遺伝子導入効率を高めたウイルスベクター及びその利用
【課題】細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率を高めたウイルスベクターを提供することである。
【解決手段】エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子を組み込んだウイルスベクターは、細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率が顕著に向上しており、遺伝治療等の有用である。外来遺伝子が癌抑制遺伝子のｐ５３遺伝子又はその変異体であり、ウイルスベクターがアデノウイルスベクターであり、エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加。
【解決手段】エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子を組み込んだウイルスベクターは、細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率が顕著に向上しており、遺伝治療等の有用である。外来遺伝子が癌抑制遺伝子のｐ５３遺伝子又はその変異体であり、ウイルスベクターがアデノウイルスベクターであり、エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率を高めたウイルスベクターに関する。また、本発明は、当該ウイルスベクターを用いた、遺伝子治療用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮体癌は、世界的にも発生患者数が増加しており、術後に有効な補助療法が必要とされる一方、若年者や未産婦に対しては手術以外の治療法の開発も望まれている。妊孕性の温存希望の患者の場合には、黄体ホルモン剤が使用され、十分な治療効果が得られるケースが多くないが、腫瘍が消失してその後に出産し再発も見られず経過した患者では、黄体ホルモン投与中の子宮体癌組織にがん抑制遺伝子産物ｐ５３が増加していることが確認されている。ｐ５３の生体内でのメカニズムについては十分に解明されておらず、ｐ５３が抗腫瘍効果に直接的に関与しているか、或いはｐ５３によって黄体ホルモンの作用が抗腫瘍効果を奏しやすいものに変化したのかは、明らかではないが、ｐ５３の発現が癌の治療効果に関わっていると考えられている。
【０００３】
黄体ホルモンが、エストロゲンの作用で増殖した正常の子宮内膜組織を分泌期の状態に変化させて細胞増殖を止める役割を果たすことが知られているが、子宮内膜細胞が癌化してできたと考えられる子宮体癌が黄体ホルモンによって増殖を停止する程度に影響を受ける場合は、培養細胞でも実際の症例検討でも稀である。黄体ホルモンの正常子宮内膜に対する増殖抑制と分泌期への移行作用には、エストロゲンが先に作用している条件下で現れることからも、ホルモンだけの作用でなく、細胞周期の制御を担っているｐ５３も関与していると考えられている。
【０００４】
一方、癌の治療の試みとして遺伝子治療が１９９０年代からなされている。特に、アデノウイルスベクターを使用することにより、挿入遺伝子の発現量が他のベクターに比べて多く、また細胞の染色体に組み込まれないため安全性が高いと評価されている（非特許文献１−３参照）。しかしながら、遺伝子治療は、癌の治療への臨床的応用では期待されたほど効果が得られ難く、抗癌剤による化学療法との併用効果が報告されているものの（非特許文献４参照）、単独療法として確立するに至っていないのが現状である。有効な遺伝子治療が確立されていない要因として、癌細胞に対する遺伝子導入効率が低く、治療有効量の導入遺伝子を細胞内で発現できないことが挙げられる。このような従来技術を背景として、細胞内への遺伝子導入効率に優れ、遺伝子治療に有効なベクターを開発することが切望されている。
【０００５】
なお、従来、エストロゲン応答配列をアデノウイルスベクターに組み込むことにより、挿入遺伝子の発現をコントロールできることが報告されている。例えば、非特許文献５には、エストロゲン応答配列を含むプロモーターを導入したアデノウイルスベクターを使用することにより、エストロゲンレセプターを発現する細胞において挿入遺伝子の転写活性を向上できることが報告されている。また、特許文献１には、エストロゲン応答配列を組み込んだベクターを利用することによってベクターに挿入されたレポータータンパク質の発現量からエストロゲンの量を定量評価できることが報告されている。しかしながら、これらの技術において、エストロゲン応答配列は、挿入遺伝子の発現を制御するプロモーターの上流に配置されており、ベクター内で挿入遺伝子に付加された状態で存在するものではない。また、これらの技術は、あくまでエストロゲンレセプターの存在下でエンハンサーとして機能させる目的でエストロゲン応答配列を使用しているに過ぎず、エストロゲンレセプターの有無に拘わらず遺伝子導入効率を高めるために、エストロゲン応答配列を使用できるか、或いはどのような態様で使用できるかを示唆するものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】藤原俊義、遺伝子改変アデノウイルスによる固形癌治療、日本臨床 ６８（８）：６２７−６３３、２０１０
【非特許文献２】斉藤泉、遺伝子治療のベクター：アデノウイルスベクター、蛋白質核酸酵素 ４２（１０）：１７９８−１８０５、１９９７
【非特許文献３】Ｘｉｎ Ｙｕａｎ Ｌｉｕ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｅ−ｖｏｒｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｓｐｅｒｉｔｙ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：８７９−８８６、２００６
【非特許文献４】Ｋｈｕｒｉ ＦＲ．ｅｔ ａｌ．，Ａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ＯＮＹＸ−０１５，ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．６：８７９−８８５，２０００
【非特許文献５】Ｒｕｂｅｎ Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｃｏｃｅｂａ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ，ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｈａｔ ａｌｌｏｗｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ１ａ−ｄｅｌｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：２００９−２０２４，２０００
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２９７３５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率を高めたウイルスベクターを提供することを目的とする。更に、本発明は、当該ウイルスベクターを使用し、癌をはじめとする各種疾患の遺伝子治療に有効な医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、驚くべくことに、エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子を組み込んだウイルスベクターは、細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率が顕著に向上することを見出した。また、前記外来遺伝子として、ｐ５３遺伝子又はその変異体を使用する場合には、コドン７２がプロリンであればエストロゲン受容体を発現している細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に向上し、またコドン７２がアルギニンであればエストロゲン受容体を発現していない細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に向上することを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする、ウイルスベクター。
項２．外来遺伝子が癌抑制遺伝子である、項１に記載のウイルスベクター。
項３．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体である、項１又は２に記載のウイルスベクター。
項４．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がプロリンをコードしている、項１乃至３のいずれかに記載のウイルスベクター。
項５．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がアルギニンをコードしている、項１乃至３のいずれかに記載のウイルスベクター。
項６．アデノウイルスベクターである、項１乃至５のいずれかに記載のウイルスベクター。
項７．外来遺伝子の５’末端にエストロゲン応答配列の３’末端に直接結合している、項１乃至６のいずれかに記載のウイルスベクター。
項８．項１乃至７のいずれかに記載のウイルスベクターを含む、医薬組成物。
項９．遺伝子治療に使用される、項８に記載の医薬組成物。
項１０．外来遺伝子としてｐ５３遺伝子又はその変異体を含有するウイルスベクターを含み、癌の治療に使用される、項８又は９に記載の医薬組成物。
項１１．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がプロリンをコードしており、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有する癌患者に対して適用される、項１０に記載の医薬組成物。
項１２．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がアルギニンをコードしており、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有していない癌患者を保有する癌患者に対して適用される、項１０に記載の医薬組成物。
項１３．エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加されたｐ５３遺伝子又はその変異体からなる、融合遺伝子。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のウイルスベクターによれば、外来遺伝子を効率的に細胞内に導入できるので、細胞の形質転換効率を向上させ、ひいては細胞内での外来遺伝子の発現量を増加させることができる。
【００１２】
とりわけ、本発明のウイルスベクターは、癌細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に優れており、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子等の癌抑制遺伝子を使用することにより、癌の遺伝子治療に好適に用いられる。また、本発明のウイルスベクターにおいて、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子を使用する場合、コドン７２がプロリンであればエストロゲン受容体を発現している癌細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に高く、またコドン７２がアルギニンであればエストロゲン受容体を発現していない癌細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に高い。そのため、本発明のウイルスベクターにおいて外来遺伝子としてｐ５３遺伝子を組み込んで癌の治療剤として使用する場合、癌患者の病因となっている癌細胞におけるエストロゲン受容体の発現の有無に応じて、ｐ５３遺伝子のコドン７２がコードするアミノ酸の種類を設定することにより、癌細胞のタイプに応じた最適な癌治療の方策を講じることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１において、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子（ｐ５３Ｒｃ）、コドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子（ｐ５３Ｐｃ）、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの（ＥＲＥｐ５３Ｒｃ）、又はコドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの（ＥＲＥｐ５３Ｐｃ）が挿入されたアデノウイルスをＨＨＵＡ細胞に感染させて、４８時間後にＧＦＰ蛍光を発現している細胞を観察した結果を示す。
【図２】実施例１において、ｐ５３Ｒｃ、ｐ５３Ｐｃ、ＥＲＥｐ５３Ｒｃ又はＥＲＥｐ５３Ｐｃが挿入されたアデノウイルスをＫＬＥ細胞に感染させて、４８時間後にＧＦＰ蛍光を発現している細胞を観察した結果を示す。
【図３】実施例１において、アデノウイルスの感染から７２時間後に、フローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。
【図４】実施例１において、アデノウイルスの感染から４８時間時間後に、フローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞中のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。
【図５】実施例１において、アデノウイルスの感染から７２時間後に、フローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞中のＰＩ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。
【図６】実施例１において、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞、ＳＷ４８細胞、及びＫＬＥ細胞について、アデノウイルス感染量（ｐ５３遺伝子量）を測定した結果を示す。
