透明化羊膜の作製方法及び透明化羊膜
【課題】
本発明は、眼科分野においては眼表面の保護や創傷治癒効果を目的としてすでに羊膜移植が広く行われている反面、羊膜の透明性が低いことによる移植後の視力低下の改善を課題とする。また、角膜移植における、ドナー不足や拒絶反応の問題に対し、透明性が高く、拒絶反応を生じにくく、さらに羊膜同等の眼表面の治癒効果が得られる移植材料の開発を課題とする。
【解決手段】
単離された羊膜を脱水し、必要に応じて架橋処理を施すことにより、湿潤な生理条件でもコラーゲン線維間距離が極端に短く、間隙が狭い状態が維持され、透明性が持続する羊膜を調製する。
なし
本発明は、眼科分野においては眼表面の保護や創傷治癒効果を目的としてすでに羊膜移植が広く行われている反面、羊膜の透明性が低いことによる移植後の視力低下の改善を課題とする。また、角膜移植における、ドナー不足や拒絶反応の問題に対し、透明性が高く、拒絶反応を生じにくく、さらに羊膜同等の眼表面の治癒効果が得られる移植材料の開発を課題とする。
【解決手段】
単離された羊膜を脱水し、必要に応じて架橋処理を施すことにより、湿潤な生理条件でもコラーゲン線維間距離が極端に短く、間隙が狭い状態が維持され、透明性が持続する羊膜を調製する。
なし
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、羊膜を透明化する方法に関する。より詳しくは、羊膜を不可逆的に透明化する方法と前記方法によって得られた透明化羊膜、及びその角膜移植材料等への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、重篤な角膜障害に対しては、アイバンク眼の移植が行われているが、絶対的なドナー不足と他家移植に伴う拒絶反応などの問題がある。しかしながら、角膜障害に対する移植術について、臨床的に実用化の域に達している代替材料は極めて少ない。例えば、移植の１割を占める角膜上皮移植については、発明者らが開発した培養自家口腔粘膜のみである（特許文献１及び非特許文献１）。移植の４割といわれる角膜実質移植については、現在の臨床応用されている代替材料はない。
【０００３】
上記のような問題を解消するために、人工角膜の開発等、生体組織以外の材料を角膜の代替物として角膜移植に用いる試みもなされてきた。例えば、ガラスや合成高分子（ＰＭＭＡ、ＰＨＥＭＡ等）の使用は２００年以上前から既に試みられている（非特許文献２）。しかしながら、人工角膜はホスト角膜の融解を引き起こして脱落することが明らかになり（非特許文献３）、標準治療として利用し得る人工角膜は未だに開発されていない。角膜の主成分であるコラーゲンをゲル化させた人工角膜実質の開発も報告されているが、縫合糸に対する脆弱性など、臨床応用にあたっては克服すべき課題が数多く残されている（非特許文献４）。
【０００４】
発明者らは、単離された強膜（白目）を透明化し、これを角膜実質移植材料として利用する技術を確立している（特許文献２）。しかしながら、この技術には、用いる強膜組織が他家由来であるため拒絶反応を生じる可能性があり、その供給に限界がること。また、得られる強膜の透明度が架橋しても６０％程度しかないため、臨床に必要な７０〜８０％の透明度にするためには、レーザー処理等のさらなる処理を必要とするという問題がある。
【０００５】
一方、薬剤や自然乾燥による脱水作用で皮膚が透明化する現象が報告されている（非特許文献５）。しかしながら、臨床応用を目的とした透明化条件の検討や、移植材料として不可欠な湿潤条件下（生理的条件下）で透明性を維持する技術の開発は行われていない。
【０００６】
羊膜は癒着防止効果、消炎効果、血管浸入抑制効果、抗菌効果、拒絶反応を生じにくいといった特長を有しており、眼科分野においては眼表面の保護や創傷治癒効果を目的として用いられている。しかしながら、羊膜は透明性が低いため、眼部に適用すると著しい視力低下が生じてしまう。もし羊膜の透明度を改善することができれば、視力を維持しながら眼表面を保護する眼科移植材料として極めて有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−１３０８３８
【特許文献２】特開２００９−２８５１５５
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nishida K et al., New England Journal of Medicine, (2004) 351:1187-1196
【非特許文献２】Casy TA and Mayer DJ, Corneal Grafting, W.B. Saunders Company (1984)
【非特許文献３】Hicks CR et al., Progress in Retinal and Eye Research (2000) 19:249-
【非特許文献４】Griffith M et al., Investigative Ophthalmology and Visual Science (2006) 47:1869-1875
【非特許文献５】Viator JA et al., Physics Medicine and Biology, (2003) 48:N15-N24
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、透明性が高く、拒絶反応を生じにくい新規な角膜移植材料を開発し、角膜移植におけるドナー不足や拒絶反応の問題を解決することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、発明者らは癒着防止、血管浸入抑制等の優れた効果を有し、拒絶反応が生じにくい羊膜に注目し、この羊膜を特殊な方法により透明化し、その透明性を湿潤条件下（生理的条件下）においても維持させる方法を見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、単離された羊膜を脱水処理のみ、又は脱水処理と架橋処理との組み合わせにより、湿潤な生理条件下でも透明性が持続する羊膜を得ることを特徴とする、透明化羊膜の調製方法に関する。
【００１２】
脱水は、例えば、自然乾燥により行うことができる。自然乾燥により羊膜を脱水する方法としては、例えば、羊膜の少なくとも一部分が外気と接触する条件下で、２〜１０℃にて少なくとも３０分以上、好ましくは１２時間以上静置する方法などを挙げることができる。
上記した方法のほか、吸湿性化合物で処理することにより羊膜を脱水してもよい。
【００１３】
架橋処理は、架橋剤を用いた化学的架橋、あるいは熱架橋や紫外線架橋を含む物理的架橋により実施することができる。
【００１４】
用いる架橋剤としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含む水溶性カルボジイミド系架橋剤；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）やＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを含むスクシンイミド系架橋剤；ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤；エチレングリコールジエチルエーテル等のポリエポキシ系架橋剤；エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテルを含むグリシジルエーテル系架橋剤；グルタールアルデヒド；パラホルムアルデヒド；非共有結合型コラーゲン架橋剤（コラーゲンモデルペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている分子構造を有する架橋剤：ＷＯ２００９/１３６５９９）；及び、トランスグルタミナーゼから選ばれる１又は２以上の組合せを挙げることができる。
【００１５】
本明細書の実施例では、一例として、脱水処理のみを行う方法、脱水処理後にＥＤＣ及び／又はＮＨＳを用いた化学的架橋による方法について記載した。脱水処理のみを行う方法では架橋によって生じる毒性のリスクが生じない。またＥＤＣ/ＮＨＳを使用する場合であっても架橋後のサンプルに残留しないため、架橋化羊膜を臨床適用した際に、その分解によって架橋剤由来の有毒な物質が体内に放出される危険性がないという点で優れている。
なお、架橋処理は１回でもよいし、必要であれば、２回以上行ってもよい。
【００１６】
本発明はまた、線維径１００μ以下の細く均一なコラーゲン線維を含み、湿潤条件下でもその線維間距離が生理条件よりも短いことを特徴とする、単離された透明化羊膜を提供する。
【００１７】
こうした透明化羊膜は、例えば、上述した方法により調製することができる。すなわち、低温乾燥や加圧等によって、線維が密にパッキングされた透明化羊膜を得ることができ、さらに線維間に導入された架橋によりこの状態を維持することができる。
【００１８】
