遺伝子導入剤及びその製造方法並びに核酸複合体
【課題】遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤及びその製造方法を提供する。
【解決手段】芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体とし、この分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得、該架橋反応生成物を分子量分画して得た、前記分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有した画分よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【解決手段】芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体とし、この分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得、該架橋反応生成物を分子量分画して得た、前記分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有した画分よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターが、ＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（下記特許文献１）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤及びその製造方法と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体とし、この分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得、該架橋反応生成物を分子量分画して得た、前記分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有した画分よりなることを特徴とするものである。
【０００６】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、該遺伝子導入剤の数平均分子量Ｍ２と、前記分岐型重合体の数平均分子量Ｍ１との比Ｍ２／Ｍ１が０．８〜１．５であることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、該分岐鎖に光照射することにより、前記分岐鎖を架橋反応させることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項１ないし３のいずれか1項において、該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項３又は４において、前記分岐型重合体をフィルム状に成形して光照射することを特徴とするものである。
【００１０】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、フィルム状の該分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより架橋反応を行うことを特徴とするものである。
【００１１】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項６において、該液状エーテルは、ジエチルエーテル、ジオクチルエーテル、メチルシクロヘキシルエーテル、ビス（メチルベンジル）エーテル、メチルブチルエーテル、ブチルヘキシルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、及びクラウンエーテルよりなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、及び／又は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートであることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基が架橋点として寄与していることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項１１の遺伝子導入剤は、請求項１ないし１０のいずれか1項において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基に由来する紫外線吸収ピークが実質的に不検出であるか、前記分岐型重合体の該吸収ピークよりも減少していることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明（請求項１２）の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体を製造する工程と、得られた分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得る工程と、該架橋反応生成物を分子量分画して、前記分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有した画分を分取する工程とを有することを特徴とするものである。
【００１７】
本発明（請求項１３）の核酸複合体は、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【００１８】
本発明（請求項１４）の核酸複合体は、請求項１２の遺伝子導入剤の製造方法で製造された遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の遺伝子導入剤は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を有する芳香族化合物をイニファクターとし、これにビニル系モノマーをリビング重合させて合成した、芳香環を核として、分岐鎖が放射状に伸延する分岐型重合体（以下「第１次分岐型重合体」ということがある。）に光を照射するなどして分岐鎖を架橋させて架橋反応生成物を得、この架橋反応生成物から第１次分岐型重合体とほぼ同等の分子量画分を分取して得た合成高分子ベクターであり、高い遺伝子導入活性を示す。
【００２０】
この遺伝子導入剤は、第１次分岐型重合体の末端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が架橋点として寄与してその第１次分岐型重合体の分岐鎖の途中又はその第１次分岐型重合体の他の分岐鎖の末端に架橋してなる分子内架橋体であると推察されるが、種々の研究の結果、この遺伝子導入剤は、第１次分岐型重合体よりもＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができることが認められた。
【００２１】
架橋反応生成物を分子量分画して得られる本発明の遺伝子導入剤の数平均分子量Ｍ２は、架橋前の第１次分岐型重合体の数平均分子量Ｍ１に対して、分子量比Ｍ２／Ｍ１が０．８〜１．５であることが好ましい（請求項２）。
【００２２】
また、イニファターが有するＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基としてはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が好ましく（請求項４）、特にイニファターは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合しているものが好ましい（請求項８）。また、イニファターの分岐鎖に光照射リビング重合させるビニル系モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、及び／又は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい（請求項９）。
【００２３】
本発明においては、第１次分岐型重合体の分岐鎖に光照射することにより、分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得ることが好ましく（請求項３）、この場合において、第１次分岐型重合体をフィルム状に成形し（請求項５）、さらには、このフィルム状の該分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより架橋反応を行うことが好ましい（請求項６）。
【００２４】
ここで用いる液状エーテルとしては、ジエチルエーテル、ジオクチルエーテル、メチルシクロヘキシルエーテル、ビス（メチルベンジル）エーテル、メチルブチルエーテル、ブチルヘキシルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、及びクラウンエーテルよりなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられる（請求項７）。
【００２５】
このように、フィルム状の第１次分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより、架橋反応の際に生成するジスルフィド化合物を固相からエーテル中へ抽出除去することができるため、効率よく架橋を行うことが可能となると考えられる。使用する液状エーテルは窒素ガスのバブリングで溶存酸素を追い出すことで、酸素分子によるラジカル捕捉反応を抑制し、さらに効率良く均質なポリマー架橋を行うことが可能となる。また、フィルム状の第１次分岐型重合体に光を照射することにより、分子間架橋よりも分子内架橋を優先させて、本発明の遺伝子導入剤を効率的に製造することができるようになる。
【００２６】
本発明の遺伝子導入剤は、第１次分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基が架橋点として寄与することにより、分子内架橋体となったものであり（請求項１０）、この結果、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基に由来する紫外線吸収ピークが実質的に不検出であるか、第１次分岐型重合体の該吸収ピークよりも減少したものとなる（請求項１１）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２８】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環に分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて得たスター形の第１次分岐型重合体を架橋反応させ、この架橋反応生成物から第１次分岐型重合体とほぼ同一分子量の画分を分取して得たものである。
