遺伝子導入剤の製造方法、及び遺伝子導入剤の製造装置
【課題】光照射リビング重合により、分子量分布の狭い遺伝子導活性に優れた遺伝子導入剤を効率的に製造する。
【解決手段】溶液中での光照射リビング重合を行う工程を含む遺伝子導入剤の製造方法において、接液面が光透過性の樹脂で構成された光照射手段を該溶液に浸漬させて光照射を行う。光照射手段を反応溶液内に浸漬させて反応を行うことにより、分子量分布が狭く、遺伝子導入活性に優れる遺伝子導入剤を得ることができる。好ましくは、この光照射手段により溶液を撹拌する。
【解決手段】溶液中での光照射リビング重合を行う工程を含む遺伝子導入剤の製造方法において、接液面が光透過性の樹脂で構成された光照射手段を該溶液に浸漬させて光照射を行う。光照射手段を反応溶液内に浸漬させて反応を行うことにより、分子量分布が狭く、遺伝子導入活性に優れる遺伝子導入剤を得ることができる。好ましくは、この光照射手段により溶液を撹拌する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中での光照射リビング重合により遺伝子導入剤を製造する方法に係り、詳しくは、この方法により、分子量分布が狭く、遺伝子導入活性に優れた遺伝子導入剤を製造する方法に関する。本発明はまた、この遺伝子導入剤の製造方法に用いる遺伝子導入剤の製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。本出願人らは、前述の合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できる遺伝子導入剤を提案した（特許文献１，２）。
【０００４】
本出願人らはまた、前記分岐構造のベクターである分岐型重合体、或いは、この分岐型重合体に光を照射するなどして分岐型重合体同士を架橋させた架橋体のうち、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を液体クロマトグラフィー等により分取して得た遺伝子導入剤が、さらに効率よく細胞へ遺伝子を導入することができることを見出し、先に特許出願した（特許文献３）。
【０００５】
なお、特許文献１〜３において、遺伝子導入剤は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに対してビニル系モノマーを光照射リビング重合することにより製造されている。この光照射リビング重合は、イニファターとビニル系モノマーとを含む溶液を反応容器に入れ、この反応容器の一側面側から光を照射することにより行われている。
【０００６】
しかして、このような方法で製造される遺伝子導入剤は、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが２．５程度と分子量分布の大きいものであるが、特許文献３では、この分子量分布の大きい重合反応生成物を液体クロマトグラフィー等により分子量分画し、Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の分画を分取して遺伝子導入剤としている。
【０００７】
ところで、光照射手段として、管状クラッドと、この管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料よりなるコアとを備えた光伝送チューブにおいて、管状クラッドとコアとの間に帯状の反射層を形成することにより、管状クラッドの側周面（外表面部）から指向性を有する光を放出させるようにした光伝送チューブが知られており、特許文献４には、「管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備える光伝送チューブにおいて、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるようにした光伝送チューブであって、該帯状の反射層を複数条形成し、前記コアを通る光を管状クラッド側周面から複数の方向に放出させるようにしたことを特徴とする光伝送チューブ。」が提案されている。このような光伝送チューブは、その柔軟性、耐衝撃性、軽量性等を利用して、主として自動車室内照明分野や、建築、家電・情報機器分野、屋外照明分野などに使用されており、従来、これを光反応の光源として用いるという提案はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８号公報
【特許文献２】特開２００７−０７０５７９号公報
【特許文献３】特願２００８−１２８５６５
【特許文献４】特開２０００−０３９５１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記特許文献１，２に記載されるベンゼン環から放射状にポリマー鎖が伸延する遺伝子導入剤は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターのジチオカルバメート基の光開裂性を利用することにより、このイニファターに対してビニル系モノマーを光照射リビング重合したものであって、同じモノマーユニットからなる線形ポリマーと比較して、その構造上、電荷密度を高く配置することが可能である。このため、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸との複合体をより強く凝集させることが可能であり、より粒子径の小さい微細なポリプレックス粒子を形成させることができるが、より遺伝子導入効率に優れた遺伝子導入剤の開発が望まれていた。
【００１０】
この要望に対し、本発明者らは、特許文献１，２に記載される分岐構造を有するベクターのうち、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎ（以下、この比を「分散比」と称す場合がある。）が小さい遺伝子導入剤が特に優れた遺伝子導入活性を示すことを見出し、光照射リビング重合反応生成物から、この分散比が１．０〜１．５である画分を分子量分画により分取する遺伝子導入剤の製造方法を提案した（特許文献３）。
【００１１】
特許文献３に記載される遺伝子導入剤の製造方法によれば、分散比が１．０〜１．５である画分を分取することにより、遺伝子導入活性に特に優れる遺伝子導入剤を得ることができるが、このためには、反応生成物に対して液体クロマトグラフィー等による分子量分画を行う必要がある。
【００１２】
即ち、ジチオカルバメート基の光開裂性を利用した重合反応では、以下に説明するように、分散比が小さく、分子量分布が狭い重合体を光照射リビング重合により直接製造することが難しい。
【００１３】
有機テルル、ニトロキシド、ジチオエステル（ＲＡＦＴ試薬）をドーマント核として用いるリビングラジカル重合では、休眠期のドーマント核と成長ラジカルとの交換反応が平衡に達しているため、重合反応が反応系全体において均一に進行し、分散比がほぼ１．０であるポリマーを得ることができる。これに対し、ジチオカルバメート基の光開裂性を利用するリビング重合では、ジチオカルバメート基の光ラジカル開裂速度が遅く、ジチオカルバメート基と成長ラジカルとの交換反応がほとんど生じない。従って、この重合反応では、光量子を吸収した分子のみが重合するため、上記の有機テルルなどのリビングラジカル重合反応と比較して分子量分布が若干広くなる。
【００１４】
特に、ジチオカルバメート基の光開裂性を利用したイニファターとカチオン性モノマーとの重合反応においては、以下の(１)、(２)の理由により、分子量分布の狭い分岐型重合体を収率よく得ることができない。
（１） カチオン性モノマーは、反応性が低いため高濃度の溶液で反応させる必要がある。しかしながら、このカチオン性モノマーを含む溶液は、カチオン性官能基に由来する水素結合の寄与により粘度が高く、撹拌効率が悪く、重合中に反応溶液を十分に撹拌して均一な反応溶液とすることが難しい。
（２） カチオン性モノマーとして用いられるアミン化合物は、その独特の色から明らかなように、イニファターの光開裂に重要な近紫外光の吸収率がスチレンなどの他の中性モノマーに比べて高い。このため、反応容器内の溶液に対して、均一に光を照射し、均一に重合反応を進行させることが困難である。即ち、反応溶液を入れた反応容器の一側面側から光を照射しても、溶液内の光源に近い部分に存在するアミン化合物が近紫外光を吸収して、この部分で局所的に重合が進行してしまうため、光源から遠い部分に存在するイニファターに光が到達しにくく、反応溶液中で均一に反応が進行しない。この問題は、上記（１）の均一撹拌が困難であることによって、更に助長される。
【００１５】
本発明は上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、光照射リビング重合により、分子量分布の狭い遺伝子導活性に優れた遺伝子導入剤を効率的に製造することができる遺伝子導入剤の製造方法、及びこの遺伝子導入剤の製造方法に用いる遺伝子導入剤の製造装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、溶液中での光照射リビング重合において、反応系全体に光を照射して系内全体で均一な反応を進行させる方法について検討を重ねた結果、反応溶液に光照射手段を浸漬し、溶液中で直接光照射を行うことにより、光源からイニファターまでの光路を短くすることができ、これにより、溶液内での光照射リビング重合を均一に進行させることができること、そして、溶液内での光照射リビング重合を均一に進行させることにより、分子量分布の狭い遺伝子導入剤を得ることができること、を見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤の製造方法は、溶液中での光照射リビング重合を行う工程を含む遺伝子導入剤の製造方法において、接液面が光透過性の樹脂で構成された光照射手段を該溶液に浸漬させて光照射を行うことを特徴とするものである。
【００１８】
請求項２の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１において、前記光照射手段は、樹脂製の光伝送チューブを備え、該チューブは、該チューブの一端から入射した光を該チューブの側周面から放出するものであることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項３の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１又は２において、前記樹脂が、（メタ）アクリル系ポリマーよりなることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項４の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記光照射手段により前記溶液を撹拌することを特徴とするものである。
【００２１】
請求項５の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項２ないし４のいずれか１項において、前記光照射手段は、前記光伝送チューブを複数本有するものであることを特徴とするものである。
【００２２】
請求項６の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし５のいずれか１項において、少なくとも、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物からなるイニファターに対して、ビニル系モノマーを光照射リビング重合してなる分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造することを特徴とするものである。