【図７】実施例１において、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞及びＫＬＥ細胞内のｐ５３ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。
【図８】実施例２において、アデノウイルスの感染から４８時間後に、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の各ＨＨＵＡ細胞について、フローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞中のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。
【図９】実施例２において、アデノウイルスの感染から４８時間後に、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の各ＨＨＵＡ細胞について、フローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞中のＰＩ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。
【図１０】実施例２において、アデノウイルスの感染から７２時間後に、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の各ＨＨＵＡ細胞について、ｐ５３ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。
【図１１】実施例２において、アデノウイルスの感染から７２時間後に、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の各ＨＨＵＡ細胞について、ｐ３００ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．ウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする。以下に、本発明のウイルスベクターについて、詳細に説明する。
【００１５】
本発明において、エストロゲン応答配列は、ＥＲＥ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）とも称される塩基配列であり、エストロゲンレセプターによって転写活性が調節される標的遺伝子の転写調節領域に存在し、エストロゲンとエストロゲンレセプターとの複合体が、該配列を認識することにより、エストロゲン依存的に標的遺伝子の転写を促進する機能を有している。本発明で使用されるエストロゲン応答配列としては、具体的には、ＰＳ２、ビテロゲニンA2、補体3遺伝子、ラクトフェリン等の遺伝子の５’上流領域に存在するＥＲＥが挙げられる。本発明で使用されるエストロゲン応答配列は、コンセンサス配列（５’−ＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣ−３’、ｎはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。；配列番号１）を１回以上含む塩基配列である。これらのエストロゲン応答配列は、野生型であってもよく、また遺伝子導入の促進作用を保持していることを限度として変異型であってもよい。本発明で使用されるエストロゲン応答配列の好適一例として、配列番号２に示す塩基配列（５’−ＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＣＣ−３’）が挙げられる。また、本発明で使用されるエストロゲン応答配列の例として、配列番号１又は２に示す塩基配列に相補する塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ外来遺伝子に対する導入促進作用を有する塩基配列が例示される。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列とは、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ及び１．８５ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、２×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で４２℃でハイブリダイゼーション、続いて０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄する条件、又はこれと等価の条件を含む。
【００１６】
また、本発明で使用されるエストロゲン応答配列の一例として、配列番号２に示す塩基配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列が挙げられる。塩基配列の同一性は、２つの塩基配列の間の最適アライメントを決定、比較することによって算定される。塩基配列の最適アライメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０））の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８））の類似性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は検分によって、Ｓｍｉｔｈら（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１））の局所相同性アルゴリズムを用いて行うことができる。配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムはＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））ｏｙｏｂｉＳｈｐａｅｒ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３８：１７９−１９１（１９９６））に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｗｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公的に入手可能である。
【００１７】
また、本発明において、エストロゲン応答配列が付加される外来遺伝子としては、タンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡが好適に使用され、当該外来遺伝子の種類については本発明のウイルスベクターの用途に応じて適宜設定される。例えば、本発明のウイルスベクターを医薬用途で使用する場合には、目的の疾患の治療に有効なタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡを使用すればよい。また、例えば、本発明のウイルスベクターを、薬効又は機能の評価、或いは薬剤スクリーニングの目的で使用する場合には、評価対象又はスクリーニングの候補物質となるタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡを使用すればよい。
【００１８】
本発明のウイルスベクターは、癌細胞に対する外来遺伝子の導入に適しているので、挿入される外来遺伝子としては、癌抑制遺伝子が好適に使用される。癌抑制遺伝子としては、具体的には、ｐ５３遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、インターロイキン−１２遺伝子、Ｂ７遺伝子、ＲＢ遺伝子(ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｅｎｅ)、ＢＲＣＡ２遺伝子、ＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ）遺伝子等が挙げられる。これらの中でも、とりわけｐ５３遺伝子は、本発明のウイルスベクターによって癌細胞に対する導入効率が格段に向上するので、上記外来遺伝子として特に好適に使用される。ｐ５３遺伝子の塩基配列としては、具体的には、塩基配列３に示す塩基配列を含むものが挙げられる。
【００１９】
本発明のウイルスベクターにおいて、挿入される外来遺伝子は、野生型遺伝子であっても、また野生型遺伝子に変異を加えられた変異型遺伝子であってもよい。例えば、導入する遺伝子が、疾患の治療に有効なタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡである場合には、その遺伝子産物のアミノ酸配列における数個、或いは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されており、且つ、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する変異遺伝子産物をコードしている変異遺伝子であってもよい。具体的には、変異遺伝子産物がアミノ酸の置換及び／又は挿入の変異を伴う場合であれば、その置換及び／又は挿入されたアミノ酸の数としては、例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個が挙げられる。また、変異遺伝子産物がアミノ酸の欠失の変異を伴う場合であれば、その欠失されたアミノ酸の数としては、例えば、例えば１〜９０個、好ましくは１〜８５個、更に好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜７５個が挙げられる。変異遺伝子産物がアミノ酸の欠失の変異を伴う場合の好適な例として、Ｎ末端及びＣ末端側の少なくとも一方が末端欠失されているものが挙げられる。遺伝子産物であるタンパク質又はペプチドのＮ末端側を末端欠失させる場合、必要に応じて、当該タンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡの５’末端に開始コドンを挿入しておくことが望ましい。
【００２０】
本発明において外来遺伝子としてｐ５３の変異型遺伝子を使用する場合、その好適な例として、配列番号３に示される塩基配列における１〜１６５位のｐ５３Ｎ末端側をコードしている領域、及び１１４４〜１１８２位のｐ５３Ｃ末端側をコードしている領域の内、少なくとも何れか一方、好ましくはこれらの双方を欠失している遺伝子が例示される。当該ｐ５３の変異型遺伝子として、配列番号３に示される塩基配列における１〜１６５位のｐ５３Ｎ末端側をコードしている領域を欠失させる場合には、１６６位の塩基の５’末端に開始コドンを付加しておくことが望ましい。
【００２１】
また、本発明のウイルスベクターにおいて、挿入される外来遺伝子は、野生型遺伝子の塩基配列に相補する塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ野生型遺伝子と同等の活性を有する遺伝子産物（タンパク質又はペプチド）をコードしているＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、前述する条件と同様である。更に、挿入される外来遺伝子は、野生型遺伝子の塩基配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有し、且つ野生型遺伝子と同等の活性を有する遺伝子産物（タンパク質又はペプチド）をコードしているＤＮＡであってもよい。ここで、塩基配列の「同一性」については、前述する算定法により求めることができる。
【００２２】
本発明のウイルスベクターにおいて、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子を使用する場合、コドン７２（配列番号３における２１４〜２１６位の塩基配列）は野生型であるプロリンをコードしているもの（例えば、ＣＣＣ）であってもよく、また多型として高い頻度で認められるアルギニンをコードしているものであってもよい。本発明のウイルスベクターに組み込まれたｐ５３遺伝子のコドン７２がプロリンをコードしている場合、エストロゲン受容体を発現している癌細胞に対して、格段に優れた遺伝子導入効率を実現することができる。また、本発明のウイルスベクターに組み込まれたｐ５３遺伝子のコドン７２がアルギニンをコードしている場合、エストロゲン受容体を発現していない癌細胞に対して、格段に優れた遺伝子導入効率を実現することができる。
【００２３】
本発明のウイルスベクターにおいて、外来遺伝子は、その５’末端（開始コドンの５’末端）にエストロゲン応答配列が付加されていればよい。外来遺伝子の５’末端とエストロゲン応答配列の３’末端が直接連結されていることが望ましいが、外来遺伝子の５’末端とエストロゲン応答配列の３’末端がリンカー配列（例えば、１〜２０塩基程度からなる塩基配列）を介して連結されていてもよい。ここで、リンカー配列とは、外来遺伝子とエストロゲン応答配列とを連結するために使用される任意の塩基配列であればよく、プロモーターやエンハンサー等の機能性を有する塩基配列は含まれない。外来遺伝子とエストロゲン応答配列とを連結するには、プライマー配列に含めPCRで増幅する方法等の公知の手法で行うことができる。
【００２４】
本発明のウイルスベクターは、エストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子を、当該ウイルスベクターのプロモーターに作動可能に連結されていればよい。ここで、「作動可能」とは、プロモーターと外来遺伝子との間の機能的関係をいい、当該プロモーターによって外来遺伝子の転写がコントロールされる状態といえる。一般に、作動可能に連結している塩基配列は互いに隣接している。エストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子をウイルスベクターに組み込むには、当該技術分野で公知の組み換え技術を使用して行うことができる。使用するウイルスベクターにマルチクローニングサイトが存在するのであれば、当該マルチクローニングサイトにエストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子を挿入すればよい。
【００２５】
