進化と合理的設計の組合せによって得られた、１，２−プロパンジオールの製造のための新規微生物
本発明は、炭素源から１，２−プロパンジオールを製造するための微生物株を製造することを目的とする進化と合理的設計を組み合わせた新規な方法に関する。該方法は、始原株を適切な増殖培地中、選択圧下で増殖させること（該始原細菌株は、始原株において進化を促進するための、ｔｐｉＡ遺伝子の発現の減弱、およびメチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現の減弱を含む）、次に、１，２プロパンジオールの生産率が高まった進化株を選択および単離すること、その後、その進化株において機能的ｔｐｉＡ遺伝子を再構築することを含む。本発明はまた、得られたもののような進化株に関し、それは副生成物無しに、最良の可能性ある収率で、炭素源の１，２−プロパンジオールへの変換を至適化するためにさらに遺伝的に改変することができる。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、１，２−プロパンジオールを製造するための微生物の製造を目的とする進化と合理的設計を組み合わせた新規な方法、それにより得られる微生物および１，２−プロパンジオールの製造のためのその使用に関する。
【０００２】
Ｃ３ジアルコールである１，２−プロパンジオールすなわちプロピレングリコールは、広く用いられている化学物質である。これは、不飽和ポリエステル樹脂、液体洗剤、冷却剤、不凍剤および航空機の徐氷液の成分である。プロピレングリコールは、プロピレン誘導体より有毒であると認識されているエチレン誘導体の代わりとして１９９３〜１９９４年以来、使用が増えてきた。
【０００３】
１，２−プロパンジオールは現在、大量の水を消費するプロピレンオキシド水和法を用いた化学的手段により製造されている。プロピレンオキシドは、一方はエピクロロヒドリンを用い、他方はヒドロペルオキシドを用いる２つの方法のいずれかよって製造することができる。両経路とも、毒性が強い物質を用いる。さらに、ヒドロペルオキシド経路は、ｔｅｒｔ−ブタノールおよび１−フェニルエタノールなどの副生成物を生じる。プロピレンの産生を有利にするためには、これらの副生成物の用途を見出さなければならない。この化学的経路は一般的にラセミ１，２−プロパンジオールを生成するが、２つの立体異性体（Ｒ）１，２−プロパンジオールおよび（Ｓ）１，２−プロパンジオールはそれぞれ、ある特定の適用（例えば、特殊化学物質および医薬品のためのキラル出発材料）に関して注目されるものである。
【０００４】
これら１，２−プロパンジオールの製造のための化学法の欠点は、生合成を魅力的な選択肢とする。微生物による糖からの１，２−プロパンジオールの天然生産に関して２つの経路が同定されている。
【０００５】
１つ目の経路では、６−デオキシ糖（例えば、Ｌ−ラムノースまたはＬ−フコース）がジヒドロキシアセトンリン酸および（Ｓ）−ラクトアルデヒドに開裂され、さらに（Ｓ）−１，２−プロパンジオールへと還元することができる(Badia et al, 1985)。この経路は大腸菌(E. coli)で機能するものの、デオキシヘキソースのコストが高いために経済上実現可能な方法をもたらすことはできない。
【０００６】
２つ目の経路は、解糖経路、次いでメチルグリオキサール経路を介した汎用糖（例えば、グルコースまたはキシロース）の代謝である。ジヒドロキシアセトンリン酸はメチルグリオキサールへ変換され、これがラクトアルデヒドまたはアセトールのいずれかへ還元することができる。その後、これら２つの化合物は２回目の還元を受け、１，２−プロパンジオールを生じ得る。この経路は、クロストリジウム・スフェノイデス(Clostridium sphenoides)およびサーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカム(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)などの天然（Ｒ）−１，２−プロパンジオール生産株によって用いられている。クロストリジウム・スフェノイデスは、リン酸制限条件下、１．５８ｇ／ｌの力価で１，２−プロパンジオールを産生するために用いられている(Tran Din and Gottschalk, 1985)。また、サーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカムも、１，２−プロパンジオールの生産に関して検討されてきた(Cameron and Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al, 1987)。得られた最高性能は力価９ｇ／ｌであり、０．２ｇ／ｇのグルコースからの収率であった。しかしながら、これらの生物で得られる性能の改良は、利用可能な遺伝的手段が不足しているために限られていると思われる。
【０００７】
先行技術
Cameron et al (1998)は、糖の１，２−プロパンジオールへの変換に関して代謝操作するためのプラットフォームとしての使用を検討した。彼らの理論分析は、現実的な生成物収率の上限（質量バランスと増殖のためのエネルギーの生産を考慮）は培養条件によって著しく異なる。嫌気性条件下では、減少した補因子を再循環させるために副生成物として酢酸が生成され、最良の収率はグルコース１モル当たり１，２−プロパンジオール１モル（０．４２ｇ／ｇ）に限定されるはずである。好気性条件下では、補因子の再循環は末端電子受容体として酸素を用いる呼吸鎖によって確保されるはずであり、副生成物を生じずに１，２−プロパンジオールを生産することが可能となる。これらの条件下では、収率は良くて１．４２ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．６ｇ／ｇ）に達し得る。Cameron et alは、１，２−プロパンジオールの最大力価を考慮して、生成物および副生成物の毒性へのその依存を考察した。１，２−プロパンジオールは１，３−プロパンジオールよりも著しく毒性が低く、大腸菌(E. coli)は１００ｇ／ｌ １，２−プロパンジオールで、０．５／時の増殖速度の残存を示す。この増殖の阻害は、増殖阻害性が高いことが知られている副生成物の酢酸によるものである可能性が高い。高い力価および収率で１，２−プロパンジオールを製造するための嫌気性プロセスの開発では、この酢酸の問題に取り組まなければならない。酢酸の、阻害性がより低く、in situで容易に除去できるアセトンへの変換が提案されている（ＷＯ２００５／０７３３６４）。
【０００８】
単純炭素源を用いて１，２−プロパンジオール生産株を得るための大腸菌の遺伝的改変に関するいくつかの検討がCameronのグループ(Cameron et al, 1998, Altaras and Cameron, 1999, Altaras and Cameron, 2000)およびBennettのグループ(Huang et al, 1999, Berrios-Rivera et al, 2003)によって行われた。これらの研究は、一方では、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールへの経路における１つ、またはいくつかの酵素活性に頼り、他方では、宿主株におけるＮＡＤＨおよび炭素消費経路の除去に頼るものである。Cameronのグループによって得られた最良の結果は、嫌気的フラスコ培養における１．４ｇ／ｌの１，２−プロパンジオールの生産であり、グルコース消費１ｇ当たり０．２ｇの収率であった。嫌気性流加発酵槽に外挿すると、生産量は１，２−プロパンジオール４．５ｇ／ｌであり、グルコース１ｇ当たり０．１９ｇの収率であり、Cameronの理論的評価からかけ離れていた。これらの性能は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）を欠いた株における、大腸菌のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子（ｍｇｓ）、大腸菌のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｌｄＡ）および大腸菌の１，２−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子（ｆｕｃＯ）の過剰発現を用いて得られたものである。力価および収率は低いが、同じアプローチを用いて得られた結果が米国特許第６，０８７，１４０号、同第６，３０３，３５２号およびＷＯ９８／３７２０４にも記載されている。
【０００９】
Bennettのグループも、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)由来のｍｇｓ遺伝子および大腸菌由来のｇｌｄＡ遺伝子の過剰発現のためにｌｄｈＡ欠損大腸菌宿主株を用いた。嫌気条件下でのフラスコ培養では力価１．３ｇ／ｌおよび収率０．１２ｇ／ｇであったが、微好気培養では力価１．４ｇ／ｌであり、収率は０．１３ｇ／ｇであった。
【００１０】
１，２−プロパンジオールを生産する株を得るための別法は、「始原株」の進化を、その「進化株」がより良い特徴を有する所望の化合物を生産する状態へ向けることである。この方法は、まず、ｔｐｉＡとメチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する一遺伝子の２つの遺伝子の減弱により改変された微生物の自然進化に基づく。トリオースリン酸イソメラーゼをコードするｔｐｉＡ遺伝子を減弱する目的は、この酵素により自然に相互変換されるグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡ３Ｐ）およびジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）において始まる２つの代謝分岐を分離することである。ＤＨＰＡから１，２−プロパンジオールへの経路は、還元型の補因子（ＮＡＤＨ）を消費する「還元分岐」であり、一方、ＧＡ３Ｐから酢酸への代謝は、ＮＡＤＨと細胞増殖のためのエネルギーを生産する「酸化分岐」である。機能的ｔｐｉＡ遺伝子が存在しないと、細胞の代謝は「ロック」され、株の増殖、１，２−プロパンジオールの生産および酢酸の生産が強く結びつけられている。適切な増殖培地での選択圧下では、この始原株は該株による１，２−プロパンジオールの生産が高まる状態へ進化する。１，２−プロパンジオールの製造向けの微生物の「進化株」を得るためのこの手法は特許出願ＷＯ２００５／０７３３６４に記載されている。この進化プロセスおよび次の発酵段階は好ましくは嫌気性条件下で行われる。この技術は先行技術に優る明らかな改良法である。力価１．８ｇ／ｌの１，２−プロパンジオールが得られ、消費グルコース１ｇ当たり０．３５グラムの収率となり、Cameron et alの理論的結果に近かった。
【００１１】
本発明の目的は、進化とそれに続く進化株の合理的遺伝子操作による１，２−プロパンジオール生産株の改良である。特異な特徴は進化したｔｐｉＡマイナス株における機能的ｔｐｉＡ遺伝子の再構築である。これらの改変は１，２−プロパンジオール生産の改良をもたらす。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、炭素源から１，２−プロパンジオールを製造するための微生物株の製造を目的として進化と合理的設計を組み合わせた新規な方法に関する。該方法は、
【００１３】
始原株を適切な増殖培地中、選択圧下で増殖させること（該始原細菌株は、始原株において進化を促進するための、ｔｐｉＡ遺伝子の発現の減弱、およびメチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する少なくとも１つの遺伝子（ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢなど）の発現の減弱を含む）、
次に、１，２プロパンジオールの生産率が高まった（少なくとも２０％高まった）進化株を選択および単離すること、
その後、その進化株において機能的ｔｐｉＡ遺伝子を再構築すること
を含む。
【００１４】
本発明の一態様では、不要な副生成物の合成が、ピルビン酸からの乳酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ギ酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ）、エタノールの合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ａｄｈＥ）を欠失させることにより減弱される。本発明の別の態様では、Entner-Doudoroff経路がｅｄｄ遺伝子またはｅｄａ遺伝子のいずれか、または双方を欠失させることによって削除される。有利には、１，２−プロパンジオールの生合成経路の還元段階により多くのＮＡＤＨを利用可能とするために、ａｒｃＡおよびｎｄｈから選択される少なくとも１つの遺伝子が減弱される。
【００１５】
１，２−プロパンジオールの製造に使用される微生物は細菌、酵母および真菌から選択されるが、好ましくは大腸菌 (Escherichia coli)またはクロストリジウム・アセトブチリカム種に由来のものである。
【００１６】
本発明はまた、得られたもののような進化株に関し、それは副生成物無しに、最良の可能性ある収率で、炭素源の１，２−プロパンジオールへの変換を至適化するためにさらに遺伝的に改変することができる。本発明の一態様では、利用可能なグリセルアルデヒド３リン酸の一部を１，２−プロパンジオールの合成へ向け直すために、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ活性が低減される。本発明の別の態様では、ｇａｌＰによりコードされているもののようなホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とは独立の糖移入を用いるか、または糖ホスホトランスフェラーゼ系により多くのＰＥＰを供給するかのいずれかによって、糖移入効率が高められる。これは、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子によりコードされている）のようなＰＥＰを消費する経路を除去することにより、かつ／または例えばＰＥＰシンターゼをコードするｐｐｓＡ遺伝子を過剰発現させることによるなど、ＰＥＰの合成を促進することにより得られる。さらに、ピルビン酸をアセチル−ｃｏＡに変換する酵素が、嫌気性条件下で見られる高濃度のＮＡＤＨに耐性があることも有用である。これはｌｐｄ遺伝子の特異的突然変異により得ることができる。有利には、副生成物である酢酸の合成が、遺伝子ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢの１つまたはいくつかを減弱することにより妨げられる。
【００１７】
本発明はまた、好気性、微好気性または嫌気性条件下で、進化し、かつ所望により遺伝的に改変された大腸菌株を、単純炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖させたものを用いて、至適収率で１，２−プロパンジオールを製造するための方法に関する。さらに、本発明は、嫌気性条件下で、進化し、かつ所望により遺伝的に改変されたＣ．アセトブチリカム株を、単純または複合炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖させたものを用いて、至適収率で１，２−プロパンジオールを製造するための方法に関する。次に、本発明の方法に従って製造された１，２−プロパンジオールは回収され、所望により精製される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす添付図面は本発明を例示し、その説明とともに本発明の原理を説明にするのに役立つ。
【００１９】
【図１】炭水化物からの１，２−プロパンジオール生産系の開発における中枢代謝の遺伝子工学を示す。
【発明の具体的説明】
【００２０】
本明細書において、特許請求の範囲および明細書の解釈に以下の用語を用いることができる。
【００２１】
「株」とは、ある種(species)の遺伝的変異体を表す。従って、「微生物株」とは、ある種(species)の特定の微生物の遺伝的変異体を表す。株について示された特徴はその対応する微生物にも当てはまり、逆もそうである。
【００２２】
本発明によれば、「培養」、「増殖」および「発酵」とは、単純炭素源を含有する適切な増殖培地での細菌の増殖を表すために互換的に用いられる。
【００２３】
本発明において「炭素源」とは、微生物の正常な増殖を支えるために当業者が使用可能ないずれの炭素源も表し、ヘキソース、ペントース、単糖類、二糖類、オリゴ糖、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびそれらの組合せであり得る。
【００２４】
本発明において「適切な増殖培地」とは、微生物の増殖に適合され、望む進化を促進するように設計された既知の分子組成の培地を表す。
【００２５】
本発明の進化プロセスは、改良された生産特徴を示す進化した微生物を製造するための方法であり、次の工程：
ａ）代謝がロックされた始原株を得るための微生物の改変（その始原株の細胞を適切な培地で増殖させた際に進化が所望の方向にのみ向くことができる）、
ｂ）それを進化させるための、適切な培地での上記で得られた始原株の増殖（始原株は好気性、微好気性または嫌気性条件下で増殖される）、
ｃ）所望の化合物に対して改良された生産特徴を示す、これらの特定の条件下で増殖可能な「進化株」の選択
を含んでなる。この進化プロセスは、同じ出願者らによる、２００４年２月１７日出願の特許出願ＷＯ２００４／０７６６５９および２００５年１２月１日出願のＷＯ２００５／０７３３６４に包括的に記載されている。
【００２６】
本発明において「選択」とは、その培地で保持される微生物株だけが選択圧条件下でより良い適合性を示すものとなるプロセスを表す。一般に、最適株は競合株よりも速く増殖し、その後選択される。ある集団において微生物の特定の進化株を選択する簡単な方法は、その集団を連続培養で増殖させ、増殖の遅い株が培養からやがて排除されるということからなる。これは選択の排他的な例ではなく、当業者に知られている他の選択法も適用可能である。
【００２７】
「単離」とは、特定の遺伝的改変を示す個々の株が、種々の遺伝的特徴を示す株の集団から分離されるプロセスを表す。これは、進化期間の後にバイオマスをサンプリングし、それをペトリ皿に拡げて単一のコロニーを単離することによって行う。
【００２８】