本発明の透明化羊膜は、可視領域における透過率が少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。これだけの透明度があれば、特別な処理を施すことなく、角膜保護材等の眼科用移植材料としてそのまま利用できる。
【００１９】
本発明の透明化羊膜は、湿潤な生理条件下においても透明性が維持されることを特徴とする。それゆえ、本発明の透明化羊膜は、角膜実質組織代替物などの角膜移植材料として利用することができる。より高い透明度が必要な場合は、レーザー処理で表面形状をスムーズにすることにより透明度を向上させることもできる。
【００２０】
このほか、本発明の透明化羊膜は培養粘膜上皮細胞や培養内皮細胞のキャリアシートとしても利用できる。
【発明の効果】
【００２１】
透明な生体組織は角膜以外に存在しないため、これまで重篤な角膜障害においては、主にアイバンク眼を用いた移植治療しか行うことができなかった。本発明によれば、通常出産後に廃棄されている羊膜を材料として、透明な組織が簡便に調製できる。羊膜は、癒着防止効果、消炎効果、血管浸入抑制効果、抗菌効果、拒絶反応が生じにくいといった利点を有し、無機・高分子材料を用いた人工材料のような拒絶反応や副作用のリスクがないため、角膜移植材料（とくに、角膜実質組織代替物）として有用である。
【００２２】
また羊膜は眼科分野においては眼表面の保護や創傷治癒効果を目的として広く用いられている。しかしながら、羊膜は透明性が低いため、眼部に適用すると著しい視力低下が生じてしまう。もし羊膜の透明度を改善することができれば、視力を維持しながら眼表面を保護する眼科移植材料として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、低温乾燥させたヒト羊膜の透明度を表す。 Ａは、低温乾燥後のヒト羊膜（Ｄｒｙ）、未処理の湿潤状態のヒト羊膜（Ｎａｔｉｖｅ−Ｗｅｔ）の４００〜７００ｎｍにおける透過率を示すグラフである（横軸は波長、縦軸は透過率）。 Ｂは、低温乾燥後のヒト羊膜（Ｄｒｙ）、未処理の湿潤状態のヒト羊膜（Ｎａｔｉｖｅ−Ｗｅｔ）の４００ｎｍ、５５０ｎｍ、７００ｎｍにおける透過率を示すグラフである（横軸は波長、縦軸は透過率）。
【図２】図２は、ＥＤＣ／ＮＨＳによる架橋処理後の羊膜の透明性を表す。 Ａは、湿潤条件下における、各サンプルの写真を示す（左から、未処理（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、０％ＥＤＣ/０％ＮＨＳ架橋処理、０．１％ＥＤＣ/０．０５％ＮＨＳ架橋処理、１．０％ＥＤＣ/０．５％ＮＨＳ架橋処理）。 Ｂは、各サンプルの湿潤状態における透過率を示すグラフである（横軸は波長、縦軸は透過率：グラフ下から、未処理（Ｎａｔｉｖｅ）、０％ＥＤＣ/０％ＮＨＳ架橋処理、０．１％ＥＤＣ/０．０５％ＮＨＳ架橋処理、１．０％ＥＤＣ/０．５％ＮＨＳ架橋処理）。 Ｃは、架橋サンプルの５５０ｎｍにおける透過率を示すグラフである（左から、０％ＥＤＣ/０％ＮＨＳ架橋処理、０．１％ＥＤＣ/０．０５％ＮＨＳ架橋処理、１．０％ＥＤＣ/０．５％ＮＨＳ架橋処理）。
【図３】図３は、ＥＤＣ／ＮＨＳ（２：１）で架橋したブタ羊膜の透明性を表す。 Ａは、架橋処理前のブタ羊膜（ＰＢＳ中）の写真である。 Ｂは、湿潤条件下での架橋処理したブタ羊膜の写真である（左から、ＥＤＣ濃度０％、０．０１％、０．１％、１．０％、１０．０％）。 Ｃは、低温乾燥後のブタ羊膜（Ｄｒｙ）、未処理の湿潤状態のブタ羊膜（Ｗｅｔ）、架橋処理後の湿潤状態におけるブタ羊膜（Ｓｉｎｇｌｅ）の５５０ｎｍにおける透過率を比較したグラフである（横軸はＥＤＣ濃度、縦軸は透過率）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、羊膜を透明化する方法と、前記方法によって得られた透明化羊膜、及び前記透明化羊膜の角膜移植材料への応用に関する。
【００２５】
１．定義
羊膜
羊膜は胎盤の一部で、胎児を包み、羊水を保持する薄い膜である。羊膜は、上皮細胞層、基底膜層、緻密層の三層からなり、ヒト羊膜の場合、大きさは約２０ｃｍ×３０ｃｍ、厚さは５０〜８０μｍである。
【００２６】
羊膜はコラーゲンやラミニン、ニドゲンからなる厚い基底膜を持ち、血管成分を含まず、移植に用いても拒絶反応が起こりにくいという特長を有する。また、羊膜は、非常に薄く、透明性があり、柔軟でありながら丈夫であるという特性も有する。さらに、羊膜は、抗炎症作用、癒着防止効果、抗菌効果、基底膜保持機能等も有するため、古くから外科領域等における創傷被覆材や手術後の癒着防止材として用いられてきた。
【００２７】
羊膜は凍結乾燥により常温で保存することが可能であり、再度水分を含ませることにより容易に柔軟性を取り戻す。また羊膜は、現在は出産後に廃棄物として扱われているため、その使用には倫理的な問題もなく、再生治療用素材として極めて有望である。
【００２８】
羊膜は、上記のような特性を有し、眼球の形状を維持するのに十分な強度を有するため、これを透明化した本発明の透明化羊膜は、角膜損傷患者の処置において非常に有用な移植材料となり得る。
【００２９】
本発明で用いられる羊膜の由来は、ヒトに近い皮膚組織を有する哺乳動物であればとくに限定されないが、移植材料として利用する場合は、移植を受ける個体と同種であることが好ましい。「同種」とは、羊膜を摘出される動物（ドナー）と、それから得られた材料を移植される動物（レシピエント）とが同じ動物種に属することを意味する。例えば、本発明の方法を用いて作製された材料を移植されるレシピエントがヒトである場合、ドナーもまたヒトであることが好ましい。ドナーとレシピエントが同種であることにより、異種生物組織を移植した場合に惹起される拒絶反応を防ぐことができる。また、ドナーとレシピエントが同種であることは、異種動物間での病原体の交差感染を防ぐ点でも有利である。
【００３０】
透明化
本発明において「透明化」とは、可視光の透過率が少なくとも部分的に上昇することを意味する。好ましくは、少なくとも５５％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％である。
【００３１】
本発明において、羊膜の透明化は生理条件下、すなわち湿潤条件においても維持される。羊膜中の線維は他組織と比較して線維径が細く（１００μｍ以下）均一であるため、一時的な脱水を伴う処理を行うことにより、湿潤条件下でもその透明性が失われることなく、不可逆的にその透明性が維持される。また、脱水後に架橋処理を行うことにより脱水時の構造が効果的に保持され、湿潤条件下での透明性がさらに向上する。
【００３２】
脱水
本発明において「脱水」とは、生体から摘出された羊膜の水分量が少なくとも部分的に低下することを意味する。本発明における脱水工程で達成される水分含有量は、好ましくは３０％、２０％、１５％、１０％、５％又は２％であり、より好ましくは１０％以下である。脱水は、後述するように、自然乾燥（低温乾燥）あるいは吸湿性化合物を用いた方法等により実施できる。
【００３３】
架橋
「架橋」は、主に高分子化合物同士（あるいは高分子化合物内部、高分子化合物と低分子化合物）の結合である。本発明の場合、架橋は羊膜、特にこれを構成するコラーゲン線維間に形成される。架橋の方法は特に限定されず、化学的架橋、物理的架橋、光架橋のいずれであってもよい。架橋方法や架橋条件については、「２．２ 架橋工程」において詳述する。
【００３４】
２．羊膜の透明化
本発明にかかる羊膜は、単離された羊膜を脱水し、架橋処理を施すことにより調製することができる。
【００３５】
２．１ 脱水工程
本発明において、脱水は、例えば、自然乾燥（低温乾燥）、凍結乾燥、減圧乾燥、吸湿性化合物での処理などにより行うことができる。
【００３６】
（１）自然乾燥
本発明の一実施形態では、脱水工程は、自然乾燥により行う。乾燥時間は、羊膜の厚さ等に依存する。例えば、通常のヒト羊膜（５０〜８０μｍ）の厚みであれば、２時間程で透明になる。また架橋処理を繰り返す場合は、２回目以降の乾燥に要する時間はさらに短くなり、３０分程度でも透明性が得られる場合もある。基本的には、低温で長時間置くほど透明性は向上する。
【００３７】
好ましい実施形態では、吸湿性化合物はグリセロールである。グリセロール処理は、羊膜をグリセロール含有溶液に浸漬することにより行う。グリセロール溶液のグリセロール濃度は、好ましくは４０〜１００％（ｖ／ｖ）、より好ましくは６０〜１００％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは１００％である。グリセロールは、人体への使用に推奨されているグレードのものであることが望ましい。グリセロール溶液の溶媒としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）などが挙げられる。ＰＢＳが好ましい。浸漬時間は、羊膜の透明化が十分に達成される時間であれば特に制限されないが、好ましくは少なくとも３分間、より好ましくは少なくとも５分間、さらに好ましくは少なくとも１０分間である。