【００２３】
請求項７の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項６において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【００２４】
請求項８の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項６又は７において、前記ビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００２５】
請求項９の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の分子量が、１，０００〜６０，０００であることを特徴とするものである。
【００２６】
請求項１０の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが、１．３以下であることを特徴とするものである。
【００２７】
本発明（請求項１１）の遺伝子導入剤の製造装置は、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤の製造方法に用いる遺伝子導入剤の製造装置であって、反応溶液を保持する反応容器と、該反応溶液に浸漬される光伝送チューブを備える光照射手段とを有し、該光伝送チューブは、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるように構成されていることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法では、接液面が光透過性の樹脂よりなる光照射手段を反応溶液に浸漬させて光照射を行うため、反応系内の基質と光源との距離が短く、反応系内に存在する基質に対して均一に光を照射することができる。これにより、溶液内での光照射リビング重合を均一に進行させることができ、結果として分子量分布の狭い遺伝子導入剤を得ることができる。また、本発明で用いる光照射手段の接液面は樹脂で構成されるため、接液面の耐衝撃性が高く、取り扱いが容易であると共に、製造コストを抑えることもできる。
【００２９】
前記光照射手段は、樹脂製の光伝送チューブを備え、該チューブは、該チューブの一端から入射した光を該チューブの側周面から放出するものであることが好ましい（請求項２）。
【００３０】
光照射手段の接液面を構成する光透過性の樹脂としては、（メタ）アクリル系ポリマーが好ましい（請求項３）。（メタ）アクリル系ポリマーを用いた場合、以下の理由により反応効率が向上し、分子量が大きい遺伝子導入剤を得ることができる。
【００３１】
即ち、光照射リビング重合において常用される照射強度の照射光には、重合反応（正反応）を生じさせる波長３７０ｎｍ付近の光と、分解反応（逆反応）を生じさせる波長３３０〜３５０ｎｍ程度の光が含まれているが、（メタ）アクリル系ポリマーは、このうち、波長３５０ｎｍ以下の光を吸収する性質を有する。このため、光照射手段の接液面を構成する樹脂として（メタ）アクリル系ポリマーを用いた場合は、この光を（メタ）アクリル系ポリマーが吸収して、その透過を抑え、これにより、３５０ｎｍ以下の波長の光に起因する逆反応を生じ難くすることができ、この結果、正反応を優先させて分子量の大きい遺伝子導入剤を得ることができる。
【００３２】
本発明においては、前記光照射手段により前記溶液を撹拌することが好ましい（請求項４）。前記光照射手段で反応溶液を撹拌することにより、溶液内に存在する基質に対してより一層均一に光を照射することができる。
【００３３】
前記光照射手段は、前記光伝送チューブを複数本有するものであることが、反応系内へ均一な光照射を行う上で好ましい（請求項５）。
【００３４】
本発明において製造する遺伝子導入剤としては、少なくとも、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物からなるイニファターに対して、ビニル系モノマーを光照射リビング重合してなる分岐型重合体よりなることが好ましい（請求項６）。
【００３５】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合しているものが好ましく（請求項７）、前記ビニル系モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい（請求項８）。
【００３６】
前記遺伝子導入剤の分子量は、１，０００〜６０，０００であることが好ましい（請求項９）。
【００３７】
前記遺伝子導入剤の重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．３以下であることが好ましい（請求項１０）。
【００３８】
本発明の遺伝子導入剤の製造装置（請求項１１）は、上記の遺伝子導入剤の製造方法に用いるものであって、反応溶液を保持する反応容器と、該反応溶液に浸漬される光伝送チューブを備える光照射手段とを有し、該光伝送チューブは、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるように構成されているものであり、反応溶液内の基質に対して効率的に光を照射することができ、分子量分布の狭い遺伝子導入剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施の形態に係る製造装置の斜視図である。
【図２】実施の形態に係る光伝送チューブの斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００４１】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法は、溶液中での光照射リビング重合を行う工程を含む遺伝子導入剤の製造方法において、接液面が光透過性の樹脂で構成された光照射手段を該溶液に浸漬させて光照射を行うことを特徴とする。
【００４２】
本発明の遺伝子導入剤の製造装置は、このような本発明の遺伝子導入剤の製造方法に有用な装置であって、反応溶液を保持する反応容器と、該反応溶液に浸漬される光伝送チューブを備える光照射手段とを有し、該光伝送チューブは、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるように構成されていることを特徴とする。
【００４３】
＜光照射手段＞
先ず、本発明に好適に用いられる光照射手段について、図面を参照して説明する。
【００４４】
第１図は、実施の形態に係る製造装置の斜視図である。図１の通り、この製造装置は、光照射手段１と反応容器５とで主として構成されている。光照射手段１は、光伝送チューブ３とこれを保持する円盤状のプレート２とを有している。本実施の形態では、プレート２の盤面の中心に孔４が設けられており、さらに、この孔４を中心とした正六角形の各頂点上にもそれぞれ同様の孔４が設けられている。これらの孔４には、それぞれ光透過性を有する樹脂により構成された光伝送チューブ３が挿通されている。なお、図示のプレート２には、１個の孔に対して１本の光伝送チューブが挿通されているが、１個の孔に対して複数の光伝送チューブが挿通されていてもよい。また、孔は７個に限らず、６個以下あるいは８個以上でも良いが、反応容器５内の溶液中になるべく均等に光照射を行うことができるような配置とされていることが好ましい。この実施の形態では、孔４に挿通されたチューブ３の先端を、反応容器５内の反応溶液に浸漬させて光照射を行う。
【００４５】
反応溶液内において光を照射する光伝送チューブ３としては、チューブの一端から入射した光を、チューブの側周面から放出する性質を備える光伝送性のチューブが好ましい。より具体的には、前述の特許文献４に記載される光伝送チューブを挙げることができる。
【００４６】
以下、図面を参照して光伝送チューブ３の好ましい形態について詳細に説明する。
図２は光伝送チューブの実施の形態を示す斜視図である。
【００４７】
図２に示す光伝送チューブ１１は、コア１２とこれを覆う管状クラッド１３との間に、チューブの長手方向に延在する帯状の反射層１４Ａ，１４Ｂを２条に形成したものである。なお、反射層１４Ａ，１４Ｂはコア１２の表面から若干コア１２の内部に侵入した状態で形成されていても良い。
【００４８】
コア１２を構成する材料（コア材）には、管状クラッド１３を構成する材料（クラッド材）よりも屈折率が高い透明材料が用いられ、一般的には、プラスチック、エラストマー等の中から目的に応じて適宜選択使用される。
【００４９】
コア材の具体例としては、ポリスチレン、スチレン・メチルメタクリレート共重合体、（メタ）アクリル樹脂、ポリメチルペンテン、アリルグリコールカーボネート樹脂、スピラン樹脂、アモルファスポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアリレート、ポリサルホン、ポリアリルサルホン、ポリエーテルサルホン、ポリエーテルイミド、ポリイミド、ジアリルフタレート、フッ素樹脂、ポリエステルカーボネート、ノルボルネン系樹脂（ＡＲＴＯＮ）、脂環式アクリル樹脂（オプトレッツ）、シリコン樹脂、アクリルゴム、シリコンゴム等の透明材料が挙げられる（なお、「（メタ）アクリル」とは「アクリル及びメタクリル」を示す。）。
【００５０】
一方、クラッド材としては、屈折率の低い透明材料の中から選定することができ、プラスチックやエラストマー等の有機材料が挙げられる。
【００５１】
クラッド材の具体例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、フッ化ポリメチルメタアクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリビニルアルコール、ポリエチレン−ポリビニルアルコール共重合体、フッ素樹脂、シリコン樹脂、天然ゴム、ポリイソプレンゴム、ポリブタジエンゴム、スチレン−ブタジエン共重合体、ブチルゴム、ハロゲン化ブチルゴム、クロロプレンゴム、アクリルゴム、エチレン−プロピレン−ジエン共重合体（ＥＰＤＭ）、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体、フッ素ゴム、シリコンゴム等が挙げられる。
【００５２】
上記のコア材、クラッド材のうち、透明性や屈折率等の光学特性及び同時押し出し加工性の面から、コア材としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、スチレン−（メタ）アクリル共重合体（ＭＳポリマー）等が好ましく、また、クラッド材としては（メタ）アクリル系ポリマー等が好ましい。
【００５３】
本発明においては、例えばクラッド材を（メタ）アクリル系ポリマーで構成することにより、（メタ）アクリル系ポリマーが３５０ｎｍ以下の波長の光を吸収し、３５０ｎｍ以下の波長の光に起因する逆反応が生じ難くなり、正反応が優先して生じるため、結果として、分子量の大きい遺伝子導入剤を効率的に製造することができる。
【００５４】
反射層は白色顔料や散乱材を含む（メタ）アクリル系ポリマーで形成することが好ましい。ここで白色顔料や散乱材としては、シリコーン樹脂粒子やポリスチレン樹脂粒子等の有機ポリマー粒子、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２等の金属酸化物粒子、ＢａＳＯ４等の硫酸塩粒子、ＣａＣＯ３等の炭酸塩粒子等が挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を併用して使用することができる。