「１，２−プロパンジオール生産率」とは、次のようにして算出される、ｇ／ｌ／時で表される生産率を意味する：
培地中の１，２−プロパンジオール生産濃度（ｇ／ｌ）／この生産に要する時間（時間）。
【００２９】
さらに、バイオマスの量を考慮してｇ／ｇ／時で表される特殊な生産率も次のようにして算出することができる：
培地中１，２−プロパンジオール生産濃度（ｇ／ｌ）／培地中のバイオマス生産濃度（ｇ／ｌ）／この生産に要する時間（時間）。
【００３０】
バイオマスの濃度は、例えば６００ｎｍでの分光光度計の読み取りにより発酵液の吸光度を測定するか、または規定量の発酵液を乾燥させた後に細胞の乾重を測定するかのいずれかによって求める。
【００３１】
生産された１，２−プロパンジオールの量は、当技術分野のプロトコールの現状に従い、適したカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定される。
【００３２】
本発明では、進化株は次の特徴：グルコース取り込み率の上昇および１，２−プロパンジオールの生産率の向上に関して選択される。次に、これらの特徴を示す株を単離し、有利には、最良の生産株を同定する方法で互いに比較する。
【００３３】
グルコースの取り込み率（ｇ／ｌ／時で表される）は次のようにして算出される：
培養により消費されたグルコースの濃度（ｇ／ｌ）／この消費に要する時間（時間）。
【００３４】
上記のように培地中のバイオマスの濃度を考慮することで、特殊なグルコース取り込み率が算出できる。
【００３５】
グルコース取り込み率と１，２−プロパンジオール生産率は密接に関連している。グルコースの消費が増えれば、グルコース代謝からの生成物の生産が同じ割合で増える。
【００３６】
選択および単離の後、最良の進化株は、始原株の取り込みよりも約２０％高い、好ましくは約３０％高いまたはそれを超える、より好ましくは５０％高いグルコース取り込みを示す。
【００３７】
１，２−プロパンジオール生産率の上昇は、始原株の生産率よりも約２０％高い、好ましくは約３０％高いまたはそれを超える、より好ましくは約５０％高いものである。
【００３８】
ｔｐｉｈ遺伝子は、ＤＨＡＰとＧＡ３Ｐの相互変換を触媒する酵素「トリオースリン酸イソメラーゼ」をコードする（図１参照）。この遺伝子の減弱の目的は、最も有効な１，２−プロパンジオール生産へ向かう進化が可能となるように細胞の代謝を操作することである。
【００３９】
本発明において「遺伝子の発現の減弱」とは、遺伝子の発現の部分的なまたは完全な抑制を表し、その後、それは「減弱された」と言われる。この発現の抑制は、その遺伝子の活性化機構の抑制、その遺伝子の発現の阻害、その遺伝子発現に必要なプロモーター領域の全てもしくは一部の欠失、またはその遺伝子のコード領域の欠失のいずれかであり得る。好ましくは、遺伝子の減弱は本質的にその遺伝子の完全な欠失であり、その遺伝子は、本発明の株の同定、単離および精製を助ける選択マーカー遺伝子で置換することができる。遺伝子は、Datsenko, K.A. & Wanner, B. L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K- 12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645に記載されているように、好ましくは、相同組換えの技術によって不活性化される。他の方法を以下に記載する。
【００４０】
「発現」とは、その遺伝子の産物である、対応するタンパク質の生成をもたらす遺伝子配列の転写および翻訳を指す。
【００４１】
「進化株において機能的ｔｐｉＡ遺伝子を再構築する」とは、選択された進化株が進化プロセスの後に機能的ｔｐｉＡ遺伝子を導入することにより改変されることを意味し、これは、相同組換えによって、減弱された遺伝子コピーを野生型の機能的コピーで置換し、始原株で測定された活性と類似のトリオースリン酸イソメラーゼ活性を回復させることによるか、または異なる染色体座に機能的ｔｐｉＡ遺伝子を導入することによるか、またはプラスミドに機能的ｔｐｉＡ遺伝子を導入することによって達成することができる。この回復は、トリオースリン酸イソメラーゼの作用を介した１，２−プロパンジオールの生産のためにＧＡ３Ｐを部分的にＤＨＡＰへ再循環させることにより、グルコースから１モル／モルを超える収率の１，２−プロパンジオール生産を可能とする。
【００４２】
メチルグリオキサール（２−オキソプロパナール）の乳酸への変換に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現を減弱する目的は、メチルグリオキサールの乳酸への変換を阻害することであり、従って、存在するメチルグリオキサールは本質的に１，２−プロパンジオールの合成のための細胞機構により用いられる。
【００４３】
メチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する遺伝子は、特に、
・メチルグリオキサールからのラクトイルグルタチオンの合成を触媒するグリオキサラーゼをコードする遺伝子、例えばグリオキサラーゼＩをコードするｇｌｏＡ遺伝子、
・ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（（Ｓ）ラクトアルデヒドからの（Ｓ）乳酸の合成を触媒する）をコードするａｌｄＡおよびａｌｄＢ遺伝子
である。
【００４４】
これらの１以上の遺伝子の発現が始原株において減弱される（または遺伝子が完全に欠失される）ことが有利である。好ましくは、ｇｌｏＡ遺伝子が欠失される。
【００４５】
還元性の、ＮＡＤＨ等価物を消費する、従って、１，２−プロパンジオール生合成経路と競合する天然のグルコース発酵経路を抑制することからなるさらなる改変を始原株に施すことが有利である。
【００４６】
特に、ピルビン酸からの乳酸の合成を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈＡ遺伝子の発現と、アセチル−ＣｏＡからのエタノールの合成を触媒するアルコール−アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｄｈＥ遺伝子の発現を減弱することが有利である。
【００４７】
同様に、ピルビン酸からアセチル−ＣｏＡとＮＡＤＨを生産するために微生物にピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を使用させることができる。これは、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードするｐｆｌＡおよびｐｆｌＢ遺伝子の発現を減弱することにより達成することができる。
【００４８】
１，２−プロパンジオール合成経路を迂回可能なグルコースの、グリセルアルデヒド−３−リン酸およびピルビン酸への直接代謝を妨げるために、Entner-Doudoroff経路に関与する酵素をコードするｅｄｄおよびｅｄａ遺伝子の少なくとも１つを減弱することもまた有用である。
【００４９】
嫌気性または微好気性条件下では、前駆体の１，２−プロパンジオールへの還元のためのＮＡＤＨのアベラビリティーを高めることが有利である。これは、グローバルレギュレーターＡｒｃＡ（ａｒｃＡ遺伝子によりコードされている）により媒介されるトリカルボン酸サイクルに対する抑制を軽減することにより得られる。細胞のＮＡＤＨ濃度はまた、遺伝子ｎｄｈによりコードされているＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩＩを不活性化することにより増強され得る。よって、好ましくは、ａｒｃＡおよびｎｄｈから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱される。
【００５０】
好ましくは、始原株は細菌、酵母または真菌からなる群から選択される。
【００５１】
より好ましくは、始原株は腸内細菌科、バチルス科、クロストリジウム科、ストレプトミセス科およびコリネバクテリア科からなる群から選択される。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様では、始原株は大腸菌かクロストリジウム・アセトブチリカムのいずれかである。
【００５３】
取得可能な進化株および前記の方法によって得られるような進化株も本発明の目的である。
【００５４】
この進化株において、特定の遺伝子の発現を改変する、すなわち、遺伝子発現を増強または減弱することが有利である。これらの改変は１，２−プロパンジオールの生産性能の改善を可能とする。
【００５５】
目的遺伝子の過剰発現を得るため、当業者であれば、例えば
・内因性プロモーターのより強力なプロモーターでの置換
・目的遺伝子を有する発現ベクターの、微生物への導入
・目的遺伝子の付加的コピーの、染色体への導入
などの種々の方法を知っている。
【００５６】
当業者ならば、ＤＮＡを細菌株へ導入するためのいくつかの技術を知っている。好ましい技術はエレクトロポレーションであり、当業者にはよく知られている。
【００５７】
本発明の特定の実施態様では、進化株は、解糖の下方部分のフラックスを低減するため、そしてそれをＤＨＡＰ、最終的には１，２−プロパンジオールの合成に向け直すために、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）活性の減弱により改変される（図１参照）。この低減された活性は特に、ｇａｐＡ遺伝子の発現の減弱により得られる。
【００５８】
「酵素の活性の減弱」とは、改変前の進化株で観察された活性に比べた、目的酵素の活性の低下を指す。当業者ならばこの結果を得るための多数の手段を知っており、例えば、下記のもの：
・その遺伝子への、この遺伝子の発現レベルまたはコードされているタンパク質の活性のレベルを低下させる突然変異の導入
・その遺伝子の天然プロモーターの、より低い発現をもたらす強度の低いプロモーターでの置換
・対応するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質を脱安定化するエレメントの使用
・発現が全く望まれないならば、その遺伝子の欠失
がある。
【００５９】
有利には、進化株において、糖移入の効率が高められる。ｇａｐＡ遺伝子発現の強い減弱はＧＡＰＤＨ反応において５０％を超える炭素フラックスの低下をもたらし、この結果、移入グルコース１モル当たり１モル未満のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）が合成される。単純糖の細胞への移入を通常確保する糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）は、グルコース６リン酸を生じるリン酸化反応と結びついている。この反応に必要なリン酸は、ＰＥＰのピルビン酸への変換により供給される。グリセルアルデヒド−３−リン酸を介してフラックスを低減することにより生産されるＰＥＰの量を減らすと、糖移入が減少する。
【００６０】
本発明の特定の実施態様では、糖はホスホエノールピルビン酸のアベラビリティーとは独立の糖移入系によって微生物に移入され得る。リン酸化を含まない遺伝子ｇａｌＰによりコードされているガラクターゼ−プロトン共輸送体が利用可能である。この場合、移入したグルコースは、ｇｌｋ遺伝子によりコードされているグルコースキナーゼによってリン酸化されなければならない。この経路を促進するために、ｇａｌＰおよびｇｌｋから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が増強される。結果として、ＰＴＳは分配可能となり、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩまたはｃｒｒから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を減弱することによって排除することができる。
【００６１】
本発明の別の特定の実施態様では、ＰＴＳの効率が、代謝産物ＰＥＰのアベラビリティーを高めることによって増強される。ｇａｐＡ活性の減弱およびピルビン酸へ向かう炭素フラックスの低さのために、本発明の改変株におけるＰＥＰの量は限定され、細胞へ輸送されるグルコースの量が少なくなり得る。
【００６２】
微生物株においてＰＥＰのアベラビリティーを高めるために使用可能な様々な手段がある。特に、ＰＥＰ→ピルビン酸の反応を減弱する手段がある。好ましくは、この結果を得るために前記の株においてピルビン酸キナーゼ酵素をコードするｐｙｋＡおよびｐｙｋＦから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱される。ＰＥＰのアベラビリティーを高める別法は、この酵素の活性を高めることによってホスホエノールピルビン酸シンターゼにより触媒されるピルビン酸→ＰＥＰの反応に有利になるようにすることである。この酵素はｐｐｓＡ遺伝子によりコードされている。よって、好ましくは、この微生物において、ｐｐｓＡ遺伝子の発現が増強される。両改変が微生物に同時に存在してもよい。
【００６３】
特に嫌気性または微好気性条件下で、ピルビン酸をアセチル−ｃｏＡへ変換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）がＮＡＤＨによる阻害に対して低い感受性を有することが有利である。より低い感受性とは、ＷＯ２００５／０７３３６４にすでに示されているように、非改変酵素の感受性に対して定義される。特に、このような特徴は、酵素のタンパク質配列においてアラニン５５のバリンによる置換をもたらす、ｌｐｄ遺伝子（ＰＤＣのサブユニットリポアミドデヒドロゲナーゼをコードする）に特異的突然変異を導入することによって得ることができる。
【００６４】
本発明の別の特定の実施態様では、副生成物である酢酸の合成が妨げられる。完全好気条件下では、還元された補因子ＮＡＤＨは好ましくは、末端電子受容体として酸素を用いる呼吸鎖を介してＮＡＤ＋へと酸化される。従って、同時生成物（例えば、酢酸）の合成が強いられない。１，２−プロパンジオールの生産を至適化するためにはこのような酢酸合成を回避することが好ましい。
【００６５】
酢酸の生産を妨げるためには、有利には、酢酸の合成に関与する少なくとも１つの遺伝子の活性が減弱される。好ましくは、ａｃｋＡ、ｐｔａおよびｐｏｘＢから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱され、これらの遺伝子は全て、異なる酢酸生合成経路（図１参照）に関与する酵素をコードしている。
【００６６】
本発明のもう１つの目的は、これまでに記載したものなどの進化株が炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、その後、生成された１，２−プロパンジオールが回収される、１，２−プロパンジオールを製造するための方法である。１，２−プロパンジオールの製造は好気性、微好気性または嫌気性条件下で行われる。
【００６７】
本発明の微生物の培養条件（発酵）は、当業者ならば容易に定義することができる。特に、細菌は２０℃〜５５℃の間、好ましくは２５℃〜４０℃の間の温度、好ましくは、Ｃ．アセトブチリカムでは約３５℃、大腸菌では約３７℃で発酵される。
【００６８】
この工程は回分法、流加法または連続法のいずれかで行うことができる。
【００６９】
「好気性条件下」とは、酸素が、液体相に気体を溶解させることにより培養物に供給されることを意味する。これは、（１）酸素を含有する気体（例えば、空気）を液体相に散布すること、または（２）培養培地を含有する容器を振盪して、上部空間に含まれている酸素を液体相に送ることにより得ることができる。嫌気性条件下ではなく好気性条件下での発酵の利点は、電子受容体としての酸素の存在が、その株の、細胞プロセスのためにより多くのエネルギーをＡＴＰ形態で生産する能力を改良するということである。従って、その株はその全般的代謝が改良されている。
【００７０】
微好気性条件は、低パーセンテージの酸素（例えば、０．１〜１０％の間の酸素を含み、窒素で１００％とした混合物を用いる）が液体相に溶解される培養条件として定義される。
【００７１】
嫌気性条件は、培養培地に酸素が供給されない培養条件として定義される。厳密な嫌気性条件は、他の気体の痕跡を除去するために培養培地に窒素のような不活性ガスを散布することにより得られる。硝酸を電子受容体として用い、株によるＡＴＰ生産を改良し、その代謝を改良することができる。
【００７２】
１，２−プロパンジオール製造のための進化プロセスおよび発酵プロセスの際の株の培養は、発酵槽で、少なくとも１つの炭素源を含有し、使用する細菌に適合した既知の設定構成の無機培養培地を用いて行われる。従って、特に、大腸菌用の無機増殖培地は、Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)と同一もしくは類似の組成のもの、またはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)により定義されているものなどの培地、および下記のＭＰＧと呼ばれる最小培養培地であり得る。
【００７３】
【表１】
【００７４】
本発明の特定の実施態様では、この方法は、大腸菌の進化株を用い、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロースまたはキシロースであり得る単純炭素源を含有する増殖培地で行われる。
【００７５】
本発明の別の特定の実施態様では、この方法はクロストリジウム・アセトブチリカムの進化株を用い、単純炭素源または複合炭素源を含有する増殖培地で行われる。
【００７６】
従って、Ｃ．アセトブチリカム用の増殖培地は、クロストリジウム増殖培地(CGM, Wiesenborn et al., Appl. Environm. Microbiol., 54: 2717-2722)またはMonot et al. (Appl. Environm. Microbiol., 44: 1318-1324)もしくはVasconcelos et al. (J. Bacterid., 176: 1443-1450)により示されているような無機増殖培地と同一もしくは類似の組成のものであり得る。
【００７７】
Ｃ．アセトブチリカムの培養に用いられる炭素源は単純炭素または複合炭素のいずれかである。単純炭素源はアラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロースまたはキシロースであり得る。特に好ましい単純炭素源はグルコースである。複合炭素源はデンプンまたはヘミセルロースであり得る。特に好ましい複合炭素源はデンプンである。
【００７８】