【００２９】
即ち、第１次分岐型重合体に光を照射するなどして架橋反応させると、複数の第１次分岐型重合体が分子間架橋して、分子量の異なる様々な分子間架橋体が生成する。
本発明者らは、この架橋反応生成物を分子量分画して、分子量毎に架橋体を分画し、分子量と遺伝子導入活性との関係を調べたところ、架橋前の第１次分岐型重合体と同等の分子量を有する架橋体が高い遺伝子導入活性を示すことを見出した。
【００３０】
この架橋前の第１次分岐型重合体と同等の分子量を有する架橋体は、分子量は架橋前の第１次分岐型重合体とほぼ同等であるものの、分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基のジチオカルバミル基に由来する特異的な波長２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸収ピーク（以下「ＵＶ２８０ｎｍピーク」と称す。）が消失しているか、或いは、架橋前の第１次分岐型重合体に比べてＵＶ２８０ｎｍピークが大幅に減少していることから、架橋反応しなかった未反応第１次分岐型重合体ではなく、第１次分岐型重合体の分岐鎖の末端ジチオカルバミル基が、当該分岐鎖の途中又は同一分子内の他の分岐鎖の途中若しくは他の分岐鎖の末端と架橋してループ状分岐鎖を形成した分子内架橋体であると推察された。
【００３１】
このような分子内架橋体（以下「自己環化ポリマー」と称す場合がある。）が高い遺伝子導入活性を示す理由の詳細は明らかではないが、ループ状分岐鎖という特異的な構造的優位性による効果であると推測される。特に、本発明の遺伝子導入剤は、血管内皮細胞への遺伝子導入活性に優れ、架橋前の第１次分岐型重合体の血管内皮細胞への遺伝子導入活性と比較して１０倍程度の高い遺伝子導入活性を示す。
【００３２】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものである。
【００３３】
なお、第１次分岐型重合体を架橋して得られる架橋反応生成物を分子量分画して得られる画分には、本発明の遺伝子導入剤のように、架橋前の第１次分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有する画分であって、架橋前の第１次分岐型重合体よりもはるかに高い遺伝子導入活性を有する分子内架橋体と、架橋前の第１次分岐型重合体よりも分子量が大きく（例えば、第１次分岐型重合体の分子量の２〜１０倍）かつ、第１次分岐型重合体よりも遺伝子導入活性が高い画分の分子間架橋体とがあり、分子内架橋体である本発明の遺伝子導入剤は、架橋前の第１次分岐型重合体に比べて通常２〜５倍、遺伝子の種類によっては１０倍程度の遺伝子導入活性の向上が認められる一方で、分子間架橋体には、架橋前の第１次分岐型重合体に比べて、約１０倍の遺伝子導入活性の向上が認められるものがある。
【００３４】
従って、遺伝子導入活性の面では、分子間架橋体の方が、本発明に係る分子内架橋体よりも有利であるともみられるが、分子量が過度に大きな分子間架橋体は、代謝性、生分解性に劣る傾向があり、特に遺伝子治療、再生医療、細胞治療、細胞診断などの生体内での利用を目的とした場合、この問題は大きな障壁となる場合がある。
これに対して、本発明に係る分子内架橋体は分子量が小さく、代謝性、生分解性に優れるため、特に遺伝子治療、再生医療、細胞治療、細胞診断などの生体内での利用に適している。
【００３５】
＜第１次分岐型重合体＞
本発明に係る第１次分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体（以下「スター形分岐型重合体」或いは「スター形ポリマー」と称す場合がある。）である。
【００３６】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００３７】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００３８】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。
【００３９】
このイニファターに重合させるビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられ、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４０】
イニファターと上記ビニル系モノマーとを反応させるには、イニファター及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しビニル系モノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００４１】
該原料溶液中のビニル系モノマーの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。また、原料溶液中のイニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００４２】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適であり、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００４３】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して第１次分岐型重合体としてのホモポリマーを得る。
【００４４】
この第１次分岐型重合体の数平均分子量は分岐鎖の鎖数によるが、２，０００〜５００，０００、特に２，０００〜１５０，０００、とりわけ２，０００〜１００，０００程度が好ましい。
【００４５】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００４６】
本発明に係る第１次分岐型重合体は、このホモポリマーであってもよく、さらに異なるモノマーを導入したブロック共重合体又はランダム共重合体であってもよい。例えば、上記ホモポリマーに対し、ホモポリマーの合成に用いたビニル系モノマーとは異なるビニル系モノマー、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入してもよい。
【００４７】
即ち、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。これにより遺伝子導入剤が上記温度応答性を具備するようになる。
なお、先にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマーよりなる分岐鎖を有した分岐型重合体を形成し、その後、各分岐鎖の先端側に前述のカチオン性ビニル系モノマーよりなるポリマーブロックを導入するようにしてもよい。
【００４８】
カチオン性ポリマーブロックにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドあるいはＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させるには、上記のようにして合成した分岐型重合体を好ましくはアルコール例えばメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型重合体の濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４９】
このように分岐鎖をブロック又はランダム共重合体にて構成したスター形分岐型共重合体（スター形コポリマー）を第１次分岐型重合体として用いる場合、その数平均分子量は３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
【００５０】
＜第１次分岐型重合体の架橋＞
本発明では、上記のように合成した第１次分岐型重合体を架橋反応させ、その後、架橋反応生成物から第１次分岐型重合体とほぼ同一分子量の画分を分取することにより、目的とする遺伝子導入剤を得る。この第１次分岐型重合体の架橋を行うには、次のｉ），ii），iii），iv）の方法を採用することができるが、架橋効率及び架橋精度の点においてiv）の方法を採用することが好ましい。
【００５１】
ｉ)第１次分岐型重合体をメタノールなど適宜の溶媒に溶解させ、加熱するか、光を照射することにより、分岐型重合体同士を架橋する。この架橋反応を開始させる際の溶液中の第１次分岐型重合体の濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適である。加熱条件は、３０〜３００℃、１分〜３０,０００時間程度が好適である。
【００５２】
ii）第１次分岐型重合体へ直接光照射や加熱処理を行うことによって分岐型重合体を架橋させる。この場合、ｉ)の溶媒へ溶解した溶液への処理と相違して、分岐型重合体の主鎖及び又は側鎖へ発生したラジカルが溶媒によって捕捉され、分岐型重合体の架橋反応が阻害されることを抑制することが可能となる。直接光照射を行う場合は、凍結乾燥粉末を霧状に攪拌して、ここへ光を照射することで均質な処理が可能となる。なお、第１次分岐型重合体をフィルム状に加工し、このフィルムへ処理を行うことも均質な架橋体を得る方法として好ましい。具体的には、ガラス板、金属板などの上へ第１次分岐型重合体の溶液、例えば、クロロホルム溶液を流延させ、ドクターナイフなどで液切りして均一な厚みとし、これを乾燥させることで均質なフィルムを形成させることが可能である。この場合の溶媒としては揮発性が高いメタノール、クロロホルムが好適である。
【００５３】
iii）常温又は冷却下に長期間保持することによって第１次分岐型重合体を架橋させる。例えば、４℃、−２０℃などの冷却下においても１５，０００時間程度の時間を経過すれば十分に架橋の効果が現れる。この場合、第１次分岐型重合体は凍結乾燥フィルムまたはフィルム状態で経時変化させることが好ましく、遮光状態でも蛍光灯程度の光が迷光として暴露されていても良い。凍結乾燥状態で経時変化をさせるのであれば、高分子量成分の乾燥重量で１．５ｇ／５０ｍＬ程度の密度とすることで均質な架橋体を得ることが可能である。
【００５４】
iv）固体状態の第１次分岐型重合体、好ましくはフィルム状の第１次分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより、第１次分岐型重合体同士を架橋させる。
【００５５】