【００３８】
以下の実施例において具体的に示すとおり、上記のように自然乾燥又はグリセロール処理などの脱水工程により透明化した羊膜は、水溶液中にて水和させても透明性を維持し、脱水処理前の羊膜よりも透明性が著しく改善される。しかしながら、その透明性は約６０〜７５％程度であり、更なる改善の余地がある。架橋処理を施すことにより、水溶液中の透明性をさらに改善することができる。
【００３９】
２．２ 架橋工程
本発明において、架橋は、架橋剤や縮合剤を用いた化学的架橋、γ線、紫外線、熱脱水、電子線等を用いた物理的架橋などにより実施できる。
【００４０】
（１）化学的架橋
化学的架橋は、動物組織中のタンパク質又は糖を架橋し得る架橋剤や縮合剤を用いて実施できる。例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含む水溶性カルボジイミド系架橋剤；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）やＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを含むスクシンイミド系架橋剤；ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤；エチレングリコールジエチルエーテル等のポリエポキシ系架橋剤；エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテルを含むグリシジルエーテル系架橋剤；グルタールアルデヒド；パラホルムアルデヒド；非共有結合型コラーゲン架橋剤；及び、トランスグルタミナーゼから選ばれる１又は２以上の架橋剤を用いて実施できる。
【００４１】
ここで、「非共有結合型コラーゲン架橋剤」とは、ＷＯ２００９/１３６５９９に記載された架橋剤であって、末端に２個以上のＯＨ基（好ましくは３〜１６個）を有する多価アルコールからなるスペーサー及び、該ＯＨ基を介して、３つのアミノ酸の繰り返しで構成されるコラーゲンペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている、非共有結合型コラーゲン架橋剤。あるいは、金粒子からなるスペーサー及び、３つのアミノ酸の繰り返しで構成されるコラーゲンペプチド又はコラーゲンモデルペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている、非共有結合型コラーゲン架橋剤を意味する。前記多価アルコールとしては、ペンタエリトリトールテトラポリエチレングリコールエーテルの４価アルコール、又はヘキサグリセロールオクタポリエチレングリコールエーテルの８価アルコールが挙げられる。前記アームとしては、一般式 (Ｙ−Ｘ−Ｇ)n（式中,Ｇはグリシン残基:Ｘ及びＹは、それぞれ独立してアラニン残基（Ａ）、プロリン残基（Ｐ）、ヒドロキシプロリン残基（Ｏ）等のアミノ酸残基；nは１〜５０の整数）で示されるものが挙げられる。
【００４２】
架橋条件は、用いる架橋剤と試料の量に応じて、適宜設定される。例えば、脱水した羊膜を、架橋剤水溶液に適当な時間浸漬することにより行うことができる。
【００４３】
本発明の実施例では、ＥＤＣ／ＮＨＳの組み合わせを用いた。この場合、ＥＤＣとＮＨＳとの濃度比は、約２：１（重量比）であることが好ましく、ＥＤＣの濃度は、０．０１〜２０重量％、特に０．１〜１０重量％であることが好ましい。ＥＤＣ及びＮＨＳは、人体への使用に推奨されているグレードのものであるのが望ましい。
【００４４】
なお、水溶液中で架橋処理を行う場合、膨潤と架橋の競争反応となるため、架橋反応が遅い場合は効果を得にくい可能性があるので注意が必要である。
【００４５】
（２）紫外線架橋
紫外線架橋とは、照射した光のエネルギーにより組織中のタンパク質、糖などが架橋されることであると考えられる。紫外線照射による光架橋は、具体的には、クリーンベンチ内などで通常用いられるＵＶランプ光の下、５〜１４日間程度静置することにより行うことができる。この場合、架橋効率を向上させるために、脱水前に羊膜をリボフラビンで処理するのが望ましい。リボフラビン処理は、例えば、４℃にて２〜３時間、０．１重量％リボフラビン／ＰＢＳ中に組織を浸漬することにより行うことができる。
【００４６】
好ましい架橋の程度は、具体的数値として示すことはできないが、羊膜内部での光の散乱が生じにくいように、線維間隙が極端に狭く安定化され、組織の透明性が維持できる程度に導入されればよい。架橋が不十分では透明性が維持できず、架橋が過剰であると透明性は損なわれるからである。
【００４７】
１回の架橋により十分な架橋が達成できない場合、架橋工程は、２回以上反復して実施してもよい。用いる架橋方法（架橋剤やその濃度）にもよるが、脱水と架橋の過程を複数回繰り返すことによって、厚い組織であっても内部まで均一な架橋を施すことができる。またこの様な過程を繰り返すことにより、透明性を得るのに必要とされる架橋剤の量を減らすことができる。本発明の実施例では、ＥＤＣ／ＮＨＳの組み合わせを用いた。この場合、ＥＤＣとＮＨＳとの濃度比は、約２：１（重量比）であることが好ましく、ＥＤＣの濃度は、０．０１〜１０重量％、特に０．１〜１重量％であることが好ましく、２回以上繰り返すことが好ましい。
【００４８】
２．３ 加圧処理
ブタの皮膚真皮組織を加圧すると透明になるという現象が報告されている。加圧は脱水を伴って線維間距離を短縮させうる。それゆえ、加圧工程を行ってから架橋工程を行い、透明化羊膜を得ることもできる。
【００４９】
２．４ 菲薄化、レーザー処理（透明度の向上）
乾燥、架橋処理によって得られる羊膜は、可視領域における透過率が７０％〜８０％以上有しており、そのまま眼科領域での保護剤として臨床応用可能である。しかしながら、さらなる透明度の向上を必要とする場合は、エキシマレーザー等で表面加工処理を施してスムーズにすることにより、その透過率をより高めることができる。
【００５０】
３．透明化羊膜
３．１ 透明性
上記した方法によって得られた透明化羊膜は、生理条件下、すなわち湿潤条件においてもその透明性が維持される。つまり、羊膜中の線維は他組織と比較して細線維径が細く均一であるため、一時的な脱水を伴う処理を行うことにより、湿潤条件下でもその透明性が失われることなく、不可逆的にその透明性が維持される。また、脱水後に架橋処理を行うことにより脱水時の構造が効果的に保持され、湿潤条件下での透明性がさらに向上する。
【００５１】
上記した方法によって得られる羊膜は、可視領域での透明性は脱水-未架橋処理の場合、７０％程度、架橋処理を伴う場合は透明度が８０％程度である。なお、可視領域とは、具体的には３５０〜７５０ｎｍ程度の波長領域をいう。
【００５２】
従来公知の透明化強膜（特開２００９−２８５１５５）の透明度は、架橋前で１０％以下、架橋後でも６０％程度であるため、臨床で必要とされる透明度（７０〜８０％）にするために、菲薄化やレーザー処理等のさらなる処理を施すことが必要であった。本発明の透明化羊膜は上記のとおり高い透明度を有し、さらなる処理を必要とすることなく、臨床に供することができる。さらにあえて毒性のリスクが伴う架橋処理を行わずとも臨床に必要とされる透明性が得られるため、早期の実用化が見込まれる。
【００５３】
３．２ コラーゲン線維
羊膜中のコラーゲン線維には細線維径を制御する役割を担うＶ型コラーゲンが含まれており、他の組織より細く（５０ｎｍ程度）均一に制御されている。本発明の透明化羊膜においては、脱水処理を行うことでコラーゲン線維間の距離を著しく短くし、その後再水和させても、透明性の向上が達成される。すなわち、ゆっくりと乾燥された羊膜組織内ではコラーゲン線維が密にパッキングされ、光の散乱が生じにくくなるが、再水和させてとしても脱水時の線維構造が水和時の構造に反映され、光の乱反射が抑制される。この現象は羊膜特異的であり、強膜の様に細線維径が大きく不均一で光透過性の低い他の組織では、脱水処理を行ったとしても再水和時に透明性の向上は得られない。上記の様な羊膜の特異的な構造的は、高い初期光透過率や再水和後の線維構造の不可逆性に影響し、本発明で得られる特徴的な透明性の向上につながった。また強膜の場合と同様に脱水後の架橋処理により、乾燥時の密なコラーゲン線維構造がより安定的に維持され、未架橋時よりも高い透明性が得られる。また、この様な構造的変換とコラーゲン線維内及び線維間の架橋により高い弾性率を有する素材が達成される。
【００５４】
４．角結膜組織再建の移植材料
本発明の透明化羊膜は、可視領域において７０〜８０％以上の透明度を有し、生理的条件下においても安定的にその透明性が維持される。また、羊膜組織は抗炎症効果、癒着防止効果を有し、本来眼科分野においては眼表面の保護や創傷治癒効果を目的として広く用いられている。本発明の透明化羊膜は視力を維持しながら、従来と同様の使用法で同様の治療効果が得られる眼科移植材料として極めて有用である。また、本発明の透明化羊膜は角膜移植材料、とくに角膜実質組織代替物としても有用である。
【００５５】