好ましくは、回収された１，２−プロパンジオールはさらに精製される。当業者ならば生産された１，２−プロパンジオールを回収および精製するための方法を知っている。これらの方法は通常のプロセスである。
【００７９】
本発明は上記、下記および大腸菌に関して実施例に記載されている。よって、本発明の始原株および進化株に関して減弱、欠失または過剰発現可能な遺伝子は、主として大腸菌由来の遺伝子の名称を用いて定義される。しかしながら、この名称は本発明によればより一般的な意味を持ち、他の微生物において対応する遺伝子も包含する。当業者ならば、大腸菌由来の遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ参照番号を用いて、大腸菌以外の生物における等価な遺伝子を同定することができる。
【００８０】
相同配列の同定の手段およびそれらの相同性％は当業者によく知られており、特に、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で、このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに使用することができるＢＬＡＳＴプログラムを含む。得られた配列は、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)を、これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて利用（アライン）することができる。
【００８１】
ＰＦＡＭデータベース（protein families database of alignments and Hidden Markov Models http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アライメントの大きなコレクションである。各ＰＦＡＭは、複数のアライメントの可視化、タンパク質ドメインの観測、生物間での分布の評価、他のデータベースへのアクセスの確保および既知のタンパク質構造の可視化を可能とする。
【００８２】
ＣＯＧ（Clusters of Orthologous Groups of protein http://www.ncbi.nlm.nih. gov/COG/）は、４４の主要な系統発生論的系統を表す６６の完全に配列決定されたゲノムに由来するタンパク質配列を比較することにより得られる。各ＣＯＧは少なくとも３つの系統から定義され、古くから保存されていたドメインの同定が可能となる。
【００８３】
参照文献（本明細書に引用されている順）
【表２】
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は、
１−改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈの構築
２−前記始原株の進化
３−選択された進化株におけるｔｐｉＡ遺伝子の再構築
４−ｇａｐＡ遺伝子の減弱；ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子の欠失；ｐｐｓＡ遺伝子の過剰発現
５−ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｏｘＢ遺伝子の欠失
６−得られた数株の、好気性条件下での１，２−プロパンジオール生産に関する比較
７−最良の株を用いた流加培養での１，２−プロパンジオールの生産
【００８５】
実施例１：１，２−プロパンジオール生産の改良に向けた進化が可能な大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈの改変株構築
ａ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄの構築
プロトコール１に従い、大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ：：ｃｍ（ＷＯ２００５０７３３６４参照）においてクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。
【００８６】
プロトコール１：耐性カセットの除去
クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットを以下の技術に従って除去した。クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位にＦＬＰレコンビナーゼ作用を有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションによりこの株へ導入した。４２℃で連続培養した後、これらの抗生物質耐性カセットの欠損を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【００８７】
この株において予め確立されている改変の存在を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【００８８】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄと命名した。
【００８９】
【表３】
【００９０】
ｂ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄの構築
カナマイシン耐性カセットを除去するため、およびｌｄｈＡ遺伝子を不活性化するために、プロトコール２に従い、関連遺伝子の大部分を欠失したｌｄｈＡ遺伝子にクロラムフェニコール耐性カセットを挿入した。
【００９１】
プロトコール２：組換えのためのＰＣＲ産物の導入および組換え体の選択
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択され、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用い、プラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドｐＫＤ４由来のカナマイシン耐性カセットを増幅した(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))。次に、得られたＰＣＲ産物を、そこで発現したλ Ｒｅｄ（γβ，ｅｘｏ）系が相同組換えに極めて有利である、プラスミドｐＫＤ４６を担持するレシピエント株にエレクトロポレーションにより導入した。その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、その耐性カセットの挿入を、表１に示された適切なオリゴヌクレオチドを用いた分析により確認した。
【００９２】
この株の他の改変も、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【００９３】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄと命名した。
【００９４】
【表４】
【００９５】
ｃ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ΔａｒｃＡ：：ｋｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５において、プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ａｒｃＡ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ΔａｒｃＡ：：ｋｍと命名した。
【００９６】
ｄ）大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｌｆＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡの改変株の構築
【００９７】
大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄにおける、その遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによるａｒｃＡ遺伝子の欠失は、ファージＰ１を用いた形質導入技術によって行った。
【００９８】
プロトコール３：遺伝子欠失のためのファージＰ１を用いた形質導入
レシピエント大腸菌における、その遺伝子を耐性カセット（カナマイシンまたはクロラムフェニコール）で置換することによる選択された遺伝子の欠失は、ファージＰ１を用いた形質導入技術によって行った。プロトコールは、（ｉ）単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株でのファージ溶解液の作製、および（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の形質導入の二段階であった。
【００９９】
ファージ溶解液の作製
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ ３０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２ ５ｍＭでの、単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを播種する。
・振盪しながら３７℃で３０分インキュベーション。
・野生株ＭＧ１６５５で作製したファージＰ１溶解液１００μｌ（およそ１×１０９ファージ／ｍｌ）を加える。
・３７℃で３時間、全ての細胞が溶解するまで振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける・
・４５００ｇで１０分の遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。
・上清を無菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
・この溶解液を４℃で保存する。
形質導入
・ＬＢ培地中、大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分遠心分離する。
・この細胞ペレットを２．５ｍｌのＭｇＳＯ４ １０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ５ｍＭ中に懸濁させる。
・対照試験管：細胞１００μｌ
単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株のファージＰ１ １００μｌ
・試験管試験：細胞１００μｌ＋単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株のファージＰ１ １００μｌ
・振盪せずに３０℃で３０分インキュベーション。
・各試験管に１Ｍクエン酸ナトリウム１００μｌを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍｌのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベーション。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分遠心分離した後、ディッシュ上、ＬＢ＋Ｃｍ３０μｇ／ｍｌでプレーティング。
・３７℃で一晩インキュベーション。
【０１００】
次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、欠失の挿入を、表１に示された適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【０１０１】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ：：ｋｍと命名した。
【０１０２】
次に、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール耐性カセットおよびカナマイシン耐性カセットを除去した。
【０１０３】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡと命名した。
【０１０４】
ｅ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ Δｎｄｈ：：ｋｍの構築
プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ｎｄｈ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ Δｎｄｈ：：ｋｍと命名した。
【０１０５】
ｆ）大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｌｆＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ＡｐｌｆＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡにおける、その遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによるｎｄｈ遺伝子の欠失は、これまでのように、プロトコール３に記載のファージＰ１を用いた形質導入技術を用いて行った。
【０１０６】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ：：ｋｍと命名した。
【０１０７】
次に、プロトコール１に従い、カナマイシン耐性カセットを除去した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈと命名した。
【０１０８】
各段階で、株においてそれまでに構築された改変の存在を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１０９】
実施例２：微好気性条件下でのケモスタット培養における改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄの進化および進化の生理学的特徴
【０１１０】
１，２−プロパンジオール生産の改良に向けて進化させるため、大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄを、過剰なグルコース（最初は２０ｇ／ｌ、グルコースが使い尽くされれば追加）を含む、これまでに記載したものなどの培養培地ＭＰＧ中、一方は嫌気性条件下、他方は微好気性条件（１％酸素）下での連続培養で培養した。温度は３７℃に設定し、ｐＨは塩基を加えることで６．５に調整した。これらのケモスタットでの株の進化に続き、生成物１，２−プロパンジオールと副生成物である酢酸の濃度の増加と結びついたバイオマス濃度の増加が数週間（４週間から６週間まで）見られた。これはこれらの株の性能の改良を表すものであった。これらの培養物が、これらの条件下でその濃度のさらなる上昇が見られない定常状態に達した際に、その進化が起こった。
【０１１１】
進化前後の株の特徴を評価した。個々のクローンを表す単一のコロニーをペトリ皿に単離した。これらのクローンを、エルレンマイヤーフラスコアッセイにて、ケモスタット培養で用いたものと同じＭＰＧ培地を用い、始原株を対照として評価した。これらのクローンのうちいくつかが対照に比べて良好な１，２−プロパンジオール特異的生産率を示した。これらのクローンを次の工程のために選択した。各進化条件に関して最良のクローンで得られた結果を以下の表４および５に報告する。
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
これらのクローンを、酵母抽出液を含む培養培地で長期間培養したことから、最小培地での増殖に順応させる必要があった。２つの最良のクローン（その性能は表４および５に示されている）は、最小培地で連続培養して、そのような条件下での増殖速度を高めることにより順応させ、増殖速度が安定した際に順応を止めた。最終培養物からクローンを単離し、その順応した集団に代表的なものであるかどうか確認した。
【０１１５】
実施例３：大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄの選択された進化株におけるｔｐｉＡ遺伝子の再構築
ａ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ｔｐｉＡ：：ｋｍの構築
プロトコール２に記載の技術に従い、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用い、ｔｐｉＡ遺伝子の上流にカナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｔｐｉＡ：：ｋｍと命名した。
【０１１６】
次に、プロトコール３に記載のファージＰ１による形質導入技術を用い、大腸菌進化株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｌｆＡＢ，ΔａｄｈＥ，Δｌｄｈ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，ΔｎｄｈにおけるｔｐｉＡ遺伝子の再構築を行った。
【０１１７】
得られた株を進化型大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ｔｐｉＡｒｃ：：ｋｍ，ΔｐｌｆＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈと命名した。
【０１１８】
その後、プロトコール２に従い、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」と命名した。
【０１１９】
株においてそれまでに構築された改変の存在を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１２０】
実施例４：「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」の改変：ｇａｐＡ遺伝子の減弱；ｐｙｋＡおよびｐｒｋＦ遺伝子の欠失；ベクターｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡによるｐｐｓＡ遺伝子の剰発現
ａ）天然ｇａｐＡプロモーターの、合成ショートＰｔｒｃ１６プロモーターでの置換
