遺伝子導入剤
【課題】肝細胞への遺伝子導入が可能な遺伝子導入剤を提供する。
【解決手段】芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入され、かつ該高分子鎖にポリＬ−リジンが導入された高分子化合物よりなる遺伝子導入剤。前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなる。前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖にポリアミノスチレンを導入し、さらにポリＬ−リジンをそのアミノ基に末端のカルボキシル基を結合させるようにしてポリＬ−リジンを導入している。
【解決手段】芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入され、かつ該高分子鎖にポリＬ−リジンが導入された高分子化合物よりなる遺伝子導入剤。前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなる。前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖にポリアミノスチレンを導入し、さらにポリＬ−リジンをそのアミノ基に末端のカルボキシル基を結合させるようにしてポリＬ−リジンを導入している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤に係り、特に、肝細胞への遺伝子導入が可能な遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。特に悪性腫瘍や難治性のウイルス疾患などではこの傾向が強い。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。
【０００３】
従来、細胞へ遺伝子を導入する技術としては次のようなものが知られているが、いずれも以下に述べるような欠点がある。
【０００４】
（１）ウイルスベクター法
（２）リポフェクチン法、ポリカチオン法等
【０００５】
（１）ウイルスベクター法
ウイルス全般については、合成工程が複雑で感染の危険性がある；ウイルス内には挿入できないような大きな核酸が導入できない（例えばアデノウイルスでは、導入サイズは９０００ｂ以下である。）；といった欠点がある。
【０００６】
また、レセプターを介して細胞へ侵入するタイプのウイルスの場合、レセプターが発現されていない細胞へは導入できない；遺伝子治療を目指して研究をする場合に、マウスなど小動物での実験が必須であるが、ヒト細胞に存在するレセプターがマウスに存在しなければ実験が成立しない；細胞の種類によってレセプター発現量が異なり、これが導入効率に影響してしまう；アデノウイルスの設計には主としてＣＡＲ（コサッキーアデノウイルスレセプター）を利用するが、疾病によってＣＡＲの発現量が少ない患者も多く、遺伝子治療への応用に制約を受けることもある；といった欠点がある。
【０００７】
（２） 細胞のエンドサイトーシスを利用するリポフェクチン法、Ｎａｋｅｄプラスミド法、ポリカチオン法は、一般的に遺伝子導入効率が低いことと、遺伝子治療用の医薬として生体内へ投与（全身投与）する場合、標的細胞への特異的な導入を行う方法は未だに確立されていない。従って、循環血液量の多い肺胞や脾臓などで、かつ、細網管上皮細胞の多い臓器へ優先的に投与遺伝子が消費されてしまう。
【０００８】
なお、特開平１１−２９００７３には、遺伝子導入能を有する両親媒性のαヘリックスペプチドがガラクトース基で修飾された糖修飾ペプチド誘導体による肝細胞への遺伝子導入が記載されている。
【０００９】
また、ＷＯ２００４／０９２３８８には、スター型分岐ポリマーよりなるベクターが記載されているが、肝細胞に効率よく遺伝子導入することについては記載されていない。
【特許文献１】特開平１１−２９００７３
【特許文献２】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記従来の実状に鑑みてなされたものであって、生体内投与の際に肝細胞へ優先的、特異的に効率よく遺伝子導入することが可能で、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎や肝臓ガンなどの難治性肝臓疾患の遺伝子治療に利用可能な遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１の遺伝子導入剤は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入され、かつ該高分子鎖にポリＬ−リジンが導入された高分子化合物よりなるものである。
【００１２】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記高分子鎖にアミノ基が導入され、このアミノ基がポリＬ−リジンの末端のカルボキシル基と脱水縮合していることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項９において、前記高分子鎖の一部がポリアミノスチレンで構成されており、前記アミノ基は該ポリアミノスチレンのアミノ基であることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項１１の遺伝子導入剤は、請求項１ないし１０のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とするものである。
【００２２】
請求項１２の遺伝子導入剤は、請求項９において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の遺伝子導入剤で用いられる高分子化合物は、芳香環に複数の高分子鎖を導入してなるスター型分岐ポリマーであり、この高分子鎖にはポリＬ−リジンが導入されている。リジンが７個以上重合したポリＬ−リジンは肝細胞のレセプタであるヘパラン硫酸に対する指向性を有しており、肝細胞に容易に侵入し得る。
【００２４】
本発明の遺伝子導入剤を構成する高分子化合物（スター型分岐ポリマー）と遺伝子を混合してナノ粒子状のポリプレックスを形成したものが生体に投与される。
【００２５】
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本発明の遺伝子導入剤を用いた核酸含有複合体では、核酸をスター型分岐ポリマーとの凝集体とすることにより、少なくとも凝集体内部の核酸を生体内で正常に機能させることができる。即ち、本発明で使用するスター型分岐ポリマーは、その独自の分子構造によるイオン強度・電荷密度がポリプレックスの形成に至適と考えられ、水溶液中で安定して分散するポリプレックスが得られる。ポリプレックスへ包埋された遺伝子は、酵素の作用に対しても安定である。
【００２６】