この場合の液状エーテルとしては、ジエチルエーテル、ジエチルエーテル、ジオクチルエーテル、メチルシクロヘキシルエーテル、ビス（メチルベンジル）エーテル、メチルブチルエーテル、ブチルヘキシルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クラウンエーテル等が挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５６】
液状エーテルに浸漬させる際の前記第１次分岐型重合体の形状としては、フィルム状、粉末状、塊状、フレーク上、ゲル状等が挙げられるが、分子間架橋よりも本発明で目的とする分子内架橋が優先して起こりやすいことから、フィルム状とすることが好ましい。
【００５７】
第１次分岐型重合体の形状としてフィルム状を採用した場合、フィルムの厚さは１０μｍ〜２０００μｍ程度、特に５０μｍ〜１０００μｍ程度が好ましい。極端にフィルムが薄いと遺伝子導入剤の製造効率が悪く、また極端にフィルムが厚いと光照射の効果及び光架橋反応においてジチオカルバミル基から脱離して生成するジスルフィド化合物のエーテル中への拡散・抽出除去の効果が十分に得られない。
【００５８】
また、第１次分岐型重合体の形状を粉末状にした場合、粉末の粒径は０．１〜１０００μｍ程度特に１００〜５００μｍ程度が好ましい。粒径を極端に小さくすることは困難であるが、逆に粒径を大きくした場合は光照射の効果及び光架橋反応においてジチオカルバミル基から脱離して生成するジスルフィド化合物のエーテル中への拡散・抽出除去の効果が十分に得られない。
【００５９】
さらに、第１次分岐型重合体の形状を塊状、フレーク状やフレーク状にした場合は、光暴露量の均質性や光架橋反応においてジチオカルバミル基から脱離して生成するジスルフィド化合物のエーテル中への拡散性を十分に考慮して行う必要ある。
【００６０】
光の照射条件は、光波長３００〜４００ｎｍ、照射時間１〜３００分、照射強度０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度が好適である。なおこの光照射条件は、ｉ）、ii）においても同様である。
【００６１】
iv）の架橋方法によれば、架橋反応の際に生成すると考えられるジスルフィド化合物を固層からエーテル中へ抽出除去することにより、効率的に架橋反応を行うことができる。従って、反応を行う際に液状エーテルを撹拌することが好ましい。これにより生成したジスルフィド化合物をより効率的に液状エーテル中へ抽出除去することができる。
【００６２】
さらに効率的に架橋反応を行うには、第１次分岐型重合体の浸漬時間を１〜３００分程度、液状エーテルの液温を２０〜６０℃程度にすることが好ましい。
【００６３】
この架橋反応では、第１次分岐型重合体の分岐鎖のジスルフィド化合物のチオ基が開いて分岐鎖同士が架橋するものと推察される。この架橋反応により、第１次分岐型重合体が２〜１０個、特に２〜５個程度架橋した高次分岐型重合体（分子間架橋体）が生成するが、同時に、この架橋反応により、１つの第１次分岐型重合体内において、その分岐鎖の末端のジチオカルバミル基が当該分岐鎖の途中又は同一第１次分岐型重合体内の他の分岐鎖の途中若しくは他の分岐鎖の末端と架橋してループ状分岐鎖を有した分子内架橋体も生成する。なお、このようにループ状分岐鎖を有した分岐鎖が生成したことは、生成物を分子量分画することにより、第１次分岐型重合体とほぼ同一分子量の画分が得られること、この画分の生成物は実質的にジチオカルバミル基を有していないか、或いは、第１次分岐型重合体よりもジチオカルバミル基量が大幅に低減していることから十分に推認される。
【００６４】
なお、この架橋反応で得られる架橋反応生成物の数平均分子量には特に制限はないが、通常２０，０００〜８０，０００程度である。
【００６５】
＜分子量分画＞
本発明では、上記のように第1次分岐型重合体を架橋させて得られた架橋反応生成物を分子量分画し、第1次分岐型重合体とほぼ同一分子量の画分を分取する。
【００６６】
この分子量分画は、液体クロマトグラフィー、電気泳動、貧溶媒／良溶媒グラジエント溶出技術などによって行うことができる。
【００６７】
分子量分画を液体クロマトグラフィーで行う場合、使用する移動相、カラムに応じてゲル浸透、サイズ排除、イオン排除、イオン抑制法などを組み合わせ、常法に従ってカラム分離能が適切に設定された条件で、当業者に自明の方法で行うことができる。
【００６８】
液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度は４０〜６０℃とすることが移動層溶液の粘度を下げ、圧力損失を低く、段数の高い状態で分離が行われ、かつ、通常の室温と比較して温度差があるため温度制御が安定して行うことができ、結果、分離も安定して行うことができるので好ましい。
【００６９】
なお、上記の「ほぼ同一の分子量の画分」とは、第１次分岐型重合体の数平均分子量をＭ１とし、分取した画分の架橋体の数平均分子量をＭ２とした場合、Ｍ２／Ｍ１が０．８〜１．５特に０．９〜１．２の範囲にあることをいう。ここで、本発明でいうＭ２／Ｍ１が１．０以下、すなわち、架橋前よりも分子量が小さくなるのは、ポリマー末端の分子団が架橋反応に消費されて外れていることと、測定精度上の問題も含むものである。Ｍ２／Ｍ１がこの範囲外であると、遺伝子導入活性に優れた遺伝子導入剤を得ることができない。ここで、数平均分子量とはＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の値である。
【００７０】
本発明では、このようにして得られた、架橋前の第１次分岐型重合体とほぼ同一分子量の画分を遺伝子導入剤とする。
【００７１】
＜核酸複合体＞
上述のようにして得られた本発明の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００７２】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００７３】
なお、前記の通り、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させた遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。従って、３０℃よりも低い温度で核酸と遺伝子導入剤の水溶液とを混合して遺伝子導入剤に核酸を複合させることができる。
【００７４】
約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有し、水不溶性となる。
【００７５】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００７６】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００７７】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００７８】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００７９】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００８０】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００８１】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００８２】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００８３】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００８４】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００８５】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００８６】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【００８７】
また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、必要に応じ乾燥させることにより、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。
【００８８】
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。
【００８９】
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。
【００９０】
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。
【実施例】
【００９１】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００９２】
［実施例１］
＜（ａ）イニファターの合成＞
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００９３】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下にて室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００９４】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００９５】
【化１】
【００９６】
＜（ｂ）４分岐型スター形重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成＞
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性ビニル系モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００９７】
即ち、上記（ａ）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）３．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を３０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター形ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率３２％）。このカチオン性ホモポリマーの数平均分子量はＧＰＣにより、２８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３３）と測定された。