前述したとおり、羊膜は廃棄物扱いであるため、その使用に倫理的問題がない。また、免疫拒絶を生じる可能性が低いため、拒絶反応のリスクがない、安全な角膜移植が可能となる。
【００５６】
なお、本発明の透明化羊膜は調製後すぐに利用しない場合は、凍結もしくは冷蔵することによって保存することが好ましい。
【００５７】
５．培養細胞シートのキャリア
本発明の透明化羊膜は適当な強度と弾力性を有する、それゆえ、これを支持体として、培養粘膜上皮細胞や、角膜上皮あるいは角膜内皮細胞を培養することにより、これら培養細胞を用いて作製される細胞シートのキャリアとしても利用できる。
【００５８】
以下、実施例により、本発明について具体的に説明するが、これらの実施例は例示であって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５９】
低温乾燥によるヒト羊膜の透明化
材料及び方法
ヒト羊膜（東北大学病院産婦人科より供与）は、ＰＢＳ中、−８０℃にて凍結保存した。この凍結羊膜を４〜８℃（冷蔵庫内）で解凍し、生理食塩水を用いてオーバーナイトで洗浄し残留する血液を除去した。
【００６０】
得られたヒト羊膜を試験サンプルとして５ｍｍ×１５ｍｍにカットし、１枚のスライドガラス上に置き、２００μに維持されるように間にシリコンスペーサーを入れてカバーガラスを被せ、サンプルとガラスの間の隙間を満たすようにすみやかに生理食塩水を入れた。
【００６１】
湿潤状態のサンプルを分析後、蒸留水を用いて、４〜８℃にてオーバーナイトで脱塩した。余分な水分を除去し、４〜８℃（冷蔵庫内）にてオーバーナイトで乾燥させた。
次いで、１時間室温に置いた後、水分を加えることなく、乾燥状態のサンプルの透過率を測定した。
【００６２】
結果及び考察
図１に示されるように、羊膜の４００〜７００ｎｍでの透過率は、簡単な低温乾燥によって顕著に向上することが確認された。また、透過率は短波長側でより高い値を示した（図１Ｂ）。
【００６３】
化学的架橋による透明化の維持
材料及び方法
臨床においては、透明性が湿潤状態においても維持されることが必要である。そこで、上記の方法にしたがって乾燥させた羊膜サンプルを、架橋剤ＥＤＣ/ＮＨＳ（０．１ｗｔ％/０．０５ｗｔ％、１．０ｗｔ％/０．５ｗｔ％）を含む蒸留水もしくは架橋剤を含まない蒸留水で室温（約２３℃）にて２時間処理し、生理食塩水で洗浄した。ＥＤＣ/ＮＨＳは架橋後のサンプルに残留しないため、架橋化羊膜を臨床適用した際に、その分解によって架橋剤由来の有毒な物質が放出される恐れがない。
ＥＤＣ:１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ピアス社製）
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（和光純薬工業製）
架橋後の羊膜サンプル（ｎ＝３）は、湿潤状態にて４００〜７００ｎｍでの透過率を測定した。
【００６４】
結果及び考察
低温乾燥による強膜の透明化は可逆的であり、水溶液中で膨潤し、乾燥処理前と同様にまで透明性が低下する。しかし図２に示されるように、低温乾燥による羊膜の透明化は、不可逆的であり、水溶液中で膨潤させても高い光透過率が維持され（５５０ｎｍで７０．１％）、乾燥処理前のレベル（ｎａｔｉｖｅ）にまで透明性が低下しない。また架橋処理後の羊膜の透過率は湿潤状態においてさらに高い透過率（５５０ｎｍで８０％）を有する。
【実施例２】
【００６５】
ブタ羊膜を用いた架橋条件の検討
材料及び方法
１．架橋剤の濃度
実施例１の方法にしたがって低温乾燥したブタ羊膜サンプルを、架橋剤ＥＤＣ/ＮＨＳを含む蒸留水もしくは架橋剤を含まない蒸留水で常温（約２３℃）にて２時間処理し、ＰＢＳで洗浄した。架橋剤は、ＥＤＣ/ＮＨＳ（２:１）の比率を維持し、ＥＤＣの濃度を０．０〜１０．０％まで変化させた。
【００６６】
架橋した乾燥透明化羊膜サンプルはＰＢＳに浸漬した後、その透過率（５５０ｎｍ）を測定した。対照として、乾燥処理する前の羊膜（Ｗｅｔ）、架橋処理前の乾燥透明化羊膜（Ｄｒｙ）の透過率もそれぞれ示した。
【００６７】
結果及び考察
図３に示すように、０．０１〜１．０ｗｔ％ ＥＤＣまでは、架橋剤の濃度にかかわらず９０％以上の透過率が得られたが、１０ｗｔ％ ＥＤＣでは架橋処理を施さない乾燥羊膜よりも低い透過率であった（図３Ｃ）。適切な架橋剤濃度（０．０１〜１．０ｗｔ％ ＥＤＣ）においては、湿潤状態において、極めて高い透明性を有する羊膜が得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
羊膜は、通常廃棄物として扱われているため、その使用には倫理的な問題がなく、また癒着防止効果、消炎効果、血管浸入抑制効果、抗菌効果、拒絶反応のリスクが少ないといった医療材料として優れた特長を有している。本発明の透明化羊膜は、湿潤状態においても７０％〜８０％以上の高い透明性を有し、また副作用のリスクもないため、視野を損なわずに、眼科分野にて従来行われている様膜移植と同様の使用法で同様の優れた治療効果が得られる眼表面再建用移植材料として極めて有用である。また、本発明の透明化羊膜は角膜移植材料、とくに角膜実質組織代替物や培養細胞シートのキャリアとしても極めて有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、羊膜を透明化する方法に関する。より詳しくは、羊膜を不可逆的に透明化する方法と前記方法によって得られた透明化羊膜、及びその角膜移植材料等への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、重篤な角膜障害に対しては、アイバンク眼の移植が行われているが、絶対的なドナー不足と他家移植に伴う拒絶反応などの問題がある。しかしながら、角膜障害に対する移植術について、臨床的に実用化の域に達している代替材料は極めて少ない。例えば、移植の１割を占める角膜上皮移植については、発明者らが開発した培養自家口腔粘膜のみである（特許文献１及び非特許文献１）。移植の４割といわれる角膜実質移植については、現在の臨床応用されている代替材料はない。
【０００３】
上記のような問題を解消するために、人工角膜の開発等、生体組織以外の材料を角膜の代替物として角膜移植に用いる試みもなされてきた。例えば、ガラスや合成高分子（ＰＭＭＡ、ＰＨＥＭＡ等）の使用は２００年以上前から既に試みられている（非特許文献２）。しかしながら、人工角膜はホスト角膜の融解を引き起こして脱落することが明らかになり（非特許文献３）、標準治療として利用し得る人工角膜は未だに開発されていない。角膜の主成分であるコラーゲンをゲル化させた人工角膜実質の開発も報告されているが、縫合糸に対する脆弱性など、臨床応用にあたっては克服すべき課題が数多く残されている（非特許文献４）。
【０００４】
発明者らは、単離された強膜（白目）を透明化し、これを角膜実質移植材料として利用する技術を確立している（特許文献２）。しかしながら、この技術には、用いる強膜組織が他家由来であるため拒絶反応を生じる可能性があり、その供給に限界がること。また、得られる強膜の透明度が架橋しても６０％程度しかないため、臨床に必要な７０〜８０％の透明度にするためには、レーザー処理等のさらなる処理を必要とするという問題がある。
【０００５】
一方、薬剤や自然乾燥による脱水作用で皮膚が透明化する現象が報告されている（非特許文献５）。しかしながら、臨床応用を目的とした透明化条件の検討や、移植材料として不可欠な湿潤条件下（生理的条件下）で透明性を維持する技術の開発は行われていない。
【０００６】
羊膜は癒着防止効果、消炎効果、血管浸入抑制効果、抗菌効果、拒絶反応を生じにくいといった特長を有しており、眼科分野においては眼表面の保護や創傷治癒効果を目的として用いられている。しかしながら、羊膜は透明性が低いため、眼部に適用すると著しい視力低下が生じてしまう。もし羊膜の透明度を改善することができれば、視力を維持しながら眼表面を保護する眼科移植材料として極めて有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−１３０８３８
【特許文献２】特開２００９−２８５１５５
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nishida K et al., New England Journal of Medicine, (2004) 351:1187-1196
【非特許文献２】Casy TA and Mayer DJ, Corneal Grafting, W.B. Saunders Company (1984)
【非特許文献３】Hicks CR et al., Progress in Retinal and Eye Research (2000) 19:249-
【非特許文献４】Griffith M et al., Investigative Ophthalmology and Visual Science (2006) 47:1869-1875
