を行なうことができる質量分析用基板および質量分析方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る質量分析用基板は、レーザーイオン化質量分析に用いる質量分析用基板であって、アニオン種が非炭酸型である層状複水酸化物を有することを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る質量分析方法は、上記の質量分析用基板上に試料を載置してレーザーを照射する工程を有することを特徴とする。
本発明において、質量分析用基板上における試料調整において、少なくともＳＤＳ等のアニオン性界面活性剤と、測定試料分子とを含有した溶液に、アニオン種が非炭酸型である層状複水酸化物を作用させることを特徴としている。
【００２２】
前記層状複水酸化物が、下記一般式（１）で表される化合物が料好ましい。
【００２３】
【化１】
【００２４】
（式中、Ｍ２＋はＭｇ２＋，Ｍｎ２＋，Ｎｉ２＋，Ｚｎ２＋から選ばれる金属の２価カチオンを示す。Ｍ３＋はＡｌ３＋，Ｃｒ３＋，Ｆｅ３＋，Ｃｏ３＋から選ばれる金属の３価カチオンを示す。Ａｎ−はＯＨ−、Ｃｌ−、Ｆ−、Ｉ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−，ＳＯ４２‐から選ばれるアニオンを示す。Ｘは０．２以上０．３３以下の数値を示す。ｎはアニオンの負電荷を示す価数である。）
また、前記層状複水酸化物のアニオン種Ａが、よう素アニオンもしくは硝酸イオンであることが好ましい。
【００２５】
前記層状複水酸化物が波長３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の紫外線を吸収することが好ましい。
前記試料に、分子量が５００以下のアニオン性界面活性剤を含有させてレーザーを照射することが好ましい。
【００２６】
本発明において、前記層状複水酸化物は層状構造からなり、該層状構造は、下記一般式（１）で表される化合物
【００２７】
【化２】
【００２８】
が層状に配置して形成されている。２価の金属水酸化物層に３価の金属イオンがランダムに置換固溶化しており、Ｍ３＋の置換量に依存して層の正電荷量が決まる。この正電荷を層間アニオンが中和し、アニオンが占めた残りのスペースはＨ２Ｏが満たしている。
【００２９】
層状複水酸化物と酸成分（アニオン種）が作用すると、アニオン種が、正電荷を帯びている層状複水酸化物のカチオン層との静電的な相互作用のために、層状複水酸化物のカチオン層間へ取り込まれる。
【００３０】
層状複水酸化物によるアニオン種の取り込み作用を応用した例として、ハイドロタルサイト（Ｈｙｄｒｏｔａｌｃｉｔｅ）（Ｍ２＋＝Ｍｇ２＋、Ｍ３＋＝Ａｌ３＋、Ａ２−−＝ＣＯ３２−）を医薬用制酸剤や電子写真装置の放電プロセスで生成する酸成分の吸着剤として電子写真トナーへの添加剤として応用した例が知られている。また、最近では環境浄化を目的とした亜ヒ酸やセレン酸の吸着剤への応用が期待されている。しかしながら、界面活性剤のような分子サイズが無機酸類に比べて大きくなる化合物の場合は、層状複水酸化物の層間への取り込みは、必ずしも容易ではなく、特に層状複水酸化物のアニオン成分：Ａに依存する。特に、天然に存在し、層状複水酸化物として最も一般的な化合物は、ハイドロタルサイト（Ｈｙｄｒｏｔａｌｃｉｔｅ）やパイロオーライト（Ｐｙｒｏａｕｒｉｔｅ）のようなアニオン種が炭酸である化合物であるが、このアニオン種が炭酸である場合には、例え層状複水酸化物にアニオン性界面活性剤を作用させても、層状複水酸化物層間に界面活性剤を取り込むことができない。
【００３１】
本発明者らは、質量分析において、蛋白質の可溶化剤であるアニオン性界面活性剤の影響を除去する目的のためには、層状複水酸化物のアニオン種として炭酸以外の化合物を用いる必要があることを見出した。
【００３２】
層状複水酸化物は、可溶化剤であるアニオン性界面活性剤の影響を除くために用いる。層状複水酸化物のうち、金属イオン（Ｍ）の種類により光学的特性が変わる。本発明においては、３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の紫外線域に、より好ましくは３３０ｎｍ以上３６０ｎｍ以下の紫外線域に層状複水酸化物自身が吸収を有するものがよい。具体的には、Ｍ２＋がＭｎ２＋，Ｎｉ２＋，Ｚｎ２＋であり、Ｍ３＋はＡｌ３＋，Ｆｅ３＋である。またこれらの金属の比率に関わる比率Ｘは、層状複水酸化物の合成の際に用いる原料の比率でコントロールすることが可能である。
【００３３】
