軸索再生促進剤
【課題】
中枢神経の軸索の再生を促進することができる新規な軸索再生促進剤を提供すること。
【解決手段】
脂質ラフトを破壊する物質を有効成分として含有する軸索再生促進剤及びコレステロールのキレーターを有効成分として含有する軸索再生促進剤とする。
中枢神経の軸索の再生を促進することができる新規な軸索再生促進剤を提供すること。
【解決手段】
脂質ラフトを破壊する物質を有効成分として含有する軸索再生促進剤及びコレステロールのキレーターを有効成分として含有する軸索再生促進剤とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞、特に、中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進することができる軸索再生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
交通事故等に起因する傷害あるいは脳血管障害等で、脊髄等の中枢神経が損傷を受ける。中枢神経を損傷するとしばしば部分的な麻痺が起きる。従って、損傷した中枢神経を再生させることは医療分野における重要な課題である。
【０００３】
もっとも、成人の中枢神経の軸索が末梢神経のグラフトを介して再生しうる（下記非特許文献１参照）ことから、成人の中枢神経が再生しない主な原因は、神経細胞を取り巻く局所的な環境にあることが示唆されている。これまでに中枢神経の再生を阻害する３つの主な阻害物質としてＮｏｇｏ、ミエリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）、及び稀突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク（ＯＭｇｐ）が同定されている。Ｎｏｇｏはモノクローナル抗体ＩＮ−１の対応抗原として同定されており（下記非特許文献２〜４参照）、ミエリン鞘の形成及び維持に重要な役割を果たすことが知られているＭＡＧ（下記非特許文献５〜８参照）は、ある種のニューロンからの軸索の成長を阻害することが見いだされており（下記非特許文献９、１０参照）、成人中枢神経の白質中の主たるピーナツアグルチニンー結合ポリペプチドであるＯＭｇｐ（非特許文献１１参照）は、軸索成長の第３の阻害物質として同定されている（非特許文献１２、１３参照）。またＮｏｇｏ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐはｐ７５のコレセプターとしてＮｇＲに結合することが知られており、このことはこれらが共通の信号伝達経路を共有していることを示唆している（非特許文献１４〜１７参照）。
【０００４】
従って以上の経緯からこれらの阻害物質を排除又は阻害することにより、軸索を再生することが研究されてきた。しかしながら一方で、これらの阻害物質のそれぞれをノックアウトしたマウスの研究により、これらの阻害物質を排除しただけでは中枢神経の軸索が再生されないことが報告され（非特許文献１８〜２２参照）、更に、機能的なｐ７５を枯渇したり、可溶性ｐ７５−Ｆｃを投与しても、損傷した脊髄の再生が促進されなかったことが報告されている（非特許文献２３参照）。
【０００５】
【非特許文献１】Ｓ．Ｄａｖｉｄ，Ａ．Ｊ．Ａｇｕａｙｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２１４，９３１-３（Ｎｏｖ２０，１９８１）
【非特許文献２】Ｍ．Ｓ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０３，４３４-９（Ｊａｎ２７，２０００）
【非特許文献３】Ｔ．ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｆ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．Ｖａｒｔａｎｉａｎ，Ｓ．Ｍ．Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ４０３，４３９-４４（Ｊａｎ，２０００）
【非特許文献４】Ｐ．Ｃａｒｏｎｉ，Ｍ．Ｅ．Ｓｃｈｗａｂ，Ｎｅｕｒｏｎ １，８５-９６（Ｍａｒ，１９８８）
【非特許文献５】Ｓ．Ｃａｒｅｎｉｎｉ，Ｄ．Ｍｏｎｔａｇ，Ｈ．Ｃｒｅｍｅｒ，Ｍ．Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ，Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｃｅｌｌ ＴｉｓｓｕｅＲｅｓ ２８７，３-９（Ｊａｎ，１９９７）
【非特許文献６】Ｍ．Ｆｒｕｔｔｉｇｅｒ，Ｄ．Ｍｏｎｔａｇ，Ｍ．Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ，Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ７，５１１-５（Ｍａｒ １，１９９５）
【非特許文献７】Ｎ．Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １８，１９７０-８（Ｍａｒ１５，１９９８）
【非特許文献８】Ｊ．Ｍａｒｃｕｓ，Ｊ．Ｌ．Ｄｕｐｒｅｅ，Ｂ．Ｐｏｐｋｏ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５６，５６７-７７（Ｆｅｂ ４，２００２）
【非特許文献９】Ｇ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｐ．Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｆ．Ｓ．Ｗａｌｓｈ，Ｐ．Ｒ．Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｍ．Ｔ．Ｆｉｌｂｉｎ，Ｎｅｕｒｏｎ １３，７５６-６７（Ｓｅｐ， １９９４）
【非特許文献１０】Ｌ．ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １３，８０５-１１（Ｏｃｔ，１９９４）
【非特許文献１１】Ｄ．Ｄ．Ｍｉｋｏｌ，Ｋ．Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０６，１２７３-９（Ａｐｒ，１９８８）