【００９８】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００９９】
【化２】
【０１００】
＜（ｃ）カチオン性ホモポリマーフィルムの作製＞
１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンのポリマーフィルムを５０ｍｍ縦×５０ｍｍ横×１ｍｍ厚の平滑面ガラス板上へ形成させた。即ち、上記（ｂ）で合成した分子量２８，０００の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー０．３ｇを１０ｍＬクロロホルムへ溶解し、１ｍｍ厚ガラス板上へ１００μｍ厚に流延し、６０℃オーブン中で溶媒を乾燥させてフィルムを形成させた。
【０１０１】
＜（ｄ）カチオン性ホモポリマーの光架橋反応＞
１００ｍｍ縦×１００ｍｍ横×２ｍｍ厚の平滑な面を有する直方体容器中で１ｍｍ厚ガラス板を垂直に固定した。この１ｍｍ厚ガラス板は直方体容器壁と接触しており、ポリマーフィルムは容器の壁との接触面の反応側のガラス板面に配置した。この容器内へジエチルエーテル中を入れ、マグネットスターラーで攪拌し、ポリマーフィルムをジエチルエーテルで抽出洗浄できる状態とした。このジエチルエーテル中へ高純度窒素ガスをパージしながら（２Ｌ／分）光照射を行った。照射強度は３ｍｍガラス（容器厚さとガラス板厚さとの合計）透過後で１．０ｍＷ／ｃｍ２となるように調整し、光照射時間は２４０分で行った。照射終了後、フィルムを５０ｍＬのメタノールへ投入すると不溶性のゲル状成分が生成していた。このメタノール液を＃２の濾紙で濾過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮物をジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。得られた架橋体の数平均分子量はＧＰＣにより４６，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５）と測定され、光架橋により数平均分子量の増大と分子量分布のブロード化が確認された。また、光照射により得られた光架橋反応生成物ではＵＶ２８０ｎｍピークは消失していた。
【０１０２】
＜（ｅ）カチオン性ポリマー光架橋体のフラクション分離と特定分子量分画の採取＞
島津製作所高速液体クロマトグラフシステムＬＣ１０Ａｖｐを使用し、上記（ｄ）で合成したカチオン性ポリマーの光架橋反応生成物のフラクション分離を行った。
移動相は臭化リチウム３０ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド溶液を使用した。カラムにはＡｓａｈｉｐａｃｋＧＦ−５１０ＨＱとＡｓａｈｉｐａｃｋ７１０ＨＱを連結したものを用い、カラム温度４０℃でサイズ排除分離を行った。フラクション分離はフラクションコレクターＦＲＣ−１０Ａを使用して行った。得られた画分からＧＰＣによる数平均分子量２８，０００の分画を採取し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを高真空エバポレーターで留去し、ジエチルエーテル中へ滴下してポリマー成分と電解質成分を沈殿させ、超遠心限外濾過キット（アミネックスス）を使用して脱塩し、凍結乾燥することでポリマー成分を分離精製した。
【０１０３】
＜（ｆ）遺伝子導入活性＞
インビトロでの細胞遺伝子導入実験を行った。細胞にはＣＯＳ-１細胞とＥＣ（血管内皮細胞）を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。いずれも２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
【０１０４】
上記（ｅ）で採取した光架橋前と同一分子量を有するカチオン性ポリマー分子内架橋体を遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はカチオン性ポリマーのモノマー単位の分子量１５６から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
【０１０５】
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１，２に示す。
【０１０６】
［比較例１］
実施例１の（ｂ）で合成したカチオン性ホモポリマーを遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１における（ｆ）に準拠して遺伝子導入活性を評価した。結果を図１，２に示す。
【０１０７】
［比較例２］
実施例１の（ｂ）で合成したカチオン性ホモポリマー０．１グラムを５０ｍＬ滅菌瓶へ入れ、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液８０ｍＬへ溶解し、１２１℃で４０分間高圧蒸気滅菌処理を行った。処理直後の溶液は、若干白濁して硫黄化合物独特の臭気を有していた。
【０１０８】
放冷後、溶液を透析膜へ移し、１Ｎ水酸化ナトリウムで２日間、精製水で５日間透析し、凍結乾燥を行った。得られたカチオン性ホモポリマーの加水分解処理粉末のＧＰＣによる分子量測定結果は処理前と変化は確認されず、１３,０００回積算のＮＭＲ解析においても、主鎖、側鎖には処理前と変化はなく、ポリマー末端のジチオカルバミル基のピークのみが消失していることが確認された。このものはＵＶ２８０ｎｍピークも消失しており、加水分解によりカチオン性ホモポリマーの末端のジチオカルバミル基が脱離したものであることが示唆された。
このカチオン性ホモポリマー加水分解処理粉末を遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１における（ｆ）に準拠して遺伝子導入活性を評価した。結果を図１，２に示す。
【０１０９】
図１，２より、次のことが分かる。
実施例１、比較例１及び比較例２で用いた遺伝子導入剤は、いずれも同一分子量のカチオン性ホモポリマーである。実施例１と比較例２のものは、ポリマー末端のジチオカルバミル基が存在しない。比較例１のものではＮＭＲの解析、ＧＰＣ、ＵＶ吸収の解析より、１分子当たりに平均して４．０３個のジチオカルバミル基が存在することが確認されている。
【０１１０】
これらのカチオン性ホモポリマーの遺伝子導入活性を比較すると、実施例１のものが遺伝子導入活性が高いのは、ポリマー末端の作用でなく、光照射により自己環化（分子内架橋）された構造的な優位性によるものと考えられる。活性の向上は２倍以上であり、５倍程度の向上効果が確認されるケースもある。
【０１１１】
また、血管内皮細胞の場合には、ＣＯＳ細胞での遺伝子導入活性と比較して、本発明の効果はより顕著に現れた。細胞との相性、選択性が発現される理由は不明であるが、本発明は、通常遺伝子導入が行いにくい内皮系細胞、樹状細胞、幹細胞への応用に期待できる技術であると推定される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】実施例１、比較例１及び比較例２のカチオン性ホモポリマーによるＣＯＳ細胞への遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【図２】実施例１、比較例１及び比較例２のカチオン性ホモポリマーによる血管内皮細胞への遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターが、ＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（下記特許文献１）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤及びその製造方法と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体とし、この分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得、該架橋反応生成物を分子量分画して得た、前記分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有した画分よりなることを特徴とするものである。
【０００６】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、該遺伝子導入剤の数平均分子量Ｍ２と、前記分岐型重合体の数平均分子量Ｍ１との比Ｍ２／Ｍ１が０．８〜１．５であることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、該分岐鎖に光照射することにより、前記分岐鎖を架橋反応させることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項１ないし３のいずれか1項において、該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項３又は４において、前記分岐型重合体をフィルム状に成形して光照射することを特徴とするものである。
【００１０】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、フィルム状の該分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより架橋反応を行うことを特徴とするものである。
【００１１】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項６において、該液状エーテルは、ジエチルエーテル、ジオクチルエーテル、メチルシクロヘキシルエーテル、ビス（メチルベンジル）エーテル、メチルブチルエーテル、ブチルヘキシルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、及びクラウンエーテルよりなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、及び／又は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートであることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基が架橋点として寄与していることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項１１の遺伝子導入剤は、請求項１ないし１０のいずれか1項において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基に由来する紫外線吸収ピークが実質的に不検出であるか、前記分岐型重合体の該吸収ピークよりも減少していることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明（請求項１２）の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体を製造する工程と、得られた分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得る工程と、該架橋反応生成物を分子量分画して、前記分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有した画分を分取する工程とを有することを特徴とするものである。