アニオン性界面活性剤の取り込みは、層状複水酸化物のカチオン層の電荷がドライビングフォースになると考えられるため、Ｘの値としては０．２から０．３３、好ましくは０．２５から０．３３、より好ましくは０．３から０．３３である。このうように、層状複水酸化物の場合は、一枚の層の電荷的な欠陥が非常に多くあることから、イオン性界面活性剤を表に効率よく吸着できる。
【００３４】
またアニオン種類Ａｎ−については、ＯＨ−、Ｃｌ−、Ｆ−、Ｉ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−，ＳＯ４２−等を挙げることができるが、アニオン性界面活性剤との交換反応の観点から、好ましくはＦ−、Ｉ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−であり、より好ましくはＩ−、ＮＯ３−である。
【００３５】
層状複水酸化物の合成法には、共沈法、均一沈殿法、水熱合成法、イオン交換法等が知られている。特に本発明に用いる層状複水酸化物の合成としては、共沈法若しくはイオン交換法が好ましい。
【００３６】
共沈法は、目的とする層状複水酸化物の金属成分、Ｍ２＋の塩の水溶液と、Ｍ３＋の塩の水溶液をアルカリ条件下で沈殿させること方法である。ことのとき、これらの金属塩のアニオンは、目的とする層状複水酸化物のアニオン種（例えば、Ｉ−やＮＯ３−など）を用いることになる。また、イオン交換法は、一旦、目的とする金属イオンを用いて炭酸型層状複水酸化物を合成した後に、アニオン種を目的とするものと変換する手法である。
【００３７】
また、層状複水酸化物は合成方法により、その結晶の大きさが異なる。例えば尿素を用いた均一沈殿法では、比較的粒径の大きい結晶を作ることが可能となる。層状複水酸化物の結晶の形態としては燐片状である。本発明において、層状複水酸化物の結晶の大きさとは、この燐片状の厚さ方向ではなく面内方向の直径を指す。本発明においては、大きな粒径である必要はなく寧ろ、アニオン性界面活性剤が層状複水酸化物の層間に入ることを鑑みると、粒径は小さいほうがよく、２００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下がよい。従って、共沈法、若しくはイオン交換法を好適に用いることが出来る。
【００３８】
また、実際の質量分析においては、層状複水酸化物とアニオン型界面活性剤を含有する測定試料とが接触すると、界面活性剤が層状複水酸化物の層間へ取り込まれる。接触方法としては、予め質量分析用基板上に、層状複水酸化物の微結晶を固定化しておく方法や、アニオン性界面活性剤を含む測定試料溶液中に、層状複水酸化物の微結晶を分散させる方法がある。基板に固定する場合、層状複水酸化物の結晶の形態から考えると、基板が全く平坦である場合には、層状複水酸化物の燐片状の結晶は基板面に張り付くように固定される。従って、より効果的なアニオン性界面活性剤の吸着を鑑みた場合には、燐片状の結晶が基板面に対して立っている状態が好ましい。この形態を実現するには、層状複水酸化物を固定する基板として、層状複水酸化物の結晶と同程度の大きさの凹凸を持つ基板がよい。
【００３９】
また、層状複水酸化物体は層構造を有する結晶性の化合物であるが、シリカゲルのような多孔質体ではなく、分子量が１０００以下の界面活性剤程度の比較的分子量の小さい化合物しか取り込めない。このことは、質量分析においては、検出を目的とするタンパクやペプチドといった分子量の大きい分子を層状複水酸化物層間には取り込まず、シリカゲルのような検出を目的とする測定分子自体を固定化する問題はない。
【００４０】
アニオン性界面活性剤を含有する測定試料中には、測定を目的とする試料、測定試料の可溶化剤であるアニオン性界面活性剤のほかＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ ＭＳにおいて脱離、イオン化を促進する目的で、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）、９−ニトロアントラセン（９−ｎｉｔｒｏａｎｔｈｒａｃｅｎ）、２，５−ジヒドロキシベンゾイックアッシッド（２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＤＨＢ））、α−シアノ−ヒドロキシシンナミックアッシッド（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ））、または３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシシンナミックアシッド（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ））等の従来公知のマトリックス分子を添加することが可能である。本発明においては、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）若しくは９−ニトロアントラセン（９−ｎｉｔｒｏａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）を好適に用いることができる。