また、本発明の遺伝子導入剤は、たんぱく質を吸着しても遺伝子導入活性を失わない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に本発明の遺伝子導入剤の実施の形態を詳細に説明する。
【００２８】
［高分子化合物］
まず、本発明の遺伝子導入剤において用いられる高分子化合物について説明する。
【００２９】
この高分子化合物は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入され、かつこの高分子鎖にポリＬ−リジンが導入された化合物である。
【００３０】
ここで、この高分子鎖の核となる芳香環としては、炭素数５〜８の芳香環、特に炭素数６の芳香環（即ちベンゼン環）の、単環又は２〜６個の縮合環、例えば、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環、ピレン環が挙げられ、好ましくはベンゼン環である。
【００３１】
核となる芳香環に導入される高分子鎖の数は、ベンゼン環であれば２〜６個、ナフタレン環の場合２〜８個、アントラセン環、ピレン環の場合２〜１０個であるが、多い程効果的であり、例えばベンゼン環であれば２、３、４又は６個、特に４又は６個、とりわけ６個であることが好ましい。
【００３２】
高分子鎖を導入するための原料となる芳香環化合物としては、例えば芳香環がベンゼン環の場合、次のようなベンゼン誘導体が挙げられる。
【００３３】
即ち、３分岐鎖用としては、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００３４】
芳香環に導入された高分子鎖のうちの少なくとも一つ、好ましくはそのすべてがその先端側に活性高分子ブロック鎖を有するものである。この高分子鎖は、ビニル系単量体の単独又は異なるビニル系単量体の共重合体よりなるビニル系高分子ブロック鎖、特に３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等の重合体よりなるポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖であることが好ましい。
【００３５】
また、１本の高分子鎖を構成する単量体の数は、その単量体の種類や反応性等によっても異なるが、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖を構成する単量体数は５〜１０００程度であることが好ましい。
【００３６】
芳香環にこのような高分子鎖を導入してなる高分子化合物、例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体よりなる高分子ブロック鎖を導入した高分子化合物を合成するには、まず、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと前述のベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−ＣＨ２−等を介して３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した高分子化合物を製造する。
【００３７】
次いで、この高分子ブロック鎖にアミノ基を導入する。このアミノ基を導入するには、アミノ基を有するポリマー鎖を上記高分子ブロック鎖に結合させるのが好ましい。アミノ基を有するポリマー鎖としては、ポリアミノスチレン、メタクリル酸２−アミノエチル、などが使用可能であるが、とりわけポリアミノスチレンが好適である。ポリアミノスチレンを導入するには、上記３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した高分子化合物を溶媒に溶解させ、アミノスチレンを添加し、光照射重合させるのが好ましい。高分子鎖１本当りに導入するポリアミノスチレンの重合度は２分子ブロック〜２０分子ブロック程度が好適である。
【００３８】
このようにアミノ基を導入した高分子化合物に対しポリＬ−リジンを導入する。詳しくは、ポリＬ−リジンの末端のカルボキシル基と、上記アミノ基とを脱水縮合させる。このポリＬ−リジンの重合度は３以上、好ましくは５〜５０程度が好ましい。ポリＬ−リジンを上記アミノ基を有する高分子化合物に導入するには、この高分子化合物をリン酸バッファー中に溶解させ、Ｎ−［ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンアミドエステルを触媒として添加し、ポリＬ−リジンを混合し、室温程度で反応させればよい。
【００３９】
このようにして合成された高分子化合物よりなる遺伝子導入剤の分子量は５千〜５０万、特に１万〜２０万、とりわけ１万〜１０万程度であることが好ましい。この分子量が過度に大きいと、高分子化合物及び核酸で複合体を形成させた際の複合体のサイズが大きくなったり、溶解性が低くなったり、生体内へ使用する場合に、排泄に不利になることが考えられる。逆に過度に小さいと低分子量有機化合物としての性質が強く発生して細胞毒性、高浸透圧、など生物学的な弊害が出てしまう。
【００４０】
［核酸］
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００４１】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００４２】
この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド特にＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。
【００４３】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４４】
また、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４５】
また、アンチセンスによるリプレッシングの他に、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ破壊などに利用することも可能である。
【００４６】
［ポリプレックスの形成］
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させてポリプレックスを形成するには、この高分子化合物の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して高分子化合物を過剰量添加し、高分子化合物を核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４７】
核酸を複合させた遺伝子導入剤は、微粒状のポリプレックスとなる。その粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、ポリプレックス内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００４８】
［生体への投与］