本発明のウイルスベクターは、エストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子、及びプロモーター以外に、複製開始点、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー等を含んでいてもよい。
【００２６】
本発明のウイルスベクターの種類については、特に制限されず、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンビスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＳＶ４０等のウイルスベクターが挙げられる。これらのウイルスベクターの中でも、アデノウイルスベクターは、細胞内への外来遺伝子の導入効率が高く、ヒトの遺伝子治療に使用する場合であっても安全性が高いため、本発明において好適に使用される。
【００２７】
アデノウイルスベクターの場合には、Ｅ１領域が欠失しているアデノウイルスベクター、Ｅ１及びＥ３領域が欠失しているアデノウイルスベクター、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４領域が欠失しているアデノウイルスベクター、又はヘルパー依存性アデノウイルスベクターであってもよい。
【００２８】
本発明のウイルスベクターは、外来遺伝子の導入対象となる細胞に接触させることにより、細胞内に外来遺伝子を導入することができる。
【００２９】
本発明のウイルスベクターの適用対象となる細胞の種類は、特に制限されず、いかなる由来であってもよく、また正常細胞であっても、癌細胞であってもよい。とりわけ、本発明のウイルスベクターは、癌細胞内に外来遺伝子を導入するのに好適である。本発明のウイルスベクターの適用対象となる癌細胞としては、特に制限されないが、例えば、子宮体癌細胞、子宮頸癌細胞、大腸癌細胞、皮膚癌細胞等が挙げられる。これらの癌細胞の中でも、子宮体癌細胞は、外来遺伝子の導入効率を一層向上させ得るので、本発明において特に好適な適用対象細胞である。
【００３０】
本発明のウイルスベクターを医薬用途で使用する場合には、遺伝子治療ベクターとして、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで細胞または組織に導入され得る。
【００３１】
本発明のウイルスベクターを細胞内に導入する方法としては、導入形式（インビボ、インビトロ、又はエクスビボ）、適用対象となる細胞の種類等に応じて適宜設定すればよく、通常のウイルスベクターと同じ条件を採用することができる。
【００３２】
本発明のウイルスベクターは、組み込まれている外来遺伝子の種類に応じた各種の用途に使用される。例えば、疾患の治療に有効な外来遺伝子を使用している場合には、遺伝子治療用医薬として使用される。また、例えば、薬効又は機能の評価が求められている外来遺伝子を使用している場合には、薬効又は機能の評価のための試験材料として使用される。また、例えば、薬剤スクリーニングの候補物質をコードしている外来遺伝子を使用している場合には、薬剤スクリーニングのためのスクリーニングツールとして使用される。
【００３３】
２．融合遺伝子
本発明は、更に、エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加されたｐ５３遺伝子又はその変異体からなる融合遺伝子を提供する。当該融合遺伝子は、ウイルスベクターに挿入され、癌の遺伝子治療に使用することができる。当該融合遺伝子に使用されるエストロゲン配列、ｐ５３遺伝子又はその変異体、リンカー配列等については、前述する通りである。また、当該融合遺伝子が挿入されるウイルスベクターの種類等についても、前述する通りである。
【００３４】
３．医薬組成物
上記ウイルスベクターが、外来遺伝子として、疾患の治療に有効な外来遺伝子（例えば、疾患の治療に有効なタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡ、或いは疾患の治療に有効なｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに転写されるＤＮＡ等）を含む場合には、上記ウイルスベクターは、医薬組成物として提供することができる。即ち、当該医薬組成物は遺伝子治療の用途で使用される。
【００３５】
特に、上記ウイルスベクターは癌細胞に対する導入効率が高いことを鑑みれば、当該医薬組成物は、癌の治療用途に好適に使用される。癌の治療用途に使用する場合には、外来遺伝子として癌抑制遺伝子を含む上記ウイルスベクターを使用すればよい。癌抑制遺伝子としては、ｐ５３遺伝子又はその変異体が特に好適に使用される。また、当該医薬組成物を癌の治療用途に使用する場合、その対象となる癌については、特に制限されず、例えば、子宮体癌、子宮頸癌、大腸癌、皮膚癌等が挙げられる。これらの癌の中でも、好ましくは子宮体癌が例示される。
【００３６】
また、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを癌の治療に使用する場合、コドン７２がコードするアミノ酸の種類と導入対象となる癌細胞のタイプによって遺伝子導入効率が変わり得るので、癌の治療効果を高めるために、癌患者が保有する癌細胞のエストロゲン受容体の発現の有無に応じて、５３遺伝子又はその変異体におけるコドン７２がプロリンをコードしているアミノ酸の種類を設定することが望ましい。
【００３７】
即ち、先ず、癌患者から癌組織の一部を採取して、当該癌組織に含まれる癌細胞において、エストロゲン受容体の発現の有無を測定する。エストロゲン受容体の発現の有無は、例えば、細胞内ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を作用させてcDNAを作製し、エストロゲン受容体遺伝子を検出するためのＴａｑＭａｎプローブ及びプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲに供してエストロゲン受容体遺伝子の増幅が認められるか否かで判定できる。次いで、癌患者が保有する癌細胞がエストロゲン受容体を発現している場合、コドン７２がプロリンをコードしているｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを癌の治療に使用することが好ましい。また、癌患者が保有する癌細胞がエストロゲン受容体を発現していない場合、コドン７２がアルギニンをコードしているｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを癌の治療に使用することが好ましい。従来、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有していない癌患者は、通常の抗癌剤が十分な薬効を示さない傾向がみられていたが、コドン７２がアルギニンをコードしているｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを利用することにより、当該患者に対して有効な癌治療を行うことが可能になる。
【００３８】
当該医薬組成物を用いて上記ウイルスベクターを細胞に導入するには、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで細胞又は組織に上記ウイルスベクターを接触させればよい。より具体的には、インビボで上記ウイルスベクターを細胞に導入するのであれば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所注入、腹腔内投与、経皮又は経粘膜投与等により、当該医薬組成物を投与すればよい。
【００３９】
当該医薬組成物は、上記ウイルスベクターの他に、薬学的に許容される担体や添加剤を含むことができる。遺伝子治療に使用される医薬組成物の好適な製剤としては、水性又は非水性の等張な無菌の注射液剤が挙げられ、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。
【００４０】
当該医薬組成物の投与量は、対象となる疾患の種類やその重篤度、患者の年齢や体重等に応じて、目的の治療効果を奏させるのに適した量を適宜設定すればよく、動物実験の結果に基づいて適宜設定することが望ましい。また、当該医薬組成物の投与回数は、目的の治療効果を奏させるのに十分な回数であればよい。例えば、１回の投与であってもよいが、組み込まれる外来遺伝子のコピー数を増加させ、より広範囲の細胞に導入させるために、複数回投与してもよい。
【実施例】
【００４１】
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、本明細書及び図面において、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子をｐ５３Ｒｃ又はｐ５３Ｒ；コドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子をｐ５３Ｐｃ又はｐ５３Ｐ；コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているものをＥＲＥｐ５３Ｒｃ又はＥＲＥｐ５３Ｒ；コドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているものをＥＲＥｐ５３Ｐｃ又はＥＲＥｐ５３Ｐと略記することもある。
【００４２】
実施例１：エストロゲン応答配列が付加されたｐ５３遺伝子を含むウイルスベクターの感染試験（１）
１．実験材料及び方法
（１）プラスミド
ヒト絨毛膜組織由来の全ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによってヒトｃＤＮＡを得た。ＰｆｕＵｌｔｒａ ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、フォワードプライマー（ＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＴ：配列番号４）及びリバースプライマー（ＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴ：配列番号５）を利用して、断片化ｐ５３の遺伝子（配列番号３における第１６６〜１１４３位の塩基配列からなる遺伝子（但し、２１４〜２１６位の塩基はＣＧＣである））を増幅させた。得られた断片化ｐ５３の遺伝子に対して、ＥｃｏＲ１サイト、エストロゲン応答配列、及び５’末端での開始コドンを付加するために、５’末端での開始コドンを付加し、更にＥｃｏＲ１サイトを結合させるために、フォワードプライマー（ＧＡＡＴＴＣＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＴ：配列番号６）、及びリバースプライマー（ＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴ：配列番号７）を用いて増幅を行い、エストロゲン応答配列結合の断片化ｐ５３遺伝子（配列番号３における第１６６〜１１４３位の塩基配列の３’末端に開始コドンが付加され、且つＥｃｏＲ１サイトが連結されている遺伝子）を調製した。また、別途、得られた断片化ｐ５３の遺伝子に対して、ＥｃｏＲ１サイト及び５’末端での開始コドンを付加するために、フォワードプライマー（ＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＴ：配列番号８）、及びリバースプライマー（ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴ：配列番号９）を用いて増幅を行いエストロゲン応答配列未結合の断片化ｐ５３遺伝子を調製した。得られた各ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αにトランスフェクトした。増幅させたプラスミドをＥｃｏＲ１で消化し、ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（ＨＡタグとｈｒＧＦＰの付いたシャトルベクター）にライゲートし、当該シャトルベクターの発現カセットに目的遺伝子をサブクローニングした。なお、断片化ｐ５３遺伝子のコドン７２がアルギニン（ＣＧＣ）であったため、ｐ５３のコドン７２の変種を作製するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、プライマー（ＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣ：配列番号１０、及びＣＧＴＧＣＡＡＧＴＣＡＣＡＧＡＣＴＴ：配列番号１１）で、絨毛膜組織由来のｃＤＮＡ中の対応するアルギニン変種（ＣＧＣ）をプロリン変種（ＣＣＣ）に変換したものも作製した。
【００４３】
（２）組み換えアデノウイルス
ＡｄＥａｓｙTMＸＬアデノウイルスベクターシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、エストロゲン応答配列結合又は未結合の断片化ｐ５３遺伝子を含むシャトルベクターと、ｐＡｄＥａｓｙ−１ベクターを大腸菌（ＢＪ５１８３株）に同時に形質転換し、相同性組換えを誘発することにより、目的遺伝子を含む発現カセットをアデノウイルスのゲノム内へ移行させ、組み換えアデノウイルスを調製した。
【００４４】
（３）ＰＣＲによるアデノウイルスの定量
培養細胞に感染するアデノウイルスは、Ａｄ ｐｒｅｐを用いた遠心分離にて精製した。次いで、０．６％ ＳＤＳなどを加えてタンパクを可溶化し、５Ｍ ＮａＣｌによる沈殿後に冷エタノールによる沈殿、０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ及び０．２％ＳＤＳを含む溶液での消化、及びフェノール／クロロホルムでの抽出により、ＤＮＡを分離した。
【００４５】
アデノウイルスＤＮＡのＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを行うために、フォワードプライマー（ＧＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡ：配列番号１２）、リバースプライマー（ＡＧＧＴＡＧＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＴ：配列番号１３）、及びＴａｑＭａｎプローブが結合したＤＮＡ配列（ＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡ：配列番号１４）を準備した。これらは、それぞれｐ５３遺伝子の３’末端結合領域、及びシャトルベクターのＸｈｏクローニングサイトに対応している。