【００４１】
更に、本発明ではイオン化促進剤としてトリフルオロ酢酸の金属塩（金属はＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ａｇ）などの金属塩を添加することが可能である。
測定試料溶液の溶剤としては、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパルノール、テトラヒドロフラン等の従来、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定用試料調整に用いられている溶媒を用いることが可能である。
【００４２】
本発明においては、これらの溶媒以外に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いることで、より効率的なアニオン性界面活性剤の取り込みがおこることを見出した。その作用メカニズムついては必ずしも明白ではないが、ＤＭＦを添加することで、層状複水酸化物のカチオン層の間がある程度膨潤し、比較的分子サイズの大きいアニオン性界面活性剤が取り込まれ易くなった可能性を挙げることができる。
【００４３】
また、層状複水酸化物を固定化する基板としては、ある程度の導電性があるものが好ましく、ステンレス、アルミニウムの他、金や白金等の金属、或いはシリコンウエハーやチタニアのような半導体を用いることが可能となる。
【００４４】
また、アニオン性界面活性剤としては、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルアミド硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルアミドリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩、アルキロイルアルキルタウリン塩、Ｎ−長鎖アシルアミノ酸塩等が挙げられ、スルホコハク酸塩としては、オレイン酸アミドスルホコハク酸塩、ポリオキシエチレンスルホコハク酸塩、スルホコハク酸アルキル塩、スルホコハク酸ポリオキシエチレンアルキロイルエタノールアミド塩等の従来公知のものを用いることが可能であるが、取り扱いの容易性や、層状複水酸化物への取り込みやすさ、水溶性を考慮すると分子量が５００以下のものが好ましい。具体的には、アルキル硫酸塩のうちアルキル鎖の炭素数が８から１６程度で、金属がＬｉ、Ｎａ、Ｋのアルカリ金属である化合物が好ましい。
【００４５】
本発明の質量分析方法に用いることができる試料は、膜蛋白質、膜蛋白質の膜中ドメインペプチド鎖等の脂溶性化合物、合成高分子が挙げられる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
＜合成例１＞
以下の手法に従い、２価金属：、Ｍ２＋＝Ｍｇ２＋、３価金属：Ｍ３＋＝Ａｌ３＋、アニオン種：ＮＯ３−である硝酸型のＭｇ／Ａｌ系層状複水酸化物を合成した。
【００４７】
硝酸マグネシウム六水和物及び硝酸アルミニウム六水和物（共にキシダ化学製、特級）をマグネシウム：アルミニウムのモル比が２：１になるように重量を調整し、これらを窒素バブリングさせながら、純水に溶解させた。このとき、金属イオンの総量が１ｍｏｌ／ｄｍ３になるように調整する。得た混合液４５０ｃｍ３を、窒素バブリングさせながら０．５ｍｏｌ／ｄｍ３硝酸ナトリウム水溶液２００ｃｍ３に滴下し加えた。このとき、溶液のｐＨが約１０に保たれるように３ｍｏｌ／ｄｍ３水酸化ナトリウム水溶液も同時に滴下した。一時間ほど掛けて全ての混合溶液を加えた後、２０度、１８時間攪拌し、沈殿物としてＡｌ−Ｍｎ型層状複水酸化物を得た。得たＡｌ−Ｍｎ型層状複水酸化物を５０℃の窒素条件下にて乾燥した。
【００４８】
生成物を酸性水溶液中にて溶解し、ＩＣＰ組成分析を行った結果、この複水酸化物はおおよそ［Ｍｇ２＋０．６７Ａｌ３＋０．３３（ＯＨ）２］０．３３＋［ＮＯ３−］０．３３−である。