「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」株における天然ｇａｐＡプロモーターの、合成ショートＰｔｒｃ１６プロモーター（配列番号５２：gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtggaa）での置換は、２２５ｐｂの上流ｇａｐＡ配列をＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴおよび操作プロモーターで置換することにより行った。この技術はプロトコール２に記載され、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用いる。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡと命名した。
【０１２１】
次に、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール耐性カセットを除去した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡと命名した。
【０１２２】
ｂ）ｐｙｋＡ遺伝子の欠失
ｐｙｋＡ遺伝子は、プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより不活性化した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ ΔｐｙｋＡ：：ｋｍと命名した。
【０１２３】
次に、プロトコール１に従い、カナマイシン耐性カセットを除去した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ ΔｐｙｋＡと命名した。
【０１２４】
ｃ）ｐｙｋＦ遺伝子の欠失
ｐｙｋＦ遺伝子は、プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより不活性化した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ：：ｋｍと命名した。
【０１２５】
次に、前記のように、プロトコール１に従い、カナマイシン耐性カセットを除去した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦと命名した。
【０１２６】
ｄ）発現ベクターｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡの株への導入
ホスホエノールピルビン酸の生産を高めるために、ｐｐｓＡ遺伝子を、ｇａｐＡプロモーターを用いてプラスミドｐＪＢ１３７から発現させた。プラスミドｐＪＢ１３７−Ｐ ｇａｐＡ−ｐｐｓＡの構築のため、ｐｐｓＡ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０１２７】
１．ｇａｐＡ−ｐｐｓＡＦは、６５塩基（配列番号５３）：
ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC
からなり、
・ウェブサイト（http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の参照配列であるｐｐｓＡ遺伝子（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８５１０６〜１７８５１３６）と相同な領域（大文字）
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０７９４〜１８６０７６１）と相同な領域（小文字）
を含む。
【０１２８】
２．ｐｐｓＡＲは、４３塩基（配列番号５４）：
aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC
からなり、
・ｐｐｓＡ遺伝子の領域（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８２７５８〜１７８２７８０）と相同な領域（小文字）
・制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ（下線の文字）
を含む。
【０１２９】
同時に、大腸菌ｇａｐＡ遺伝子のｇａｐＡプロモーター領域を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
【０１３０】
１．ｇａｐＡ−ｐｐｓＡＲは、６５塩基（配列番号５５）：
GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg
からなり、
・ｐｐｓＡ遺伝子（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８５１０６〜１７８５１３６）と相同な領域（大文字）および
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０７９４〜１８６０７６１）と相同な領域（小文字）
を含む。
【０１３１】
２．ｇａｐＡＦは、３３塩基（配列番号５６）：
ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc
からなり、
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０６３９〜１８６０６６１）と相同な領域（小文字）
・制限部位ＳｍａＩ（下線の文字）
を含む。
【０１３２】
次に、両断片を、オリゴヌクレオチドｐｐｓＡＲおよびｇａｐＡＦ(Horton et al. 1989 Gene 77:61-68)を用いて融合した。ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで切断し、ベクターｐＪＢ１３７（ＥＭＢＬ受託番号：Ｕ７５３２６）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングし、ベクターｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡを得た。組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１３３】
このプラスミドｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡを「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ株に導入する。
【０１３４】
得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」，Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）と命名する。
【０１３５】
各段階で、株においてそれまでに構築された改変の存在を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１３６】
実施例５：副生成物として酢酸を生じずに１，２−プロパンジオールを生産可能な「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）株の構築
ａ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：ｃｍの構築
プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ａｃｋＡおよびｐｔａ遺伝子を不活性化する。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：ｃｍと命名する。
【０１３７】
ｂ）「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ株の構築
「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ株におけるａｃｋＡおよびｐｔａ遺伝子の欠失を、前記のように、プロトコール３に記載のようなファージＰ１を用いた形質導入技術を用いて行う。
【０１３８】
得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：ｃｍと命名する。
【０１３９】
次に、前記のように、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール耐性カセットを除去する。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａと命名する。
【０１４０】
ｃ）改変株「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）の構築
プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ｐｏｘＢ遺伝子を不活性化する。
【０１４１】
得られた株を進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ：：ｃｍと命名する。
【０１４２】
次に、前記のように、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール耐性カセットを除去する。得られた株を進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢと命名する。
【０１４３】
このプラスミドｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡを、進化型大腸菌株ｔｐｉＡｒｃ Ｐｔｒｃ１−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢに導入する。得られた株を進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）と命名する。
【０１４４】
各段階で、株においてそれまでに構築された改変の存在を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１４５】
実施例６：好気性条件下での１，２−プロパンジオール生産に関する種々の進化株の比較
実施例４に記載のように得られた株と対照株（対照１：嫌気性条件下で進化したＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊ ΔｔｐｉＡ ΔｐｆｌＡＢ ΔａｄｈＥ ΔｌｄｈＡ：：Ｃｍ ΔｇｌｏＡ Δａｌｄ，ΔａｌｄＢ Δｅｄｄおよび対照２：微好気性条件下で進化したＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊ ΔｔｐｉＡ ΔｐｆｌＡＢ ΔａｄｈＥ ΔｌｄｈＡ：：Ｃｍ ΔｇｌｏＡ Δａｌｄ，ΔａｌｄＢ Δｅｄｄ）を、エルレンマイヤーフラスコアッセイにて、好気性条件下、酵母抽出液および炭素源としてのグルコースを添加した最小培地で培養した。培養は３４℃で行い、培養培地をＭＯＰＳで緩衝させることによりｐＨを維持した。培養の終了時に、発酵液中の１，２−プロパンジオール、アセトールおよび残留グルコースをＨＰＬＣにより分析し、グルコースに対する１，２−プロパンジオールおよびグルコースに対する１，２−プロパンジオール＋アセトールの収率を算出した。その後、最良の株を発酵槽での流加培養のために選択した。
【０１４６】
【表７】
【０１４７】
実施例７：最良の株を用いた流加培養での１，２−プロパンジオールの生産
これまでの実験で選択された最良の株を、流加プロトコールを用い、２１発酵槽で培養する。
【０１４８】
培養物の温度は３７℃に維持し、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液を用い、常に６．５〜８の間に調整する。振盪速度は回分期には２００〜３００ｒｐｍの間に維持し、流加期の終了時には１０００ｒｐｍまで引き上げる。溶解酸素濃度は、ガスコントローラーを用いて３０〜４０％の間の値に維持する。光学密度が３〜５の間の値に達した際に、流加を初期流速０．３〜０．５ｍｌ／時で開始し、２．５〜３．５ｍｌ／時の間の流速値まで段階的に引き上げる。この時点で２４〜４８時間、流速を一定に維持する。流加培地は３００〜５００ｇ／ｌの間の濃度のグルコースを含有する最小培地に基づく。
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、１，２−プロパンジオールを製造するための微生物の製造を目的とする進化と合理的設計を組み合わせた新規な方法、それにより得られる微生物および１，２−プロパンジオールの製造のためのその使用に関する。
【０００２】
Ｃ３ジアルコールである１，２−プロパンジオールすなわちプロピレングリコールは、広く用いられている化学物質である。これは、不飽和ポリエステル樹脂、液体洗剤、冷却剤、不凍剤および航空機の徐氷液の成分である。プロピレングリコールは、プロピレン誘導体より有毒であると認識されているエチレン誘導体の代わりとして１９９３〜１９９４年以来、使用が増えてきた。
【０００３】
１，２−プロパンジオールは現在、大量の水を消費するプロピレンオキシド水和法を用いた化学的手段により製造されている。プロピレンオキシドは、一方はエピクロロヒドリンを用い、他方はヒドロペルオキシドを用いる２つの方法のいずれかよって製造することができる。両経路とも、毒性が強い物質を用いる。さらに、ヒドロペルオキシド経路は、ｔｅｒｔ−ブタノールおよび１−フェニルエタノールなどの副生成物を生じる。プロピレンの産生を有利にするためには、これらの副生成物の用途を見出さなければならない。この化学的経路は一般的にラセミ１，２−プロパンジオールを生成するが、２つの立体異性体（Ｒ）１，２−プロパンジオールおよび（Ｓ）１，２−プロパンジオールはそれぞれ、ある特定の適用（例えば、特殊化学物質および医薬品のためのキラル出発材料）に関して注目されるものである。
【０００４】
これら１，２−プロパンジオールの製造のための化学法の欠点は、生合成を魅力的な選択肢とする。微生物による糖からの１，２−プロパンジオールの天然生産に関して２つの経路が同定されている。
【０００５】
１つ目の経路では、６−デオキシ糖（例えば、Ｌ−ラムノースまたはＬ−フコース）がジヒドロキシアセトンリン酸および（Ｓ）−ラクトアルデヒドに開裂され、さらに（Ｓ）−１，２−プロパンジオールへと還元することができる(Badia et al, 1985)。この経路は大腸菌(E. coli)で機能するものの、デオキシヘキソースのコストが高いために経済上実現可能な方法をもたらすことはできない。
【０００６】
２つ目の経路は、解糖経路、次いでメチルグリオキサール経路を介した汎用糖（例えば、グルコースまたはキシロース）の代謝である。ジヒドロキシアセトンリン酸はメチルグリオキサールへ変換され、これがラクトアルデヒドまたはアセトールのいずれかへ還元することができる。その後、これら２つの化合物は２回目の還元を受け、１，２−プロパンジオールを生じ得る。この経路は、クロストリジウム・スフェノイデス(Clostridium sphenoides)およびサーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカム(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)などの天然（Ｒ）−１，２−プロパンジオール生産株によって用いられている。クロストリジウム・スフェノイデスは、リン酸制限条件下、１．５８ｇ／ｌの力価で１，２−プロパンジオールを産生するために用いられている(Tran Din and Gottschalk, 1985)。また、サーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカムも、１，２−プロパンジオールの生産に関して検討されてきた(Cameron and Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al, 1987)。得られた最高性能は力価９ｇ／ｌであり、０．２ｇ／ｇのグルコースからの収率であった。しかしながら、これらの生物で得られる性能の改良は、利用可能な遺伝的手段が不足しているために限られていると思われる。
【０００７】
先行技術
Cameron et al (1998)は、糖の１，２−プロパンジオールへの変換に関して代謝操作するためのプラットフォームとしての使用を検討した。彼らの理論分析は、現実的な生成物収率の上限（質量バランスと増殖のためのエネルギーの生産を考慮）は培養条件によって著しく異なる。嫌気性条件下では、減少した補因子を再循環させるために副生成物として酢酸が生成され、最良の収率はグルコース１モル当たり１，２−プロパンジオール１モル（０．４２ｇ／ｇ）に限定されるはずである。好気性条件下では、補因子の再循環は末端電子受容体として酸素を用いる呼吸鎖によって確保されるはずであり、副生成物を生じずに１，２−プロパンジオールを生産することが可能となる。これらの条件下では、収率は良くて１．４２ｍｏｌ／ｍｏｌ（０．６ｇ／ｇ）に達し得る。Cameron et alは、１，２−プロパンジオールの最大力価を考慮して、生成物および副生成物の毒性へのその依存を考察した。１，２−プロパンジオールは１，３−プロパンジオールよりも著しく毒性が低く、大腸菌(E. coli)は１００ｇ／ｌ １，２−プロパンジオールで、０．５／時の増殖速度の残存を示す。この増殖の阻害は、増殖阻害性が高いことが知られている副生成物の酢酸によるものである可能性が高い。高い力価および収率で１，２−プロパンジオールを製造するための嫌気性プロセスの開発では、この酢酸の問題に取り組まなければならない。酢酸の、阻害性がより低く、in situで容易に除去できるアセトンへの変換が提案されている（ＷＯ２００５／０７３３６４）。
【０００８】
単純炭素源を用いて１，２−プロパンジオール生産株を得るための大腸菌の遺伝的改変に関するいくつかの検討がCameronのグループ(Cameron et al, 1998, Altaras and Cameron, 1999, Altaras and Cameron, 2000)およびBennettのグループ(Huang et al, 1999, Berrios-Rivera et al, 2003)によって行われた。これらの研究は、一方では、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールへの経路における１つ、またはいくつかの酵素活性に頼り、他方では、宿主株におけるＮＡＤＨおよび炭素消費経路の除去に頼るものである。Cameronのグループによって得られた最良の結果は、嫌気的フラスコ培養における１．４ｇ／ｌの１，２−プロパンジオールの生産であり、グルコース消費１ｇ当たり０．２ｇの収率であった。嫌気性流加発酵槽に外挿すると、生産量は１，２−プロパンジオール４．５ｇ／ｌであり、グルコース１ｇ当たり０．１９ｇの収率であり、Cameronの理論的評価からかけ離れていた。これらの性能は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）を欠いた株における、大腸菌のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子（ｍｇｓ）、大腸菌のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｌｄＡ）および大腸菌の１，２−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子（ｆｕｃＯ）の過剰発現を用いて得られたものである。力価および収率は低いが、同じアプローチを用いて得られた結果が米国特許第６，０８７，１４０号、同第６，３０３，３５２号およびＷＯ９８／３７２０４にも記載されている。