【非特許文献５】Viator JA et al., Physics Medicine and Biology, (2003) 48:N15-N24
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、透明性が高く、拒絶反応を生じにくい新規な角膜移植材料を開発し、角膜移植におけるドナー不足や拒絶反応の問題を解決することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、発明者らは癒着防止、血管浸入抑制等の優れた効果を有し、拒絶反応が生じにくい羊膜に注目し、この羊膜を特殊な方法により透明化し、その透明性を湿潤条件下（生理的条件下）においても維持させる方法を見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、単離された羊膜を脱水処理のみ、又は脱水処理と架橋処理との組み合わせにより、湿潤な生理条件下でも透明性が持続する羊膜を得ることを特徴とする、透明化羊膜の調製方法に関する。
【００１２】
脱水は、例えば、自然乾燥により行うことができる。自然乾燥により羊膜を脱水する方法としては、例えば、羊膜の少なくとも一部分が外気と接触する条件下で、２〜１０℃にて少なくとも３０分以上、好ましくは１２時間以上静置する方法などを挙げることができる。
上記した方法のほか、吸湿性化合物で処理することにより羊膜を脱水してもよい。
【００１３】
架橋処理は、架橋剤を用いた化学的架橋、あるいは熱架橋や紫外線架橋を含む物理的架橋により実施することができる。
【００１４】
用いる架橋剤としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含む水溶性カルボジイミド系架橋剤；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）やＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを含むスクシンイミド系架橋剤；ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤；エチレングリコールジエチルエーテル等のポリエポキシ系架橋剤；エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテルを含むグリシジルエーテル系架橋剤；グルタールアルデヒド；パラホルムアルデヒド；非共有結合型コラーゲン架橋剤（コラーゲンモデルペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている分子構造を有する架橋剤：ＷＯ２００９/１３６５９９）；及び、トランスグルタミナーゼから選ばれる１又は２以上の組合せを挙げることができる。
【００１５】
本明細書の実施例では、一例として、脱水処理のみを行う方法、脱水処理後にＥＤＣ及び／又はＮＨＳを用いた化学的架橋による方法について記載した。脱水処理のみを行う方法では架橋によって生じる毒性のリスクが生じない。またＥＤＣ/ＮＨＳを使用する場合であっても架橋後のサンプルに残留しないため、架橋化羊膜を臨床適用した際に、その分解によって架橋剤由来の有毒な物質が体内に放出される危険性がないという点で優れている。
なお、架橋処理は１回でもよいし、必要であれば、２回以上行ってもよい。
【００１６】
本発明はまた、線維径１００μ以下の細く均一なコラーゲン線維を含み、湿潤条件下でもその線維間距離が生理条件よりも短いことを特徴とする、単離された透明化羊膜を提供する。
【００１７】
こうした透明化羊膜は、例えば、上述した方法により調製することができる。すなわち、低温乾燥や加圧等によって、線維が密にパッキングされた透明化羊膜を得ることができ、さらに線維間に導入された架橋によりこの状態を維持することができる。
【００１８】
本発明の透明化羊膜は、可視領域における透過率が少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。これだけの透明度があれば、特別な処理を施すことなく、角膜保護材等の眼科用移植材料としてそのまま利用できる。
【００１９】
本発明の透明化羊膜は、湿潤な生理条件下においても透明性が維持されることを特徴とする。それゆえ、本発明の透明化羊膜は、角膜実質組織代替物などの角膜移植材料として利用することができる。より高い透明度が必要な場合は、レーザー処理で表面形状をスムーズにすることにより透明度を向上させることもできる。
【００２０】
このほか、本発明の透明化羊膜は培養粘膜上皮細胞や培養内皮細胞のキャリアシートとしても利用できる。
【発明の効果】
【００２１】
透明な生体組織は角膜以外に存在しないため、これまで重篤な角膜障害においては、主にアイバンク眼を用いた移植治療しか行うことができなかった。本発明によれば、通常出産後に廃棄されている羊膜を材料として、透明な組織が簡便に調製できる。羊膜は、癒着防止効果、消炎効果、血管浸入抑制効果、抗菌効果、拒絶反応が生じにくいといった利点を有し、無機・高分子材料を用いた人工材料のような拒絶反応や副作用のリスクがないため、角膜移植材料（とくに、角膜実質組織代替物）として有用である。
【００２２】
また羊膜は眼科分野においては眼表面の保護や創傷治癒効果を目的として広く用いられている。しかしながら、羊膜は透明性が低いため、眼部に適用すると著しい視力低下が生じてしまう。もし羊膜の透明度を改善することができれば、視力を維持しながら眼表面を保護する眼科移植材料として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、低温乾燥させたヒト羊膜の透明度を表す。 Ａは、低温乾燥後のヒト羊膜（Ｄｒｙ）、未処理の湿潤状態のヒト羊膜（Ｎａｔｉｖｅ−Ｗｅｔ）の４００〜７００ｎｍにおける透過率を示すグラフである（横軸は波長、縦軸は透過率）。 Ｂは、低温乾燥後のヒト羊膜（Ｄｒｙ）、未処理の湿潤状態のヒト羊膜（Ｎａｔｉｖｅ−Ｗｅｔ）の４００ｎｍ、５５０ｎｍ、７００ｎｍにおける透過率を示すグラフである（横軸は波長、縦軸は透過率）。
【図２】図２は、ＥＤＣ／ＮＨＳによる架橋処理後の羊膜の透明性を表す。 Ａは、湿潤条件下における、各サンプルの写真を示す（左から、未処理（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、０％ＥＤＣ/０％ＮＨＳ架橋処理、０．１％ＥＤＣ/０．０５％ＮＨＳ架橋処理、１．０％ＥＤＣ/０．５％ＮＨＳ架橋処理）。 Ｂは、各サンプルの湿潤状態における透過率を示すグラフである（横軸は波長、縦軸は透過率：グラフ下から、未処理（Ｎａｔｉｖｅ）、０％ＥＤＣ/０％ＮＨＳ架橋処理、０．１％ＥＤＣ/０．０５％ＮＨＳ架橋処理、１．０％ＥＤＣ/０．５％ＮＨＳ架橋処理）。 Ｃは、架橋サンプルの５５０ｎｍにおける透過率を示すグラフである（左から、０％ＥＤＣ/０％ＮＨＳ架橋処理、０．１％ＥＤＣ/０．０５％ＮＨＳ架橋処理、１．０％ＥＤＣ/０．５％ＮＨＳ架橋処理）。
【図３】図３は、ＥＤＣ／ＮＨＳ（２：１）で架橋したブタ羊膜の透明性を表す。 Ａは、架橋処理前のブタ羊膜（ＰＢＳ中）の写真である。 Ｂは、湿潤条件下での架橋処理したブタ羊膜の写真である（左から、ＥＤＣ濃度０％、０．０１％、０．１％、１．０％、１０．０％）。 Ｃは、低温乾燥後のブタ羊膜（Ｄｒｙ）、未処理の湿潤状態のブタ羊膜（Ｗｅｔ）、架橋処理後の湿潤状態におけるブタ羊膜（Ｓｉｎｇｌｅ）の５５０ｎｍにおける透過率を比較したグラフである（横軸はＥＤＣ濃度、縦軸は透過率）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、羊膜を透明化する方法と、前記方法によって得られた透明化羊膜、及び前記透明化羊膜の角膜移植材料への応用に関する。
【００２５】
１．定義
羊膜
羊膜は胎盤の一部で、胎児を包み、羊水を保持する薄い膜である。羊膜は、上皮細胞層、基底膜層、緻密層の三層からなり、ヒト羊膜の場合、大きさは約２０ｃｍ×３０ｃｍ、厚さは５０〜８０μｍである。
【００２６】
羊膜はコラーゲンやラミニン、ニドゲンからなる厚い基底膜を持ち、血管成分を含まず、移植に用いても拒絶反応が起こりにくいという特長を有する。また、羊膜は、非常に薄く、透明性があり、柔軟でありながら丈夫であるという特性も有する。さらに、羊膜は、抗炎症作用、癒着防止効果、抗菌効果、基底膜保持機能等も有するため、古くから外科領域等における創傷被覆材や手術後の癒着防止材として用いられてきた。
【００２７】
羊膜は凍結乾燥により常温で保存することが可能であり、再度水分を含ませることにより容易に柔軟性を取り戻す。また羊膜は、現在は出産後に廃棄物として扱われているため、その使用には倫理的な問題もなく、再生治療用素材として極めて有望である。
【００２８】
羊膜は、上記のような特性を有し、眼球の形状を維持するのに十分な強度を有するため、これを透明化した本発明の透明化羊膜は、角膜損傷患者の処置において非常に有用な移植材料となり得る。