【００４９】
図１は、合成例１で得られたＭｇ−Ａｌの硝酸型層状複水酸化物の粉末Ｘ線回折を示す図である。図１の粉末のＸ線回折分析の結果、基本面間隔が約０．８９ｎｍ（８．９Å）の層状物質であることから、層間のアニオン種は硝酸イオンであることが明らかとなった。また、ＳＥＭによる観察の結果、生成物は板状の形態をしており、その径がおおよそ２０から３００ｎｍの結晶が多く観察された。
【００５０】
＜合成例２＞
以下の手法に従い、２価金属：、Ｍ２＋＝Ｍｎ２＋、３価金属：Ｍ３＋＝Ａｌ３＋、アニオン種：ＮＯ３−である硝酸型のＭｎ／Ａｌ系層状複水酸化物を合成した。
【００５１】
硝酸マンガン六水和物及び硝酸アルミニウム六水和物（共にキシダ化学製、特級）をニッケル：マンガンのモル比が２：１になるように重量を調整し、これらを窒素バブリングさせながら、純水に溶解させた。このとき、金属イオンの総量が１ｍｏｌ／ｄｍ３になるように調整する。得た混合液４５０ｃｍ３を、窒素バブリングさせながら０．５ｍｏｌ／ｄｍ３硝酸ナトリウム水溶液２００ｃｍ３に滴下し加えた。このとき、溶液のｐＨが約１０に保たれるように３ｍｏｌ／ｄｍ３水酸化ナトリウム水溶液も同時に滴下した。一時間ほど掛けて全ての混合溶液を加えた後、２０度、１８時間攪拌し、沈殿物としてＡｌ−Ｍｎ型層状複水酸化物を得た。得たＡｌ−Ｍｎ型層状複水酸化物を５０℃の窒素条件下にて乾燥した。
【００５２】
生成物を酸性水溶液中にて溶解し、ＩＣＰ組成分析を行った結果、この複水酸化物はおおよそ［Ｍｎ２＋０．６７Ａｌ３＋０．３３（ＯＨ）２］０．３３＋［ＮＯ３−］０．３３−である。
【００５３】
図２は、合成例２で得られたＭｎ−Ａｌの硝酸型層状複水酸化物の粉末Ｘ線回折を示す図である。図２の粉末のＸ線回折分析の結果、基本面間隔が約０．８９ｎｍ（８．９Å）の層状物質であることから、層間のアニオン種は硝酸イオンであることが明らかとなった。また、ＳＥＭによる観察の結果、生成物は板状の形態をしており、その径がおおよそ１５０から２００ｎｍの結晶が多く観察された。
【００５４】
＜実施例１＞
合成例１で得られた硝酸型のＭｇ／Ａｌ系層状複水酸化物：０．１ｇをエタノール１ｇへ添加し、超音波洗浄器にて超音波を３分照射して分散した。この分散液を、ステンレス製の質量分析基板の上に３μＬ滴下して溶剤を乾燥させた。
【００５５】
次いで、２ｗｔ％の濃度となるようにドデシル硫酸ナトリウムを溶解した水溶液を用いて、アンジオテンシン（分子量：１３００）が１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度になるように測定試料溶液を調整した。この溶液を、層状複水酸化物分散液を滴下・乾燥した部分に１μＬ滴下し、乾燥した。
【００５６】
さらに、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）のエタノール溶液（５ｗｔ％）を層状複水酸化物−測定試料の上に滴下、乾燥させた。
この試料基板を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（ＲＥＦＬＥＸ−ＩＩＩ、ブルカー・ダルトンクス製）に装着し、カチオン検出モードにて測定を行った。図３は分子量約１３００のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す図である。
【００５７】
＜比較例１＞
ステンレス製の質量分析基板の上に２ｗｔ％の濃度となるようにドデシル硫酸ナトリウムを溶解した水溶液を用いて、分子量約１３００ｇ／ｍｏｌのペプチドが１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度になるように測定試料溶液を調整した。この溶液を、層状複水酸化物分散液を滴下・乾燥した部分に１μＬ滴下した、乾燥した。
【００５８】
さらに、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）のエタノール溶液（５ｗｔ％）を層状複水酸化物−測定試料の上に滴下、乾燥させた。
この試料基板を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（ＲＥＦＬＥＸ−ＩＩＩ、ブルカー・ダルトンクス製）に装着し、カチオン検出モードにて測定を行った。図３に分子量約１３００のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す。
【００５９】
＜実施例２＞