【０００９】
Bennettのグループも、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)由来のｍｇｓ遺伝子および大腸菌由来のｇｌｄＡ遺伝子の過剰発現のためにｌｄｈＡ欠損大腸菌宿主株を用いた。嫌気条件下でのフラスコ培養では力価１．３ｇ／ｌおよび収率０．１２ｇ／ｇであったが、微好気培養では力価１．４ｇ／ｌであり、収率は０．１３ｇ／ｇであった。
【００１０】
１，２−プロパンジオールを生産する株を得るための別法は、「始原株」の進化を、その「進化株」がより良い特徴を有する所望の化合物を生産する状態へ向けることである。この方法は、まず、ｔｐｉＡとメチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する一遺伝子の２つの遺伝子の減弱により改変された微生物の自然進化に基づく。トリオースリン酸イソメラーゼをコードするｔｐｉＡ遺伝子を減弱する目的は、この酵素により自然に相互変換されるグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡ３Ｐ）およびジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）において始まる２つの代謝分岐を分離することである。ＤＨＰＡから１，２−プロパンジオールへの経路は、還元型の補因子（ＮＡＤＨ）を消費する「還元分岐」であり、一方、ＧＡ３Ｐから酢酸への代謝は、ＮＡＤＨと細胞増殖のためのエネルギーを生産する「酸化分岐」である。機能的ｔｐｉＡ遺伝子が存在しないと、細胞の代謝は「ロック」され、株の増殖、１，２−プロパンジオールの生産および酢酸の生産が強く結びつけられている。適切な増殖培地での選択圧下では、この始原株は該株による１，２−プロパンジオールの生産が高まる状態へ進化する。１，２−プロパンジオールの製造向けの微生物の「進化株」を得るためのこの手法は特許出願ＷＯ２００５／０７３３６４に記載されている。この進化プロセスおよび次の発酵段階は好ましくは嫌気性条件下で行われる。この技術は先行技術に優る明らかな改良法である。力価１．８ｇ／ｌの１，２−プロパンジオールが得られ、消費グルコース１ｇ当たり０．３５グラムの収率となり、Cameron et alの理論的結果に近かった。
【００１１】
本発明の目的は、進化とそれに続く進化株の合理的遺伝子操作による１，２−プロパンジオール生産株の改良である。特異な特徴は進化したｔｐｉＡマイナス株における機能的ｔｐｉＡ遺伝子の再構築である。これらの改変は１，２−プロパンジオール生産の改良をもたらす。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、炭素源から１，２−プロパンジオールを製造するための微生物株の製造を目的として進化と合理的設計を組み合わせた新規な方法に関する。該方法は、
【００１３】
始原株を適切な増殖培地中、選択圧下で増殖させること（該始原細菌株は、始原株において進化を促進するための、ｔｐｉＡ遺伝子の発現の減弱、およびメチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する少なくとも１つの遺伝子（ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢなど）の発現の減弱を含む）、
次に、１，２プロパンジオールの生産率が高まった（少なくとも２０％高まった）進化株を選択および単離すること、
その後、その進化株において機能的ｔｐｉＡ遺伝子を再構築すること
を含む。
【００１４】
本発明の一態様では、不要な副生成物の合成が、ピルビン酸からの乳酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ギ酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ）、エタノールの合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ａｄｈＥ）を欠失させることにより減弱される。本発明の別の態様では、Entner-Doudoroff経路がｅｄｄ遺伝子またはｅｄａ遺伝子のいずれか、または双方を欠失させることによって削除される。有利には、１，２−プロパンジオールの生合成経路の還元段階により多くのＮＡＤＨを利用可能とするために、ａｒｃＡおよびｎｄｈから選択される少なくとも１つの遺伝子が減弱される。
【００１５】
１，２−プロパンジオールの製造に使用される微生物は細菌、酵母および真菌から選択されるが、好ましくは大腸菌 (Escherichia coli)またはクロストリジウム・アセトブチリカム種に由来のものである。
【００１６】
本発明はまた、得られたもののような進化株に関し、それは副生成物無しに、最良の可能性ある収率で、炭素源の１，２−プロパンジオールへの変換を至適化するためにさらに遺伝的に改変することができる。本発明の一態様では、利用可能なグリセルアルデヒド３リン酸の一部を１，２−プロパンジオールの合成へ向け直すために、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ活性が低減される。本発明の別の態様では、ｇａｌＰによりコードされているもののようなホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とは独立の糖移入を用いるか、または糖ホスホトランスフェラーゼ系により多くのＰＥＰを供給するかのいずれかによって、糖移入効率が高められる。これは、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子によりコードされている）のようなＰＥＰを消費する経路を除去することにより、かつ／または例えばＰＥＰシンターゼをコードするｐｐｓＡ遺伝子を過剰発現させることによるなど、ＰＥＰの合成を促進することにより得られる。さらに、ピルビン酸をアセチル−ｃｏＡに変換する酵素が、嫌気性条件下で見られる高濃度のＮＡＤＨに耐性があることも有用である。これはｌｐｄ遺伝子の特異的突然変異により得ることができる。有利には、副生成物である酢酸の合成が、遺伝子ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢの１つまたはいくつかを減弱することにより妨げられる。
【００１７】
本発明はまた、好気性、微好気性または嫌気性条件下で、進化し、かつ所望により遺伝的に改変された大腸菌株を、単純炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖させたものを用いて、至適収率で１，２−プロパンジオールを製造するための方法に関する。さらに、本発明は、嫌気性条件下で、進化し、かつ所望により遺伝的に改変されたＣ．アセトブチリカム株を、単純または複合炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖させたものを用いて、至適収率で１，２−プロパンジオールを製造するための方法に関する。次に、本発明の方法に従って製造された１，２−プロパンジオールは回収され、所望により精製される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす添付図面は本発明を例示し、その説明とともに本発明の原理を説明にするのに役立つ。
【００１９】
【図１】炭水化物からの１，２−プロパンジオール生産系の開発における中枢代謝の遺伝子工学を示す。
【発明の具体的説明】
【００２０】
本明細書において、特許請求の範囲および明細書の解釈に以下の用語を用いることができる。
【００２１】
「株」とは、ある種(species)の遺伝的変異体を表す。従って、「微生物株」とは、ある種(species)の特定の微生物の遺伝的変異体を表す。株について示された特徴はその対応する微生物にも当てはまり、逆もそうである。
【００２２】
本発明によれば、「培養」、「増殖」および「発酵」とは、単純炭素源を含有する適切な増殖培地での細菌の増殖を表すために互換的に用いられる。
【００２３】
本発明において「炭素源」とは、微生物の正常な増殖を支えるために当業者が使用可能ないずれの炭素源も表し、ヘキソース、ペントース、単糖類、二糖類、オリゴ糖、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびそれらの組合せであり得る。
【００２４】
本発明において「適切な増殖培地」とは、微生物の増殖に適合され、望む進化を促進するように設計された既知の分子組成の培地を表す。
【００２５】
本発明の進化プロセスは、改良された生産特徴を示す進化した微生物を製造するための方法であり、次の工程：
ａ）代謝がロックされた始原株を得るための微生物の改変（その始原株の細胞を適切な培地で増殖させた際に進化が所望の方向にのみ向くことができる）、
ｂ）それを進化させるための、適切な培地での上記で得られた始原株の増殖（始原株は好気性、微好気性または嫌気性条件下で増殖される）、
ｃ）所望の化合物に対して改良された生産特徴を示す、これらの特定の条件下で増殖可能な「進化株」の選択
を含んでなる。この進化プロセスは、同じ出願者らによる、２００４年２月１７日出願の特許出願ＷＯ２００４／０７６６５９および２００５年１２月１日出願のＷＯ２００５／０７３３６４に包括的に記載されている。
【００２６】
本発明において「選択」とは、その培地で保持される微生物株だけが選択圧条件下でより良い適合性を示すものとなるプロセスを表す。一般に、最適株は競合株よりも速く増殖し、その後選択される。ある集団において微生物の特定の進化株を選択する簡単な方法は、その集団を連続培養で増殖させ、増殖の遅い株が培養からやがて排除されるということからなる。これは選択の排他的な例ではなく、当業者に知られている他の選択法も適用可能である。
【００２７】
「単離」とは、特定の遺伝的改変を示す個々の株が、種々の遺伝的特徴を示す株の集団から分離されるプロセスを表す。これは、進化期間の後にバイオマスをサンプリングし、それをペトリ皿に拡げて単一のコロニーを単離することによって行う。
【００２８】
「１，２−プロパンジオール生産率」とは、次のようにして算出される、ｇ／ｌ／時で表される生産率を意味する：
培地中の１，２−プロパンジオール生産濃度（ｇ／ｌ）／この生産に要する時間（時間）。
【００２９】
さらに、バイオマスの量を考慮してｇ／ｇ／時で表される特殊な生産率も次のようにして算出することができる：
培地中１，２−プロパンジオール生産濃度（ｇ／ｌ）／培地中のバイオマス生産濃度（ｇ／ｌ）／この生産に要する時間（時間）。
【００３０】
バイオマスの濃度は、例えば６００ｎｍでの分光光度計の読み取りにより発酵液の吸光度を測定するか、または規定量の発酵液を乾燥させた後に細胞の乾重を測定するかのいずれかによって求める。
【００３１】
生産された１，２−プロパンジオールの量は、当技術分野のプロトコールの現状に従い、適したカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定される。
【００３２】
本発明では、進化株は次の特徴：グルコース取り込み率の上昇および１，２−プロパンジオールの生産率の向上に関して選択される。次に、これらの特徴を示す株を単離し、有利には、最良の生産株を同定する方法で互いに比較する。
【００３３】
グルコースの取り込み率（ｇ／ｌ／時で表される）は次のようにして算出される：
培養により消費されたグルコースの濃度（ｇ／ｌ）／この消費に要する時間（時間）。
【００３４】
上記のように培地中のバイオマスの濃度を考慮することで、特殊なグルコース取り込み率が算出できる。
【００３５】
グルコース取り込み率と１，２−プロパンジオール生産率は密接に関連している。グルコースの消費が増えれば、グルコース代謝からの生成物の生産が同じ割合で増える。
【００３６】
選択および単離の後、最良の進化株は、始原株の取り込みよりも約２０％高い、好ましくは約３０％高いまたはそれを超える、より好ましくは５０％高いグルコース取り込みを示す。
【００３７】
１，２−プロパンジオール生産率の上昇は、始原株の生産率よりも約２０％高い、好ましくは約３０％高いまたはそれを超える、より好ましくは約５０％高いものである。
【００３８】
ｔｐｉｈ遺伝子は、ＤＨＡＰとＧＡ３Ｐの相互変換を触媒する酵素「トリオースリン酸イソメラーゼ」をコードする（図１参照）。この遺伝子の減弱の目的は、最も有効な１，２−プロパンジオール生産へ向かう進化が可能となるように細胞の代謝を操作することである。
【００３９】
本発明において「遺伝子の発現の減弱」とは、遺伝子の発現の部分的なまたは完全な抑制を表し、その後、それは「減弱された」と言われる。この発現の抑制は、その遺伝子の活性化機構の抑制、その遺伝子の発現の阻害、その遺伝子発現に必要なプロモーター領域の全てもしくは一部の欠失、またはその遺伝子のコード領域の欠失のいずれかであり得る。好ましくは、遺伝子の減弱は本質的にその遺伝子の完全な欠失であり、その遺伝子は、本発明の株の同定、単離および精製を助ける選択マーカー遺伝子で置換することができる。遺伝子は、Datsenko, K.A. & Wanner, B. L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K- 12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645に記載されているように、好ましくは、相同組換えの技術によって不活性化される。他の方法を以下に記載する。
【００４０】
「発現」とは、その遺伝子の産物である、対応するタンパク質の生成をもたらす遺伝子配列の転写および翻訳を指す。
【００４１】
「進化株において機能的ｔｐｉＡ遺伝子を再構築する」とは、選択された進化株が進化プロセスの後に機能的ｔｐｉＡ遺伝子を導入することにより改変されることを意味し、これは、相同組換えによって、減弱された遺伝子コピーを野生型の機能的コピーで置換し、始原株で測定された活性と類似のトリオースリン酸イソメラーゼ活性を回復させることによるか、または異なる染色体座に機能的ｔｐｉＡ遺伝子を導入することによるか、またはプラスミドに機能的ｔｐｉＡ遺伝子を導入することによって達成することができる。この回復は、トリオースリン酸イソメラーゼの作用を介した１，２−プロパンジオールの生産のためにＧＡ３Ｐを部分的にＤＨＡＰへ再循環させることにより、グルコースから１モル／モルを超える収率の１，２−プロパンジオール生産を可能とする。
【００４２】
メチルグリオキサール（２−オキソプロパナール）の乳酸への変換に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現を減弱する目的は、メチルグリオキサールの乳酸への変換を阻害することであり、従って、存在するメチルグリオキサールは本質的に１，２−プロパンジオールの合成のための細胞機構により用いられる。
【００４３】
メチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する遺伝子は、特に、
・メチルグリオキサールからのラクトイルグルタチオンの合成を触媒するグリオキサラーゼをコードする遺伝子、例えばグリオキサラーゼＩをコードするｇｌｏＡ遺伝子、
・ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（（Ｓ）ラクトアルデヒドからの（Ｓ）乳酸の合成を触媒する）をコードするａｌｄＡおよびａｌｄＢ遺伝子
である。
【００４４】
これらの１以上の遺伝子の発現が始原株において減弱される（または遺伝子が完全に欠失される）ことが有利である。好ましくは、ｇｌｏＡ遺伝子が欠失される。
【００４５】
還元性の、ＮＡＤＨ等価物を消費する、従って、１，２−プロパンジオール生合成経路と競合する天然のグルコース発酵経路を抑制することからなるさらなる改変を始原株に施すことが有利である。
【００４６】
特に、ピルビン酸からの乳酸の合成を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈＡ遺伝子の発現と、アセチル−ＣｏＡからのエタノールの合成を触媒するアルコール−アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｄｈＥ遺伝子の発現を減弱することが有利である。
【００４７】
同様に、ピルビン酸からアセチル−ＣｏＡとＮＡＤＨを生産するために微生物にピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を使用させることができる。これは、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードするｐｆｌＡおよびｐｆｌＢ遺伝子の発現を減弱することにより達成することができる。
【００４８】
１，２−プロパンジオール合成経路を迂回可能なグルコースの、グリセルアルデヒド−３−リン酸およびピルビン酸への直接代謝を妨げるために、Entner-Doudoroff経路に関与する酵素をコードするｅｄｄおよびｅｄａ遺伝子の少なくとも１つを減弱することもまた有用である。
【００４９】
嫌気性または微好気性条件下では、前駆体の１，２−プロパンジオールへの還元のためのＮＡＤＨのアベラビリティーを高めることが有利である。これは、グローバルレギュレーターＡｒｃＡ（ａｒｃＡ遺伝子によりコードされている）により媒介されるトリカルボン酸サイクルに対する抑制を軽減することにより得られる。細胞のＮＡＤＨ濃度はまた、遺伝子ｎｄｈによりコードされているＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩＩを不活性化することにより増強され得る。よって、好ましくは、ａｒｃＡおよびｎｄｈから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱される。
