転写干渉による遺伝子休止化に基づくダブル・ハイブリッド系
本発明は、新規ダブル・ハイブリッド系およびこの使用に関する。この系は、特に、タンパク質間相互作用の遮断の検出を可能にするツールをもたらす。開発した系は、タンパク質対の相互作用の破壊を検出するメカニズムとして転写干渉を用いる。開発したダブル・ハイブリッド系は、タンパク質間相互作用を破壊する分子の検出を可能にする、ならびにこのタンパク質間相互作用に関与するタンパク質の相互作用のない対立遺伝子の同定を可能にする分子のスクリーニングに適用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写干渉による遺伝子休止化に基づく新規ダブル・ハイブリッド系に関する。本発明は、タンパク質間相互作用に対して作用する生物活性化合物の同定のためのこの系の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ダブル・ハイブリッド系（Ｙ２Ｈ：「酵母ツーハイブリッド系」）は、タンパク質間相互作用の同定のために酵母において広範に用いられている（特に、Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．Ｔら、１９９１、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ，１９８９、Ｃａｇｎｅｙ，Ｇら、２０００、６．Ｃａｕｓｉｅｒ，Ｂ．およびＢ．Ｄａｖｉｅｓ，２００２、Ｃｏａｔｅｓ，Ｐ．Ｊ．およびＰ．Ａ．Ｈａｌｌ．２００３参照）。
【０００３】
ダブル・ハイブリッド法は、別個のキメラタンパク質が含有するＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが、これら２つのドメインが互いに十分に近いとき、遺伝子の転写を活性化し得るという事実に基づく。酵母におけるダブル・ハイブリッド系の現行使用バージョンは、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ４ｐタンパク質の特性を利用している（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９）。
【０００４】
特に、タンパク質ＧＡＬ４ｐは、酵母によるガラクトースの利用に必要なＧＡＬ１遺伝子の転写を活性化し、ならびにこのタンパク質は、次の２つのドメインから成る：ＤＮＡ配列（酵母ＧＡＬ遺伝子の上流活性化配列であるＵＡＳＧ）に特異的に結合するＮ末端ドメインおよび転写活性化を可能にする酸性領域を含有するＣ末端ドメイン。
【０００５】
この第一のダブル・ハイブリッド系は、次の３つの作用因子を介入させる：２つの融合タンパク質と、プロモーター遺伝子がＧＡＬ１遺伝子のプロモーター（Ｐｇａｌ１）の制御下に置かれている１つの構築物。ＧＡＬ４ｐタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合した第一のタンパク質は、上で説明した構築物を有する酵母Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において発現される。ＧＡＬ４ｐの転写活性化ドメイン（ＡＤ）に融合した第二のタンパク質は、この同じ酵母において共発現される。これら２つの融合タンパク質の相互作用の場合、ＧＡＬ４−ＡＤ転写活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインを一緒にすることにより、Ｐｇａｌ１の制御下に置かれたレポーター遺伝子の発現を誘発することができる機能性ＧＡＬ４ｐ転写因子を、再構成することができる。
【０００６】
（例えば、遺伝子ＨＩＳ３のような）酵母の生存能に必須の遺伝子をレポーター遺伝子として選択することにより、レポーター遺伝子が発現される株、従って、２つのハイブリッドタンパク質の間に相互作用が発生する株を、容易にスクリーニングすることができる。このような相互作用が発生しない株は、Ｐｇａｌ１を活性化することができず、またこのレポーター遺伝子がこの酵母の生存能に必須の遺伝子である場合には成長することができない。
【０００７】
より最近、いわゆる逆ダブル・ハイブリッド系が開発された（ｒＹ２Ｈ：「酵母逆ツーハイブリッド系」）。これらの系は、レポーター遺伝子の活性化が、タンパク質間相互作用不在の状態で誘発され、これは、パートナーと相互作用する能力を喪失した変異タンパク質の同定、ならびにタンパク質間相互作用を特異的に阻害する分子の同定に特に有用である。
【０００８】
Ｙｏｕｎｇらは、カルシウムチャネルモジュレーターを同定するために逆ダブル・ハイブリッド系に基づく高効率スクリーニングテストをかくして完成した（Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．ら、１９９８）。このｒＹ２Ｈ系は、ＣＹＨ２の特性を活用する。ＣＹＨ２遺伝子は、シクロヘキシミドに対する感受性を細胞に付与するリボソームタンパク質Ｌ２９、すなわちリボソームサブユニット６０Ｓの一成分をコードする（Ｋａｕｆｅｒ，Ｎ．Ｆ．ら、１９８３）。レポーターカセットＰｇａｌ１−ＣＹＨ２を、内因性変異ＣＹＨ２遺伝子を有するシクロヘキシミドに耐性の酵母菌株に導入する。野生型の対立遺伝子ＣＹＨ２が優勢である場合、二タンパク質間の相互作用が発生すると（従って、レポーターカセットが転写されると）、シクロヘキシミドを含有する培地ではレポーター細胞の成長が阻害される。この相互作用の遮断は、シクロへキサミドの毒性効果を減弱させ、シクロヘキシミドを含有する培地でのレポーター細胞の成長を可能にする（Ｌｅａｎｎａ，Ｃ．Ａ．，およびＨ．Ｈａｎｎｉｎｋ．１９９６）。
【０００９】
しかし、ｍＲＮＡの安定性およびタンパク質の安定性に関連した問題ならびに野生型ＣＹＨ２ｐタンパク質および変異ＣＹＨ２ｐタンパク質の活性レベルでの相違により、タンパク質間相互作用の解離（逆Ｙ２Ｈ相互作用）の検出のためのこの系の使用が複雑になり、感度が不十分になる。
【００１０】
加えて、この系には、使用して最大感度を得ることが比較的困難であるという欠点がある。逆Ｙ２Ｈ相互作用に対するこの応答が、幾つかの分子に依存するためである。例えば、リボソームへの組み込みレベルでの野生型ＣＹＨ２ｐと変異ＣＹＨ２ｐの間の競合が、レポーターの感度に影響する。加えて、シクロヘキシミドの捕捉のレベルおよびリボソームに対するこの反応性のレベルでの変動は、この系の応答能力にまず間違いなく影響を及ぼす。
【００１１】
レポーター遺伝子ＵＲＡ３とこの前毒性基質：５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）との併用に基づく、もう１つの逆ダブル・ハイブリッド系も説明されている（Ｈｕａｎｇ，Ｊ．およびＳ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ．１９９７、Ｖｉｄａｌ，Ｍ．ら、１９９６、ＷＯ９６３２５０３）。この系では、タンパク質ＵＲＡ３ｐの発現の誘導が、細胞成長を阻害する。この時、５−ＦＡＯが、この毒性類似体：５−フルオロ−ＵＴＰに変換されるためである。これに対して、ＵＲＡ３の不活性化は、細胞の成長を可能にする。この時、５−ＦＯＡは、もはや代謝されず、細胞が、この培地に補足されたウラシルを使用するためである。この系は、通常のパートナーと相互作用する能力を喪失した変異タンパク質を同定するために使用される（Ｂｕｒｋｅ，Ｔ．Ｗ．ら、２００１；Ｄａｒｏｓ，Ｊ．Ａ．ら、１９９９；Ｐｕｔｈａｌａｋａｔｈ，Ｈ．ら、１９９９）。
【００１２】
この系の構造およびメカニズムは、上で説明した逆ダブル・ハイブリッド系のものに非常に類似している（Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．ら、１９９８）。このため、この系は、上に挙げた欠点を有する。加えて、５−ＦＯＡの使用に基づく系は、この系自体と関係がある偽陽性を生じさせる欠点を有する。実際、細胞成長は、野生型ＵＲＡ３の不活性化と関係がある。従って、ＵＲＡ３ｐタンパク質を阻害する化合物は、細胞成長を可能にする。このため、これらの化合物は、タンパク質間相互作用を特異的に阻害する分子の同定にこの系を使用している間に、偽陽性シグナルを発生させる。
【００１３】
この系は、比較的高価な化学薬品である５−ＦＯＡを使用するという欠点も有する。
【００１４】
最後に、２つのレポーター遺伝子のカスケードを含む、「スプリット・ハイブリッド（Ｓｐｒｉｔ−Ｈｙｂｒｉｄ）」という名のリレー系も説明されている（ＷＯ９５２６４００およびＷＯ９８１３５０２）。このｒＹ２Ｈ系は、ＣＢＰとの連結を遮断するタンパク質ＣＲＥＢの変異を同定するために使用されている（Ｃｒｉｓｐｉｎｏ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９９）。これらの系では、ダブル・ハイブリッド相互作用が、第一レポータータンパク質の発現を活性化し、これがまた、成長選択に使用される第二レポーター遺伝子の発現を制御する。しかし、この系は、逆Ｙ２Ｈ相互作用の検出のためには使用が複雑であり、感度が不十分である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このように、上で説明した系は、幾つかの分子（２つのレポーター遺伝子、レポーター遺伝子と毒性物質、野生型レポーター遺伝子と変異レポーター遺伝子）の活性に依存する。これは、特に最大感度が求められるとき、これらの利用の複雑さを増大させる。より単純であり、より経済的でもあると同時に良好な感度を有する系を有することが、望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、転写干渉による遺伝子の休止化（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）に基づく新規ダブル・ハイブリッド系に関する。本発明のダブル・ハイブリッド系は、単純であり、培地への毒性物質の添加を必要とせず、ならびにゲノムへの組み込みを必要とせずに使用することができる。
【００１７】
本発明の第一の主題は、干渉ＤＮＡ構築物を含有する細胞に関し、
前記構築物は、
第一プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター、いわゆる干渉プロモーター［前記干渉プロモーターの活性化が、前記第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択されおよび配置され、その結果前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。］、
を含み、
前記細胞は、
第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）［前記第一キメラタンパク質は、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるタンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る。］、
第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）［前記第二キメラタンパク質は、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る。］
をさらに発現し、
前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。
【００１８】
１つの実施形態によると、本発明は、レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターが、誘導性プロモーターであり、タンパク質Ｙが、２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができる、上で説明したものなどの細胞に関し、この細胞は、このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）をさらに発現し、２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用が、このレポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明は、レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターが、キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含む、上で定義したものなどの細胞に関する。
【００２０】
本発明は、レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターが、構成的プロモーターである、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００２１】
本発明は、干渉ＤＮＡ構築物によりおよびキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入された宿主細胞である、上で説明したものなどの細胞にも関し、これらの構築物のすべてが、１つまたはそれ以上の非組み込みベクターに担持されたものである。
【００２２】
本発明のもう１つの態様は、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入された宿主細胞である、上で定義したものなどの細胞に関し、これらの構築物は、１つまたはそれ以上の非組み込みベクターに担持されており、干渉ＤＮＡ構築物は、細胞のゲノムに組み込まれている。
【００２３】
本発明は、干渉ＤＮＡ構築物およびキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物が、細胞のゲノムに組み込まれている、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００２４】
好ましい実施形態において、本発明は、干渉ＤＮＡ構築物が、摂動性ゲノム転写活性のない遺伝子座に組み込まれている、上で説明したものなどの細胞に関する。
【００２５】
本発明は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および酵母細胞により形成された群から選択される、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００２６】
本発明は、酵母細胞に関する、上で説明したものなどの細胞にも関する。
【００２７】
好ましい実施形態において、本発明は、サッカロミセス・セレビジエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）またはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）種の酵母に関する、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００２８】
本発明は、レポーター遺伝子および第一プロモーターの下流に、後者とは反対の配向で配置された（ＤＩ）少なくとも１つの干渉プロモーターを有する、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００２９】
本発明は、レポーター遺伝子および第一プロモーターの下流に、後者と同じ配向で配置された（ｎＤＩ）少なくとも１つの干渉プロモーターを有する、上で説明したものなどの細胞にも関する。
【００３０】
本発明は、レポーター遺伝子および第一プロモーターの上流に、後者と同じ配向で配置された（ＵＩ）少なくとも１つの干渉プロモーターを有する、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００３１】
本発明のもう１つの態様は、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置された少なくとも１つの干渉プロモーターを有し、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターが、第一プロモーターに対して集中的な配向を有し、ならびに第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に配置された干渉プロモーターが、第一プロモーターのものと同一の配向を有する（ＵＤＩ）、上で説明したものなどの細胞に関する。
【００３２】
加えて、本発明は、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置された少なくとも１つの干渉プロモーターを有し、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターが、第一プロモーターに対して対状の配向を有し、ならびに第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に配置された干渉プロモーターが、第一プロモーターのものと同一の配向を有する（ｎＵＤＩ）、上で定義したものなどの細胞に関する。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明は、上で定義したものなどの細胞であって、レポーター遺伝子がこの細胞の生存に必須の遺伝子である細胞に関する。
【００３４】
本発明は、上で説明したものなどの細胞であって、レポーター遺伝子が、一次代謝、細胞分裂、タンパク質合成、ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成に不可欠な遺伝子である細胞にも関する。
【００３５】
本発明は、レポーター遺伝子が、それ自体は、単独では細胞の生存に必須でないが、発現が転写干渉系により制御されるまたはされない同じタイプの１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子に関連してこの転写が阻害されるときには細胞の生存に必須である、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００３６】
好ましい実施形態において、本発明は、誘導性干渉プロモーターが、キメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列（Ｘ−ＤＢＤ）を含む、上で説明したものなどの細胞に関する。
【００３７】
本発明は、誘導性干渉プロモーターが、ＧＡＬ４ ＵＡＳ、ＬｅｘＡｏｐ、ｃＩｏｐおよびＴｅｔＲｏｐにより形成された群から選択されるＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有するタンパク質と相互作用することができる配列を含む、ならびにキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤのＤＮＡ結合ドメインが、対応するＤＢＤ（それぞれ、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡ、ｃＩまたはＴｅｔＲ）であるような、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００３８】
本発明のもう１つの態様は、キメラタンパク質Ｙ−ＡＤの転写活性化ドメイン（ＡＤ）が、次のタンパク質：Ｂ４２、ＶＰ１６およびＧＡＬ４ｐの転写活性化ドメインにより形成された群から選択される、上で説明したものなどの細胞に関する。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明は、干渉ＤＮＡ構築物が、この末端で、１つまたはそれ以上の一方向性または二方向性転写ターミネーターに隣接している、上で定義したものなどの細胞に関する。
【００４０】
本発明のもう１つの態様は、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害する化合物を同定するためのプロセスに関し、このプロセスは、
ａ）上で定義したものなどの細胞を培養する段階、
ｂ）被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下と不在下で比較する段階、
を含み、レポーター遺伝子の発現の増加は、被検化合物が、培養細胞によって発現されたタンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であることの指標となる。
【００４１】
加えて、本発明は、タンパク質間相互作用を阻害する化合物を同定するための、上で定義したものなどの細胞の使用に関する。
【００４２】
本発明は、タンパク質間相互作用を特異的に排除するペプチドまたはタンパク質因子を同定するためにｃＤＮＡバンクまたはペプチドバンクをスクリーニングするための、上で説明したものなどの細胞の使用にも関する。
【００４３】
本発明のもう１つの態様は、ダブル・ハイブリッド系を作るためのキットに関し、このキットは、
第一ＤＮＡ構築物［前期第一ＤＮＡ構築物は、
第一プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター（前記誘導性プロモーターの活性化が、前記第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、その結果、前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。）
を含む。］、
第二ＤＮＡ構築物［前記第二ＤＮＡ構築物は、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるパートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）をコードする。］、
第三ＤＮＡ構築物［前記第三ＤＮＡ構築物は、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）
をコードする。］
を含み、前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記２つのキメラタンパク質が宿主細胞において発現されたときに干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。
【００４４】
本発明は、レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターが、誘導性プロモーターであり、タンパク質Ｙが、２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができる、上で定義したようなキットにも関し、この場合のキットは、このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）をコードする第四ＤＮＡ構築物を含み、２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。
【００４５】
本発明のもう１つの態様は、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害するが、このタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用はまったく阻害しないか、あまり阻害しない化合物を同定するための方法に関し、この方法は、
ａ）上で定義した細胞を培養する段階、
ｂ）被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下と不在下で比較する段階
を含み、レポーター遺伝子の発現の増加は、被検化合物が、タンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であること、しかし、この生成物が、タンパク質Ｙとタンパク質Ｚの間の相互作用をまったく阻害しないか、あまり阻害しないことの指標となる。
【００４６】
最後に、本発明は、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子ＵＲＡ３のオープンリーディングフレームの上流および下流領域に相同な２つのフラグメントを含有し、これら２つのフラグメント間に挿入される配列の遺伝子座ＵＲＡ３のレベルでの相同組換えにより組み込むことができる、酵母組み込みベクターに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、転写干渉による遺伝子の休止化に基づく新規ダブル・ハイブリッド系に関する。本発明のダブル・ハイブリッド系は、単純であり、培地への毒性物質の添加を必要とせず、ならびにゲノムへの組み込みを必要とせずに使用することができる。
【００４８】
転写干渉は、第二プロモーターが活性化されたときの第一プロモーターの活性の摂動と定義される。例えば、あるプロモーターの転写活性が、他のプロモーターのレベルで開始される転写を減少させる。転写干渉は、例えば酵母に関して説明されている（Ｇｒｅｇｅｒ，Ｉ．Ｈ．，ａｎｄ Ｎ．Ｊ．Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ．１９９８、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｏ．ら、１９９７、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．およびＡ．Ｍ．Ｍｙｅｒｓ，１９９３、Ｐｕｉｇ，Ｓ．ら、１９９９、Ｍａｒｔｅｎｓら、２００４）。
【００４９】
本発明の第一の主題は、特定のタンパク質間相互作用が不在の状態でレポーター遺伝子を発現することができるが、この相互作用が発生したとき、前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な低下が認められる、１つまたはそれ以上の構築物を有する細胞に関する。
【００５０】
より詳細には、本発明の細胞は、１つまたはそれ以上のＤＮＡ構築物、いわゆる干渉構築物を含有し、前記構築物は、
第一プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター、いわゆる干渉プロモーター［前記干渉プロモーターの活性化が、前記第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択されおよび配置され、その結果前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。］、
を含み、
前記細胞は、
第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）［前記第一キメラタンパク質は、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるタンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る。］、
第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）［前記第二キメラタンパク質は、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る。］
をさらに発現し、
前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。
【００５１】
第一の実施形態において、本発明の細胞は、レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物（干渉構築物）により形質転換または形質移入された宿主細胞であり、これらは、２つのキメラタンパク質の各々をコードする２つのＤＮＡ構築物によっても形質転換または形質移入される。これら３つの構築物は、同じＤＮＡベクターに担持されていることがあり、または２つもしくは３つの異なるベクター上で見出される。すべての組み合わせが考えられる：同じベクター上に３つの構築物；３つの異なるベクター上に３つの構築物；同じベクター上に２つのキメラタンパク質をコードする２つの構築物、但し、３つ目の構築物は、別のベクター上で見出される；同じベクター上に２つのキメラタンパク質のうちの１つをコードする構築物と干渉構築物、しかし別のベクター上で見出される、もう１つのキメラタンパク質をコードする構築物。この第一の実施形態におけるベクターは、非組み込みベクターである。
【００５２】
本発明の第二の実施形態において、干渉構築物は、細胞のゲノムに組み込まれており、これらの細胞は、２つのキメラタンパク質の各々をコードする２つのＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入される。これらのキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、同じＤＮＡベクターに担持されていることがあり、または２つの異なるベクター上で見出され、このまたはこれらのベクターは、非組み込みベクターである。
【００５３】
本発明の第三の実施形態において、干渉構築物、および２つのキメラタンパク質の各々をコードするＤＮＡ構築物は、細胞のゲノムに組み込まれている。２つのキメラタンパク質のうちの１つをコードする２つの構築物のうちの１つだけが、ゲノムに組み込まれており、もう１つの構築物が、非組み込みベクターに担持されていることもある。最後に、最後の実施形態では、干渉構築物、および２つのキメラタンパク質のうちの１つをコードする２つの構築物のうちの１つは、非組み込みベクターに担持されているが、もう１つのキメラタンパク質をコードする構築物は、細胞のゲノムに組み込まれている。
【００５４】
レポーター遺伝子は、慣例的には、容易に検出できる産物をコードする遺伝子と定義される。優先的な実施形態において、本発明に関連して用いるレポーター遺伝子は、この発現が細胞の生存に必須である遺伝子である。これは、例えば、一次代謝、細胞分裂、タンパク質合成（リボソームなど）、ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成などに不可欠な遺伝子である。
【００５５】
このタイプの遺伝子の例として、酵母の生存に必須と記載されているすべての遺伝子、すなわち、このゲノムを構成する遺伝子の約１／６（Ｗｉｎｚｅｌｅｒ Ｅ．Ａ．ら、１９９９）を挙げることができる。
【００５６】
例えば、レポーター遺伝子は、一次代謝に関与し、一次代謝に不可欠であるか、細胞分裂に不可欠である遺伝子である場合がある。より詳細には、レポーター遺伝子は、添加できるか、培地から除去することができる必須代謝産物の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子である場合がある。
【００５７】
このタイプの遺伝子の例としては、酵母の培地中のアミノ酸または対応する核酸塩基を容易に補足することができるため、酵母Ｓ．セレビジエにおいて幅広く用いられている遺伝子ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２、ＭＥＴ１５およびＡＲＧ４を挙げることができる。代謝産物に基づく他のマーカーを用いてもよく、例としては、遺伝子ＨＩＳ５（酵母Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）の遺伝子）、遺伝子ＵＲＡ３およびＬＥＵ２（酵母Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）の遺伝子）、ＵＲＡ３（酵母Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の遺伝子）、ＬＥＵ２（酵母Ａ．ゴシピ（Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ）の遺伝子）を挙げることができる。
【００５８】
レポーター遺伝子は、一次代謝に関与し、一次代謝に必須でない遺伝子、または単独で使用されたとき、細胞分裂に必須でない遺伝子である場合もある。一方、これらの転写が同じタイプの１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子に関連して阻害される場合、効果が併さることによって酵母の生存に必須の機能に対する阻害が導かれることがある。レポーター遺伝子は、例えば、これらの共伴的役割が一次代謝、細胞分裂、タンパク質合成（リボソームなど）、ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成などに不可欠な機能を導く遺伝子の集合体である場合がある。
【００５９】
このタイプの遺伝子の例としては、酵母の生存に必須ではないと記載されている遺伝子（すなわち、このゲノムを構成する遺伝子の約５／６（Ｗｉｎｚｅｌｅｒ Ｅ．Ａ．ら、１９９９））であって、同じタイプの１つまたはそれ以上の遺伝子に関連して必須になる、すべての遺伝子を挙げることができる。
【００６０】
しかし、他のレポーター遺伝子も、本発明に関連して使用することができる。例としては、酵素ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子；ルシフェラーゼをコードする遺伝子ｌｕｃ；蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ（「緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」）、ＣＦＰ（「シアン蛍光タンパク質（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」）、ＹＦＰ（「黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」）またはＲＦＰ（「赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」）、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。
【００６１】
毒性生成物に対する耐性を付与するマーカー：トランスポゾン Ｔｎ９０３の遺伝子ｋａｎ（ゲネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性を付与）、トランスポゾン Ｔｎ５の遺伝子ｂｌｅ（フレオマイシンに対する耐性を付与）、遺伝子ＣＹＨｒ（シクロヘキシミドに対する耐性を付与）、ｐａｔ（ビアラフォスに対する耐性を付与するＳ．ビリドクロモゲネス（Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）の遺伝子）、ｎａｔ１（ヌルセオトリシンに対する耐性を付与するＳ．ヌールセイ（Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ）の遺伝子、ｈｐｈ（ヒグロマイシンＢに対する耐性を付与する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子）である場合もある。これらの遺伝子すべてが、特に酵母において、機能性である（ＧｕｔｈｅｒｉｅおよびＦｉｎｋ，２００２）。
【００６２】
レポーター遺伝子は、第一プロモーターの制御下に置かれる。好ましい実施形態において、この第一プロモーターは、構成的プロモーターである。構成的プロモーターは、一般に認められているように、周囲の状況とは比較的無関係に発現することができるプロモーターである。
【００６３】
一例として、酵母においてレポーター遺伝子を構成的変異プロモーター ＡＤＨ１（７００）（変異した遺伝子ＡＤＨ１のプロモーター（Ｐａｄｈ１））（Ｒｕｏｈｏｎｅｎら、１９９５）の制御下で発現させることができる。しかし、他の構成的プロモーターも、本発明に関連して酵母において使用することができる。例としては、プロモーターＴＰＩ（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，１９８２）、ＴＥＦ１、ＴＤＨ３、ＫＥＸ２（Ｎａｃｋｅｎら、１９９６）およびＡＣＴ１（Ｅｒｎｓｔ，１９８６）を挙げることができる。
【００６４】
哺乳動物の細胞に関して言えば、例えば、プロモーターＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時−初期エンハンサー／プロモーター）（ＦｏｅｃｋｉｎｇおよびＨｏｆｓｔｅｔｔｅｒ，１９８６）（Ｋｒｏｎｍａｎら、１９９２）、プロモーターＥＦ−１ α（ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ，１９９０）、プロモーターＳＶ４０（シミアンウイルス４０初期エンハンサー／プロモーター）（Ｄａｓら、１９８５）、プロモーターＵＢ（ユビキチンのヒト遺伝子Ｃ（ｈＵｂＣ）のプロモーター）（Ｎｅｎｏｉら、１９９６；Ｓｃｈｏｒｐｐら、１９９６）、ラウス肉腫ウイルスのプロモーターＲＳＶ ＬＴＲ（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０）を挙げることができる。
【００６５】
このプロモーター、いわゆる「干渉プロモーター」は、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、これらの活性化が第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、この結果、レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。
【００６６】
本発明に関連して利用することができる干渉プロモーターは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を介してこのプロモーターの配列（ＤＢＤにより連結されるＤＮＡ配列）と相互作用する転写因子により活性化が誘導される誘導性プロモーターであり、前記転写因子は、このプロモーターにより支配される転写を開始させることができる。従って、本発明に関連して利用することができる干渉プロモーターは、考慮する生物においてダブル・ハイブリッド系を作るために適するすべてのプロモーターである。
【００６７】
好ましくは、本発明の干渉プロモーターは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有するタンパク質と相互作用することができる配列（ＤＢＤにより結合されたＤＮＡ配列（ＵＡＳ））を含む。より詳細には、本誘導性干渉プロモーターは、キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含む。
【００６８】
これらは、例えば、転写因子ＧＡＬ４ｐにより誘導可能なプロモーター Ｐｇａｌ１、Ｐｇａｌ１０、Ｐｇａｌ５、Ｐｇａｌ８０、Ｐｍｅｌ１、Ｐｇａｌ２、Ｐｇａｌ７、Ｐｇａｌ３、Ｐｇｃｙ１、Ｐｌｔｈ１、Ｐｐｃｌ１０およびＰｆｕｒ４（Ｒｅｎら、２０００；ＳｖｅｔｌｏｖおよびＣｏｏｐｅｒ，１９９５）である（野生型細胞において、転写因子ＧＡＬ４ｐは、ガラクトースにより誘導される遺伝子の発現に、特に関与する）。好ましくは、利用する誘導性プロモーターは、プロモーター Ｐｇａｌ１である。
【００６９】
しかし、他の誘導性発現系を使用する本発明の他の実施形態も、本発明の範囲に入る。表１は、ダブル・ハイブリッド系において既に使用されている非常に多数の誘導性系を示す。文献に記載されているこれらの系の誘導性プロモーターも、本発明の意図では干渉プロモーターである。機能性ダブル・ハイブリッド系を得るために、表１中のＤＢＤとＡＤの間で可能なすべての組み合わせが考えられる。
【００７０】
【表１】
【００７１】
誘導性干渉プロモーターは、これらの活性化が第一プロモーターの転写干渉に影響するように配置され、この結果、レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。
【００７２】
例えば、干渉性プロモーターは、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に配置することができる。この時、下流に位置する干渉プロモーターの活性化は、さらに上流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、下流干渉の事である。
【００７３】
しかし、下流干渉に関連して、この干渉プロモーターは、２つの可能な配向を有することできる。第一の配向は、第一プロモーターに対して集中的な配向に相当し、この構造は、下流干渉（またはＤＩ）と呼ばれている。この干渉プロモーターは、第一プロモーターに対して対状の配向を有することもあり、この第二の構造は、ナンセンス下流干渉（またはｎＤＩ）と呼ばれており、これもレポーター遺伝子の発現の阻害を示す（実施例セクション参照）。
【００７４】
干渉プロモーターは、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に配置することもできる。この時、上流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに下流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、上流干渉の事である。この時、干渉プロモーターは、第一プロモーターと同一の配向を有する（従って、これら２つのプロモーターは、対状の構造を有する）。この構造は、上流干渉（またはＵＩ）と呼ばれている。
【００７５】
もう１つの可能な構造は、上で説明した２つの構造の組み合わせ（ＵＩおよびＤＩ系）である。この場合、少なくとも１つの誘導性干渉プロモーターが、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置される。この時、上流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに下流に位置する第一プロモーターの活性に干渉し、また下流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに上流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、上流−下流干渉の事である。
【００７６】
第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターに対して集中的な配向を有する（上記ＤＩ系参照）。第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターのものと同一の配向を有する（従って、これら２つのプロモーターは、対状の構造を有する）（上記ＵＩ系参照）。
【００７７】
この構造は、上流−下流干渉（またはＵＤＩ）と呼ばれている。
【００７８】
もう１つの可能な構造は、上で説明した２つの構造の組み合わせ（ＵＩおよびｎＤＩ系）である。この場合、少なくとも１つの誘導性干渉プロモーターが、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置される。この時、上流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに下流に位置する第一プロモーターの活性に干渉し、また下流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに上流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、上流−下流干渉の事である。
【００７９】
第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターに対して対状の配向を有する（上記ｎＤＩ系参照）。第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターのものと同一の配向を有し（上記ＵＩ系参照）、従って、これら３つのプロモーターは、対状の構造を有する。
【００８０】
この構造は、ナンセンス上流−下流干渉（またはｎＵＤＩ）と呼ばれている。
【００８１】
ＵＩタイプの構築物の場合、干渉プロモーターの活性化は、転写干渉のため、第一プロモーターの活性の減少をもたらす。しかし、この上流干渉プロモーターの活性が、レポーター遺伝子のセンス転写産物を再び生じさせることがある。
【００８２】
この機能性センス転写産物の翻訳を防止するために、好適には、短いオープンリーディングフレーム、これに続く１つまたはそれ以上（例えば２つまたは３つ）の停止コドンが、干渉プロモーターと第一プロモーターの間に挿入される。この時、ＵＩ系における転写干渉は、バイシストロン性メッセンジャーを生じさせ、ここから出発してこの最初の短いオープンリーディングフレームだけを翻訳する。
【００８３】
これは、ＵＤＩおよびｎＵＤＩタイプの構造の場合も同様である。実際、ＵＤＩまたはｎＵＤＩタイプの構築物の場合、第一プロモーターの上流に位置する干渉プロモーターの活性化は、転写干渉のために第一プロモーターの活性の減少をもたらす。しかし、上流干渉プロモーターの活性が、レポーター遺伝子のセンス転写産物を再び生じさせることもある。
【００８４】
この機能性センス転写産物の翻訳を防止するために、好適には、短いオープンリーディングフレーム、これに続く１つまたはそれ以上の停止コドンが、干渉プロモーターと第一プロモーターの間に挿入される。この時、ＵＤＩまたはｎＵＤＩ系における転写干渉は、バイシストロン性メッセンジャーを生じさせ、ここから出発してこの最初の短いオープンリーディングフレームだけを翻訳する。
【００８５】
好適には、上で説明した干渉構築物は、これらの末端で二方向性転写ターミネーターに隣接する。任意の機能性で二方向性の転写ターミネーターを使用して、本発明の構築物に隣接させることができる。例として、遺伝子ＣＹＣ１の転写ターミネーター（Ｔｃｙｃ１）（１９８９年、Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｂ．Ｉ．およびＬ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ．，１９８９によって説明されたもの）ならびに遺伝子ＡＤＨ１のターミネーター（Ｔａｄｈ１）（１９９１年、Ｉｒｎｉｇｅｒ，Ｓ．らによって説明されたもの）を使用することができる。
【００８６】
二方向性転写ターミネーターは、二方向様式で転写を停止させる。これは、第一プロモーターまたは干渉プロモーターにより命じられる転写がこの構築物を越えて拡大することを防止し、およびまた、この構築物の外部に位置する転写活性の起こり得る影響からこの系を保護する。
【００８７】
同じ目的で、（二方向性ターミネーターを得るために、拡散的または集中的な配向で転写を阻止する２つの一方向性ターミネーターを組み合わせることにより）一方向性ターミネーターを二方向で転写を阻止する構造に組み合わせることもできる。一方向性ターミネーターの例としては、次のターミネーターを挙げることができる：Ｔｐｇｋ１（Ｐｉｃａｒｄら、１９９０）、Ｔｔｅｆ（Ａ．ゴシピからのもの）（ＳｔｅｉｎｅｒおよびＰｈｉｌｉｐｐｓｅｎ，１９９４）、Ｔｈｉｓ３（Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）からのもの）（ＷｅｉｓｔｏｃｋおよびＳｔｒａｔｈｅｒｎ，１９９３）。
【００８８】
本発明の干渉プロモーターは、誘導性プロモーターであり、ならびにこの活性化が第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、この結果、レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。
【００８９】
この誘導性プロモーターは、条件付で活性化される。本発明に関連して、誘導プロモーターは、転写因子が活性であるとき、この転写因子によって活性化される。本発明によると、誘導性プロモーターを活性化する転写因子は、２つのキメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤ）の集合体によって形成され、これは、２つのキメラタンパク質 Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの間に相互作用が発生したとき、誘導性プロモーターを活性化することができる活性転写因子を再構成する。
【００９０】
上に明記したように、本発明の細胞は、２つのキメラタンパク質：
−パートナータンパク質Ｘと相互作用することができる、パートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る、第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）、
−このタンパク質Ｙと相互作用することができる、このタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）
を発現し、２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用の結果、干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子が形成される。
【００９１】
従って、第二キメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、誘導性プロモーターの一機能として前記プロモーターのレベルでＤＮＡに連結するように選択される。好ましくは、このキメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、前記プロモーター中に存在する配列（ＤＢＤにより連結されるＤＮＡ配列（ＵＡＳ）（上流活性化配列））と相互作用するように選択される。
【００９２】
この第一キメラタンパク質Ｙ−ＡＤの転写活性化ドメインにより、細胞内での誘導性プロモーターの転写を活性化することができる。例えば、干渉プロモーター（誘導性プロモーター）は、２つのキメラタンパク質 Ｙ−ＡＤおよびＸ−ＤＢＤの集合体（これらの間の相互作用）によって形成された機能性転写因子により誘導され、この機能性転写因子は、このＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を介してこのプロモーターの配列と相互作用し、ならびにこのプロモーターにより支配される転写をこの転写活性ドメイン（ＡＤ）を介して開始させることができる。
【００９３】
これは、まさしくダブル・ハイブリッド法の原理の構成要素であり、当業者は、本発明の実施を可能にする多彩なプロモーター／転写因子対を選択することができる。酵母におけるダブル・ハイブリッド系の現行使用バージョンは、酵母サッカロミセス・セレビジエのタンパク質ＧＡＬ４ｐ（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ，１９８９）およびこのプロモーターＰｇａｌ１の特性を利用している。しかし、記載されている他のダブル・ハイブリッド系、特に、表１に記載されているものも、本発明に関連して使用することができる。
【００９４】