【００１７】
本発明（請求項１３）の核酸複合体は、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【００１８】
本発明（請求項１４）の核酸複合体は、請求項１２の遺伝子導入剤の製造方法で製造された遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の遺伝子導入剤は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を有する芳香族化合物をイニファクターとし、これにビニル系モノマーをリビング重合させて合成した、芳香環を核として、分岐鎖が放射状に伸延する分岐型重合体（以下「第１次分岐型重合体」ということがある。）に光を照射するなどして分岐鎖を架橋させて架橋反応生成物を得、この架橋反応生成物から第１次分岐型重合体とほぼ同等の分子量画分を分取して得た合成高分子ベクターであり、高い遺伝子導入活性を示す。
【００２０】
この遺伝子導入剤は、第１次分岐型重合体の末端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が架橋点として寄与してその第１次分岐型重合体の分岐鎖の途中又はその第１次分岐型重合体の他の分岐鎖の末端に架橋してなる分子内架橋体であると推察されるが、種々の研究の結果、この遺伝子導入剤は、第１次分岐型重合体よりもＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができることが認められた。
【００２１】
架橋反応生成物を分子量分画して得られる本発明の遺伝子導入剤の数平均分子量Ｍ２は、架橋前の第１次分岐型重合体の数平均分子量Ｍ１に対して、分子量比Ｍ２／Ｍ１が０．８〜１．５であることが好ましい（請求項２）。
【００２２】
また、イニファターが有するＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基としてはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が好ましく（請求項４）、特にイニファターは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合しているものが好ましい（請求項８）。また、イニファターの分岐鎖に光照射リビング重合させるビニル系モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、及び／又は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい（請求項９）。
【００２３】
本発明においては、第１次分岐型重合体の分岐鎖に光照射することにより、分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得ることが好ましく（請求項３）、この場合において、第１次分岐型重合体をフィルム状に成形し（請求項５）、さらには、このフィルム状の該分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより架橋反応を行うことが好ましい（請求項６）。
【００２４】
ここで用いる液状エーテルとしては、ジエチルエーテル、ジオクチルエーテル、メチルシクロヘキシルエーテル、ビス（メチルベンジル）エーテル、メチルブチルエーテル、ブチルヘキシルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、及びクラウンエーテルよりなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられる（請求項７）。
【００２５】
このように、フィルム状の第１次分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより、架橋反応の際に生成するジスルフィド化合物を固相からエーテル中へ抽出除去することができるため、効率よく架橋を行うことが可能となると考えられる。使用する液状エーテルは窒素ガスのバブリングで溶存酸素を追い出すことで、酸素分子によるラジカル捕捉反応を抑制し、さらに効率良く均質なポリマー架橋を行うことが可能となる。また、フィルム状の第１次分岐型重合体に光を照射することにより、分子間架橋よりも分子内架橋を優先させて、本発明の遺伝子導入剤を効率的に製造することができるようになる。
【００２６】
本発明の遺伝子導入剤は、第１次分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基が架橋点として寄与することにより、分子内架橋体となったものであり（請求項１０）、この結果、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基に由来する紫外線吸収ピークが実質的に不検出であるか、第１次分岐型重合体の該吸収ピークよりも減少したものとなる（請求項１１）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２８】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環に分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて得たスター形の第１次分岐型重合体を架橋反応させ、この架橋反応生成物から第１次分岐型重合体とほぼ同一分子量の画分を分取して得たものである。
【００２９】
即ち、第１次分岐型重合体に光を照射するなどして架橋反応させると、複数の第１次分岐型重合体が分子間架橋して、分子量の異なる様々な分子間架橋体が生成する。
本発明者らは、この架橋反応生成物を分子量分画して、分子量毎に架橋体を分画し、分子量と遺伝子導入活性との関係を調べたところ、架橋前の第１次分岐型重合体と同等の分子量を有する架橋体が高い遺伝子導入活性を示すことを見出した。
【００３０】
この架橋前の第１次分岐型重合体と同等の分子量を有する架橋体は、分子量は架橋前の第１次分岐型重合体とほぼ同等であるものの、分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基のジチオカルバミル基に由来する特異的な波長２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸収ピーク（以下「ＵＶ２８０ｎｍピーク」と称す。）が消失しているか、或いは、架橋前の第１次分岐型重合体に比べてＵＶ２８０ｎｍピークが大幅に減少していることから、架橋反応しなかった未反応第１次分岐型重合体ではなく、第１次分岐型重合体の分岐鎖の末端ジチオカルバミル基が、当該分岐鎖の途中又は同一分子内の他の分岐鎖の途中若しくは他の分岐鎖の末端と架橋してループ状分岐鎖を形成した分子内架橋体であると推察された。
【００３１】
このような分子内架橋体（以下「自己環化ポリマー」と称す場合がある。）が高い遺伝子導入活性を示す理由の詳細は明らかではないが、ループ状分岐鎖という特異的な構造的優位性による効果であると推測される。特に、本発明の遺伝子導入剤は、血管内皮細胞への遺伝子導入活性に優れ、架橋前の第１次分岐型重合体の血管内皮細胞への遺伝子導入活性と比較して１０倍程度の高い遺伝子導入活性を示す。
【００３２】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものである。
【００３３】
なお、第１次分岐型重合体を架橋して得られる架橋反応生成物を分子量分画して得られる画分には、本発明の遺伝子導入剤のように、架橋前の第１次分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有する画分であって、架橋前の第１次分岐型重合体よりもはるかに高い遺伝子導入活性を有する分子内架橋体と、架橋前の第１次分岐型重合体よりも分子量が大きく（例えば、第１次分岐型重合体の分子量の２〜１０倍）かつ、第１次分岐型重合体よりも遺伝子導入活性が高い画分の分子間架橋体とがあり、分子内架橋体である本発明の遺伝子導入剤は、架橋前の第１次分岐型重合体に比べて通常２〜５倍、遺伝子の種類によっては１０倍程度の遺伝子導入活性の向上が認められる一方で、分子間架橋体には、架橋前の第１次分岐型重合体に比べて、約１０倍の遺伝子導入活性の向上が認められるものがある。
【００３４】
従って、遺伝子導入活性の面では、分子間架橋体の方が、本発明に係る分子内架橋体よりも有利であるともみられるが、分子量が過度に大きな分子間架橋体は、代謝性、生分解性に劣る傾向があり、特に遺伝子治療、再生医療、細胞治療、細胞診断などの生体内での利用を目的とした場合、この問題は大きな障壁となる場合がある。
これに対して、本発明に係る分子内架橋体は分子量が小さく、代謝性、生分解性に優れるため、特に遺伝子治療、再生医療、細胞治療、細胞診断などの生体内での利用に適している。
【００３５】
＜第１次分岐型重合体＞
本発明に係る第１次分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体（以下「スター形分岐型重合体」或いは「スター形ポリマー」と称す場合がある。）である。
【００３６】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００３７】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００３８】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。
【００３９】