【００５０】
好ましくは、始原株は細菌、酵母または真菌からなる群から選択される。
【００５１】
より好ましくは、始原株は腸内細菌科、バチルス科、クロストリジウム科、ストレプトミセス科およびコリネバクテリア科からなる群から選択される。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様では、始原株は大腸菌かクロストリジウム・アセトブチリカムのいずれかである。
【００５３】
取得可能な進化株および前記の方法によって得られるような進化株も本発明の目的である。
【００５４】
この進化株において、特定の遺伝子の発現を改変する、すなわち、遺伝子発現を増強または減弱することが有利である。これらの改変は１，２−プロパンジオールの生産性能の改善を可能とする。
【００５５】
目的遺伝子の過剰発現を得るため、当業者であれば、例えば
・内因性プロモーターのより強力なプロモーターでの置換
・目的遺伝子を有する発現ベクターの、微生物への導入
・目的遺伝子の付加的コピーの、染色体への導入
などの種々の方法を知っている。
【００５６】
当業者ならば、ＤＮＡを細菌株へ導入するためのいくつかの技術を知っている。好ましい技術はエレクトロポレーションであり、当業者にはよく知られている。
【００５７】
本発明の特定の実施態様では、進化株は、解糖の下方部分のフラックスを低減するため、そしてそれをＤＨＡＰ、最終的には１，２−プロパンジオールの合成に向け直すために、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）活性の減弱により改変される（図１参照）。この低減された活性は特に、ｇａｐＡ遺伝子の発現の減弱により得られる。
【００５８】
「酵素の活性の減弱」とは、改変前の進化株で観察された活性に比べた、目的酵素の活性の低下を指す。当業者ならばこの結果を得るための多数の手段を知っており、例えば、下記のもの：
・その遺伝子への、この遺伝子の発現レベルまたはコードされているタンパク質の活性のレベルを低下させる突然変異の導入
・その遺伝子の天然プロモーターの、より低い発現をもたらす強度の低いプロモーターでの置換
・対応するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質を脱安定化するエレメントの使用
・発現が全く望まれないならば、その遺伝子の欠失
がある。
【００５９】
有利には、進化株において、糖移入の効率が高められる。ｇａｐＡ遺伝子発現の強い減弱はＧＡＰＤＨ反応において５０％を超える炭素フラックスの低下をもたらし、この結果、移入グルコース１モル当たり１モル未満のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）が合成される。単純糖の細胞への移入を通常確保する糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）は、グルコース６リン酸を生じるリン酸化反応と結びついている。この反応に必要なリン酸は、ＰＥＰのピルビン酸への変換により供給される。グリセルアルデヒド−３−リン酸を介してフラックスを低減することにより生産されるＰＥＰの量を減らすと、糖移入が減少する。
【００６０】
本発明の特定の実施態様では、糖はホスホエノールピルビン酸のアベラビリティーとは独立の糖移入系によって微生物に移入され得る。リン酸化を含まない遺伝子ｇａｌＰによりコードされているガラクターゼ−プロトン共輸送体が利用可能である。この場合、移入したグルコースは、ｇｌｋ遺伝子によりコードされているグルコースキナーゼによってリン酸化されなければならない。この経路を促進するために、ｇａｌＰおよびｇｌｋから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が増強される。結果として、ＰＴＳは分配可能となり、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩまたはｃｒｒから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を減弱することによって排除することができる。
【００６１】
本発明の別の特定の実施態様では、ＰＴＳの効率が、代謝産物ＰＥＰのアベラビリティーを高めることによって増強される。ｇａｐＡ活性の減弱およびピルビン酸へ向かう炭素フラックスの低さのために、本発明の改変株におけるＰＥＰの量は限定され、細胞へ輸送されるグルコースの量が少なくなり得る。
【００６２】
微生物株においてＰＥＰのアベラビリティーを高めるために使用可能な様々な手段がある。特に、ＰＥＰ→ピルビン酸の反応を減弱する手段がある。好ましくは、この結果を得るために前記の株においてピルビン酸キナーゼ酵素をコードするｐｙｋＡおよびｐｙｋＦから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱される。ＰＥＰのアベラビリティーを高める別法は、この酵素の活性を高めることによってホスホエノールピルビン酸シンターゼにより触媒されるピルビン酸→ＰＥＰの反応に有利になるようにすることである。この酵素はｐｐｓＡ遺伝子によりコードされている。よって、好ましくは、この微生物において、ｐｐｓＡ遺伝子の発現が増強される。両改変が微生物に同時に存在してもよい。
【００６３】
特に嫌気性または微好気性条件下で、ピルビン酸をアセチル−ｃｏＡへ変換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）がＮＡＤＨによる阻害に対して低い感受性を有することが有利である。より低い感受性とは、ＷＯ２００５／０７３３６４にすでに示されているように、非改変酵素の感受性に対して定義される。特に、このような特徴は、酵素のタンパク質配列においてアラニン５５のバリンによる置換をもたらす、ｌｐｄ遺伝子（ＰＤＣのサブユニットリポアミドデヒドロゲナーゼをコードする）に特異的突然変異を導入することによって得ることができる。
【００６４】
本発明の別の特定の実施態様では、副生成物である酢酸の合成が妨げられる。完全好気条件下では、還元された補因子ＮＡＤＨは好ましくは、末端電子受容体として酸素を用いる呼吸鎖を介してＮＡＤ＋へと酸化される。従って、同時生成物（例えば、酢酸）の合成が強いられない。１，２−プロパンジオールの生産を至適化するためにはこのような酢酸合成を回避することが好ましい。
【００６５】
酢酸の生産を妨げるためには、有利には、酢酸の合成に関与する少なくとも１つの遺伝子の活性が減弱される。好ましくは、ａｃｋＡ、ｐｔａおよびｐｏｘＢから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱され、これらの遺伝子は全て、異なる酢酸生合成経路（図１参照）に関与する酵素をコードしている。
【００６６】
本発明のもう１つの目的は、これまでに記載したものなどの進化株が炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、その後、生成された１，２−プロパンジオールが回収される、１，２−プロパンジオールを製造するための方法である。１，２−プロパンジオールの製造は好気性、微好気性または嫌気性条件下で行われる。
【００６７】
本発明の微生物の培養条件（発酵）は、当業者ならば容易に定義することができる。特に、細菌は２０℃〜５５℃の間、好ましくは２５℃〜４０℃の間の温度、好ましくは、Ｃ．アセトブチリカムでは約３５℃、大腸菌では約３７℃で発酵される。
【００６８】
この工程は回分法、流加法または連続法のいずれかで行うことができる。
【００６９】
「好気性条件下」とは、酸素が、液体相に気体を溶解させることにより培養物に供給されることを意味する。これは、（１）酸素を含有する気体（例えば、空気）を液体相に散布すること、または（２）培養培地を含有する容器を振盪して、上部空間に含まれている酸素を液体相に送ることにより得ることができる。嫌気性条件下ではなく好気性条件下での発酵の利点は、電子受容体としての酸素の存在が、その株の、細胞プロセスのためにより多くのエネルギーをＡＴＰ形態で生産する能力を改良するということである。従って、その株はその全般的代謝が改良されている。
【００７０】
微好気性条件は、低パーセンテージの酸素（例えば、０．１〜１０％の間の酸素を含み、窒素で１００％とした混合物を用いる）が液体相に溶解される培養条件として定義される。
【００７１】
嫌気性条件は、培養培地に酸素が供給されない培養条件として定義される。厳密な嫌気性条件は、他の気体の痕跡を除去するために培養培地に窒素のような不活性ガスを散布することにより得られる。硝酸を電子受容体として用い、株によるＡＴＰ生産を改良し、その代謝を改良することができる。
【００７２】
１，２−プロパンジオール製造のための進化プロセスおよび発酵プロセスの際の株の培養は、発酵槽で、少なくとも１つの炭素源を含有し、使用する細菌に適合した既知の設定構成の無機培養培地を用いて行われる。従って、特に、大腸菌用の無機増殖培地は、Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)と同一もしくは類似の組成のもの、またはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)により定義されているものなどの培地、および下記のＭＰＧと呼ばれる最小培養培地であり得る。
【００７３】
【表１】
【００７４】
本発明の特定の実施態様では、この方法は、大腸菌の進化株を用い、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロースまたはキシロースであり得る単純炭素源を含有する増殖培地で行われる。
【００７５】
本発明の別の特定の実施態様では、この方法はクロストリジウム・アセトブチリカムの進化株を用い、単純炭素源または複合炭素源を含有する増殖培地で行われる。
【００７６】
従って、Ｃ．アセトブチリカム用の増殖培地は、クロストリジウム増殖培地(CGM, Wiesenborn et al., Appl. Environm. Microbiol., 54: 2717-2722)またはMonot et al. (Appl. Environm. Microbiol., 44: 1318-1324)もしくはVasconcelos et al. (J. Bacterid., 176: 1443-1450)により示されているような無機増殖培地と同一もしくは類似の組成のものであり得る。
【００７７】
Ｃ．アセトブチリカムの培養に用いられる炭素源は単純炭素または複合炭素のいずれかである。単純炭素源はアラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロースまたはキシロースであり得る。特に好ましい単純炭素源はグルコースである。複合炭素源はデンプンまたはヘミセルロースであり得る。特に好ましい複合炭素源はデンプンである。
【００７８】
好ましくは、回収された１，２−プロパンジオールはさらに精製される。当業者ならば生産された１，２−プロパンジオールを回収および精製するための方法を知っている。これらの方法は通常のプロセスである。
【００７９】
本発明は上記、下記および大腸菌に関して実施例に記載されている。よって、本発明の始原株および進化株に関して減弱、欠失または過剰発現可能な遺伝子は、主として大腸菌由来の遺伝子の名称を用いて定義される。しかしながら、この名称は本発明によればより一般的な意味を持ち、他の微生物において対応する遺伝子も包含する。当業者ならば、大腸菌由来の遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ参照番号を用いて、大腸菌以外の生物における等価な遺伝子を同定することができる。
【００８０】
相同配列の同定の手段およびそれらの相同性％は当業者によく知られており、特に、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で、このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに使用することができるＢＬＡＳＴプログラムを含む。得られた配列は、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)を、これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて利用（アライン）することができる。
【００８１】
ＰＦＡＭデータベース（protein families database of alignments and Hidden Markov Models http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アライメントの大きなコレクションである。各ＰＦＡＭは、複数のアライメントの可視化、タンパク質ドメインの観測、生物間での分布の評価、他のデータベースへのアクセスの確保および既知のタンパク質構造の可視化を可能とする。
【００８２】
ＣＯＧ（Clusters of Orthologous Groups of protein http://www.ncbi.nlm.nih. gov/COG/）は、４４の主要な系統発生論的系統を表す６６の完全に配列決定されたゲノムに由来するタンパク質配列を比較することにより得られる。各ＣＯＧは少なくとも３つの系統から定義され、古くから保存されていたドメインの同定が可能となる。
【００８３】
参照文献（本明細書に引用されている順）
【表２】
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は、
１−改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈの構築
２−前記始原株の進化
３−選択された進化株におけるｔｐｉＡ遺伝子の再構築
４−ｇａｐＡ遺伝子の減弱；ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子の欠失；ｐｐｓＡ遺伝子の過剰発現
５−ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｏｘＢ遺伝子の欠失
６−得られた数株の、好気性条件下での１，２−プロパンジオール生産に関する比較
７−最良の株を用いた流加培養での１，２−プロパンジオールの生産
【００８５】
実施例１：１，２−プロパンジオール生産の改良に向けた進化が可能な大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈの改変株構築
ａ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄの構築
プロトコール１に従い、大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ：：ｃｍ（ＷＯ２００５０７３３６４参照）においてクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。
【００８６】
プロトコール１：耐性カセットの除去
クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットを以下の技術に従って除去した。クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位にＦＬＰレコンビナーゼ作用を有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションによりこの株へ導入した。４２℃で連続培養した後、これらの抗生物質耐性カセットの欠損を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【００８７】
この株において予め確立されている改変の存在を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【００８８】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄと命名した。
【００８９】
【表３】
【００９０】
ｂ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄの構築
カナマイシン耐性カセットを除去するため、およびｌｄｈＡ遺伝子を不活性化するために、プロトコール２に従い、関連遺伝子の大部分を欠失したｌｄｈＡ遺伝子にクロラムフェニコール耐性カセットを挿入した。
【００９１】
プロトコール２：組換えのためのＰＣＲ産物の導入および組換え体の選択
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択され、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用い、プラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドｐＫＤ４由来のカナマイシン耐性カセットを増幅した(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))。次に、得られたＰＣＲ産物を、そこで発現したλ Ｒｅｄ（γβ，ｅｘｏ）系が相同組換えに極めて有利である、プラスミドｐＫＤ４６を担持するレシピエント株にエレクトロポレーションにより導入した。その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、その耐性カセットの挿入を、表１に示された適切なオリゴヌクレオチドを用いた分析により確認した。
【００９２】
この株の他の改変も、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【００９３】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄと命名した。
【００９４】
【表４】
【００９５】
ｃ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ΔａｒｃＡ：：ｋｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５において、プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ａｒｃＡ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ΔａｒｃＡ：：ｋｍと命名した。
【００９６】
ｄ）大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｌｆＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡの改変株の構築