上述のような高分子化合物（スター型分岐ポリマー）よりなる遺伝子導入剤と核酸とのポリプレックスは、生体内へ投与される。
【００４９】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」は肝細胞である。即ち、上記のポリＬ−リジンは肝細胞のレセプタであるヘパラン硫酸への指向性を有しており、肝細胞に容易に進入することができる。
【００５０】
本発明の遺伝子導入剤は任意の方法で生体に投与することができる。
【００５１】
体内へ挿入するデバイスとしては、経皮的に患部付近の組織へ刺入するものや、血管カテーテル、ステントグラフトのように血管内へ留置するものなどがあるが、この限りではない。
【００５２】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５３】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５４】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５５】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５６】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、肝臓がん、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、劇症肝炎などが挙げられる。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００５８】
［実施例１，比較例１］
＜スター型６分岐ポリマー（高分子ブロック鎖導入高分子化合物）の合成＞
［１］ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの合成
【００５９】
【化１】
【００６０】
ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン５ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３１．８ｇをエタノール１Ｌ中へ加え、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、ここへ１５０ｍＬの水を加えて液抽出を行って臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させた。濾過後、ｎ−ヘキサンを加えて再結晶を行って、微かに淡青色を帯びたヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの白色結晶を得た（収率９０％）。
【００６１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ １．２６−１．３１（ｔ，３６Ｈ，Ｊ＝６．９ Ｈｚ，−ＣＨ２ＳＣ（Ｓ）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），３．７１−４．０１（ｗｑ，２４Ｈ，Ｊ＝６．９ Ｈｚ，−ＣＨ２ＳＣ（Ｓ）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２)，４．５７（ｓ，１２Ｈ，−ＣＨ２ＳＣ（Ｓ）ＮＥｔ２）であった。
【００６２】
［２］６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーの合成
【００６３】
【化２】
【００６４】
モノマーの３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、ＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）は、減圧蒸留で精製した。ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルチオカルバミルメチル）ベンゼン８．７ｍｇを２０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド３．９ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで希釈して５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした。２００Ｗ高圧水銀灯で３０分間の紫外光照射を行った。照度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで再沈殿させて精製した。これを少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させてヘキサキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼン（６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー）を得た（重合率４０％）。
【００６５】
分子量はＧＰＣにより１７，３００と測定され、１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ １．００−１．７０（ｂｒ，４１６Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ−ａｎｄ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−) ，１．９０（ｂｒ，１０４Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ−），２．０９（ｓ，６２４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３）２），２．２５（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２），２．９８（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＯＮＨＣＨ２−）で、目的物であることを確認した。
【００６６】
＜６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳの合成＞
このｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳはヘキサキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル（ポリ４アミノスチレン）−ブロック−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼンの略語である。
【００６７】
このヘキサキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル（ポリ４アミノスチレン）−ブロック−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼンの合成は以下のように行った。前述のように合成した６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー１５０ｍｇをメタノールへ溶解し、４−アミノスチレン６２０ｍｇを混合して全量をメタノールで５０ｍＬに調整した。前述と同様の条件で光照射重合を行って、メタノール／ジエチルエーテル系で精製を行って６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーを得た(重合率３８％)。
【００６８】
分子量はＧＰＣにより、１８，３００と測定され、１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）はδ １．００−１．７０（ｂｒ，４３２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ− ａｎｄ −ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），１．９０（ｂｒ，１０４Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ ｏｆ ＰＤＭＡＰＡＡｍ)，２．０６（ｓ，６２４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３）２ ｏｆ ＰＤＭＡＰＡＡｍ），２．２１（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２），３．０２（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＯＮＨＣＨ２−)，６．４０−６．８０（ｂｒ，１６Ｈ，３−Ｈ ａｎｄ ５−Ｈ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｒｉｎｇ ｐｒｏｔｏｎ），６．９５−７．３０（ｂｒ，１６Ｈ，２−Ｈ ａｎｄ ６−Ｈ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｒｉｎｇ ｐｒｏｔｏｎ）と測定された。
【００６９】
以上より、６分岐型ポリマーの６本のポリマー鎖に各々、６個モノマー単位のアミノスチレンがブロック化導入された６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳが合成された。
【００７０】
＜６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーへのポリＬ−リジンの導入＞
ポリＬ−リジンは微生物発酵法で合成したものを使用した。なお、ポリＬ−リジンの重合度は平均して７ｍｅｒである。
【００７１】
このポリＬ−リジンを、その末端のカルボキシル基を６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳのアミノスチレン側鎖のアミノ基へ化学結合させることにより導入した。すなわち、６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．０）へ溶解し、濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。ここにＮ−［ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステルを終濃度０．１ｍＭとなるように混合し、室温で３０分間攪拌した。８倍モル量のポリＬ−リジンを室温下で混合し、３時間放置した。未反応のペプチドなどを透析で除去して精製し、ポリリジンが化学結合にて導入された６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーを得た。
【００７２】
＜ポリＬ−リジンの導入の確認＞
ポリＬ−リジン導入６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマー及びＤ−フルクトースを０．１ＮのＮａＯＨ水溶液に溶解し、終濃度をそれぞれ１％及び２０％とした。この溶液を４０℃で２週間インキュベートした。２週間後、濃い茶褐色を呈した溶液を高圧蒸気滅菌器により１２１℃で２０分間処理した。溶液を塩酸で弱酸性とし、ポリアクリルアミド系サイズ排除ゲル（バイオラッド社、バイオゲルＰ３０）を充填したカラムと０．１Ｎ塩酸を移動相として精製分離し、高分子量成分のみを採取した。
【００７３】
この高分子量成分について、ＲＩ及びＵＶ検出器をタンデムに接続した高速液体クロマトグラフィーによりＧＰＣ測定を行った。イオン排除効果、疎水相互作用などＧＰＣのクロマトグラムはやや変形していたもののポリＬ−リジン導入前の分子量分布の間で大きな変化は認められなかった。一方で導入後のみに２８０ｎｍにおけるクロマトグラムにおいて高分子量成分に強い吸光が確認された。これはポリＬ−リジン残基のε−位のアミノ基に導入されたＤ−フルクトースが加熱処理により環化して形成されるフラン環が検出されるものと考えられ、６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーへポリＬ−リジンが導入されたことが確認された。
【００７４】
＜遺伝子導入実験＞
遺伝子導入剤としては、本発明のポリＬ−リジン導入６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマー（実施例）及び６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマー（比較例）を使用した。ＤＮＡはＬａｃＺをコードするプラスミドＤＮＡ（プロモーターＣＭＶ）を使用し、生理食塩水溶液中でイオン複合体を形成させ、マウス頸静脈より注射し、４８時間後に犠牲死させて、肝臓を摘出し、ＰＦＡで固定後にＸ−Ｇａｌ染色を行って組織学的評価を行った。組織に多くのスリットを入れて染色液の浸透を促進させた。切片はパラフィン包埋にて作成した。４０倍の顕微鏡写真を図１に示す。
【００７５】
この結果、図１の通り、ポリＬ−リジンを導入した本発明の遺伝子導入剤においてＬａｃＺ遺伝子の発現によるＸ−Ｇａｌ染色陽性のスポットが多く確認された。以上よりポリＬ−リジンを導入した分岐型ブロックポリマーとＤＮＡで形成させたイオン複合体が肝臓へ指向性を有する可能性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】実施例１及び比較例１において遺伝子導入を行った肝臓の組織を示す顕微鏡写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤に係り、特に、肝細胞への遺伝子導入が可能な遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。特に悪性腫瘍や難治性のウイルス疾患などではこの傾向が強い。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。