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＡＤ）にそれぞれ融合したパートナータンパク質ＸおよびＹは、（たとえこれがこれらの起源生物における場合でなくても）細胞内で相互作用して誘導性プロモーター、例えば上で定義したもの、を活性化する機能性転写因子（Ｘ−ＤＢＤ／Ｙ−ＡＤ）を結果的に形成する、ＤＢＤおよびＡＤにそれぞれ融合した任意のタンパク質対と定義することができる。これは、完全タンパク質または完全タンパク質のフラグメントの事である。例えば、本発明に関連して、ダブル・ハイブリッドシグナルを発生するキメラタンパク質を使用することができる。すなわち、２つのパートナータンパク質（またはこれらのパートナータンパク質のフラグメント）が、使用される細胞内で、誘導性プロモーターを活性化する機能性転写因子を形成するために十分な親和性で互いに相互作用する、キメラタンパク質［この場合、前記転写因子は、第一キメラタンパク質のＤＮＡにこの結合ドメインを介して結合し、第二キメラタンパク質の転写活性ドメイン（ＡＤ）により前記プロモーターを活性化する。］である。
【００９５】
本発明の細胞は、組み込まれているまたは組み込まれていないベクターに担持された、ＤＮＡ構築物とキメラタンパク質をコードする構築物とを有することができる。被組み込み干渉ＤＮＡ構築物で最良の結果が得られることが、確認された。
【００９６】
好適には、干渉ＤＮＡ構築物は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。レポーターカセットの外側で開始される転写活性の起こり得る影響からこの干渉系を保護するために、この干渉構築物を潜在的摂動性ゲノム転写活性のない遺伝子座にターゲッティングすると有利である。
【００９７】
これを行うために、酵母ｐＲＢ２の新規組み込みベクターを構築した。この組み込みベクターにより、干渉構築物を潜在的摂動性ゲノム転写活性のない遺伝子座にターゲッティングする（図３参照）。
【００９８】
非組み込みベクターに担持された本発明の干渉系が遺伝子的に安定であり、これにより、レポーターカセットが組み込まれた株を構築する必要がなくなることも明らかになった。この特徴は、医薬品のスクリーニングのために非常に興味深い。小分子の透過性を増大させるために、異なる変異を有する非常に多数の株を容易に評価することができるからである。
【００９９】
本発明の主題であるダブル・ハイブリッド系の実現に利用することができる細胞は、上で説明した前記ダブル・ハイブリッド系において必要なキメラタンパク質を発現することができる任意の細胞、および上で説明した干渉ＤＮＡ構築物によって／を用いて形質転換または形質移入することができる任意の細胞から成る。これらの宿主細胞は、真核性または原核性宿主であり、これらは、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、またはさらに好適には酵母細胞であり得る。
【０１００】
好ましい実施形態において、本発明の細胞は、真菌界から選択される。好適には、真菌界の生物は、子嚢菌門から選択され、さらに好ましくは、サッカロミコチナ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門から選択され、さらにいっそう好ましくは、サッカロミセテス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）またはシゾサッカロミセテス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）から選択され、さらにいっそう好ましくは、サッカロミセタレス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目またはシゾサッカロミセタレス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目から選択され、さらにいっそう好ましくは、サッカロミセタセア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）科またはシゾサッカロミセタセア（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）科から選択され、さらにいっそう好ましくは、サッカロミセス属またはシゾサッカロミセス属から選択され；完全に好ましくは、本発明の真菌界の生物は、サッカロミセス・セレビジエ種またはシゾサッカロミセス・ポンベ種に属する。クルイベロミセス・ラクティス種、ピチア・パストリス種、サッカロミセス・カールスベルゲンシス種またはカンジダ・アルビカンス種の酵母も、本発明の範囲内に入る細胞である。
【０１０１】
これまでに説明されている系に反して、本発明のダブル・ハイブリッド系は、毒性または非毒性物質の添加を必要としない。このことは、これらが細胞生理に対して付加的効果をおそらく有するため、およびこれらが一定の逆Ｙ２Ｈ相互作用の検出に干渉することがあるため、有利な要因である。しかし、毒性または非毒性物質の使用は、依然として可能である。例えば、生存に不可欠なレポーター遺伝子、例えば、一次代謝、細胞分裂、タンパク質合成（リボソームなど）、ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成などに不可欠な遺伝子を使用する場合、レポーター遺伝子の生産を阻害する物質の使用は、興味深いはずである。実際、レポーター遺伝子が、転写干渉にもかかわらずなお十分に発現される場合、および細胞の成長の完全な不在が求められる場合、このようなレポーター遺伝子の生産を阻害する物質を使用して、ダブル・ハイブリッド系の感度を増すことができる。従って、例えば、レポーター遺伝子が、遺伝子ＨＩＳ３である場合、干渉酵母（例えば、Ｓ．セレビジエ）株の細胞成長は、ヒスチジンを枯渇させた培地を用いて評価することができる。もしくは、タンパク質ＨＩＳ３ｐの競合阻害剤（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ））を培地に添加して、このレポーター遺伝子ＨＩＳ３の活性のレベルのレベル差を観察してもよい。これによって、より大きな感度を実現することができ、またこの系を検量することができる（実施例６参照）。
【０１０２】
しかし、レポーター遺伝子が、転写干渉にもかかわらずなお十分に発現される場合、および細胞の成長の完全な不在が求められる場合、１つの可能性は、ダブル・ハイブリッド系の感度を増す効果を有する、上で説明した干渉系（ＵＩ、ＤＩ、ｎＤＩ、ＵＤＩおよびｎＵＤＩ）により制御されるまたはされない他のレポーター遺伝子の併用である。これらのレポーター遺伝子の発現の部分的な阻害であっても、これらの効果が加わることにより、成長の完全阻害につながる。従って、例えば、レポーター遺伝子のうちの１つが、遺伝子ＨＩＳ３であり、他のもののうちの１つが、遺伝子ＵＲＡ３であり、これらの両方が干渉系により制御される場合、干渉酵母（例えば、Ｓ．セレビジエ）の成長は、ヒスチジンおよびウラシルを枯渇させた培地を用いて評価することができる。ヒスチジンまたはウラシルを一方だけ枯渇させた培地を用いると、レポーター遺伝子に対する部分的転写干渉を有する酵母は、なお成長することができるが、ウラシルとヒスチジンの両方を枯渇させた培地を用いると、成長を完全に廃止することができる。
【０１０３】
本発明のダブル・ハイブリッド系は、非常に多数の用途を有することができる。例えば、タンパク質間相互作用阻害活性を有する分子の選別に特に適する。
【０１０４】
病理に関与するタンパク質間相互作用の同定は、これらの相互作用が新規医薬品を開発するための潜在的ターゲットを提供するので、非常に興味深い。疾病に関与するタンパク質間相互作用が同定されたならば、複雑な生体系における一方ではこのタンパク質間相互作用の適所を確認するためにこの相互作用を特異的に解離させる利用可能な合成または天然分子を有すること、および医薬品の開発のための利用可能な候補分子を有することは、多くの場合、非常に興味深い（Ｖｉｄａｌ，Ｍ．およびＨ．Ｅｎｄｏｈ，１９９９参照）。
【０１０５】
本発明のダブル・ハイブリッド系は、所与のタンパク質間相互作用の阻害剤スクリーニングのための単純な遺伝子系を提供する。例えば、本発明のダブル・ハイブリッド系では、タンパク質間相互作用を解離させる分子が、レポーター遺伝子の発現を引き起こし、これによりこれらを同定することができる。
【０１０６】
この発現が細胞の生存に必須であるレポーター遺伝子を選択することが、適切である場合もある。例えば、この必須遺伝子の再発現が可能である場合、この結果、細胞の成長を追跡することにより、タンパク質間相互作用を阻害する分子を容易に同定することができる。
【０１０７】
例えば、探索するタンパク質間相互作用の阻害剤スクリーニングは、例えば、相互作用を各阻害剤候補の濃度勾配について評価することができる、寒天での高出力拡散分析（Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．ら、１９９８）で行うことができる。
【０１０８】
従って、本発明は、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害する化合物の同定方法に関し、この方法は、
ａ）上で説明したものなどの細胞を培養する段階、
ｂ）被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下および不在下で比較する段階、
を含み、レポーター遺伝子の発現の増加は、被検化合物が、培養細胞により発現されたタンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であることの指標となる。
【０１０９】
本発明の干渉系のもう１つの用途は、調査するタンパク質間相互作用を特異的に排除するペプチドまたはタンパク質因子を同定するための、ｃＤＮＡバンクおよびペプチドバンクのスクリーニングである（Ｚｕｔｓｈｉ，Ｒ．ら、１９９８）。
【０１１０】
疾病のレベルで関係があるタンパク質間相互作用が、同定および確認されたならば、観察された相互作用の構造および調節を特性付けすることは、興味深い。相互作用しているタンパク質対の各パートナーのレベルでこの相互作用を遮断する変異の同定は、相互作用の構造成分を調査するためばかりでなく、インビボでの機能の特性付けのためのトランスドミナントネガティブ変異体（Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ，Ｉ．Ｇ．ら、２００１）のような遺伝子ツールを作製する手段としても有用である。これは、多数の相互作用パートナーを有するタンパク質には特に重要である。本発明の干渉系は、相互作用を遮断する変異の同定のための変異誘発によるスクリーニングにおいて使用することができる。変異誘発を受けた相互作用パートナーのバンクを作製しなければならず、これらを細胞成長の修復に関して高出力形式でスクリーニングすることができる（Ｇｕｔｈｅｒｉｅ，Ｃ．およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ（編集）、２００２）。このアプローチにより、相互作用のレベルで欠損した変異タンパク質、特にドミナントネガティブ特性を有する変異体、の集合体を迅速に同定することができる。変異体の集合体は、タンパク質間相互作用に関与するタンパク質の表面の限定に役立つこともあり、ならびに構造生物学者が構造と親和性の関係の研究中に阻害剤候補の構造を改善する助けになることもある。
【０１１１】
本発明は、上で説明したものなどのダブル・ハイブリッド系を作るためのキットにも関し、このキットは、
−上で定義したものなどの干渉ＤＮＡ構築物；
−第二ＤＮＡ構築物［これは、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるパートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る、第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）をコードする。］；
−第三ＤＮＡ構築物［これは、このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）をコードする。］；
を含み、前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用が、２つのキメラタンパク質が宿主細胞において発現されたときに干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成を生じさせる。
【０１１２】
上で説明したキットの３つのＤＮＡ構築物は、同じＤＮＡ分子上に存在することがあり、または２つもしくは３つの異なるＤＮＡ分子上に存在することもある。従って、３つの構築物が、同じＤＮＡベクターに担持されていることがあり、または２つもしくは３つの異なるベクター上で見出される。例えば、２つのキメラタンパク質をコードする２つの構築物を同じベクター上で見出すことができるが、３つ目の構築物は、別のベクター上で見出される。
【０１１３】
従って、本発明は、タンパク質間相互作用の遮断を誘導する変異および分子を同定するための単純な遺伝子系の集合体を提供する。本発明は、タンパク質間相互作用を特性付けるために、およびまた新規医薬品の開発のために有用なツールである。
【０１１４】
本発明は、タンパク質Ｙと他の２つのタンパク質ＸおよびＺとの相互作用の場合、ならびにＹとＸの間の相互作用を阻害するが、ＹとＺの間の相互作用を阻害しない分子を同定したい場合に非常に有用であると立証することもできる。このような選択を可能にする細胞は、例えば、図７にある遺伝子構築物を有し、ならびに図７に表されているもののような少なくとも３つのキメラタンパク質をさらに発現する。タンパク質Ｙがもう１つのタンパク質Ｚとも相互作用する場合、これらの細胞によってタンパク質Ｘとタンパク質Ｙの間の相互作用の特異的阻害剤を同定することができる。
【０１１５】
本発明は、ＤＮＡ構築物、いわゆる干渉構築物、を含有する細胞にも関し、
前記構築物は、
−第一誘導性プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
−１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター、いわゆる干渉プロモーター[この（これらの）干渉プロモーター活性化は前記第一誘導性プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、その結果前記レポーター遺伝子の発現が誘導されたときに前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。]、
を含み、
前記細胞は、
−２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互することができる、タンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る、第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）、
−このタンパク質Ｙと相互作用することができる、タンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）、
［前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤとＹ−ＡＤの相互作用の結果、前記干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子が形成される。］、
−このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合した、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）
［前記２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤとＹ−ＡＤの相互作用の結果、前記レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子が形成される。］
をさらに発現する。
【０１１６】
第一の実施形態において、本発明の細胞は、レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物（干渉構築物）により形質転換または形質移入された宿主細胞であり、これらは、３つのキメラタンパク質の各々をコードする３つのＤＮＡ構築物によっても形質転換または形質移入される。これら４つの構築物は、同じＤＮＡベクターに担持されていることがあり、または２つもしくは３つの異なるベクター上で見出される。すべての組み合わせが考えられる：同じベクター上に４つの構築物；４つの異なるベクター上に４つの構築物；同じベクター上に３つのキメラタンパク質をコードする３つの構築物、しかし４つ目の構築物（干渉構築物）は、別のベクター上で見出される；同じベクター上に３つのキメラタンパク質のうちの１つをコードする構築物と干渉構築物、しかし、他の２つのキメラタンパク質をコードする構築物は別のベクター上で見出される、など。この第一の実施形態におけるベクターは、非組み込みベクターである。
【０１１７】
第二の実施形態において、干渉構築物は、細胞のゲノムに組み込まれており、これらの細胞は、３つのキメラタンパク質の各々をコードする３つのＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入される。これらのキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、同じＤＮＡベクターに担持されていることがあり、または異なるベクター上で見出され、このまたはこれらのベクターは、非組み込みベクターである。
【０１１８】
本発明の第三の実施形態において、干渉構築物ならびにキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、細胞のゲノムに組み込まれている。３つのキメラタンパク質のうちの１つまたは２つをコードする３つの構築物のうちの１つまたは２つだけが、ゲノムに組み込まれているという場合もあり、ならびに構築物（単数または複数）は、非組み込みベクターに担持されていることもあるが、干渉構築物は、ゲノムに組み込まれているという場合もある。最後に、最後の実施形態において、干渉構築物、および３つのキメラタンパク質のうちの１つまたは２つをコードする１つまたは２つの構築物は、非組み込みベクターに担持されているが、３つ目のキメラタンパク質をコードする構築物は、細胞のゲノムに組み込まれている。
【０１１９】
レポーター遺伝子は、上で定義したものなどである。レポーター遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下に置かれている。好ましくは、レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有するタンパク質と相互作用することができる配列（ＤＢＤにより結合されるＤＮＡ配列（ＵＡＳ））を含む。さらに詳細には、レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターは、キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含む。
【０１２０】
プロモーター、いわゆる「干渉プロモーター」、も誘導性プロモーターである。この誘導性プロモーターは、これらの活性化が、第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、この結果、レポーター遺伝子の発現が誘導されたときにこのレポーター遺伝子の発現の検出可能な減少を導く。
【０１２１】
利用することができる干渉プロモーターは、上で定義したものなどの誘導性プロモーターである。好ましくは、利用することができる干渉プロモーターは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有するタンパク質と相互作用することができる配列（ＤＢＤにより結合されるＤＮＡ配列（ＵＡＳ））を含む。より詳細には、この誘導性干渉プロモーターは、キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含む。
【０１２２】
干渉プロモーターは、上で説明したように配置することができる。例えば、これらは、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に配置することができ、こういうわけで、これは下流干渉の事である。干渉プロモーターは、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に配置することもできる。こういうわけで、これは、上流干渉の事である。
【０１２３】
しかし、下流干渉に関連して、干渉プロモーターは、２つの可能な配向を有することができる。第一の配向は、第一プロモーターに対して集束的な配向に相当し、この構造は、下流干渉（またはＤＩ）と呼ばれる。干渉プロモーターは、第一プロモーターに対して対状の配向を有することもあり、この第二の構造は、ナンセンス下流干渉（またはｎＤＩ）と呼ばれている。
【０１２４】
干渉プロモーターは、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に配置することもできる。この時、干渉プロモーターは、第一プロモーターと同一の配向を有する（従って、これら２つのプロモーターは、対状の構造を有する）。この構造は、上流干渉（またはＵＩ）と呼ばれている。
【０１２５】
もう１つの可能な構造は、上で説明した２つの構造の組み合わせ（ＵＩおよびＤＩ系）である。この場合、少なくとも１つの（誘導性）干渉プロモーターが、第一誘導性プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置される。この時、上流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに下流に位置する第一プロモーターの活性に干渉し、下流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに上流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、上流−下流干渉の事である。
【０１２６】
第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターに対して集中的な配向を有する（上記ＤＩ系参照）。第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターのものと同一の配向を有する（従って、これら２つのプロモーターは、対状の構造を有する）（上記ＵＩ系参照）。
【０１２７】
この構造は、上流−下流干渉（またはＵＤＩ）と呼ばれている。
【０１２８】
もう１つの可能な構造は、上で説明した２つの構造の組み合わせ（ＵＩおよびｎＤＩ系）である。この場合、少なくとも１つの誘導性干渉プロモーターが、第一誘導性プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置される。この時、上流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに下流に位置する第一プロモーターの活性に干渉し、下流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに上流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、上流−下流干渉の事である。
【０１２９】
第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターに対して対状の配向を有する（上記ｎＤＩ系参照）。第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターのものと同一の配向を有し（上記ＵＩ系参照）、従って、これら３つのプロモーターは、対状の構造を有する。
【０１３０】
この構造は、ナンセンス上流−下流干渉（またはｎＵＤＩ）と呼ばれている。
【０１３１】
ＵＩ、ＵＤＩおよびｎＵＤＩタイプの構築物の場合、上で説明したように、好適には、短いオープンリーディングフレーム、これに続く１つまたはそれ以上（例えば２つまたは３つ）の停止コドンが、干渉プロモーターと第一プロモーターの間に挿入される。
【０１３２】
好適には、干渉構築物は、これらの末端で、上で説明したものなどの二方向性転写ターミネーターに隣接する。
【０１３３】
この干渉プロモーターは、条件付で活性化される誘導性プロモーターである。本発明に関連して、これは、転写因子が活性であるときにこの転写因子によって活性化される。本発明によると、誘導性プロモーターを活性化する転写因子は、２つのキメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤ）の集合体によって形成され、これは、これら２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの間に相互作用が発生したときにこの誘導性プロモーターを活性化することができる活性転写因子を再構成する。
【０１３４】
上で明記したように、本発明のこの特定の実施形態における細胞は、３つのキメラタンパク質を発現する。従って、これらは、
−２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができる、パートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る、第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）、
−このタンパク質Ｙと相互作用することができる、タンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）、
を発現し、前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用の結果、干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子が形成され、
−発現された第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）は、このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合した、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成り、上記２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用の結果、レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子が形成される。
【０１３５】
第二キメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、干渉プロモーターの一機能として前記プロモーターのレベルでＤＮＡに結合するように選択される。好ましくは、この第二キメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、前記プロモーター中に存在する配列（ＤＢＤによって見出されるＤＮＡ配列（ＵＡＳ）（上流活性化配列））と相互作用するように選択される。この誘導性干渉プロモーターは、キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含む。
【０１３６】
第一キメラタンパク質の転写活性化ドメイン（Ｙ−ＡＤのドメインＡＤ）は、細胞内での干渉プロモーターの転写を活性化することができる。従って、前記干渉プロモーター（誘導性プロモーター）は、互いに相互作用する２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤによって形成された機能性転写因子により誘導される。この機能性転写因子は、このＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を介して干渉プロモーターの配列と相互作用し、ならびにこの転写活性化ドメイン（ＡＤ）を介してこのプロモーターにより支配される転写を開始させることができる。
【０１３７】
上で明記したように、これは、まさしくダブル・ハイブリッド法の原理の構成要素であり、当業者は、本発明の実施を可能にする多彩なプロモーター／転写因子対を選択することができる。
【０１３８】
第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターの一機能として、前記プロモーターのレベルでＤＮＡに結合するように選択される。好ましくは、キメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーター中に存在する配列（ＤＢＤによって結合されるＤＮＡ配列（ＵＡＳ）（上流活性化配列））と相互作用するように選択される。
【０１３９】
レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターと干渉プロモーターは、異なるプロモーターである。特に、レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターは、キメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤに結合しないように選択される（従って、このプロモーターは、Ｘ−ＤＢＤのＤＢＤによって結合される任意のＤＮＡ配列（ＵＡＳ）（上流活性化配列）を含有しない。）。加えて、誘導性干渉プロモーターは、キメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤに結合しないように選択される（従って、このプロモーターは、Ｚ−ＤＢＤのＤＢＤによって結合される任意のＤＮＡ配列（ＵＡＳ）（上流活性化配列）を含有しない。）。
【０１４０】
第一キメラタンパク質の転写活性化ドメイン（Ｙ−ＡＤのドメインＡＤ）は、細胞内でのレポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターの転写を活性化することができる。従って、このレポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターは、互いに相互作用する２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤによって形成された機能性転写因子によって誘導される。この機能性転写因子は、このＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を介して、レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターの配列と相互作用し、ならびにこの転写活性化ドメイン（ＡＤ）を介して、このプロモーターにより支配される転写を開始させることができる。
【０１４１】
上で明記したように、これは、まさしくダブル・ハイブリッド法の原理を構成し、当業者は、本発明の実施を可能にする多彩なプロモーター／転写因子対を選択することができる。
【０１４２】
従って、タンパク質ＹとＸの間の相互作用の場合、干渉プロモーターを活性化し、これによりレポーター遺伝子の転写への干渉を導く。ＹとＸの間の相互作用を（例えば、ＹとＸの間の相互作用を阻害するキメラ阻害剤の作用により）摂動させると、干渉プロモーターは、あまり活性化しないかまったく活性化せず、従って、レポーター遺伝子の発現減少を招く。
【０１４３】
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＡＤ）に融合するパートナータンパク質Ｘ、ＹおよびＺは、ＹとＸの間およびＺとＹの間に相互作用が存在する任意のタンパク質群であって、ＹがＡＤおよびＺに融合しており、Ｘが異なるＤＢＤに融合しているとき、（たとえこれがこれらの起源生物における場合でなくても）細胞内で相互作用して誘導性プロモーター、例えば上で定義したもの、を活性化する２つの機能性転写因子（それぞれ、Ｘ−ＤＢＤ／Ｙ−ＡＤおよびＺ−ＤＢＤ／Ｙ−ＡＤ）の形成をもたらす任意のタンパク質群と、定義することができる。これらは、完全タンパク質である場合もあり、または完全タンパク質のフラグメントである場合もある。このように、ダブル・ハイブリッドシグナルを生じさせるキメラタンパク質を、本発明に関連して使用することができる。すなわち、２つのパートナータンパク質（またはこれらのパートナータンパク質のフラグメント）が、使用される細胞内で、誘導性プロモーターを活性化する機能性転写因子を形成するために十分な親和性で互いに相互作用する、キメラタンパク質［この場合、前記転写因子は、第一キメラタンパク質のＤＮＡにこの結合ドメインを介して結合し、ならびに第二キメラタンパク質の転写活性ドメイン（ＡＤ）によって前記プロモーターを活性化する］である。
【０１４４】
干渉ＤＮＡ構築物が、宿主細胞のゲノムに組み込まれているとき、上で説明したように、この構築物は潜在的摂動性ゲノム転写活性のない遺伝子座を標的にすると有利である。
【０１４５】
本発明のこの実施形態（３つのキメラタンパク質）に関連して使用することができる細胞は、上で説明したものである。
【０１４６】
上に明記したように、本発明のダブル・ハイブリッド系は、非常に多数の用途を有することができる。例えば、タンパク質間相互作用に対する阻害活性を有する分子のスクリーニングに特に適する。３つのキメラタンパク質での本発明の実施形態に関連して、タンパク質ＹとＸの間の相互作用を阻害するが、ＹとＺの間の相互作用を阻害しない分子の同定に関して言えば、上で説明した細胞は特に興味深い。例えば、これらの細胞では、ＹとＸの間のタンパク質間相互作用を解離させる分子がレポーター遺伝子の発現を引き起こし、これによりこれらを同定することができる。
【０１４７】
従って、本発明は、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害するが、このタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの相互作用はまったく阻害しないか、あまり阻害しない化合物を同定するための方法にも関し、この方法は、
ａ）上で定義したもの（三キメラタンパク質実施形態）などの細胞を培養する段階、
ｂ）被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下と不在下で比較する段階
を含み、この場合、レポーター遺伝子の発現の増加は、被検化合物が、タンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であること、しかし、この生成物が、タンパク質Ｙとタンパク質Ｚの間の相互作用をまったく阻害しないか、あまり阻害しないことの指標となる。
【０１４８】
三キメラタンパク質相互作用系のもう１つの用途は、調査するタンパク質Ｘとタンパク質Ｙの間の相互作用を特異的に排除する（Ｚｕｔｓｈｉ，Ｒ．ら、１９９８）が、タンパク質Ｘとタンパク質Ｚの間の相互作用には影響を及ぼさないペプチドまたはタンパク質因子を同定するための、ｃＤＮＡバンクおよびペプチドバンクのスクリーニングである。
【０１４９】
もう１つの用途は、タンパク質Ｙとタンパク質Ｘの間の相互作用を遮断するが、タンパク質Ｙとタンパク質Ｚの間の相互作用には影響を及ぼさない、タンパク質Ｙの変異の同定である。これは、特定の相互作用の構造成分を調査するためばかりでなく、インビボでの機能の特性付けのためのトランスドミナントネガティブ変異体（Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ，Ｉ．Ｇ．ら、２００１）のような遺伝子ツールを作製する手段としても有用である（上記参照）。
【０１５０】
本発明は、上で説明したものなどのダブル・ハイブリッド系を作るためのキットにも関し、このキットは、
−上で定義したＤＮＡ構築物；
−第二ＤＮＡ構築物（これは、２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができる、パートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る、第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）をコードする。）；
−第三ＤＮＡ構築物（これは、このタンパク質Ｙと相互作用することができる、タンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）をコードする。）；
［前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。］
−第四ＤＮＡ構築物（これは、このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合した、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）をコードする。）；
［前記２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。］
を含む。
【０１５１】
上で説明したキットの４つのＤＮＡ構築物は、同じＤＮＡ分子内に存在する場合もあり、または２つ、３つもしくは４つの異なるＤＮＡ分子上に存在する場合もある。従って、これら４つの構築物は、同じＤＮＡベクターに担持されている場合があり、または２つ、３つもしくは４つの異なるベクター上で見出される。例えば、３つのキメラタンパク質をコードする３つの構築物を同じベクター上で見出すことができるが、４つ目の構築物は、別のベクター上で見出される。
【０１５２】
本発明は、タンパク質間相互作用の特性付けのために有用なツールであるが、新規医薬品の開発に有用なツールでもある。
【０１５３】
図面への手がかり
図１：転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系。
逆Ｙ２Ｈ相互作用の検出のための転写干渉の適用を図解する略図。
Ｙ２Ｈ相互作用が不在の状態では、レポーター遺伝子ＨＩＳ３は、正常に発現され、細胞は、ヒスチジンを含有しない培地で成長することができる（図１Ａ）。Ｙ２Ｈ相互作用の存在は、ＨＩＳ３の転写レベルを低下させ、これに起因して、ヒスチジンについて栄養要求のレポーター株の細胞成長が減少する（図１Ｂ）。ＨＩＳ３のＯＲＦは、淡色の長方形によって表し、小さな黒い矢印が開始コドンの位置を指定している。ＨＩＳ３のＯＲＦの上の灰色の矢印は、Ｐａｄｈ１のレベルで開始される転写を表すのに対し、黒矢印は、Ｐｇａｌ１の転写を表す。矢印の濃さは、プロモーターの転写活性を象徴している。矢印は、転写の方向を指している。ＧＡＬ４−ＤＢＤ（Ｘ−ＤＢＤ）およびＧＡＬ４−ＡＤ（Ｙ−ＡＤ）のために用いた相互作用しているタンパク質ＸおよびＹを卵形で示す。Ｐａｄｈ１：ＡＤＨ１プロモーター；Ｐｇａｌ１：ＧＡＬ１プロモーター；ＨＩＳ３：ＨＩＳ３のＯＲＦ；ＤＩ：下流干渉；ＵＩ：上流干渉。縮尺に従わずに示した図。
【０１５４】
図２：転写干渉構築物。
転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。制限部位ＳａｌＩおよびＳａｃＩ、ならびに対応するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター上でのこれらの位置を指摘する。例示するプラスミドの名前（実施例４および表２参照）を示す。略語：Ｐａｄｈ１：ＡＤＨ１プロモーター；Ｐｇａｌ１：ＧＡＬ１プロモーター；ＨＩＳ３：ＨＩＳ３のＯＲＦ；Ｔａｄｈ１：ＡＤＨ１ターミネーター；Ｔｃｙｃ１：ＣＹＣ１ターミネーター；ＯＲＦ：２つの停止コドンに続くオープンリーディングフレーム；ＤＩ：下流干渉（２Ａ）；ＵＩ：上流干渉（２Ｂ）；ＵＤＩ：上流−下流干渉（２Ｃ）；ｎＤＩ：ナンセンス下流干渉（２Ｄ）；ｎＵＩ：ナンセンス上流干渉（２Ｅ）。
【０１５５】
図３：干渉構築物のゲノム組み込み。
転写干渉構築物のゲノム組み込みを図解する例。ｐＲＢ１７のフラグメントＳａｌＩ−ＳａｃＩをｐＲＢ２に挿入することにより、組み込みベクターｐＲＢ２３を構築した。この後、ｐＲＢ２３を使用してターゲット株ｙＣＭ１５を形質転換し、ここにｐＲＢ２３を相同組換えにより遺伝子座ＵＲＡ３のレベルで組み込む。ＵＲＡ３の遺伝子座（ＵＲＡ３の上流／下流）での相同ベクター配列をハッチングして示す。ＵＲＡ３の遺伝子に隣接するＯＲＦ（ＧＥＡ２、ＴＩＭ９およびＲＰＲ）を示し、モデル欠失ｕｒａ３Ｄ０を指摘する（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ，Ｃ．Ｂ．ら、１９９８）。略語：Ｐａｄｈ１：ＡＤＨ１プロモーター；Ｐｇａｌ１：ＧＡＬ１プロモーター；ＨＩＳ３：ＨＩＳ３のＯＲＦ；Ｔａｄｈ１：ＡＤＨ１ターミネーター；Ｔｃｙｃ１：ＣＹＣ１ターミネーター；３ＨＡ：ｐＲＢ２上のコード化タグ配列；Ｐｔｅｆ：ＴＥＦプロモーター；Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８への耐性をコードするＯＲＦ；ａｍｐＲ：アンピシリン耐性遺伝子。
【０１５６】
図４：被組み込み干渉系の機能評価。
組み込まれた干渉系コピーを有する株（ｙＲＢ４８（ＤＩ）、ｙＲＢ４９（ＵＩ）、ｙＲＢ５０（ｎＵＩ）、ｙＲＢ８３（ＵＤＩ）およびｙＲＢ８２（ｎＤＩ））を、プラスミドｐＣＬ１／ｐＦＬ３９（＋）およびｐＴＡＬ２０／ｐＤＢＴ（−）の系列でそれぞれ形質転換し、これらの形質転換体の細胞成長を、完全培地（図４Ａ）またはヒスチジンを枯渇させた培地（図４ＢからＥ）で、滴下評価（ｄｒｏｐ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）法により試験する。各形質転換体について１０倍稀釈系列を調製する。場合によっては、タンパク質ＨＩＳ３ｐの競合阻害剤（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ））を示す漸増濃度（０ｍＭから２２ｍＭ）で培地に添加する（図４ＢからＥ）。略語：ＤＩ：下流干渉株；ＵＩ：上流干渉株；ｎＤＩ：ナンセンス下流干渉株；ｎＵＩ：ナンセンス上流干渉株；ＵＤＩ：上流−下流干渉株。
【０１５７】
図５：プラスミドに基づく干渉系の機能評価（ゲノムレベルで組み込まれていないもの）：
株ｙＣＭ１５を、プラスミドに基づくバージョンの干渉系（ｐＲＢ２０（ＤＩ）、ｐＲＢ２１（ＵＩ）またはｐＲＢ２８（ＵＤＩ））ならびにプラスミドｐＣＬ１／ｐＦＬ３９（＋）およびｐＴＡＬ２０／ｐＤＢＴ（−）の系列でそれぞれ独立して共形質転換する。これらの三重形質転換体の各々の細胞成長を、ヒスチジンを含有する（図５Ａ）および含有しない（図５ＢからＤ）寒天プレート、ヒスチジンを含有しないプレートについては、漸増濃度（０ｍＭから１６ｍＭ）の３−ＡＴを含有するまたは含有しない寒天プレートで試験する（図５ＢからＤ）。１０倍稀釈系列を調製し、各形質転換株について２つの独立したクローンを評価する。略語：ＤＩ：下流干渉プラスミド；ＵＩ：上流干渉プラスミド；ＵＤＩ：上流−下流干渉プラスミド。
【０１５８】
図６：
Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉：
図６Ａおよび図６Ｂ：タンパク質Ｆｅ６５とＡｐｐおよびｐ５３とｍｄｍ２の間で以前に同定されたタンパク質間相互作用は、酵母の細胞成長を阻害するように十分に転写干渉構築物を誘導する。
【０１５９】
先ず、これらの構築物の活性を検証する（図６Ａおよび６Ｆ）。これを行うために、レポーター株Ｙ１８７を次のプラスミド対によって形質転換する：ｐＲＢ３４＋ｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ）、ｐＲＢ３４＋ｐＤＢＴ（Ｆｅ６５／ＤＢＤ）およびｐＴＡＬ２０＋ｐＲＢ３５（ＡＤ／Ａｐｐ）（図６Ａ）ならびにｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ（ｐ５３／ｍｄｍ２）、ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ＋ｐＤＢＴ（ｐ５３／ＤＢＤ）およびｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２（ＡＤ／ｍｄｍ２）（図６Ｆ）。これらの各形質転換体の２つのクローンをウラシルを含有するおよび含有しない最小培地で培養する（図６Ａおよび６Ｆ）。
【０１６０】
この後、株ｙＲＢ４８（系ＤＩ）およびｙＲＢ４９（系ＵＩ）を、各々、プラスミド対 ｐＲＢ３４（Ｆｅ６５）およびｐＲＢ３５（Ａｐｐ）によって共形質転換して、２つのハイブリッドタンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５およびＤＢＤ−ＡｐｐＣｔを発現させる。対照として、株ｙＲＢ４８（系ＤＩ）およびｙＲＢ４９（系ＵＩ）を、各々、プラスミド対 ｐＲＢ３４＋ｐＤＢＴ（Ｆｅ６５／ＤＢＤ）およびｐＴＡＬ２０＋ｐＲＢ３５（ＡＤ／Ａｐｐ）によっても共形質転換する。
【０１６１】
各二重形質転換体の２つのクローンの細胞成長を、ヒスチジンを含有するおよび含有しない寒天プレート、ヒスチジンを含有しないプレートについては、漸増濃度の３−ＡＴを含有するまたは含有しない寒天プレートで試験する（図６Ｂから６Ｅ）。株ｙＲＢ４９（系ＵＩ）は、プラスミド対ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ（ｐ５３／ｍｄｍ２）によっても共形質転換して、２つのハイブリッドタンパク質ＤＢＤ−ｍｄｍ２およびＶＰ１６−ｐ５３（１−５５）を発現させる。株ｙＲＢ４９（系ＵＩ）は、対照として、プラスミド対ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＴＡＬ２０（ＡＤ／ｍｄｍ２）によっても共形質転換する。２つのプラスミドにより共形質転換された２つのクローンを、これらの２つのプラスミド対の各々について選択する。
【０１６２】
これらの二重形質転換体の２つのクローン各々の細胞成長を、ヒスチジンを含有するおよび含有しない寒天プレート、ヒスチジンを含有しないプレートについては、図に示されているように、漸増濃度の３−ＡＴを含有するまたは含有しない寒天プレートで試験する。
【０１６３】
図７：２つのタンパク質ＹとＸの間の相互作用を阻害するがこのタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用は阻害しない分子を同定することができる、本発明の転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系
２つのタンパク質ＹとＸの間の相互作用を阻害するがこのタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用は阻害しない分子を同定することができる逆Ｙ２Ｈ相互作用を検出するための転写干渉の適用を図解する略図。タンパク質ＸとＹの間の相互作用Ｙ２Ｈが不在の状態では、レポーター遺伝子ＨＩＳ３は、正常に発現され、これらの細胞は、ヒスチジンを含有しない培地で成長することができる（図７Ａ）。これは、タンパク質Ｘとパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤が存在するケースである。Ｘ−ＤＢＤとＹ−ＡＤの間のＹ２Ｈ相互作用の存在は、ＨＩＳ３の転写レベルを低下させ、これに起因して、ヒスチジンについて栄養要求性のレポーター株の細胞成長が減少する（図７Ｂ）。ＨＩＳ３のＯＲＦは、淡色の長方形によって表し、小さな黒い矢印が開始コドンの位置を指定している。ＨＩＳ３のＯＲＦの上の灰色の矢印は、Ｐｌｅｘのレベルで開始された転写を表すのに対し、黒矢印は、Ｐｇａｌ１の転写を示す。矢印の濃さは、プロモーターの転写活性を象徴している。矢印は、転写の方向を指している。用いた相互作用しているタンパク質Ｘ／ＹおよびＺ／Ｙを卵形で示す。Ｐｌｅｘ：ＬｅｘＡプロモーター；Ｐｇａｌ１：ＧＡＬ１プロモーター；ＨＩＳ３：ＨＩＳ３のＯＲＦ；縮尺に従わずに示した図。
【０１６４】
図８：
Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤を選別するための実験条件の決定
【０１６５】
図８Ａ：細胞量の決定：
ＵＩ転写干渉系を含有する株（ｙＲＢ４９）を、プラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）で共形質転換した。この形質転換株の培養物を、ＯＤ＝０．１および０．０１に稀釈し、各稀釈物の１０ｍＬを、ヒスチジンを補足した（＋ＨＩＳ）培地に平板接種した。これらの皿を３０℃で４８時間、保温した。
【０１６６】
図８Ｂ：３−ＡＴの濃度の決定
プラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）でまたは対照プラスミドｐＴＡＬ２０およびｐＤＢＴ（ＡＤ／ＤＢＤ）で共形質転換した転写干渉系（ｙＲＢ４９）を含有する株を、ヒスチジンを含有し、３−ＡＴを含有しない培地、ヒスチジンを含有せず、３−ＡＴを含有しない培地、およびヒスチジンを含有し、０．５ｍＭまたは１ｍＭの３−ＡＴを含有する培地に平板接種した。この後、１００％ＤＭＳＯ（１μＬ）、ＤＭＳＯ中１０ｍＭの分子ｘの溶液（１μＬ）、およびＤＭＳＯ中１０ｍＭの分子ｙの溶液（１μＬ）を各皿に堆積させた。これらの皿を３０℃で４８時間、保温した。
【０１６７】
図８Ｃ：ヒスチジンによる成長の修復
ＵＩ干渉系（ｙＲＢ４９）を含有し、プラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）で共形質転換した株を、ヒスチジンを含有し、１ｍＭの３−ＡＴを含有する培地に平板接種した。０．１２５％、０．２５％、０．５％もしくは１％の、ウラシル（Ｕ）（１μＬ）、アデニン（Ａ）（１μＬ）、リシン（Ｋ）（１μＬ）またはヒスチジン（Ｈ）（１μＬ）を、各皿の中央に堆積させた。これらの皿を３０℃で４８時間、保温した。
【０１６８】
図９：成長の修復によるＦｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤の検出
ＵＩ転写干渉系（ｙＲＢ４９）を含有し、プラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）で共形質転換した株を、ヒスチジンを含有せず、１ｍＭの３−ＡＴを含有する培地に平板接種した。Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の推定的阻害剤である分子１の１０ｍＭ溶液（１μＬ）、Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の推定的阻害剤である分子２の１０ｍＭ溶液（１ｕＬ）、およびＦｅ６５／Ａｐｐ相互作用に対して不活性である分子３の１０ｍＭ溶液（１μＬ）をこの皿に堆積させた。これらの皿を３０℃で４８時間、保温した。
【０１６９】
図１０：干渉系の活性化についてのＦｅ６５／Ａｐｐとｐ５３／ＭＤＭ２相互作用の比較