【００４６】
（４）癌細胞株の培養、及び組み換えアデノウイルスの感染
子宮体癌細胞株としてＨＨＵＡ細胞及びＫＬＥ細胞を用いた。また、結腸癌としてＳＷ４８細胞を用いた。
【００４７】
ＨＨＵＡ細胞は、Ｉｓｈｉｗａｔａ等によって樹立された子宮体癌細胞株であり、理化学研究所から入手した。当該ＨＨＵＡ細胞は、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）を発現することが分かっている（Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９８４； Ｚｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。また、ＫＬＥ細胞は、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社から入手した。当該ＫＬＥ細胞は、エストロゲン受容体を発現しないことが分かっている。ＨＨＵＡ細胞及びＫＬＥ細胞は、１５％ ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を添加したＦ−１２／ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養した。
【００４８】
ＳＷ４８細胞は、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社から入手した。当該ＳＷ４８細胞は、ＥＲβを発現することが分かっている。１５％ ＦＢＳを添加したｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍで、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養した。
【００４９】
癌細胞に対する前記組み換えアデノウイルスの感染は、１×１０5/ｃｍ2の癌が底面に生着しているシャーレの培養液に、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養することにより行った。
【００５０】
（５）フローサイトメトリー
アデノウイルスで癌細胞を感染させてから４８時間後に、癌細胞を０．２５％トリプシン溶液に分散させて、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｋｉｎｓｏｎ社製）と共にインキュベートした。その後、癌細胞を洗浄して、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
【００５１】
アデノウイルスで癌細胞を感染させてから７２時間後に、癌細胞を０．２５％トリプシン溶液に分散させて、５μｇ／ｍｌのＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）と共にインキュベートした。その後、癌細胞を洗浄して、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
【００５２】
（６）ＲＴ-ＰＣＲ分析
（ ）を用いて、アデノウイルス感染後７２時間の細胞からＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡについてＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲに供して、ｐ５３遺伝子量を測定することにより、細胞に感染したアデノウイルス量を定量した。ｐ５３遺伝子量は、予め、既知のコピー数を持つｐ５３遺伝子を用いてコピー数とＰＣＲのサイクル数との関係を示す検量線を作製することにより、サンプルの増幅曲線からコピー数を算出することにより行った。
ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）を用いて、アデノウイルス感染後７２時間の細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを逆転写した後に、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲにより、ｐ５３ｍＲＮＡ量を分析した。ｐ５３ｍＲＮＡ量は、細胞内で一定濃度存在すると考えられる１８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡの発現量に対するｐ５３Ｒｃが挿入されたアデノウイルスを感染させた細胞の1検体における該当ｍＲＮＡ量比を１とした場合の相対値として算出した。
【００５３】
２．結果
図１に、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子（ｐ５３Ｒｃ）、コドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子（ｐ５３Ｐｃ）、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの（ＥＲＥｐ５３Ｒｃ）、又はコドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの（ＥＲＥｐ５３Ｐｃ）が挿入されたアデノウイルスをＨＨＵＡ細胞に感染させて、４８時間後にＧＦＰ蛍光を示す細胞を観察した結果を示す。図１から明らかなように、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ＧＦＰの蛍光を示す細胞が顕著に多く、ｐ５３Ｒｃ、ｐ５３Ｐｃ、及びＥＲＥｐ５３Ｒｃに比してアデノウイルスの感染率が高いことが確認された。この結果から、ＥＲβを発現しているＨＨＵＡ細胞に対して、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスの感染率が顕著に高いことが確認された。
【００５４】
また、図２に、ｐ５３Ｒｃ、ｐ５３Ｐｃ、ＥＲＥｐ５３Ｒｃ、及びＥＲＥｐ５３Ｐｃが挿入されたアデノウイルスをＫＬＥ細胞に感染させて、４８時間後にＧＦＰ蛍光を示す細胞を観察した結果を示す。図２から明らかなように、ＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ＧＦＰの蛍光を示す細胞が顕著に多かった。即ち、ＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスは、ＥＲβを発現していないＫＬＥ細胞に対して、アデノウイルスの感染率が顕著に高いことが確認された。
【００５５】
図１及び２に示す結果から、エストロゲン受容体を発現している細胞に対してはＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスの感染率が高く、また、エストロゲン受容体を発現していない細胞に対してはＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスの感染率が高いことが明らかとなった。
【００５６】
図３に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞の内、ＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。図２から分かるようにＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスで感染させたＨＨＵＡ細胞では、ＧＦＰ陽性細胞の割合が顕著に高い値を示していた。
【００５７】
図４に、アデノウイルスの感染から４８時間後のＨＨＵＡ細胞の内、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。また、図５に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞の内、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖはアポトーシスの初期段階の検出指標、PIはアポトーシスの後期段階の指標となるマーカーである。図４及び５から明らかなように、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞及びＰＩ陽性細胞の割合が高く、アポトーシスが効率的に誘導されていることが確認された。この結果は、図１に示す結果とも整合しており、エストロゲン受容体を発現している細胞に対してはＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスの感染率が高く、導入された遺伝子が感染細胞内で機能発現していることの証左となっている。
【００５８】
図６に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞、ＳＷ４８細胞、及びＫＬＥ細胞について、アデノウイルス感染量（ｐ５３遺伝子量）を測定した結果を示す。この結果からも、ＨＨＵＡ細胞及びＳＷ４８細胞では、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを感染させた場合に、感染率が顕著に高くなっていた。また、ＫＬＥ細胞では、ＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを感染させた場合に、感染率が顕著に高くなっていた。また、図７に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞及びＫＬＥ細胞内のｐ５３ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。ｐ５３ｍＲＮＡの発現量の測定結果も、図５に示す結果と同じ傾向になっていた。即ち、図６及び７の結果から、エストロゲン受容体を発現している細胞に対する感染にはＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスが有効であり、エストロゲン受容体を発現していない細胞に対する感染にはＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスが有効であることが裏付けられた。
【００５９】
実施例２：エストロゲン応答配列が付加されたｐ５３遺伝子を含むウイルスベクターの感染試験（２）
１．実験材料及び方法
（１）組み換えアデノウイルス
実施例１と同様の方法で、ｐ５３Ｒｃ、ｐ５３Ｐｃ、ＥＲＥｐ５３Ｒｃ、又はＥＲＥｐ５３Ｐｃが挿入されたアデノウイルスを作製した。
【００６０】
（２）癌細胞株の培養、及び組み換えアデノウイルスの感染
実施例１と同様の方法で、ＨＨＵＡ細胞を培養した。
【００６１】
培養したＨＨＵＡ細胞を下記３群に分けて、組み換えアデノウイルスの感染を行った。
未処置群
１×１０5/ｃｍ2のＨＨＵＡ細胞が底面に生着しているシャーレの培養液（に、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養することにより行った。
エストラジオール添加群
１×１０5/ｃｍ2のＨＨＵＡ細胞が底面に生着しているシャーレの培養液に、１×１０9Ｍのエストラジオール（和光純薬工業株式会社）を添加し、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養することにより行った。
Ｘ線照射群
１×１０5/ｃｍ2のＨＨＵＡ細胞が底面に生着しているシャーレの培養液に、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養し、アデノウイルス添加から２４時間後に、１５０ｋＶで１０ＧｙのＸ線を照射して、引き続き培養を行った。
【００６２】
（３）フローサイトメトリー
各群のアデノウイルス感染後４８時間のＨＨＵＡ細胞について、実施例１と同様の方法で、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを用いた染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
【００６３】
また、各群のアデノウイルス感染後７２時間のＨＨＵＡ細胞について、実施例１と同様の方法で、ＰＩを用いた染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
【００６４】
（４）ＲＴ-ＰＣＲ分析
各群のアデノウイルス感染後７２時間のＨＨＵＡ細胞について、実施例１と同様の方法で、細胞内ｐ５３ｍＲＮＡ量及びｐ３００ｍＲＮＡ量を測定した。ｐ５３ｍＲＮＡ量及びｐ３００ｍＲＮＡ量は、細胞内で一定濃度存在すると考えられる１８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡの発現量に対するｐ５３Ｒｃが挿入されたアデノウイルスを感染させた未処置群の細胞の1検体における該当ｍＲＮＡ量比を１とした場合の相対値として算出した。
【００６５】
２．実験結果
図８に、アデノウイルスの感染から４８時間後の各群のＨＨＵＡ細胞について、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。また、図９に、アデノウイルスの感染から７２時間後の各群のＨＨＵＡ細胞について、ＰＩ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。この結果から、実施例１での結果と同様に、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞及びＰＩ陽性細胞の割合が高く、アポトーシスが効率的に誘導されていることが確認された。また、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の間では、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞及びＰＩ陽性細胞の割合については、有意な差がなかったことから、本発明のウイルスベクターによる感染と感染細胞内での機能発現は、感染時のエストロゲンやＸ線照射の有無には影響されないことが分かった。
【００６６】