【非特許文献１２】Ｖ．Ｋｏｔｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ８２，１５６６-９（Ｓｅｐ，２００２）
【非特許文献１３】Ｋ．Ｃ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１７，９４１-４（Ｊｕｎ２７，２００２）
【非特許文献１４】Ｋ．Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ａ．Ｋｉｍ，Ｒ．Ｓｉｖａｓａｎｋａｒａｎ，Ｒ．Ｓｅｇａｌ，Ｚ．Ｈｅ，Ｎａｔｕｒｅ ４２０，７４-８（Ｎｏｖ，２００２）
【非特許文献１５】Ｍ．Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３５，２８３-９０（Ｊｕｌ１８，２００２）
【非特許文献１６】Ａ．Ｅ．Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｔ．ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｓ．Ｍ．Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ４０９，３４１-６（Ｊａｎ １８，２００１）
【非特許文献１７】Ｔ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｈ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．Ｔｏｈｙａｍａ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５７，５６５-７０（Ｍａｙ １３，２００２）
【非特許文献１８】Ｕ．Ｂａｒｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １５，１３７５-８１（Ｄｅｃ，１９９５）
【非特許文献１９】Ｃ．Ｊ．Ｗｏｏｌｆ，Ｎｅｕｒｏｎ ３８，１５３-６（Ａｐｒ ２４，２００３）
【非特許文献２０】Ｊ．Ｅ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｌｉ，Ｔ．ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｄ．Ｑｉｕ，Ｓ．Ｍ．Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ ３８，１８７-９９（Ａｐｒ ２４，２００３）
【非特許文献２１】Ｂ．Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３８，２１３-２４（Ａｐｒ２４，２００３）
【非特許文献２２】Ｍ．Ｓｉｍｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３８，２０１-１１（Ａｐｒ２４，２００３）
【非特許文献２３】Ｘ．Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４，５４２-６（Ｊａｎ１４，２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は上記課題を鑑み、中枢神経の軸索の再生を促進することができる新規な軸索再生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、これまでの軸索の再生を阻害する物質であると考えられているＭＡＧやＮｏｇｏのシグナル伝達の場が細胞膜上の脂質ラフトに存在することを見いだした。そしてこの脂質ラフトを破壊することにより、再生阻害物質の阻害効果が消失したことを確認し、脂質ラフトを破壊することが軸索の再生促進に有効であることを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明にかかる軸索再生促進剤は、脂質ラフトを破壊する物質を有効成分として含有することを特徴とし、更に望ましくはこの場合において脂質ラフトを破壊する物質はコレステロールのキレーターである。なおここで脂質ラフトを破壊するとは、脂質ラフトの機能を失わせることをいう。
【発明の効果】
【０００９】
以上、本発明によれば、中枢神経の軸索再生を促進することができる、新規な軸索再生促進剤を提供することができる。特に、本発明の軸索再生促進剤は中枢神経の軸索の再生に有効であり、脊髄等の中枢神経に損傷を受けた患者の治療等に大いに寄与すると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本実施形態に係る軸索再生促進剤（以下「本軸索再生促進剤」）は、コレステロールのキレーターを有効成分として含有するものである。細胞膜表面のコレステロールをキレートすることにより、脂質ラフトに豊富なコレステロールを低下させることで、脂質ラフトを破壊することができる。
【００１１】
脂質ラフトを破壊するためには、種々のものを用いることができ、例えば後述の実施例にて示すようにコレステロールのキレーターが望ましく、更に具体的にはｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎが好適である。なお、脂質ラフトを破壊する物質としてはコレステロールのキレーターが、その確実性と可逆性により、望ましいが、それ以外にも細胞膜表面からコレステロールを隔離する薬剤、細胞においてコレステロールの合成を阻害する薬剤、セラミドの合成を阻害する薬剤なども考えられる。なお、コレステロールを隔離する薬剤としては例えばＦｉｌｉｐｉｎ３、Ｎｙｓｔａｔｉｎ、ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎが、コレステロールの合成を阻害する薬剤としてはｌｏｖａｓｔｉｎ、ｍｅｖａｓｔａｔｉｎが、セラミドの合成を阻害する薬剤としてはｆｕｍｏｓｉｎＢが、例示される。
【００１２】
なお、ｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎの構造は次の通りである。
Ｃ４３ Ｈ７３ Ｏ３５
【００１３】
本軸索再生促進剤の投与経路は経口投与、非経口投与が考えられ、そのなかでも非経口投与、特に神経の損傷部に直接注射することが好ましい。なお経口投与の場合、その投与量は通常０．０１ｍｇから１０ｍｇの範囲内であることが好ましく、非経口投与、例えば静脈注射等の場合は通常０．１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲内であることが好ましい。