【０００３】
従来、細胞へ遺伝子を導入する技術としては次のようなものが知られているが、いずれも以下に述べるような欠点がある。
【０００４】
（１）ウイルスベクター法
（２）リポフェクチン法、ポリカチオン法等
【０００５】
（１）ウイルスベクター法
ウイルス全般については、合成工程が複雑で感染の危険性がある；ウイルス内には挿入できないような大きな核酸が導入できない（例えばアデノウイルスでは、導入サイズは９０００ｂ以下である。）；といった欠点がある。
【０００６】
また、レセプターを介して細胞へ侵入するタイプのウイルスの場合、レセプターが発現されていない細胞へは導入できない；遺伝子治療を目指して研究をする場合に、マウスなど小動物での実験が必須であるが、ヒト細胞に存在するレセプターがマウスに存在しなければ実験が成立しない；細胞の種類によってレセプター発現量が異なり、これが導入効率に影響してしまう；アデノウイルスの設計には主としてＣＡＲ（コサッキーアデノウイルスレセプター）を利用するが、疾病によってＣＡＲの発現量が少ない患者も多く、遺伝子治療への応用に制約を受けることもある；といった欠点がある。
【０００７】
（２） 細胞のエンドサイトーシスを利用するリポフェクチン法、Ｎａｋｅｄプラスミド法、ポリカチオン法は、一般的に遺伝子導入効率が低いことと、遺伝子治療用の医薬として生体内へ投与（全身投与）する場合、標的細胞への特異的な導入を行う方法は未だに確立されていない。従って、循環血液量の多い肺胞や脾臓などで、かつ、細網管上皮細胞の多い臓器へ優先的に投与遺伝子が消費されてしまう。
【０００８】
なお、特開平１１−２９００７３には、遺伝子導入能を有する両親媒性のαヘリックスペプチドがガラクトース基で修飾された糖修飾ペプチド誘導体による肝細胞への遺伝子導入が記載されている。
【０００９】
また、ＷＯ２００４／０９２３８８には、スター型分岐ポリマーよりなるベクターが記載されているが、肝細胞に効率よく遺伝子導入することについては記載されていない。
【特許文献１】特開平１１−２９００７３
【特許文献２】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記従来の実状に鑑みてなされたものであって、生体内投与の際に肝細胞へ優先的、特異的に効率よく遺伝子導入することが可能で、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎や肝臓ガンなどの難治性肝臓疾患の遺伝子治療に利用可能な遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１の遺伝子導入剤は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入され、かつ該高分子鎖にポリＬ−リジンが導入された高分子化合物よりなるものである。
【００１２】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記高分子鎖にアミノ基が導入され、このアミノ基がポリＬ−リジンの末端のカルボキシル基と脱水縮合していることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項９において、前記高分子鎖の一部がポリアミノスチレンで構成されており、前記アミノ基は該ポリアミノスチレンのアミノ基であることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項１１の遺伝子導入剤は、請求項１ないし１０のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とするものである。
【００２２】
請求項１２の遺伝子導入剤は、請求項９において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の遺伝子導入剤で用いられる高分子化合物は、芳香環に複数の高分子鎖を導入してなるスター型分岐ポリマーであり、この高分子鎖にはポリＬ−リジンが導入されている。リジンが７個以上重合したポリＬ−リジンは肝細胞のレセプタであるヘパラン硫酸に対する指向性を有しており、肝細胞に容易に侵入し得る。
【００２４】
本発明の遺伝子導入剤を構成する高分子化合物（スター型分岐ポリマー）と遺伝子を混合してナノ粒子状のポリプレックスを形成したものが生体に投与される。
【００２５】
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本発明の遺伝子導入剤を用いた核酸含有複合体では、核酸をスター型分岐ポリマーとの凝集体とすることにより、少なくとも凝集体内部の核酸を生体内で正常に機能させることができる。即ち、本発明で使用するスター型分岐ポリマーは、その独自の分子構造によるイオン強度・電荷密度がポリプレックスの形成に至適と考えられ、水溶液中で安定して分散するポリプレックスが得られる。ポリプレックスへ包埋された遺伝子は、酵素の作用に対しても安定である。
【００２６】
また、本発明の遺伝子導入剤は、たんぱく質を吸着しても遺伝子導入活性を失わない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に本発明の遺伝子導入剤の実施の形態を詳細に説明する。
【００２８】
［高分子化合物］
まず、本発明の遺伝子導入剤において用いられる高分子化合物について説明する。
【００２９】
この高分子化合物は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入され、かつこの高分子鎖にポリＬ−リジンが導入された化合物である。
【００３０】
ここで、この高分子鎖の核となる芳香環としては、炭素数５〜８の芳香環、特に炭素数６の芳香環（即ちベンゼン環）の、単環又は２〜６個の縮合環、例えば、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環、ピレン環が挙げられ、好ましくはベンゼン環である。
【００３１】
核となる芳香環に導入される高分子鎖の数は、ベンゼン環であれば２〜６個、ナフタレン環の場合２〜８個、アントラセン環、ピレン環の場合２〜１０個であるが、多い程効果的であり、例えばベンゼン環であれば２、３、４又は６個、特に４又は６個、とりわけ６個であることが好ましい。
【００３２】
高分子鎖を導入するための原料となる芳香環化合物としては、例えば芳香環がベンゼン環の場合、次のようなベンゼン誘導体が挙げられる。
【００３３】
即ち、３分岐鎖用としては、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００３４】