合成例１で得られた硝酸型のＭｎ／Ａｌ系層状複水酸化物：０．１ｇをエタノール１ｇへ添加し、超音波洗浄器にて超音波を３分照射して分散した。この分散液を、ステンレス製の質量分析基板の上に３μＬ滴下して溶剤を乾燥させた。
【００６０】
次いで、２ｗｔ％の濃度となるようにドデシル硫酸ナトリウムを溶解した水溶液を用いて、分子量が約１７６０ｇ／ｍｏｌのペプチドを１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度になるように調整した測定試料溶液を準備した。この溶液を、層状複水酸化物分散液を滴下・乾燥した部分に１μＬ滴下した、乾燥した。
【００６１】
さらに、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）のエタノール溶液（５ｗｔ％）を層状複水酸化物−測定試料の上に滴下し、乾燥させた。
この試料基板を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（ＲＥＦＬＥＸ−ＩＩＩ、ブルカー・ダルトニクス製）に装着し、カチオン検出モードにて測定を行った。図４は分子量約１７６０のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す図である。
【００６２】
＜比較例２＞
ステンレス製の質量分析基板の上に２ｗｔ％の濃度となるようにドデシル硫酸ナトリウムを溶解した水溶液を用いて、分子量が約１７６０ｇ／ｍｏｌのペプチドを１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度になるように調整した測定試料溶液を準備した。この溶液を、層状複水酸化物分散液を滴下・乾燥した部分に１μＬ滴下した、乾燥した。
さらに、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）のエタノール溶液（５ｗｔ％）を１μＬとり層状複水酸化物−測定試料の上に滴下、乾燥させた。
【００６３】
この試料基板を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（ＲＥＦＬＥＸ−ＩＩＩ、ブルカー・ダルトンクス製）に装着し、カチオン検出モードにて測定を行った。図４に分子量約１７６０のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す。
【００６４】
＜参考例＞
分子量が約１７６０ｇ／ｍｏｌのペプチドを１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度になるように調整した測定試料水溶液を準備した。この溶液を、ステンレス製の質量分析基板の上に１μＬ滴下した、乾燥した。
【００６５】
さらに、１，８，９−トリヒドロキシアントラセン（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）のエタノール溶液（５ｗｔ％）を層状複水酸化物−測定試料の上に、１μＬ滴下・乾燥させた。
【００６６】
この試料基板を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（ＲＥＦＬＥＸ−ＩＩＩ、ブルカー・ダルトンクス製）に装着し、カチオン検出モードにて測定を行った。図４に分子量約１７６０のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す。
【００６７】
図３及び図４に示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルから明らかなように、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）による信号強度の低下は、非炭酸型層状複水酸化物により大きく回復することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の質量分析用基板は、アニオン性界面活性剤が含有されている質量分析用の分析試料において、アニオン種が炭酸イオン以外の層状複水酸化物を作用させることで、アニオン性界面活性剤の影響を排除し、高感度な質量分析を行なうことができるので、質量分析に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】合成例１で得られたＭｇ−Ａｌの硝酸型層状複水酸化物の粉末Ｘ線回折を示す図である。
【図２】合成例２で得られたＭｎ−Ａｌの硝酸型層状複水酸化物の粉末Ｘ線回折を示す図である。