【００５５】
反射効率や同時押し出し加工性等を考慮した場合、これら白色顔料や散乱材の粒子の平均粒径は０．１〜２００μｍ程度特に０．５〜５０μｍ程度であることが好ましく、また、反射層構成材料（反射材）中の含有量は０．５〜２０重量％程度特に１〜１０重量％程度であることが好ましい。
【００５６】
反射層１４Ａ，１４Ｂの厚さは特に制限されないが、１０〜２００μｍ特に５０〜１００μｍとすることが好適である。この厚さが薄すぎると反射される光が少なくなるため輝度が低くなり、厚すぎると反射される光が多くなり輝度が高くなるが、これは光源から近距離の場合で、更に光源から離れた所では逆に輝度が低くなる不利を伴う場合がある。
【００５７】
なお、コア１２の直径は特に制限されないが、通常２〜３０ｍｍ特に５〜１５ｍｍ程度とされる。また、管状クラッド１３の肉厚は通常０．０５〜４ｍｍ特に０．２〜２ｍｍ程度とされる。
【００５８】
帯状の反射層の形成条数や形成位置、反射層の帯幅や反射層間の間隔等には特に制限はなく、反射層で反射された光が指向性を有する複数の光条として放出されるように形成すれば良い。
【００５９】
各反射層の幅（周方向長さ）は、例えばコアの周長の３〜３０％、好ましくは５〜２０％程度とされるが、この範囲外であっても良い。
【００６０】
このような光伝送チューブの一端に、ブラックライト、ＬＥＤ、ショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、捕虫用蛍光灯、タングステンランプなどの発光装置（図示せず）を設けることにより、光伝送チューブの側面から光が放出される。
【００６１】
このような光伝送チューブは、溶液内に光伝送チューブを浸漬させるのに十分な長さを有していることが好ましい。光伝送チューブの全長のうち反応溶液に浸漬させる部分の長さとしては、反応溶液の液深の７０〜９９％程度が好ましい。反応溶液に浸漬させる部分が短いと、光伝送チューブを反応溶液に浸漬させて光を照射することによる効果を得にくくなると共に、光照射手段による溶液の撹拌効果も得にくくなる。
【００６２】
本発明において用いる光照射手段を構成するプレート２としては、円形、楕円形、正方形、長方形、正六角形等の平面視形状を有するものを挙げることができ、反応容器５の開口部の形状と相似形とすることもできる。このプレート２としては、光伝送チューブを保持するのに十分な大きさがあればよい。
【００６３】
また、反応容器５としては、光照射リビング重合反応において一般的に用いられているものであれば特に制限はない。反応容器５の開口部の大きさとしては、前記光伝送チューブを保持するプレートより大きいことが、光照射手段を用いて撹拌を行う面から好ましい。
【００６４】
＜遺伝子導入剤の製造方法＞
本発明の遺伝子導入剤の製造方法では、前記光照射手段を溶液内に浸漬させて光を照射して光照射リビング重合を行う。この光照射リビング重合としては、少なくとも、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物からなるイニファターに対して、ビニル系モノマーを光照射リビング重合してなる分岐型重合体よりなることが好ましい。
【００６５】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００６６】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００６７】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。前記クラッド材を構成する材質によっては、非極性溶媒に侵されるものも存在するが、この場合、非極性溶媒とアルコール等の極性溶媒とを併用することでクラッド材を保護することが可能である。この非極性溶媒に対する極性溶媒の混合量は、使用するイニファターの官能基数、クラッド材の材質、非極性溶媒の種類によって異なるが、非極性溶媒の１０倍程度（体積）が好ましい。例えば、４官能性のイニファター、ポリメチルメタクリレート、クロロホルム溶媒を使用する場合であれば、イニファターを適量のクロロホルムへ溶解した後、この溶液に対してクロロホルムの１０倍程度のメタノールを加えることにより、クロロホルムの溶解力を低下させることができ、クラッド材の表面の保護が可能である。
【００６８】
イニファターと前記ビニル系モノマーとを反応させるには、イニファター、及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ビニル系モノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００６９】
該原料溶液中のビニル系モノマーの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、イニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。
【００７０】
前記光照射手段により照射する光の波長は３３０〜４００ｎｍ、特に３６０〜３９０ｎｍが好適であり、光の照射強度としては、０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ２、特に０．５〜５ｍＷ／ｃｍ２程度が好ましい。照射時間としては、０．１〜１０時間、特に０．５〜２時間程度が好ましい。
【００７１】
効率的に反応を行うためには、前記光照射手段により光を照射すると共に、この光照射手段により反応溶液を撹拌することが好ましい。撹拌方法としては、この光照射手段を振動させる、回転させる、上下動させる方法を挙げることができる。また、光照射手段による撹拌の他に、撹拌子、撹拌羽根、ガスバブリング、超音波による撹拌を併用することもできる。
【００７２】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐鎖を有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分にビニル系モノマー単位よりなるポリマー鎖が導入され、分岐鎖の末端がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であるホモポリマーを得る。
【００７３】
この分岐型重合体の分岐鎖の１本当たりの分子量としては、１，０００〜４０，０００程度、特に１，５００〜１５，０００程度が好ましい。この分子量は、光照射の時間を制御することにより調整することができる。即ち、反応時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きい分岐型重合体を得ることができる。
【００７４】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００７５】
本発明に係る分岐型重合体の分岐鎖は、ビニル系モノマーをモノマーとする１種のモノマーのみからなるホモポリマーであることが好ましいが、２種以上のビニル系モノマーを導入したブロックコポリマー又はランダムコポリマーであってもよい。
【００７６】
前記ビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種のビニル系モノマーが挙げられ、特に、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００７７】
イニファターと２種以上のビニル系モノマーとを反応させるには、前述のイニファターと１種のビニル系モノマーとを反応させる場合と同様に、イニファターと、２種以上のビニル系モノマーとを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、２種以上のビニル系モノマーが結合したランダムコポリマーを得る。
【００７８】
また、このように製造した遺伝子導入剤の分子量としては、１，０００〜６０，０００程度、特に１０，０００〜５０，０００程度が好ましい。分子量がこの範囲内であると、遺伝子導入剤と核酸とが複合しやすい。
【００７９】
本発明によれば、前記光照射手段を用い、重合系全体に対して均一に光を照射することにより、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．３以下、特に１．１〜１．２というような分散比の小さい遺伝子導入剤を得ることができる。このように分散比の小さい遺伝子導入剤は、優れた遺伝子導入活性を示す。
【００８０】
なお、このような遺伝子導入剤を製造する装置としては、図１に示すような製造装置、即ち、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるように構成されている光伝送チューブを備える光照射手段と、反応溶液を保持する反応容器とを有する製造装置で製造することが好ましい。この装置を用いて製造することにより、分子量分布の狭い遺伝子導入剤を効率的に得ることができる。
【００８１】
＜核酸複合体＞
このようにして製造した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００８２】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度０．１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、核酸に対して遺伝子導入剤を飽和状態にして遺伝子導入剤と核酸とを複合化することが好ましい。
【００８３】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００８４】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００８５】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度、特に１００〜３５０ｎｍ、とりわけ１５０〜３００ｎｍが好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００８６】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００８７】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００８８】
核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００８９】
このような核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００９０】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００９１】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００９２】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００９３】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００９４】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００９５】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００９６】