【００２９】
本発明で用いられる羊膜の由来は、ヒトに近い皮膚組織を有する哺乳動物であればとくに限定されないが、移植材料として利用する場合は、移植を受ける個体と同種であることが好ましい。「同種」とは、羊膜を摘出される動物（ドナー）と、それから得られた材料を移植される動物（レシピエント）とが同じ動物種に属することを意味する。例えば、本発明の方法を用いて作製された材料を移植されるレシピエントがヒトである場合、ドナーもまたヒトであることが好ましい。ドナーとレシピエントが同種であることにより、異種生物組織を移植した場合に惹起される拒絶反応を防ぐことができる。また、ドナーとレシピエントが同種であることは、異種動物間での病原体の交差感染を防ぐ点でも有利である。
【００３０】
透明化
本発明において「透明化」とは、可視光の透過率が少なくとも部分的に上昇することを意味する。好ましくは、少なくとも５５％、好ましくは７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％である。
【００３１】
本発明において、羊膜の透明化は生理条件下、すなわち湿潤条件においても維持される。羊膜中の線維は他組織と比較して線維径が細く（１００μｍ以下）均一であるため、一時的な脱水を伴う処理を行うことにより、湿潤条件下でもその透明性が失われることなく、不可逆的にその透明性が維持される。また、脱水後に架橋処理を行うことにより脱水時の構造が効果的に保持され、湿潤条件下での透明性がさらに向上する。
【００３２】
脱水
本発明において「脱水」とは、生体から摘出された羊膜の水分量が少なくとも部分的に低下することを意味する。本発明における脱水工程で達成される水分含有量は、好ましくは３０％、２０％、１５％、１０％、５％又は２％であり、より好ましくは１０％以下である。脱水は、後述するように、自然乾燥（低温乾燥）あるいは吸湿性化合物を用いた方法等により実施できる。
【００３３】
架橋
「架橋」は、主に高分子化合物同士（あるいは高分子化合物内部、高分子化合物と低分子化合物）の結合である。本発明の場合、架橋は羊膜、特にこれを構成するコラーゲン線維間に形成される。架橋の方法は特に限定されず、化学的架橋、物理的架橋、光架橋のいずれであってもよい。架橋方法や架橋条件については、「２．２ 架橋工程」において詳述する。
【００３４】
２．羊膜の透明化
本発明にかかる羊膜は、単離された羊膜を脱水し、架橋処理を施すことにより調製することができる。
【００３５】
２．１ 脱水工程
本発明において、脱水は、例えば、自然乾燥（低温乾燥）、凍結乾燥、減圧乾燥、吸湿性化合物での処理などにより行うことができる。
【００３６】
（１）自然乾燥
本発明の一実施形態では、脱水工程は、自然乾燥により行う。乾燥時間は、羊膜の厚さ等に依存する。例えば、通常のヒト羊膜（５０〜８０μｍ）の厚みであれば、２時間程で透明になる。また架橋処理を繰り返す場合は、２回目以降の乾燥に要する時間はさらに短くなり、３０分程度でも透明性が得られる場合もある。基本的には、低温で長時間置くほど透明性は向上する。
【００３７】
好ましい実施形態では、吸湿性化合物はグリセロールである。グリセロール処理は、羊膜をグリセロール含有溶液に浸漬することにより行う。グリセロール溶液のグリセロール濃度は、好ましくは４０〜１００％（ｖ／ｖ）、より好ましくは６０〜１００％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは１００％である。グリセロールは、人体への使用に推奨されているグレードのものであることが望ましい。グリセロール溶液の溶媒としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）などが挙げられる。ＰＢＳが好ましい。浸漬時間は、羊膜の透明化が十分に達成される時間であれば特に制限されないが、好ましくは少なくとも３分間、より好ましくは少なくとも５分間、さらに好ましくは少なくとも１０分間である。
【００３８】
以下の実施例において具体的に示すとおり、上記のように自然乾燥又はグリセロール処理などの脱水工程により透明化した羊膜は、水溶液中にて水和させても透明性を維持し、脱水処理前の羊膜よりも透明性が著しく改善される。しかしながら、その透明性は約６０〜７５％程度であり、更なる改善の余地がある。架橋処理を施すことにより、水溶液中の透明性をさらに改善することができる。
【００３９】
２．２ 架橋工程
本発明において、架橋は、架橋剤や縮合剤を用いた化学的架橋、γ線、紫外線、熱脱水、電子線等を用いた物理的架橋などにより実施できる。
【００４０】
（１）化学的架橋
化学的架橋は、動物組織中のタンパク質又は糖を架橋し得る架橋剤や縮合剤を用いて実施できる。例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含む水溶性カルボジイミド系架橋剤；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）やＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを含むスクシンイミド系架橋剤；ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤；エチレングリコールジエチルエーテル等のポリエポキシ系架橋剤；エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテルを含むグリシジルエーテル系架橋剤；グルタールアルデヒド；パラホルムアルデヒド；非共有結合型コラーゲン架橋剤；及び、トランスグルタミナーゼから選ばれる１又は２以上の架橋剤を用いて実施できる。
【００４１】
ここで、「非共有結合型コラーゲン架橋剤」とは、ＷＯ２００９/１３６５９９に記載された架橋剤であって、末端に２個以上のＯＨ基（好ましくは３〜１６個）を有する多価アルコールからなるスペーサー及び、該ＯＨ基を介して、３つのアミノ酸の繰り返しで構成されるコラーゲンペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている、非共有結合型コラーゲン架橋剤。あるいは、金粒子からなるスペーサー及び、３つのアミノ酸の繰り返しで構成されるコラーゲンペプチド又はコラーゲンモデルペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている、非共有結合型コラーゲン架橋剤を意味する。前記多価アルコールとしては、ペンタエリトリトールテトラポリエチレングリコールエーテルの４価アルコール、又はヘキサグリセロールオクタポリエチレングリコールエーテルの８価アルコールが挙げられる。前記アームとしては、一般式 (Ｙ−Ｘ−Ｇ)n（式中,Ｇはグリシン残基:Ｘ及びＹは、それぞれ独立してアラニン残基（Ａ）、プロリン残基（Ｐ）、ヒドロキシプロリン残基（Ｏ）等のアミノ酸残基；nは１〜５０の整数）で示されるものが挙げられる。
【００４２】
架橋条件は、用いる架橋剤と試料の量に応じて、適宜設定される。例えば、脱水した羊膜を、架橋剤水溶液に適当な時間浸漬することにより行うことができる。
【００４３】
本発明の実施例では、ＥＤＣ／ＮＨＳの組み合わせを用いた。この場合、ＥＤＣとＮＨＳとの濃度比は、約２：１（重量比）であることが好ましく、ＥＤＣの濃度は、０．０１〜２０重量％、特に０．１〜１０重量％であることが好ましい。ＥＤＣ及びＮＨＳは、人体への使用に推奨されているグレードのものであるのが望ましい。
【００４４】
なお、水溶液中で架橋処理を行う場合、膨潤と架橋の競争反応となるため、架橋反応が遅い場合は効果を得にくい可能性があるので注意が必要である。
【００４５】
（２）紫外線架橋
紫外線架橋とは、照射した光のエネルギーにより組織中のタンパク質、糖などが架橋されることであると考えられる。紫外線照射による光架橋は、具体的には、クリーンベンチ内などで通常用いられるＵＶランプ光の下、５〜１４日間程度静置することにより行うことができる。この場合、架橋効率を向上させるために、脱水前に羊膜をリボフラビンで処理するのが望ましい。リボフラビン処理は、例えば、４℃にて２〜３時間、０．１重量％リボフラビン／ＰＢＳ中に組織を浸漬することにより行うことができる。
【００４６】
好ましい架橋の程度は、具体的数値として示すことはできないが、羊膜内部での光の散乱が生じにくいように、線維間隙が極端に狭く安定化され、組織の透明性が維持できる程度に導入されればよい。架橋が不十分では透明性が維持できず、架橋が過剰であると透明性は損なわれるからである。
【００４７】
１回の架橋により十分な架橋が達成できない場合、架橋工程は、２回以上反復して実施してもよい。用いる架橋方法（架橋剤やその濃度）にもよるが、脱水と架橋の過程を複数回繰り返すことによって、厚い組織であっても内部まで均一な架橋を施すことができる。またこの様な過程を繰り返すことにより、透明性を得るのに必要とされる架橋剤の量を減らすことができる。本発明の実施例では、ＥＤＣ／ＮＨＳの組み合わせを用いた。この場合、ＥＤＣとＮＨＳとの濃度比は、約２：１（重量比）であることが好ましく、ＥＤＣの濃度は、０．０１〜１０重量％、特に０．１〜１重量％であることが好ましく、２回以上繰り返すことが好ましい。