芳香環に導入された高分子鎖のうちの少なくとも一つ、好ましくはそのすべてがその先端側に活性高分子ブロック鎖を有するものである。この高分子鎖は、ビニル系単量体の単独又は異なるビニル系単量体の共重合体よりなるビニル系高分子ブロック鎖、特に３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等の重合体よりなるポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖であることが好ましい。
【００３５】
また、１本の高分子鎖を構成する単量体の数は、その単量体の種類や反応性等によっても異なるが、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖を構成する単量体数は５〜１０００程度であることが好ましい。
【００３６】
芳香環にこのような高分子鎖を導入してなる高分子化合物、例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体よりなる高分子ブロック鎖を導入した高分子化合物を合成するには、まず、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと前述のベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−ＣＨ２−等を介して３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した高分子化合物を製造する。
【００３７】
次いで、この高分子ブロック鎖にアミノ基を導入する。このアミノ基を導入するには、アミノ基を有するポリマー鎖を上記高分子ブロック鎖に結合させるのが好ましい。アミノ基を有するポリマー鎖としては、ポリアミノスチレン、メタクリル酸２−アミノエチル、などが使用可能であるが、とりわけポリアミノスチレンが好適である。ポリアミノスチレンを導入するには、上記３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した高分子化合物を溶媒に溶解させ、アミノスチレンを添加し、光照射重合させるのが好ましい。高分子鎖１本当りに導入するポリアミノスチレンの重合度は２分子ブロック〜２０分子ブロック程度が好適である。
【００３８】
このようにアミノ基を導入した高分子化合物に対しポリＬ−リジンを導入する。詳しくは、ポリＬ−リジンの末端のカルボキシル基と、上記アミノ基とを脱水縮合させる。このポリＬ−リジンの重合度は３以上、好ましくは５〜５０程度が好ましい。ポリＬ−リジンを上記アミノ基を有する高分子化合物に導入するには、この高分子化合物をリン酸バッファー中に溶解させ、Ｎ−［ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンアミドエステルを触媒として添加し、ポリＬ−リジンを混合し、室温程度で反応させればよい。
【００３９】
このようにして合成された高分子化合物よりなる遺伝子導入剤の分子量は５千〜５０万、特に１万〜２０万、とりわけ１万〜１０万程度であることが好ましい。この分子量が過度に大きいと、高分子化合物及び核酸で複合体を形成させた際の複合体のサイズが大きくなったり、溶解性が低くなったり、生体内へ使用する場合に、排泄に不利になることが考えられる。逆に過度に小さいと低分子量有機化合物としての性質が強く発生して細胞毒性、高浸透圧、など生物学的な弊害が出てしまう。
【００４０】
［核酸］
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００４１】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００４２】
この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド特にＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。
【００４３】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４４】
また、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４５】
また、アンチセンスによるリプレッシングの他に、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ破壊などに利用することも可能である。
【００４６】
［ポリプレックスの形成］
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させてポリプレックスを形成するには、この高分子化合物の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して高分子化合物を過剰量添加し、高分子化合物を核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４７】
核酸を複合させた遺伝子導入剤は、微粒状のポリプレックスとなる。その粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、ポリプレックス内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００４８】
［生体への投与］
上述のような高分子化合物（スター型分岐ポリマー）よりなる遺伝子導入剤と核酸とのポリプレックスは、生体内へ投与される。
【００４９】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」は肝細胞である。即ち、上記のポリＬ−リジンは肝細胞のレセプタであるヘパラン硫酸への指向性を有しており、肝細胞に容易に進入することができる。
【００５０】
本発明の遺伝子導入剤は任意の方法で生体に投与することができる。
【００５１】
体内へ挿入するデバイスとしては、経皮的に患部付近の組織へ刺入するものや、血管カテーテル、ステントグラフトのように血管内へ留置するものなどがあるが、この限りではない。
【００５２】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５３】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５４】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５５】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５６】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、肝臓がん、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、劇症肝炎などが挙げられる。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００５８】
［実施例１，比較例１］
＜スター型６分岐ポリマー（高分子ブロック鎖導入高分子化合物）の合成＞