ＵＩ転写干渉系を含有する株（ｙＲＢ４９）を、プラスミド対ｐＲＢ３４とｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）、ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２とｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ（ｍｄｍ２／ｐ５３相互作用）、またはｐＴＡＬ２０とｐＤＢＴ（対照）で共形質転換した。各形質転換体につき２つの独立したクローンを培養した。３０℃で一晩保温した後、すべての培養物を同じＯＤにした。各培養物の１０倍系列稀釈を行い、各稀釈溶液の１滴を、ヒスチジンを含有せず、様々な濃度（１から３２ｍＭ）の３−ＡＴを補足した培地に堆積させた。これらの皿を３０℃で４８時間保温した。
【０１７０】
図１１：Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤の特異性の確認
ＵＩ転写干渉系を含有する株（ｙＲＢ４９）を、プラスミド対ｐＲＢ３４とｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）またはｐＤＢＴ−ｍｄｍ２とｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ（ｍｄｍ２／ｐ５３相互作用）で共形質転換した。プラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）を含有する株を、１ｍＭの３−ＡＴを補足した、ヒスチジンを含有しない培地の５つの皿に平板接種し（上の行）、プラスミドｐＤＢＴ−ｍｄｍ２およびｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ（ｍｄｍ２／ｐ５３相互作用）を含有する株を、２０ｍＭの３−ＡＴを補足した、ヒスチジンを含有しない培地の５つの皿に、同様に平板接種した（下の行）。
【０１７１】
対照皿は、１μＬのヒスチジンを０．１２５％ ｗ／ｖでこの皿の中央に堆積させることにより、各相互作用について調製した。異なる分子Ａ、Ｂ、ＣまたはＤを、次の計画に従って、他の４つの皿の各々に置いた：左上の角に、０．１ｍＭの濃度の生成物（１μＬ）を堆積する；右上の角に、１ｍＭの濃度の同生成物（１μＬ）を堆積させる；中央に、１０ｍＭのこの生成物（１μＬ）を堆積させる。これらの皿を３０℃で４８時間保温した。
【０１７２】
後続の実施例を利用して本発明を例示する。これらの実施例は、実例となるもの、非限定的なものと解釈しなければならない。
【０１７３】
後続の実施例において用いる分子生物学の技法は、分子生物学の標準的なプロトコルに相当し、これらは（Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．ら、１９８９）により説明されている。高忠実度ＰＣＲ系（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、ドイツ、ＰｅｎｚｂｅｒｇのＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の使用により、ＤＮＡ配列を増幅した。
【実施例１】
【０１７４】
プラスミドｐＲＢＶの構築：
遺伝子ＡＤＨ１の完全構成的プロモーターに対応する７６１ｂｐのフラグメントを、プライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ４３ ５’−ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＧＧ−３’（配列番号１）およびＲＢ４４ ５’−ＡＡＡＡＡＣＧＣＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣ −３’（配列番号２）（制限部位ＸｂａＩおよびＭｌｕＩに下線を引く）およびゲノムＤＮＡマトリックスとしてＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株ＦＬ１００（特に、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ（米国、バージニア州、マナッサス）から番号２８３８３で入手できる。）を使用することにより、ＰＣＲによって作製する。
【０１７５】
リン酸化１本鎖オリゴヌクレオチド：配列 ５’−ＣＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣ−３’（配列番号３）のＲＢ７５および配列 ５’−ＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＣＣＡ−３’（配列番号４）のＲＢ７６、をハイブリド形成させて、相和性付着末端ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩをそれぞれ末端に有する２本鎖連結アーム（リンカー）を得る。これを行うために、前記２つの１本鎖オリゴヌクレオチドを水中、等モル濃度で混合する。この混合物を加熱ブロック（ヒートブロック）において５分間、９０℃に加熱し、この後、このブロックを（約２時間）放置して周囲温度に冷却する。
【０１７６】
ベクターｐＲＢ３を構築するために、ＰＣＲによって得られた７６１ｂｐのフラグメント（フラグメントＰａｄｈ１）を、先ず最初に、制限酵素ＸｂａＩおよびＭｌｕＩによって消化する。このようにして消化したフラグメントを、この後、事前にＸｂａＩ−ＮｏｔＩによって消化したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国、カリフォルニア州、ラホーヤ）により市販されているもの）に、リンカーと共に挿入する。このようにして得たプラスミドをｐＲＢ３を呼ぶ。
【０１７７】
次に、遺伝子ＨＩＳ３のオープンリーディングフレームに対応する６６０ｂｐのフラグメントを、マトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ４５ ５’−ＡＡＡＡＡＣＧＣＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＡＧ−３’（配列番号５）およびＲＢ４６ ５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＴＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＧ−３’（配列番号６）（部位Ｍｌｕ１、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩに下線を引く）、を使用することにより、ＰＣＲによって増幅させる。このフラグメントを制限酵素ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩによって消化し、事前に制限酵素ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩによって線形化したベクターｐＲＢ３にクローニングした。このようにして得たベクターをｐＲＢ４と呼んだ。
【０１７８】
次に、遺伝子ＡＤＨ１のターミネーター（Ｔａｄｈ１）をコードする２０３ｂｐのＰＣＲフラグメントを、マトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ５１ ５’−ＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＡＡＴＴＣＣＧＧＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴ−３’（配列番号７）およびＲＢ５２ ５’−ＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧ−３’（配列番号８）（部位ＡｓｃＩおよびＳａｃＩに下線を引く）、を使用することにより、ＰＣＲによって増幅させる。得られたフラグメントを制限酵素ＡｓｃＩおよびＳａｃＩによって消化し、これを、事前に酵素ＡｓｃＩおよびＳａｃＩによって消化したベクターｐＲＢ４に挿入する。このようにして得たプラスミドをｐＲＢ５と呼ぶ。
【０１７９】
遺伝子ＣＹＣ１のターミネーター（Ｔｃｙｃ１）をコードする８８ｂｐのフラグメントを、配列：５’−ＣＧＡＴＣＧＣＧＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＣＡＴＡＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＧＧＧＡＣＣＧ−３’（配列番号９）のＲＰ９８および配列：５’−ＡＡＴＴＣＧＧＴＣＣＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＴＧＴＴＡＧＴＡＴＴＡＡＧＡＡＣＧＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＣＧＣＧＡＴ−３’（配列番号１０）のＲＢ９９の２つのリン酸化１本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリド形成によって得る。これを行うために、これら２つの１本鎖オリゴヌクレオチドを水中、等モルで混合する。この混合物を加熱ブロック（ヒートブロック）において５分間、９０℃に加熱し、この後、このブロックを（約２時間）放置して、室温に冷却する。このようにして得た２本鎖フラグメントは、相和性付着末端ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩをそれぞれこの末端に有する。これにより、この２本鎖フラグメント（ターミネーターＴｃｙｃ１に対応する。）を、事前に酵素ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩによって消化した、上で説明したベクターｐＲＢ５に挿入することができる。このようにして得たベクターをｐＲＢＶと呼ぶ。
【０１８０】
この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【実施例２】
【０１８１】
転写干渉系の構築
２．１ 下流干渉ベクターｐＲＢ１７およびナンセンス下流干渉ベクターｐＲＢ１６の構築：
下流干渉ベクターｐＲＢ１７（ＤＩとも呼ばれる）およびナンセンス下流干渉ベクターｐＲＢ１６（ｎＤＩとも呼ばれる）を、プロモーターＰｇａｌ１に対応する５４９ｂｐのＰＣＲのフラグメントをベクターｐＲＢＶ（実施例１参照）に挿入することによって得る。
【０１８２】
このＰＣＲフラグメントは、マトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ４９ ５’−ＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＴＡＡＡＧＡＧＣＣＣＣＡＴＴＡＴＣＴＴＡＧ−３’（配列番号１１）およびＲＢ５０ ５’−ＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴ−３’（配列番号１２）（制限部位ＡｓｃＩに下線を引く）を使用することによって得る。次に、このＰＣＲフラグメントを酵素ＡｓｃＩによって消化し、酵素ＡｓｃＩで線形にしたベクターｐＲＢＶに挿入する。このフラグメントは、両方向に挿入することができ、これにより２つの構築物を得ることができる：下流干渉ベクターｐＲＢ１７（ＤＩとも呼ばれ、この場合、Ｐａｄｈ１およびＰｇａｌ１は、反対方向に配向している。）（図２Ａ参照）ならびにナンセンス下流干渉ベクターｐＲＢ１６（ｎＤＩとも呼ばれ、この場合、Ｐａｄｈ１およびＰｇａｌ１は、同じ配向である。）（図２Ｄ参照）。
【０１８３】
これらの構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０１８４】
使用した一方向性プロモーターＰｇａｌ１は、拡散的二方向性プロモーターＧＡＬ１−１０（Ｊｏｎｓｔｏｎ，Ｍ．およびＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ、１９８４）によって説明されていたもの）から生じ、ならびに４つのコンセンサス部位「ＧＡＬ４ｐ応答性ＤＮＡエンハンサー要素」および遺伝子ＧＡＬ１の基本プロモーターを含有するが、遺伝子ＧＡＬ１０のプロモーターのＴＡＴＡボックスを有さない。プロモーターＧＡＬ１は、転写因子ＧＡＬ４ｐによって調節され、これにダブル・ハイブリッド対（Ｙ２Ｈ）（別個のＡＤおよびＤＢＤドメイン）を利用することができる。このプロモーターは、十分に特性付けされており、プロモーターの誘導性発現が求められる用途での、例えば、タンパク質の精製、必須遺伝子の機能の研究などのための使用に成功している。
【０１８５】
２．２ 上流干渉ベクターｐＲＢ１８およびナンセンス上流干渉ベクターｐＲＢ１９の構築：
上流干渉ベクターｐＲＢ１８（ＵＩとも呼ばれる）およびナンセンス上流干渉ベクターｐＲＢ１９（ｎＵＩとも呼ばれる）を構築するために、タンパク質ＧＳＴのカルボキシ末端（Ｃ−ｔｅｒ ＧＳＴ）のアミノ酸をコードする短いオープンリーディングフレームを、２つの１本鎖リン酸化オリゴヌクレオチド：配列５’−ＣＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＧＡＧＴＡＧＣＴＧＡＡＴＡＡＧＴＧＡＡＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴ−３’（配列番号１３）のＲＢ８１および配列５’−ＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＴＣＡＣＴＴＡＴＴＣＡＧＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１４）（部位ＮｏｌＩに下線を引く）のＲＢ８２、のハイブリダイゼーションによって作製する。
【０１８６】
これを行うために、これら２つの１本鎖オリゴヌクレオチドを水中、等モル濃度で混合する。この混合物を加熱ブロック（ヒートブロック）において５分間、９０℃で加熱し、この後、このブロックを（約２時間）放置して、室温に冷却する。このようにして得た２本鎖フラグメントは、相和性付着末端ＸｍａＩおよびＸｂａＩをそれぞれこの末端に有する。
【０１８７】
並行して、遺伝子ＧＡＬ１のプロモーターに対応する５５２ｂｐのフラグメント（これは、下流干渉ベクターｐＲＢ１７の構築に使用したものと同じプロモーターであるが、このフラグメントは、短いオープンリーディングフレームの翻訳を開始させるために出発コドンＡＴＧを含有するので、下流構築物のために使用したものより３ｂｐ長い。）を、ＰＣＲにより増幅する。このフラグメントは、マトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ５５ ５’−ＡＡＡＡＣＣＣＧＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＣＣＣＣＡＴＴＡＴＣＴＴＡＧ−３’（配列番号１５）およびＲＢ５６ ５’−ＡＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣ−３’（配列番号１６）（部位ＸｍａＩに下線を引く）を使用することによって得る。この後、このフラグメントを酵素ＸｍａＩで消化する。
【０１８８】
次に、３つのフラグメントのライゲーションを行う（上で得た２つのフラグメント＋ベクターｐＲＢＶ）。このライゲーションは、酵素ＸｍａＩで消化したフラグメントＰｇａｌ１と短いオープンリーディングフレームＣ−ｔｅｒ ＧＳＴ（相和性付着末端ＸｍａＩおよびＸｂａＩ）とをベクターｐＲＢＶ（事前にＸｍａＩ−ＸｂａＩによって消化したもの）に挿入することに存する。このフラグメントＰｇａｌ１は、両方向に挿入することができる。この結果、２つの構築物が得られる：上流干渉ベクターｐＲＢ１８（ＵＩとも呼ばれ、この場合、Ｐａｄｈ１およびＰｇａｌ１は、同じ配向である。）（図２Ｂ参照）ならびにナンセンス上流干渉ベクターｐＲＢ１９（ｎＵＩとも呼ばれ、この場合、Ｐａｄｈ１およびＰｇａｌ１は、反対方向に配向している。）（図２Ｅ参照）。
【０１８９】
これらの構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０１９０】
２．３ 上流−下流干渉ベクターｐＲＢ２７の構築：
上流−下流干渉プラスミドｐＲＢ２７（ＵＤＩとも呼ばれる）は、ｐＲＢ１６およびｐＲＢ１７の構築に使用したものと同じ、プロモーターＰｇａｌ１に対応する５４９ｂｐのＰＣＲのフラグメント（実施例２参照：このＰＣＲフラグメントは、マトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーとしてオリゴヌクレオチドＲＢ４９およびＲＢ５０を使用して得る。）を、ベクターｐＲＢ１８に挿入することによって構築する。これを行うために、このＰＣＲのフラグメントを酵素ＡｓｃＩによって消化し、酵素ＡｓｃＩでの消化により線形にしたベクターｐＲＢ１８に挿入する。このフラグメントは、両方向に挿入することができ、より詳細には、所望の配向の挿入物を有するプラスミド（この場合、２つのプロモーターＰｇａｌ１は反対方向で配向している。）を（制限プロフィールにより）選択する（図２Ｃ参照）。
【０１９１】
このようにして得たベクターをｐＲＢ２７と呼ぶ。この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０１９２】
２．４ 転写干渉系構築の原理
本出願人は、２つのタイプのｒＹ２Ｈ（逆二重ハイブリッド）系を考えた。これらは、両方とも、転写干渉による遺伝子休止化に基づく。第一の構造は、Ｐｇａｌ１が、遺伝子ＨＩＳ３の下流に位置し、Ｐａｄｈ１およびＰｇａｌ１は、集束的な配向を有する。この構造は、Ｐｇａｌ１の下流活性化が遺伝子ＨＩＳ３の転写に干渉するため、下流干渉（ＤＩ）と呼ばれる。第二の構造では、Ｐｇａｌ１が、Ｐａｄｈ１の上流に位置し、これら２つのプロモーターは、対状の配向を有する。従って、Ｐｇａｌ１の上流活性化が、プロモーターＰａｄｈ１の活性に干渉するため、この構造は上流干渉（ＵＩ）と呼ばれる。
【０１９３】
構造ＵＩおよびＤＩを基に、５つの転写干渉構築物ｒＹ２Ｈを開発した（図２Ａから２Ｅ参照）。
【０１９４】
系ＵＩにおけるＰｇａｌ１の活性化は、転写干渉のため、Ｐａｄｈ１の活性の減少を導く。しかし、Ｐｇａｌ１の活性は、遺伝子ＨＩＳ３のセンス転写産物を、なお、生じさせることがある。機能性ＩＧＰデヒドラターゼへのこのセンス転写産物の翻訳を防止するために、２つの停止コドンに続くアミノ酸数２２の短いオープンリーディングフレームを、Ｐｇａｌ１とＰａｄｈ１の間に挿入した。この結果、系ＵＩにおける転写干渉は、バイシストロン性メッセンジャーを生じさせ、ここから出発してこの最初の短いオープンリーディングフレームのみを翻訳する。
【０１９５】
第三の構築物は、系ＵＩとＤＩの組み合わせである。上流−下流干渉系（ＵＤＩ）と呼ばれるこの系では、Ｐｇａｌ１は、Ｐａｄｈ１−ＨＩＳ３の上流に挿入され、Ｐａｄｈ１−ＨＩＳ３に対して対状であり、ならびにＰｇａｌ１のさらなるコピーが、ＨＩＳ３のオープンリーディングフレームの下流に配置され、これは、Ｐａｄｈ１に対して集中的な配向にある（図２Ｃ参照）。
【０１９６】
Ｐｇａｌ１によって誘導される転写干渉の特異性を制御するために、ナンセンス上流（ｎＵＩ）およびナンセンス下流（ｎＤＩ）干渉系を構築した。これら２つの対照構築物において、Ｐｇａｌ１の配向は、構築物ＵＩおよびＤＩに対してそれぞれ逆である。有効なＹ２Ｈ相互作用が存在する状態でさえ、これらの対照構築物の使用中に転写干渉は観察されないはずである。
【０１９７】
上で説明した５つの構築物（５つのプラスミド挿入物）は、これらの末端で、二方向性転写ターミネーター（実施例１参照）に隣接している。例えば、片側には、遺伝子ＣＹＣ１の転写ターミネーター（Ｔｃｙｃ１）（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｂ．Ｉ．およびＬ．Ｇｕａｒｅｎｔ、１９８９によって説明されたもの）をコードするフラグメント、反対側には、遺伝子ＡＤＨ１のターミネーター（Ｔａｄｈ１）（Ｉｒｎｉｇｅｒ，Ｓ．ら、１９９１によって説明されたもの）をコードするフラグメントが、見出される。これら２つの要素は、二方向性様式で転写を停止させる。これは、Ｐｇａｌ１またはＰａｄｈ１によって命じられる転写が制限部位ＳａｌＩ／ＳａｃＩを越えて拡大することを防止し、およびまた、レポーター遺伝子のカセットの外側の転写活性の起こり得る影響からｒＹ２Ｈ系を保護する。細菌ベクターを用いて干渉構築物を最初に構築し、制限部位ＳａｌＩおよびＳａｃＩを酵母の複製および組み込みベクター中へのサブクローニングに使用した（下記参照）。
【実施例３】
【０１９８】
新規組み込みベクターｐＲＢ２の構築：
遺伝子ＵＲＡ３の停止コドンＴＡＡの下流に位置する領域＋２９から＋９００に対応する８７１ｂｐのＰＣＲフラグメントを、プライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ８３ ５’−ＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＣＴＣＡＣＡＡＡＴＴＡＧＡＧＣ−３’（配列番号１７）およびＲＢ８４ ５’−ＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣＣＡＧＴＣ−３’（配列番号１８）（部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩに下線を引く）、ならびにゲノムＤＮＡのマトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００を使用することにより、ＰＣＲによって作製する。
このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩによって消化し、ベクターｐＦＡ６ａ−ｋａｎＭＸ−ＰＧＡＬ１−３ＨＡ（Ｌｏｎｇｔｉｎｅ，Ｍ．Ｓ．ら、１９９８、およびＷａｃｈ Ａ，ら、１９９７）によって説明されたものであり、この技術内容は、このベクターの構築に関して、本出願に参照により組み込まれる）の部位ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩのレベルでクローニングする。このようにして得たベクターをｐＲＢ１２と呼んだ。
【０１９９】
並行して、遺伝子ＵＲＡ３のＡＴＧの上流に位置する領域−２２３から−９９２に対応する７６９ｂｐのフラグメントを、プライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ８５ ５’−ＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＡＴＡＣＡＡＧ−３’（配列番号１９）およびＲＢ８６ ５’−ＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＣＧＴＴＴＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＡＣ−３’（配列番号２０）（部位ＢｓｉＷＩに下線を引く）、ならびにマトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡを使用することにより、ＰＣＲによって作製する。このＰＣＲ産物を酵素ＢｓｉＷＩによって消化し、ｐＲＢ１２のユニーク部位ＢｓｉＷＩのレベルでクローニングする。フラグメントを両方向に挿入することができた。所望の配向の挿入物を有するプラスミド（この場合、２つのプロモーターＰｇａｌ１は反対方向で配向している）を制限プロフィール分析により選択する。
【０２００】
この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０２０１】
ベクターｐＲＢ２は、２つの相同フラグメントを、Ｓ．セレビジエの遺伝子ＵＲＡ３のオープンリーディングフレームの上流および下流領域にそれぞれ含有する。これら２つのフラグメントの間に挿入された配列は、遺伝子座ＵＲＡ３のレベルでの組み込みをターゲットにし、このゲノム組み込みは、１１０４ｂｐの欠失が生じさせ、これによりＵＲＡ３のオープンリーディングフレームが除去される（図３参照）。ＵＲＡ３のこの欠失は、モデルｕｒａ３Ｄ０（３）に関して発表された欠失に近く、ｕｒａ３Ｄ０との違いは、ＵＲＡ３の下流の２２ｂｐ少ない領域が、ｐＲＢ２の組み込み中に除去されることである。
【０２０２】
遺伝子ＧＥＡ２は、ＵＲＡ３の上流に位置する。遺伝子ＧＥＡ２の転写レベルおよび転写サイズが、ｕｒａ３Ｄ０の欠失による影響を受けないことは、以前に示されている（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ，Ｃ．Ｂ．ら、１９９８）。遺伝子ＴＩＭ９は、ＵＲＡ３の下流に位置し、酵母Ｓ．セレビジエには必須の遺伝子である。ｕｒａ３Ｄ０株の生存率減少は、報告されておらず、ＴＩＭ９がｕｒａ３Ｄ０株において完全に機能性のままであることが証明されている。この結果、ｕｒａ３Ｄ０の欠失が隣接する遺伝子の転写に影響を及ぼすことが証明されるわけではない。
【０２０３】
従って、ｐＲＢ２と一体化した干渉系は、ＧＥＡ２およびＴＩＭ９の転写におそらく影響せず、これらの影響も受けないであろう。ベクターｐＲＢ２の利点は、ｕｒａ３−５２およびｕｒａ３Ｄ０のようなＵＲＡ３の変異株とともに使用することもできることである。
【実施例４】
【０２０４】
ｐＲＢ２酵母の組み込みおよび複製ベクター中への種々の干渉ベクター挿入物のサブクローニング：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター上の実施例２において説明した種々の干渉系および対照系（ＤＩ、ｎＤＩ、ＵＩ、ｎＵＩおよびＵＤＩ）（図２Ａから２Ｅ参照）を、組み込みベクターｐＲＢ２中にＳａｌＩ−ＳａｃＩフラグメントの形でサブクローニングする。これを行うために、種々のプラスミドｐＲＢ１６、ｐＲＢ１７、ｐＲＢ１８、ｐＲＢ１９およびｐＲＢ２７を酵素ＳａｌＩ−ＳａｃＩによって消化し、この挿入物を、事前に酵素ＳａｌＩ−ＳａｃＩによって消化した組み込みベクターｐＲＢ２中にサブクローニングする。得られた種々の構築物を、それぞれ、ｐＲＢ３１、ｐＲＢ２３、ｐＲＢ２４、ｐＲＢ２５およびｐＲＢ２９と呼んだ（表２参照）。
【０２０５】
これらの干渉系をゲノムに組み込んだ後、レポーター遺伝子ＨＩＳ３は、遺伝子ＧＥＡ２およびＴＩＭ９に対して対状である。
【０２０６】
【表２】
略語：ｎＤＩ：ナンセンス下流干渉；ＤＩ：下流干渉；ＵＩ：上流干渉；ｎＵＩ：ナンセンス上流干渉；ＵＤＩ：上流−下流干渉。
【実施例５】
【０２０７】
干渉ベクターのゲノム組み込みでの転写干渉株の構築：
５．１ 干渉ベクターのゲノム組み込み：
使用した培地は、Ｇｕｔｈｅｒｉｅ，Ｃ．およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ、２００２よって説明されたものなどである。すべての実験について、細胞は、合成最小培地ＹＮＢ（米国、デトロイトのＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）＋２％グルコース（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において３０℃で成長させる。栄養要求性マーカーを作製するために、必要なアミノ酸（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加する。
【０２０８】
株ｙＣＭ１５（ＭＡＴ ａ Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０ ｕｒａ３−５２ ｌｙｓ２−８０１ ｈｉｓ３Δ２００ ｔｒｐ１−Δ６３ ｌｅｕ２ ａｄｅ２−１０１）を、ゲノム組み込みでの株の構築に使用する。株ｙＣＭ１５は、レポーターカセットを欠失させた、株ＰＣＹ２（Ｃｈｅｖｒａｙ ＲＭおよびＮａｔｈａｎｓ Ｄ．、１９９２によって説明されたもの）から出発して構築した。
【０２０９】
株ＰＣＹ２（ＭＡＴ α Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０ ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−ｌａｃＺ Ｌｙｓ２−８０１ ａｄｅ２−１０１ ｔｒｐ１−Δ６３ ｈｉｓ３−Δ２００ ｌｅｕ２）は、株ＹＰＨ４９９（ＭＡＴ ａ ｕｒａ３−５２ ｌｙｓ２−８０１ ａｄｅ２−１０１ ｔｒｐ１−Δ６３ ｈｉｓ３−Δ２００ ｌｅｕ２−Δ１；ＡＴＣＣ ７６６２５、２０４６７９；（ＳｉｋｏｒｓｋｉおよびＨｉｅｔｅｒ、１９８９））（特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）から番号２０４６７９で入手できる。）と株ＧＧＹ１：：１７１（ＭＡＴ α Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３ ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−ｌａｃＺ）（ＧｉｌｌおよびＰｔａｓｈｎｅ、１９８７）の間の交雑の結果である。
【０２１０】
株ＧＧＹ１：１７１は、ＵＡＳＧにより活性化された遺伝子ＧＡＬ１のプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子ｌａｃＺを有するカセットＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−ｌａｃＺ（Ｙｏｃｕｍら、１９８４）を株ＧＧＹ１（ＭＡＴ α Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３（ＧｉｌｌおよびＰｔａｓｈｎｅ、１９８７））に組み込むことによって構築した。株ＧＧＹ１それ自体は、株ＤＢＹ７４５（ＭＡＴ α Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０ ｌｅｕ２−３、１１２ ａｄｅ１−１００ ｕｒａ３−５２；（ＧｒａｈａｍおよびＣｈａｍｂｅｒｓ、１９９６；Ｆｅｒｒｅｉｒｏら、２００４；ＮａｇａｒａｊａｎおよびＳｔｏｒｍ、１９９７；Ｄｏｒｍｅｒら、２０００）と株ＹＭ７０９（Ｐｅａｒｌｂｅｒｇ，Ｊ．、１９９５）の間の交雑の結果である。
【０２１１】
株ＰＣＹ２の代わりに、遺伝子型（ｇａｌ４−ｇａｌ８０−ｔｒｐ１−ｈｉｓ３−ｌｅｕ２−ｕｒａ３−）を有する任意の酵母Ｓ．セレビジエ株を使用することができる。例えば、株ＰＣＹ２の代わりに、株Ｙ１８７（Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、１９９３によって説明されたものであり、特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）から番号９６３９９で入手できる。）を使用することができる。
【０２１２】
表３は、株ＰＣＹ２の代わりに使用することができる株の他の例を示すものである。これらの呼称、これらの株の簡単な説明およびこれらの株を入手することができる団体、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）でのこれらの参照番号を示す。
【０２１３】
株ｙＣＭ１５を構築するために、株ＰＣＹ２のクローンの１０６から１０７個の細胞を滅菌水に懸濁させ、アミノ酸ｌｙｓ＋ａｄｅ＋ｈｉｓ＋ｕｒａ＋ｔｒｐ＋ｌｅｕを補充した、ＹＮＢ培地＋２％グルコースの寒天プレートで画線培養する。この寒天プレートは、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）も１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する。５−ＦＯＡは、遺伝子ＵＲＡ３を発現する細胞に対して毒性である。このため、５−ＦＯＡを含有するこれらのプレートを用いて、レポーターカセットＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−ｌａｃＺを欠失した株ＰＣＹ２の変異体を選択する（Ｂｏｅｋｅら、１９８７）。得られた変異体におけるレポーターカセットの不在は、レポーターｌａｃＺの活性を検査することにより検証する。この後、プロモーターＧＡＬ１の非常に強いアクチベーターである転写因子ＧＡＬ４ｐをコードするプラスミドｐＣＬ１（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９）でこれらの変異体を形質転換し、ｌａｃＺ活性を測定する（Ｂｒｅｅｄｅｎ，Ｌ．およびＫ．Ｎａｓｍｙｔｈ、１９８５）。５−ＦＯＡに対して耐性であり、ｌａｃＺ活性を有さない変異体を選択し、これをｙＣＭ１５と呼ぶ。
【０２１４】
【表３】
【０２１５】
組み込みベクターｐＲＢ３１、ｐＲＢ２３、ｐＲＢ２４、ｐＲＢ２５およびｐＲＢ２９を、酵素ＤｒｄＩでの消化により線形化する。株ｙＣＭ１５を、酢酸リチウム形質転換法（例えば、Ｇｉｅｔｚ，Ｒ．Ｄ．およびＡ．Ｓｕｇｉｎｏ、１９８８によって説明されたもの）を用いることにより、各組み込みベクターの線形化ＤＮＡ（１μｇ）によって独立して形質転換し、これらの細胞を、アミノ酸ｌｙｓ＋ａｄｅ＋ｔｒｐ＋ｌｅｕおよびウラシル（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により完全にした、ヒスチジン枯渇培地（ＹＮＢ（米国、デトロイトのＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）＋ ２％グルコース（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、成長させる。ヒスチジンについて栄養要求性のクローンを単離し、遺伝子座ＵＲＡ３のレベルでのレポーターカセットの組み込みを、各接合部に特異的な内部および外部プライマーを使用することによるコロニーＰＣＲ（Ｇｕｔｈｅｒｉｅ，Ｃ．ら、２００２によって説明されたもの）によって検証する（表４参照）。
【０２１６】
【表４】
【０２１７】
使用したプライマーの配列は、以下のものである：
【０２１８】
【化１】
【０２１９】
組み込みベクターｐＲＢ３１、ｐＲＢ２３、ｐＲＢ２４、ｐＲＢ２５、ｐＲＢ２９の各々による株ｙＣＭ１５の独立した形質転換によって得られた株であって、遺伝子座ＵＲＡ３のレベルでの各レポーターカセットの組み込みが実証されている株を、それぞれ、ｙＲＢ８２、ｙＲＢ４８、ｙＲＢ４９、ｙＲＢ５０、ｙＲＢ８３と呼んだ（表２参照）。
【０２２０】
５．２ 被組み込み干渉構築物の活性化：
干渉系の活性を評価するために、実施例５．１で得たレポーター株を２つのプラスミド対で形質転換する。第一の対は、完全長のＧＡＬ４ｐ転写因子（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９）の発現に起因するＰｇａｌ１の強力な活性化に対する干渉系の応答を試験するために使用する。第二のプラスミド対は、ＧＬＡ４ｐの活性化ドメイン（ＡＤ）およびＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を別々に発現させることができ、この個々の異なるドメインがＰｇａｌ１を活性化できないため、負の対照として役立つ。
【０２２１】
従って、実施例５．１において得た株（株ｙＲＢ８２、ｙＲＢ４８、ｙＲＢ４９、ｙＲＢ５０、ｙＲＢ８３）を、ＧＡＬ４ｐ転写因子をコードする動原体プラスミドｐＣＬ１（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９によって説明されたもの）および動原体挿入物を有さないプラスミドｐＦＬ３９（Ｂｏｎｎｅａｕｄ Ｎ．ら、１９９１によって説明されたもの）によって共形質転換する。酵母において複製されるこれらのプラスミドは、選択マーカーとして遺伝子ＬＥＵ２またはＴＲＰ１を有する。
【０２２２】
これらの形質転換体を、アミノ酸ｌｙｓ＋ａｄｅ＋ｈｉｓおよびウラシル（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により完全にした、ＹＮＢ培地（米国、デトロイトのＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）＋ ２％グルコース（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて選択する。
【０２２３】
得られた形質転換体を、それぞれ、ｎＤＩ＋、ＤＩ＋、ＵＩ＋、ｎＵＩ＋およびＵＤＩ＋と呼ぶ。
【０２２４】
負の対照は、ベクターｐＴＡＬ２０およびｐＤＢＴによる実施例５．１に記載した株（株ｙＲＢ８２、ｙＲＢ４８、ｙＲＢ４９、ｙＲＢ５０、ｙＲＢ８３）の共形質転換によって得る。ベクターｐＴＡＬ２０およびｐＤＢＴは、ＧＬＡ４ｐの活性化ドメイン（ＡＤ）およびＧＡＬ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を発現させることができる（これらのベクターは、Ｎａｖａｒｒｏ，Ｐ．ら、１９９７によって説明される）。
【０２２５】
このようにして得た形質転換体を、それぞれ、ｎＤＩ−、ＤＩ−、ＵＩ−、ｎＵＩ−およびＵＤＩ−と呼ぶ。
【実施例６】
【０２２６】
転写干渉系がゲノムに組み込まれている酵母の成長試験
形質転換体の細胞成長を滴下評価法により試験する。これを行うために、ヒスチジンを含有する寒天プレート上に細胞を堆積させ、３０℃で一晩保温する。この後、これらの細胞を細胞数約１０６／ｍｌで水に懸濁させ、１０倍稀釈系列を調製する。各稀釈溶液の５μＬの液滴をピペットによって取り出し、所望の培地を含む予乾燥寒天プレート上に堆積させる。これらのプレートを３０℃で保温する。
【０２２７】
干渉形質転換体の細胞成長は、ヒスチジン枯渇培地で評価する。場合によっては、タンパク質ＨＩＳ３ｐの競合阻害剤（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ））を漸増濃度で培地に添加して、種々の干渉株間のレポーター遺伝子ＨＩＳ３の活性レベルのレベルでの違いを観察する（図４）。阻害剤を含有する培地は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ品質の水中、競合阻害剤３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ；Ｓｉｇｍａ）の１Ｍの濃度の原液から出発して調製する。寒天を６０℃に冷却した後、３−ＡＴを所望の濃度で添加する。試験した種々の培地は、アミノ酸ｌｙｓ＋ａｄｅおよびウラシル（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により完全にした、３−ＡＴを含有しないまたは３−ＡＴを８、１６、２２、３２ｍＭの濃度で含有する、最少培地（ＹＮＢＧ（米国、デトロイトのＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）＋２％グルコース（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。正の対照も行う（ヒスチジンを含有し、３−ＡＴを含有しない培地）。これらのプレートを３０℃で４８から７２時間保温する。結果の一部を図４Ａから４Ｅに提示する。
【０２２８】
ＧＡＬ４ｐ（＋株）の存在下で、ＵＩ＋形質転換体について細胞成長の最大減少が観察される。ＧＡＬ４ｐを発現するＵＩ細胞は、ヒスチジン不在の状態では成長できず、これに対して、対照ＡＤ／ＤＢＤを有する細胞（ＵＩ−形質転換体）は、３２ｍＭより高い３−ＡＴの濃度で正常に成長する。ＧＡＬ４ｐも、対照ＡＤ／ＤＢＤも、対照形質転換体ｎＵＩ＋およびｎＵＩ−の細胞成長を阻害せず、これは、ＧＡＬ４ｐを発現する細胞ＵＩ＋の成長の阻害が、Ｐａｄｈ１に向けられたＰｇａｌ１の転写の活性化に起因することを示す。
【０２２９】
ＤＩ＋細胞において、３−ＡＴ阻害剤が不在のとき、ＧＡＬ４ｐの発現は、細胞成長に影響を及ぼさない（図４Ｂ参照）が、３−ＡＴが８ｍＭまたはそれ以上の濃度で存在するとき、この成長は完全に阻害される（図４Ｃから４Ｅ参照）。これに反して、対照形質転換体ＤＢＤ／ＡＤ（ＤＩ−形質転換体）の細胞成長は、３２ｍＭの３−ＡＴ濃度でさえ影響を受けない（図４Ｅ参照）。従って、遺伝子ＨＩＳ３のアンチセンス鎖のＰｇａｌ１によって命じられる転写は、ＤＩ＋細胞のヒスチジンについての栄養要求性のレベルを有意に上昇させる。
【０２３０】
驚くべきことに、ＧＡＬ４ｐもｎＤＩ＋形質転換体において細胞成長を阻害する（８ｍＭまたはそれ以上の濃度で３−ＡＴが存在するとき、成長が阻害される（図４Ｃから４Ｅ参照）。これらの細胞において、Ｐｇａｌ１により命じられる転写は、Ｔａｄｈ１に向けられ（図２Ｄ参照）、これはＨＩＳ３の発現に干渉しないと思われる。この成長の阻害は、Ｐｇａｌ１の特異的活性化に起因する。対照ＡＤ／ＤＢＤがｎＤＩ−細胞中に存在するときには成長の阻害が観察されないからである（図４Ｂから４Ｅ参照）。
【０２３１】
ＧＡＬ４ｐの存在下で、ＵＤＩ＋形質転換体は、ＤＩ＋細胞のものに類似した成長阻害レベルを示す。対照ＤＢＤ／ＡＤは、ＵＤＩ−細胞の成長には影響を及ぼさない（図４Ｂから４Ｅ参照）。
【０２３２】
本発明者らは、株ＵＩ＋、ＤＩ＋およびＵＤＩ＋において、プロモーターＰｇａｌ１のＧＡＬ４ｐに起因する活性化は、細胞成長の有意な阻害を導き、この阻害は、レポーターＨＩＳ３の活性減少に起因すると結論付けた。この成長の阻害は、ＵＩ細胞におけるほうがＤＩおよびＵＤＩ細胞におけるより僅かに大きい。
【０２３３】
従って、ＧＡＬ４ｐにより誘導される、ＨＩＳ３の活性の減少は、細胞成長を有意に遅速するが、これを完全には阻害しない。干渉条件下では、保温の最初の６〜７日間はプレート上にコロニーは検出されないが、より長く保温すると、極めて小さいコロニーが見えてくる。
【０２３４】
干渉は、ＤＩ、ＵＤＩまたはｎＤＩ系でよりＵＩ系でのほうが強力であることが観察された。これは、転写干渉を生じさせる分子メカニズムから起こり得る。上流干渉の詳細な研究により、上流プロモーター活性化は、下流プロモーターのレベルでこれらの連結部位から活性化因子を除去することにより、下流プロモーターの活性を減少させることが、明らかになった（Ｇｒｅｇｅｒ，Ｉ．Ｈ．ら、２０００、Ｇｒｅｇｅｒ，Ｉ．Ｈ．ら、１９９８、Ｖａｌｅｒｉｕｓ，Ｏ．Ｃ．ら、２００２、Ｃａｌｌｅｎ ＢＰら、２００４）。干渉を生じさせるプロモーターが、ＵＩ構築物においてレポーター遺伝子のプロモーターに近いほど、ＤＩ構築物におけるよりＵＩにおける干渉の効果のほうが大きくなり得る。
【０２３５】
上流干渉が異なる分子メカニズムから起こることもある。系ＤＩでは、集中的に転写するＲＮＡポリメラーゼが衝突することがあり、これは、転写の停止および遺伝子ＨＩＳ３の休止化を導くことがある。ＲＮＡポリメラーゼの正面衝突は、Ｐａｄｈ１の転写活性化因子の除去より効果が低いＨＩＳ３休止化手段であろう。加えて、ＤＩ系では、Ｐａｄｈ１の活性化が転写干渉によりＰｇａｌ１を不活性化することがあり、これは、ＵＤＩ系がＵＩ系またはＤＩ系より優れていない理由の説明にもなり得る。
【０２３６】
驚くべきことに、本出願人は、Ｐｇａｌ１を、レポーターカセットＨＩＳ３に対して対状で下流に挿入したとき（ｎＤＩ構築物）にも下流転写干渉が存在することを確認した。遺伝子の転写レベルは、プロモーターの力、ならびに転写停止シグナルの質に依存する（Ｗａｈｌｅ，Ｅ．およびＵ．Ｒｕｅｇｓｅｇｇｅｒ、１９９９）。Ｐｇａｌ１をＨＩＳ３のＯＲＦとこの転写ターミネーターＴａｄｈ１の間に挿入した場合、Ｐｇａｌ１の活性は、構築物ｎＤＩではＨＩＳ３の転写産物の適切な停止に干渉することがあり、従って、これが、これらの細胞におけるＨＩＳ３ｐの活性を減少させる。
【実施例７】
【０２３７】
ベクターｐＬａｃ３３中への種々の干渉ベクター挿入物のサブクローニング：
転写干渉系が、プラスミド上に存在し、ゲノムレベルで組み込まれていないとき、機能性であるかどうかを試験するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター上の実施例２で説明した種々の干渉系（ＤＩ、ＵＩおよびＵＤＩ）（図２Ａから２Ｅ参照）を、組み込みベクターｐＬａｃ３３中にＳａｌＩ−ＳａｃＩの形でサブクローニングする。このベクターは、選択マーカーとして酵母の遺伝子ＵＲＡ３を含有し、Ｇｉｅｔｚ，Ｒ．Ｄ．およびＡ．Ｓｕｇｉｎｏ、１９８８によって説明されている。これを行うために、種々のプラスミドｐＲＢ２７、ｐＲＢ１７、ｐＲＢ１８を酵素ＳａｌＩ−ＳａｃＩによって消化し、この挿入物を、事前に酵素ＳａｌＩ−ＳａｃＩによって消化した複製ベクターｐＬａｃ３３中にサブクローニングする。得られた種々の構築物を、それぞれ、ｐＲＢ２８、ｐＲＢ２０、ｐＲＢ２１と呼んだ。
【実施例８】
【０２３８】
転写干渉系がゲノムに組み込まれていない酵母の成長試験：
干渉構築物ＵＩ、ＤＩおよびＵＤＩが、プラスミド上に存在し、ゲノムレベルで組み込まれていないとき、機能性であるかどうかも試験した。これを行うために、種々の転写干渉構築物を有する、実施例７で説明したプラスミドｐＬａｃ３３から誘導したベクターを使用して、株ｙＣＭ１５を独立して形質転換した。
【０２３９】
株ｙＣＭ１５は、ベクターｐＣＬ１およびｐＦＬ３９を随伴するベクターｐＲＢ２８、ｐＲＢ２０またはｐＲＢ２１（実施例７参照）の各々のＤＮＡ（０．３μｇ）によって、個々に共形質転換される。従って、株ｙＣＭ１５は、３つのプラスミドの３つの群（ｐＲＢ２８＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９、またはｐＲＢ２０＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９、またはｐＲＢ２１＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９）によって、個々形質転換される。原動体プラスミドｐＣＬ１は、ＧＡＬ４ｐ転写因子をコードし（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９によって説明された。）、プラスミドｐＦＬ３８は、原動体挿入物を有さないプラスミドである（Ｂｏｎｎｅａｕｄ Ｎら、１９９１によって説明された）。これらの酵母複製プラスミドは、遺伝子ＬＥＵ２またはＴＲＰ１を選択マーカーとして有する。
【０２４０】
株ｙＣＭ１５はまた、ベクターｐＴＡＬ２０およびｐＤＢＴ（ＧＡＬ４ｐの活性化ドメイン（ＡＤ）およびＧＡＬ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を発現することができる（これらのベクターは、Ｎａｖａｒｒｏ，Ｐ．ら、１９９７によって説明されている。）。）を随伴するベクターｐＲＢ２８、ｐＲＢ２０またはｐＲＢ２１（実施例７参照）の各々のＤＮＡ（０．３μｇ）によって、個々に共形質転換さる。従って、株ｙＣＭ１５は、３つのプラスミドの３つの群（ｐＲＢ２８＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ、またはｐＲＢ２０＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ、またはｐＲＢ２１＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ）によって、個々形質転換される。
【０２４１】
これらの三重形質転換体の各々の細胞成長を、実施例６において説明したように、ヒスチジンを含有するおよび含有しない寒天プレート、ヒスチジンを含有しないプレートについては、漸増濃度の３−ＡＴを含有しないまたは含有する寒天プレートで試験する。
【０２４２】
組み込まれていないプラスミドに基づく干渉構築物で得られた結果は、組み込まれている干渉構築物について得られたものに類似している（図５Ａから５Ｄ参照）。例えば、培地が、ヒスチジンおよび３−ＡＴが枯渇したものであるとき、ＧＡＬ４ｐを発現するＵＩ細胞（三重形質転換体ｐＲＢ２１＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９）は、活性ＧＡＬ４ｐを発現しないＵＩ細胞（三重形質転換体ｐＲＢ２１＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ）と比較して、成長の非常に強い減少を示す。しかし、ＵＩの成長の阻害レベルは、構築物ＵＩの被組み込みバージョンで観察されたものと同様の大きさである（実施例６参照）。
【０２４３】
ＤＩ細胞（三重形質転換体ｐＲＢ２１＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９（活性ＧＡＬ４ｐを発現する。）またはｐＲＢ２０＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ（活性ＧＡＬ４ｐを発現しない。））およびＵＤＩ（三重形質転換体ｐＲＢ２８＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９（活性ＧＡＬ４ｐを発現する。）またはｐＲＢ２８＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ（活性ＧＡＬ４ｐを発現しない。））は、これらが活性ＧＡＬ４ｐを発現しようと、しなかろうと、ある程度正常に成長する。
【０２４４】
培地が、３−ＡＴを８ｍＭまたはそれ以上の濃度で含有するとき、ＧＡＬ４ｐを発現する、および構築物ＵＩ、ＤＩまたはＵＤＩによって形質転換された細胞は、もはや全く成長しない（図５Ｃおよび５Ｄ参照）。この結果は、負の対照細胞（活性ＧＡＬ４ｐを発現しないもの（ＡＤ／ＤＢＤ））について得られたもの、および細胞成長が影響を受けない干渉プラスミドによって形質転換されたものとは対照的である（図５Ｃおよび５Ｄ参照）。
【０２４５】
本出願人は、ＵＩ、ＤＩおよびＵＤＩのプラスミドに基づくバージョンは、機能性であるが、これらの干渉構築物の対応する被組み込みバージョンよりＰｇａｌ１の活性化に対する感度が僅かに低いと結論付ける。
【実施例９】
【０２４６】
宿主株の遺伝的背景に関する転写干渉系の独立性：
転写干渉系の活性が、宿主株の遺伝的背景に依存するかどうかを試験するために、プラスミドに基づく構築物（例えば、実施例７で説明したもの）を別の酵母菌株：株ｙＲＢ３１においても評価した。株ｙＲＢ３１（ＭＡＴ α ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３−Δ２００ ａｄｅ２−１０１ ｔｒｐ１−９０１ ｌｅｕ２−３、１１２ ｍｅｔ−Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０）を、株Ｙ１８７（株Ｙ１８７は、Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、１９９３によって説明されており、ならびに特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）から参照番号９６３９９で入手できる。）のカセットＵＲＡ３：：ＧＡＬ１（ＵＡＳ）−ＧＡＬ１（ＴＡＴＡ）−ｌａｃＺを削除することによって構築する。
【０２４７】