【００４８】
２．３ 加圧処理
ブタの皮膚真皮組織を加圧すると透明になるという現象が報告されている。加圧は脱水を伴って線維間距離を短縮させうる。それゆえ、加圧工程を行ってから架橋工程を行い、透明化羊膜を得ることもできる。
【００４９】
２．４ 菲薄化、レーザー処理（透明度の向上）
乾燥、架橋処理によって得られる羊膜は、可視領域における透過率が７０％〜８０％以上有しており、そのまま眼科領域での保護剤として臨床応用可能である。しかしながら、さらなる透明度の向上を必要とする場合は、エキシマレーザー等で表面加工処理を施してスムーズにすることにより、その透過率をより高めることができる。
【００５０】
３．透明化羊膜
３．１ 透明性
上記した方法によって得られた透明化羊膜は、生理条件下、すなわち湿潤条件においてもその透明性が維持される。つまり、羊膜中の線維は他組織と比較して細線維径が細く均一であるため、一時的な脱水を伴う処理を行うことにより、湿潤条件下でもその透明性が失われることなく、不可逆的にその透明性が維持される。また、脱水後に架橋処理を行うことにより脱水時の構造が効果的に保持され、湿潤条件下での透明性がさらに向上する。
【００５１】
上記した方法によって得られる羊膜は、可視領域での透明性は脱水-未架橋処理の場合、７０％程度、架橋処理を伴う場合は透明度が８０％程度である。なお、可視領域とは、具体的には３５０〜７５０ｎｍ程度の波長領域をいう。
【００５２】
従来公知の透明化強膜（特開２００９−２８５１５５）の透明度は、架橋前で１０％以下、架橋後でも６０％程度であるため、臨床で必要とされる透明度（７０〜８０％）にするために、菲薄化やレーザー処理等のさらなる処理を施すことが必要であった。本発明の透明化羊膜は上記のとおり高い透明度を有し、さらなる処理を必要とすることなく、臨床に供することができる。さらにあえて毒性のリスクが伴う架橋処理を行わずとも臨床に必要とされる透明性が得られるため、早期の実用化が見込まれる。
【００５３】
３．２ コラーゲン線維
羊膜中のコラーゲン線維には細線維径を制御する役割を担うＶ型コラーゲンが含まれており、他の組織より細く（５０ｎｍ程度）均一に制御されている。本発明の透明化羊膜においては、脱水処理を行うことでコラーゲン線維間の距離を著しく短くし、その後再水和させても、透明性の向上が達成される。すなわち、ゆっくりと乾燥された羊膜組織内ではコラーゲン線維が密にパッキングされ、光の散乱が生じにくくなるが、再水和させてとしても脱水時の線維構造が水和時の構造に反映され、光の乱反射が抑制される。この現象は羊膜特異的であり、強膜の様に細線維径が大きく不均一で光透過性の低い他の組織では、脱水処理を行ったとしても再水和時に透明性の向上は得られない。上記の様な羊膜の特異的な構造的は、高い初期光透過率や再水和後の線維構造の不可逆性に影響し、本発明で得られる特徴的な透明性の向上につながった。また強膜の場合と同様に脱水後の架橋処理により、乾燥時の密なコラーゲン線維構造がより安定的に維持され、未架橋時よりも高い透明性が得られる。また、この様な構造的変換とコラーゲン線維内及び線維間の架橋により高い弾性率を有する素材が達成される。
【００５４】
４．角結膜組織再建の移植材料
本発明の透明化羊膜は、可視領域において７０〜８０％以上の透明度を有し、生理的条件下においても安定的にその透明性が維持される。また、羊膜組織は抗炎症効果、癒着防止効果を有し、本来眼科分野においては眼表面の保護や創傷治癒効果を目的として広く用いられている。本発明の透明化羊膜は視力を維持しながら、従来と同様の使用法で同様の治療効果が得られる眼科移植材料として極めて有用である。また、本発明の透明化羊膜は角膜移植材料、とくに角膜実質組織代替物としても有用である。
【００５５】
前述したとおり、羊膜は廃棄物扱いであるため、その使用に倫理的問題がない。また、免疫拒絶を生じる可能性が低いため、拒絶反応のリスクがない、安全な角膜移植が可能となる。
【００５６】
なお、本発明の透明化羊膜は調製後すぐに利用しない場合は、凍結もしくは冷蔵することによって保存することが好ましい。
【００５７】
５．培養細胞シートのキャリア
本発明の透明化羊膜は適当な強度と弾力性を有する、それゆえ、これを支持体として、培養粘膜上皮細胞や、角膜上皮あるいは角膜内皮細胞を培養することにより、これら培養細胞を用いて作製される細胞シートのキャリアとしても利用できる。
【００５８】
以下、実施例により、本発明について具体的に説明するが、これらの実施例は例示であって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５９】
低温乾燥によるヒト羊膜の透明化
材料及び方法
ヒト羊膜（東北大学病院産婦人科より供与）は、ＰＢＳ中、−８０℃にて凍結保存した。この凍結羊膜を４〜８℃（冷蔵庫内）で解凍し、生理食塩水を用いてオーバーナイトで洗浄し残留する血液を除去した。
【００６０】
得られたヒト羊膜を試験サンプルとして５ｍｍ×１５ｍｍにカットし、１枚のスライドガラス上に置き、２００μに維持されるように間にシリコンスペーサーを入れてカバーガラスを被せ、サンプルとガラスの間の隙間を満たすようにすみやかに生理食塩水を入れた。
【００６１】
湿潤状態のサンプルを分析後、蒸留水を用いて、４〜８℃にてオーバーナイトで脱塩した。余分な水分を除去し、４〜８℃（冷蔵庫内）にてオーバーナイトで乾燥させた。
次いで、１時間室温に置いた後、水分を加えることなく、乾燥状態のサンプルの透過率を測定した。
【００６２】
結果及び考察
図１に示されるように、羊膜の４００〜７００ｎｍでの透過率は、簡単な低温乾燥によって顕著に向上することが確認された。また、透過率は短波長側でより高い値を示した（図１Ｂ）。
【００６３】
化学的架橋による透明化の維持
材料及び方法
臨床においては、透明性が湿潤状態においても維持されることが必要である。そこで、上記の方法にしたがって乾燥させた羊膜サンプルを、架橋剤ＥＤＣ/ＮＨＳ（０．１ｗｔ％/０．０５ｗｔ％、１．０ｗｔ％/０．５ｗｔ％）を含む蒸留水もしくは架橋剤を含まない蒸留水で室温（約２３℃）にて２時間処理し、生理食塩水で洗浄した。ＥＤＣ/ＮＨＳは架橋後のサンプルに残留しないため、架橋化羊膜を臨床適用した際に、その分解によって架橋剤由来の有毒な物質が放出される恐れがない。
ＥＤＣ:１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ピアス社製）
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（和光純薬工業製）
架橋後の羊膜サンプル（ｎ＝３）は、湿潤状態にて４００〜７００ｎｍでの透過率を測定した。
【００６４】
結果及び考察
低温乾燥による強膜の透明化は可逆的であり、水溶液中で膨潤し、乾燥処理前と同様にまで透明性が低下する。しかし図２に示されるように、低温乾燥による羊膜の透明化は、不可逆的であり、水溶液中で膨潤させても高い光透過率が維持され（５５０ｎｍで７０．１％）、乾燥処理前のレベル（ｎａｔｉｖｅ）にまで透明性が低下しない。また架橋処理後の羊膜の透過率は湿潤状態においてさらに高い透過率（５５０ｎｍで８０％）を有する。
【実施例２】
【００６５】
ブタ羊膜を用いた架橋条件の検討
材料及び方法
１．架橋剤の濃度
実施例１の方法にしたがって低温乾燥したブタ羊膜サンプルを、架橋剤ＥＤＣ/ＮＨＳを含む蒸留水もしくは架橋剤を含まない蒸留水で常温（約２３℃）にて２時間処理し、ＰＢＳで洗浄した。架橋剤は、ＥＤＣ/ＮＨＳ（２:１）の比率を維持し、ＥＤＣの濃度を０．０〜１０．０％まで変化させた。
【００６６】
架橋した乾燥透明化羊膜サンプルはＰＢＳに浸漬した後、その透過率（５５０ｎｍ）を測定した。対照として、乾燥処理する前の羊膜（Ｗｅｔ）、架橋処理前の乾燥透明化羊膜（Ｄｒｙ）の透過率もそれぞれ示した。
【００６７】
結果及び考察
図３に示すように、０．０１〜１．０ｗｔ％ ＥＤＣまでは、架橋剤の濃度にかかわらず９０％以上の透過率が得られたが、１０ｗｔ％ ＥＤＣでは架橋処理を施さない乾燥羊膜よりも低い透過率であった（図３Ｃ）。適切な架橋剤濃度（０．０１〜１．０ｗｔ％ ＥＤＣ）においては、湿潤状態において、極めて高い透明性を有する羊膜が得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
羊膜は、通常廃棄物として扱われているため、その使用には倫理的な問題がなく、また癒着防止効果、消炎効果、血管浸入抑制効果、抗菌効果、拒絶反応のリスクが少ないといった医療材料として優れた特長を有している。本発明の透明化羊膜は、湿潤状態においても７０％〜８０％以上の高い透明性を有し、また副作用のリスクもないため、視野を損なわずに、眼科分野にて従来行われている様膜移植と同様の使用法で同様の優れた治療効果が得られる眼表面再建用移植材料として極めて有用である。また、本発明の透明化羊膜は角膜移植材料、とくに角膜実質組織代替物や培養細胞シートのキャリアとしても極めて有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された羊膜を脱水することにより、湿潤な生理条件下でも透明性が持続する羊膜組織を得ることを特徴とする、透明化羊膜の調製方法。