【００９７】
大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄにおける、その遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによるａｒｃＡ遺伝子の欠失は、ファージＰ１を用いた形質導入技術によって行った。
【００９８】
プロトコール３：遺伝子欠失のためのファージＰ１を用いた形質導入
レシピエント大腸菌における、その遺伝子を耐性カセット（カナマイシンまたはクロラムフェニコール）で置換することによる選択された遺伝子の欠失は、ファージＰ１を用いた形質導入技術によって行った。プロトコールは、（ｉ）単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株でのファージ溶解液の作製、および（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の形質導入の二段階であった。
【００９９】
ファージ溶解液の作製
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ ３０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２ ５ｍＭでの、単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを播種する。
・振盪しながら３７℃で３０分インキュベーション。
・野生株ＭＧ１６５５で作製したファージＰ１溶解液１００μｌ（およそ１×１０９ファージ／ｍｌ）を加える。
・３７℃で３時間、全ての細胞が溶解するまで振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける・
・４５００ｇで１０分の遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。
・上清を無菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
・この溶解液を４℃で保存する。
形質導入
・ＬＢ培地中、大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分遠心分離する。
・この細胞ペレットを２．５ｍｌのＭｇＳＯ４ １０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ５ｍＭ中に懸濁させる。
・対照試験管：細胞１００μｌ
単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株のファージＰ１ １００μｌ
・試験管試験：細胞１００μｌ＋単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株のファージＰ１ １００μｌ
・振盪せずに３０℃で３０分インキュベーション。
・各試験管に１Ｍクエン酸ナトリウム１００μｌを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍｌのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベーション。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分遠心分離した後、ディッシュ上、ＬＢ＋Ｃｍ３０μｇ／ｍｌでプレーティング。
・３７℃で一晩インキュベーション。
【０１００】
次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、欠失の挿入を、表１に示された適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【０１０１】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ：：ｋｍと命名した。
【０１０２】
次に、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール耐性カセットおよびカナマイシン耐性カセットを除去した。
【０１０３】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡと命名した。
【０１０４】
ｅ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ Δｎｄｈ：：ｋｍの構築
プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ｎｄｈ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ Δｎｄｈ：：ｋｍと命名した。
【０１０５】
ｆ）大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｌｆＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ＡｐｌｆＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡにおける、その遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによるｎｄｈ遺伝子の欠失は、これまでのように、プロトコール３に記載のファージＰ１を用いた形質導入技術を用いて行った。
【０１０６】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ：：ｋｍと命名した。
【０１０７】
次に、プロトコール１に従い、カナマイシン耐性カセットを除去した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈと命名した。
【０１０８】
各段階で、株においてそれまでに構築された改変の存在を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１０９】
実施例２：微好気性条件下でのケモスタット培養における改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄの進化および進化の生理学的特徴
【０１１０】
１，２−プロパンジオール生産の改良に向けて進化させるため、大腸菌株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄを、過剰なグルコース（最初は２０ｇ／ｌ、グルコースが使い尽くされれば追加）を含む、これまでに記載したものなどの培養培地ＭＰＧ中、一方は嫌気性条件下、他方は微好気性条件（１％酸素）下での連続培養で培養した。温度は３７℃に設定し、ｐＨは塩基を加えることで６．５に調整した。これらのケモスタットでの株の進化に続き、生成物１，２−プロパンジオールと副生成物である酢酸の濃度の増加と結びついたバイオマス濃度の増加が数週間（４週間から６週間まで）見られた。これはこれらの株の性能の改良を表すものであった。これらの培養物が、これらの条件下でその濃度のさらなる上昇が見られない定常状態に達した際に、その進化が起こった。
【０１１１】
進化前後の株の特徴を評価した。個々のクローンを表す単一のコロニーをペトリ皿に単離した。これらのクローンを、エルレンマイヤーフラスコアッセイにて、ケモスタット培養で用いたものと同じＭＰＧ培地を用い、始原株を対照として評価した。これらのクローンのうちいくつかが対照に比べて良好な１，２−プロパンジオール特異的生産率を示した。これらのクローンを次の工程のために選択した。各進化条件に関して最良のクローンで得られた結果を以下の表４および５に報告する。
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
これらのクローンを、酵母抽出液を含む培養培地で長期間培養したことから、最小培地での増殖に順応させる必要があった。２つの最良のクローン（その性能は表４および５に示されている）は、最小培地で連続培養して、そのような条件下での増殖速度を高めることにより順応させ、増殖速度が安定した際に順応を止めた。最終培養物からクローンを単離し、その順応した集団に代表的なものであるかどうか確認した。
【０１１５】
実施例３：大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄの選択された進化株におけるｔｐｉＡ遺伝子の再構築
ａ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ｔｐｉＡ：：ｋｍの構築
プロトコール２に記載の技術に従い、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用い、ｔｐｉＡ遺伝子の上流にカナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ｔｐｉＡ：：ｋｍと命名した。
【０１１６】
次に、プロトコール３に記載のファージＰ１による形質導入技術を用い、大腸菌進化株ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｌｆＡＢ，ΔａｄｈＥ，Δｌｄｈ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，ΔｎｄｈにおけるｔｐｉＡ遺伝子の再構築を行った。
【０１１７】
得られた株を進化型大腸菌ＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊，ｔｐｉＡｒｃ：：ｋｍ，ΔｐｌｆＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈと命名した。
【０１１８】
その後、プロトコール２に従い、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」と命名した。
【０１１９】
株においてそれまでに構築された改変の存在を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１２０】
実施例４：「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」の改変：ｇａｐＡ遺伝子の減弱；ｐｙｋＡおよびｐｒｋＦ遺伝子の欠失；ベクターｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡによるｐｐｓＡ遺伝子の剰発現
ａ）天然ｇａｐＡプロモーターの、合成ショートＰｔｒｃ１６プロモーターでの置換
「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」株における天然ｇａｐＡプロモーターの、合成ショートＰｔｒｃ１６プロモーター（配列番号５２：gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtggaa）での置換は、２２５ｐｂの上流ｇａｐＡ配列をＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴおよび操作プロモーターで置換することにより行った。この技術はプロトコール２に記載され、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用いる。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡと命名した。
【０１２１】
次に、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール耐性カセットを除去した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡと命名した。
【０１２２】
ｂ）ｐｙｋＡ遺伝子の欠失
ｐｙｋＡ遺伝子は、プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより不活性化した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ ΔｐｙｋＡ：：ｋｍと命名した。
【０１２３】
次に、プロトコール１に従い、カナマイシン耐性カセットを除去した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ ΔｐｙｋＡと命名した。
【０１２４】
ｃ）ｐｙｋＦ遺伝子の欠失
ｐｙｋＦ遺伝子は、プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより不活性化した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ：：ｋｍと命名した。
【０１２５】
次に、前記のように、プロトコール１に従い、カナマイシン耐性カセットを除去した。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦと命名した。
【０１２６】
ｄ）発現ベクターｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡの株への導入
ホスホエノールピルビン酸の生産を高めるために、ｐｐｓＡ遺伝子を、ｇａｐＡプロモーターを用いてプラスミドｐＪＢ１３７から発現させた。プラスミドｐＪＢ１３７−Ｐ ｇａｐＡ−ｐｐｓＡの構築のため、ｐｐｓＡ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０１２７】
１．ｇａｐＡ−ｐｐｓＡＦは、６５塩基（配列番号５３）：
ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC
からなり、
・ウェブサイト（http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の参照配列であるｐｐｓＡ遺伝子（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８５１０６〜１７８５１３６）と相同な領域（大文字）
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０７９４〜１８６０７６１）と相同な領域（小文字）
を含む。
【０１２８】
２．ｐｐｓＡＲは、４３塩基（配列番号５４）：
aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC
からなり、
・ｐｐｓＡ遺伝子の領域（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８２７５８〜１７８２７８０）と相同な領域（小文字）
・制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ（下線の文字）
を含む。
【０１２９】
同時に、大腸菌ｇａｐＡ遺伝子のｇａｐＡプロモーター領域を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
【０１３０】
１．ｇａｐＡ−ｐｐｓＡＲは、６５塩基（配列番号５５）：
GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg
からなり、
・ｐｐｓＡ遺伝子（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８５１０６〜１７８５１３６）と相同な領域（大文字）および
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０７９４〜１８６０７６１）と相同な領域（小文字）
を含む。
【０１３１】
２．ｇａｐＡＦは、３３塩基（配列番号５６）：
ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc
からなり、
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０６３９〜１８６０６６１）と相同な領域（小文字）
・制限部位ＳｍａＩ（下線の文字）
を含む。
【０１３２】
次に、両断片を、オリゴヌクレオチドｐｐｓＡＲおよびｇａｐＡＦ(Horton et al. 1989 Gene 77:61-68)を用いて融合した。ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで切断し、ベクターｐＪＢ１３７（ＥＭＢＬ受託番号：Ｕ７５３２６）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングし、ベクターｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡを得た。組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１３３】
このプラスミドｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡを「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ株に導入する。
【０１３４】
得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」，Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）と命名する。
【０１３５】
各段階で、株においてそれまでに構築された改変の存在を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１３６】
実施例５：副生成物として酢酸を生じずに１，２−プロパンジオールを生産可能な「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）株の構築
ａ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５ ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：ｃｍの構築
プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ａｃｋＡおよびｐｔａ遺伝子を不活性化する。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５ ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：ｃｍと命名する。
【０１３７】
ｂ）「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ株の構築