また、図１０に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞内のｐ５３ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。ｐ５３ｍＲＮＡの発現量の測定結果も、図９に示す結果と同様に、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の間では、ｐ５３ｍＲＮＡ量については、有意な差は認められなかった。
【００６７】
また、図１１に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞内のｐ３００ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。ｐ３００は、ｐ５３の分解に寄与することが知られているタンパク質である。ＥＲＥｐ５３Ｐｃ又はＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを感染した場合には、ｐ５３Ｐｃ又はｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを感染した場合と比較して、ｐ３００ｍＲＮＡ量が少なくなっていた。また、ｐ３００ｍＲＮＡ量も、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の間では有意な差は認められなかった。即ち、本結果から、ＥＲＥｐ５３Ｐｃ又はＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスは、感染時のエストロゲンやＸ線照射の有無には影響されず、感染した細胞内でｐ５３が有効に機能していることが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率を高めたウイルスベクターに関する。また、本発明は、当該ウイルスベクターを用いた、遺伝子治療用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮体癌は、世界的にも発生患者数が増加しており、術後に有効な補助療法が必要とされる一方、若年者や未産婦に対しては手術以外の治療法の開発も望まれている。妊孕性の温存希望の患者の場合には、黄体ホルモン剤が使用され、十分な治療効果が得られるケースが多くないが、腫瘍が消失してその後に出産し再発も見られず経過した患者では、黄体ホルモン投与中の子宮体癌組織にがん抑制遺伝子産物ｐ５３が増加していることが確認されている。ｐ５３の生体内でのメカニズムについては十分に解明されておらず、ｐ５３が抗腫瘍効果に直接的に関与しているか、或いはｐ５３によって黄体ホルモンの作用が抗腫瘍効果を奏しやすいものに変化したのかは、明らかではないが、ｐ５３の発現が癌の治療効果に関わっていると考えられている。
【０００３】
黄体ホルモンが、エストロゲンの作用で増殖した正常の子宮内膜組織を分泌期の状態に変化させて細胞増殖を止める役割を果たすことが知られているが、子宮内膜細胞が癌化してできたと考えられる子宮体癌が黄体ホルモンによって増殖を停止する程度に影響を受ける場合は、培養細胞でも実際の症例検討でも稀である。黄体ホルモンの正常子宮内膜に対する増殖抑制と分泌期への移行作用には、エストロゲンが先に作用している条件下で現れることからも、ホルモンだけの作用でなく、細胞周期の制御を担っているｐ５３も関与していると考えられている。
【０００４】
一方、癌の治療の試みとして遺伝子治療が１９９０年代からなされている。特に、アデノウイルスベクターを使用することにより、挿入遺伝子の発現量が他のベクターに比べて多く、また細胞の染色体に組み込まれないため安全性が高いと評価されている（非特許文献１−３参照）。しかしながら、遺伝子治療は、癌の治療への臨床的応用では期待されたほど効果が得られ難く、抗癌剤による化学療法との併用効果が報告されているものの（非特許文献４参照）、単独療法として確立するに至っていないのが現状である。有効な遺伝子治療が確立されていない要因として、癌細胞に対する遺伝子導入効率が低く、治療有効量の導入遺伝子を細胞内で発現できないことが挙げられる。このような従来技術を背景として、細胞内への遺伝子導入効率に優れ、遺伝子治療に有効なベクターを開発することが切望されている。
【０００５】
なお、従来、エストロゲン応答配列をアデノウイルスベクターに組み込むことにより、挿入遺伝子の発現をコントロールできることが報告されている。例えば、非特許文献５には、エストロゲン応答配列を含むプロモーターを導入したアデノウイルスベクターを使用することにより、エストロゲンレセプターを発現する細胞において挿入遺伝子の転写活性を向上できることが報告されている。また、特許文献１には、エストロゲン応答配列を組み込んだベクターを利用することによってベクターに挿入されたレポータータンパク質の発現量からエストロゲンの量を定量評価できることが報告されている。しかしながら、これらの技術において、エストロゲン応答配列は、挿入遺伝子の発現を制御するプロモーターの上流に配置されており、ベクター内で挿入遺伝子に付加された状態で存在するものではない。また、これらの技術は、あくまでエストロゲンレセプターの存在下でエンハンサーとして機能させる目的でエストロゲン応答配列を使用しているに過ぎず、エストロゲンレセプターの有無に拘わらず遺伝子導入効率を高めるために、エストロゲン応答配列を使用できるか、或いはどのような態様で使用できるかを示唆するものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】藤原俊義、遺伝子改変アデノウイルスによる固形癌治療、日本臨床 ６８（８）：６２７−６３３、２０１０
【非特許文献２】斉藤泉、遺伝子治療のベクター：アデノウイルスベクター、蛋白質核酸酵素 ４２（１０）：１７９８−１８０５、１９９７
【非特許文献３】Ｘｉｎ Ｙｕａｎ Ｌｉｕ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｅ−ｖｏｒｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｓｐｅｒｉｔｙ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：８７９−８８６、２００６
【非特許文献４】Ｋｈｕｒｉ ＦＲ．ｅｔ ａｌ．，Ａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ＯＮＹＸ−０１５，ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．６：８７９−８８５，２０００
【非特許文献５】Ｒｕｂｅｎ Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｃｏｃｅｂａ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｏｖｅｌ，ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｈａｔ ａｌｌｏｗｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ１ａ−ｄｅｌｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：２００９−２０２４，２０００
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２９７３５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率を高めたウイルスベクターを提供することを目的とする。更に、本発明は、当該ウイルスベクターを使用し、癌をはじめとする各種疾患の遺伝子治療に有効な医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、驚くべくことに、エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子を組み込んだウイルスベクターは、細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率が顕著に向上することを見出した。また、前記外来遺伝子として、ｐ５３遺伝子又はその変異体を使用する場合には、コドン７２がプロリンであればエストロゲン受容体を発現している細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に向上し、またコドン７２がアルギニンであればエストロゲン受容体を発現していない細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に向上することを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする、ウイルスベクター。
項２．外来遺伝子が癌抑制遺伝子である、項１に記載のウイルスベクター。
項３．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体である、項１又は２に記載のウイルスベクター。
項４．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がプロリンをコードしている、項１乃至３のいずれかに記載のウイルスベクター。
項５．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がアルギニンをコードしている、項１乃至３のいずれかに記載のウイルスベクター。
項６．アデノウイルスベクターである、項１乃至５のいずれかに記載のウイルスベクター。
項７．外来遺伝子の５’末端にエストロゲン応答配列の３’末端に直接結合している、項１乃至６のいずれかに記載のウイルスベクター。
項８．項１乃至７のいずれかに記載のウイルスベクターを含む、医薬組成物。
項９．遺伝子治療に使用される、項８に記載の医薬組成物。
項１０．外来遺伝子としてｐ５３遺伝子又はその変異体を含有するウイルスベクターを含み、癌の治療に使用される、項８又は９に記載の医薬組成物。
項１１．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がプロリンをコードしており、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有する癌患者に対して適用される、項１０に記載の医薬組成物。
項１２．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がアルギニンをコードしており、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有していない癌患者を保有する癌患者に対して適用される、項１０に記載の医薬組成物。
項１３．エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加されたｐ５３遺伝子又はその変異体からなる、融合遺伝子。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のウイルスベクターによれば、外来遺伝子を効率的に細胞内に導入できるので、細胞の形質転換効率を向上させ、ひいては細胞内での外来遺伝子の発現量を増加させることができる。
【００１２】
とりわけ、本発明のウイルスベクターは、癌細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に優れており、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子等の癌抑制遺伝子を使用することにより、癌の遺伝子治療に好適に用いられる。また、本発明のウイルスベクターにおいて、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子を使用する場合、コドン７２がプロリンであればエストロゲン受容体を発現している癌細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に高く、またコドン７２がアルギニンであればエストロゲン受容体を発現していない癌細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に高い。そのため、本発明のウイルスベクターにおいて外来遺伝子としてｐ５３遺伝子を組み込んで癌の治療剤として使用する場合、癌患者の病因となっている癌細胞におけるエストロゲン受容体の発現の有無に応じて、ｐ５３遺伝子のコドン７２がコードするアミノ酸の種類を設定することにより、癌細胞のタイプに応じた最適な癌治療の方策を講じることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１において、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子（ｐ５３Ｒｃ）、コドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子（ｐ５３Ｐｃ）、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの（ＥＲＥｐ５３Ｒｃ）、又はコドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの（ＥＲＥｐ５３Ｐｃ）が挿入されたアデノウイルスをＨＨＵＡ細胞に感染させて、４８時間後にＧＦＰ蛍光を発現している細胞を観察した結果を示す。
【図２】実施例１において、ｐ５３Ｒｃ、ｐ５３Ｐｃ、ＥＲＥｐ５３Ｒｃ又はＥＲＥｐ５３Ｐｃが挿入されたアデノウイルスをＫＬＥ細胞に感染させて、４８時間後にＧＦＰ蛍光を発現している細胞を観察した結果を示す。
【図３】実施例１において、アデノウイルスの感染から７２時間後に、フローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。
【図４】実施例１において、アデノウイルスの感染から４８時間時間後に、フローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞中のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。
【図５】実施例１において、アデノウイルスの感染から７２時間後に、フローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞中のＰＩ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。