【請求項２】
自然乾燥により羊膜を脱水することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
羊膜の少なくとも一部分が外気と接触する条件下で、２〜１０℃にて少なくとも３０分以上静置することにより羊膜を脱水することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
吸湿性化合物で処理することにより羊膜を脱水することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに架橋処理を施すことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
架橋剤を用いた化学的架橋、あるいは熱架橋や紫外線架橋を含む物理的架橋を行うことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
架橋剤が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含む水溶性カルボジイミド系架橋剤；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）やＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを含むスクシンイミド系架橋剤；ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤；エチレングリコールジエチルエーテル等のポリエポキシ系架橋剤；エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテルを含むグリシジルエーテル系架橋剤；グルタールアルデヒド；パラホルムアルデヒド；コラーゲンモデルペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている分子構造を有する非共有結合型コラーゲン架橋剤及び、トランスグルタミナーゼから選ばれる１又は２以上の組合せである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＤＣ及び／又はＮＨＳを用いて化学的架橋を行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
線維径１００μｍ以下の細く均一なコラーゲン線維を含み、湿潤条件下でもその線維間距離が生理条件よりも短いことを特徴とする、単離された透明化羊膜。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により調製された、透明化羊膜。
【請求項１１】
可視領域における透過率が少なくとも６０％以上であることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の透明化羊膜。
【請求項１２】
可視領域における透過率が少なくとも７０％以上であることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の透明化羊膜。
【請求項１３】
架橋によりコラーゲン線維間距離が生理条件よりも短く維持されていることを特徴とする、請求項１２に記載の透明化羊膜。
【請求項１４】
湿潤な生理条件下においても透明性が維持されることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の透明化羊膜。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか１項に記載の透明化羊膜を利用した角膜移植材料。
【請求項１６】
角膜実質組織代替物である、請求項１５に記載の角膜移植材料。
【請求項１７】
細胞キャリアシートである、請求項１５に記載の角膜移植材料。
【請求項１】
単離された羊膜を脱水することにより、湿潤な生理条件下でも透明性が持続する羊膜組織を得ることを特徴とする、透明化羊膜の調製方法。
【請求項２】
自然乾燥により羊膜を脱水することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
羊膜の少なくとも一部分が外気と接触する条件下で、２〜１０℃にて少なくとも３０分以上静置することにより羊膜を脱水することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
吸湿性化合物で処理することにより羊膜を脱水することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに架橋処理を施すことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
架橋剤を用いた化学的架橋、あるいは熱架橋や紫外線架橋を含む物理的架橋を行うことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
架橋剤が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含む水溶性カルボジイミド系架橋剤；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）やＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを含むスクシンイミド系架橋剤；ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤；エチレングリコールジエチルエーテル等のポリエポキシ系架橋剤；エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテルを含むグリシジルエーテル系架橋剤；グルタールアルデヒド；パラホルムアルデヒド；コラーゲンモデルペプチドからなるアームがスペーサーに結合されている分子構造を有する非共有結合型コラーゲン架橋剤及び、トランスグルタミナーゼから選ばれる１又は２以上の組合せである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＤＣ及び／又はＮＨＳを用いて化学的架橋を行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
線維径１００μｍ以下の細く均一なコラーゲン線維を含み、湿潤条件下でもその線維間距離が生理条件よりも短いことを特徴とする、単離された透明化羊膜。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により調製された、透明化羊膜。
【請求項１１】
可視領域における透過率が少なくとも６０％以上であることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の透明化羊膜。
【請求項１２】
可視領域における透過率が少なくとも７０％以上であることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の透明化羊膜。
【請求項１３】
架橋によりコラーゲン線維間距離が生理条件よりも短く維持されていることを特徴とする、請求項１２に記載の透明化羊膜。
【請求項１４】
湿潤な生理条件下においても透明性が維持されることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の透明化羊膜。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか１項に記載の透明化羊膜を利用した角膜移植材料。
【請求項１６】
角膜実質組織代替物である、請求項１５に記載の角膜移植材料。
【請求項１７】
細胞キャリアシートである、請求項１５に記載の角膜移植材料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−４８６４３（Ｐ２０１３−４８６４３Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１３１０（Ｐ２０１０−５１３１０）
【出願日】平成２２年３月９日（２０１０．３．９）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月９日（２０１０．３．９）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
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