【００１４】
また、上記例として、ｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎを用いた場合、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、ｆｉｌｉｐｉｎ３を用いた場合、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、Ｎｙｓｔａｔｉｎを用いた場合１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢを用いた場合、２．５ｎｇ／ｍｌ〜２．５ｇ／ｍｌ、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎを用いた場合、４０ｎＭ〜４００ｍＭ、ｌｏｖａｓｔｉｎを用いた場合、１５ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、ｍｅｖａｓｔａｔｉｎを用いた場合、０．０４ｕＭ〜４００ｍＭ、ｆｕｍｏｓｉｎＢを用いた場合、１０ｎＭ〜１００ｍＭ、投与することが望ましい。
【００１５】
本軸索再生促進剤を投与する場合、そのまま投与することも可能であるが、通常、医薬で用いられる担体を用いて製剤される。製剤に用いる担体としては、製剤分野で常用されるいずれのものも用いることができ、例えば、注射剤の調製には生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水等が好ましく用いられる。さらに、乳化剤や浸透圧調整剤等の常用される添加剤を含めてもよい。
【００１６】
本軸索再生促進剤は、神経細胞、特に脊髄等の中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進するのに有効である。従って、事故等に起因する中枢神経の損傷の治療に用いることができる。なお、後述する実施例では、マウスのニューロンを取り出して試験しているため、ＭＡＧｍＮｏｇｏ又はミエリンを添加して実験を行っているが、生体内の神経線維では、これらは神経鞘中に含まれているので、軸索再生促進剤中にＭＡＧ、Ｎｏｇｏ又はミエリンを別途添加する必要はない。
【実施例】
【００１７】
以下、上記軸索再生促進剤の効果を確かめるべく、マウスのニューロンを取り出して試験を行った。以下に詳述する。なお本実施例においてはコレステロールのキレーターとしてｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎを用いた。
【００１８】
（材料と方法）
（１）成長円錐虚脱アッセイ
１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジンをあらかじめコートしたプラスチックのスライド上で、胎生１２日のニワトリの後根神経節の外植片をインキュベートし、ＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ／ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）で十分間処理した。外植片を４％（Ｗ／Ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光標識したファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社製））で染色した。各実験において、少なくとも１００個の成長円錐を調べ、同じ実験を三回繰り返した。
【００１９】
（２）軸索伸展アッセイ
１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジンをあらかじめコートしたプラスチックのスライド上で、生後７日の野生型及びＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｙｌ-ａｌｐｈａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ：（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｙｌ）−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ−ｂｅｔａ−１，４−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（以下「ＧａｌＮＡｃＴ」）とｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
８ （ａｌｐｈａ−２，８−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）Ａ（以下「ＧＤ３Ｓ」）のノックアウトマウスの小脳顆粒細胞を単離し、ＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ／ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）と共に、２４時間培養した。４％（Ｗ／Ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞骨格特異的蛋白であるβ−ｔｕｂｕｌｉｎ−ＩＩＩに対する一次抗体（Ｔｕｊ−１（ｃｏｖａｎｃｅ社製））蛍光標識した二次抗体（Ａｌｅｘａ-５４６ （ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社製））で染色した。各実験において、少なくとも１００個の神経細胞を調べ、同じ実験を三回繰り返した。
【００２０】
（３）Ｒｈｏ 活性化アッセイ
１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジンをあらかじめコートしたプラスチックのスライド上で、生後７日の野生型及びノックアウトマウスの小脳顆粒細胞を単離し、２４時間培養した。その後、ＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ／ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）、抗ガングリオシドＧＴ１ｂ抗体（生化学工業）抗ガングリオシドＧＤ１ａ抗体（生化学工業）抗ガングリオシドＧＭ１抗体（生化学工業）で十分間処理し、細胞を０．６ｍｌの溶解バッファーで溶解し、ＧＳＴ結合型Ｒｈｏｔｅｋｉｎと４５分間４℃でインキュベートし、ウェスタンブロッティング法で解析した。