株ｙＲＢ３１を構築するために、株Ｙ１８７のクローンの１０６から１０７個の細胞を滅菌水に懸濁させ、アミノ酸ｍｅｔ＋ａｄｅ＋ｈｉｓ＋ｕｒａ＋ｔｒｐ＋ｌｅｕにより完全にした、ＹＮＢ培地＋２％グルコースの寒天プレートで画線培養する。この寒天プレートは、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）も１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する。５−ＦＯＡは、遺伝子ＵＲＡ３を発現する細胞に対して毒性である。このため、５−ＦＯＡを含有するこれらのプレートを用いて、レポーターカセットＵＲＡ３：：ＧＡＬ１（ＵＡＳ）−ＧＡＬ１（ＴＡＴＡ）−ｌａｃＺを欠失した株Ｙ１８７の変異体を選択する（Ｂｏｅｋｅら、１９８７）。得られた変異体におけるレポーターカセットの不在を、レポーターｌａｃＺの活性を検査することにより検証する。プロモーターＧＡＬ１の非常に強いアクチベーターであるＧＡＬ４ｐ転写因子をコードするプラスミドｐＣＬ１（Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９）でこれらの変異体を形質転換し、ｌａｃＺ活性を測定する（Ｂｒｅｅｄｅｎ Ｌ．およびＫ．Ｎａｓｍｙｔｈ、１９８５）。５−ＦＯＡに対して耐性であり、ｌａｃＺ活性を有さない変異体を選択し、これをｙＲＢ３１と呼ぶ。
【０２４８】
この株ｙＲＢ３１を、株ｙＣＭ１５について実施例８で説明したのと同じ様式で形質転換した。得られた形質転換体は、これらの細胞成長に関するかぎり、実施例８において説明したのと同じ仕方で試験した。干渉プラスミドの活性に関するかぎり、株ｙＣＭ１５とｙＲＢ３１の間で違いは観察されなかった。
【実施例１０】
【０２４９】
タンパク質間相互作用によるＵＩおよびＤＩ干渉系の発現の誘導および細胞成長の阻害に対する効果：
１０．１：タンパク質Ｆｅ６５と以前に同定されたタンパク質ＡＰＰとの相互作用による干渉系の発現の誘導：
タンパク質Ｆｅ６５とＡＰＰの間の以前に同定されたタンパク質間相互作用（ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎ ＤＭおよびＭｉｌｌｅｒ ＣＣ、１９９６；Ｆｉｏｒｅ Ｆら、１９９５；Ｚａｍｂｒａｎｏ Ｎら、１９９７）が、酵母の細胞成長を阻害するように十分に転写干渉体の構築を誘導できるかどうかを試験した。
【０２５０】
構築物ＵＩおよびＤＩの被組み込みバージョンを使用する。融合タンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５およびＤＢＤ−ＡｐｐＣｔを、強活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーター（Ｒｕｏｈｏｎｅｎ Ｌら、１９９５によって説明されたプロモーター）の制御下で発現させる。
【０２５１】
プラスミドｐＲＢ３４により、強活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターの制御下で融合タンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５を発現させることができる。
【０２５２】
プラスミドｐＲＢ３４の構築は、数段階で行った。第一段階において、遺伝子Ｆｅ６５の一対のリーディングフレームを、ベクターｐＧＡＤ４２４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（米国、カリフォルニア州、パロアルト））中にクローニングする。遺伝子Ｆｅ６５（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号：ＢＣ０１０８５４）のアミノ酸１５２から７０８に対応する１６９４ｂｐのＰＣＲフラグメントを、プライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ２５０ ５’−ＡＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧ−３’（配列番号２７）およびＲＢ２５１ ５’−ＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＴＧＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号２８）（部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩに下線を引く）、ならびにマトリックスとして市販の人間の脳（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（米国、カリフォルニア州、パロアルト））のｃＤＮＡのバンクプラスミドＤＮＡを使用することにより、ＰＣＲによって作製する。このＰＣＲ産物を酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩによって消化し、ベクターｐＧＡＤ４２４の部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩのレベルでクローニングする。このようにして得たベクターをｐＲＢＳＧ１１と呼ぶ。この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０２５３】
第二段階において、酵素ＳｐｈＩと弱活性トランケート型プロモーターＡＤＨ１をコードするフラグメントとを用いてこのプラスミドｐＲＢＳＧ１１の部分消化を行い、融合タンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５およびターミネーターＡＤＨ１を原動体プラスミドｐＦＬ３６（Ｂｏｎｎｅａｕｄ Ｎら、１９９１によって説明されたもの）の部位ＳｐｈＩに挿入する。これによってプラスミドｐＲＢＩＭ５４を得ることができる。良好な構築物の獲得を制限分析により検証する。このフラグメントは、両方向に挿入することができる。ＡＤＨ１プロモーターがプラスミドｐＦＬ３６のユニーク部位ＳａｃＩの近くにある、所望の配向を有するクローンを選択する。第三段階において、強活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターをコードするフラグメントを、プライマーＲＢ１３６（５’−ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＧＴＡＣＧＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＧＧＧＴＧ−３’）（配列番号２９）およびＲＢ１３７（５’−ＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣＴＴＧＧＴＡＴＡＧＣ−３’）（配列番号３０）を用い、株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲによって増幅する。相同組換えによるクローニング法（ＧＡＰ修復）（ＤｅＭａｒｉｎｉら、２００１；Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、１９８３）を用いることにより、このＰＣＲフラグメントを使用して、事前に酵素ＳａｃＩにより消化したプラスミドｐＲＢＩＭ５４における弱活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターを、強活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターで置換する。この相同組換えは、株ｙＣＭ１５において行う。構築された新規プラスミドを制限分析によって検証し、これをｐＲＢ３４と呼ぶ。このプラスミドの配列を配列番号３１に示す。
【０２５４】
プラスミドｐＲＢ３５により、強活性トランケート型のＡＤＨ１の制御下で融合タンパク質ＤＢＤ−ＡｐｐＣｔを発現させることができる。プラスミドｐＲＢ３５の構築は、数段階で行った。
【０２５５】
第一段階において、遺伝子ＨＳＡＦＰＡ４（Ａｐｐ、アクセッション番号ＥＭＢＬ Ｙ００２６４）のリーディングフレームのカルボキシ末端部分を、ベクターｐＧＢＴ９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（米国、カリフォルニア州、パロアルト））中にクローニングする。遺伝子ＨＳＡＦＰＡ４のアミノ酸６５０から６９５をコードする１４３ｂｐのフラグメントを、配列：ＲＢ２５２ ５’−ＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＴＣＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＧＧＣＴＡＣＧＡＡＡＡＴＣＣＡＡＣＣＴＡＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＣＴＡＧＧ−３’（配列番号３２）、および配列：５’−ＴＣＧＡＣＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＴＴＧＴＡＧＧＴＴＧＧＡＴＴＴＴＣＧＴＡＧＣＣＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＴＧＴＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号３３）のＲＢ２５３の２つのリン酸化１本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリド形成によって得る。これを行うために、この２つの１本鎖オリゴヌクレオチドを水中、等モル濃度で混合する。この混合物を加熱ブロック（ヒートブロック）において５分間、９０℃で加熱し、この後、このブロックを（約２時間）放置して周囲温度に冷却する。このようにして得た２本鎖フラグメントは、この末端に、相和性付着末端ＥｃｏＲＩおよびＳａ１Ｉをそれぞれ有する。これにより、この２本鎖フラグメント（ＨＳＡＦＰＡ４のカルボキシ末端部分に対応する）をベクターｐＧＢＴ９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入することができる。このようにして得たベクターは、ＧＡＬ４ＤＢＤとＡｐｐのアミノ酸６５０から６９５との間の融合タンパク質（ＤＢＤ−ＡｐｐＣＴ）を発現させることができ、これをｐＳＧ１４と呼ぶ。この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０２５６】
第二段階において、このプラスミドｐＳＧ１４を酵素ＳｐｈＩで部分的に消化する。この後、弱活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーター、融合ＤＢＤ−ＡｐｐＣｔおよびＡＤＨ１ターミネーターをコードするフラグメントを、事前に酵素ＳｐｈＩによって消化したベクターｐＦＬ３９（Ｂｏｎｎｅａｕｄ Ｎら、１９９１によって説明されたもの）に挿入する。結果として生じたプラスミドをｐＩＭ５５と呼ぶ。良好な構築物の獲得を制限分析により検証する。このフラグメントは、両方向に挿入することができる。ＡＤＨ１プロモーターがプラスミドｐＦＬ３６のユニーク部位ＳａｃＩの近くにある、所望の配向を有するクローンを選択する。
【０２５７】
次に、ｐＩＭ５５の弱活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターを、強活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターにより強化することによって、プラスミドｐＲＢ３５を得る。ｐＲＢ３４の構築に使用したものと同じＰＣＲフラグメントを、事前に酵素ＳｐｈＩによって消化したｐＩＭ５５に、同じＧＡＰ修復法を用いて導入する。構築したプラスミドを制限分析により検証し、これをｐＲＢ３５と呼ぶ。このプラスミドの配列を配列番号３４に示す。
【０２５８】
第一に、構築物の活性を検証する。これを行うために、レポーター株Ｙ１８７（この株Ｙ１８７は、プロモーターＰｇａｌ１の制御下に置かれた遺伝子ＵＲＡ３を有するものであり、Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、１９９３によって説明された。特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）から参照番号９６３９９で入手できる。）を、３つのプラスミド対によって形質転換する。これらの対は、次のものである：ｐＲＢ３４＋ｐＲＢ３５、ｐＲＢ３４＋ｐＤＢＴ、およびｐＴＡＬ２０＋ｐＲＢ３５。これらのプラスミド対の各々によって共形質転換された２つのクローンを選択する。ウラシルを含有するおよび含有しない最小培地で成長するこれらの能力を試験する。６つの対応するクローンは、ウラシルが存在する状態での最小培地で成長することができることがわかる（図６Ａ参照）。しかし、ウラシル不在の状態では、プラスミドｐＲＢ３４＋ｐＲＢ３５によって共形質転換された２つのクローンしか成長できない（図６Ａ参照）。これは、遺伝子ＵＲＡ３が株Ｙ１８７において活性化され、これにプロモーターＰｇａｌ１を活性化することができる活性転写因子ＧＡＬ４ｐを再構成するＡＤ−Ｆｅ６５とＤＢＤ−ＡｐｐＣｔの間の相互作用が利用されることを示す。使用した構築物の活性が、このように実証される。
【０２５９】
次に、株ｙＲＢ４８（ＤＩ系）およびｙＲＢ４９（ＵＩ系）を、各々、２つのハイブリッドタンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５およびＤＢＤ−ＡｐｐＣｔを発現させることができるプラスミド対ｐＲＢ３４とｐＲＢ３５よって共形質転換する。株ｙＲＢ４８（ＤＩ系）およびｙＲＢ４９（ＵＩ系）は、対照として、各々、プラスミド対ｐＲＢ３４＋ｐＤＢＴおよびｐＴＡＬ２０＋ｐＲＢ３５によっても共形質転換する。これらのプラスミド対の各々によって共形質転換された２つのクローンを選択する。これらの二重形質転換体の２つのクローンの各々の細胞成長を、実施例６において説明したように、ヒスチジンを含有するおよび含有しない寒天プレート、ならびにヒスチジンを含有せず、漸増濃度の３−ＡＴを含有するまたは含有しない寒天プレートで試験する。
【０２６０】
図６Ｂから６Ｅに示すように、融合タンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５とＤＢＤ−ＡｐｐＣｔの間の相互作用は、干渉構築物ＵＩおよびＤＩを有する株の細胞成長を阻害するが、融合タンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５およびこのドメインＤＢＤ、または融合タンパク質ＤＢＤ−ＡｐｐＣｔおよびこのドメインＡＤを発現する細胞は、正常に成長する。この実験では、３−ＡＴを１５ｍＭより高い濃度まで添加したとき、細胞成長のレベルで差が検出される。
【０２６１】
ダブル・ハイブリッド相互作用により誘導された転写干渉は、ｒＹ２Ｈ ＵＩおよびＤＩ系で容易に検出することができると結論付けることができる。
【０２６２】
１０．２：以前に同定されたタンパク質ｍｄｍ２とタンパク質ｐ５３の相互作用による干渉系の発現の誘導：
タンパク質ｐ５３とｍｄｍ２の間の以前に同定された別のタンパク質間相互作用（Ｏｌｉｎｅｒ ＪＤら、１９９３；Ｃｈｅｎ Ｊら、１９９３；Ｍｏｍａｎｄ Ｊら、１９９２）が、酵母の細胞成長を阻害するように十分に転写干渉構築物を誘導することができるかどうかも試験した。これを行うために、構築物ＵＩの組み込みバージョンを使用する。融合タンパク質ＤＢＤ−ｍｄｍ２およびＶＰ１６−ｐ５３（１−５５）を、２μプラスミドから出発して、遺伝子ＡＤＨ１の完全プロモーターの制御下で発現させる。
【０２６３】
ベクターｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔを構築するために、ヒトｐ５３タンパク質（ゲンバンク参照番号：ＢＣ００３５９６）のアミノ末端の５５のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを、２つのリン酸化１本鎖オリゴヌクレオチド：ＲＢ２００ ５’−ＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＡＡＣＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴＣＧＴＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＣＡＧＡＡＣＧＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＧＴＡＧＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧ−‘３（配列番号３５）およびＲＢ２０１ ５’−ＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＴＣＡＧＡＴＣＣＴＡＧＣＧＴＣＧＡＧＣＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＡＡＡＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＣＧＴＴＣＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＡＣＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＴＴＣＡＣＴＧＣ−３’（配列番号３６） （部位ＮｏｌＩおよびＢａｍＨＩに下線を引く）のハイブリダイゼーションによって作製する。これを行うために、これら２つの相補１本鎖オリゴヌクレオチドを水中、等モル濃度で混合する。この混合物を加熱ブロック（ヒートブロック）において５分間、９０℃で加熱し、この後、このブロックを（約２時間）放置して周囲温度に冷却する。このようにして得た２本鎖フラグメントは、この末端に、相和性付着末端ＮｏｔＩおよびＢａｍＨ１をそれぞれ有する。
【０２６４】
この後、事前に酵素ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩによって消化したベクターｐＶＰ１６（ＶｏｊｔｅｋおよびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、１９９５；Ｖｏｊｔｅｋら、１９９３）においてフラグメント連結を行う。この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０２６５】
ベクターｐＤＴＢ−ｍｄｍ２を構築するために、全Ｍｄｍ２ヒトタンパク質（ゲンバンク参照番号：ＮＭ＿００２３９２）をコードする遺伝子を、マトリックスとしてベクターｐＣＲ３−ｍｄｍ２ｆｌ（Ｓｉｇａｌａｓら、１９９６）、ならびに次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ２０２（５’−ＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣ−３’）（配列番号３７）およびＲＢ２０３（５’−ＡＣＴＴＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＴＡＧＣＡＣＡＡＴＣ−３’）（配列番号３８）（部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩに下線を引く）を使用することにより、ＰＣＲによって増幅する。このＰＣＲ産物を酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩによって消化し、ベクターｐＤＢＴ（Ｎａｖａｒｒｏら、１９９７）において部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩのレベルでクローニングする。この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０２６６】
得られた構築物の活性を検証した。これを行うために、レポーター株Ｙ１８７（この株Ｙ１８７は、プロモーターＰｇａｌ１の制御下に置かれた遺伝子ＵＲＡ３を有するものであり、Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、１９９３によって説明された。特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）から参照番号９６３９９で入手できる。）を、３つのプラスミド対によって形質転換する。これらの対は、次のものである：ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ、ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ＋ｐＤＢＴ、およびｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２。２つのプラスミドにより共形質転換された２つのクローンを、これらのプラスミド対の各々について選択する。ウラシルを含有するおよび含有しない最小培地で成長するこれらの能力を試験する。６つの対応するクローンは、ウラシルが存在する状態での最小培地で成長することができることがわかる（図６Ｆ参照）。しかし、ウラシル不在の状態では、プラスミドｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔにより共形質転換された２つのクローンしか成長できない。これは、遺伝子ＵＲＡ３が株Ｙ１８７において活性化され、これにプロモーターＰｇａｌ１を活性化することができる活性転写因子を再構成するＤＢＤ−ｍｄｍ２とＶＰ１６−ｐ５３（１−５５）の間の相互作用が利用されることを示す。従って、使用した構築物の活性が示される。
【０２６７】
次に、株ｙＲＢ４９（ＵＩ系）を、２つのハイブリッドタンパク質ＤＢＤ−ｍｄｍ２およびＶＰ１６−ｐ５３（１−５５）を発現させることができるプラスミド対ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔによって共形質転換する。株ｙＲＢ４９（ＵＩ系）は、対照としてプラスミド対ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＴＡＬ２０によっても共形質転換する。２つのプラスミドによって共形質転換された２つのクローンを、これら２つのプラスミド対の各々について選択する。これらの二重形質転換体の２つのクローンの各々の細胞成長を、実施例６において説明したように、ヒスチジンを含有するおよび含有しない寒天プレート、ならびにヒスチジンを含有せず、漸増濃度の３−ＡＴを含有するまたは含有しない寒天プレートで試験する。図６Ｇに示すように、融合タンパク質ＤＢＤ−ｍｄｍ２とＶＰ１６−ｐ５３（１−５５）の間の相互作用は、干渉構築物ＵＩを有する株の細胞成長を阻害するが、融合タンパク質ＤＢＤ−ｍｄｍ２およびこのドメインＡＤを発現する細胞は、正常に成長する。
【０２６８】
この実験では、５ｍＭまたはそれ以上の濃度の３−ＡＴの存在下では、細胞成長のレベルで差が検出される。
【０２６９】
ダブル・ハイブリッド相互作用により誘導された転写干渉は、ｒＹ２Ｈ ＵＩ系で容易に検出することができると結論付けることができる。
【実施例１１】
【０２７０】
タンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニングへのｒＹ２Ｈ ＵＩ転写干渉系の適用：
１１．１ 固体培地での酵母成長の回復についての試験の補正
ゲノムに組み込まれたｒＹ２Ｈ ＵＩ転写干渉系を含有する酵母菌株（ｙＲＢ４９）を使用して、成長の回復についての試験によりタンパク質間相互作用阻害剤を単離した。
【０２７１】
この試験を行うために、特異的タンパク質間相互作用に連結した、ｒＹ２Ｈ ＵＩ転写干渉系を含有する酵母菌株を、３−ＡＴを含有する固体培地に平板接種する。化合物の溶液の液滴を接種用皿に堆積させる。寒天への化合物の拡散により、この堆積ゾーンの周りに濃度勾配が作られる。タンパク質間相互作用を阻害することができる生成物は、細胞成長を可能にし、これは、この堆積ゾーンを取り囲む成長回復輪により反映される。
【０２７２】
このような試験の開発のための条件を決定するために、一連の予備実験を行った。この第一段階は、例えば、ペトリ皿に堆積させる細胞の量を評価するためのものであり、第二段階は、細胞成長を阻害する培地中の３−ＡＴの最小濃度を評価するためのものであった。
【０２７３】
先ず最初に、ＵＩ系の被組み込みバージョンを含有する酵母（ｙＲＢ４９）をプラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５で共形質転換して、この転写干渉系をタンパク質間相互作用カップル、Ｆｅ６５／Ａｐｐの制御下に置いた。次に、ヒスチジンを含有する液体培地でこれらの酵母を培養した。培養物の光学濃度（ＯＤ）が、３の値（１ｍＬ当たり、細胞数３×１０７）に達し次第、細胞を１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離し、滅菌水で２回洗浄し、ＯＤ＝０．１または０．０１で再び懸濁させた。事前に１２０ｍｍ四方のペトリ皿に注入しておいた固体培地の全表面にわたって均一にこの懸濁液の１０ｍＬを平板接種した。１分後、液体を吸引により除去した。これらの皿を層流フードのもとで１５分間乾燥させ、この後、３０℃で４８時間保温した。
【０２７４】
図８Ａは、これらの皿の最適な接種が、最低稀釈、すなわちＤＯ＝０．０１（右側の皿）で達成されたことを示すものである。
【０２７５】
酵母の成長を阻害することができる３−ＡＴの最小濃度を決定するために、ｙＲＢ４９株を、上のようにプラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ）で、または対照プラスミドｐＴＡＬ２０／ｐＤＢＴ（タンパク質間相互作用を発現しない。）で形質転換した。これら２つの形質転換株を、ヒスチジンを含有するまたはヒスチジンを含有しない、０、０．５または１ｍＭの３−ＡＴを補足した培地に平板接種した。図８Ｂに示されているように、Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用を有する株は、１ｍＭの３−ＡＴを含有する培地では、同じ条件下でこの成長に影響を受けない対照プラスミドを含有するものと比較して、非常に遅延した成長を示す。
【０２７６】
同実験において、この成長回復試験における溶液中の分子の毒性を迅速に試験するために、化合物数１００００のライブラリーから２つの分子をランダムに選択した。ＤＭＳＯに１０ｍＭで溶解した後、各々の１μＬを各皿に堆積させ、１μＬのＤＭＳＯも同様にした。これら２つの分子は、いずれも、酵母の成長を回復することができなかった。しかし、高濃度ではこれらの分子の毒性作用に関連して、分子堆積ゾーンの周りに成長阻害ディスクを生じさせる（図８Ｂ）。
【０２７７】
培地へのヒスチジンの添加は、転写干渉系からこれを除去することによるこれらの株のヒスチジン合成欠如を補正する。上で説明した実験条件により、酵母成長の回復を検出できるようになることを確認するために、プラスミド対ｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）で共形質転換したｙＲＢ４９株を、ヒスチジンがなく、１ｍＭの３−Ａｔを補足した上記培地に平板接種し、この後、漸増量のウラシル、アデニン、ロイシンまたはヒスチジンを各皿の中央に堆積させた。
【０２７８】
図８Ｃに示すように、ヒスチジンだけが、堆積物の周りの酵母の成長をこの濃度に依存する様式で回復させることができる。
【０２７９】
１１．２：タンパク質間相互作用阻害剤により誘導される酵母成長回復の検出
上で報告した実験条件を大規模に用いて、分子数１００００のコレクションをスクリーニングした。これらの条件下、このコレクションの各分子を、ヒスチジンがなく、１ｍＭの３−ＡＴを含有する固体培地に、９６−ニードルレプリケーターによって、約０．２μＬの１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液の比率で堆積させた。このスクリーニングに使用したロボットプラットフォームは、以前にＢｅｙｄｏｎら（２０００）によって以前に説明されたものである。酵母成長を回復させることができる２つの分子は、こうして単離した：これら２つの生成物の各々については、高濃度でのこれらの分子の毒性作用に関連して回復成長の強い白色の輪を成長阻害ゾーンの周りで容易に識別することができ、これに対して、対照生成物３については、予想通り、影響はまったく検出されない（図９）。
【０２８０】
この試験で単離した分子の作用の特異性を確認するために、Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用を阻害する可能性を秘めた他の３つの分子（図１１においてＡ、ＢおよびＣと呼ばれているもの）の影響を、この干渉系を使用する別のタイプのタンパク質間相互作用、ｐ５３／ｍｄｍ２相互作用（実施例１０．２参照）を用いて試験した。
【０２８１】
先ず最初に、Ｆｅ６５／Ａｐｐおよびｐ５３／ｍｄｍ２の一機能としてＵＩ干渉系の相対応答を、滴下試験により試験した。例えば、ｐ５３／ｍｄｍ２複合体は、ヒスチジンを含有しないが、Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用を有する株で使用したものより高い３−ＡＴ濃度の培地で、酵母成長を阻害することが観察された（図１０）。これは、ｐ５３／ｍｄｍ２相互作用が、Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用より弱いか、そうでなければこの相互作用が、酵母ではあまりよく発現されないことを示唆している。
【０２８２】
次に、ｙＲＢ４９株をプラスミド対ｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５で形質転換してＦｅ６５／Ａｐｐ相互作用を発現させるか、プラスミド対ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２およびｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔで形質転換してｐ５３／ｍｄｍ２相互作用を発現させた。
【０２８３】
これら２つのＦｅ６５／Ａｐｐおよびｐ５３／ｍｄｍ２株を、ヒスチジンがなく、１ｍＭおよび２０ｍＭの３−ＡＴをそれぞれ補足した培地の皿に平板接種した。３つの潜在的阻害分子の各々について、ＤＭＳＯ中０．１、１および１０ｍＭの１μＬの溶液の３滴を皿ごとに堆積させた。加えて、１μＬのヒスチジン（０．１２５％ ｗ／ｖ）を、成長修復の正の対照として、別の皿の中央に堆積させた。前記コレクションから無作為に取り、試験する３つの分子と同じ濃度で使用する生成物を、負の対照として使用した。
【０２８４】
図１１に提示した結果は、生成物ＡおよびＢは、Ｆｅ６５／Ａｐｐ株の回復成長の輪を誘導するので、活性であり、この輪のサイズは、使用する濃度に依存することを示している。このような濃度依存性の輪は、ｐ５３／ｍｄｍ２株については観察されず、これは、これら２つの分子の阻害効果の特異性を実証している。一方、生成物Ｃは、２つの株、Ｆｅ６５／Ａｐｐおよびｐ５３／ｍｄｍ２の成長を誘導し、従って、活性と分類することはできるが、非特異的である。予想どおり、生成物Ｄは、試験した２つの株に対して効果がなく、これは、不活性と考えられる。
【０２８５】
従って、成長回復試験により、分子数が数千のライブラリーから、タンパク質／タンパク質相互作用の特異的阻害剤である分子を単離することができるようになる。
【０２８６】
言及したすべての出版物および特許は、本出願に参照により組み込まれる。
【０２８７】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１Ａ】転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系を示し、逆Ｙ２Ｈ相互作用の検出のための転写干渉の適用を図解する。Ｙ２Ｈ相互作用が不在の状態では、レポーター遺伝子ＨＩＳ３は、正常に発現され、細胞は、ヒスチジンを含有しない培地で成長することができる（図１Ａ）。
【図１Ｂ】転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系を示し、逆Ｙ２Ｈ相互作用の検出のための転写干渉の適用を図解する。Ｙ２Ｈ相互作用の存在は、ＨＩＳ３の転写レベルを低下させ、これに起因して、ヒスチジンについて栄養要求のレポーター株の細胞成長が減少する（図１Ｂ）。
【図２Ａ】転写干渉構築物を示し、転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。
【図２Ｂ】転写干渉構築物を示し、転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。
【図２Ｃ】転写干渉構築物を示し、転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。
【図２Ｄ】転写干渉構築物を示し、転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。
【図２Ｅ】転写干渉構築物を示し、転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。
【図３】干渉構築物のゲノム組み込みを示し、転写干渉構築物のゲノム組み込みを図解する。
【図４Ａ】被組み込み干渉系の機能評価の結果を示す。
【図４Ｂ】被組み込み干渉系の機能評価の結果を示す。
【図４Ｃ】被組み込み干渉系の機能評価の結果を示す。
【図４Ｄ】被組み込み干渉系の機能評価の結果を示す。
【図４Ｅ】被組み込み干渉系の機能評価の結果を示す。
【図５Ａ】プラスミドに基づく干渉系の機能評価（ゲノムレベルで組み込まれていないもの）の結果を示す。
【図５Ｂ】プラスミドに基づく干渉系の機能評価（ゲノムレベルで組み込まれていないもの）の結果を示す。
【図５Ｃ】プラスミドに基づく干渉系の機能評価（ゲノムレベルで組み込まれていないもの）の結果を示す。
【図５Ｄ】プラスミドに基づく干渉系の機能評価（ゲノムレベルで組み込まれていないもの）の結果を示す。
【図６Ａ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｂ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｃ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｄ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｅ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｆ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｇ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図７Ａ】２つのタンパク質ＹとＸの間の相互作用を阻害するがこのタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用は阻害しない分子を同定することができる、本発明の転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系を示す。
【図７Ｂ】２つのタンパク質ＹとＸの間の相互作用を阻害するがこのタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用は阻害しない分子を同定することができる、本発明の転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系を示す。
【図８Ａ】Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤をスクリーニングするための実験条件の決定を示し、細胞量の決定を示す。
【図８Ｂ】Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤をスクリーニングするための実験条件の決定を示し、３−ＡＴの濃度の決定を示す。
【図８Ｃ】Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤をスクリーニングするための実験条件の決定を示し、ヒスチジンによる成長の回復を示す。
【図９】成長の修復によるＦｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤の検出について示す。
【図１０】干渉系の活性化についてのＦｅ６５／Ａｐｐとｐ５３／ＭＤＭ２相互作用の比較について示す。
【図１１】Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤の特異性の確認について示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写干渉による遺伝子休止化に基づく新規ダブル・ハイブリッド系に関する。本発明は、タンパク質間相互作用に対して作用する生物活性化合物の同定のためのこの系の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ダブル・ハイブリッド系（Ｙ２Ｈ：「酵母ツーハイブリッド系」）は、タンパク質間相互作用の同定のために酵母において広範に用いられている（特に、Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．Ｔら、１９９１、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ，１９８９、Ｃａｇｎｅｙ，Ｇら、２０００、６．Ｃａｕｓｉｅｒ，Ｂ．およびＢ．Ｄａｖｉｅｓ，２００２、Ｃｏａｔｅｓ，Ｐ．Ｊ．およびＰ．Ａ．Ｈａｌｌ．２００３参照）。
【０００３】
ダブル・ハイブリッド法は、別個のキメラタンパク質が含有するＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが、これら２つのドメインが互いに十分に近いとき、遺伝子の転写を活性化し得るという事実に基づく。酵母におけるダブル・ハイブリッド系の現行使用バージョンは、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ４ｐタンパク質の特性を利用している（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９）。
【０００４】
特に、タンパク質ＧＡＬ４ｐは、酵母によるガラクトースの利用に必要なＧＡＬ１遺伝子の転写を活性化し、ならびにこのタンパク質は、次の２つのドメインから成る：ＤＮＡ配列（酵母ＧＡＬ遺伝子の上流活性化配列であるＵＡＳＧ）に特異的に結合するＮ末端ドメインおよび転写活性化を可能にする酸性領域を含有するＣ末端ドメイン。
【０００５】
この第一のダブル・ハイブリッド系は、次の３つの作用因子を介入させる：２つの融合タンパク質と、プロモーター遺伝子がＧＡＬ１遺伝子のプロモーター（Ｐｇａｌ１）の制御下に置かれている１つの構築物。ＧＡＬ４ｐタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合した第一のタンパク質は、上で説明した構築物を有する酵母Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において発現される。ＧＡＬ４ｐの転写活性化ドメイン（ＡＤ）に融合した第二のタンパク質は、この同じ酵母において共発現される。これら２つの融合タンパク質の相互作用の場合、ＧＡＬ４−ＡＤ転写活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインを一緒にすることにより、Ｐｇａｌ１の制御下に置かれたレポーター遺伝子の発現を誘発することができる機能性ＧＡＬ４ｐ転写因子を、再構成することができる。
【０００６】
（例えば、遺伝子ＨＩＳ３のような）酵母の生存能に必須の遺伝子をレポーター遺伝子として選択することにより、レポーター遺伝子が発現される株、従って、２つのハイブリッドタンパク質の間に相互作用が発生する株を、容易にスクリーニングすることができる。このような相互作用が発生しない株は、Ｐｇａｌ１を活性化することができず、またこのレポーター遺伝子がこの酵母の生存能に必須の遺伝子である場合には成長することができない。
【０００７】
より最近、いわゆる逆ダブル・ハイブリッド系が開発された（ｒＹ２Ｈ：「酵母逆ツーハイブリッド系」）。これらの系は、レポーター遺伝子の活性化が、タンパク質間相互作用不在の状態で誘発され、これは、パートナーと相互作用する能力を喪失した変異タンパク質の同定、ならびにタンパク質間相互作用を特異的に阻害する分子の同定に特に有用である。
【０００８】
Ｙｏｕｎｇらは、カルシウムチャネルモジュレーターを同定するために逆ダブル・ハイブリッド系に基づく高効率スクリーニングテストをかくして完成した（Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．ら、１９９８）。このｒＹ２Ｈ系は、ＣＹＨ２の特性を活用する。ＣＹＨ２遺伝子は、シクロヘキシミドに対する感受性を細胞に付与するリボソームタンパク質Ｌ２９、すなわちリボソームサブユニット６０Ｓの一成分をコードする（Ｋａｕｆｅｒ，Ｎ．Ｆ．ら、１９８３）。レポーターカセットＰｇａｌ１−ＣＹＨ２を、内因性変異ＣＹＨ２遺伝子を有するシクロヘキシミドに耐性の酵母菌株に導入する。野生型の対立遺伝子ＣＹＨ２が優勢である場合、二タンパク質間の相互作用が発生すると（従って、レポーターカセットが転写されると）、シクロヘキシミドを含有する培地ではレポーター細胞の成長が阻害される。この相互作用の遮断は、シクロへキサミドの毒性効果を減弱させ、シクロヘキシミドを含有する培地でのレポーター細胞の成長を可能にする（Ｌｅａｎｎａ，Ｃ．Ａ．，およびＨ．Ｈａｎｎｉｎｋ．１９９６）。
【０００９】
しかし、ｍＲＮＡの安定性およびタンパク質の安定性に関連した問題ならびに野生型ＣＹＨ２ｐタンパク質および変異ＣＹＨ２ｐタンパク質の活性レベルでの相違により、タンパク質間相互作用の解離（逆Ｙ２Ｈ相互作用）の検出のためのこの系の使用が複雑になり、感度が不十分になる。
【００１０】
加えて、この系には、使用して最大感度を得ることが比較的困難であるという欠点がある。逆Ｙ２Ｈ相互作用に対するこの応答が、幾つかの分子に依存するためである。例えば、リボソームへの組み込みレベルでの野生型ＣＹＨ２ｐと変異ＣＹＨ２ｐの間の競合が、レポーターの感度に影響する。加えて、シクロヘキシミドの捕捉のレベルおよびリボソームに対するこの反応性のレベルでの変動は、この系の応答能力にまず間違いなく影響を及ぼす。
【００１１】
レポーター遺伝子ＵＲＡ３とこの前毒性基質：５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）との併用に基づく、もう１つの逆ダブル・ハイブリッド系も説明されている（Ｈｕａｎｇ，Ｊ．およびＳ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ．１９９７、Ｖｉｄａｌ，Ｍ．ら、１９９６、ＷＯ９６３２５０３）。この系では、タンパク質ＵＲＡ３ｐの発現の誘導が、細胞成長を阻害する。この時、５−ＦＡＯが、この毒性類似体：５−フルオロ−ＵＴＰに変換されるためである。これに対して、ＵＲＡ３の不活性化は、細胞の成長を可能にする。この時、５−ＦＯＡは、もはや代謝されず、細胞が、この培地に補足されたウラシルを使用するためである。この系は、通常のパートナーと相互作用する能力を喪失した変異タンパク質を同定するために使用される（Ｂｕｒｋｅ，Ｔ．Ｗ．ら、２００１；Ｄａｒｏｓ，Ｊ．Ａ．ら、１９９９；Ｐｕｔｈａｌａｋａｔｈ，Ｈ．ら、１９９９）。
【００１２】
この系の構造およびメカニズムは、上で説明した逆ダブル・ハイブリッド系のものに非常に類似している（Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．ら、１９９８）。このため、この系は、上に挙げた欠点を有する。加えて、５−ＦＯＡの使用に基づく系は、この系自体と関係がある偽陽性を生じさせる欠点を有する。実際、細胞成長は、野生型ＵＲＡ３の不活性化と関係がある。従って、ＵＲＡ３ｐタンパク質を阻害する化合物は、細胞成長を可能にする。このため、これらの化合物は、タンパク質間相互作用を特異的に阻害する分子の同定にこの系を使用している間に、偽陽性シグナルを発生させる。
【００１３】
この系は、比較的高価な化学薬品である５−ＦＯＡを使用するという欠点も有する。
【００１４】
最後に、２つのレポーター遺伝子のカスケードを含む、「スプリット・ハイブリッド（Ｓｐｒｉｔ−Ｈｙｂｒｉｄ）」という名のリレー系も説明されている（ＷＯ９５２６４００およびＷＯ９８１３５０２）。このｒＹ２Ｈ系は、ＣＢＰとの連結を遮断するタンパク質ＣＲＥＢの変異を同定するために使用されている（Ｃｒｉｓｐｉｎｏ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９９）。これらの系では、ダブル・ハイブリッド相互作用が、第一レポータータンパク質の発現を活性化し、これがまた、成長選択に使用される第二レポーター遺伝子の発現を制御する。しかし、この系は、逆Ｙ２Ｈ相互作用の検出のためには使用が複雑であり、感度が不十分である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このように、上で説明した系は、幾つかの分子（２つのレポーター遺伝子、レポーター遺伝子と毒性物質、野生型レポーター遺伝子と変異レポーター遺伝子）の活性に依存する。これは、特に最大感度が求められるとき、これらの利用の複雑さを増大させる。より単純であり、より経済的でもあると同時に良好な感度を有する系を有することが、望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、転写干渉による遺伝子の休止化（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）に基づく新規ダブル・ハイブリッド系に関する。本発明のダブル・ハイブリッド系は、単純であり、培地への毒性物質の添加を必要とせず、ならびにゲノムへの組み込みを必要とせずに使用することができる。
【００１７】
本発明の第一の主題は、干渉ＤＮＡ構築物を含有する細胞に関し、
前記構築物は、
第一プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター、いわゆる干渉プロモーター［前記干渉プロモーターの活性化が、前記第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択されおよび配置され、その結果前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。］、
を含み、
前記細胞は、
第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）［前記第一キメラタンパク質は、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるタンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る。］、
第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）［前記第二キメラタンパク質は、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る。］
をさらに発現し、
前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。
【００１８】
１つの実施形態によると、本発明は、レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターが、誘導性プロモーターであり、タンパク質Ｙが、２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができる、上で説明したものなどの細胞に関し、この細胞は、このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）をさらに発現し、２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用が、このレポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明は、レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターが、キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含む、上で定義したものなどの細胞に関する。
【００２０】
本発明は、レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターが、構成的プロモーターである、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００２１】
本発明は、干渉ＤＮＡ構築物によりおよびキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入された宿主細胞である、上で説明したものなどの細胞にも関し、これらの構築物のすべてが、１つまたはそれ以上の非組み込みベクターに担持されたものである。
【００２２】
本発明のもう１つの態様は、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入された宿主細胞である、上で定義したものなどの細胞に関し、これらの構築物は、１つまたはそれ以上の非組み込みベクターに担持されており、干渉ＤＮＡ構築物は、細胞のゲノムに組み込まれている。
【００２３】
本発明は、干渉ＤＮＡ構築物およびキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物が、細胞のゲノムに組み込まれている、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００２４】
好ましい実施形態において、本発明は、干渉ＤＮＡ構築物が、摂動性ゲノム転写活性のない遺伝子座に組み込まれている、上で説明したものなどの細胞に関する。
【００２５】
本発明は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および酵母細胞により形成された群から選択される、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００２６】
本発明は、酵母細胞に関する、上で説明したものなどの細胞にも関する。
【００２７】
好ましい実施形態において、本発明は、サッカロミセス・セレビジエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）またはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）種の酵母に関する、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００２８】
本発明は、レポーター遺伝子および第一プロモーターの下流に、後者とは反対の配向で配置された（ＤＩ）少なくとも１つの干渉プロモーターを有する、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００２９】