【図３】分子量約１３００のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す図である。
【図４】分子量約１７６０のペプチド種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの測定スペクトルを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザーイオン化質量分析に用いる質量分析用基板であって、アニオン種が非炭酸型である層状複水酸化物を有することを特徴とする質量分析用基板。
【請求項２】
前記層状複水酸化物が、下記一般式（１）で表される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の質量分析用基板。
【化１】
（式中、Ｍ２＋はＭｇ２＋，Ｍｎ２＋，Ｎｉ２＋，Ｚｎ２＋から選ばれる金属の２価カチオンを示す。Ｍ３＋はＡｌ３＋，Ｃｒ３＋，Ｆｅ３＋，Ｃｏ３＋から選ばれる金属の３価カチオンを示す。Ａｎ−はＯＨ−、Ｃｌ−、Ｆ−、Ｉ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−，ＳＯ４２‐から選ばれるアニオンを示す。Ｘは０．２以上０．３３以下の数値を示す。ｎはアニオンの負電荷を示す価数である。）
【請求項３】
前記層状複水酸化物のアニオン種が、よう素アニオンもしくは硝酸イオンであることを特徴とする請求項１または２に記載の質量分析用基板。
【請求項４】
前記層状複水酸化物が波長３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の紫外線を吸収することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかの項に記載の質量分析用基板。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の質量分析用基板上に試料を載置してレーザーを照射する工程を有することを特徴とする質量分析方法。
【請求項６】
前記試料に、分子量が５００以下のアニオン性界面活性剤を含有させてレーザーを照射することを特徴とする請求項５に記載の質量分析方法。
【請求項１】
レーザーイオン化質量分析に用いる質量分析用基板であって、アニオン種が非炭酸型である層状複水酸化物を有することを特徴とする質量分析用基板。
【請求項２】
前記層状複水酸化物が、下記一般式（１）で表される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の質量分析用基板。
【化１】
（式中、Ｍ２＋はＭｇ２＋，Ｍｎ２＋，Ｎｉ２＋，Ｚｎ２＋から選ばれる金属の２価カチオンを示す。Ｍ３＋はＡｌ３＋，Ｃｒ３＋，Ｆｅ３＋，Ｃｏ３＋から選ばれる金属の３価カチオンを示す。Ａｎ−はＯＨ−、Ｃｌ−、Ｆ−、Ｉ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−，ＳＯ４２‐から選ばれるアニオンを示す。Ｘは０．２以上０．３３以下の数値を示す。ｎはアニオンの負電荷を示す価数である。）
【請求項３】
前記層状複水酸化物のアニオン種が、よう素アニオンもしくは硝酸イオンであることを特徴とする請求項１または２に記載の質量分析用基板。
【請求項４】
前記層状複水酸化物が波長３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の紫外線を吸収することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかの項に記載の質量分析用基板。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の質量分析用基板上に試料を載置してレーザーを照射する工程を有することを特徴とする質量分析方法。
【請求項６】
前記試料に、分子量が５００以下のアニオン性界面活性剤を含有させてレーザーを照射することを特徴とする請求項５に記載の質量分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−２６４９１０（Ｐ２００９−２６４９１０Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１４４８２（Ｐ２００８−１１４４８２）
【出願日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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