【００２１】
（４）ショ糖密勾配遠心法
１００μｇ/ｍｌのポリ−Ｌ−リジンをあらかじめコートしたプラスチックの培養皿上で、生後７日の野生型マウスの小脳顆粒細胞を単離培養し、ＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ/ｍｌ）、Ｎｏｇｏペプチド（４μＭ）抗ガングリオシドＧＴ１ｂ抗体（生化学工業）、抗ガングリオシドＧＤ１ａ抗体（生化学工業）、抗ガングリオシドＧＭ１抗体（生化学工業）で十分間処理した。０．５ｍｌの溶解バッファーで細胞を溶解後、８０%ショ糖液を０．５ｍｌ加え、更に８ｍｌの３０%ショ糖液と１ｍｌの超純水を重層した。３５０００回転で、１２時間から１６時間超遠心し、上層より０．８３ｍｌずつ回収した溶液をウェスタンブロッティング法にて解析した。
【００２２】
（結果）
（１）成長円錐虚脱アッセイ
神経成長円錐に対するＭＡＧ及びＮｏｇｏの効果を調べるために、胎生１２日のニワトリの後根神経節の外植片を用いた。ＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ/ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）を槽内投与（ｂａｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）すると、有意な成長円錐虚脱活性を示した。この結果を図１に示す。図１によると、ｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎの存在下（図中ＭβＣＤ（＋））においては、ＭＡＧ−Ｆｃ及びＮｏｇｏペプチドによる成長円錐虚脱活性が消失したことが確認できる。なお図中のデータは、平均±標準誤差を示しており、米印は統計学的に有意であることを示している。
【００２３】
（２）軸索伸展アッセイ
小脳顆粒細胞に対するＭＡＧ及びＮｏｇｏの効果を調べるために、生後七日のＧａｌＮＡｃＴとＧＤ３Ｓ のノックアウトマウスより単離した小脳顆粒細胞をＭＡＧ-Ｆｃ（２５μｇ/ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）と共に２４時間培養した。この結果を図２に示す。この図によると、ＧａｌＮＡｃＴのノックアウトマウスより単離した小脳顆粒細胞に対しては、ＭＡＧによる効果が消失していたがＮｏｇｏの効果は見られた。またＧＤ３Ｓのノックアウトマウスより単離した小脳顆粒細胞に対しては、ＭＡＧによる効果及びＮｏｇｏによる効果が消失していた。更に、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ-ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ（以下ＰＩ-ＰＬＣ）により細胞を処理した場合においては、ＭＡＧ及びＮｏｇｏの効果が両方消失していた。なお図中のデータは、平均±標準誤差を示しており、米印は統計学的に有意であることを示している。
【００２４】
（３）Ｒｈｏ活性化アッセイ
同様にＲｈｏの活性化を評価した結果を図３に示す。この結果、上記軸索進呈アッセイの結果と同様に、ＧａｌＮＡｃＴのノックアウトマウスより得られた小脳顆粒細胞のみ、ＭＡＧの効果が消失していることが確認できた。抗ガングリオシドＧＴ１ｂ及びＧＤ１ａの抗体においてもＲｈｏの活性化が認められた。なお図中のデータは、平均±標準誤差を示しており、米印は統計学的に有意であることを示している。
【００２５】
（４）ショ糖密度勾配遠心法
脂質ラフトにおけるｐ７５、ガングリオシドの発現をショ糖密度勾配遠心法及びウェスタンブロッティング法にて評価した。図４にこの結果を示す。この結果により、ｐ７５のほとんどが脂質ラフト外にある一方、ガングリオシドが脂質ラフトに集積していることが確認できた。また、単離した小脳顆粒細胞をＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ/ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）で十分間処理したショ糖密度勾配遠心法にて評価した。この結果を図５に示す。この結果、ＭＡＧ−Ｆｃ又はＮｏｇｏを加えた場合ｐ７５の脂質ラフトへの集積が認められ、また、抗ガングリオシドＧＴ１ｂ及びＧＤ１ａの抗体にても同様の結果が得られた。なお図中のデータは、平均±標準誤差を示し、米印は統計学的に有意であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
以上のとおり、本発明に係る軸索再生促進剤は、損傷した中枢神経の再生に有効であり、中枢神経系を損傷した患者のための治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】成長円錐虚脱アッセイの結果を示す図。
【図２】軸索伸展アッセイの結果を示す図。
【図３】Ｒｈｏ活性化アッセイの結果を示す図。
【図４】ショ糖密度勾配遠心法による結果を示す図。
【図５】ウェスタンブロッティング法による結果を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞、特に、中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進することができる軸索再生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
交通事故等に起因する傷害あるいは脳血管障害等で、脊髄等の中枢神経が損傷を受ける。中枢神経を損傷するとしばしば部分的な麻痺が起きる。従って、損傷した中枢神経を再生させることは医療分野における重要な課題である。
【０００３】