このイニファターに重合させるビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられ、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４０】
イニファターと上記ビニル系モノマーとを反応させるには、イニファター及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しビニル系モノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００４１】
該原料溶液中のビニル系モノマーの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。また、原料溶液中のイニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００４２】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適であり、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００４３】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して第１次分岐型重合体としてのホモポリマーを得る。
【００４４】
この第１次分岐型重合体の数平均分子量は分岐鎖の鎖数によるが、２，０００〜５００，０００、特に２，０００〜１５０，０００、とりわけ２，０００〜１００，０００程度が好ましい。
【００４５】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００４６】
本発明に係る第１次分岐型重合体は、このホモポリマーであってもよく、さらに異なるモノマーを導入したブロック共重合体又はランダム共重合体であってもよい。例えば、上記ホモポリマーに対し、ホモポリマーの合成に用いたビニル系モノマーとは異なるビニル系モノマー、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入してもよい。
【００４７】
即ち、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。これにより遺伝子導入剤が上記温度応答性を具備するようになる。
なお、先にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマーよりなる分岐鎖を有した分岐型重合体を形成し、その後、各分岐鎖の先端側に前述のカチオン性ビニル系モノマーよりなるポリマーブロックを導入するようにしてもよい。
【００４８】
カチオン性ポリマーブロックにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドあるいはＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させるには、上記のようにして合成した分岐型重合体を好ましくはアルコール例えばメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型重合体の濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４９】
このように分岐鎖をブロック又はランダム共重合体にて構成したスター形分岐型共重合体（スター形コポリマー）を第１次分岐型重合体として用いる場合、その数平均分子量は３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
【００５０】
＜第１次分岐型重合体の架橋＞
本発明では、上記のように合成した第１次分岐型重合体を架橋反応させ、その後、架橋反応生成物から第１次分岐型重合体とほぼ同一分子量の画分を分取することにより、目的とする遺伝子導入剤を得る。この第１次分岐型重合体の架橋を行うには、次のｉ），ii），iii），iv）の方法を採用することができるが、架橋効率及び架橋精度の点においてiv）の方法を採用することが好ましい。
【００５１】
ｉ)第１次分岐型重合体をメタノールなど適宜の溶媒に溶解させ、加熱するか、光を照射することにより、分岐型重合体同士を架橋する。この架橋反応を開始させる際の溶液中の第１次分岐型重合体の濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適である。加熱条件は、３０〜３００℃、１分〜３０,０００時間程度が好適である。
【００５２】
ii）第１次分岐型重合体へ直接光照射や加熱処理を行うことによって分岐型重合体を架橋させる。この場合、ｉ)の溶媒へ溶解した溶液への処理と相違して、分岐型重合体の主鎖及び又は側鎖へ発生したラジカルが溶媒によって捕捉され、分岐型重合体の架橋反応が阻害されることを抑制することが可能となる。直接光照射を行う場合は、凍結乾燥粉末を霧状に攪拌して、ここへ光を照射することで均質な処理が可能となる。なお、第１次分岐型重合体をフィルム状に加工し、このフィルムへ処理を行うことも均質な架橋体を得る方法として好ましい。具体的には、ガラス板、金属板などの上へ第１次分岐型重合体の溶液、例えば、クロロホルム溶液を流延させ、ドクターナイフなどで液切りして均一な厚みとし、これを乾燥させることで均質なフィルムを形成させることが可能である。この場合の溶媒としては揮発性が高いメタノール、クロロホルムが好適である。
【００５３】
iii）常温又は冷却下に長期間保持することによって第１次分岐型重合体を架橋させる。例えば、４℃、−２０℃などの冷却下においても１５，０００時間程度の時間を経過すれば十分に架橋の効果が現れる。この場合、第１次分岐型重合体は凍結乾燥フィルムまたはフィルム状態で経時変化させることが好ましく、遮光状態でも蛍光灯程度の光が迷光として暴露されていても良い。凍結乾燥状態で経時変化をさせるのであれば、高分子量成分の乾燥重量で１．５ｇ／５０ｍＬ程度の密度とすることで均質な架橋体を得ることが可能である。
【００５４】
iv）固体状態の第１次分岐型重合体、好ましくはフィルム状の第１次分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより、第１次分岐型重合体同士を架橋させる。
【００５５】
この場合の液状エーテルとしては、ジエチルエーテル、ジエチルエーテル、ジオクチルエーテル、メチルシクロヘキシルエーテル、ビス（メチルベンジル）エーテル、メチルブチルエーテル、ブチルヘキシルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クラウンエーテル等が挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５６】
液状エーテルに浸漬させる際の前記第１次分岐型重合体の形状としては、フィルム状、粉末状、塊状、フレーク上、ゲル状等が挙げられるが、分子間架橋よりも本発明で目的とする分子内架橋が優先して起こりやすいことから、フィルム状とすることが好ましい。
【００５７】
第１次分岐型重合体の形状としてフィルム状を採用した場合、フィルムの厚さは１０μｍ〜２０００μｍ程度、特に５０μｍ〜１０００μｍ程度が好ましい。極端にフィルムが薄いと遺伝子導入剤の製造効率が悪く、また極端にフィルムが厚いと光照射の効果及び光架橋反応においてジチオカルバミル基から脱離して生成するジスルフィド化合物のエーテル中への拡散・抽出除去の効果が十分に得られない。
【００５８】
また、第１次分岐型重合体の形状を粉末状にした場合、粉末の粒径は０．１〜１０００μｍ程度特に１００〜５００μｍ程度が好ましい。粒径を極端に小さくすることは困難であるが、逆に粒径を大きくした場合は光照射の効果及び光架橋反応においてジチオカルバミル基から脱離して生成するジスルフィド化合物のエーテル中への拡散・抽出除去の効果が十分に得られない。
【００５９】
さらに、第１次分岐型重合体の形状を塊状、フレーク状やフレーク状にした場合は、光暴露量の均質性や光架橋反応においてジチオカルバミル基から脱離して生成するジスルフィド化合物のエーテル中への拡散性を十分に考慮して行う必要ある。
【００６０】
光の照射条件は、光波長３００〜４００ｎｍ、照射時間１〜３００分、照射強度０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度が好適である。なおこの光照射条件は、ｉ）、ii）においても同様である。
【００６１】
iv）の架橋方法によれば、架橋反応の際に生成すると考えられるジスルフィド化合物を固層からエーテル中へ抽出除去することにより、効率的に架橋反応を行うことができる。従って、反応を行う際に液状エーテルを撹拌することが好ましい。これにより生成したジスルフィド化合物をより効率的に液状エーテル中へ抽出除去することができる。
【００６２】
さらに効率的に架橋反応を行うには、第１次分岐型重合体の浸漬時間を１〜３００分程度、液状エーテルの液温を２０〜６０℃程度にすることが好ましい。
【００６３】
この架橋反応では、第１次分岐型重合体の分岐鎖のジスルフィド化合物のチオ基が開いて分岐鎖同士が架橋するものと推察される。この架橋反応により、第１次分岐型重合体が２〜１０個、特に２〜５個程度架橋した高次分岐型重合体（分子間架橋体）が生成するが、同時に、この架橋反応により、１つの第１次分岐型重合体内において、その分岐鎖の末端のジチオカルバミル基が当該分岐鎖の途中又は同一第１次分岐型重合体内の他の分岐鎖の途中若しくは他の分岐鎖の末端と架橋してループ状分岐鎖を有した分子内架橋体も生成する。なお、このようにループ状分岐鎖を有した分岐鎖が生成したことは、生成物を分子量分画することにより、第１次分岐型重合体とほぼ同一分子量の画分が得られること、この画分の生成物は実質的にジチオカルバミル基を有していないか、或いは、第１次分岐型重合体よりもジチオカルバミル基量が大幅に低減していることから十分に推認される。
【００６４】
なお、この架橋反応で得られる架橋反応生成物の数平均分子量には特に制限はないが、通常２０，０００〜８０，０００程度である。
【００６５】
＜分子量分画＞
本発明では、上記のように第1次分岐型重合体を架橋させて得られた架橋反応生成物を分子量分画し、第1次分岐型重合体とほぼ同一分子量の画分を分取する。
【００６６】
この分子量分画は、液体クロマトグラフィー、電気泳動、貧溶媒／良溶媒グラジエント溶出技術などによって行うことができる。
【００６７】
分子量分画を液体クロマトグラフィーで行う場合、使用する移動相、カラムに応じてゲル浸透、サイズ排除、イオン排除、イオン抑制法などを組み合わせ、常法に従ってカラム分離能が適切に設定された条件で、当業者に自明の方法で行うことができる。