（１） 光照射手段の作製
特開２０００−３９５１７号公報に記載された光伝送チューブの製造方法に準拠して、管状クラッドがアクリル樹脂よりなり、チューブ側面から光を放出する性質を備える図２に示すような光伝送チューブ（直径２ｍｍ、長さ１００ｍｍ）を作成した。次いで、直径３０ｍｍ、厚み１０ｍｍのプレートを用意し、図１のように、正六角形（１辺１０ｍｍ）の各頂点とプレートの中心に、それぞれ２ｍｍの孔を設け、各孔に光伝送チューブを挿通し固定した。光伝送チューブの一端からブラックライト（ＮＥＣ製：ＦＣＬ３０ＢＬ）の光を入射すると、チューブの側周面が発光した。ブラックライト自体の照射強度はウシオ電機社製ＵＩＴ−１５０に受光器としてＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して測定したところ１．５〜２．０ｍＷ／ｃｍ２であった。
【００９７】
（２） イニファターの合成
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００９８】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間撹拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノール中に投入して３０分間撹拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００９９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）であった。
【０１００】
【化１】
【０１０１】
（３） ４分岐型重合体よりなるホモポリマーの光重合による合成（実施例１、比較例１，２）
下記（３ａ）〜（３ｃ）に記載の通り、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをモノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンよりなるホモポリマーの合成を行った。なお、実施例１では、（１）において作製した光照射手段を用いて光照射リビング重合を行い、比較例１，２では、（１）において作製した光照射手段を用いずに光照射リビング重合を行った。
【０１０２】
（３ａ） 実施例１
上記（２）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを３００μＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド９．０ｇを加えて混合し、全量をメタノールで３０ｍＬに調整した。ガラスセル（直径４５ｍｍ）中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージして溶存酸素を除去し、（１）において作製した光照射手段を溶液に浸漬した。チューブの浸漬深さは、液深の約９０％とした。この光照射手段のチューブの一端からに対しては、ブラックライトの光を入射させ、チューブの側面から光を放出させて１８０分間重合反応を行った。照射強度はウシオ電機社製のＵＩＴ−１５０に受光器としてＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して測定したところ約１．５ｍＷ／ｃｍ２であった。この光照射による重合反応時には、反応溶液内の基質の濃度が均一になるように、この光照射手段を反応容器内の全範囲を可動域として振動させると共に、マグネットスターラーによる撹拌も行った。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、ジエチルエーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて目的とする４分岐型スター型重合体よりなるホモポリマーを得た（重合率２２％）。このホモポリマーのポリエチレングリコールを標準物質としたＧＰＣによる数平均分子量は、３６，０００であり、分散比Ｍｗ／Ｍｎは１．１であった。また、計算により分岐鎖１本当たりの分子量は、８，８１９であることが分かった。
【０１０３】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）であった。
【０１０４】
【化２】
【０１０５】
（３ｂ） 比較例１
上記（２）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを３００μＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド９．０ｇを加えて混合し、全量をメタノールで３０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル（直径５０ｍｍの円筒形）中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージした後密栓した。丸管形蛍光灯（Ｏ字形）ブラックライト（ＮＥＣ社製ＦＣＬ３０ＢＬ）の中央部へガラスセルとマグネットスターラーを配置し、ガラスセルの全側周方向から近紫外光を６０分間照射した。照射強度はウシオ電機社製のＵＩＴ−１５０に受光器としてＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して測定したところ約２ｍＷ／ｃｍ２であった。得られた重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、ジエチルエーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて目的とする４分岐型スター型重合体よりなるホモポリマーを得た（重合率２６％）。このホモポリマーのポリエチレングリコールを標準物質としたＧＰＣによる数平均分子量は、３８，０００であり、分散比Ｍｗ／Ｍｎは、１．５であった。また、計算により分岐鎖１本当たりの分子量は、９，３１９であることが分かった。
【０１０６】
（３ｃ） 比較例２
上記（２）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを３００μＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド９．０ｇを加えて混合し、全量をメタノールで３０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル（底面が５０ｍｍ角の直方体形）中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージした後密栓した。直管形蛍光灯ブラックライトを使用して直方体形ガラスセルの一側面方向から近紫外光を８０分間照射した。照射強度はウシオ電機社製のＵＩＴ−１５０に受光器としてＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して約２ｍＷ／ｃｍ２とした。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、ジエチルエーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて、目的とする４分岐型スター型重合体よりなるホモポリマーを得た（重合率２９％）。このホモポリマーのポリエチレングリコールを標準物質としたＧＰＣによる数平均分子量は、２２，０００であり、分散比Ｍｗ／Ｍｎは、１．８であった。また、計算により分岐鎖１本当たりの分子量は、５，３１９であることが分かった。
【０１０７】
［考察］
(１)で作製した光照射手段を反応溶液に浸漬させて反応を行った実施例１の遺伝子導入剤は、分散比が１．１と小さい値を示したのに対し、光照射手段を反応溶液に浸漬させず、反応溶液の側周面及び一側面から光を照射した比較例１，２の遺伝子導入剤は、分散比がそれぞれ１．５、１．８と大きい値を示した。実施例１の遺伝子導入剤の分散比が１．１と小さい値を示したのは、反応溶液内に７本のチューブを浸漬させたことにより、反応溶液内に存在する各イニファターに対して均一に光量子が供給されたためであると考えられる。この結果より、光照射手段を反応溶液内に浸漬させて反応を行う本発明の遺伝子導入剤の製造方法によれば、分子量分布が狭く、遺伝子導入活性に優れる遺伝子導入剤を得ることができることがわかる。
【０１０８】
なお、分散比の小さい遺伝子導入剤が遺伝子導入活性に優れる理由の詳細は明らかになっていないが、分散比が小さく、ほぼ同程度の大きさの重合体であれば、核酸との反応性が等しく、より高密度に核酸を凝集することができるためであると考えられる。
【符号の説明】
【０１０９】
１ 光照射手段
２ プレート
３ 光伝送チューブ
４ 孔
５ 反応容器
１１ 光伝送チューブ
１２ コア
１３ 管状クラッド
１４Ａ，１４Ｂ 反射層
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中での光照射リビング重合により遺伝子導入剤を製造する方法に係り、詳しくは、この方法により、分子量分布が狭く、遺伝子導入活性に優れた遺伝子導入剤を製造する方法に関する。本発明はまた、この遺伝子導入剤の製造方法に用いる遺伝子導入剤の製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。本出願人らは、前述の合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できる遺伝子導入剤を提案した（特許文献１，２）。
【０００４】
本出願人らはまた、前記分岐構造のベクターである分岐型重合体、或いは、この分岐型重合体に光を照射するなどして分岐型重合体同士を架橋させた架橋体のうち、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の画分を液体クロマトグラフィー等により分取して得た遺伝子導入剤が、さらに効率よく細胞へ遺伝子を導入することができることを見出し、先に特許出願した（特許文献３）。
【０００５】
なお、特許文献１〜３において、遺伝子導入剤は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに対してビニル系モノマーを光照射リビング重合することにより製造されている。この光照射リビング重合は、イニファターとビニル系モノマーとを含む溶液を反応容器に入れ、この反応容器の一側面側から光を照射することにより行われている。
【０００６】
しかして、このような方法で製造される遺伝子導入剤は、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが２．５程度と分子量分布の大きいものであるが、特許文献３では、この分子量分布の大きい重合反応生成物を液体クロマトグラフィー等により分子量分画し、Ｍｗ／Ｍｎが１．０〜１．５の分画を分取して遺伝子導入剤としている。
【０００７】