もっとも、成人の中枢神経の軸索が末梢神経のグラフトを介して再生しうる（下記非特許文献１参照）ことから、成人の中枢神経が再生しない主な原因は、神経細胞を取り巻く局所的な環境にあることが示唆されている。これまでに中枢神経の再生を阻害する３つの主な阻害物質としてＮｏｇｏ、ミエリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）、及び稀突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク（ＯＭｇｐ）が同定されている。Ｎｏｇｏはモノクローナル抗体ＩＮ−１の対応抗原として同定されており（下記非特許文献２〜４参照）、ミエリン鞘の形成及び維持に重要な役割を果たすことが知られているＭＡＧ（下記非特許文献５〜８参照）は、ある種のニューロンからの軸索の成長を阻害することが見いだされており（下記非特許文献９、１０参照）、成人中枢神経の白質中の主たるピーナツアグルチニンー結合ポリペプチドであるＯＭｇｐ（非特許文献１１参照）は、軸索成長の第３の阻害物質として同定されている（非特許文献１２、１３参照）。またＮｏｇｏ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐはｐ７５のコレセプターとしてＮｇＲに結合することが知られており、このことはこれらが共通の信号伝達経路を共有していることを示唆している（非特許文献１４〜１７参照）。
【０００４】
従って以上の経緯からこれらの阻害物質を排除又は阻害することにより、軸索を再生することが研究されてきた。しかしながら一方で、これらの阻害物質のそれぞれをノックアウトしたマウスの研究により、これらの阻害物質を排除しただけでは中枢神経の軸索が再生されないことが報告され（非特許文献１８〜２２参照）、更に、機能的なｐ７５を枯渇したり、可溶性ｐ７５−Ｆｃを投与しても、損傷した脊髄の再生が促進されなかったことが報告されている（非特許文献２３参照）。
【０００５】
【非特許文献１】Ｓ．Ｄａｖｉｄ，Ａ．Ｊ．Ａｇｕａｙｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２１４，９３１-３（Ｎｏｖ２０，１９８１）
【非特許文献２】Ｍ．Ｓ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０３，４３４-９（Ｊａｎ２７，２０００）
【非特許文献３】Ｔ．ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｆ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．Ｖａｒｔａｎｉａｎ，Ｓ．Ｍ．Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ４０３，４３９-４４（Ｊａｎ，２０００）
【非特許文献４】Ｐ．Ｃａｒｏｎｉ，Ｍ．Ｅ．Ｓｃｈｗａｂ，Ｎｅｕｒｏｎ １，８５-９６（Ｍａｒ，１９８８）
【非特許文献５】Ｓ．Ｃａｒｅｎｉｎｉ，Ｄ．Ｍｏｎｔａｇ，Ｈ．Ｃｒｅｍｅｒ，Ｍ．Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ，Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｃｅｌｌ ＴｉｓｓｕｅＲｅｓ ２８７，３-９（Ｊａｎ，１９９７）
【非特許文献６】Ｍ．Ｆｒｕｔｔｉｇｅｒ，Ｄ．Ｍｏｎｔａｇ，Ｍ．Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ，Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ７，５１１-５（Ｍａｒ １，１９９５）
【非特許文献７】Ｎ．Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １８，１９７０-８（Ｍａｒ１５，１９９８）
【非特許文献８】Ｊ．Ｍａｒｃｕｓ，Ｊ．Ｌ．Ｄｕｐｒｅｅ，Ｂ．Ｐｏｐｋｏ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５６，５６７-７７（Ｆｅｂ ４，２００２）
【非特許文献９】Ｇ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｐ．Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｆ．Ｓ．Ｗａｌｓｈ，Ｐ．Ｒ．Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｍ．Ｔ．Ｆｉｌｂｉｎ，Ｎｅｕｒｏｎ １３，７５６-６７（Ｓｅｐ， １９９４）
【非特許文献１０】Ｌ．ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １３，８０５-１１（Ｏｃｔ，１９９４）
【非特許文献１１】Ｄ．Ｄ．Ｍｉｋｏｌ，Ｋ．Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０６，１２７３-９（Ａｐｒ，１９８８）
【非特許文献１２】Ｖ．Ｋｏｔｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ８２，１５６６-９（Ｓｅｐ，２００２）
【非特許文献１３】Ｋ．Ｃ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１７，９４１-４（Ｊｕｎ２７，２００２）
【非特許文献１４】Ｋ．Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ａ．Ｋｉｍ，Ｒ．Ｓｉｖａｓａｎｋａｒａｎ，Ｒ．Ｓｅｇａｌ，Ｚ．Ｈｅ，Ｎａｔｕｒｅ ４２０，７４-８（Ｎｏｖ，２００２）
【非特許文献１５】Ｍ．Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３５，２８３-９０（Ｊｕｌ１８，２００２）
【非特許文献１６】Ａ．Ｅ．Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｔ．ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｓ．Ｍ．Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ４０９，３４１-６（Ｊａｎ １８，２００１）