本発明は、レポーター遺伝子および第一プロモーターの下流に、後者と同じ配向で配置された（ｎＤＩ）少なくとも１つの干渉プロモーターを有する、上で説明したものなどの細胞にも関する。
【００３０】
本発明は、レポーター遺伝子および第一プロモーターの上流に、後者と同じ配向で配置された（ＵＩ）少なくとも１つの干渉プロモーターを有する、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００３１】
本発明のもう１つの態様は、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置された少なくとも１つの干渉プロモーターを有し、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターが、第一プロモーターに対して集中的な配向を有し、ならびに第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に配置された干渉プロモーターが、第一プロモーターのものと同一の配向を有する（ＵＤＩ）、上で説明したものなどの細胞に関する。
【００３２】
加えて、本発明は、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置された少なくとも１つの干渉プロモーターを有し、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターが、第一プロモーターに対して対状の配向を有し、ならびに第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に配置された干渉プロモーターが、第一プロモーターのものと同一の配向を有する（ｎＵＤＩ）、上で定義したものなどの細胞に関する。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明は、上で定義したものなどの細胞であって、レポーター遺伝子がこの細胞の生存に必須の遺伝子である細胞に関する。
【００３４】
本発明は、上で説明したものなどの細胞であって、レポーター遺伝子が、一次代謝、細胞分裂、タンパク質合成、ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成に不可欠な遺伝子である細胞にも関する。
【００３５】
本発明は、レポーター遺伝子が、それ自体は、単独では細胞の生存に必須でないが、発現が転写干渉系により制御されるまたはされない同じタイプの１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子に関連してこの転写が阻害されるときには細胞の生存に必須である、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００３６】
好ましい実施形態において、本発明は、誘導性干渉プロモーターが、キメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列（Ｘ−ＤＢＤ）を含む、上で説明したものなどの細胞に関する。
【００３７】
本発明は、誘導性干渉プロモーターが、ＧＡＬ４ ＵＡＳ、ＬｅｘＡｏｐ、ｃＩｏｐおよびＴｅｔＲｏｐにより形成された群から選択されるＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有するタンパク質と相互作用することができる配列を含む、ならびにキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤのＤＮＡ結合ドメインが、対応するＤＢＤ（それぞれ、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡ、ｃＩまたはＴｅｔＲ）であるような、上で定義したものなどの細胞にも関する。
【００３８】
本発明のもう１つの態様は、キメラタンパク質Ｙ−ＡＤの転写活性化ドメイン（ＡＤ）が、次のタンパク質：Ｂ４２、ＶＰ１６およびＧＡＬ４ｐの転写活性化ドメインにより形成された群から選択される、上で説明したものなどの細胞に関する。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明は、干渉ＤＮＡ構築物が、この末端で、１つまたはそれ以上の一方向性または二方向性転写ターミネーターに隣接している、上で定義したものなどの細胞に関する。
【００４０】
本発明のもう１つの態様は、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害する化合物を同定するためのプロセスに関し、このプロセスは、
ａ）上で定義したものなどの細胞を培養する段階、
ｂ）被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下と不在下で比較する段階、
を含み、レポーター遺伝子の発現の増加は、被検化合物が、培養細胞によって発現されたタンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であることの指標となる。
【００４１】
加えて、本発明は、タンパク質間相互作用を阻害する化合物を同定するための、上で定義したものなどの細胞の使用に関する。
【００４２】
本発明は、タンパク質間相互作用を特異的に排除するペプチドまたはタンパク質因子を同定するためにｃＤＮＡバンクまたはペプチドバンクをスクリーニングするための、上で説明したものなどの細胞の使用にも関する。
【００４３】
本発明のもう１つの態様は、ダブル・ハイブリッド系を作るためのキットに関し、このキットは、
第一ＤＮＡ構築物［前期第一ＤＮＡ構築物は、
第一プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター（前記誘導性プロモーターの活性化が、前記第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、その結果、前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。）
を含む。］、
第二ＤＮＡ構築物［前記第二ＤＮＡ構築物は、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるパートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）をコードする。］、
第三ＤＮＡ構築物［前記第三ＤＮＡ構築物は、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）
をコードする。］
を含み、前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記２つのキメラタンパク質が宿主細胞において発現されたときに干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。
【００４４】
本発明は、レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターが、誘導性プロモーターであり、タンパク質Ｙが、２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができる、上で定義したようなキットにも関し、この場合のキットは、このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）をコードする第四ＤＮＡ構築物を含み、２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。
【００４５】
本発明のもう１つの態様は、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害するが、このタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用はまったく阻害しないか、あまり阻害しない化合物を同定するための方法に関し、この方法は、
ａ）上で定義した細胞を培養する段階、
ｂ）被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下と不在下で比較する段階
を含み、レポーター遺伝子の発現の増加は、被検化合物が、タンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であること、しかし、この生成物が、タンパク質Ｙとタンパク質Ｚの間の相互作用をまったく阻害しないか、あまり阻害しないことの指標となる。
【００４６】
最後に、本発明は、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子ＵＲＡ３のオープンリーディングフレームの上流および下流領域に相同な２つのフラグメントを含有し、これら２つのフラグメント間に挿入される配列の遺伝子座ＵＲＡ３のレベルでの相同組換えにより組み込むことができる、酵母組み込みベクターに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、転写干渉による遺伝子の休止化に基づく新規ダブル・ハイブリッド系に関する。本発明のダブル・ハイブリッド系は、単純であり、培地への毒性物質の添加を必要とせず、ならびにゲノムへの組み込みを必要とせずに使用することができる。
【００４８】
転写干渉は、第二プロモーターが活性化されたときの第一プロモーターの活性の摂動と定義される。例えば、あるプロモーターの転写活性が、他のプロモーターのレベルで開始される転写を減少させる。転写干渉は、例えば酵母に関して説明されている（Ｇｒｅｇｅｒ，Ｉ．Ｈ．，ａｎｄ Ｎ．Ｊ．Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ．１９９８、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｏ．ら、１９９７、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．およびＡ．Ｍ．Ｍｙｅｒｓ，１９９３、Ｐｕｉｇ，Ｓ．ら、１９９９、Ｍａｒｔｅｎｓら、２００４）。
【００４９】
本発明の第一の主題は、特定のタンパク質間相互作用が不在の状態でレポーター遺伝子を発現することができるが、この相互作用が発生したとき、前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な低下が認められる、１つまたはそれ以上の構築物を有する細胞に関する。
【００５０】
より詳細には、本発明の細胞は、１つまたはそれ以上のＤＮＡ構築物、いわゆる干渉構築物を含有し、前記構築物は、
第一プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター、いわゆる干渉プロモーター［前記干渉プロモーターの活性化が、前記第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択されおよび配置され、その結果前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。］、
を含み、
前記細胞は、
第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）［前記第一キメラタンパク質は、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるタンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る。］、
第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）［前記第二キメラタンパク質は、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る。］
をさらに発現し、
前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。
【００５１】
第一の実施形態において、本発明の細胞は、レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物（干渉構築物）により形質転換または形質移入された宿主細胞であり、これらは、２つのキメラタンパク質の各々をコードする２つのＤＮＡ構築物によっても形質転換または形質移入される。これら３つの構築物は、同じＤＮＡベクターに担持されていることがあり、または２つもしくは３つの異なるベクター上で見出される。すべての組み合わせが考えられる：同じベクター上に３つの構築物；３つの異なるベクター上に３つの構築物；同じベクター上に２つのキメラタンパク質をコードする２つの構築物、但し、３つ目の構築物は、別のベクター上で見出される；同じベクター上に２つのキメラタンパク質のうちの１つをコードする構築物と干渉構築物、しかし別のベクター上で見出される、もう１つのキメラタンパク質をコードする構築物。この第一の実施形態におけるベクターは、非組み込みベクターである。
【００５２】
本発明の第二の実施形態において、干渉構築物は、細胞のゲノムに組み込まれており、これらの細胞は、２つのキメラタンパク質の各々をコードする２つのＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入される。これらのキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、同じＤＮＡベクターに担持されていることがあり、または２つの異なるベクター上で見出され、このまたはこれらのベクターは、非組み込みベクターである。
【００５３】
本発明の第三の実施形態において、干渉構築物、および２つのキメラタンパク質の各々をコードするＤＮＡ構築物は、細胞のゲノムに組み込まれている。２つのキメラタンパク質のうちの１つをコードする２つの構築物のうちの１つだけが、ゲノムに組み込まれており、もう１つの構築物が、非組み込みベクターに担持されていることもある。最後に、最後の実施形態では、干渉構築物、および２つのキメラタンパク質のうちの１つをコードする２つの構築物のうちの１つは、非組み込みベクターに担持されているが、もう１つのキメラタンパク質をコードする構築物は、細胞のゲノムに組み込まれている。
【００５４】
レポーター遺伝子は、慣例的には、容易に検出できる産物をコードする遺伝子と定義される。優先的な実施形態において、本発明に関連して用いるレポーター遺伝子は、この発現が細胞の生存に必須である遺伝子である。これは、例えば、一次代謝、細胞分裂、タンパク質合成（リボソームなど）、ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成などに不可欠な遺伝子である。
【００５５】
このタイプの遺伝子の例として、酵母の生存に必須と記載されているすべての遺伝子、すなわち、このゲノムを構成する遺伝子の約１／６（Ｗｉｎｚｅｌｅｒ Ｅ．Ａ．ら、１９９９）を挙げることができる。
【００５６】
例えば、レポーター遺伝子は、一次代謝に関与し、一次代謝に不可欠であるか、細胞分裂に不可欠である遺伝子である場合がある。より詳細には、レポーター遺伝子は、添加できるか、培地から除去することができる必須代謝産物の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子である場合がある。
【００５７】
このタイプの遺伝子の例としては、酵母の培地中のアミノ酸または対応する核酸塩基を容易に補足することができるため、酵母Ｓ．セレビジエにおいて幅広く用いられている遺伝子ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２、ＭＥＴ１５およびＡＲＧ４を挙げることができる。代謝産物に基づく他のマーカーを用いてもよく、例としては、遺伝子ＨＩＳ５（酵母Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）の遺伝子）、遺伝子ＵＲＡ３およびＬＥＵ２（酵母Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）の遺伝子）、ＵＲＡ３（酵母Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の遺伝子）、ＬＥＵ２（酵母Ａ．ゴシピ（Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ）の遺伝子）を挙げることができる。
【００５８】
レポーター遺伝子は、一次代謝に関与し、一次代謝に必須でない遺伝子、または単独で使用されたとき、細胞分裂に必須でない遺伝子である場合もある。一方、これらの転写が同じタイプの１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子に関連して阻害される場合、効果が併さることによって酵母の生存に必須の機能に対する阻害が導かれることがある。レポーター遺伝子は、例えば、これらの共伴的役割が一次代謝、細胞分裂、タンパク質合成（リボソームなど）、ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成などに不可欠な機能を導く遺伝子の集合体である場合がある。
【００５９】
このタイプの遺伝子の例としては、酵母の生存に必須ではないと記載されている遺伝子（すなわち、このゲノムを構成する遺伝子の約５／６（Ｗｉｎｚｅｌｅｒ Ｅ．Ａ．ら、１９９９））であって、同じタイプの１つまたはそれ以上の遺伝子に関連して必須になる、すべての遺伝子を挙げることができる。
【００６０】
しかし、他のレポーター遺伝子も、本発明に関連して使用することができる。例としては、酵素ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子；ルシフェラーゼをコードする遺伝子ｌｕｃ；蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ（「緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」）、ＣＦＰ（「シアン蛍光タンパク質（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」）、ＹＦＰ（「黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」）またはＲＦＰ（「赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」）、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。
【００６１】
毒性生成物に対する耐性を付与するマーカー：トランスポゾン Ｔｎ９０３の遺伝子ｋａｎ（ゲネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性を付与）、トランスポゾン Ｔｎ５の遺伝子ｂｌｅ（フレオマイシンに対する耐性を付与）、遺伝子ＣＹＨｒ（シクロヘキシミドに対する耐性を付与）、ｐａｔ（ビアラフォスに対する耐性を付与するＳ．ビリドクロモゲネス（Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）の遺伝子）、ｎａｔ１（ヌルセオトリシンに対する耐性を付与するＳ．ヌールセイ（Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ）の遺伝子、ｈｐｈ（ヒグロマイシンＢに対する耐性を付与する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子）である場合もある。これらの遺伝子すべてが、特に酵母において、機能性である（ＧｕｔｈｅｒｉｅおよびＦｉｎｋ，２００２）。
【００６２】
レポーター遺伝子は、第一プロモーターの制御下に置かれる。好ましい実施形態において、この第一プロモーターは、構成的プロモーターである。構成的プロモーターは、一般に認められているように、周囲の状況とは比較的無関係に発現することができるプロモーターである。
【００６３】
一例として、酵母においてレポーター遺伝子を構成的変異プロモーター ＡＤＨ１（７００）（変異した遺伝子ＡＤＨ１のプロモーター（Ｐａｄｈ１））（Ｒｕｏｈｏｎｅｎら、１９９５）の制御下で発現させることができる。しかし、他の構成的プロモーターも、本発明に関連して酵母において使用することができる。例としては、プロモーターＴＰＩ（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，１９８２）、ＴＥＦ１、ＴＤＨ３、ＫＥＸ２（Ｎａｃｋｅｎら、１９９６）およびＡＣＴ１（Ｅｒｎｓｔ，１９８６）を挙げることができる。
【００６４】
哺乳動物の細胞に関して言えば、例えば、プロモーターＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時−初期エンハンサー／プロモーター）（ＦｏｅｃｋｉｎｇおよびＨｏｆｓｔｅｔｔｅｒ，１９８６）（Ｋｒｏｎｍａｎら、１９９２）、プロモーターＥＦ−１ α（ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ，１９９０）、プロモーターＳＶ４０（シミアンウイルス４０初期エンハンサー／プロモーター）（Ｄａｓら、１９８５）、プロモーターＵＢ（ユビキチンのヒト遺伝子Ｃ（ｈＵｂＣ）のプロモーター）（Ｎｅｎｏｉら、１９９６；Ｓｃｈｏｒｐｐら、１９９６）、ラウス肉腫ウイルスのプロモーターＲＳＶ ＬＴＲ（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０）を挙げることができる。
【００６５】
このプロモーター、いわゆる「干渉プロモーター」は、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、これらの活性化が第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、この結果、レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。
【００６６】
本発明に関連して利用することができる干渉プロモーターは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を介してこのプロモーターの配列（ＤＢＤにより連結されるＤＮＡ配列）と相互作用する転写因子により活性化が誘導される誘導性プロモーターであり、前記転写因子は、このプロモーターにより支配される転写を開始させることができる。従って、本発明に関連して利用することができる干渉プロモーターは、考慮する生物においてダブル・ハイブリッド系を作るために適するすべてのプロモーターである。
【００６７】
好ましくは、本発明の干渉プロモーターは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有するタンパク質と相互作用することができる配列（ＤＢＤにより結合されたＤＮＡ配列（ＵＡＳ））を含む。より詳細には、本誘導性干渉プロモーターは、キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含む。
【００６８】
これらは、例えば、転写因子ＧＡＬ４ｐにより誘導可能なプロモーター Ｐｇａｌ１、Ｐｇａｌ１０、Ｐｇａｌ５、Ｐｇａｌ８０、Ｐｍｅｌ１、Ｐｇａｌ２、Ｐｇａｌ７、Ｐｇａｌ３、Ｐｇｃｙ１、Ｐｌｔｈ１、Ｐｐｃｌ１０およびＰｆｕｒ４（Ｒｅｎら、２０００；ＳｖｅｔｌｏｖおよびＣｏｏｐｅｒ，１９９５）である（野生型細胞において、転写因子ＧＡＬ４ｐは、ガラクトースにより誘導される遺伝子の発現に、特に関与する）。好ましくは、利用する誘導性プロモーターは、プロモーター Ｐｇａｌ１である。
【００６９】
しかし、他の誘導性発現系を使用する本発明の他の実施形態も、本発明の範囲に入る。表１は、ダブル・ハイブリッド系において既に使用されている非常に多数の誘導性系を示す。文献に記載されているこれらの系の誘導性プロモーターも、本発明の意図では干渉プロモーターである。機能性ダブル・ハイブリッド系を得るために、表１中のＤＢＤとＡＤの間で可能なすべての組み合わせが考えられる。
【００７０】
【表１】
【００７１】
誘導性干渉プロモーターは、これらの活性化が第一プロモーターの転写干渉に影響するように配置され、この結果、レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。
【００７２】
例えば、干渉性プロモーターは、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に配置することができる。この時、下流に位置する干渉プロモーターの活性化は、さらに上流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、下流干渉の事である。
【００７３】
しかし、下流干渉に関連して、この干渉プロモーターは、２つの可能な配向を有することできる。第一の配向は、第一プロモーターに対して集中的な配向に相当し、この構造は、下流干渉（またはＤＩ）と呼ばれている。この干渉プロモーターは、第一プロモーターに対して対状の配向を有することもあり、この第二の構造は、ナンセンス下流干渉（またはｎＤＩ）と呼ばれており、これもレポーター遺伝子の発現の阻害を示す（実施例セクション参照）。
【００７４】
干渉プロモーターは、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に配置することもできる。この時、上流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに下流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、上流干渉の事である。この時、干渉プロモーターは、第一プロモーターと同一の配向を有する（従って、これら２つのプロモーターは、対状の構造を有する）。この構造は、上流干渉（またはＵＩ）と呼ばれている。
【００７５】
もう１つの可能な構造は、上で説明した２つの構造の組み合わせ（ＵＩおよびＤＩ系）である。この場合、少なくとも１つの誘導性干渉プロモーターが、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置される。この時、上流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに下流に位置する第一プロモーターの活性に干渉し、また下流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに上流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、上流−下流干渉の事である。
【００７６】
第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターに対して集中的な配向を有する（上記ＤＩ系参照）。第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターのものと同一の配向を有する（従って、これら２つのプロモーターは、対状の構造を有する）（上記ＵＩ系参照）。
【００７７】
この構造は、上流−下流干渉（またはＵＤＩ）と呼ばれている。
【００７８】
もう１つの可能な構造は、上で説明した２つの構造の組み合わせ（ＵＩおよびｎＤＩ系）である。この場合、少なくとも１つの誘導性干渉プロモーターが、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置される。この時、上流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに下流に位置する第一プロモーターの活性に干渉し、また下流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに上流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、上流−下流干渉の事である。
【００７９】
第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターに対して対状の配向を有する（上記ｎＤＩ系参照）。第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターのものと同一の配向を有し（上記ＵＩ系参照）、従って、これら３つのプロモーターは、対状の構造を有する。
【００８０】
この構造は、ナンセンス上流−下流干渉（またはｎＵＤＩ）と呼ばれている。
【００８１】
ＵＩタイプの構築物の場合、干渉プロモーターの活性化は、転写干渉のため、第一プロモーターの活性の減少をもたらす。しかし、この上流干渉プロモーターの活性が、レポーター遺伝子のセンス転写産物を再び生じさせることがある。
【００８２】
この機能性センス転写産物の翻訳を防止するために、好適には、短いオープンリーディングフレーム、これに続く１つまたはそれ以上（例えば２つまたは３つ）の停止コドンが、干渉プロモーターと第一プロモーターの間に挿入される。この時、ＵＩ系における転写干渉は、バイシストロン性メッセンジャーを生じさせ、ここから出発してこの最初の短いオープンリーディングフレームだけを翻訳する。
【００８３】
これは、ＵＤＩおよびｎＵＤＩタイプの構造の場合も同様である。実際、ＵＤＩまたはｎＵＤＩタイプの構築物の場合、第一プロモーターの上流に位置する干渉プロモーターの活性化は、転写干渉のために第一プロモーターの活性の減少をもたらす。しかし、上流干渉プロモーターの活性が、レポーター遺伝子のセンス転写産物を再び生じさせることもある。
【００８４】
この機能性センス転写産物の翻訳を防止するために、好適には、短いオープンリーディングフレーム、これに続く１つまたはそれ以上の停止コドンが、干渉プロモーターと第一プロモーターの間に挿入される。この時、ＵＤＩまたはｎＵＤＩ系における転写干渉は、バイシストロン性メッセンジャーを生じさせ、ここから出発してこの最初の短いオープンリーディングフレームだけを翻訳する。
【００８５】
好適には、上で説明した干渉構築物は、これらの末端で二方向性転写ターミネーターに隣接する。任意の機能性で二方向性の転写ターミネーターを使用して、本発明の構築物に隣接させることができる。例として、遺伝子ＣＹＣ１の転写ターミネーター（Ｔｃｙｃ１）（１９８９年、Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｂ．Ｉ．およびＬ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ．，１９８９によって説明されたもの）ならびに遺伝子ＡＤＨ１のターミネーター（Ｔａｄｈ１）（１９９１年、Ｉｒｎｉｇｅｒ，Ｓ．らによって説明されたもの）を使用することができる。
【００８６】
二方向性転写ターミネーターは、二方向様式で転写を停止させる。これは、第一プロモーターまたは干渉プロモーターにより命じられる転写がこの構築物を越えて拡大することを防止し、およびまた、この構築物の外部に位置する転写活性の起こり得る影響からこの系を保護する。
【００８７】
同じ目的で、（二方向性ターミネーターを得るために、拡散的または集中的な配向で転写を阻止する２つの一方向性ターミネーターを組み合わせることにより）一方向性ターミネーターを二方向で転写を阻止する構造に組み合わせることもできる。一方向性ターミネーターの例としては、次のターミネーターを挙げることができる：Ｔｐｇｋ１（Ｐｉｃａｒｄら、１９９０）、Ｔｔｅｆ（Ａ．ゴシピからのもの）（ＳｔｅｉｎｅｒおよびＰｈｉｌｉｐｐｓｅｎ，１９９４）、Ｔｈｉｓ３（Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）からのもの）（ＷｅｉｓｔｏｃｋおよびＳｔｒａｔｈｅｒｎ，１９９３）。
【００８８】
本発明の干渉プロモーターは、誘導性プロモーターであり、ならびにこの活性化が第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、この結果、レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。
【００８９】
この誘導性プロモーターは、条件付で活性化される。本発明に関連して、誘導プロモーターは、転写因子が活性であるとき、この転写因子によって活性化される。本発明によると、誘導性プロモーターを活性化する転写因子は、２つのキメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤ）の集合体によって形成され、これは、２つのキメラタンパク質 Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの間に相互作用が発生したとき、誘導性プロモーターを活性化することができる活性転写因子を再構成する。
【００９０】
上に明記したように、本発明の細胞は、２つのキメラタンパク質：
−パートナータンパク質Ｘと相互作用することができる、パートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る、第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）、
−このタンパク質Ｙと相互作用することができる、このタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）
を発現し、２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用の結果、干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子が形成される。
【００９１】
従って、第二キメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、誘導性プロモーターの一機能として前記プロモーターのレベルでＤＮＡに連結するように選択される。好ましくは、このキメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、前記プロモーター中に存在する配列（ＤＢＤにより連結されるＤＮＡ配列（ＵＡＳ）（上流活性化配列））と相互作用するように選択される。
【００９２】
この第一キメラタンパク質Ｙ−ＡＤの転写活性化ドメインにより、細胞内での誘導性プロモーターの転写を活性化することができる。例えば、干渉プロモーター（誘導性プロモーター）は、２つのキメラタンパク質 Ｙ−ＡＤおよびＸ−ＤＢＤの集合体（これらの間の相互作用）によって形成された機能性転写因子により誘導され、この機能性転写因子は、このＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を介してこのプロモーターの配列と相互作用し、ならびにこのプロモーターにより支配される転写をこの転写活性ドメイン（ＡＤ）を介して開始させることができる。
【００９３】
これは、まさしくダブル・ハイブリッド法の原理の構成要素であり、当業者は、本発明の実施を可能にする多彩なプロモーター／転写因子対を選択することができる。酵母におけるダブル・ハイブリッド系の現行使用バージョンは、酵母サッカロミセス・セレビジエのタンパク質ＧＡＬ４ｐ（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ，１９８９）およびこのプロモーターＰｇａｌ１の特性を利用している。しかし、記載されている他のダブル・ハイブリッド系、特に、表１に記載されているものも、本発明に関連して使用することができる。
【００９４】
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＡＤ）にそれぞれ融合したパートナータンパク質ＸおよびＹは、（たとえこれがこれらの起源生物における場合でなくても）細胞内で相互作用して誘導性プロモーター、例えば上で定義したもの、を活性化する機能性転写因子（Ｘ−ＤＢＤ／Ｙ−ＡＤ）を結果的に形成する、ＤＢＤおよびＡＤにそれぞれ融合した任意のタンパク質対と定義することができる。これは、完全タンパク質または完全タンパク質のフラグメントの事である。例えば、本発明に関連して、ダブル・ハイブリッドシグナルを発生するキメラタンパク質を使用することができる。すなわち、２つのパートナータンパク質（またはこれらのパートナータンパク質のフラグメント）が、使用される細胞内で、誘導性プロモーターを活性化する機能性転写因子を形成するために十分な親和性で互いに相互作用する、キメラタンパク質［この場合、前記転写因子は、第一キメラタンパク質のＤＮＡにこの結合ドメインを介して結合し、第二キメラタンパク質の転写活性ドメイン（ＡＤ）により前記プロモーターを活性化する。］である。
【００９５】
本発明の細胞は、組み込まれているまたは組み込まれていないベクターに担持された、ＤＮＡ構築物とキメラタンパク質をコードする構築物とを有することができる。被組み込み干渉ＤＮＡ構築物で最良の結果が得られることが、確認された。
【００９６】
好適には、干渉ＤＮＡ構築物は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。レポーターカセットの外側で開始される転写活性の起こり得る影響からこの干渉系を保護するために、この干渉構築物を潜在的摂動性ゲノム転写活性のない遺伝子座にターゲッティングすると有利である。
【００９７】
これを行うために、酵母ｐＲＢ２の新規組み込みベクターを構築した。この組み込みベクターにより、干渉構築物を潜在的摂動性ゲノム転写活性のない遺伝子座にターゲッティングする（図３参照）。
【００９８】
非組み込みベクターに担持された本発明の干渉系が遺伝子的に安定であり、これにより、レポーターカセットが組み込まれた株を構築する必要がなくなることも明らかになった。この特徴は、医薬品のスクリーニングのために非常に興味深い。小分子の透過性を増大させるために、異なる変異を有する非常に多数の株を容易に評価することができるからである。
【００９９】
本発明の主題であるダブル・ハイブリッド系の実現に利用することができる細胞は、上で説明した前記ダブル・ハイブリッド系において必要なキメラタンパク質を発現することができる任意の細胞、および上で説明した干渉ＤＮＡ構築物によって／を用いて形質転換または形質移入することができる任意の細胞から成る。これらの宿主細胞は、真核性または原核性宿主であり、これらは、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、またはさらに好適には酵母細胞であり得る。
【０１００】
好ましい実施形態において、本発明の細胞は、真菌界から選択される。好適には、真菌界の生物は、子嚢菌門から選択され、さらに好ましくは、サッカロミコチナ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門から選択され、さらにいっそう好ましくは、サッカロミセテス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）またはシゾサッカロミセテス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）から選択され、さらにいっそう好ましくは、サッカロミセタレス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目またはシゾサッカロミセタレス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目から選択され、さらにいっそう好ましくは、サッカロミセタセア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）科またはシゾサッカロミセタセア（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）科から選択され、さらにいっそう好ましくは、サッカロミセス属またはシゾサッカロミセス属から選択され；完全に好ましくは、本発明の真菌界の生物は、サッカロミセス・セレビジエ種またはシゾサッカロミセス・ポンベ種に属する。クルイベロミセス・ラクティス種、ピチア・パストリス種、サッカロミセス・カールスベルゲンシス種またはカンジダ・アルビカンス種の酵母も、本発明の範囲内に入る細胞である。
【０１０１】
これまでに説明されている系に反して、本発明のダブル・ハイブリッド系は、毒性または非毒性物質の添加を必要としない。このことは、これらが細胞生理に対して付加的効果をおそらく有するため、およびこれらが一定の逆Ｙ２Ｈ相互作用の検出に干渉することがあるため、有利な要因である。しかし、毒性または非毒性物質の使用は、依然として可能である。例えば、生存に不可欠なレポーター遺伝子、例えば、一次代謝、細胞分裂、タンパク質合成（リボソームなど）、ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成などに不可欠な遺伝子を使用する場合、レポーター遺伝子の生産を阻害する物質の使用は、興味深いはずである。実際、レポーター遺伝子が、転写干渉にもかかわらずなお十分に発現される場合、および細胞の成長の完全な不在が求められる場合、このようなレポーター遺伝子の生産を阻害する物質を使用して、ダブル・ハイブリッド系の感度を増すことができる。従って、例えば、レポーター遺伝子が、遺伝子ＨＩＳ３である場合、干渉酵母（例えば、Ｓ．セレビジエ）株の細胞成長は、ヒスチジンを枯渇させた培地を用いて評価することができる。もしくは、タンパク質ＨＩＳ３ｐの競合阻害剤（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ））を培地に添加して、このレポーター遺伝子ＨＩＳ３の活性のレベルのレベル差を観察してもよい。これによって、より大きな感度を実現することができ、またこの系を検量することができる（実施例６参照）。
【０１０２】
しかし、レポーター遺伝子が、転写干渉にもかかわらずなお十分に発現される場合、および細胞の成長の完全な不在が求められる場合、１つの可能性は、ダブル・ハイブリッド系の感度を増す効果を有する、上で説明した干渉系（ＵＩ、ＤＩ、ｎＤＩ、ＵＤＩおよびｎＵＤＩ）により制御されるまたはされない他のレポーター遺伝子の併用である。これらのレポーター遺伝子の発現の部分的な阻害であっても、これらの効果が加わることにより、成長の完全阻害につながる。従って、例えば、レポーター遺伝子のうちの１つが、遺伝子ＨＩＳ３であり、他のもののうちの１つが、遺伝子ＵＲＡ３であり、これらの両方が干渉系により制御される場合、干渉酵母（例えば、Ｓ．セレビジエ）の成長は、ヒスチジンおよびウラシルを枯渇させた培地を用いて評価することができる。ヒスチジンまたはウラシルを一方だけ枯渇させた培地を用いると、レポーター遺伝子に対する部分的転写干渉を有する酵母は、なお成長することができるが、ウラシルとヒスチジンの両方を枯渇させた培地を用いると、成長を完全に廃止することができる。
【０１０３】
本発明のダブル・ハイブリッド系は、非常に多数の用途を有することができる。例えば、タンパク質間相互作用阻害活性を有する分子の選別に特に適する。
【０１０４】
病理に関与するタンパク質間相互作用の同定は、これらの相互作用が新規医薬品を開発するための潜在的ターゲットを提供するので、非常に興味深い。疾病に関与するタンパク質間相互作用が同定されたならば、複雑な生体系における一方ではこのタンパク質間相互作用の適所を確認するためにこの相互作用を特異的に解離させる利用可能な合成または天然分子を有すること、および医薬品の開発のための利用可能な候補分子を有することは、多くの場合、非常に興味深い（Ｖｉｄａｌ，Ｍ．およびＨ．Ｅｎｄｏｈ，１９９９参照）。
【０１０５】
本発明のダブル・ハイブリッド系は、所与のタンパク質間相互作用の阻害剤スクリーニングのための単純な遺伝子系を提供する。例えば、本発明のダブル・ハイブリッド系では、タンパク質間相互作用を解離させる分子が、レポーター遺伝子の発現を引き起こし、これによりこれらを同定することができる。
【０１０６】
この発現が細胞の生存に必須であるレポーター遺伝子を選択することが、適切である場合もある。例えば、この必須遺伝子の再発現が可能である場合、この結果、細胞の成長を追跡することにより、タンパク質間相互作用を阻害する分子を容易に同定することができる。
【０１０７】
例えば、探索するタンパク質間相互作用の阻害剤スクリーニングは、例えば、相互作用を各阻害剤候補の濃度勾配について評価することができる、寒天での高出力拡散分析（Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．ら、１９９８）で行うことができる。
【０１０８】
従って、本発明は、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害する化合物の同定方法に関し、この方法は、
ａ）上で説明したものなどの細胞を培養する段階、
ｂ）被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下および不在下で比較する段階、
を含み、レポーター遺伝子の発現の増加は、被検化合物が、培養細胞により発現されたタンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であることの指標となる。
【０１０９】
本発明の干渉系のもう１つの用途は、調査するタンパク質間相互作用を特異的に排除するペプチドまたはタンパク質因子を同定するための、ｃＤＮＡバンクおよびペプチドバンクのスクリーニングである（Ｚｕｔｓｈｉ，Ｒ．ら、１９９８）。
【０１１０】
疾病のレベルで関係があるタンパク質間相互作用が、同定および確認されたならば、観察された相互作用の構造および調節を特性付けすることは、興味深い。相互作用しているタンパク質対の各パートナーのレベルでこの相互作用を遮断する変異の同定は、相互作用の構造成分を調査するためばかりでなく、インビボでの機能の特性付けのためのトランスドミナントネガティブ変異体（Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ，Ｉ．Ｇ．ら、２００１）のような遺伝子ツールを作製する手段としても有用である。これは、多数の相互作用パートナーを有するタンパク質には特に重要である。本発明の干渉系は、相互作用を遮断する変異の同定のための変異誘発によるスクリーニングにおいて使用することができる。変異誘発を受けた相互作用パートナーのバンクを作製しなければならず、これらを細胞成長の修復に関して高出力形式でスクリーニングすることができる（Ｇｕｔｈｅｒｉｅ，Ｃ．およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ（編集）、２００２）。このアプローチにより、相互作用のレベルで欠損した変異タンパク質、特にドミナントネガティブ特性を有する変異体、の集合体を迅速に同定することができる。変異体の集合体は、タンパク質間相互作用に関与するタンパク質の表面の限定に役立つこともあり、ならびに構造生物学者が構造と親和性の関係の研究中に阻害剤候補の構造を改善する助けになることもある。
【０１１１】
本発明は、上で説明したものなどのダブル・ハイブリッド系を作るためのキットにも関し、このキットは、
−上で定義したものなどの干渉ＤＮＡ構築物；
−第二ＤＮＡ構築物［これは、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるパートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る、第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）をコードする。］；
−第三ＤＮＡ構築物［これは、このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）をコードする。］；
を含み、前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用が、２つのキメラタンパク質が宿主細胞において発現されたときに干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成を生じさせる。
【０１１２】
上で説明したキットの３つのＤＮＡ構築物は、同じＤＮＡ分子上に存在することがあり、または２つもしくは３つの異なるＤＮＡ分子上に存在することもある。従って、３つの構築物が、同じＤＮＡベクターに担持されていることがあり、または２つもしくは３つの異なるベクター上で見出される。例えば、２つのキメラタンパク質をコードする２つの構築物を同じベクター上で見出すことができるが、３つ目の構築物は、別のベクター上で見出される。
【０１１３】
従って、本発明は、タンパク質間相互作用の遮断を誘導する変異および分子を同定するための単純な遺伝子系の集合体を提供する。本発明は、タンパク質間相互作用を特性付けるために、およびまた新規医薬品の開発のために有用なツールである。
【０１１４】
本発明は、タンパク質Ｙと他の２つのタンパク質ＸおよびＺとの相互作用の場合、ならびにＹとＸの間の相互作用を阻害するが、ＹとＺの間の相互作用を阻害しない分子を同定したい場合に非常に有用であると立証することもできる。このような選択を可能にする細胞は、例えば、図７にある遺伝子構築物を有し、ならびに図７に表されているもののような少なくとも３つのキメラタンパク質をさらに発現する。タンパク質Ｙがもう１つのタンパク質Ｚとも相互作用する場合、これらの細胞によってタンパク質Ｘとタンパク質Ｙの間の相互作用の特異的阻害剤を同定することができる。
【０１１５】
本発明は、ＤＮＡ構築物、いわゆる干渉構築物、を含有する細胞にも関し、
前記構築物は、
−第一誘導性プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
−１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター、いわゆる干渉プロモーター[この（これらの）干渉プロモーター活性化は前記第一誘導性プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、その結果前記レポーター遺伝子の発現が誘導されたときに前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。]、
を含み、
前記細胞は、
−２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互することができる、タンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る、第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）、
−このタンパク質Ｙと相互作用することができる、タンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）、
［前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤとＹ−ＡＤの相互作用の結果、前記干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子が形成される。］、
−このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合した、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）
［前記２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤとＹ−ＡＤの相互作用の結果、前記レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子が形成される。］
をさらに発現する。
【０１１６】
第一の実施形態において、本発明の細胞は、レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物（干渉構築物）により形質転換または形質移入された宿主細胞であり、これらは、３つのキメラタンパク質の各々をコードする３つのＤＮＡ構築物によっても形質転換または形質移入される。これら４つの構築物は、同じＤＮＡベクターに担持されていることがあり、または２つもしくは３つの異なるベクター上で見出される。すべての組み合わせが考えられる：同じベクター上に４つの構築物；４つの異なるベクター上に４つの構築物；同じベクター上に３つのキメラタンパク質をコードする３つの構築物、しかし４つ目の構築物（干渉構築物）は、別のベクター上で見出される；同じベクター上に３つのキメラタンパク質のうちの１つをコードする構築物と干渉構築物、しかし、他の２つのキメラタンパク質をコードする構築物は別のベクター上で見出される、など。この第一の実施形態におけるベクターは、非組み込みベクターである。
【０１１７】
第二の実施形態において、干渉構築物は、細胞のゲノムに組み込まれており、これらの細胞は、３つのキメラタンパク質の各々をコードする３つのＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入される。これらのキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、同じＤＮＡベクターに担持されていることがあり、または異なるベクター上で見出され、このまたはこれらのベクターは、非組み込みベクターである。
【０１１８】
本発明の第三の実施形態において、干渉構築物ならびにキメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、細胞のゲノムに組み込まれている。３つのキメラタンパク質のうちの１つまたは２つをコードする３つの構築物のうちの１つまたは２つだけが、ゲノムに組み込まれているという場合もあり、ならびに構築物（単数または複数）は、非組み込みベクターに担持されていることもあるが、干渉構築物は、ゲノムに組み込まれているという場合もある。最後に、最後の実施形態において、干渉構築物、および３つのキメラタンパク質のうちの１つまたは２つをコードする１つまたは２つの構築物は、非組み込みベクターに担持されているが、３つ目のキメラタンパク質をコードする構築物は、細胞のゲノムに組み込まれている。
【０１１９】
レポーター遺伝子は、上で定義したものなどである。レポーター遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下に置かれている。好ましくは、レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有するタンパク質と相互作用することができる配列（ＤＢＤにより結合されるＤＮＡ配列（ＵＡＳ））を含む。さらに詳細には、レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターは、キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含む。
【０１２０】
プロモーター、いわゆる「干渉プロモーター」、も誘導性プロモーターである。この誘導性プロモーターは、これらの活性化が、第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、この結果、レポーター遺伝子の発現が誘導されたときにこのレポーター遺伝子の発現の検出可能な減少を導く。
【０１２１】
利用することができる干渉プロモーターは、上で定義したものなどの誘導性プロモーターである。好ましくは、利用することができる干渉プロモーターは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有するタンパク質と相互作用することができる配列（ＤＢＤにより結合されるＤＮＡ配列（ＵＡＳ））を含む。より詳細には、この誘導性干渉プロモーターは、キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含む。
【０１２２】
干渉プロモーターは、上で説明したように配置することができる。例えば、これらは、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に配置することができ、こういうわけで、これは下流干渉の事である。干渉プロモーターは、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に配置することもできる。こういうわけで、これは、上流干渉の事である。
【０１２３】
しかし、下流干渉に関連して、干渉プロモーターは、２つの可能な配向を有することができる。第一の配向は、第一プロモーターに対して集束的な配向に相当し、この構造は、下流干渉（またはＤＩ）と呼ばれる。干渉プロモーターは、第一プロモーターに対して対状の配向を有することもあり、この第二の構造は、ナンセンス下流干渉（またはｎＤＩ）と呼ばれている。
【０１２４】
干渉プロモーターは、第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に配置することもできる。この時、干渉プロモーターは、第一プロモーターと同一の配向を有する（従って、これら２つのプロモーターは、対状の構造を有する）。この構造は、上流干渉（またはＵＩ）と呼ばれている。
【０１２５】
もう１つの可能な構造は、上で説明した２つの構造の組み合わせ（ＵＩおよびＤＩ系）である。この場合、少なくとも１つの（誘導性）干渉プロモーターが、第一誘導性プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置される。この時、上流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに下流に位置する第一プロモーターの活性に干渉し、下流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに上流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、上流−下流干渉の事である。
【０１２６】
第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターに対して集中的な配向を有する（上記ＤＩ系参照）。第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターのものと同一の配向を有する（従って、これら２つのプロモーターは、対状の構造を有する）（上記ＵＩ系参照）。
【０１２７】
この構造は、上流−下流干渉（またはＵＤＩ）と呼ばれている。
【０１２８】
もう１つの可能な構造は、上で説明した２つの構造の組み合わせ（ＵＩおよびｎＤＩ系）である。この場合、少なくとも１つの誘導性干渉プロモーターが、第一誘導性プロモーターおよびレポーター遺伝子の両側に配置される。この時、上流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに下流に位置する第一プロモーターの活性に干渉し、下流に位置する干渉プロモーターの活性化が、さらに上流に位置する第一プロモーターの活性に干渉するため、これは、上流−下流干渉の事である。
【０１２９】
第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターに対して対状の配向を有する（上記ｎＤＩ系参照）。第一プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流に位置する干渉プロモーターは、この第一プロモーターのものと同一の配向を有し（上記ＵＩ系参照）、従って、これら３つのプロモーターは、対状の構造を有する。
【０１３０】
この構造は、ナンセンス上流−下流干渉（またはｎＵＤＩ）と呼ばれている。
【０１３１】
ＵＩ、ＵＤＩおよびｎＵＤＩタイプの構築物の場合、上で説明したように、好適には、短いオープンリーディングフレーム、これに続く１つまたはそれ以上（例えば２つまたは３つ）の停止コドンが、干渉プロモーターと第一プロモーターの間に挿入される。
【０１３２】
好適には、干渉構築物は、これらの末端で、上で説明したものなどの二方向性転写ターミネーターに隣接する。
【０１３３】
この干渉プロモーターは、条件付で活性化される誘導性プロモーターである。本発明に関連して、これは、転写因子が活性であるときにこの転写因子によって活性化される。本発明によると、誘導性プロモーターを活性化する転写因子は、２つのキメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤ）の集合体によって形成され、これは、これら２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの間に相互作用が発生したときにこの誘導性プロモーターを活性化することができる活性転写因子を再構成する。
【０１３４】
上で明記したように、本発明のこの特定の実施形態における細胞は、３つのキメラタンパク質を発現する。従って、これらは、
−２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができる、パートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る、第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）、
−このタンパク質Ｙと相互作用することができる、タンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）、
を発現し、前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用の結果、干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子が形成され、
−発現された第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）は、このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合した、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成り、上記２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用の結果、レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子が形成される。
【０１３５】
第二キメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、干渉プロモーターの一機能として前記プロモーターのレベルでＤＮＡに結合するように選択される。好ましくは、この第二キメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、前記プロモーター中に存在する配列（ＤＢＤによって見出されるＤＮＡ配列（ＵＡＳ）（上流活性化配列））と相互作用するように選択される。この誘導性干渉プロモーターは、キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含む。
【０１３６】
第一キメラタンパク質の転写活性化ドメイン（Ｙ−ＡＤのドメインＡＤ）は、細胞内での干渉プロモーターの転写を活性化することができる。従って、前記干渉プロモーター（誘導性プロモーター）は、互いに相互作用する２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤによって形成された機能性転写因子により誘導される。この機能性転写因子は、このＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を介して干渉プロモーターの配列と相互作用し、ならびにこの転写活性化ドメイン（ＡＤ）を介してこのプロモーターにより支配される転写を開始させることができる。
【０１３７】
上で明記したように、これは、まさしくダブル・ハイブリッド法の原理の構成要素であり、当業者は、本発明の実施を可能にする多彩なプロモーター／転写因子対を選択することができる。
【０１３８】
第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターの一機能として、前記プロモーターのレベルでＤＮＡに結合するように選択される。好ましくは、キメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーター中に存在する配列（ＤＢＤによって結合されるＤＮＡ配列（ＵＡＳ）（上流活性化配列））と相互作用するように選択される。
【０１３９】
レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターと干渉プロモーターは、異なるプロモーターである。特に、レポーター遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターは、キメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤに結合しないように選択される（従って、このプロモーターは、Ｘ−ＤＢＤのＤＢＤによって結合される任意のＤＮＡ配列（ＵＡＳ）（上流活性化配列）を含有しない。）。加えて、誘導性干渉プロモーターは、キメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤに結合しないように選択される（従って、このプロモーターは、Ｚ−ＤＢＤのＤＢＤによって結合される任意のＤＮＡ配列（ＵＡＳ）（上流活性化配列）を含有しない。）。
【０１４０】
第一キメラタンパク質の転写活性化ドメイン（Ｙ−ＡＤのドメインＡＤ）は、細胞内でのレポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターの転写を活性化することができる。従って、このレポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターは、互いに相互作用する２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤによって形成された機能性転写因子によって誘導される。この機能性転写因子は、このＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を介して、レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターの配列と相互作用し、ならびにこの転写活性化ドメイン（ＡＤ）を介して、このプロモーターにより支配される転写を開始させることができる。
【０１４１】
上で明記したように、これは、まさしくダブル・ハイブリッド法の原理を構成し、当業者は、本発明の実施を可能にする多彩なプロモーター／転写因子対を選択することができる。
【０１４２】
従って、タンパク質ＹとＸの間の相互作用の場合、干渉プロモーターを活性化し、これによりレポーター遺伝子の転写への干渉を導く。ＹとＸの間の相互作用を（例えば、ＹとＸの間の相互作用を阻害するキメラ阻害剤の作用により）摂動させると、干渉プロモーターは、あまり活性化しないかまったく活性化せず、従って、レポーター遺伝子の発現減少を招く。
【０１４３】
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および転写活性化ドメイン（ＡＤ）に融合するパートナータンパク質Ｘ、ＹおよびＺは、ＹとＸの間およびＺとＹの間に相互作用が存在する任意のタンパク質群であって、ＹがＡＤおよびＺに融合しており、Ｘが異なるＤＢＤに融合しているとき、（たとえこれがこれらの起源生物における場合でなくても）細胞内で相互作用して誘導性プロモーター、例えば上で定義したもの、を活性化する２つの機能性転写因子（それぞれ、Ｘ−ＤＢＤ／Ｙ−ＡＤおよびＺ−ＤＢＤ／Ｙ−ＡＤ）の形成をもたらす任意のタンパク質群と、定義することができる。これらは、完全タンパク質である場合もあり、または完全タンパク質のフラグメントである場合もある。このように、ダブル・ハイブリッドシグナルを生じさせるキメラタンパク質を、本発明に関連して使用することができる。すなわち、２つのパートナータンパク質（またはこれらのパートナータンパク質のフラグメント）が、使用される細胞内で、誘導性プロモーターを活性化する機能性転写因子を形成するために十分な親和性で互いに相互作用する、キメラタンパク質［この場合、前記転写因子は、第一キメラタンパク質のＤＮＡにこの結合ドメインを介して結合し、ならびに第二キメラタンパク質の転写活性ドメイン（ＡＤ）によって前記プロモーターを活性化する］である。
【０１４４】
干渉ＤＮＡ構築物が、宿主細胞のゲノムに組み込まれているとき、上で説明したように、この構築物は潜在的摂動性ゲノム転写活性のない遺伝子座を標的にすると有利である。
【０１４５】
本発明のこの実施形態（３つのキメラタンパク質）に関連して使用することができる細胞は、上で説明したものである。
【０１４６】
上に明記したように、本発明のダブル・ハイブリッド系は、非常に多数の用途を有することができる。例えば、タンパク質間相互作用に対する阻害活性を有する分子のスクリーニングに特に適する。３つのキメラタンパク質での本発明の実施形態に関連して、タンパク質ＹとＸの間の相互作用を阻害するが、ＹとＺの間の相互作用を阻害しない分子の同定に関して言えば、上で説明した細胞は特に興味深い。例えば、これらの細胞では、ＹとＸの間のタンパク質間相互作用を解離させる分子がレポーター遺伝子の発現を引き起こし、これによりこれらを同定することができる。
【０１４７】
従って、本発明は、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害するが、このタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの相互作用はまったく阻害しないか、あまり阻害しない化合物を同定するための方法にも関し、この方法は、
ａ）上で定義したもの（三キメラタンパク質実施形態）などの細胞を培養する段階、
ｂ）被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下と不在下で比較する段階
を含み、この場合、レポーター遺伝子の発現の増加は、被検化合物が、タンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であること、しかし、この生成物が、タンパク質Ｙとタンパク質Ｚの間の相互作用をまったく阻害しないか、あまり阻害しないことの指標となる。
【０１４８】
三キメラタンパク質相互作用系のもう１つの用途は、調査するタンパク質Ｘとタンパク質Ｙの間の相互作用を特異的に排除する（Ｚｕｔｓｈｉ，Ｒ．ら、１９９８）が、タンパク質Ｘとタンパク質Ｚの間の相互作用には影響を及ぼさないペプチドまたはタンパク質因子を同定するための、ｃＤＮＡバンクおよびペプチドバンクのスクリーニングである。
【０１４９】
もう１つの用途は、タンパク質Ｙとタンパク質Ｘの間の相互作用を遮断するが、タンパク質Ｙとタンパク質Ｚの間の相互作用には影響を及ぼさない、タンパク質Ｙの変異の同定である。これは、特定の相互作用の構造成分を調査するためばかりでなく、インビボでの機能の特性付けのためのトランスドミナントネガティブ変異体（Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ，Ｉ．Ｇ．ら、２００１）のような遺伝子ツールを作製する手段としても有用である（上記参照）。
【０１５０】
本発明は、上で説明したものなどのダブル・ハイブリッド系を作るためのキットにも関し、このキットは、
−上で定義したＤＮＡ構築物；
−第二ＤＮＡ構築物（これは、２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができる、パートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る、第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）をコードする。）；
−第三ＤＮＡ構築物（これは、このタンパク質Ｙと相互作用することができる、タンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）をコードする。）；
［前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。］
−第四ＤＮＡ構築物（これは、このタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合した、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る、第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）をコードする。）；
［前記２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。］
を含む。
【０１５１】
上で説明したキットの４つのＤＮＡ構築物は、同じＤＮＡ分子内に存在する場合もあり、または２つ、３つもしくは４つの異なるＤＮＡ分子上に存在する場合もある。従って、これら４つの構築物は、同じＤＮＡベクターに担持されている場合があり、または２つ、３つもしくは４つの異なるベクター上で見出される。例えば、３つのキメラタンパク質をコードする３つの構築物を同じベクター上で見出すことができるが、４つ目の構築物は、別のベクター上で見出される。
【０１５２】
本発明は、タンパク質間相互作用の特性付けのために有用なツールであるが、新規医薬品の開発に有用なツールでもある。
【０１５３】
図面への手がかり
図１：転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系。
逆Ｙ２Ｈ相互作用の検出のための転写干渉の適用を図解する略図。
Ｙ２Ｈ相互作用が不在の状態では、レポーター遺伝子ＨＩＳ３は、正常に発現され、細胞は、ヒスチジンを含有しない培地で成長することができる（図１Ａ）。Ｙ２Ｈ相互作用の存在は、ＨＩＳ３の転写レベルを低下させ、これに起因して、ヒスチジンについて栄養要求のレポーター株の細胞成長が減少する（図１Ｂ）。ＨＩＳ３のＯＲＦは、淡色の長方形によって表し、小さな黒い矢印が開始コドンの位置を指定している。ＨＩＳ３のＯＲＦの上の灰色の矢印は、Ｐａｄｈ１のレベルで開始される転写を表すのに対し、黒矢印は、Ｐｇａｌ１の転写を表す。矢印の濃さは、プロモーターの転写活性を象徴している。矢印は、転写の方向を指している。ＧＡＬ４−ＤＢＤ（Ｘ−ＤＢＤ）およびＧＡＬ４−ＡＤ（Ｙ−ＡＤ）のために用いた相互作用しているタンパク質ＸおよびＹを卵形で示す。Ｐａｄｈ１：ＡＤＨ１プロモーター；Ｐｇａｌ１：ＧＡＬ１プロモーター；ＨＩＳ３：ＨＩＳ３のＯＲＦ；ＤＩ：下流干渉；ＵＩ：上流干渉。縮尺に従わずに示した図。
【０１５４】
図２：転写干渉構築物。
転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。制限部位ＳａｌＩおよびＳａｃＩ、ならびに対応するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター上でのこれらの位置を指摘する。例示するプラスミドの名前（実施例４および表２参照）を示す。略語：Ｐａｄｈ１：ＡＤＨ１プロモーター；Ｐｇａｌ１：ＧＡＬ１プロモーター；ＨＩＳ３：ＨＩＳ３のＯＲＦ；Ｔａｄｈ１：ＡＤＨ１ターミネーター；Ｔｃｙｃ１：ＣＹＣ１ターミネーター；ＯＲＦ：２つの停止コドンに続くオープンリーディングフレーム；ＤＩ：下流干渉（２Ａ）；ＵＩ：上流干渉（２Ｂ）；ＵＤＩ：上流−下流干渉（２Ｃ）；ｎＤＩ：ナンセンス下流干渉（２Ｄ）；ｎＵＩ：ナンセンス上流干渉（２Ｅ）。
【０１５５】
図３：干渉構築物のゲノム組み込み。
転写干渉構築物のゲノム組み込みを図解する例。ｐＲＢ１７のフラグメントＳａｌＩ−ＳａｃＩをｐＲＢ２に挿入することにより、組み込みベクターｐＲＢ２３を構築した。この後、ｐＲＢ２３を使用してターゲット株ｙＣＭ１５を形質転換し、ここにｐＲＢ２３を相同組換えにより遺伝子座ＵＲＡ３のレベルで組み込む。ＵＲＡ３の遺伝子座（ＵＲＡ３の上流／下流）での相同ベクター配列をハッチングして示す。ＵＲＡ３の遺伝子に隣接するＯＲＦ（ＧＥＡ２、ＴＩＭ９およびＲＰＲ）を示し、モデル欠失ｕｒａ３Ｄ０を指摘する（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ，Ｃ．Ｂ．ら、１９９８）。略語：Ｐａｄｈ１：ＡＤＨ１プロモーター；Ｐｇａｌ１：ＧＡＬ１プロモーター；ＨＩＳ３：ＨＩＳ３のＯＲＦ；Ｔａｄｈ１：ＡＤＨ１ターミネーター；Ｔｃｙｃ１：ＣＹＣ１ターミネーター；３ＨＡ：ｐＲＢ２上のコード化タグ配列；Ｐｔｅｆ：ＴＥＦプロモーター；Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８への耐性をコードするＯＲＦ；ａｍｐＲ：アンピシリン耐性遺伝子。
【０１５６】
図４：被組み込み干渉系の機能評価。
組み込まれた干渉系コピーを有する株（ｙＲＢ４８（ＤＩ）、ｙＲＢ４９（ＵＩ）、ｙＲＢ５０（ｎＵＩ）、ｙＲＢ８３（ＵＤＩ）およびｙＲＢ８２（ｎＤＩ））を、プラスミドｐＣＬ１／ｐＦＬ３９（＋）およびｐＴＡＬ２０／ｐＤＢＴ（−）の系列でそれぞれ形質転換し、これらの形質転換体の細胞成長を、完全培地（図４Ａ）またはヒスチジンを枯渇させた培地（図４ＢからＥ）で、滴下評価（ｄｒｏｐ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）法により試験する。各形質転換体について１０倍稀釈系列を調製する。場合によっては、タンパク質ＨＩＳ３ｐの競合阻害剤（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ））を示す漸増濃度（０ｍＭから２２ｍＭ）で培地に添加する（図４ＢからＥ）。略語：ＤＩ：下流干渉株；ＵＩ：上流干渉株；ｎＤＩ：ナンセンス下流干渉株；ｎＵＩ：ナンセンス上流干渉株；ＵＤＩ：上流−下流干渉株。
【０１５７】
図５：プラスミドに基づく干渉系の機能評価（ゲノムレベルで組み込まれていないもの）：
株ｙＣＭ１５を、プラスミドに基づくバージョンの干渉系（ｐＲＢ２０（ＤＩ）、ｐＲＢ２１（ＵＩ）またはｐＲＢ２８（ＵＤＩ））ならびにプラスミドｐＣＬ１／ｐＦＬ３９（＋）およびｐＴＡＬ２０／ｐＤＢＴ（−）の系列でそれぞれ独立して共形質転換する。これらの三重形質転換体の各々の細胞成長を、ヒスチジンを含有する（図５Ａ）および含有しない（図５ＢからＤ）寒天プレート、ヒスチジンを含有しないプレートについては、漸増濃度（０ｍＭから１６ｍＭ）の３−ＡＴを含有するまたは含有しない寒天プレートで試験する（図５ＢからＤ）。１０倍稀釈系列を調製し、各形質転換株について２つの独立したクローンを評価する。略語：ＤＩ：下流干渉プラスミド；ＵＩ：上流干渉プラスミド；ＵＤＩ：上流−下流干渉プラスミド。
【０１５８】
図６：
Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉：
図６Ａおよび図６Ｂ：タンパク質Ｆｅ６５とＡｐｐおよびｐ５３とｍｄｍ２の間で以前に同定されたタンパク質間相互作用は、酵母の細胞成長を阻害するように十分に転写干渉構築物を誘導する。
【０１５９】
先ず、これらの構築物の活性を検証する（図６Ａおよび６Ｆ）。これを行うために、レポーター株Ｙ１８７を次のプラスミド対によって形質転換する：ｐＲＢ３４＋ｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ）、ｐＲＢ３４＋ｐＤＢＴ（Ｆｅ６５／ＤＢＤ）およびｐＴＡＬ２０＋ｐＲＢ３５（ＡＤ／Ａｐｐ）（図６Ａ）ならびにｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ（ｐ５３／ｍｄｍ２）、ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ＋ｐＤＢＴ（ｐ５３／ＤＢＤ）およびｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２（ＡＤ／ｍｄｍ２）（図６Ｆ）。これらの各形質転換体の２つのクローンをウラシルを含有するおよび含有しない最小培地で培養する（図６Ａおよび６Ｆ）。
【０１６０】
この後、株ｙＲＢ４８（系ＤＩ）およびｙＲＢ４９（系ＵＩ）を、各々、プラスミド対 ｐＲＢ３４（Ｆｅ６５）およびｐＲＢ３５（Ａｐｐ）によって共形質転換して、２つのハイブリッドタンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５およびＤＢＤ−ＡｐｐＣｔを発現させる。対照として、株ｙＲＢ４８（系ＤＩ）およびｙＲＢ４９（系ＵＩ）を、各々、プラスミド対 ｐＲＢ３４＋ｐＤＢＴ（Ｆｅ６５／ＤＢＤ）およびｐＴＡＬ２０＋ｐＲＢ３５（ＡＤ／Ａｐｐ）によっても共形質転換する。
【０１６１】
各二重形質転換体の２つのクローンの細胞成長を、ヒスチジンを含有するおよび含有しない寒天プレート、ヒスチジンを含有しないプレートについては、漸増濃度の３−ＡＴを含有するまたは含有しない寒天プレートで試験する（図６Ｂから６Ｅ）。株ｙＲＢ４９（系ＵＩ）は、プラスミド対ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ（ｐ５３／ｍｄｍ２）によっても共形質転換して、２つのハイブリッドタンパク質ＤＢＤ−ｍｄｍ２およびＶＰ１６−ｐ５３（１−５５）を発現させる。株ｙＲＢ４９（系ＵＩ）は、対照として、プラスミド対ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＴＡＬ２０（ＡＤ／ｍｄｍ２）によっても共形質転換する。２つのプラスミドにより共形質転換された２つのクローンを、これらの２つのプラスミド対の各々について選択する。
【０１６２】
これらの二重形質転換体の２つのクローン各々の細胞成長を、ヒスチジンを含有するおよび含有しない寒天プレート、ヒスチジンを含有しないプレートについては、図に示されているように、漸増濃度の３−ＡＴを含有するまたは含有しない寒天プレートで試験する。
【０１６３】
図７：２つのタンパク質ＹとＸの間の相互作用を阻害するがこのタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用は阻害しない分子を同定することができる、本発明の転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系
２つのタンパク質ＹとＸの間の相互作用を阻害するがこのタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用は阻害しない分子を同定することができる逆Ｙ２Ｈ相互作用を検出するための転写干渉の適用を図解する略図。タンパク質ＸとＹの間の相互作用Ｙ２Ｈが不在の状態では、レポーター遺伝子ＨＩＳ３は、正常に発現され、これらの細胞は、ヒスチジンを含有しない培地で成長することができる（図７Ａ）。これは、タンパク質Ｘとパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤が存在するケースである。Ｘ−ＤＢＤとＹ−ＡＤの間のＹ２Ｈ相互作用の存在は、ＨＩＳ３の転写レベルを低下させ、これに起因して、ヒスチジンについて栄養要求性のレポーター株の細胞成長が減少する（図７Ｂ）。ＨＩＳ３のＯＲＦは、淡色の長方形によって表し、小さな黒い矢印が開始コドンの位置を指定している。ＨＩＳ３のＯＲＦの上の灰色の矢印は、Ｐｌｅｘのレベルで開始された転写を表すのに対し、黒矢印は、Ｐｇａｌ１の転写を示す。矢印の濃さは、プロモーターの転写活性を象徴している。矢印は、転写の方向を指している。用いた相互作用しているタンパク質Ｘ／ＹおよびＺ／Ｙを卵形で示す。Ｐｌｅｘ：ＬｅｘＡプロモーター；Ｐｇａｌ１：ＧＡＬ１プロモーター；ＨＩＳ３：ＨＩＳ３のＯＲＦ；縮尺に従わずに示した図。
【０１６４】
図８：
Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤を選別するための実験条件の決定
【０１６５】
図８Ａ：細胞量の決定：
ＵＩ転写干渉系を含有する株（ｙＲＢ４９）を、プラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）で共形質転換した。この形質転換株の培養物を、ＯＤ＝０．１および０．０１に稀釈し、各稀釈物の１０ｍＬを、ヒスチジンを補足した（＋ＨＩＳ）培地に平板接種した。これらの皿を３０℃で４８時間、保温した。
【０１６６】
図８Ｂ：３−ＡＴの濃度の決定
プラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）でまたは対照プラスミドｐＴＡＬ２０およびｐＤＢＴ（ＡＤ／ＤＢＤ）で共形質転換した転写干渉系（ｙＲＢ４９）を含有する株を、ヒスチジンを含有し、３−ＡＴを含有しない培地、ヒスチジンを含有せず、３−ＡＴを含有しない培地、およびヒスチジンを含有し、０．５ｍＭまたは１ｍＭの３−ＡＴを含有する培地に平板接種した。この後、１００％ＤＭＳＯ（１μＬ）、ＤＭＳＯ中１０ｍＭの分子ｘの溶液（１μＬ）、およびＤＭＳＯ中１０ｍＭの分子ｙの溶液（１μＬ）を各皿に堆積させた。これらの皿を３０℃で４８時間、保温した。
【０１６７】
図８Ｃ：ヒスチジンによる成長の修復
ＵＩ干渉系（ｙＲＢ４９）を含有し、プラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）で共形質転換した株を、ヒスチジンを含有し、１ｍＭの３−ＡＴを含有する培地に平板接種した。０．１２５％、０．２５％、０．５％もしくは１％の、ウラシル（Ｕ）（１μＬ）、アデニン（Ａ）（１μＬ）、リシン（Ｋ）（１μＬ）またはヒスチジン（Ｈ）（１μＬ）を、各皿の中央に堆積させた。これらの皿を３０℃で４８時間、保温した。
【０１６８】
図９：成長の修復によるＦｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤の検出
ＵＩ転写干渉系（ｙＲＢ４９）を含有し、プラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）で共形質転換した株を、ヒスチジンを含有せず、１ｍＭの３−ＡＴを含有する培地に平板接種した。Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の推定的阻害剤である分子１の１０ｍＭ溶液（１μＬ）、Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の推定的阻害剤である分子２の１０ｍＭ溶液（１ｕＬ）、およびＦｅ６５／Ａｐｐ相互作用に対して不活性である分子３の１０ｍＭ溶液（１μＬ）をこの皿に堆積させた。これらの皿を３０℃で４８時間、保温した。
【０１６９】
図１０：干渉系の活性化についてのＦｅ６５／Ａｐｐとｐ５３／ＭＤＭ２相互作用の比較
ＵＩ転写干渉系を含有する株（ｙＲＢ４９）を、プラスミド対ｐＲＢ３４とｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）、ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２とｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ（ｍｄｍ２／ｐ５３相互作用）、またはｐＴＡＬ２０とｐＤＢＴ（対照）で共形質転換した。各形質転換体につき２つの独立したクローンを培養した。３０℃で一晩保温した後、すべての培養物を同じＯＤにした。各培養物の１０倍系列稀釈を行い、各稀釈溶液の１滴を、ヒスチジンを含有せず、様々な濃度（１から３２ｍＭ）の３−ＡＴを補足した培地に堆積させた。これらの皿を３０℃で４８時間保温した。
【０１７０】
図１１：Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤の特異性の確認
ＵＩ転写干渉系を含有する株（ｙＲＢ４９）を、プラスミド対ｐＲＢ３４とｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）またはｐＤＢＴ−ｍｄｍ２とｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ（ｍｄｍ２／ｐ５３相互作用）で共形質転換した。プラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）を含有する株を、１ｍＭの３−ＡＴを補足した、ヒスチジンを含有しない培地の５つの皿に平板接種し（上の行）、プラスミドｐＤＢＴ−ｍｄｍ２およびｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ（ｍｄｍ２／ｐ５３相互作用）を含有する株を、２０ｍＭの３−ＡＴを補足した、ヒスチジンを含有しない培地の５つの皿に、同様に平板接種した（下の行）。
【０１７１】
対照皿は、１μＬのヒスチジンを０．１２５％ ｗ／ｖでこの皿の中央に堆積させることにより、各相互作用について調製した。異なる分子Ａ、Ｂ、ＣまたはＤを、次の計画に従って、他の４つの皿の各々に置いた：左上の角に、０．１ｍＭの濃度の生成物（１μＬ）を堆積する；右上の角に、１ｍＭの濃度の同生成物（１μＬ）を堆積させる；中央に、１０ｍＭのこの生成物（１μＬ）を堆積させる。これらの皿を３０℃で４８時間保温した。
【０１７２】
後続の実施例を利用して本発明を例示する。これらの実施例は、実例となるもの、非限定的なものと解釈しなければならない。
【０１７３】
後続の実施例において用いる分子生物学の技法は、分子生物学の標準的なプロトコルに相当し、これらは（Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．ら、１９８９）により説明されている。高忠実度ＰＣＲ系（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、ドイツ、ＰｅｎｚｂｅｒｇのＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の使用により、ＤＮＡ配列を増幅した。
【実施例１】
【０１７４】
プラスミドｐＲＢＶの構築：
遺伝子ＡＤＨ１の完全構成的プロモーターに対応する７６１ｂｐのフラグメントを、プライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ４３ ５’−ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＧＧ−３’（配列番号１）およびＲＢ４４ ５’−ＡＡＡＡＡＣＧＣＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣ −３’（配列番号２）（制限部位ＸｂａＩおよびＭｌｕＩに下線を引く）およびゲノムＤＮＡマトリックスとしてＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株ＦＬ１００（特に、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ（米国、バージニア州、マナッサス）から番号２８３８３で入手できる。）を使用することにより、ＰＣＲによって作製する。
【０１７５】
リン酸化１本鎖オリゴヌクレオチド：配列 ５’−ＣＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣ−３’（配列番号３）のＲＢ７５および配列 ５’−ＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＣＣＡ−３’（配列番号４）のＲＢ７６、をハイブリド形成させて、相和性付着末端ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩをそれぞれ末端に有する２本鎖連結アーム（リンカー）を得る。これを行うために、前記２つの１本鎖オリゴヌクレオチドを水中、等モル濃度で混合する。この混合物を加熱ブロック（ヒートブロック）において５分間、９０℃に加熱し、この後、このブロックを（約２時間）放置して周囲温度に冷却する。
【０１７６】
ベクターｐＲＢ３を構築するために、ＰＣＲによって得られた７６１ｂｐのフラグメント（フラグメントＰａｄｈ１）を、先ず最初に、制限酵素ＸｂａＩおよびＭｌｕＩによって消化する。このようにして消化したフラグメントを、この後、事前にＸｂａＩ−ＮｏｔＩによって消化したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国、カリフォルニア州、ラホーヤ）により市販されているもの）に、リンカーと共に挿入する。このようにして得たプラスミドをｐＲＢ３を呼ぶ。
【０１７７】
次に、遺伝子ＨＩＳ３のオープンリーディングフレームに対応する６６０ｂｐのフラグメントを、マトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ４５ ５’−ＡＡＡＡＡＣＧＣＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＡＧ−３’（配列番号５）およびＲＢ４６ ５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＴＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＧ−３’（配列番号６）（部位Ｍｌｕ１、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩに下線を引く）、を使用することにより、ＰＣＲによって増幅させる。このフラグメントを制限酵素ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩによって消化し、事前に制限酵素ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩによって線形化したベクターｐＲＢ３にクローニングした。このようにして得たベクターをｐＲＢ４と呼んだ。
【０１７８】
次に、遺伝子ＡＤＨ１のターミネーター（Ｔａｄｈ１）をコードする２０３ｂｐのＰＣＲフラグメントを、マトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ５１ ５’−ＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＡＡＴＴＣＣＧＧＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴ−３’（配列番号７）およびＲＢ５２ ５’−ＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣＣＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧ−３’（配列番号８）（部位ＡｓｃＩおよびＳａｃＩに下線を引く）、を使用することにより、ＰＣＲによって増幅させる。得られたフラグメントを制限酵素ＡｓｃＩおよびＳａｃＩによって消化し、これを、事前に酵素ＡｓｃＩおよびＳａｃＩによって消化したベクターｐＲＢ４に挿入する。このようにして得たプラスミドをｐＲＢ５と呼ぶ。
【０１７９】
遺伝子ＣＹＣ１のターミネーター（Ｔｃｙｃ１）をコードする８８ｂｐのフラグメントを、配列：５’−ＣＧＡＴＣＧＣＧＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＣＡＴＡＡＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＧＧＧＡＣＣＧ−３’（配列番号９）のＲＰ９８および配列：５’−ＡＡＴＴＣＧＧＴＣＣＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＴＧＴＴＡＧＴＡＴＴＡＡＧＡＡＣＧＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＡＡＣＧＣＧＡＴ−３’（配列番号１０）のＲＢ９９の２つのリン酸化１本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリド形成によって得る。これを行うために、これら２つの１本鎖オリゴヌクレオチドを水中、等モルで混合する。この混合物を加熱ブロック（ヒートブロック）において５分間、９０℃に加熱し、この後、このブロックを（約２時間）放置して、室温に冷却する。このようにして得た２本鎖フラグメントは、相和性付着末端ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩをそれぞれこの末端に有する。これにより、この２本鎖フラグメント（ターミネーターＴｃｙｃ１に対応する。）を、事前に酵素ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩによって消化した、上で説明したベクターｐＲＢ５に挿入することができる。このようにして得たベクターをｐＲＢＶと呼ぶ。
【０１８０】
この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【実施例２】
【０１８１】
転写干渉系の構築
２．１ 下流干渉ベクターｐＲＢ１７およびナンセンス下流干渉ベクターｐＲＢ１６の構築：
下流干渉ベクターｐＲＢ１７（ＤＩとも呼ばれる）およびナンセンス下流干渉ベクターｐＲＢ１６（ｎＤＩとも呼ばれる）を、プロモーターＰｇａｌ１に対応する５４９ｂｐのＰＣＲのフラグメントをベクターｐＲＢＶ（実施例１参照）に挿入することによって得る。
【０１８２】
このＰＣＲフラグメントは、マトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ４９ ５’−ＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＴＡＡＡＧＡＧＣＣＣＣＡＴＴＡＴＣＴＴＡＧ−３’（配列番号１１）およびＲＢ５０ ５’−ＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴ−３’（配列番号１２）（制限部位ＡｓｃＩに下線を引く）を使用することによって得る。次に、このＰＣＲフラグメントを酵素ＡｓｃＩによって消化し、酵素ＡｓｃＩで線形にしたベクターｐＲＢＶに挿入する。このフラグメントは、両方向に挿入することができ、これにより２つの構築物を得ることができる：下流干渉ベクターｐＲＢ１７（ＤＩとも呼ばれ、この場合、Ｐａｄｈ１およびＰｇａｌ１は、反対方向に配向している。）（図２Ａ参照）ならびにナンセンス下流干渉ベクターｐＲＢ１６（ｎＤＩとも呼ばれ、この場合、Ｐａｄｈ１およびＰｇａｌ１は、同じ配向である。）（図２Ｄ参照）。
【０１８３】
これらの構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０１８４】
使用した一方向性プロモーターＰｇａｌ１は、拡散的二方向性プロモーターＧＡＬ１−１０（Ｊｏｎｓｔｏｎ，Ｍ．およびＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ、１９８４）によって説明されていたもの）から生じ、ならびに４つのコンセンサス部位「ＧＡＬ４ｐ応答性ＤＮＡエンハンサー要素」および遺伝子ＧＡＬ１の基本プロモーターを含有するが、遺伝子ＧＡＬ１０のプロモーターのＴＡＴＡボックスを有さない。プロモーターＧＡＬ１は、転写因子ＧＡＬ４ｐによって調節され、これにダブル・ハイブリッド対（Ｙ２Ｈ）（別個のＡＤおよびＤＢＤドメイン）を利用することができる。このプロモーターは、十分に特性付けされており、プロモーターの誘導性発現が求められる用途での、例えば、タンパク質の精製、必須遺伝子の機能の研究などのための使用に成功している。
【０１８５】
２．２ 上流干渉ベクターｐＲＢ１８およびナンセンス上流干渉ベクターｐＲＢ１９の構築：
上流干渉ベクターｐＲＢ１８（ＵＩとも呼ばれる）およびナンセンス上流干渉ベクターｐＲＢ１９（ｎＵＩとも呼ばれる）を構築するために、タンパク質ＧＳＴのカルボキシ末端（Ｃ−ｔｅｒ ＧＳＴ）のアミノ酸をコードする短いオープンリーディングフレームを、２つの１本鎖リン酸化オリゴヌクレオチド：配列５’−ＣＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＧＡＧＴＡＧＣＴＧＡＡＴＡＡＧＴＧＡＡＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴ−３’（配列番号１３）のＲＢ８１および配列５’−ＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＴＣＡＣＴＴＡＴＴＣＡＧＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＣＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１４）（部位ＮｏｌＩに下線を引く）のＲＢ８２、のハイブリダイゼーションによって作製する。
【０１８６】
これを行うために、これら２つの１本鎖オリゴヌクレオチドを水中、等モル濃度で混合する。この混合物を加熱ブロック（ヒートブロック）において５分間、９０℃で加熱し、この後、このブロックを（約２時間）放置して、室温に冷却する。このようにして得た２本鎖フラグメントは、相和性付着末端ＸｍａＩおよびＸｂａＩをそれぞれこの末端に有する。
【０１８７】
並行して、遺伝子ＧＡＬ１のプロモーターに対応する５５２ｂｐのフラグメント（これは、下流干渉ベクターｐＲＢ１７の構築に使用したものと同じプロモーターであるが、このフラグメントは、短いオープンリーディングフレームの翻訳を開始させるために出発コドンＡＴＧを含有するので、下流構築物のために使用したものより３ｂｐ長い。）を、ＰＣＲにより増幅する。このフラグメントは、マトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ５５ ５’−ＡＡＡＡＣＣＣＧＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＣＣＣＣＡＴＴＡＴＣＴＴＡＧ−３’（配列番号１５）およびＲＢ５６ ５’−ＡＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣ−３’（配列番号１６）（部位ＸｍａＩに下線を引く）を使用することによって得る。この後、このフラグメントを酵素ＸｍａＩで消化する。
【０１８８】