【００６８】
液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度は４０〜６０℃とすることが移動層溶液の粘度を下げ、圧力損失を低く、段数の高い状態で分離が行われ、かつ、通常の室温と比較して温度差があるため温度制御が安定して行うことができ、結果、分離も安定して行うことができるので好ましい。
【００６９】
なお、上記の「ほぼ同一の分子量の画分」とは、第１次分岐型重合体の数平均分子量をＭ１とし、分取した画分の架橋体の数平均分子量をＭ２とした場合、Ｍ２／Ｍ１が０．８〜１．５特に０．９〜１．２の範囲にあることをいう。ここで、本発明でいうＭ２／Ｍ１が１．０以下、すなわち、架橋前よりも分子量が小さくなるのは、ポリマー末端の分子団が架橋反応に消費されて外れていることと、測定精度上の問題も含むものである。Ｍ２／Ｍ１がこの範囲外であると、遺伝子導入活性に優れた遺伝子導入剤を得ることができない。ここで、数平均分子量とはＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の値である。
【００７０】
本発明では、このようにして得られた、架橋前の第１次分岐型重合体とほぼ同一分子量の画分を遺伝子導入剤とする。
【００７１】
＜核酸複合体＞
上述のようにして得られた本発明の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００７２】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００７３】
なお、前記の通り、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させた遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。従って、３０℃よりも低い温度で核酸と遺伝子導入剤の水溶液とを混合して遺伝子導入剤に核酸を複合させることができる。
【００７４】
約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有し、水不溶性となる。
【００７５】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００７６】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００７７】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００７８】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００７９】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００８０】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００８１】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００８２】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００８３】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００８４】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００８５】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００８６】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【００８７】
また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、必要に応じ乾燥させることにより、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。
【００８８】
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。
【００８９】
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。
【００９０】
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。
【実施例】
【００９１】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００９２】
［実施例１］
＜（ａ）イニファターの合成＞
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００９３】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下にて室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００９４】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００９５】
【化１】
【００９６】
＜（ｂ）４分岐型スター形重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成＞
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性ビニル系モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００９７】
即ち、上記（ａ）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）３．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を３０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター形ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率３２％）。このカチオン性ホモポリマーの数平均分子量はＧＰＣにより、２８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３３）と測定された。
【００９８】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００９９】
【化２】
【０１００】
＜（ｃ）カチオン性ホモポリマーフィルムの作製＞
１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンのポリマーフィルムを５０ｍｍ縦×５０ｍｍ横×１ｍｍ厚の平滑面ガラス板上へ形成させた。即ち、上記（ｂ）で合成した分子量２８，０００の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー０．３ｇを１０ｍＬクロロホルムへ溶解し、１ｍｍ厚ガラス板上へ１００μｍ厚に流延し、６０℃オーブン中で溶媒を乾燥させてフィルムを形成させた。
【０１０１】
＜（ｄ）カチオン性ホモポリマーの光架橋反応＞
１００ｍｍ縦×１００ｍｍ横×２ｍｍ厚の平滑な面を有する直方体容器中で１ｍｍ厚ガラス板を垂直に固定した。この１ｍｍ厚ガラス板は直方体容器壁と接触しており、ポリマーフィルムは容器の壁との接触面の反応側のガラス板面に配置した。この容器内へジエチルエーテル中を入れ、マグネットスターラーで攪拌し、ポリマーフィルムをジエチルエーテルで抽出洗浄できる状態とした。このジエチルエーテル中へ高純度窒素ガスをパージしながら（２Ｌ／分）光照射を行った。照射強度は３ｍｍガラス（容器厚さとガラス板厚さとの合計）透過後で１．０ｍＷ／ｃｍ２となるように調整し、光照射時間は２４０分で行った。照射終了後、フィルムを５０ｍＬのメタノールへ投入すると不溶性のゲル状成分が生成していた。このメタノール液を＃２の濾紙で濾過した後、エバポレーターで濃縮し、濃縮物をジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。得られた架橋体の数平均分子量はＧＰＣにより４６，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５）と測定され、光架橋により数平均分子量の増大と分子量分布のブロード化が確認された。また、光照射により得られた光架橋反応生成物ではＵＶ２８０ｎｍピークは消失していた。
【０１０２】
＜（ｅ）カチオン性ポリマー光架橋体のフラクション分離と特定分子量分画の採取＞
島津製作所高速液体クロマトグラフシステムＬＣ１０Ａｖｐを使用し、上記（ｄ）で合成したカチオン性ポリマーの光架橋反応生成物のフラクション分離を行った。
移動相は臭化リチウム３０ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド溶液を使用した。カラムにはＡｓａｈｉｐａｃｋＧＦ−５１０ＨＱとＡｓａｈｉｐａｃｋ７１０ＨＱを連結したものを用い、カラム温度４０℃でサイズ排除分離を行った。フラクション分離はフラクションコレクターＦＲＣ−１０Ａを使用して行った。得られた画分からＧＰＣによる数平均分子量２８，０００の分画を採取し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを高真空エバポレーターで留去し、ジエチルエーテル中へ滴下してポリマー成分と電解質成分を沈殿させ、超遠心限外濾過キット（アミネックスス）を使用して脱塩し、凍結乾燥することでポリマー成分を分離精製した。
【０１０３】
＜（ｆ）遺伝子導入活性＞
インビトロでの細胞遺伝子導入実験を行った。細胞にはＣＯＳ-１細胞とＥＣ（血管内皮細胞）を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。いずれも２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
【０１０４】
上記（ｅ）で採取した光架橋前と同一分子量を有するカチオン性ポリマー分子内架橋体を遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はカチオン性ポリマーのモノマー単位の分子量１５６から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
【０１０５】
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１，２に示す。