【非特許文献１７】Ｔ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｈ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．Ｔｏｈｙａｍａ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５７，５６５-７０（Ｍａｙ １３，２００２）
【非特許文献１８】Ｕ．Ｂａｒｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １５，１３７５-８１（Ｄｅｃ，１９９５）
【非特許文献１９】Ｃ．Ｊ．Ｗｏｏｌｆ，Ｎｅｕｒｏｎ ３８，１５３-６（Ａｐｒ ２４，２００３）
【非特許文献２０】Ｊ．Ｅ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｌｉ，Ｔ．ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｄ．Ｑｉｕ，Ｓ．Ｍ．Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ ３８，１８７-９９（Ａｐｒ ２４，２００３）
【非特許文献２１】Ｂ．Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３８，２１３-２４（Ａｐｒ２４，２００３）
【非特許文献２２】Ｍ．Ｓｉｍｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３８，２０１-１１（Ａｐｒ２４，２００３）
【非特許文献２３】Ｘ．Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４，５４２-６（Ｊａｎ１４，２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は上記課題を鑑み、中枢神経の軸索の再生を促進することができる新規な軸索再生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、これまでの軸索の再生を阻害する物質であると考えられているＭＡＧやＮｏｇｏのシグナル伝達の場が細胞膜上の脂質ラフトに存在することを見いだした。そしてこの脂質ラフトを破壊することにより、再生阻害物質の阻害効果が消失したことを確認し、脂質ラフトを破壊することが軸索の再生促進に有効であることを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明にかかる軸索再生促進剤は、脂質ラフトを破壊する物質を有効成分として含有することを特徴とし、更に望ましくはこの場合において脂質ラフトを破壊する物質はコレステロールのキレーターである。なおここで脂質ラフトを破壊するとは、脂質ラフトの機能を失わせることをいう。
【発明の効果】
【０００９】
以上、本発明によれば、中枢神経の軸索再生を促進することができる、新規な軸索再生促進剤を提供することができる。特に、本発明の軸索再生促進剤は中枢神経の軸索の再生に有効であり、脊髄等の中枢神経に損傷を受けた患者の治療等に大いに寄与すると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本実施形態に係る軸索再生促進剤（以下「本軸索再生促進剤」）は、コレステロールのキレーターを有効成分として含有するものである。細胞膜表面のコレステロールをキレートすることにより、脂質ラフトに豊富なコレステロールを低下させることで、脂質ラフトを破壊することができる。
【００１１】
脂質ラフトを破壊するためには、種々のものを用いることができ、例えば後述の実施例にて示すようにコレステロールのキレーターが望ましく、更に具体的にはｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎが好適である。なお、脂質ラフトを破壊する物質としてはコレステロールのキレーターが、その確実性と可逆性により、望ましいが、それ以外にも細胞膜表面からコレステロールを隔離する薬剤、細胞においてコレステロールの合成を阻害する薬剤、セラミドの合成を阻害する薬剤なども考えられる。なお、コレステロールを隔離する薬剤としては例えばＦｉｌｉｐｉｎ３、Ｎｙｓｔａｔｉｎ、ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎが、コレステロールの合成を阻害する薬剤としてはｌｏｖａｓｔｉｎ、ｍｅｖａｓｔａｔｉｎが、セラミドの合成を阻害する薬剤としてはｆｕｍｏｓｉｎＢが、例示される。
【００１２】
なお、ｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎの構造は次の通りである。
Ｃ４３ Ｈ７３ Ｏ３５
【００１３】
本軸索再生促進剤の投与経路は経口投与、非経口投与が考えられ、そのなかでも非経口投与、特に神経の損傷部に直接注射することが好ましい。なお経口投与の場合、その投与量は通常０．０１ｍｇから１０ｍｇの範囲内であることが好ましく、非経口投与、例えば静脈注射等の場合は通常０．１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲内であることが好ましい。
【００１４】
また、上記例として、ｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎを用いた場合、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、ｆｉｌｉｐｉｎ３を用いた場合、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、Ｎｙｓｔａｔｉｎを用いた場合１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢを用いた場合、２．５ｎｇ／ｍｌ〜２．５ｇ／ｍｌ、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎを用いた場合、４０ｎＭ〜４００ｍＭ、ｌｏｖａｓｔｉｎを用いた場合、１５ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、ｍｅｖａｓｔａｔｉｎを用いた場合、０．０４ｕＭ〜４００ｍＭ、ｆｕｍｏｓｉｎＢを用いた場合、１０ｎＭ〜１００ｍＭ、投与することが望ましい。
【００１５】