【図６】実施例１において、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞、ＳＷ４８細胞、及びＫＬＥ細胞について、アデノウイルス感染量（ｐ５３遺伝子量）を測定した結果を示す。
【図７】実施例１において、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞及びＫＬＥ細胞内のｐ５３ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。
【図８】実施例２において、アデノウイルスの感染から４８時間後に、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の各ＨＨＵＡ細胞について、フローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞中のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。
【図９】実施例２において、アデノウイルスの感染から４８時間後に、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の各ＨＨＵＡ細胞について、フローサイトメーターでＧＦＰ陽性細胞中のＰＩ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。
【図１０】実施例２において、アデノウイルスの感染から７２時間後に、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の各ＨＨＵＡ細胞について、ｐ５３ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。
【図１１】実施例２において、アデノウイルスの感染から７２時間後に、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の各ＨＨＵＡ細胞について、ｐ３００ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．ウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする。以下に、本発明のウイルスベクターについて、詳細に説明する。
【００１５】
本発明において、エストロゲン応答配列は、ＥＲＥ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）とも称される塩基配列であり、エストロゲンレセプターによって転写活性が調節される標的遺伝子の転写調節領域に存在し、エストロゲンとエストロゲンレセプターとの複合体が、該配列を認識することにより、エストロゲン依存的に標的遺伝子の転写を促進する機能を有している。本発明で使用されるエストロゲン応答配列としては、具体的には、ＰＳ２、ビテロゲニンA2、補体3遺伝子、ラクトフェリン等の遺伝子の５’上流領域に存在するＥＲＥが挙げられる。本発明で使用されるエストロゲン応答配列は、コンセンサス配列（５’−ＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣ−３’、ｎはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。；配列番号１）を１回以上含む塩基配列である。これらのエストロゲン応答配列は、野生型であってもよく、また遺伝子導入の促進作用を保持していることを限度として変異型であってもよい。本発明で使用されるエストロゲン応答配列の好適一例として、配列番号２に示す塩基配列（５’−ＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＣＣ−３’）が挙げられる。また、本発明で使用されるエストロゲン応答配列の例として、配列番号１又は２に示す塩基配列に相補する塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ外来遺伝子に対する導入促進作用を有する塩基配列が例示される。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列とは、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ及び１．８５ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、２×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で４２℃でハイブリダイゼーション、続いて０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄する条件、又はこれと等価の条件を含む。
【００１６】
また、本発明で使用されるエストロゲン応答配列の一例として、配列番号２に示す塩基配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列が挙げられる。塩基配列の同一性は、２つの塩基配列の間の最適アライメントを決定、比較することによって算定される。塩基配列の最適アライメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０））の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８））の類似性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は検分によって、Ｓｍｉｔｈら（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１））の局所相同性アルゴリズムを用いて行うことができる。配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムはＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））ｏｙｏｂｉＳｈｐａｅｒ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３８：１７９−１９１（１９９６））に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｗｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公的に入手可能である。
【００１７】
また、本発明において、エストロゲン応答配列が付加される外来遺伝子としては、タンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡが好適に使用され、当該外来遺伝子の種類については本発明のウイルスベクターの用途に応じて適宜設定される。例えば、本発明のウイルスベクターを医薬用途で使用する場合には、目的の疾患の治療に有効なタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡを使用すればよい。また、例えば、本発明のウイルスベクターを、薬効又は機能の評価、或いは薬剤スクリーニングの目的で使用する場合には、評価対象又はスクリーニングの候補物質となるタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡを使用すればよい。
【００１８】
本発明のウイルスベクターは、癌細胞に対する外来遺伝子の導入に適しているので、挿入される外来遺伝子としては、癌抑制遺伝子が好適に使用される。癌抑制遺伝子としては、具体的には、ｐ５３遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、インターロイキン−１２遺伝子、Ｂ７遺伝子、ＲＢ遺伝子(ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｅｎｅ)、ＢＲＣＡ２遺伝子、ＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ）遺伝子等が挙げられる。これらの中でも、とりわけｐ５３遺伝子は、本発明のウイルスベクターによって癌細胞に対する導入効率が格段に向上するので、上記外来遺伝子として特に好適に使用される。ｐ５３遺伝子の塩基配列としては、具体的には、塩基配列３に示す塩基配列を含むものが挙げられる。
【００１９】
本発明のウイルスベクターにおいて、挿入される外来遺伝子は、野生型遺伝子であっても、また野生型遺伝子に変異を加えられた変異型遺伝子であってもよい。例えば、導入する遺伝子が、疾患の治療に有効なタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡである場合には、その遺伝子産物のアミノ酸配列における数個、或いは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されており、且つ、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する変異遺伝子産物をコードしている変異遺伝子であってもよい。具体的には、変異遺伝子産物がアミノ酸の置換及び／又は挿入の変異を伴う場合であれば、その置換及び／又は挿入されたアミノ酸の数としては、例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個が挙げられる。また、変異遺伝子産物がアミノ酸の欠失の変異を伴う場合であれば、その欠失されたアミノ酸の数としては、例えば、例えば１〜９０個、好ましくは１〜８５個、更に好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜７５個が挙げられる。変異遺伝子産物がアミノ酸の欠失の変異を伴う場合の好適な例として、Ｎ末端及びＣ末端側の少なくとも一方が末端欠失されているものが挙げられる。遺伝子産物であるタンパク質又はペプチドのＮ末端側を末端欠失させる場合、必要に応じて、当該タンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡの５’末端に開始コドンを挿入しておくことが望ましい。
【００２０】
本発明において外来遺伝子としてｐ５３の変異型遺伝子を使用する場合、その好適な例として、配列番号３に示される塩基配列における１〜１６５位のｐ５３Ｎ末端側をコードしている領域、及び１１４４〜１１８２位のｐ５３Ｃ末端側をコードしている領域の内、少なくとも何れか一方、好ましくはこれらの双方を欠失している遺伝子が例示される。当該ｐ５３の変異型遺伝子として、配列番号３に示される塩基配列における１〜１６５位のｐ５３Ｎ末端側をコードしている領域を欠失させる場合には、１６６位の塩基の５’末端に開始コドンを付加しておくことが望ましい。
【００２１】
また、本発明のウイルスベクターにおいて、挿入される外来遺伝子は、野生型遺伝子の塩基配列に相補する塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ野生型遺伝子と同等の活性を有する遺伝子産物（タンパク質又はペプチド）をコードしているＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、前述する条件と同様である。更に、挿入される外来遺伝子は、野生型遺伝子の塩基配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有し、且つ野生型遺伝子と同等の活性を有する遺伝子産物（タンパク質又はペプチド）をコードしているＤＮＡであってもよい。ここで、塩基配列の「同一性」については、前述する算定法により求めることができる。
【００２２】
本発明のウイルスベクターにおいて、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子を使用する場合、コドン７２（配列番号３における２１４〜２１６位の塩基配列）は野生型であるプロリンをコードしているもの（例えば、ＣＣＣ）であってもよく、また多型として高い頻度で認められるアルギニンをコードしているものであってもよい。本発明のウイルスベクターに組み込まれたｐ５３遺伝子のコドン７２がプロリンをコードしている場合、エストロゲン受容体を発現している癌細胞に対して、格段に優れた遺伝子導入効率を実現することができる。また、本発明のウイルスベクターに組み込まれたｐ５３遺伝子のコドン７２がアルギニンをコードしている場合、エストロゲン受容体を発現していない癌細胞に対して、格段に優れた遺伝子導入効率を実現することができる。
【００２３】
本発明のウイルスベクターにおいて、外来遺伝子は、その５’末端（開始コドンの５’末端）にエストロゲン応答配列が付加されていればよい。外来遺伝子の５’末端とエストロゲン応答配列の３’末端が直接連結されていることが望ましいが、外来遺伝子の５’末端とエストロゲン応答配列の３’末端がリンカー配列（例えば、１〜２０塩基程度からなる塩基配列）を介して連結されていてもよい。ここで、リンカー配列とは、外来遺伝子とエストロゲン応答配列とを連結するために使用される任意の塩基配列であればよく、プロモーターやエンハンサー等の機能性を有する塩基配列は含まれない。外来遺伝子とエストロゲン応答配列とを連結するには、プライマー配列に含めPCRで増幅する方法等の公知の手法で行うことができる。
【００２４】
本発明のウイルスベクターは、エストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子を、当該ウイルスベクターのプロモーターに作動可能に連結されていればよい。ここで、「作動可能」とは、プロモーターと外来遺伝子との間の機能的関係をいい、当該プロモーターによって外来遺伝子の転写がコントロールされる状態といえる。一般に、作動可能に連結している塩基配列は互いに隣接している。エストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子をウイルスベクターに組み込むには、当該技術分野で公知の組み換え技術を使用して行うことができる。使用するウイルスベクターにマルチクローニングサイトが存在するのであれば、当該マルチクローニングサイトにエストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子を挿入すればよい。