［１］ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの合成
【００５９】
【化１】
【００６０】
ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン５ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３１．８ｇをエタノール１Ｌ中へ加え、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、ここへ１５０ｍＬの水を加えて液抽出を行って臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させた。濾過後、ｎ−ヘキサンを加えて再結晶を行って、微かに淡青色を帯びたヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの白色結晶を得た（収率９０％）。
【００６１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ １．２６−１．３１（ｔ，３６Ｈ，Ｊ＝６．９ Ｈｚ，−ＣＨ２ＳＣ（Ｓ）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），３．７１−４．０１（ｗｑ，２４Ｈ，Ｊ＝６．９ Ｈｚ，−ＣＨ２ＳＣ（Ｓ）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２)，４．５７（ｓ，１２Ｈ，−ＣＨ２ＳＣ（Ｓ）ＮＥｔ２）であった。
【００６２】
［２］６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーの合成
【００６３】
【化２】
【００６４】
モノマーの３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、ＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）は、減圧蒸留で精製した。ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルチオカルバミルメチル）ベンゼン８．７ｍｇを２０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド３．９ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで希釈して５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした。２００Ｗ高圧水銀灯で３０分間の紫外光照射を行った。照度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで再沈殿させて精製した。これを少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させてヘキサキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼン（６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー）を得た（重合率４０％）。
【００６５】
分子量はＧＰＣにより１７，３００と測定され、１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ １．００−１．７０（ｂｒ，４１６Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ−ａｎｄ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−) ，１．９０（ｂｒ，１０４Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ−），２．０９（ｓ，６２４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３）２），２．２５（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２），２．９８（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＯＮＨＣＨ２−）で、目的物であることを確認した。
【００６６】
＜６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳの合成＞
このｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳはヘキサキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル（ポリ４アミノスチレン）−ブロック−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼンの略語である。
【００６７】
このヘキサキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル（ポリ４アミノスチレン）−ブロック−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼンの合成は以下のように行った。前述のように合成した６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー１５０ｍｇをメタノールへ溶解し、４−アミノスチレン６２０ｍｇを混合して全量をメタノールで５０ｍＬに調整した。前述と同様の条件で光照射重合を行って、メタノール／ジエチルエーテル系で精製を行って６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーを得た(重合率３８％)。
【００６８】
分子量はＧＰＣにより、１８，３００と測定され、１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）はδ １．００−１．７０（ｂｒ，４３２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ− ａｎｄ −ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），１．９０（ｂｒ，１０４Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ ｏｆ ＰＤＭＡＰＡＡｍ)，２．０６（ｓ，６２４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ３）２ ｏｆ ＰＤＭＡＰＡＡｍ），２．２１（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２），３．０２（ｂｒ，２０８Ｈ，−ＣＯＮＨＣＨ２−)，６．４０−６．８０（ｂｒ，１６Ｈ，３−Ｈ ａｎｄ ５−Ｈ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｒｉｎｇ ｐｒｏｔｏｎ），６．９５−７．３０（ｂｒ，１６Ｈ，２−Ｈ ａｎｄ ６−Ｈ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｒｉｎｇ ｐｒｏｔｏｎ）と測定された。