本軸索再生促進剤を投与する場合、そのまま投与することも可能であるが、通常、医薬で用いられる担体を用いて製剤される。製剤に用いる担体としては、製剤分野で常用されるいずれのものも用いることができ、例えば、注射剤の調製には生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水等が好ましく用いられる。さらに、乳化剤や浸透圧調整剤等の常用される添加剤を含めてもよい。
【００１６】
本軸索再生促進剤は、神経細胞、特に脊髄等の中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進するのに有効である。従って、事故等に起因する中枢神経の損傷の治療に用いることができる。なお、後述する実施例では、マウスのニューロンを取り出して試験しているため、ＭＡＧｍＮｏｇｏ又はミエリンを添加して実験を行っているが、生体内の神経線維では、これらは神経鞘中に含まれているので、軸索再生促進剤中にＭＡＧ、Ｎｏｇｏ又はミエリンを別途添加する必要はない。
【実施例】
【００１７】
以下、上記軸索再生促進剤の効果を確かめるべく、マウスのニューロンを取り出して試験を行った。以下に詳述する。なお本実施例においてはコレステロールのキレーターとしてｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎを用いた。
【００１８】
（材料と方法）
（１）成長円錐虚脱アッセイ
１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジンをあらかじめコートしたプラスチックのスライド上で、胎生１２日のニワトリの後根神経節の外植片をインキュベートし、ＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ／ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）で十分間処理した。外植片を４％（Ｗ／Ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光標識したファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社製））で染色した。各実験において、少なくとも１００個の成長円錐を調べ、同じ実験を三回繰り返した。
【００１９】
（２）軸索伸展アッセイ
１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジンをあらかじめコートしたプラスチックのスライド上で、生後７日の野生型及びＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｙｌ-ａｌｐｈａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ：（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｙｌ）−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ−ｂｅｔａ−１，４−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（以下「ＧａｌＮＡｃＴ」）とｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
８ （ａｌｐｈａ−２，８−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）Ａ（以下「ＧＤ３Ｓ」）のノックアウトマウスの小脳顆粒細胞を単離し、ＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ／ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）と共に、２４時間培養した。４％（Ｗ／Ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞骨格特異的蛋白であるβ−ｔｕｂｕｌｉｎ−ＩＩＩに対する一次抗体（Ｔｕｊ−１（ｃｏｖａｎｃｅ社製））蛍光標識した二次抗体（Ａｌｅｘａ-５４６ （ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社製））で染色した。各実験において、少なくとも１００個の神経細胞を調べ、同じ実験を三回繰り返した。
【００２０】
（３）Ｒｈｏ 活性化アッセイ
１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジンをあらかじめコートしたプラスチックのスライド上で、生後７日の野生型及びノックアウトマウスの小脳顆粒細胞を単離し、２４時間培養した。その後、ＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ／ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）、抗ガングリオシドＧＴ１ｂ抗体（生化学工業）抗ガングリオシドＧＤ１ａ抗体（生化学工業）抗ガングリオシドＧＭ１抗体（生化学工業）で十分間処理し、細胞を０．６ｍｌの溶解バッファーで溶解し、ＧＳＴ結合型Ｒｈｏｔｅｋｉｎと４５分間４℃でインキュベートし、ウェスタンブロッティング法で解析した。
【００２１】
（４）ショ糖密勾配遠心法
１００μｇ/ｍｌのポリ−Ｌ−リジンをあらかじめコートしたプラスチックの培養皿上で、生後７日の野生型マウスの小脳顆粒細胞を単離培養し、ＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ/ｍｌ）、Ｎｏｇｏペプチド（４μＭ）抗ガングリオシドＧＴ１ｂ抗体（生化学工業）、抗ガングリオシドＧＤ１ａ抗体（生化学工業）、抗ガングリオシドＧＭ１抗体（生化学工業）で十分間処理した。０．５ｍｌの溶解バッファーで細胞を溶解後、８０%ショ糖液を０．５ｍｌ加え、更に８ｍｌの３０%ショ糖液と１ｍｌの超純水を重層した。３５０００回転で、１２時間から１６時間超遠心し、上層より０．８３ｍｌずつ回収した溶液をウェスタンブロッティング法にて解析した。
【００２２】
（結果）
（１）成長円錐虚脱アッセイ