【０１０６】
［比較例１］
実施例１の（ｂ）で合成したカチオン性ホモポリマーを遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１における（ｆ）に準拠して遺伝子導入活性を評価した。結果を図１，２に示す。
【０１０７】
［比較例２］
実施例１の（ｂ）で合成したカチオン性ホモポリマー０．１グラムを５０ｍＬ滅菌瓶へ入れ、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液８０ｍＬへ溶解し、１２１℃で４０分間高圧蒸気滅菌処理を行った。処理直後の溶液は、若干白濁して硫黄化合物独特の臭気を有していた。
【０１０８】
放冷後、溶液を透析膜へ移し、１Ｎ水酸化ナトリウムで２日間、精製水で５日間透析し、凍結乾燥を行った。得られたカチオン性ホモポリマーの加水分解処理粉末のＧＰＣによる分子量測定結果は処理前と変化は確認されず、１３,０００回積算のＮＭＲ解析においても、主鎖、側鎖には処理前と変化はなく、ポリマー末端のジチオカルバミル基のピークのみが消失していることが確認された。このものはＵＶ２８０ｎｍピークも消失しており、加水分解によりカチオン性ホモポリマーの末端のジチオカルバミル基が脱離したものであることが示唆された。
このカチオン性ホモポリマー加水分解処理粉末を遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１における（ｆ）に準拠して遺伝子導入活性を評価した。結果を図１，２に示す。
【０１０９】
図１，２より、次のことが分かる。
実施例１、比較例１及び比較例２で用いた遺伝子導入剤は、いずれも同一分子量のカチオン性ホモポリマーである。実施例１と比較例２のものは、ポリマー末端のジチオカルバミル基が存在しない。比較例１のものではＮＭＲの解析、ＧＰＣ、ＵＶ吸収の解析より、１分子当たりに平均して４．０３個のジチオカルバミル基が存在することが確認されている。
【０１１０】
これらのカチオン性ホモポリマーの遺伝子導入活性を比較すると、実施例１のものが遺伝子導入活性が高いのは、ポリマー末端の作用でなく、光照射により自己環化（分子内架橋）された構造的な優位性によるものと考えられる。活性の向上は２倍以上であり、５倍程度の向上効果が確認されるケースもある。
【０１１１】
また、血管内皮細胞の場合には、ＣＯＳ細胞での遺伝子導入活性と比較して、本発明の効果はより顕著に現れた。細胞との相性、選択性が発現される理由は不明であるが、本発明は、通常遺伝子導入が行いにくい内皮系細胞、樹状細胞、幹細胞への応用に期待できる技術であると推定される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】実施例１、比較例１及び比較例２のカチオン性ホモポリマーによるＣＯＳ細胞への遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【図２】実施例１、比較例１及び比較例２のカチオン性ホモポリマーによる血管内皮細胞への遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体とし、
この分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得、
該架橋反応生成物を分子量分画して得た、前記分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有した画分よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、該遺伝子導入剤の数平均分子量Ｍ２と、前記分岐型重合体の数平均分子量Ｍ１との比Ｍ２／Ｍ１が０．８〜１．５であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１又は２において、該分岐鎖に光照射することにより、前記分岐鎖を架橋反応させることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか1項において、該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項３又は４において、前記分岐型重合体をフィルム状に成形して光照射することにより架橋反応を行うことを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項５において、フィルム状の該分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより架橋反応を行うことを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項６において、該液状エーテルは、ジエチルエーテル、ジオクチルエーテル、メチルシクロヘキシルエーテル、ビス（メチルベンジル）エーテル、メチルブチルエーテル、ブチルヘキシルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、及びクラウンエーテルよりなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、及び／又は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基が架橋点として寄与していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか1項において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基に由来する紫外線吸収ピークが実質的に不検出であるか、前記分岐型重合体の該吸収ピークよりも減少していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１２】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体を製造する工程と、
得られた分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得る工程と、
該架橋反応生成物を分子量分画して、前記分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有した画分を分取する工程とを有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【請求項１４】
請求項１２の遺伝子導入剤の製造方法で製造された遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【請求項１】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体とし、
この分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得、
該架橋反応生成物を分子量分画して得た、前記分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有した画分よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、該遺伝子導入剤の数平均分子量Ｍ２と、前記分岐型重合体の数平均分子量Ｍ１との比Ｍ２／Ｍ１が０．８〜１．５であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１又は２において、該分岐鎖に光照射することにより、前記分岐鎖を架橋反応させることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか1項において、該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項３又は４において、前記分岐型重合体をフィルム状に成形して光照射することにより架橋反応を行うことを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項５において、フィルム状の該分岐型重合体を液状エーテルに浸漬させた状態で光照射することにより架橋反応を行うことを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項６において、該液状エーテルは、ジエチルエーテル、ジオクチルエーテル、メチルシクロヘキシルエーテル、ビス（メチルベンジル）エーテル、メチルブチルエーテル、ブチルヘキシルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、及びクラウンエーテルよりなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、及び／又は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基が架橋点として寄与していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか1項において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基に由来する紫外線吸収ピークが実質的に不検出であるか、前記分岐型重合体の該吸収ピークよりも減少していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１２】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にビニル系モノマーを光照射リビング重合させて分岐型重合体を製造する工程と、
得られた分岐型重合体の分岐鎖を架橋反応させて架橋反応生成物を得る工程と、
該架橋反応生成物を分子量分画して、前記分岐型重合体とほぼ同等の分子量を有した画分を分取する工程とを有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【請求項１４】
請求項１２の遺伝子導入剤の製造方法で製造された遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２７４９９８（Ｐ２００９−２７４９９８Ａ）
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２８５６６（Ｐ２００８−１２８５６６）
【出願日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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