【００６９】
以上より、６分岐型ポリマーの６本のポリマー鎖に各々、６個モノマー単位のアミノスチレンがブロック化導入された６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳが合成された。
【００７０】
＜６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーへのポリＬ−リジンの導入＞
ポリＬ−リジンは微生物発酵法で合成したものを使用した。なお、ポリＬ−リジンの重合度は平均して７ｍｅｒである。
【００７１】
このポリＬ−リジンを、その末端のカルボキシル基を６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳのアミノスチレン側鎖のアミノ基へ化学結合させることにより導入した。すなわち、６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．０）へ溶解し、濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。ここにＮ−［ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステルを終濃度０．１ｍＭとなるように混合し、室温で３０分間攪拌した。８倍モル量のポリＬ−リジンを室温下で混合し、３時間放置した。未反応のペプチドなどを透析で除去して精製し、ポリリジンが化学結合にて導入された６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーを得た。
【００７２】
＜ポリＬ−リジンの導入の確認＞
ポリＬ−リジン導入６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマー及びＤ−フルクトースを０．１ＮのＮａＯＨ水溶液に溶解し、終濃度をそれぞれ１％及び２０％とした。この溶液を４０℃で２週間インキュベートした。２週間後、濃い茶褐色を呈した溶液を高圧蒸気滅菌器により１２１℃で２０分間処理した。溶液を塩酸で弱酸性とし、ポリアクリルアミド系サイズ排除ゲル（バイオラッド社、バイオゲルＰ３０）を充填したカラムと０．１Ｎ塩酸を移動相として精製分離し、高分子量成分のみを採取した。
【００７３】
この高分子量成分について、ＲＩ及びＵＶ検出器をタンデムに接続した高速液体クロマトグラフィーによりＧＰＣ測定を行った。イオン排除効果、疎水相互作用などＧＰＣのクロマトグラムはやや変形していたもののポリＬ−リジン導入前の分子量分布の間で大きな変化は認められなかった。一方で導入後のみに２８０ｎｍにおけるクロマトグラムにおいて高分子量成分に強い吸光が確認された。これはポリＬ−リジン残基のε−位のアミノ基に導入されたＤ−フルクトースが加熱処理により環化して形成されるフラン環が検出されるものと考えられ、６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーへポリＬ−リジンが導入されたことが確認された。
【００７４】
＜遺伝子導入実験＞
遺伝子導入剤としては、本発明のポリＬ−リジン導入６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマー（実施例）及び６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマー（比較例）を使用した。ＤＮＡはＬａｃＺをコードするプラスミドＤＮＡ（プロモーターＣＭＶ）を使用し、生理食塩水溶液中でイオン複合体を形成させ、マウス頸静脈より注射し、４８時間後に犠牲死させて、肝臓を摘出し、ＰＦＡで固定後にＸ−Ｇａｌ染色を行って組織学的評価を行った。組織に多くのスリットを入れて染色液の浸透を促進させた。切片はパラフィン包埋にて作成した。４０倍の顕微鏡写真を図１に示す。
【００７５】
この結果、図１の通り、ポリＬ−リジンを導入した本発明の遺伝子導入剤においてＬａｃＺ遺伝子の発現によるＸ−Ｇａｌ染色陽性のスポットが多く確認された。以上よりポリＬ−リジンを導入した分岐型ブロックポリマーとＤＮＡで形成させたイオン複合体が肝臓へ指向性を有する可能性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】実施例１及び比較例１において遺伝子導入を行った肝臓の組織を示す顕微鏡写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入され、かつ該高分子鎖にポリＬ−リジンが導入された高分子化合物よりなる遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記高分子鎖にアミノ基が導入され、このアミノ基がポリＬ−リジンの末端のカルボキシル基と脱水縮合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項９において、前記高分子鎖の一部がポリアミノスチレンで構成されており、前記アミノ基は該ポリアミノスチレンのアミノ基であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１２】
請求項１１において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１】
芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入され、かつ該高分子鎖にポリＬ−リジンが導入された高分子化合物よりなる遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記高分子鎖にアミノ基が導入され、このアミノ基がポリＬ−リジンの末端のカルボキシル基と脱水縮合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項９において、前記高分子鎖の一部がポリアミノスチレンで構成されており、前記アミノ基は該ポリアミノスチレンのアミノ基であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１２】
請求項１１において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【図１】
【公開番号】特開２００８−１９５６８４（Ｐ２００８−１９５６８４Ａ）
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３４８９４（Ｐ２００７−３４８９４）
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]