次に、３つのフラグメントのライゲーションを行う（上で得た２つのフラグメント＋ベクターｐＲＢＶ）。このライゲーションは、酵素ＸｍａＩで消化したフラグメントＰｇａｌ１と短いオープンリーディングフレームＣ−ｔｅｒ ＧＳＴ（相和性付着末端ＸｍａＩおよびＸｂａＩ）とをベクターｐＲＢＶ（事前にＸｍａＩ−ＸｂａＩによって消化したもの）に挿入することに存する。このフラグメントＰｇａｌ１は、両方向に挿入することができる。この結果、２つの構築物が得られる：上流干渉ベクターｐＲＢ１８（ＵＩとも呼ばれ、この場合、Ｐａｄｈ１およびＰｇａｌ１は、同じ配向である。）（図２Ｂ参照）ならびにナンセンス上流干渉ベクターｐＲＢ１９（ｎＵＩとも呼ばれ、この場合、Ｐａｄｈ１およびＰｇａｌ１は、反対方向に配向している。）（図２Ｅ参照）。
【０１８９】
これらの構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０１９０】
２．３ 上流−下流干渉ベクターｐＲＢ２７の構築：
上流−下流干渉プラスミドｐＲＢ２７（ＵＤＩとも呼ばれる）は、ｐＲＢ１６およびｐＲＢ１７の構築に使用したものと同じ、プロモーターＰｇａｌ１に対応する５４９ｂｐのＰＣＲのフラグメント（実施例２参照：このＰＣＲフラグメントは、マトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡ、ならびにプライマーとしてオリゴヌクレオチドＲＢ４９およびＲＢ５０を使用して得る。）を、ベクターｐＲＢ１８に挿入することによって構築する。これを行うために、このＰＣＲのフラグメントを酵素ＡｓｃＩによって消化し、酵素ＡｓｃＩでの消化により線形にしたベクターｐＲＢ１８に挿入する。このフラグメントは、両方向に挿入することができ、より詳細には、所望の配向の挿入物を有するプラスミド（この場合、２つのプロモーターＰｇａｌ１は反対方向で配向している。）を（制限プロフィールにより）選択する（図２Ｃ参照）。
【０１９１】
このようにして得たベクターをｐＲＢ２７と呼ぶ。この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０１９２】
２．４ 転写干渉系構築の原理
本出願人は、２つのタイプのｒＹ２Ｈ（逆二重ハイブリッド）系を考えた。これらは、両方とも、転写干渉による遺伝子休止化に基づく。第一の構造は、Ｐｇａｌ１が、遺伝子ＨＩＳ３の下流に位置し、Ｐａｄｈ１およびＰｇａｌ１は、集束的な配向を有する。この構造は、Ｐｇａｌ１の下流活性化が遺伝子ＨＩＳ３の転写に干渉するため、下流干渉（ＤＩ）と呼ばれる。第二の構造では、Ｐｇａｌ１が、Ｐａｄｈ１の上流に位置し、これら２つのプロモーターは、対状の配向を有する。従って、Ｐｇａｌ１の上流活性化が、プロモーターＰａｄｈ１の活性に干渉するため、この構造は上流干渉（ＵＩ）と呼ばれる。
【０１９３】
構造ＵＩおよびＤＩを基に、５つの転写干渉構築物ｒＹ２Ｈを開発した（図２Ａから２Ｅ参照）。
【０１９４】
系ＵＩにおけるＰｇａｌ１の活性化は、転写干渉のため、Ｐａｄｈ１の活性の減少を導く。しかし、Ｐｇａｌ１の活性は、遺伝子ＨＩＳ３のセンス転写産物を、なお、生じさせることがある。機能性ＩＧＰデヒドラターゼへのこのセンス転写産物の翻訳を防止するために、２つの停止コドンに続くアミノ酸数２２の短いオープンリーディングフレームを、Ｐｇａｌ１とＰａｄｈ１の間に挿入した。この結果、系ＵＩにおける転写干渉は、バイシストロン性メッセンジャーを生じさせ、ここから出発してこの最初の短いオープンリーディングフレームのみを翻訳する。
【０１９５】
第三の構築物は、系ＵＩとＤＩの組み合わせである。上流−下流干渉系（ＵＤＩ）と呼ばれるこの系では、Ｐｇａｌ１は、Ｐａｄｈ１−ＨＩＳ３の上流に挿入され、Ｐａｄｈ１−ＨＩＳ３に対して対状であり、ならびにＰｇａｌ１のさらなるコピーが、ＨＩＳ３のオープンリーディングフレームの下流に配置され、これは、Ｐａｄｈ１に対して集中的な配向にある（図２Ｃ参照）。
【０１９６】
Ｐｇａｌ１によって誘導される転写干渉の特異性を制御するために、ナンセンス上流（ｎＵＩ）およびナンセンス下流（ｎＤＩ）干渉系を構築した。これら２つの対照構築物において、Ｐｇａｌ１の配向は、構築物ＵＩおよびＤＩに対してそれぞれ逆である。有効なＹ２Ｈ相互作用が存在する状態でさえ、これらの対照構築物の使用中に転写干渉は観察されないはずである。
【０１９７】
上で説明した５つの構築物（５つのプラスミド挿入物）は、これらの末端で、二方向性転写ターミネーター（実施例１参照）に隣接している。例えば、片側には、遺伝子ＣＹＣ１の転写ターミネーター（Ｔｃｙｃ１）（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｂ．Ｉ．およびＬ．Ｇｕａｒｅｎｔ、１９８９によって説明されたもの）をコードするフラグメント、反対側には、遺伝子ＡＤＨ１のターミネーター（Ｔａｄｈ１）（Ｉｒｎｉｇｅｒ，Ｓ．ら、１９９１によって説明されたもの）をコードするフラグメントが、見出される。これら２つの要素は、二方向性様式で転写を停止させる。これは、Ｐｇａｌ１またはＰａｄｈ１によって命じられる転写が制限部位ＳａｌＩ／ＳａｃＩを越えて拡大することを防止し、およびまた、レポーター遺伝子のカセットの外側の転写活性の起こり得る影響からｒＹ２Ｈ系を保護する。細菌ベクターを用いて干渉構築物を最初に構築し、制限部位ＳａｌＩおよびＳａｃＩを酵母の複製および組み込みベクター中へのサブクローニングに使用した（下記参照）。
【実施例３】
【０１９８】
新規組み込みベクターｐＲＢ２の構築：
遺伝子ＵＲＡ３の停止コドンＴＡＡの下流に位置する領域＋２９から＋９００に対応する８７１ｂｐのＰＣＲフラグメントを、プライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ８３ ５’−ＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＣＴＣＡＣＡＡＡＴＴＡＧＡＧＣ−３’（配列番号１７）およびＲＢ８４ ５’−ＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣＣＡＧＴＣ−３’（配列番号１８）（部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩに下線を引く）、ならびにゲノムＤＮＡのマトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００を使用することにより、ＰＣＲによって作製する。
このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩによって消化し、ベクターｐＦＡ６ａ−ｋａｎＭＸ−ＰＧＡＬ１−３ＨＡ（Ｌｏｎｇｔｉｎｅ，Ｍ．Ｓ．ら、１９９８、およびＷａｃｈ Ａ，ら、１９９７）によって説明されたものであり、この技術内容は、このベクターの構築に関して、本出願に参照により組み込まれる）の部位ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩのレベルでクローニングする。このようにして得たベクターをｐＲＢ１２と呼んだ。
【０１９９】
並行して、遺伝子ＵＲＡ３のＡＴＧの上流に位置する領域−２２３から−９９２に対応する７６９ｂｐのフラグメントを、プライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ８５ ５’−ＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＡＴＡＣＡＡＧ−３’（配列番号１９）およびＲＢ８６ ５’−ＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＣＧＴＴＴＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＡＣ−３’（配列番号２０）（部位ＢｓｉＷＩに下線を引く）、ならびにマトリックスとしてＳ．セレビジエの株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡを使用することにより、ＰＣＲによって作製する。このＰＣＲ産物を酵素ＢｓｉＷＩによって消化し、ｐＲＢ１２のユニーク部位ＢｓｉＷＩのレベルでクローニングする。フラグメントを両方向に挿入することができた。所望の配向の挿入物を有するプラスミド（この場合、２つのプロモーターＰｇａｌ１は反対方向で配向している）を制限プロフィール分析により選択する。
【０２００】
この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０２０１】
ベクターｐＲＢ２は、２つの相同フラグメントを、Ｓ．セレビジエの遺伝子ＵＲＡ３のオープンリーディングフレームの上流および下流領域にそれぞれ含有する。これら２つのフラグメントの間に挿入された配列は、遺伝子座ＵＲＡ３のレベルでの組み込みをターゲットにし、このゲノム組み込みは、１１０４ｂｐの欠失が生じさせ、これによりＵＲＡ３のオープンリーディングフレームが除去される（図３参照）。ＵＲＡ３のこの欠失は、モデルｕｒａ３Ｄ０（３）に関して発表された欠失に近く、ｕｒａ３Ｄ０との違いは、ＵＲＡ３の下流の２２ｂｐ少ない領域が、ｐＲＢ２の組み込み中に除去されることである。
【０２０２】
遺伝子ＧＥＡ２は、ＵＲＡ３の上流に位置する。遺伝子ＧＥＡ２の転写レベルおよび転写サイズが、ｕｒａ３Ｄ０の欠失による影響を受けないことは、以前に示されている（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ，Ｃ．Ｂ．ら、１９９８）。遺伝子ＴＩＭ９は、ＵＲＡ３の下流に位置し、酵母Ｓ．セレビジエには必須の遺伝子である。ｕｒａ３Ｄ０株の生存率減少は、報告されておらず、ＴＩＭ９がｕｒａ３Ｄ０株において完全に機能性のままであることが証明されている。この結果、ｕｒａ３Ｄ０の欠失が隣接する遺伝子の転写に影響を及ぼすことが証明されるわけではない。
【０２０３】
従って、ｐＲＢ２と一体化した干渉系は、ＧＥＡ２およびＴＩＭ９の転写におそらく影響せず、これらの影響も受けないであろう。ベクターｐＲＢ２の利点は、ｕｒａ３−５２およびｕｒａ３Ｄ０のようなＵＲＡ３の変異株とともに使用することもできることである。
【実施例４】
【０２０４】
ｐＲＢ２酵母の組み込みおよび複製ベクター中への種々の干渉ベクター挿入物のサブクローニング：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター上の実施例２において説明した種々の干渉系および対照系（ＤＩ、ｎＤＩ、ＵＩ、ｎＵＩおよびＵＤＩ）（図２Ａから２Ｅ参照）を、組み込みベクターｐＲＢ２中にＳａｌＩ−ＳａｃＩフラグメントの形でサブクローニングする。これを行うために、種々のプラスミドｐＲＢ１６、ｐＲＢ１７、ｐＲＢ１８、ｐＲＢ１９およびｐＲＢ２７を酵素ＳａｌＩ−ＳａｃＩによって消化し、この挿入物を、事前に酵素ＳａｌＩ−ＳａｃＩによって消化した組み込みベクターｐＲＢ２中にサブクローニングする。得られた種々の構築物を、それぞれ、ｐＲＢ３１、ｐＲＢ２３、ｐＲＢ２４、ｐＲＢ２５およびｐＲＢ２９と呼んだ（表２参照）。
【０２０５】
これらの干渉系をゲノムに組み込んだ後、レポーター遺伝子ＨＩＳ３は、遺伝子ＧＥＡ２およびＴＩＭ９に対して対状である。
【０２０６】
【表２】
略語：ｎＤＩ：ナンセンス下流干渉；ＤＩ：下流干渉；ＵＩ：上流干渉；ｎＵＩ：ナンセンス上流干渉；ＵＤＩ：上流−下流干渉。
【実施例５】
【０２０７】
干渉ベクターのゲノム組み込みでの転写干渉株の構築：
５．１ 干渉ベクターのゲノム組み込み：
使用した培地は、Ｇｕｔｈｅｒｉｅ，Ｃ．およびＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ、２００２よって説明されたものなどである。すべての実験について、細胞は、合成最小培地ＹＮＢ（米国、デトロイトのＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）＋２％グルコース（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において３０℃で成長させる。栄養要求性マーカーを作製するために、必要なアミノ酸（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加する。
【０２０８】
株ｙＣＭ１５（ＭＡＴ ａ Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０ ｕｒａ３−５２ ｌｙｓ２−８０１ ｈｉｓ３Δ２００ ｔｒｐ１−Δ６３ ｌｅｕ２ ａｄｅ２−１０１）を、ゲノム組み込みでの株の構築に使用する。株ｙＣＭ１５は、レポーターカセットを欠失させた、株ＰＣＹ２（Ｃｈｅｖｒａｙ ＲＭおよびＮａｔｈａｎｓ Ｄ．、１９９２によって説明されたもの）から出発して構築した。
【０２０９】
株ＰＣＹ２（ＭＡＴ α Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０ ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−ｌａｃＺ Ｌｙｓ２−８０１ ａｄｅ２−１０１ ｔｒｐ１−Δ６３ ｈｉｓ３−Δ２００ ｌｅｕ２）は、株ＹＰＨ４９９（ＭＡＴ ａ ｕｒａ３−５２ ｌｙｓ２−８０１ ａｄｅ２−１０１ ｔｒｐ１−Δ６３ ｈｉｓ３−Δ２００ ｌｅｕ２−Δ１；ＡＴＣＣ ７６６２５、２０４６７９；（ＳｉｋｏｒｓｋｉおよびＨｉｅｔｅｒ、１９８９））（特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）から番号２０４６７９で入手できる。）と株ＧＧＹ１：：１７１（ＭＡＴ α Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３ ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−ｌａｃＺ）（ＧｉｌｌおよびＰｔａｓｈｎｅ、１９８７）の間の交雑の結果である。
【０２１０】
株ＧＧＹ１：１７１は、ＵＡＳＧにより活性化された遺伝子ＧＡＬ１のプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子ｌａｃＺを有するカセットＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−ｌａｃＺ（Ｙｏｃｕｍら、１９８４）を株ＧＧＹ１（ＭＡＴ α Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０ ｌｅｕ２ ｈｉｓ３（ＧｉｌｌおよびＰｔａｓｈｎｅ、１９８７））に組み込むことによって構築した。株ＧＧＹ１それ自体は、株ＤＢＹ７４５（ＭＡＴ α Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０ ｌｅｕ２−３、１１２ ａｄｅ１−１００ ｕｒａ３−５２；（ＧｒａｈａｍおよびＣｈａｍｂｅｒｓ、１９９６；Ｆｅｒｒｅｉｒｏら、２００４；ＮａｇａｒａｊａｎおよびＳｔｏｒｍ、１９９７；Ｄｏｒｍｅｒら、２０００）と株ＹＭ７０９（Ｐｅａｒｌｂｅｒｇ，Ｊ．、１９９５）の間の交雑の結果である。
【０２１１】
株ＰＣＹ２の代わりに、遺伝子型（ｇａｌ４−ｇａｌ８０−ｔｒｐ１−ｈｉｓ３−ｌｅｕ２−ｕｒａ３−）を有する任意の酵母Ｓ．セレビジエ株を使用することができる。例えば、株ＰＣＹ２の代わりに、株Ｙ１８７（Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、１９９３によって説明されたものであり、特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）から番号９６３９９で入手できる。）を使用することができる。
【０２１２】
表３は、株ＰＣＹ２の代わりに使用することができる株の他の例を示すものである。これらの呼称、これらの株の簡単な説明およびこれらの株を入手することができる団体、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）でのこれらの参照番号を示す。
【０２１３】
株ｙＣＭ１５を構築するために、株ＰＣＹ２のクローンの１０６から１０７個の細胞を滅菌水に懸濁させ、アミノ酸ｌｙｓ＋ａｄｅ＋ｈｉｓ＋ｕｒａ＋ｔｒｐ＋ｌｅｕを補充した、ＹＮＢ培地＋２％グルコースの寒天プレートで画線培養する。この寒天プレートは、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）も１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する。５−ＦＯＡは、遺伝子ＵＲＡ３を発現する細胞に対して毒性である。このため、５−ＦＯＡを含有するこれらのプレートを用いて、レポーターカセットＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−ｌａｃＺを欠失した株ＰＣＹ２の変異体を選択する（Ｂｏｅｋｅら、１９８７）。得られた変異体におけるレポーターカセットの不在は、レポーターｌａｃＺの活性を検査することにより検証する。この後、プロモーターＧＡＬ１の非常に強いアクチベーターである転写因子ＧＡＬ４ｐをコードするプラスミドｐＣＬ１（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９）でこれらの変異体を形質転換し、ｌａｃＺ活性を測定する（Ｂｒｅｅｄｅｎ，Ｌ．およびＫ．Ｎａｓｍｙｔｈ、１９８５）。５−ＦＯＡに対して耐性であり、ｌａｃＺ活性を有さない変異体を選択し、これをｙＣＭ１５と呼ぶ。
【０２１４】
【表３】
【０２１５】
組み込みベクターｐＲＢ３１、ｐＲＢ２３、ｐＲＢ２４、ｐＲＢ２５およびｐＲＢ２９を、酵素ＤｒｄＩでの消化により線形化する。株ｙＣＭ１５を、酢酸リチウム形質転換法（例えば、Ｇｉｅｔｚ，Ｒ．Ｄ．およびＡ．Ｓｕｇｉｎｏ、１９８８によって説明されたもの）を用いることにより、各組み込みベクターの線形化ＤＮＡ（１μｇ）によって独立して形質転換し、これらの細胞を、アミノ酸ｌｙｓ＋ａｄｅ＋ｔｒｐ＋ｌｅｕおよびウラシル（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により完全にした、ヒスチジン枯渇培地（ＹＮＢ（米国、デトロイトのＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）＋ ２％グルコース（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、成長させる。ヒスチジンについて栄養要求性のクローンを単離し、遺伝子座ＵＲＡ３のレベルでのレポーターカセットの組み込みを、各接合部に特異的な内部および外部プライマーを使用することによるコロニーＰＣＲ（Ｇｕｔｈｅｒｉｅ，Ｃ．ら、２００２によって説明されたもの）によって検証する（表４参照）。
【０２１６】
【表４】
【０２１７】
使用したプライマーの配列は、以下のものである：
【０２１８】
【化１】
【０２１９】
組み込みベクターｐＲＢ３１、ｐＲＢ２３、ｐＲＢ２４、ｐＲＢ２５、ｐＲＢ２９の各々による株ｙＣＭ１５の独立した形質転換によって得られた株であって、遺伝子座ＵＲＡ３のレベルでの各レポーターカセットの組み込みが実証されている株を、それぞれ、ｙＲＢ８２、ｙＲＢ４８、ｙＲＢ４９、ｙＲＢ５０、ｙＲＢ８３と呼んだ（表２参照）。
【０２２０】
５．２ 被組み込み干渉構築物の活性化：
干渉系の活性を評価するために、実施例５．１で得たレポーター株を２つのプラスミド対で形質転換する。第一の対は、完全長のＧＡＬ４ｐ転写因子（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９）の発現に起因するＰｇａｌ１の強力な活性化に対する干渉系の応答を試験するために使用する。第二のプラスミド対は、ＧＬＡ４ｐの活性化ドメイン（ＡＤ）およびＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を別々に発現させることができ、この個々の異なるドメインがＰｇａｌ１を活性化できないため、負の対照として役立つ。
【０２２１】
従って、実施例５．１において得た株（株ｙＲＢ８２、ｙＲＢ４８、ｙＲＢ４９、ｙＲＢ５０、ｙＲＢ８３）を、ＧＡＬ４ｐ転写因子をコードする動原体プラスミドｐＣＬ１（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９によって説明されたもの）および動原体挿入物を有さないプラスミドｐＦＬ３９（Ｂｏｎｎｅａｕｄ Ｎ．ら、１９９１によって説明されたもの）によって共形質転換する。酵母において複製されるこれらのプラスミドは、選択マーカーとして遺伝子ＬＥＵ２またはＴＲＰ１を有する。
【０２２２】
これらの形質転換体を、アミノ酸ｌｙｓ＋ａｄｅ＋ｈｉｓおよびウラシル（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により完全にした、ＹＮＢ培地（米国、デトロイトのＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）＋ ２％グルコース（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて選択する。
【０２２３】
得られた形質転換体を、それぞれ、ｎＤＩ＋、ＤＩ＋、ＵＩ＋、ｎＵＩ＋およびＵＤＩ＋と呼ぶ。
【０２２４】
負の対照は、ベクターｐＴＡＬ２０およびｐＤＢＴによる実施例５．１に記載した株（株ｙＲＢ８２、ｙＲＢ４８、ｙＲＢ４９、ｙＲＢ５０、ｙＲＢ８３）の共形質転換によって得る。ベクターｐＴＡＬ２０およびｐＤＢＴは、ＧＬＡ４ｐの活性化ドメイン（ＡＤ）およびＧＡＬ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を発現させることができる（これらのベクターは、Ｎａｖａｒｒｏ，Ｐ．ら、１９９７によって説明される）。
【０２２５】
このようにして得た形質転換体を、それぞれ、ｎＤＩ−、ＤＩ−、ＵＩ−、ｎＵＩ−およびＵＤＩ−と呼ぶ。
【実施例６】
【０２２６】
転写干渉系がゲノムに組み込まれている酵母の成長試験
形質転換体の細胞成長を滴下評価法により試験する。これを行うために、ヒスチジンを含有する寒天プレート上に細胞を堆積させ、３０℃で一晩保温する。この後、これらの細胞を細胞数約１０６／ｍｌで水に懸濁させ、１０倍稀釈系列を調製する。各稀釈溶液の５μＬの液滴をピペットによって取り出し、所望の培地を含む予乾燥寒天プレート上に堆積させる。これらのプレートを３０℃で保温する。
【０２２７】
干渉形質転換体の細胞成長は、ヒスチジン枯渇培地で評価する。場合によっては、タンパク質ＨＩＳ３ｐの競合阻害剤（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ））を漸増濃度で培地に添加して、種々の干渉株間のレポーター遺伝子ＨＩＳ３の活性レベルのレベルでの違いを観察する（図４）。阻害剤を含有する培地は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ品質の水中、競合阻害剤３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（３−ＡＴ；Ｓｉｇｍａ）の１Ｍの濃度の原液から出発して調製する。寒天を６０℃に冷却した後、３−ＡＴを所望の濃度で添加する。試験した種々の培地は、アミノ酸ｌｙｓ＋ａｄｅおよびウラシル（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により完全にした、３−ＡＴを含有しないまたは３−ＡＴを８、１６、２２、３２ｍＭの濃度で含有する、最少培地（ＹＮＢＧ（米国、デトロイトのＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）＋２％グルコース（フランス、リヨンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。正の対照も行う（ヒスチジンを含有し、３−ＡＴを含有しない培地）。これらのプレートを３０℃で４８から７２時間保温する。結果の一部を図４Ａから４Ｅに提示する。
【０２２８】
ＧＡＬ４ｐ（＋株）の存在下で、ＵＩ＋形質転換体について細胞成長の最大減少が観察される。ＧＡＬ４ｐを発現するＵＩ細胞は、ヒスチジン不在の状態では成長できず、これに対して、対照ＡＤ／ＤＢＤを有する細胞（ＵＩ−形質転換体）は、３２ｍＭより高い３−ＡＴの濃度で正常に成長する。ＧＡＬ４ｐも、対照ＡＤ／ＤＢＤも、対照形質転換体ｎＵＩ＋およびｎＵＩ−の細胞成長を阻害せず、これは、ＧＡＬ４ｐを発現する細胞ＵＩ＋の成長の阻害が、Ｐａｄｈ１に向けられたＰｇａｌ１の転写の活性化に起因することを示す。
【０２２９】
ＤＩ＋細胞において、３−ＡＴ阻害剤が不在のとき、ＧＡＬ４ｐの発現は、細胞成長に影響を及ぼさない（図４Ｂ参照）が、３−ＡＴが８ｍＭまたはそれ以上の濃度で存在するとき、この成長は完全に阻害される（図４Ｃから４Ｅ参照）。これに反して、対照形質転換体ＤＢＤ／ＡＤ（ＤＩ−形質転換体）の細胞成長は、３２ｍＭの３−ＡＴ濃度でさえ影響を受けない（図４Ｅ参照）。従って、遺伝子ＨＩＳ３のアンチセンス鎖のＰｇａｌ１によって命じられる転写は、ＤＩ＋細胞のヒスチジンについての栄養要求性のレベルを有意に上昇させる。
【０２３０】
驚くべきことに、ＧＡＬ４ｐもｎＤＩ＋形質転換体において細胞成長を阻害する（８ｍＭまたはそれ以上の濃度で３−ＡＴが存在するとき、成長が阻害される（図４Ｃから４Ｅ参照）。これらの細胞において、Ｐｇａｌ１により命じられる転写は、Ｔａｄｈ１に向けられ（図２Ｄ参照）、これはＨＩＳ３の発現に干渉しないと思われる。この成長の阻害は、Ｐｇａｌ１の特異的活性化に起因する。対照ＡＤ／ＤＢＤがｎＤＩ−細胞中に存在するときには成長の阻害が観察されないからである（図４Ｂから４Ｅ参照）。
【０２３１】
ＧＡＬ４ｐの存在下で、ＵＤＩ＋形質転換体は、ＤＩ＋細胞のものに類似した成長阻害レベルを示す。対照ＤＢＤ／ＡＤは、ＵＤＩ−細胞の成長には影響を及ぼさない（図４Ｂから４Ｅ参照）。
【０２３２】
本発明者らは、株ＵＩ＋、ＤＩ＋およびＵＤＩ＋において、プロモーターＰｇａｌ１のＧＡＬ４ｐに起因する活性化は、細胞成長の有意な阻害を導き、この阻害は、レポーターＨＩＳ３の活性減少に起因すると結論付けた。この成長の阻害は、ＵＩ細胞におけるほうがＤＩおよびＵＤＩ細胞におけるより僅かに大きい。
【０２３３】
従って、ＧＡＬ４ｐにより誘導される、ＨＩＳ３の活性の減少は、細胞成長を有意に遅速するが、これを完全には阻害しない。干渉条件下では、保温の最初の６〜７日間はプレート上にコロニーは検出されないが、より長く保温すると、極めて小さいコロニーが見えてくる。
【０２３４】
干渉は、ＤＩ、ＵＤＩまたはｎＤＩ系でよりＵＩ系でのほうが強力であることが観察された。これは、転写干渉を生じさせる分子メカニズムから起こり得る。上流干渉の詳細な研究により、上流プロモーター活性化は、下流プロモーターのレベルでこれらの連結部位から活性化因子を除去することにより、下流プロモーターの活性を減少させることが、明らかになった（Ｇｒｅｇｅｒ，Ｉ．Ｈ．ら、２０００、Ｇｒｅｇｅｒ，Ｉ．Ｈ．ら、１９９８、Ｖａｌｅｒｉｕｓ，Ｏ．Ｃ．ら、２００２、Ｃａｌｌｅｎ ＢＰら、２００４）。干渉を生じさせるプロモーターが、ＵＩ構築物においてレポーター遺伝子のプロモーターに近いほど、ＤＩ構築物におけるよりＵＩにおける干渉の効果のほうが大きくなり得る。
【０２３５】
上流干渉が異なる分子メカニズムから起こることもある。系ＤＩでは、集中的に転写するＲＮＡポリメラーゼが衝突することがあり、これは、転写の停止および遺伝子ＨＩＳ３の休止化を導くことがある。ＲＮＡポリメラーゼの正面衝突は、Ｐａｄｈ１の転写活性化因子の除去より効果が低いＨＩＳ３休止化手段であろう。加えて、ＤＩ系では、Ｐａｄｈ１の活性化が転写干渉によりＰｇａｌ１を不活性化することがあり、これは、ＵＤＩ系がＵＩ系またはＤＩ系より優れていない理由の説明にもなり得る。
【０２３６】
驚くべきことに、本出願人は、Ｐｇａｌ１を、レポーターカセットＨＩＳ３に対して対状で下流に挿入したとき（ｎＤＩ構築物）にも下流転写干渉が存在することを確認した。遺伝子の転写レベルは、プロモーターの力、ならびに転写停止シグナルの質に依存する（Ｗａｈｌｅ，Ｅ．およびＵ．Ｒｕｅｇｓｅｇｇｅｒ、１９９９）。Ｐｇａｌ１をＨＩＳ３のＯＲＦとこの転写ターミネーターＴａｄｈ１の間に挿入した場合、Ｐｇａｌ１の活性は、構築物ｎＤＩではＨＩＳ３の転写産物の適切な停止に干渉することがあり、従って、これが、これらの細胞におけるＨＩＳ３ｐの活性を減少させる。
【実施例７】
【０２３７】
ベクターｐＬａｃ３３中への種々の干渉ベクター挿入物のサブクローニング：
転写干渉系が、プラスミド上に存在し、ゲノムレベルで組み込まれていないとき、機能性であるかどうかを試験するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター上の実施例２で説明した種々の干渉系（ＤＩ、ＵＩおよびＵＤＩ）（図２Ａから２Ｅ参照）を、組み込みベクターｐＬａｃ３３中にＳａｌＩ−ＳａｃＩの形でサブクローニングする。このベクターは、選択マーカーとして酵母の遺伝子ＵＲＡ３を含有し、Ｇｉｅｔｚ，Ｒ．Ｄ．およびＡ．Ｓｕｇｉｎｏ、１９８８によって説明されている。これを行うために、種々のプラスミドｐＲＢ２７、ｐＲＢ１７、ｐＲＢ１８を酵素ＳａｌＩ−ＳａｃＩによって消化し、この挿入物を、事前に酵素ＳａｌＩ−ＳａｃＩによって消化した複製ベクターｐＬａｃ３３中にサブクローニングする。得られた種々の構築物を、それぞれ、ｐＲＢ２８、ｐＲＢ２０、ｐＲＢ２１と呼んだ。
【実施例８】
【０２３８】
転写干渉系がゲノムに組み込まれていない酵母の成長試験：
干渉構築物ＵＩ、ＤＩおよびＵＤＩが、プラスミド上に存在し、ゲノムレベルで組み込まれていないとき、機能性であるかどうかも試験した。これを行うために、種々の転写干渉構築物を有する、実施例７で説明したプラスミドｐＬａｃ３３から誘導したベクターを使用して、株ｙＣＭ１５を独立して形質転換した。
【０２３９】
株ｙＣＭ１５は、ベクターｐＣＬ１およびｐＦＬ３９を随伴するベクターｐＲＢ２８、ｐＲＢ２０またはｐＲＢ２１（実施例７参照）の各々のＤＮＡ（０．３μｇ）によって、個々に共形質転換される。従って、株ｙＣＭ１５は、３つのプラスミドの３つの群（ｐＲＢ２８＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９、またはｐＲＢ２０＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９、またはｐＲＢ２１＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９）によって、個々形質転換される。原動体プラスミドｐＣＬ１は、ＧＡＬ４ｐ転写因子をコードし（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９によって説明された。）、プラスミドｐＦＬ３８は、原動体挿入物を有さないプラスミドである（Ｂｏｎｎｅａｕｄ Ｎら、１９９１によって説明された）。これらの酵母複製プラスミドは、遺伝子ＬＥＵ２またはＴＲＰ１を選択マーカーとして有する。
【０２４０】
株ｙＣＭ１５はまた、ベクターｐＴＡＬ２０およびｐＤＢＴ（ＧＡＬ４ｐの活性化ドメイン（ＡＤ）およびＧＡＬ４ｐのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を発現することができる（これらのベクターは、Ｎａｖａｒｒｏ，Ｐ．ら、１９９７によって説明されている。）。）を随伴するベクターｐＲＢ２８、ｐＲＢ２０またはｐＲＢ２１（実施例７参照）の各々のＤＮＡ（０．３μｇ）によって、個々に共形質転換さる。従って、株ｙＣＭ１５は、３つのプラスミドの３つの群（ｐＲＢ２８＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ、またはｐＲＢ２０＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ、またはｐＲＢ２１＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ）によって、個々形質転換される。
【０２４１】
これらの三重形質転換体の各々の細胞成長を、実施例６において説明したように、ヒスチジンを含有するおよび含有しない寒天プレート、ヒスチジンを含有しないプレートについては、漸増濃度の３−ＡＴを含有しないまたは含有する寒天プレートで試験する。
【０２４２】
組み込まれていないプラスミドに基づく干渉構築物で得られた結果は、組み込まれている干渉構築物について得られたものに類似している（図５Ａから５Ｄ参照）。例えば、培地が、ヒスチジンおよび３−ＡＴが枯渇したものであるとき、ＧＡＬ４ｐを発現するＵＩ細胞（三重形質転換体ｐＲＢ２１＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９）は、活性ＧＡＬ４ｐを発現しないＵＩ細胞（三重形質転換体ｐＲＢ２１＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ）と比較して、成長の非常に強い減少を示す。しかし、ＵＩの成長の阻害レベルは、構築物ＵＩの被組み込みバージョンで観察されたものと同様の大きさである（実施例６参照）。
【０２４３】
ＤＩ細胞（三重形質転換体ｐＲＢ２１＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９（活性ＧＡＬ４ｐを発現する。）またはｐＲＢ２０＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ（活性ＧＡＬ４ｐを発現しない。））およびＵＤＩ（三重形質転換体ｐＲＢ２８＋ｐＣＬ１＋ｐＦＬ３９（活性ＧＡＬ４ｐを発現する。）またはｐＲＢ２８＋ｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ（活性ＧＡＬ４ｐを発現しない。））は、これらが活性ＧＡＬ４ｐを発現しようと、しなかろうと、ある程度正常に成長する。
【０２４４】
培地が、３−ＡＴを８ｍＭまたはそれ以上の濃度で含有するとき、ＧＡＬ４ｐを発現する、および構築物ＵＩ、ＤＩまたはＵＤＩによって形質転換された細胞は、もはや全く成長しない（図５Ｃおよび５Ｄ参照）。この結果は、負の対照細胞（活性ＧＡＬ４ｐを発現しないもの（ＡＤ／ＤＢＤ））について得られたもの、および細胞成長が影響を受けない干渉プラスミドによって形質転換されたものとは対照的である（図５Ｃおよび５Ｄ参照）。
【０２４５】
本出願人は、ＵＩ、ＤＩおよびＵＤＩのプラスミドに基づくバージョンは、機能性であるが、これらの干渉構築物の対応する被組み込みバージョンよりＰｇａｌ１の活性化に対する感度が僅かに低いと結論付ける。
【実施例９】
【０２４６】
宿主株の遺伝的背景に関する転写干渉系の独立性：
転写干渉系の活性が、宿主株の遺伝的背景に依存するかどうかを試験するために、プラスミドに基づく構築物（例えば、実施例７で説明したもの）を別の酵母菌株：株ｙＲＢ３１においても評価した。株ｙＲＢ３１（ＭＡＴ α ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３−Δ２００ ａｄｅ２−１０１ ｔｒｐ１−９０１ ｌｅｕ２−３、１１２ ｍｅｔ−Δｇａｌ４ Δｇａｌ８０）を、株Ｙ１８７（株Ｙ１８７は、Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、１９９３によって説明されており、ならびに特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）から参照番号９６３９９で入手できる。）のカセットＵＲＡ３：：ＧＡＬ１（ＵＡＳ）−ＧＡＬ１（ＴＡＴＡ）−ｌａｃＺを削除することによって構築する。
【０２４７】
株ｙＲＢ３１を構築するために、株Ｙ１８７のクローンの１０６から１０７個の細胞を滅菌水に懸濁させ、アミノ酸ｍｅｔ＋ａｄｅ＋ｈｉｓ＋ｕｒａ＋ｔｒｐ＋ｌｅｕにより完全にした、ＹＮＢ培地＋２％グルコースの寒天プレートで画線培養する。この寒天プレートは、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）も１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する。５−ＦＯＡは、遺伝子ＵＲＡ３を発現する細胞に対して毒性である。このため、５−ＦＯＡを含有するこれらのプレートを用いて、レポーターカセットＵＲＡ３：：ＧＡＬ１（ＵＡＳ）−ＧＡＬ１（ＴＡＴＡ）−ｌａｃＺを欠失した株Ｙ１８７の変異体を選択する（Ｂｏｅｋｅら、１９８７）。得られた変異体におけるレポーターカセットの不在を、レポーターｌａｃＺの活性を検査することにより検証する。プロモーターＧＡＬ１の非常に強いアクチベーターであるＧＡＬ４ｐ転写因子をコードするプラスミドｐＣＬ１（Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ．およびＯ．Ｓｏｎｇ、１９８９）でこれらの変異体を形質転換し、ｌａｃＺ活性を測定する（Ｂｒｅｅｄｅｎ Ｌ．およびＫ．Ｎａｓｍｙｔｈ、１９８５）。５−ＦＯＡに対して耐性であり、ｌａｃＺ活性を有さない変異体を選択し、これをｙＲＢ３１と呼ぶ。
【０２４８】
この株ｙＲＢ３１を、株ｙＣＭ１５について実施例８で説明したのと同じ様式で形質転換した。得られた形質転換体は、これらの細胞成長に関するかぎり、実施例８において説明したのと同じ仕方で試験した。干渉プラスミドの活性に関するかぎり、株ｙＣＭ１５とｙＲＢ３１の間で違いは観察されなかった。
【実施例１０】
【０２４９】
タンパク質間相互作用によるＵＩおよびＤＩ干渉系の発現の誘導および細胞成長の阻害に対する効果：
１０．１：タンパク質Ｆｅ６５と以前に同定されたタンパク質ＡＰＰとの相互作用による干渉系の発現の誘導：
タンパク質Ｆｅ６５とＡＰＰの間の以前に同定されたタンパク質間相互作用（ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎ ＤＭおよびＭｉｌｌｅｒ ＣＣ、１９９６；Ｆｉｏｒｅ Ｆら、１９９５；Ｚａｍｂｒａｎｏ Ｎら、１９９７）が、酵母の細胞成長を阻害するように十分に転写干渉体の構築を誘導できるかどうかを試験した。
【０２５０】
構築物ＵＩおよびＤＩの被組み込みバージョンを使用する。融合タンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５およびＤＢＤ−ＡｐｐＣｔを、強活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーター（Ｒｕｏｈｏｎｅｎ Ｌら、１９９５によって説明されたプロモーター）の制御下で発現させる。
【０２５１】
プラスミドｐＲＢ３４により、強活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターの制御下で融合タンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５を発現させることができる。
【０２５２】
プラスミドｐＲＢ３４の構築は、数段階で行った。第一段階において、遺伝子Ｆｅ６５の一対のリーディングフレームを、ベクターｐＧＡＤ４２４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（米国、カリフォルニア州、パロアルト））中にクローニングする。遺伝子Ｆｅ６５（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号：ＢＣ０１０８５４）のアミノ酸１５２から７０８に対応する１６９４ｂｐのＰＣＲフラグメントを、プライマーとして次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ２５０ ５’−ＡＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧ−３’（配列番号２７）およびＲＢ２５１ ５’−ＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＴＧＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号２８）（部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩに下線を引く）、ならびにマトリックスとして市販の人間の脳（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（米国、カリフォルニア州、パロアルト））のｃＤＮＡのバンクプラスミドＤＮＡを使用することにより、ＰＣＲによって作製する。このＰＣＲ産物を酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩによって消化し、ベクターｐＧＡＤ４２４の部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩのレベルでクローニングする。このようにして得たベクターをｐＲＢＳＧ１１と呼ぶ。この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０２５３】
第二段階において、酵素ＳｐｈＩと弱活性トランケート型プロモーターＡＤＨ１をコードするフラグメントとを用いてこのプラスミドｐＲＢＳＧ１１の部分消化を行い、融合タンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５およびターミネーターＡＤＨ１を原動体プラスミドｐＦＬ３６（Ｂｏｎｎｅａｕｄ Ｎら、１９９１によって説明されたもの）の部位ＳｐｈＩに挿入する。これによってプラスミドｐＲＢＩＭ５４を得ることができる。良好な構築物の獲得を制限分析により検証する。このフラグメントは、両方向に挿入することができる。ＡＤＨ１プロモーターがプラスミドｐＦＬ３６のユニーク部位ＳａｃＩの近くにある、所望の配向を有するクローンを選択する。第三段階において、強活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターをコードするフラグメントを、プライマーＲＢ１３６（５’−ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＧＴＡＣＧＡＴＡＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＧＧＧＴＧ−３’）（配列番号２９）およびＲＢ１３７（５’−ＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣＴＴＧＧＴＡＴＡＧＣ−３’）（配列番号３０）を用い、株ＦＬ１００のゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲによって増幅する。相同組換えによるクローニング法（ＧＡＰ修復）（ＤｅＭａｒｉｎｉら、２００１；Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、１９８３）を用いることにより、このＰＣＲフラグメントを使用して、事前に酵素ＳａｃＩにより消化したプラスミドｐＲＢＩＭ５４における弱活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターを、強活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターで置換する。この相同組換えは、株ｙＣＭ１５において行う。構築された新規プラスミドを制限分析によって検証し、これをｐＲＢ３４と呼ぶ。このプラスミドの配列を配列番号３１に示す。
【０２５４】
プラスミドｐＲＢ３５により、強活性トランケート型のＡＤＨ１の制御下で融合タンパク質ＤＢＤ−ＡｐｐＣｔを発現させることができる。プラスミドｐＲＢ３５の構築は、数段階で行った。
【０２５５】
第一段階において、遺伝子ＨＳＡＦＰＡ４（Ａｐｐ、アクセッション番号ＥＭＢＬ Ｙ００２６４）のリーディングフレームのカルボキシ末端部分を、ベクターｐＧＢＴ９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（米国、カリフォルニア州、パロアルト））中にクローニングする。遺伝子ＨＳＡＦＰＡ４のアミノ酸６５０から６９５をコードする１４３ｂｐのフラグメントを、配列：ＲＢ２５２ ５’−ＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＴＣＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＧＧＣＴＡＣＧＡＡＡＡＴＣＣＡＡＣＣＴＡＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＣＴＡＧＧ−３’（配列番号３２）、および配列：５’−ＴＣＧＡＣＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＴＴＧＴＡＧＧＴＴＧＧＡＴＴＴＴＣＧＴＡＧＣＣＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＴＧＴＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号３３）のＲＢ２５３の２つのリン酸化１本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリド形成によって得る。これを行うために、この２つの１本鎖オリゴヌクレオチドを水中、等モル濃度で混合する。この混合物を加熱ブロック（ヒートブロック）において５分間、９０℃で加熱し、この後、このブロックを（約２時間）放置して周囲温度に冷却する。このようにして得た２本鎖フラグメントは、この末端に、相和性付着末端ＥｃｏＲＩおよびＳａ１Ｉをそれぞれ有する。これにより、この２本鎖フラグメント（ＨＳＡＦＰＡ４のカルボキシ末端部分に対応する）をベクターｐＧＢＴ９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入することができる。このようにして得たベクターは、ＧＡＬ４ＤＢＤとＡｐｐのアミノ酸６５０から６９５との間の融合タンパク質（ＤＢＤ−ＡｐｐＣＴ）を発現させることができ、これをｐＳＧ１４と呼ぶ。この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０２５６】
第二段階において、このプラスミドｐＳＧ１４を酵素ＳｐｈＩで部分的に消化する。この後、弱活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーター、融合ＤＢＤ−ＡｐｐＣｔおよびＡＤＨ１ターミネーターをコードするフラグメントを、事前に酵素ＳｐｈＩによって消化したベクターｐＦＬ３９（Ｂｏｎｎｅａｕｄ Ｎら、１９９１によって説明されたもの）に挿入する。結果として生じたプラスミドをｐＩＭ５５と呼ぶ。良好な構築物の獲得を制限分析により検証する。このフラグメントは、両方向に挿入することができる。ＡＤＨ１プロモーターがプラスミドｐＦＬ３６のユニーク部位ＳａｃＩの近くにある、所望の配向を有するクローンを選択する。
【０２５７】
次に、ｐＩＭ５５の弱活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターを、強活性トランケート型ＡＤＨ１プロモーターにより強化することによって、プラスミドｐＲＢ３５を得る。ｐＲＢ３４の構築に使用したものと同じＰＣＲフラグメントを、事前に酵素ＳｐｈＩによって消化したｐＩＭ５５に、同じＧＡＰ修復法を用いて導入する。構築したプラスミドを制限分析により検証し、これをｐＲＢ３５と呼ぶ。このプラスミドの配列を配列番号３４に示す。
【０２５８】
第一に、構築物の活性を検証する。これを行うために、レポーター株Ｙ１８７（この株Ｙ１８７は、プロモーターＰｇａｌ１の制御下に置かれた遺伝子ＵＲＡ３を有するものであり、Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、１９９３によって説明された。特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）から参照番号９６３９９で入手できる。）を、３つのプラスミド対によって形質転換する。これらの対は、次のものである：ｐＲＢ３４＋ｐＲＢ３５、ｐＲＢ３４＋ｐＤＢＴ、およびｐＴＡＬ２０＋ｐＲＢ３５。これらのプラスミド対の各々によって共形質転換された２つのクローンを選択する。ウラシルを含有するおよび含有しない最小培地で成長するこれらの能力を試験する。６つの対応するクローンは、ウラシルが存在する状態での最小培地で成長することができることがわかる（図６Ａ参照）。しかし、ウラシル不在の状態では、プラスミドｐＲＢ３４＋ｐＲＢ３５によって共形質転換された２つのクローンしか成長できない（図６Ａ参照）。これは、遺伝子ＵＲＡ３が株Ｙ１８７において活性化され、これにプロモーターＰｇａｌ１を活性化することができる活性転写因子ＧＡＬ４ｐを再構成するＡＤ−Ｆｅ６５とＤＢＤ−ＡｐｐＣｔの間の相互作用が利用されることを示す。使用した構築物の活性が、このように実証される。
【０２５９】
次に、株ｙＲＢ４８（ＤＩ系）およびｙＲＢ４９（ＵＩ系）を、各々、２つのハイブリッドタンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５およびＤＢＤ−ＡｐｐＣｔを発現させることができるプラスミド対ｐＲＢ３４とｐＲＢ３５よって共形質転換する。株ｙＲＢ４８（ＤＩ系）およびｙＲＢ４９（ＵＩ系）は、対照として、各々、プラスミド対ｐＲＢ３４＋ｐＤＢＴおよびｐＴＡＬ２０＋ｐＲＢ３５によっても共形質転換する。これらのプラスミド対の各々によって共形質転換された２つのクローンを選択する。これらの二重形質転換体の２つのクローンの各々の細胞成長を、実施例６において説明したように、ヒスチジンを含有するおよび含有しない寒天プレート、ならびにヒスチジンを含有せず、漸増濃度の３−ＡＴを含有するまたは含有しない寒天プレートで試験する。
【０２６０】
図６Ｂから６Ｅに示すように、融合タンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５とＤＢＤ−ＡｐｐＣｔの間の相互作用は、干渉構築物ＵＩおよびＤＩを有する株の細胞成長を阻害するが、融合タンパク質ＡＤ−Ｆｅ６５およびこのドメインＤＢＤ、または融合タンパク質ＤＢＤ−ＡｐｐＣｔおよびこのドメインＡＤを発現する細胞は、正常に成長する。この実験では、３−ＡＴを１５ｍＭより高い濃度まで添加したとき、細胞成長のレベルで差が検出される。
【０２６１】
ダブル・ハイブリッド相互作用により誘導された転写干渉は、ｒＹ２Ｈ ＵＩおよびＤＩ系で容易に検出することができると結論付けることができる。
【０２６２】
１０．２：以前に同定されたタンパク質ｍｄｍ２とタンパク質ｐ５３の相互作用による干渉系の発現の誘導：
タンパク質ｐ５３とｍｄｍ２の間の以前に同定された別のタンパク質間相互作用（Ｏｌｉｎｅｒ ＪＤら、１９９３；Ｃｈｅｎ Ｊら、１９９３；Ｍｏｍａｎｄ Ｊら、１９９２）が、酵母の細胞成長を阻害するように十分に転写干渉構築物を誘導することができるかどうかも試験した。これを行うために、構築物ＵＩの組み込みバージョンを使用する。融合タンパク質ＤＢＤ−ｍｄｍ２およびＶＰ１６−ｐ５３（１−５５）を、２μプラスミドから出発して、遺伝子ＡＤＨ１の完全プロモーターの制御下で発現させる。