ところで、光照射手段として、管状クラッドと、この管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料よりなるコアとを備えた光伝送チューブにおいて、管状クラッドとコアとの間に帯状の反射層を形成することにより、管状クラッドの側周面（外表面部）から指向性を有する光を放出させるようにした光伝送チューブが知られており、特許文献４には、「管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備える光伝送チューブにおいて、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるようにした光伝送チューブであって、該帯状の反射層を複数条形成し、前記コアを通る光を管状クラッド側周面から複数の方向に放出させるようにしたことを特徴とする光伝送チューブ。」が提案されている。このような光伝送チューブは、その柔軟性、耐衝撃性、軽量性等を利用して、主として自動車室内照明分野や、建築、家電・情報機器分野、屋外照明分野などに使用されており、従来、これを光反応の光源として用いるという提案はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８号公報
【特許文献２】特開２００７−０７０５７９号公報
【特許文献３】特願２００８−１２８５６５
【特許文献４】特開２０００−０３９５１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記特許文献１，２に記載されるベンゼン環から放射状にポリマー鎖が伸延する遺伝子導入剤は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターのジチオカルバメート基の光開裂性を利用することにより、このイニファターに対してビニル系モノマーを光照射リビング重合したものであって、同じモノマーユニットからなる線形ポリマーと比較して、その構造上、電荷密度を高く配置することが可能である。このため、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸との複合体をより強く凝集させることが可能であり、より粒子径の小さい微細なポリプレックス粒子を形成させることができるが、より遺伝子導入効率に優れた遺伝子導入剤の開発が望まれていた。
【００１０】
この要望に対し、本発明者らは、特許文献１，２に記載される分岐構造を有するベクターのうち、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎ（以下、この比を「分散比」と称す場合がある。）が小さい遺伝子導入剤が特に優れた遺伝子導入活性を示すことを見出し、光照射リビング重合反応生成物から、この分散比が１．０〜１．５である画分を分子量分画により分取する遺伝子導入剤の製造方法を提案した（特許文献３）。
【００１１】
特許文献３に記載される遺伝子導入剤の製造方法によれば、分散比が１．０〜１．５である画分を分取することにより、遺伝子導入活性に特に優れる遺伝子導入剤を得ることができるが、このためには、反応生成物に対して液体クロマトグラフィー等による分子量分画を行う必要がある。
【００１２】
即ち、ジチオカルバメート基の光開裂性を利用した重合反応では、以下に説明するように、分散比が小さく、分子量分布が狭い重合体を光照射リビング重合により直接製造することが難しい。
【００１３】
有機テルル、ニトロキシド、ジチオエステル（ＲＡＦＴ試薬）をドーマント核として用いるリビングラジカル重合では、休眠期のドーマント核と成長ラジカルとの交換反応が平衡に達しているため、重合反応が反応系全体において均一に進行し、分散比がほぼ１．０であるポリマーを得ることができる。これに対し、ジチオカルバメート基の光開裂性を利用するリビング重合では、ジチオカルバメート基の光ラジカル開裂速度が遅く、ジチオカルバメート基と成長ラジカルとの交換反応がほとんど生じない。従って、この重合反応では、光量子を吸収した分子のみが重合するため、上記の有機テルルなどのリビングラジカル重合反応と比較して分子量分布が若干広くなる。
【００１４】
特に、ジチオカルバメート基の光開裂性を利用したイニファターとカチオン性モノマーとの重合反応においては、以下の(１)、(２)の理由により、分子量分布の狭い分岐型重合体を収率よく得ることができない。
（１） カチオン性モノマーは、反応性が低いため高濃度の溶液で反応させる必要がある。しかしながら、このカチオン性モノマーを含む溶液は、カチオン性官能基に由来する水素結合の寄与により粘度が高く、撹拌効率が悪く、重合中に反応溶液を十分に撹拌して均一な反応溶液とすることが難しい。
（２） カチオン性モノマーとして用いられるアミン化合物は、その独特の色から明らかなように、イニファターの光開裂に重要な近紫外光の吸収率がスチレンなどの他の中性モノマーに比べて高い。このため、反応容器内の溶液に対して、均一に光を照射し、均一に重合反応を進行させることが困難である。即ち、反応溶液を入れた反応容器の一側面側から光を照射しても、溶液内の光源に近い部分に存在するアミン化合物が近紫外光を吸収して、この部分で局所的に重合が進行してしまうため、光源から遠い部分に存在するイニファターに光が到達しにくく、反応溶液中で均一に反応が進行しない。この問題は、上記（１）の均一撹拌が困難であることによって、更に助長される。
【００１５】
本発明は上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、光照射リビング重合により、分子量分布の狭い遺伝子導活性に優れた遺伝子導入剤を効率的に製造することができる遺伝子導入剤の製造方法、及びこの遺伝子導入剤の製造方法に用いる遺伝子導入剤の製造装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、溶液中での光照射リビング重合において、反応系全体に光を照射して系内全体で均一な反応を進行させる方法について検討を重ねた結果、反応溶液に光照射手段を浸漬し、溶液中で直接光照射を行うことにより、光源からイニファターまでの光路を短くすることができ、これにより、溶液内での光照射リビング重合を均一に進行させることができること、そして、溶液内での光照射リビング重合を均一に進行させることにより、分子量分布の狭い遺伝子導入剤を得ることができること、を見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤の製造方法は、溶液中での光照射リビング重合を行う工程を含む遺伝子導入剤の製造方法において、接液面が光透過性の樹脂で構成された光照射手段を該溶液に浸漬させて光照射を行うことを特徴とするものである。
【００１８】
請求項２の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１において、前記光照射手段は、樹脂製の光伝送チューブを備え、該チューブは、該チューブの一端から入射した光を該チューブの側周面から放出するものであることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項３の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１又は２において、前記樹脂が、（メタ）アクリル系ポリマーよりなることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項４の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記光照射手段により前記溶液を撹拌することを特徴とするものである。
【００２１】
請求項５の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項２ないし４のいずれか１項において、前記光照射手段は、前記光伝送チューブを複数本有するものであることを特徴とするものである。
【００２２】
請求項６の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし５のいずれか１項において、少なくとも、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物からなるイニファターに対して、ビニル系モノマーを光照射リビング重合してなる分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造することを特徴とするものである。
【００２３】
請求項７の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項６において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【００２４】
請求項８の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項６又は７において、前記ビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００２５】
請求項９の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の分子量が、１，０００〜６０，０００であることを特徴とするものである。
【００２６】
請求項１０の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが、１．３以下であることを特徴とするものである。
【００２７】
本発明（請求項１１）の遺伝子導入剤の製造装置は、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤の製造方法に用いる遺伝子導入剤の製造装置であって、反応溶液を保持する反応容器と、該反応溶液に浸漬される光伝送チューブを備える光照射手段とを有し、該光伝送チューブは、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるように構成されていることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法では、接液面が光透過性の樹脂よりなる光照射手段を反応溶液に浸漬させて光照射を行うため、反応系内の基質と光源との距離が短く、反応系内に存在する基質に対して均一に光を照射することができる。これにより、溶液内での光照射リビング重合を均一に進行させることができ、結果として分子量分布の狭い遺伝子導入剤を得ることができる。また、本発明で用いる光照射手段の接液面は樹脂で構成されるため、接液面の耐衝撃性が高く、取り扱いが容易であると共に、製造コストを抑えることもできる。
【００２９】
前記光照射手段は、樹脂製の光伝送チューブを備え、該チューブは、該チューブの一端から入射した光を該チューブの側周面から放出するものであることが好ましい（請求項２）。
【００３０】
光照射手段の接液面を構成する光透過性の樹脂としては、（メタ）アクリル系ポリマーが好ましい（請求項３）。（メタ）アクリル系ポリマーを用いた場合、以下の理由により反応効率が向上し、分子量が大きい遺伝子導入剤を得ることができる。
【００３１】
即ち、光照射リビング重合において常用される照射強度の照射光には、重合反応（正反応）を生じさせる波長３７０ｎｍ付近の光と、分解反応（逆反応）を生じさせる波長３３０〜３５０ｎｍ程度の光が含まれているが、（メタ）アクリル系ポリマーは、このうち、波長３５０ｎｍ以下の光を吸収する性質を有する。このため、光照射手段の接液面を構成する樹脂として（メタ）アクリル系ポリマーを用いた場合は、この光を（メタ）アクリル系ポリマーが吸収して、その透過を抑え、これにより、３５０ｎｍ以下の波長の光に起因する逆反応を生じ難くすることができ、この結果、正反応を優先させて分子量の大きい遺伝子導入剤を得ることができる。
【００３２】