「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ株におけるａｃｋＡおよびｐｔａ遺伝子の欠失を、前記のように、プロトコール３に記載のようなファージＰ１を用いた形質導入技術を用いて行う。
【０１３８】
得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ：：ｃｍと命名する。
【０１３９】
次に、前記のように、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール耐性カセットを除去する。得られた株を「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａと命名する。
【０１４０】
ｃ）改変株「進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ」Ｐｔｒｃ１−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）の構築
プロトコール２に記載の技術を表２に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ｐｏｘＢ遺伝子を不活性化する。
【０１４１】
得られた株を進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ：：ｃｍと命名する。
【０１４２】
次に、前記のように、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール耐性カセットを除去する。得られた株を進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢと命名する。
【０１４３】
このプラスミドｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡを、進化型大腸菌株ｔｐｉＡｒｃ Ｐｔｒｃ１−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢに導入する。得られた株を進化型大腸菌ｔｐｉＡｒｃ Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ΔａｃｋＡ−ｐｔａ，ΔｐｏｘＢ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）と命名する。
【０１４４】
各段階で、株においてそれまでに構築された改変の存在を、表１に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１４５】
実施例６：好気性条件下での１，２−プロパンジオール生産に関する種々の進化株の比較
実施例４に記載のように得られた株と対照株（対照１：嫌気性条件下で進化したＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊ ΔｔｐｉＡ ΔｐｆｌＡＢ ΔａｄｈＥ ΔｌｄｈＡ：：Ｃｍ ΔｇｌｏＡ Δａｌｄ，ΔａｌｄＢ Δｅｄｄおよび対照２：微好気性条件下で進化したＭＧ１６５５ ｌｐｄ＊ ΔｔｐｉＡ ΔｐｆｌＡＢ ΔａｄｈＥ ΔｌｄｈＡ：：Ｃｍ ΔｇｌｏＡ Δａｌｄ，ΔａｌｄＢ Δｅｄｄ）を、エルレンマイヤーフラスコアッセイにて、好気性条件下、酵母抽出液および炭素源としてのグルコースを添加した最小培地で培養した。培養は３４℃で行い、培養培地をＭＯＰＳで緩衝させることによりｐＨを維持した。培養の終了時に、発酵液中の１，２−プロパンジオール、アセトールおよび残留グルコースをＨＰＬＣにより分析し、グルコースに対する１，２−プロパンジオールおよびグルコースに対する１，２−プロパンジオール＋アセトールの収率を算出した。その後、最良の株を発酵槽での流加培養のために選択した。
【０１４６】
【表７】
【０１４７】
実施例７：最良の株を用いた流加培養での１，２−プロパンジオールの生産
これまでの実験で選択された最良の株を、流加プロトコールを用い、２１発酵槽で培養する。
【０１４８】
培養物の温度は３７℃に維持し、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液を用い、常に６．５〜８の間に調整する。振盪速度は回分期には２００〜３００ｒｐｍの間に維持し、流加期の終了時には１０００ｒｐｍまで引き上げる。溶解酸素濃度は、ガスコントローラーを用いて３０〜４０％の間の値に維持する。光学密度が３〜５の間の値に達した際に、流加を初期流速０．３〜０．５ｍｌ／時で開始し、２．５〜３．５ｍｌ／時の間の流速値まで段階的に引き上げる。この時点で２４〜４８時間、流速を一定に維持する。流加培地は３００〜５００ｇ／ｌの間の濃度のグルコースを含有する最小培地に基づく。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源から１，２−プロパンジオールを製造するための進化した微生物株を製造する方法であって、
始原株を、適切な増殖培地中、選択圧下で増殖させること（該始原細菌株は、始原株において進化を促進するための、ｔｐｉＡ遺伝子の発現の減弱、およびメチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現の減弱を含む）、
次に、１，２プロパンジオールの生産率が高まった進化株を選択および単離すること、
その後、その進化株において機能的ｔｐｉＡ遺伝子を再構築すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
メチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する遺伝子が、ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
始原株が、ｌｄｈＡ、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ、ａｄｈＥ、ｅｄｄおよびｅｄａからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の減弱をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
始原株が、ａｒｃＡおよびｎｄｈからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の減弱をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
進化株が、その１，２−プロパンジオールの生産率が始原株の生産率に比べて少なくとも２０％高まったことに基づいて選択および単離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
始原株が、細菌、酵母および真菌からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
始原株が、内細菌科、バチルス科、クロストリジウム科、ストレプトミセス科およびコリネバクテリア科からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
始原株が、大腸菌またはクロストリジウム・アセトブチリカムのいずれかである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により取得可能な、微生物の進化株。
【請求項１０】
グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ活性が減弱されている、請求項９に記載の進化株。
【請求項１１】
ｇａｐＡ遺伝子の発現が減弱されている、請求項１０に記載の進化株。
【請求項１２】
糖移入の効率が高められている、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の進化株。
【請求項１３】
ホスホエノールピルビン酸とは独立の糖移入系が用いられる、請求項１２に記載の進化株。
【請求項１４】
ｇａｌＰおよびｇｌｋから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が増強されている、請求項１３に記載の進化株。
【請求項１５】
糖ホスホトランスフェラーゼ系の効率が、代謝産物ホスホエノールピルビン酸のアベラビリティーを高めることによって増強されている、請求項１２に記載の進化株。
【請求項１６】
少なくとも１つのピルビン酸キナーゼの活性が減弱されている、請求項１５に記載の進化株。
【請求項１７】
ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱されている、請求項１６に記載の進化株。
【請求項１８】
ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性が増強されている、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の進化株。
【請求項１９】
ｐｐｓＡ遺伝子の発現が増強されている、請求項１８に記載の進化株。
【請求項２０】
ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの代謝に有利な酵素が、非修飾酵素よりもＮＡＤＨによる阻害に対して低い感受性を有する、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の進化株。
【請求項２１】
ｌｐｄ遺伝子が、アラニン５５のバリンによる置換をもたらす点突然変異を有する、請求項２０に記載の進化株。
【請求項２２】
酢酸の合成に関与する少なくとも１つの酵素の活性が減弱されている、請求項９〜２１のいずれか一項に記載の進化株。
【請求項２３】
ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱されている、請求項２２に記載の進化株。
【請求項２４】
１，２−プロパンジオールを製造するための方法であって、請求項９〜２３のいずれか一項に記載の進化株が炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、生成した１，２−プロパンジオールが回収される、方法。
【請求項２５】
大腸菌の進化株が、単純炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、生成した１，２−プロパンジオールが回収される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
クロストリジウム・アセトブチリカムの進化株が、単純炭素源または複合炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、生成した１，２−プロパンジオールが回収される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
回収された１，２−プロパンジオールがさらに精製される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
炭素源から１，２−プロパンジオールを製造するための進化した微生物株を製造する方法であって、
始原株を、適切な増殖培地中、選択圧下で増殖させること（該始原細菌株は、始原株において進化を促進するための、ｔｐｉＡ遺伝子の発現の減弱、およびメチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現の減弱を含む）、
次に、１，２プロパンジオールの生産率が高まった進化株を選択および単離すること、
その後、その進化株において機能的ｔｐｉＡ遺伝子を再構築すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
メチルグリオキサールの乳酸への変換に関与する遺伝子が、ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
始原株が、ｌｄｈＡ、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ、ａｄｈＥ、ｅｄｄおよびｅｄａからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の減弱をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
始原株が、ａｒｃＡおよびｎｄｈからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の減弱をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
進化株が、その１，２−プロパンジオールの生産率が始原株の生産率に比べて少なくとも２０％高まったことに基づいて選択および単離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
始原株が、細菌、酵母および真菌からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
始原株が、内細菌科、バチルス科、クロストリジウム科、ストレプトミセス科およびコリネバクテリア科からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
始原株が、大腸菌またはクロストリジウム・アセトブチリカムのいずれかである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により取得可能な、微生物の進化株。
【請求項１０】
グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ活性が減弱されている、請求項９に記載の進化株。
【請求項１１】
ｇａｐＡ遺伝子の発現が減弱されている、請求項１０に記載の進化株。
【請求項１２】
糖移入の効率が高められている、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の進化株。
【請求項１３】
ホスホエノールピルビン酸とは独立の糖移入系が用いられる、請求項１２に記載の進化株。
【請求項１４】
ｇａｌＰおよびｇｌｋから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が増強されている、請求項１３に記載の進化株。
【請求項１５】
糖ホスホトランスフェラーゼ系の効率が、代謝産物ホスホエノールピルビン酸のアベラビリティーを高めることによって増強されている、請求項１２に記載の進化株。
【請求項１６】
少なくとも１つのピルビン酸キナーゼの活性が減弱されている、請求項１５に記載の進化株。
【請求項１７】
ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱されている、請求項１６に記載の進化株。
【請求項１８】
ホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性が増強されている、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の進化株。
【請求項１９】
ｐｐｓＡ遺伝子の発現が増強されている、請求項１８に記載の進化株。
【請求項２０】
ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの代謝に有利な酵素が、非修飾酵素よりもＮＡＤＨによる阻害に対して低い感受性を有する、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の進化株。
【請求項２１】
ｌｐｄ遺伝子が、アラニン５５のバリンによる置換をもたらす点突然変異を有する、請求項２０に記載の進化株。
【請求項２２】
酢酸の合成に関与する少なくとも１つの酵素の活性が減弱されている、請求項９〜２１のいずれか一項に記載の進化株。
【請求項２３】
ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱されている、請求項２２に記載の進化株。
【請求項２４】
１，２−プロパンジオールを製造するための方法であって、請求項９〜２３のいずれか一項に記載の進化株が炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、生成した１，２−プロパンジオールが回収される、方法。
【請求項２５】
大腸菌の進化株が、単純炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、生成した１，２−プロパンジオールが回収される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
クロストリジウム・アセトブチリカムの進化株が、単純炭素源または複合炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、生成した１，２−プロパンジオールが回収される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
回収された１，２−プロパンジオールがさらに精製される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５２１９５８（Ｐ２０１０−５２１９５８Ａ）
【公表日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５４０４５（Ｐ２００９−５５４０４５）
【出願日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５３４４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６８５２
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５０５３１１９１７）メタボリック エクスプローラー (26)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５３４４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６８５２
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５０５３１１９１７）メタボリック エクスプローラー (26)
【Ｆターム（参考）】
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