神経成長円錐に対するＭＡＧ及びＮｏｇｏの効果を調べるために、胎生１２日のニワトリの後根神経節の外植片を用いた。ＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ/ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）を槽内投与（ｂａｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）すると、有意な成長円錐虚脱活性を示した。この結果を図１に示す。図１によると、ｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎの存在下（図中ＭβＣＤ（＋））においては、ＭＡＧ−Ｆｃ及びＮｏｇｏペプチドによる成長円錐虚脱活性が消失したことが確認できる。なお図中のデータは、平均±標準誤差を示しており、米印は統計学的に有意であることを示している。
【００２３】
（２）軸索伸展アッセイ
小脳顆粒細胞に対するＭＡＧ及びＮｏｇｏの効果を調べるために、生後七日のＧａｌＮＡｃＴとＧＤ３Ｓ のノックアウトマウスより単離した小脳顆粒細胞をＭＡＧ-Ｆｃ（２５μｇ/ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）と共に２４時間培養した。この結果を図２に示す。この図によると、ＧａｌＮＡｃＴのノックアウトマウスより単離した小脳顆粒細胞に対しては、ＭＡＧによる効果が消失していたがＮｏｇｏの効果は見られた。またＧＤ３Ｓのノックアウトマウスより単離した小脳顆粒細胞に対しては、ＭＡＧによる効果及びＮｏｇｏによる効果が消失していた。更に、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ-ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ（以下ＰＩ-ＰＬＣ）により細胞を処理した場合においては、ＭＡＧ及びＮｏｇｏの効果が両方消失していた。なお図中のデータは、平均±標準誤差を示しており、米印は統計学的に有意であることを示している。
【００２４】
（３）Ｒｈｏ活性化アッセイ
同様にＲｈｏの活性化を評価した結果を図３に示す。この結果、上記軸索進呈アッセイの結果と同様に、ＧａｌＮＡｃＴのノックアウトマウスより得られた小脳顆粒細胞のみ、ＭＡＧの効果が消失していることが確認できた。抗ガングリオシドＧＴ１ｂ及びＧＤ１ａの抗体においてもＲｈｏの活性化が認められた。なお図中のデータは、平均±標準誤差を示しており、米印は統計学的に有意であることを示している。
【００２５】
（４）ショ糖密度勾配遠心法
脂質ラフトにおけるｐ７５、ガングリオシドの発現をショ糖密度勾配遠心法及びウェスタンブロッティング法にて評価した。図４にこの結果を示す。この結果により、ｐ７５のほとんどが脂質ラフト外にある一方、ガングリオシドが脂質ラフトに集積していることが確認できた。また、単離した小脳顆粒細胞をＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ/ｍｌ）又はＮｏｇｏペプチド（４μＭ）で十分間処理したショ糖密度勾配遠心法にて評価した。この結果を図５に示す。この結果、ＭＡＧ−Ｆｃ又はＮｏｇｏを加えた場合ｐ７５の脂質ラフトへの集積が認められ、また、抗ガングリオシドＧＴ１ｂ及びＧＤ１ａの抗体にても同様の結果が得られた。なお図中のデータは、平均±標準誤差を示し、米印は統計学的に有意であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
以上のとおり、本発明に係る軸索再生促進剤は、損傷した中枢神経の再生に有効であり、中枢神経系を損傷した患者のための治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】成長円錐虚脱アッセイの結果を示す図。
【図２】軸索伸展アッセイの結果を示す図。
【図３】Ｒｈｏ活性化アッセイの結果を示す図。
【図４】ショ糖密度勾配遠心法による結果を示す図。
【図５】ウェスタンブロッティング法による結果を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質ラフトを破壊する物質を有効成分として含有する軸索再生促進剤。
【請求項２】
前記ラストを破壊する物質は、コレステロールのキレーターであることを特徴とする請求項１記載の軸索再生促進剤。
【請求項３】
前記コレステロールのキレーターは、ｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎであることを特徴とする請求項２記載の軸索再生促進剤。
【請求項４】
コレステロールのキレーターを有効成分として含有する軸索再生促進剤。
【請求項５】
前記コレステロールのキレーターは、ｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎであることを特徴とする請求項４記載の軸索再生促進剤。
【請求項１】
脂質ラフトを破壊する物質を有効成分として含有する軸索再生促進剤。
【請求項２】
前記ラストを破壊する物質は、コレステロールのキレーターであることを特徴とする請求項１記載の軸索再生促進剤。
【請求項３】
前記コレステロールのキレーターは、ｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎであることを特徴とする請求項２記載の軸索再生促進剤。
【請求項４】
コレステロールのキレーターを有効成分として含有する軸索再生促進剤。
【請求項５】
前記コレステロールのキレーターは、ｍｅｔｈｙｌ-ｂｅｔａ-ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎであることを特徴とする請求項４記載の軸索再生促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−２４９０１７（Ｐ２００６−２４９０１７Ａ）
【公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−６９４９９（Ｐ２００５−６９４９９）
【出願日】平成１７年３月１１日（２００５．３．１１）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１１日（２００５．３．１１）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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