本発明においては、前記光照射手段により前記溶液を撹拌することが好ましい（請求項４）。前記光照射手段で反応溶液を撹拌することにより、溶液内に存在する基質に対してより一層均一に光を照射することができる。
【００３３】
前記光照射手段は、前記光伝送チューブを複数本有するものであることが、反応系内へ均一な光照射を行う上で好ましい（請求項５）。
【００３４】
本発明において製造する遺伝子導入剤としては、少なくとも、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物からなるイニファターに対して、ビニル系モノマーを光照射リビング重合してなる分岐型重合体よりなることが好ましい（請求項６）。
【００３５】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合しているものが好ましく（請求項７）、前記ビニル系モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい（請求項８）。
【００３６】
前記遺伝子導入剤の分子量は、１，０００〜６０，０００であることが好ましい（請求項９）。
【００３７】
前記遺伝子導入剤の重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．３以下であることが好ましい（請求項１０）。
【００３８】
本発明の遺伝子導入剤の製造装置（請求項１１）は、上記の遺伝子導入剤の製造方法に用いるものであって、反応溶液を保持する反応容器と、該反応溶液に浸漬される光伝送チューブを備える光照射手段とを有し、該光伝送チューブは、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるように構成されているものであり、反応溶液内の基質に対して効率的に光を照射することができ、分子量分布の狭い遺伝子導入剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施の形態に係る製造装置の斜視図である。
【図２】実施の形態に係る光伝送チューブの斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００４１】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法は、溶液中での光照射リビング重合を行う工程を含む遺伝子導入剤の製造方法において、接液面が光透過性の樹脂で構成された光照射手段を該溶液に浸漬させて光照射を行うことを特徴とする。
【００４２】
本発明の遺伝子導入剤の製造装置は、このような本発明の遺伝子導入剤の製造方法に有用な装置であって、反応溶液を保持する反応容器と、該反応溶液に浸漬される光伝送チューブを備える光照射手段とを有し、該光伝送チューブは、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるように構成されていることを特徴とする。
【００４３】
＜光照射手段＞
先ず、本発明に好適に用いられる光照射手段について、図面を参照して説明する。
【００４４】
第１図は、実施の形態に係る製造装置の斜視図である。図１の通り、この製造装置は、光照射手段１と反応容器５とで主として構成されている。光照射手段１は、光伝送チューブ３とこれを保持する円盤状のプレート２とを有している。本実施の形態では、プレート２の盤面の中心に孔４が設けられており、さらに、この孔４を中心とした正六角形の各頂点上にもそれぞれ同様の孔４が設けられている。これらの孔４には、それぞれ光透過性を有する樹脂により構成された光伝送チューブ３が挿通されている。なお、図示のプレート２には、１個の孔に対して１本の光伝送チューブが挿通されているが、１個の孔に対して複数の光伝送チューブが挿通されていてもよい。また、孔は７個に限らず、６個以下あるいは８個以上でも良いが、反応容器５内の溶液中になるべく均等に光照射を行うことができるような配置とされていることが好ましい。この実施の形態では、孔４に挿通されたチューブ３の先端を、反応容器５内の反応溶液に浸漬させて光照射を行う。
【００４５】
反応溶液内において光を照射する光伝送チューブ３としては、チューブの一端から入射した光を、チューブの側周面から放出する性質を備える光伝送性のチューブが好ましい。より具体的には、前述の特許文献４に記載される光伝送チューブを挙げることができる。
【００４６】
以下、図面を参照して光伝送チューブ３の好ましい形態について詳細に説明する。
図２は光伝送チューブの実施の形態を示す斜視図である。
【００４７】
図２に示す光伝送チューブ１１は、コア１２とこれを覆う管状クラッド１３との間に、チューブの長手方向に延在する帯状の反射層１４Ａ，１４Ｂを２条に形成したものである。なお、反射層１４Ａ，１４Ｂはコア１２の表面から若干コア１２の内部に侵入した状態で形成されていても良い。
【００４８】
コア１２を構成する材料（コア材）には、管状クラッド１３を構成する材料（クラッド材）よりも屈折率が高い透明材料が用いられ、一般的には、プラスチック、エラストマー等の中から目的に応じて適宜選択使用される。
【００４９】
コア材の具体例としては、ポリスチレン、スチレン・メチルメタクリレート共重合体、（メタ）アクリル樹脂、ポリメチルペンテン、アリルグリコールカーボネート樹脂、スピラン樹脂、アモルファスポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアリレート、ポリサルホン、ポリアリルサルホン、ポリエーテルサルホン、ポリエーテルイミド、ポリイミド、ジアリルフタレート、フッ素樹脂、ポリエステルカーボネート、ノルボルネン系樹脂（ＡＲＴＯＮ）、脂環式アクリル樹脂（オプトレッツ）、シリコン樹脂、アクリルゴム、シリコンゴム等の透明材料が挙げられる（なお、「（メタ）アクリル」とは「アクリル及びメタクリル」を示す。）。
【００５０】
一方、クラッド材としては、屈折率の低い透明材料の中から選定することができ、プラスチックやエラストマー等の有機材料が挙げられる。
【００５１】
クラッド材の具体例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、フッ化ポリメチルメタアクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリビニルアルコール、ポリエチレン−ポリビニルアルコール共重合体、フッ素樹脂、シリコン樹脂、天然ゴム、ポリイソプレンゴム、ポリブタジエンゴム、スチレン−ブタジエン共重合体、ブチルゴム、ハロゲン化ブチルゴム、クロロプレンゴム、アクリルゴム、エチレン−プロピレン−ジエン共重合体（ＥＰＤＭ）、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体、フッ素ゴム、シリコンゴム等が挙げられる。
【００５２】
上記のコア材、クラッド材のうち、透明性や屈折率等の光学特性及び同時押し出し加工性の面から、コア材としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、スチレン−（メタ）アクリル共重合体（ＭＳポリマー）等が好ましく、また、クラッド材としては（メタ）アクリル系ポリマー等が好ましい。
【００５３】
本発明においては、例えばクラッド材を（メタ）アクリル系ポリマーで構成することにより、（メタ）アクリル系ポリマーが３５０ｎｍ以下の波長の光を吸収し、３５０ｎｍ以下の波長の光に起因する逆反応が生じ難くなり、正反応が優先して生じるため、結果として、分子量の大きい遺伝子導入剤を効率的に製造することができる。
【００５４】
反射層は白色顔料や散乱材を含む（メタ）アクリル系ポリマーで形成することが好ましい。ここで白色顔料や散乱材としては、シリコーン樹脂粒子やポリスチレン樹脂粒子等の有機ポリマー粒子、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２等の金属酸化物粒子、ＢａＳＯ４等の硫酸塩粒子、ＣａＣＯ３等の炭酸塩粒子等が挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を併用して使用することができる。
【００５５】
反射効率や同時押し出し加工性等を考慮した場合、これら白色顔料や散乱材の粒子の平均粒径は０．１〜２００μｍ程度特に０．５〜５０μｍ程度であることが好ましく、また、反射層構成材料（反射材）中の含有量は０．５〜２０重量％程度特に１〜１０重量％程度であることが好ましい。
【００５６】
反射層１４Ａ，１４Ｂの厚さは特に制限されないが、１０〜２００μｍ特に５０〜１００μｍとすることが好適である。この厚さが薄すぎると反射される光が少なくなるため輝度が低くなり、厚すぎると反射される光が多くなり輝度が高くなるが、これは光源から近距離の場合で、更に光源から離れた所では逆に輝度が低くなる不利を伴う場合がある。
【００５７】
なお、コア１２の直径は特に制限されないが、通常２〜３０ｍｍ特に５〜１５ｍｍ程度とされる。また、管状クラッド１３の肉厚は通常０．０５〜４ｍｍ特に０．２〜２ｍｍ程度とされる。
【００５８】
帯状の反射層の形成条数や形成位置、反射層の帯幅や反射層間の間隔等には特に制限はなく、反射層で反射された光が指向性を有する複数の光条として放出されるように形成すれば良い。
【００５９】
各反射層の幅（周方向長さ）は、例えばコアの周長の３〜３０％、好ましくは５〜２０％程度とされるが、この範囲外であっても良い。
【００６０】
このような光伝送チューブの一端に、ブラックライト、ＬＥＤ、ショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、捕虫用蛍光灯、タングステンランプなどの発光装置（図示せず）を設けることにより、光伝送チューブの側面から光が放出される。
【００６１】
このような光伝送チューブは、溶液内に光伝送チューブを浸漬させるのに十分な長さを有していることが好ましい。光伝送チューブの全長のうち反応溶液に浸漬させる部分の長さとしては、反応溶液の液深の７０〜９９％程度が好ましい。反応溶液に浸漬させる部分が短いと、光伝送チューブを反応溶液に浸漬させて光を照射することによる効果を得にくくなると共に、光照射手段による溶液の撹拌効果も得にくくなる。
【００６２】
本発明において用いる光照射手段を構成するプレート２としては、円形、楕円形、正方形、長方形、正六角形等の平面視形状を有するものを挙げることができ、反応容器５の開口部の形状と相似形とすることもできる。このプレート２としては、光伝送チューブを保持するのに十分な大きさがあればよい。
【００６３】
また、反応容器５としては、光照射リビング重合反応において一般的に用いられているものであれば特に制限はない。反応容器５の開口部の大きさとしては、前記光伝送チューブを保持するプレートより大きいことが、光照射手段を用いて撹拌を行う面から好ましい。
【００６４】
＜遺伝子導入剤の製造方法＞
本発明の遺伝子導入剤の製造方法では、前記光照射手段を溶液内に浸漬させて光を照射して光照射リビング重合を行う。この光照射リビング重合としては、少なくとも、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物からなるイニファターに対して、ビニル系モノマーを光照射リビング重合してなる分岐型重合体よりなることが好ましい。