【０２６３】
ベクターｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔを構築するために、ヒトｐ５３タンパク質（ゲンバンク参照番号：ＢＣ００３５９６）のアミノ末端の５５のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを、２つのリン酸化１本鎖オリゴヌクレオチド：ＲＢ２００ ５’−ＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＡＡＣＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴＣＧＴＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＣＡＧＡＡＣＧＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＧＴＡＧＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧ−‘３（配列番号３５）およびＲＢ２０１ ５’−ＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＴＣＡＧＡＴＣＣＴＡＧＣＧＴＣＧＡＧＣＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＡＡＡＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＣＧＴＴＣＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＡＣＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＴＴＣＡＣＴＧＣ−３’（配列番号３６） （部位ＮｏｌＩおよびＢａｍＨＩに下線を引く）のハイブリダイゼーションによって作製する。これを行うために、これら２つの相補１本鎖オリゴヌクレオチドを水中、等モル濃度で混合する。この混合物を加熱ブロック（ヒートブロック）において５分間、９０℃で加熱し、この後、このブロックを（約２時間）放置して周囲温度に冷却する。このようにして得た２本鎖フラグメントは、この末端に、相和性付着末端ＮｏｔＩおよびＢａｍＨ１をそれぞれ有する。
【０２６４】
この後、事前に酵素ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩによって消化したベクターｐＶＰ１６（ＶｏｊｔｅｋおよびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、１９９５；Ｖｏｊｔｅｋら、１９９３）においてフラグメント連結を行う。この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０２６５】
ベクターｐＤＴＢ−ｍｄｍ２を構築するために、全Ｍｄｍ２ヒトタンパク質（ゲンバンク参照番号：ＮＭ＿００２３９２）をコードする遺伝子を、マトリックスとしてベクターｐＣＲ３−ｍｄｍ２ｆｌ（Ｓｉｇａｌａｓら、１９９６）、ならびに次のオリゴヌクレオチド：ＲＢ２０２（５’−ＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣ−３’）（配列番号３７）およびＲＢ２０３（５’−ＡＣＴＴＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＴＴＡＧＣＡＣＡＡＴＣ−３’）（配列番号３８）（部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩに下線を引く）を使用することにより、ＰＣＲによって増幅する。このＰＣＲ産物を酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩによって消化し、ベクターｐＤＢＴ（Ｎａｖａｒｒｏら、１９９７）において部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩのレベルでクローニングする。この構築物の配列を、「Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ」キット（米国、マサチューセッツ州、ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して塩基配列決定により検証する。
【０２６６】
得られた構築物の活性を検証した。これを行うために、レポーター株Ｙ１８７（この株Ｙ１８７は、プロモーターＰｇａｌ１の制御下に置かれた遺伝子ＵＲＡ３を有するものであり、Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、１９９３によって説明された。特に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（米国、バージニア州、マナッサス）から参照番号９６３９９で入手できる。）を、３つのプラスミド対によって形質転換する。これらの対は、次のものである：ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ、ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔ＋ｐＤＢＴ、およびｐＴＡＬ２０＋ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２。２つのプラスミドにより共形質転換された２つのクローンを、これらのプラスミド対の各々について選択する。ウラシルを含有するおよび含有しない最小培地で成長するこれらの能力を試験する。６つの対応するクローンは、ウラシルが存在する状態での最小培地で成長することができることがわかる（図６Ｆ参照）。しかし、ウラシル不在の状態では、プラスミドｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔにより共形質転換された２つのクローンしか成長できない。これは、遺伝子ＵＲＡ３が株Ｙ１８７において活性化され、これにプロモーターＰｇａｌ１を活性化することができる活性転写因子を再構成するＤＢＤ−ｍｄｍ２とＶＰ１６−ｐ５３（１−５５）の間の相互作用が利用されることを示す。従って、使用した構築物の活性が示される。
【０２６７】
次に、株ｙＲＢ４９（ＵＩ系）を、２つのハイブリッドタンパク質ＤＢＤ−ｍｄｍ２およびＶＰ１６−ｐ５３（１−５５）を発現させることができるプラスミド対ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔによって共形質転換する。株ｙＲＢ４９（ＵＩ系）は、対照としてプラスミド対ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２＋ｐＴＡＬ２０によっても共形質転換する。２つのプラスミドによって共形質転換された２つのクローンを、これら２つのプラスミド対の各々について選択する。これらの二重形質転換体の２つのクローンの各々の細胞成長を、実施例６において説明したように、ヒスチジンを含有するおよび含有しない寒天プレート、ならびにヒスチジンを含有せず、漸増濃度の３−ＡＴを含有するまたは含有しない寒天プレートで試験する。図６Ｇに示すように、融合タンパク質ＤＢＤ−ｍｄｍ２とＶＰ１６−ｐ５３（１−５５）の間の相互作用は、干渉構築物ＵＩを有する株の細胞成長を阻害するが、融合タンパク質ＤＢＤ−ｍｄｍ２およびこのドメインＡＤを発現する細胞は、正常に成長する。
【０２６８】
この実験では、５ｍＭまたはそれ以上の濃度の３−ＡＴの存在下では、細胞成長のレベルで差が検出される。
【０２６９】
ダブル・ハイブリッド相互作用により誘導された転写干渉は、ｒＹ２Ｈ ＵＩ系で容易に検出することができると結論付けることができる。
【実施例１１】
【０２７０】
タンパク質間相互作用阻害剤のスクリーニングへのｒＹ２Ｈ ＵＩ転写干渉系の適用：
１１．１ 固体培地での酵母成長の回復についての試験の補正
ゲノムに組み込まれたｒＹ２Ｈ ＵＩ転写干渉系を含有する酵母菌株（ｙＲＢ４９）を使用して、成長の回復についての試験によりタンパク質間相互作用阻害剤を単離した。
【０２７１】
この試験を行うために、特異的タンパク質間相互作用に連結した、ｒＹ２Ｈ ＵＩ転写干渉系を含有する酵母菌株を、３−ＡＴを含有する固体培地に平板接種する。化合物の溶液の液滴を接種用皿に堆積させる。寒天への化合物の拡散により、この堆積ゾーンの周りに濃度勾配が作られる。タンパク質間相互作用を阻害することができる生成物は、細胞成長を可能にし、これは、この堆積ゾーンを取り囲む成長回復輪により反映される。
【０２７２】
このような試験の開発のための条件を決定するために、一連の予備実験を行った。この第一段階は、例えば、ペトリ皿に堆積させる細胞の量を評価するためのものであり、第二段階は、細胞成長を阻害する培地中の３−ＡＴの最小濃度を評価するためのものであった。
【０２７３】
先ず最初に、ＵＩ系の被組み込みバージョンを含有する酵母（ｙＲＢ４９）をプラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５で共形質転換して、この転写干渉系をタンパク質間相互作用カップル、Ｆｅ６５／Ａｐｐの制御下に置いた。次に、ヒスチジンを含有する液体培地でこれらの酵母を培養した。培養物の光学濃度（ＯＤ）が、３の値（１ｍＬ当たり、細胞数３×１０７）に達し次第、細胞を１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離し、滅菌水で２回洗浄し、ＯＤ＝０．１または０．０１で再び懸濁させた。事前に１２０ｍｍ四方のペトリ皿に注入しておいた固体培地の全表面にわたって均一にこの懸濁液の１０ｍＬを平板接種した。１分後、液体を吸引により除去した。これらの皿を層流フードのもとで１５分間乾燥させ、この後、３０℃で４８時間保温した。
【０２７４】
図８Ａは、これらの皿の最適な接種が、最低稀釈、すなわちＤＯ＝０．０１（右側の皿）で達成されたことを示すものである。
【０２７５】
酵母の成長を阻害することができる３−ＡＴの最小濃度を決定するために、ｙＲＢ４９株を、上のようにプラスミドｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ）で、または対照プラスミドｐＴＡＬ２０／ｐＤＢＴ（タンパク質間相互作用を発現しない。）で形質転換した。これら２つの形質転換株を、ヒスチジンを含有するまたはヒスチジンを含有しない、０、０．５または１ｍＭの３−ＡＴを補足した培地に平板接種した。図８Ｂに示されているように、Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用を有する株は、１ｍＭの３−ＡＴを含有する培地では、同じ条件下でこの成長に影響を受けない対照プラスミドを含有するものと比較して、非常に遅延した成長を示す。
【０２７６】
同実験において、この成長回復試験における溶液中の分子の毒性を迅速に試験するために、化合物数１００００のライブラリーから２つの分子をランダムに選択した。ＤＭＳＯに１０ｍＭで溶解した後、各々の１μＬを各皿に堆積させ、１μＬのＤＭＳＯも同様にした。これら２つの分子は、いずれも、酵母の成長を回復することができなかった。しかし、高濃度ではこれらの分子の毒性作用に関連して、分子堆積ゾーンの周りに成長阻害ディスクを生じさせる（図８Ｂ）。
【０２７７】
培地へのヒスチジンの添加は、転写干渉系からこれを除去することによるこれらの株のヒスチジン合成欠如を補正する。上で説明した実験条件により、酵母成長の回復を検出できるようになることを確認するために、プラスミド対ｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５（Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用）で共形質転換したｙＲＢ４９株を、ヒスチジンがなく、１ｍＭの３−Ａｔを補足した上記培地に平板接種し、この後、漸増量のウラシル、アデニン、ロイシンまたはヒスチジンを各皿の中央に堆積させた。
【０２７８】
図８Ｃに示すように、ヒスチジンだけが、堆積物の周りの酵母の成長をこの濃度に依存する様式で回復させることができる。
【０２７９】
１１．２：タンパク質間相互作用阻害剤により誘導される酵母成長回復の検出
上で報告した実験条件を大規模に用いて、分子数１００００のコレクションをスクリーニングした。これらの条件下、このコレクションの各分子を、ヒスチジンがなく、１ｍＭの３−ＡＴを含有する固体培地に、９６−ニードルレプリケーターによって、約０．２μＬの１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液の比率で堆積させた。このスクリーニングに使用したロボットプラットフォームは、以前にＢｅｙｄｏｎら（２０００）によって以前に説明されたものである。酵母成長を回復させることができる２つの分子は、こうして単離した：これら２つの生成物の各々については、高濃度でのこれらの分子の毒性作用に関連して回復成長の強い白色の輪を成長阻害ゾーンの周りで容易に識別することができ、これに対して、対照生成物３については、予想通り、影響はまったく検出されない（図９）。
【０２８０】
この試験で単離した分子の作用の特異性を確認するために、Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用を阻害する可能性を秘めた他の３つの分子（図１１においてＡ、ＢおよびＣと呼ばれているもの）の影響を、この干渉系を使用する別のタイプのタンパク質間相互作用、ｐ５３／ｍｄｍ２相互作用（実施例１０．２参照）を用いて試験した。
【０２８１】
先ず最初に、Ｆｅ６５／Ａｐｐおよびｐ５３／ｍｄｍ２の一機能としてＵＩ干渉系の相対応答を、滴下試験により試験した。例えば、ｐ５３／ｍｄｍ２複合体は、ヒスチジンを含有しないが、Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用を有する株で使用したものより高い３−ＡＴ濃度の培地で、酵母成長を阻害することが観察された（図１０）。これは、ｐ５３／ｍｄｍ２相互作用が、Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用より弱いか、そうでなければこの相互作用が、酵母ではあまりよく発現されないことを示唆している。
【０２８２】
次に、ｙＲＢ４９株をプラスミド対ｐＲＢ３４およびｐＲＢ３５で形質転換してＦｅ６５／Ａｐｐ相互作用を発現させるか、プラスミド対ｐＤＢＴ−ｍｄｍ２およびｐＶＰ１６−ｐ５３Ｎｔで形質転換してｐ５３／ｍｄｍ２相互作用を発現させた。
【０２８３】
これら２つのＦｅ６５／Ａｐｐおよびｐ５３／ｍｄｍ２株を、ヒスチジンがなく、１ｍＭおよび２０ｍＭの３−ＡＴをそれぞれ補足した培地の皿に平板接種した。３つの潜在的阻害分子の各々について、ＤＭＳＯ中０．１、１および１０ｍＭの１μＬの溶液の３滴を皿ごとに堆積させた。加えて、１μＬのヒスチジン（０．１２５％ ｗ／ｖ）を、成長修復の正の対照として、別の皿の中央に堆積させた。前記コレクションから無作為に取り、試験する３つの分子と同じ濃度で使用する生成物を、負の対照として使用した。
【０２８４】
図１１に提示した結果は、生成物ＡおよびＢは、Ｆｅ６５／Ａｐｐ株の回復成長の輪を誘導するので、活性であり、この輪のサイズは、使用する濃度に依存することを示している。このような濃度依存性の輪は、ｐ５３／ｍｄｍ２株については観察されず、これは、これら２つの分子の阻害効果の特異性を実証している。一方、生成物Ｃは、２つの株、Ｆｅ６５／Ａｐｐおよびｐ５３／ｍｄｍ２の成長を誘導し、従って、活性と分類することはできるが、非特異的である。予想どおり、生成物Ｄは、試験した２つの株に対して効果がなく、これは、不活性と考えられる。
【０２８５】
従って、成長回復試験により、分子数が数千のライブラリーから、タンパク質／タンパク質相互作用の特異的阻害剤である分子を単離することができるようになる。
【０２８６】
言及したすべての出版物および特許は、本出願に参照により組み込まれる。
【０２８７】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１Ａ】転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系を示し、逆Ｙ２Ｈ相互作用の検出のための転写干渉の適用を図解する。Ｙ２Ｈ相互作用が不在の状態では、レポーター遺伝子ＨＩＳ３は、正常に発現され、細胞は、ヒスチジンを含有しない培地で成長することができる（図１Ａ）。
【図１Ｂ】転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系を示し、逆Ｙ２Ｈ相互作用の検出のための転写干渉の適用を図解する。Ｙ２Ｈ相互作用の存在は、ＨＩＳ３の転写レベルを低下させ、これに起因して、ヒスチジンについて栄養要求のレポーター株の細胞成長が減少する（図１Ｂ）。
【図２Ａ】転写干渉構築物を示し、転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。
【図２Ｂ】転写干渉構築物を示し、転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。
【図２Ｃ】転写干渉構築物を示し、転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。
【図２Ｄ】転写干渉構築物を示し、転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。
【図２Ｅ】転写干渉構築物を示し、転写干渉に基づきｒＹ２Ｈ系を作るために５つの異なる構築物を利用した。この５つの構築物を縮尺に従って示す（図２Ａから２Ｅ）。
【図３】干渉構築物のゲノム組み込みを示し、転写干渉構築物のゲノム組み込みを図解する。
【図４Ａ】被組み込み干渉系の機能評価の結果を示す。
【図４Ｂ】被組み込み干渉系の機能評価の結果を示す。
【図４Ｃ】被組み込み干渉系の機能評価の結果を示す。
【図４Ｄ】被組み込み干渉系の機能評価の結果を示す。
【図４Ｅ】被組み込み干渉系の機能評価の結果を示す。
【図５Ａ】プラスミドに基づく干渉系の機能評価（ゲノムレベルで組み込まれていないもの）の結果を示す。
【図５Ｂ】プラスミドに基づく干渉系の機能評価（ゲノムレベルで組み込まれていないもの）の結果を示す。
【図５Ｃ】プラスミドに基づく干渉系の機能評価（ゲノムレベルで組み込まれていないもの）の結果を示す。
【図５Ｄ】プラスミドに基づく干渉系の機能評価（ゲノムレベルで組み込まれていないもの）の結果を示す。
【図６Ａ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｂ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｃ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｄ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｅ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｆ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図６Ｇ】Ｙ２Ｈ相互作用により誘導された転写干渉を示す。
【図７Ａ】２つのタンパク質ＹとＸの間の相互作用を阻害するがこのタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用は阻害しない分子を同定することができる、本発明の転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系を示す。
【図７Ｂ】２つのタンパク質ＹとＸの間の相互作用を阻害するがこのタンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用は阻害しない分子を同定することができる、本発明の転写干渉に基づくｒＹ２Ｈ系を示す。
【図８Ａ】Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤をスクリーニングするための実験条件の決定を示し、細胞量の決定を示す。
【図８Ｂ】Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤をスクリーニングするための実験条件の決定を示し、３−ＡＴの濃度の決定を示す。
【図８Ｃ】Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤をスクリーニングするための実験条件の決定を示し、ヒスチジンによる成長の回復を示す。
【図９】成長の修復によるＦｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤の検出について示す。
【図１０】干渉系の活性化についてのＦｅ６５／Ａｐｐとｐ５３／ＭＤＭ２相互作用の比較について示す。
【図１１】Ｆｅ６５／Ａｐｐ相互作用の阻害剤の特異性の確認について示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
干渉ＤＮＡ構築物を含有する細胞であり、
前記構築物は、
第一プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター、いわゆる干渉プロモーター［前記干渉プロモーターの活性化が、前記第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択されおよび配置され、その結果前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。］、
を含み、
前記細胞は、
第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）［前記第一キメラタンパク質は、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるタンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る。］、
第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）［前記第二キメラタンパク質は、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る。］
をさらに発現し、
前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす
前記細胞。
【請求項２】
前記レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターが誘導性プロモーターであること、前記タンパク質Ｙが２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができること、および前記細胞が第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）を発現すること［前記第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）はタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成り、前記２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は前記レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。］を特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記レポーター遺伝子の発現を調節する前記誘導性プロモーターが、前期キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記レポーター遺伝子の発現を調節する前記プロモーターが、構成的プロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記干渉ＤＮＡ構築物によりおよび前記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入された宿主細胞であること、これらの構築物のすべてが１つまたはそれ以上の非組み込みベクターに担持されていることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入された宿主細胞であること、これらの構築物が、１つまたはそれ以上の非組み込みベクターに担持されていること、および前記干渉ＤＮＡ構築物が細胞のゲノムに組み込まれていることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記干渉ＤＮＡ構築物および前記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物が、細胞のゲノムに組み込まれていることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記干渉ＤＮＡ構築物が、摂動性ゲノムの転写活性のない遺伝子座に組み込まれていることを特徴とする、請求項６または７に記載の細胞。
【請求項９】
哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および酵母細胞により形成された群から選択されることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
酵母細胞に関することを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）またはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）種の酵母に関することを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
少なくとも１つの干渉プロモーターが、前記レポーター遺伝子および前記第一プロモーターの下流に、後者とは反対の配向で配置されること（ＤＩ）を特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
少なくとも１つの干渉プロモーターが、前記レポーター遺伝子および前記第一プロモーターの下流に、後者と同じ配向で配置されること（ｎＤＩ）を特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
少なくとも１つの干渉プロモーターが、前記レポーター遺伝子および前記第一プロモーターの上流に、後者と同じ配向で配置されること（ＵＩ）を特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
少なくとも１つの干渉プロモーターが、前記第一プロモーターおよび前記レポーター遺伝子の両側に配置され、前記第一プロモーターおよび前記レポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターが、第一プロモーターに対して集中的な配向を有し、ならびに前記第一プロモーターおよび前記レポーター遺伝子の上流に配置された干渉プロモーターが、前記第一プロモーターのものと同一の配向を有すること（ＵＤＩ）を特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
少なくとも１つの干渉プロモーターが、前記第一プロモーターおよび前記レポーター遺伝子の両側に配置され、前記第一プロモーターおよび前記レポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターが、第一プロモーターに対して対状の配向を有し、ならびに前期第一プロモーターおよび前期レポーター遺伝子の上流に配置された干渉プロモーターが、第一プロモーターのものと同一の配向を有すること（ｎＵＤＩ）を特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記レポーター遺伝子が、細胞の生存に必須の遺伝子であることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記レポーター遺伝子が、一次代謝、細胞分裂、タンパク質合成、ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成に不可欠な遺伝子であることを特徴とする、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記レポーター遺伝子が、それ自体は単独では細胞の生存に必須ではないが、発現が前記転写干渉系により制御されるまたはされない同じタイプの１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子と共同で前期レポーター遺伝子の転写が阻害されるときには細胞の生存に必須であることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記誘導性干渉プロモーターが、前期キメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列（Ｘ−ＤＢＤ）を含むことを特徴とする、請求項１から１９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２１】
前記誘導性干渉プロモーターが、ＧＡＬ４ ＵＡＳ、ＬｅｘＡｏｐ、ｃＩｏｐおよびＴｅｔＲｏｐにより形成された群から選択されるＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有するタンパク質と相互作用することができる配列を含み、ならびに前期キメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤのＤＮＡ結合ドメインが、対応するＤＢＤ（それぞれ、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡ、ｃＩまたはＴｅｔＲ）であることを特徴とする、請求項１から２０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
前記キメラタンパク質Ｙ−ＡＤの転写活性化ドメイン（ＡＤ）が、次のタンパク質：Ｂ４２、ＶＰ１６およびＧＡＬ４ｐの転写活性化ドメインにより形成された群から選択されることを特徴とする、請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記干渉ＤＮＡ構築物が、この末端で、１つまたはそれ以上の一方向性または二方向性転写ターミネーターに隣接していることを特徴とする、請求項１から２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
ａ）請求項１から２３のいずれか一項に記載の細胞を培養する段階、
ｂ）被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下と不在下で比較する段階
を含み、
前記レポーター遺伝子の発現の増加は、前期被検化合物が培養細胞により発現されたタンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であることの指標となる、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害する化合物を同定するための方法。
【請求項２５】
タンパク質間相互作用を阻害する化合物を同定するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項２６】
タンパク質間相互作用を特異的に排除するペプチドまたはタンパク質因子を特定するためにｃＤＮＡバンクまたはペプチドバンクを検索するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項２７】
第一ＤＮＡ構築物［前期第一ＤＮＡ構築物は、
第一プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター（前記誘導性プロモーターの活性化が、前記第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、その結果、前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。）
を含む。］、
第二ＤＮＡ構築物［前記第二ＤＮＡ構築物は、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるパートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）をコードする。］、
第三ＤＮＡ構築物［前記第三ＤＮＡ構築物は、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）
をコードする。］
を含み、前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記２つのキメラタンパク質が宿主細胞において発現されたときに干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす、ダブル・ハイブリッド系を作るためのキット。
【請求項２８】
前記レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターが、誘導性プロモーターであり、前記タンパク質Ｙが、２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができること、ならびに前記キットが、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）をコードする第四ＤＮＡ構築物を含むことを特徴とし、前記２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子の形成をもたらす、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
ａ）請求項２または３に記載の細胞を培養する段階、
被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｄ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下と不在下で比較する段階
（前期レポーター遺伝子の発現の増加は、前記被検化合物がタンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であること、しかし、この生成物は前記タンパク質Ｙと前記タンパク質Ｚの間の相互作用をまったく阻害しないかあまり阻害しないことの指標となる。）
を含む、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害するが、前期タンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用はまったく阻害しないかあまり阻害しない化合物を同定するための方法。
【請求項３０】
Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子ＵＲＡ３のオープンリーディングフレームの上流および下流領域に相同である２つのフラグメントを含有し、ならびにこれら２つのフラグメント間に挿入される配列の遺伝子座ＵＲＡ３のレベルでの相同組換えにより組み込むことができる、酵母組み込みベクター。
【請求項１】
干渉ＤＮＡ構築物を含有する細胞であり、
前記構築物は、
第一プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター、いわゆる干渉プロモーター［前記干渉プロモーターの活性化が、前記第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択されおよび配置され、その結果前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。］、
を含み、
前記細胞は、
第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）［前記第一キメラタンパク質は、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるタンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る。］、
第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）［前記第二キメラタンパク質は、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る。］
をさらに発現し、
前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす
前記細胞。
【請求項２】
前記レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターが誘導性プロモーターであること、前記タンパク質Ｙが２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができること、および前記細胞が第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）を発現すること［前記第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）はタンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成り、前記２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は前記レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子の形成をもたらす。］を特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記レポーター遺伝子の発現を調節する前記誘導性プロモーターが、前期キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記レポーター遺伝子の発現を調節する前記プロモーターが、構成的プロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記干渉ＤＮＡ構築物によりおよび前記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入された宿主細胞であること、これらの構築物のすべてが１つまたはそれ以上の非組み込みベクターに担持されていることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物により形質転換または形質移入された宿主細胞であること、これらの構築物が、１つまたはそれ以上の非組み込みベクターに担持されていること、および前記干渉ＤＮＡ構築物が細胞のゲノムに組み込まれていることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記干渉ＤＮＡ構築物および前記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ構築物が、細胞のゲノムに組み込まれていることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記干渉ＤＮＡ構築物が、摂動性ゲノムの転写活性のない遺伝子座に組み込まれていることを特徴とする、請求項６または７に記載の細胞。
【請求項９】
哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および酵母細胞により形成された群から選択されることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
酵母細胞に関することを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）またはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）種の酵母に関することを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
少なくとも１つの干渉プロモーターが、前記レポーター遺伝子および前記第一プロモーターの下流に、後者とは反対の配向で配置されること（ＤＩ）を特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
少なくとも１つの干渉プロモーターが、前記レポーター遺伝子および前記第一プロモーターの下流に、後者と同じ配向で配置されること（ｎＤＩ）を特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
少なくとも１つの干渉プロモーターが、前記レポーター遺伝子および前記第一プロモーターの上流に、後者と同じ配向で配置されること（ＵＩ）を特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
少なくとも１つの干渉プロモーターが、前記第一プロモーターおよび前記レポーター遺伝子の両側に配置され、前記第一プロモーターおよび前記レポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターが、第一プロモーターに対して集中的な配向を有し、ならびに前記第一プロモーターおよび前記レポーター遺伝子の上流に配置された干渉プロモーターが、前記第一プロモーターのものと同一の配向を有すること（ＵＤＩ）を特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
少なくとも１つの干渉プロモーターが、前記第一プロモーターおよび前記レポーター遺伝子の両側に配置され、前記第一プロモーターおよび前記レポーター遺伝子の下流に位置する干渉プロモーターが、第一プロモーターに対して対状の配向を有し、ならびに前期第一プロモーターおよび前期レポーター遺伝子の上流に配置された干渉プロモーターが、第一プロモーターのものと同一の配向を有すること（ｎＵＤＩ）を特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記レポーター遺伝子が、細胞の生存に必須の遺伝子であることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記レポーター遺伝子が、一次代謝、細胞分裂、タンパク質合成、ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成に不可欠な遺伝子であることを特徴とする、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記レポーター遺伝子が、それ自体は単独では細胞の生存に必須ではないが、発現が前記転写干渉系により制御されるまたはされない同じタイプの１つまたはそれ以上のレポーター遺伝子と共同で前期レポーター遺伝子の転写が阻害されるときには細胞の生存に必須であることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記誘導性干渉プロモーターが、前期キメラタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用することができる配列（Ｘ−ＤＢＤ）を含むことを特徴とする、請求項１から１９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２１】
前記誘導性干渉プロモーターが、ＧＡＬ４ ＵＡＳ、ＬｅｘＡｏｐ、ｃＩｏｐおよびＴｅｔＲｏｐにより形成された群から選択されるＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有するタンパク質と相互作用することができる配列を含み、ならびに前期キメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤのＤＮＡ結合ドメインが、対応するＤＢＤ（それぞれ、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡ、ｃＩまたはＴｅｔＲ）であることを特徴とする、請求項１から２０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
前記キメラタンパク質Ｙ−ＡＤの転写活性化ドメイン（ＡＤ）が、次のタンパク質：Ｂ４２、ＶＰ１６およびＧＡＬ４ｐの転写活性化ドメインにより形成された群から選択されることを特徴とする、請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記干渉ＤＮＡ構築物が、この末端で、１つまたはそれ以上の一方向性または二方向性転写ターミネーターに隣接していることを特徴とする、請求項１から２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
ａ）請求項１から２３のいずれか一項に記載の細胞を培養する段階、
ｂ）被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｃ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下と不在下で比較する段階
を含み、
前記レポーター遺伝子の発現の増加は、前期被検化合物が培養細胞により発現されたタンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であることの指標となる、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害する化合物を同定するための方法。
【請求項２５】
タンパク質間相互作用を阻害する化合物を同定するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項２６】
タンパク質間相互作用を特異的に排除するペプチドまたはタンパク質因子を特定するためにｃＤＮＡバンクまたはペプチドバンクを検索するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項２７】
第一ＤＮＡ構築物［前期第一ＤＮＡ構築物は、
第一プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子、
１つまたはそれ以上の誘導性プロモーター（前記誘導性プロモーターの活性化が、前記第一プロモーターの転写干渉に影響するように選択および配置され、その結果、前記レポーター遺伝子の発現の検出可能な減少をもたらす。）
を含む。］、
第二ＤＮＡ構築物［前記第二ＤＮＡ構築物は、パートナータンパク質Ｘと相互作用することができるパートナータンパク質Ｙに融合した転写活性化ドメイン（ＡＤ）から成る第一キメラタンパク質（Ｙ−ＡＤ）をコードする。］、
第三ＤＮＡ構築物［前記第三ＤＮＡ構築物は、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｘによって形成された第二ドメインに融合した第一ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る第二キメラタンパク質（Ｘ−ＤＢＤ）
をコードする。］
を含み、前記２つのキメラタンパク質Ｘ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記２つのキメラタンパク質が宿主細胞において発現されたときに干渉プロモーターを活性化する機能性転写因子の形成をもたらす、ダブル・ハイブリッド系を作るためのキット。
【請求項２８】
前記レポーター遺伝子の発現を調節するプロモーターが、誘導性プロモーターであり、前記タンパク質Ｙが、２つのパートナータンパク質ＸおよびＺと相互作用することができること、ならびに前記キットが、前記タンパク質Ｙと相互作用することができるタンパク質Ｚによって形成された第二ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）から成る第三キメラタンパク質（Ｚ−ＤＢＤ）をコードする第四ＤＮＡ構築物を含むことを特徴とし、前記２つのキメラタンパク質Ｚ−ＤＢＤおよびＹ−ＡＤの相互作用は、前記レポーター遺伝子の発現を活性化する機能性転写因子の形成をもたらす、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
ａ）請求項２または３に記載の細胞を培養する段階、
被検化合物の存在下で前記細胞を保温する段階、
ｄ）レポーター遺伝子の発現を前記化合物の存在下と不在下で比較する段階
（前期レポーター遺伝子の発現の増加は、前記被検化合物がタンパク質Ｘとこのパートナータンパク質Ｙの相互作用の阻害剤であること、しかし、この生成物は前記タンパク質Ｙと前記タンパク質Ｚの間の相互作用をまったく阻害しないかあまり阻害しないことの指標となる。）
を含む、第一タンパク質Ｘと第二タンパク質Ｙの相互作用を阻害するが、前期タンパク質Ｙと第三タンパク質Ｚの間の相互作用はまったく阻害しないかあまり阻害しない化合物を同定するための方法。
【請求項３０】
Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子ＵＲＡ３のオープンリーディングフレームの上流および下流領域に相同である２つのフラグメントを含有し、ならびにこれら２つのフラグメント間に挿入される配列の遺伝子座ＵＲＡ３のレベルでの相同組換えにより組み込むことができる、酵母組み込みベクター。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５１７５９１（Ｐ２００８−５１７５９１Ａ）
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３７３４３（Ｐ２００７−５３７３４３）
【出願日】平成１７年１０月２４日（２００５．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２６４６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４５９４１
【国際公開日】平成１８年５月４日（２００６．５．４）
【出願人】（５００１５２１１９）アバンテイス・フアルマ・エス・アー (65)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２４日（２００５．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２６４６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４５９４１
【国際公開日】平成１８年５月４日（２００６．５．４）
【出願人】（５００１５２１１９）アバンテイス・フアルマ・エス・アー (65)
【Ｆターム（参考）】
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