【００６５】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００６６】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００６７】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。前記クラッド材を構成する材質によっては、非極性溶媒に侵されるものも存在するが、この場合、非極性溶媒とアルコール等の極性溶媒とを併用することでクラッド材を保護することが可能である。この非極性溶媒に対する極性溶媒の混合量は、使用するイニファターの官能基数、クラッド材の材質、非極性溶媒の種類によって異なるが、非極性溶媒の１０倍程度（体積）が好ましい。例えば、４官能性のイニファター、ポリメチルメタクリレート、クロロホルム溶媒を使用する場合であれば、イニファターを適量のクロロホルムへ溶解した後、この溶液に対してクロロホルムの１０倍程度のメタノールを加えることにより、クロロホルムの溶解力を低下させることができ、クラッド材の表面の保護が可能である。
【００６８】
イニファターと前記ビニル系モノマーとを反応させるには、イニファター、及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ビニル系モノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００６９】
該原料溶液中のビニル系モノマーの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、イニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。
【００７０】
前記光照射手段により照射する光の波長は３３０〜４００ｎｍ、特に３６０〜３９０ｎｍが好適であり、光の照射強度としては、０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ２、特に０．５〜５ｍＷ／ｃｍ２程度が好ましい。照射時間としては、０．１〜１０時間、特に０．５〜２時間程度が好ましい。
【００７１】
効率的に反応を行うためには、前記光照射手段により光を照射すると共に、この光照射手段により反応溶液を撹拌することが好ましい。撹拌方法としては、この光照射手段を振動させる、回転させる、上下動させる方法を挙げることができる。また、光照射手段による撹拌の他に、撹拌子、撹拌羽根、ガスバブリング、超音波による撹拌を併用することもできる。
【００７２】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐鎖を有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分にビニル系モノマー単位よりなるポリマー鎖が導入され、分岐鎖の末端がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であるホモポリマーを得る。
【００７３】
この分岐型重合体の分岐鎖の１本当たりの分子量としては、１，０００〜４０，０００程度、特に１，５００〜１５，０００程度が好ましい。この分子量は、光照射の時間を制御することにより調整することができる。即ち、反応時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きい分岐型重合体を得ることができる。
【００７４】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００７５】
本発明に係る分岐型重合体の分岐鎖は、ビニル系モノマーをモノマーとする１種のモノマーのみからなるホモポリマーであることが好ましいが、２種以上のビニル系モノマーを導入したブロックコポリマー又はランダムコポリマーであってもよい。
【００７６】
前記ビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種のビニル系モノマーが挙げられ、特に、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００７７】
イニファターと２種以上のビニル系モノマーとを反応させるには、前述のイニファターと１種のビニル系モノマーとを反応させる場合と同様に、イニファターと、２種以上のビニル系モノマーとを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、２種以上のビニル系モノマーが結合したランダムコポリマーを得る。
【００７８】
また、このように製造した遺伝子導入剤の分子量としては、１，０００〜６０，０００程度、特に１０，０００〜５０，０００程度が好ましい。分子量がこの範囲内であると、遺伝子導入剤と核酸とが複合しやすい。
【００７９】
本発明によれば、前記光照射手段を用い、重合系全体に対して均一に光を照射することにより、重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが１．３以下、特に１．１〜１．２というような分散比の小さい遺伝子導入剤を得ることができる。このように分散比の小さい遺伝子導入剤は、優れた遺伝子導入活性を示す。
【００８０】
なお、このような遺伝子導入剤を製造する装置としては、図１に示すような製造装置、即ち、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるように構成されている光伝送チューブを備える光照射手段と、反応溶液を保持する反応容器とを有する製造装置で製造することが好ましい。この装置を用いて製造することにより、分子量分布の狭い遺伝子導入剤を効率的に得ることができる。
【００８１】
＜核酸複合体＞
このようにして製造した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００８２】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度０．１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、核酸に対して遺伝子導入剤を飽和状態にして遺伝子導入剤と核酸とを複合化することが好ましい。
【００８３】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００８４】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００８５】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度、特に１００〜３５０ｎｍ、とりわけ１５０〜３００ｎｍが好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００８６】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００８７】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００８８】
核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００８９】
このような核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００９０】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００９１】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００９２】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００９３】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００９４】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００９５】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００９６】
（１） 光照射手段の作製
特開２０００−３９５１７号公報に記載された光伝送チューブの製造方法に準拠して、管状クラッドがアクリル樹脂よりなり、チューブ側面から光を放出する性質を備える図２に示すような光伝送チューブ（直径２ｍｍ、長さ１００ｍｍ）を作成した。次いで、直径３０ｍｍ、厚み１０ｍｍのプレートを用意し、図１のように、正六角形（１辺１０ｍｍ）の各頂点とプレートの中心に、それぞれ２ｍｍの孔を設け、各孔に光伝送チューブを挿通し固定した。光伝送チューブの一端からブラックライト（ＮＥＣ製：ＦＣＬ３０ＢＬ）の光を入射すると、チューブの側周面が発光した。ブラックライト自体の照射強度はウシオ電機社製ＵＩＴ−１５０に受光器としてＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して測定したところ１．５〜２．０ｍＷ／ｃｍ２であった。
【００９７】
（２） イニファターの合成
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００９８】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間撹拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノール中に投入して３０分間撹拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００９９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）であった。
【０１００】
【化１】
【０１０１】
（３） ４分岐型重合体よりなるホモポリマーの光重合による合成（実施例１、比較例１，２）
下記（３ａ）〜（３ｃ）に記載の通り、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをモノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンよりなるホモポリマーの合成を行った。なお、実施例１では、（１）において作製した光照射手段を用いて光照射リビング重合を行い、比較例１，２では、（１）において作製した光照射手段を用いずに光照射リビング重合を行った。
【０１０２】
（３ａ） 実施例１
上記（２）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを３００μＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド９．０ｇを加えて混合し、全量をメタノールで３０ｍＬに調整した。ガラスセル（直径４５ｍｍ）中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージして溶存酸素を除去し、（１）において作製した光照射手段を溶液に浸漬した。チューブの浸漬深さは、液深の約９０％とした。この光照射手段のチューブの一端からに対しては、ブラックライトの光を入射させ、チューブの側面から光を放出させて１８０分間重合反応を行った。照射強度はウシオ電機社製のＵＩＴ−１５０に受光器としてＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して測定したところ約１．５ｍＷ／ｃｍ２であった。この光照射による重合反応時には、反応溶液内の基質の濃度が均一になるように、この光照射手段を反応容器内の全範囲を可動域として振動させると共に、マグネットスターラーによる撹拌も行った。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、ジエチルエーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて目的とする４分岐型スター型重合体よりなるホモポリマーを得た（重合率２２％）。このホモポリマーのポリエチレングリコールを標準物質としたＧＰＣによる数平均分子量は、３６，０００であり、分散比Ｍｗ／Ｍｎは１．１であった。また、計算により分岐鎖１本当たりの分子量は、８，８１９であることが分かった。
【０１０３】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）であった。
【０１０４】
【化２】
【０１０５】
（３ｂ） 比較例１
上記（２）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを３００μＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド９．０ｇを加えて混合し、全量をメタノールで３０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル（直径５０ｍｍの円筒形）中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージした後密栓した。丸管形蛍光灯（Ｏ字形）ブラックライト（ＮＥＣ社製ＦＣＬ３０ＢＬ）の中央部へガラスセルとマグネットスターラーを配置し、ガラスセルの全側周方向から近紫外光を６０分間照射した。照射強度はウシオ電機社製のＵＩＴ−１５０に受光器としてＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して測定したところ約２ｍＷ／ｃｍ２であった。得られた重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、ジエチルエーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて目的とする４分岐型スター型重合体よりなるホモポリマーを得た（重合率２６％）。このホモポリマーのポリエチレングリコールを標準物質としたＧＰＣによる数平均分子量は、３８，０００であり、分散比Ｍｗ／Ｍｎは、１．５であった。また、計算により分岐鎖１本当たりの分子量は、９，３１９であることが分かった。
【０１０６】
（３ｃ） 比較例２
上記（２）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを３００μＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド９．０ｇを加えて混合し、全量をメタノールで３０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル（底面が５０ｍｍ角の直方体形）中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージした後密栓した。直管形蛍光灯ブラックライトを使用して直方体形ガラスセルの一側面方向から近紫外光を８０分間照射した。照射強度はウシオ電機社製のＵＩＴ−１５０に受光器としてＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して約２ｍＷ／ｃｍ２とした。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、ジエチルエーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて、目的とする４分岐型スター型重合体よりなるホモポリマーを得た（重合率２９％）。このホモポリマーのポリエチレングリコールを標準物質としたＧＰＣによる数平均分子量は、２２，０００であり、分散比Ｍｗ／Ｍｎは、１．８であった。また、計算により分岐鎖１本当たりの分子量は、５，３１９であることが分かった。
【０１０７】
［考察］
(１)で作製した光照射手段を反応溶液に浸漬させて反応を行った実施例１の遺伝子導入剤は、分散比が１．１と小さい値を示したのに対し、光照射手段を反応溶液に浸漬させず、反応溶液の側周面及び一側面から光を照射した比較例１，２の遺伝子導入剤は、分散比がそれぞれ１．５、１．８と大きい値を示した。実施例１の遺伝子導入剤の分散比が１．１と小さい値を示したのは、反応溶液内に７本のチューブを浸漬させたことにより、反応溶液内に存在する各イニファターに対して均一に光量子が供給されたためであると考えられる。この結果より、光照射手段を反応溶液内に浸漬させて反応を行う本発明の遺伝子導入剤の製造方法によれば、分子量分布が狭く、遺伝子導入活性に優れる遺伝子導入剤を得ることができることがわかる。
【０１０８】
なお、分散比の小さい遺伝子導入剤が遺伝子導入活性に優れる理由の詳細は明らかになっていないが、分散比が小さく、ほぼ同程度の大きさの重合体であれば、核酸との反応性が等しく、より高密度に核酸を凝集することができるためであると考えられる。
【符号の説明】
【０１０９】
１ 光照射手段
２ プレート
３ 光伝送チューブ
４ 孔
５ 反応容器
１１ 光伝送チューブ
１２ コア
１３ 管状クラッド
１４Ａ，１４Ｂ 反射層
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中での光照射リビング重合を行う工程を含む遺伝子導入剤の製造方法において、
接液面が光透過性の樹脂で構成された光照射手段を該溶液に浸漬させて光照射を行うことを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、前記光照射手段は、樹脂製の光伝送チューブを備え、該チューブは、該チューブの一端から入射した光を該チューブの側周面から放出するものであることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記樹脂が、（メタ）アクリル系ポリマーよりなることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記光照射手段により前記溶液を撹拌することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項５】
請求項２ないし４のいずれか１項において、前記光照射手段は、前記光伝送チューブを複数本有するものであることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、少なくとも、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物からなるイニファターに対して、ビニル系モノマーを光照射リビング重合してなる分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項７】
請求項６において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項８】
請求項６又は７において、前記ビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の分子量が、１，０００〜６０，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが、１．３以下であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤の製造方法に用いる遺伝子導入剤の製造装置であって、
反応溶液を保持する反応容器と、該反応溶液に浸漬される光伝送チューブを備える光照射手段とを有し、
該光伝送チューブは、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるように構成されていることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１】
溶液中での光照射リビング重合を行う工程を含む遺伝子導入剤の製造方法において、
接液面が光透過性の樹脂で構成された光照射手段を該溶液に浸漬させて光照射を行うことを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、前記光照射手段は、樹脂製の光伝送チューブを備え、該チューブは、該チューブの一端から入射した光を該チューブの側周面から放出するものであることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記樹脂が、（メタ）アクリル系ポリマーよりなることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記光照射手段により前記溶液を撹拌することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項５】
請求項２ないし４のいずれか１項において、前記光照射手段は、前記光伝送チューブを複数本有するものであることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、少なくとも、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物からなるイニファターに対して、ビニル系モノマーを光照射リビング重合してなる分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項７】
請求項６において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項８】
請求項６又は７において、前記ビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の分子量が、１，０００〜６０，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比Ｍｗ／Ｍｎが、１．３以下であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤の製造方法に用いる遺伝子導入剤の製造装置であって、
反応溶液を保持する反応容器と、該反応溶液に浸漬される光伝送チューブを備える光照射手段とを有し、
該光伝送チューブは、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、管状クラッドと、該管状クラッドの構成材料よりも高屈折率の材料で構成されるコアとを備え、該管状クラッドとコアとの間に該管状クラッドの長さ方向に沿って帯状の反射層を形成し、前記コアを通る光を該反射層で反射・散乱させて該反射層形成側と反対側の管状クラッド側周面から放出させるように構成されていることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−８４５１４（Ｐ２０１１−８４５１４Ａ）
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３８４５０（Ｐ２００９−２３８４５０）
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【Ｆターム（参考）】
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