【００２５】
本発明のウイルスベクターは、エストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子、及びプロモーター以外に、複製開始点、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー等を含んでいてもよい。
【００２６】
本発明のウイルスベクターの種類については、特に制限されず、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンビスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＳＶ４０等のウイルスベクターが挙げられる。これらのウイルスベクターの中でも、アデノウイルスベクターは、細胞内への外来遺伝子の導入効率が高く、ヒトの遺伝子治療に使用する場合であっても安全性が高いため、本発明において好適に使用される。
【００２７】
アデノウイルスベクターの場合には、Ｅ１領域が欠失しているアデノウイルスベクター、Ｅ１及びＥ３領域が欠失しているアデノウイルスベクター、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４領域が欠失しているアデノウイルスベクター、又はヘルパー依存性アデノウイルスベクターであってもよい。
【００２８】
本発明のウイルスベクターは、外来遺伝子の導入対象となる細胞に接触させることにより、細胞内に外来遺伝子を導入することができる。
【００２９】
本発明のウイルスベクターの適用対象となる細胞の種類は、特に制限されず、いかなる由来であってもよく、また正常細胞であっても、癌細胞であってもよい。とりわけ、本発明のウイルスベクターは、癌細胞内に外来遺伝子を導入するのに好適である。本発明のウイルスベクターの適用対象となる癌細胞としては、特に制限されないが、例えば、子宮体癌細胞、子宮頸癌細胞、大腸癌細胞、皮膚癌細胞等が挙げられる。これらの癌細胞の中でも、子宮体癌細胞は、外来遺伝子の導入効率を一層向上させ得るので、本発明において特に好適な適用対象細胞である。
【００３０】
本発明のウイルスベクターを医薬用途で使用する場合には、遺伝子治療ベクターとして、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで細胞または組織に導入され得る。
【００３１】
本発明のウイルスベクターを細胞内に導入する方法としては、導入形式（インビボ、インビトロ、又はエクスビボ）、適用対象となる細胞の種類等に応じて適宜設定すればよく、通常のウイルスベクターと同じ条件を採用することができる。
【００３２】
本発明のウイルスベクターは、組み込まれている外来遺伝子の種類に応じた各種の用途に使用される。例えば、疾患の治療に有効な外来遺伝子を使用している場合には、遺伝子治療用医薬として使用される。また、例えば、薬効又は機能の評価が求められている外来遺伝子を使用している場合には、薬効又は機能の評価のための試験材料として使用される。また、例えば、薬剤スクリーニングの候補物質をコードしている外来遺伝子を使用している場合には、薬剤スクリーニングのためのスクリーニングツールとして使用される。
【００３３】
２．融合遺伝子
本発明は、更に、エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加されたｐ５３遺伝子又はその変異体からなる融合遺伝子を提供する。当該融合遺伝子は、ウイルスベクターに挿入され、癌の遺伝子治療に使用することができる。当該融合遺伝子に使用されるエストロゲン配列、ｐ５３遺伝子又はその変異体、リンカー配列等については、前述する通りである。また、当該融合遺伝子が挿入されるウイルスベクターの種類等についても、前述する通りである。
【００３４】
３．医薬組成物
上記ウイルスベクターが、外来遺伝子として、疾患の治療に有効な外来遺伝子（例えば、疾患の治療に有効なタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡ、或いは疾患の治療に有効なｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに転写されるＤＮＡ等）を含む場合には、上記ウイルスベクターは、医薬組成物として提供することができる。即ち、当該医薬組成物は遺伝子治療の用途で使用される。
【００３５】
特に、上記ウイルスベクターは癌細胞に対する導入効率が高いことを鑑みれば、当該医薬組成物は、癌の治療用途に好適に使用される。癌の治療用途に使用する場合には、外来遺伝子として癌抑制遺伝子を含む上記ウイルスベクターを使用すればよい。癌抑制遺伝子としては、ｐ５３遺伝子又はその変異体が特に好適に使用される。また、当該医薬組成物を癌の治療用途に使用する場合、その対象となる癌については、特に制限されず、例えば、子宮体癌、子宮頸癌、大腸癌、皮膚癌等が挙げられる。これらの癌の中でも、好ましくは子宮体癌が例示される。
【００３６】
また、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを癌の治療に使用する場合、コドン７２がコードするアミノ酸の種類と導入対象となる癌細胞のタイプによって遺伝子導入効率が変わり得るので、癌の治療効果を高めるために、癌患者が保有する癌細胞のエストロゲン受容体の発現の有無に応じて、５３遺伝子又はその変異体におけるコドン７２がプロリンをコードしているアミノ酸の種類を設定することが望ましい。
【００３７】
即ち、先ず、癌患者から癌組織の一部を採取して、当該癌組織に含まれる癌細胞において、エストロゲン受容体の発現の有無を測定する。エストロゲン受容体の発現の有無は、例えば、細胞内ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を作用させてcDNAを作製し、エストロゲン受容体遺伝子を検出するためのＴａｑＭａｎプローブ及びプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲに供してエストロゲン受容体遺伝子の増幅が認められるか否かで判定できる。次いで、癌患者が保有する癌細胞がエストロゲン受容体を発現している場合、コドン７２がプロリンをコードしているｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを癌の治療に使用することが好ましい。また、癌患者が保有する癌細胞がエストロゲン受容体を発現していない場合、コドン７２がアルギニンをコードしているｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを癌の治療に使用することが好ましい。従来、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有していない癌患者は、通常の抗癌剤が十分な薬効を示さない傾向がみられていたが、コドン７２がアルギニンをコードしているｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを利用することにより、当該患者に対して有効な癌治療を行うことが可能になる。
【００３８】
当該医薬組成物を用いて上記ウイルスベクターを細胞に導入するには、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで細胞又は組織に上記ウイルスベクターを接触させればよい。より具体的には、インビボで上記ウイルスベクターを細胞に導入するのであれば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所注入、腹腔内投与、経皮又は経粘膜投与等により、当該医薬組成物を投与すればよい。
【００３９】
当該医薬組成物は、上記ウイルスベクターの他に、薬学的に許容される担体や添加剤を含むことができる。遺伝子治療に使用される医薬組成物の好適な製剤としては、水性又は非水性の等張な無菌の注射液剤が挙げられ、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。
【００４０】
当該医薬組成物の投与量は、対象となる疾患の種類やその重篤度、患者の年齢や体重等に応じて、目的の治療効果を奏させるのに適した量を適宜設定すればよく、動物実験の結果に基づいて適宜設定することが望ましい。また、当該医薬組成物の投与回数は、目的の治療効果を奏させるのに十分な回数であればよい。例えば、１回の投与であってもよいが、組み込まれる外来遺伝子のコピー数を増加させ、より広範囲の細胞に導入させるために、複数回投与してもよい。
【実施例】
【００４１】
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、本明細書及び図面において、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子をｐ５３Ｒｃ又はｐ５３Ｒ；コドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子をｐ５３Ｐｃ又はｐ５３Ｐ；コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているものをＥＲＥｐ５３Ｒｃ又はＥＲＥｐ５３Ｒ；コドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているものをＥＲＥｐ５３Ｐｃ又はＥＲＥｐ５３Ｐと略記することもある。
【００４２】
実施例１：エストロゲン応答配列が付加されたｐ５３遺伝子を含むウイルスベクターの感染試験（１）
１．実験材料及び方法
（１）プラスミド
ヒト絨毛膜組織由来の全ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによってヒトｃＤＮＡを得た。ＰｆｕＵｌｔｒａ ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、フォワードプライマー（ＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＴ：配列番号４）及びリバースプライマー（ＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴ：配列番号５）を利用して、断片化ｐ５３の遺伝子（配列番号３における第１６６〜１１４３位の塩基配列からなる遺伝子（但し、２１４〜２１６位の塩基はＣＧＣである））を増幅させた。得られた断片化ｐ５３の遺伝子に対して、ＥｃｏＲ１サイト、エストロゲン応答配列、及び５’末端での開始コドンを付加するために、５’末端での開始コドンを付加し、更にＥｃｏＲ１サイトを結合させるために、フォワードプライマー（ＧＡＡＴＴＣＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＴ：配列番号６）、及びリバースプライマー（ＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴ：配列番号７）を用いて増幅を行い、エストロゲン応答配列結合の断片化ｐ５３遺伝子（配列番号３における第１６６〜１１４３位の塩基配列の３’末端に開始コドンが付加され、且つＥｃｏＲ１サイトが連結されている遺伝子）を調製した。また、別途、得られた断片化ｐ５３の遺伝子に対して、ＥｃｏＲ１サイト及び５’末端での開始コドンを付加するために、フォワードプライマー（ＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＴ：配列番号８）、及びリバースプライマー（ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴ：配列番号９）を用いて増幅を行いエストロゲン応答配列未結合の断片化ｐ５３遺伝子を調製した。得られた各ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αにトランスフェクトした。増幅させたプラスミドをＥｃｏＲ１で消化し、ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（ＨＡタグとｈｒＧＦＰの付いたシャトルベクター）にライゲートし、当該シャトルベクターの発現カセットに目的遺伝子をサブクローニングした。なお、断片化ｐ５３遺伝子のコドン７２がアルギニン（ＣＧＣ）であったため、ｐ５３のコドン７２の変種を作製するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、プライマー（ＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣ：配列番号１０、及びＣＧＴＧＣＡＡＧＴＣＡＣＡＧＡＣＴＴ：配列番号１１）で、絨毛膜組織由来のｃＤＮＡ中の対応するアルギニン変種（ＣＧＣ）をプロリン変種（ＣＣＣ）に変換したものも作製した。
【００４３】
（２）組み換えアデノウイルス
ＡｄＥａｓｙTMＸＬアデノウイルスベクターシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、エストロゲン応答配列結合又は未結合の断片化ｐ５３遺伝子を含むシャトルベクターと、ｐＡｄＥａｓｙ−１ベクターを大腸菌（ＢＪ５１８３株）に同時に形質転換し、相同性組換えを誘発することにより、目的遺伝子を含む発現カセットをアデノウイルスのゲノム内へ移行させ、組み換えアデノウイルスを調製した。
【００４４】
（３）ＰＣＲによるアデノウイルスの定量
培養細胞に感染するアデノウイルスは、Ａｄ ｐｒｅｐを用いた遠心分離にて精製した。次いで、０．６％ ＳＤＳなどを加えてタンパクを可溶化し、５Ｍ ＮａＣｌによる沈殿後に冷エタノールによる沈殿、０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ及び０．２％ＳＤＳを含む溶液での消化、及びフェノール／クロロホルムでの抽出により、ＤＮＡを分離した。
【００４５】
アデノウイルスＤＮＡのＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを行うために、フォワードプライマー（ＧＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡ：配列番号１２）、リバースプライマー（ＡＧＧＴＡＧＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＴ：配列番号１３）、及びＴａｑＭａｎプローブが結合したＤＮＡ配列（ＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡ：配列番号１４）を準備した。これらは、それぞれｐ５３遺伝子の３’末端結合領域、及びシャトルベクターのＸｈｏクローニングサイトに対応している。
【００４６】
（４）癌細胞株の培養、及び組み換えアデノウイルスの感染
子宮体癌細胞株としてＨＨＵＡ細胞及びＫＬＥ細胞を用いた。また、結腸癌としてＳＷ４８細胞を用いた。
【００４７】
ＨＨＵＡ細胞は、Ｉｓｈｉｗａｔａ等によって樹立された子宮体癌細胞株であり、理化学研究所から入手した。当該ＨＨＵＡ細胞は、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）を発現することが分かっている（Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９８４； Ｚｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。また、ＫＬＥ細胞は、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社から入手した。当該ＫＬＥ細胞は、エストロゲン受容体を発現しないことが分かっている。ＨＨＵＡ細胞及びＫＬＥ細胞は、１５％ ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を添加したＦ−１２／ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養した。
【００４８】
ＳＷ４８細胞は、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社から入手した。当該ＳＷ４８細胞は、ＥＲβを発現することが分かっている。１５％ ＦＢＳを添加したｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍで、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養した。
【００４９】
癌細胞に対する前記組み換えアデノウイルスの感染は、１×１０5/ｃｍ2の癌が底面に生着しているシャーレの培養液に、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養することにより行った。
【００５０】
（５）フローサイトメトリー
アデノウイルスで癌細胞を感染させてから４８時間後に、癌細胞を０．２５％トリプシン溶液に分散させて、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｋｉｎｓｏｎ社製）と共にインキュベートした。その後、癌細胞を洗浄して、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
【００５１】
アデノウイルスで癌細胞を感染させてから７２時間後に、癌細胞を０．２５％トリプシン溶液に分散させて、５μｇ／ｍｌのＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）と共にインキュベートした。その後、癌細胞を洗浄して、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
【００５２】
（６）ＲＴ-ＰＣＲ分析
（ ）を用いて、アデノウイルス感染後７２時間の細胞からＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡについてＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲに供して、ｐ５３遺伝子量を測定することにより、細胞に感染したアデノウイルス量を定量した。ｐ５３遺伝子量は、予め、既知のコピー数を持つｐ５３遺伝子を用いてコピー数とＰＣＲのサイクル数との関係を示す検量線を作製することにより、サンプルの増幅曲線からコピー数を算出することにより行った。
ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）を用いて、アデノウイルス感染後７２時間の細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを逆転写した後に、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲにより、ｐ５３ｍＲＮＡ量を分析した。ｐ５３ｍＲＮＡ量は、細胞内で一定濃度存在すると考えられる１８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡの発現量に対するｐ５３Ｒｃが挿入されたアデノウイルスを感染させた細胞の1検体における該当ｍＲＮＡ量比を１とした場合の相対値として算出した。
【００５３】
２．結果
図１に、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子（ｐ５３Ｒｃ）、コドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子（ｐ５３Ｐｃ）、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの（ＥＲＥｐ５３Ｒｃ）、又はコドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの（ＥＲＥｐ５３Ｐｃ）が挿入されたアデノウイルスをＨＨＵＡ細胞に感染させて、４８時間後にＧＦＰ蛍光を示す細胞を観察した結果を示す。図１から明らかなように、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ＧＦＰの蛍光を示す細胞が顕著に多く、ｐ５３Ｒｃ、ｐ５３Ｐｃ、及びＥＲＥｐ５３Ｒｃに比してアデノウイルスの感染率が高いことが確認された。この結果から、ＥＲβを発現しているＨＨＵＡ細胞に対して、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスの感染率が顕著に高いことが確認された。
【００５４】
また、図２に、ｐ５３Ｒｃ、ｐ５３Ｐｃ、ＥＲＥｐ５３Ｒｃ、及びＥＲＥｐ５３Ｐｃが挿入されたアデノウイルスをＫＬＥ細胞に感染させて、４８時間後にＧＦＰ蛍光を示す細胞を観察した結果を示す。図２から明らかなように、ＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ＧＦＰの蛍光を示す細胞が顕著に多かった。即ち、ＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスは、ＥＲβを発現していないＫＬＥ細胞に対して、アデノウイルスの感染率が顕著に高いことが確認された。
【００５５】
図１及び２に示す結果から、エストロゲン受容体を発現している細胞に対してはＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスの感染率が高く、また、エストロゲン受容体を発現していない細胞に対してはＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスの感染率が高いことが明らかとなった。
【００５６】
図３に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞の内、ＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。図２から分かるようにＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスで感染させたＨＨＵＡ細胞では、ＧＦＰ陽性細胞の割合が顕著に高い値を示していた。
【００５７】
図４に、アデノウイルスの感染から４８時間後のＨＨＵＡ細胞の内、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。また、図５に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞の内、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖはアポトーシスの初期段階の検出指標、PIはアポトーシスの後期段階の指標となるマーカーである。図４及び５から明らかなように、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞及びＰＩ陽性細胞の割合が高く、アポトーシスが効率的に誘導されていることが確認された。この結果は、図１に示す結果とも整合しており、エストロゲン受容体を発現している細胞に対してはＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスの感染率が高く、導入された遺伝子が感染細胞内で機能発現していることの証左となっている。
【００５８】
図６に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞、ＳＷ４８細胞、及びＫＬＥ細胞について、アデノウイルス感染量（ｐ５３遺伝子量）を測定した結果を示す。この結果からも、ＨＨＵＡ細胞及びＳＷ４８細胞では、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを感染させた場合に、感染率が顕著に高くなっていた。また、ＫＬＥ細胞では、ＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを感染させた場合に、感染率が顕著に高くなっていた。また、図７に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞及びＫＬＥ細胞内のｐ５３ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。ｐ５３ｍＲＮＡの発現量の測定結果も、図５に示す結果と同じ傾向になっていた。即ち、図６及び７の結果から、エストロゲン受容体を発現している細胞に対する感染にはＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスが有効であり、エストロゲン受容体を発現していない細胞に対する感染にはＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスが有効であることが裏付けられた。
【００５９】
実施例２：エストロゲン応答配列が付加されたｐ５３遺伝子を含むウイルスベクターの感染試験（２）
１．実験材料及び方法
（１）組み換えアデノウイルス
実施例１と同様の方法で、ｐ５３Ｒｃ、ｐ５３Ｐｃ、ＥＲＥｐ５３Ｒｃ、又はＥＲＥｐ５３Ｐｃが挿入されたアデノウイルスを作製した。
【００６０】
（２）癌細胞株の培養、及び組み換えアデノウイルスの感染
実施例１と同様の方法で、ＨＨＵＡ細胞を培養した。
【００６１】
培養したＨＨＵＡ細胞を下記３群に分けて、組み換えアデノウイルスの感染を行った。
未処置群
１×１０5/ｃｍ2のＨＨＵＡ細胞が底面に生着しているシャーレの培養液（に、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養することにより行った。
エストラジオール添加群
１×１０5/ｃｍ2のＨＨＵＡ細胞が底面に生着しているシャーレの培養液に、１×１０9Ｍのエストラジオール（和光純薬工業株式会社）を添加し、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養することにより行った。
Ｘ線照射群
１×１０5/ｃｍ2のＨＨＵＡ細胞が底面に生着しているシャーレの培養液に、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養し、アデノウイルス添加から２４時間後に、１５０ｋＶで１０ＧｙのＸ線を照射して、引き続き培養を行った。
【００６２】
（３）フローサイトメトリー
各群のアデノウイルス感染後４８時間のＨＨＵＡ細胞について、実施例１と同様の方法で、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを用いた染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
【００６３】
また、各群のアデノウイルス感染後７２時間のＨＨＵＡ細胞について、実施例１と同様の方法で、ＰＩを用いた染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
【００６４】
（４）ＲＴ-ＰＣＲ分析
各群のアデノウイルス感染後７２時間のＨＨＵＡ細胞について、実施例１と同様の方法で、細胞内ｐ５３ｍＲＮＡ量及びｐ３００ｍＲＮＡ量を測定した。ｐ５３ｍＲＮＡ量及びｐ３００ｍＲＮＡ量は、細胞内で一定濃度存在すると考えられる１８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡの発現量に対するｐ５３Ｒｃが挿入されたアデノウイルスを感染させた未処置群の細胞の1検体における該当ｍＲＮＡ量比を１とした場合の相対値として算出した。
【００６５】
２．実験結果
図８に、アデノウイルスの感染から４８時間後の各群のＨＨＵＡ細胞について、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。また、図９に、アデノウイルスの感染から７２時間後の各群のＨＨＵＡ細胞について、ＰＩ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。この結果から、実施例１での結果と同様に、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞及びＰＩ陽性細胞の割合が高く、アポトーシスが効率的に誘導されていることが確認された。また、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の間では、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞及びＰＩ陽性細胞の割合については、有意な差がなかったことから、本発明のウイルスベクターによる感染と感染細胞内での機能発現は、感染時のエストロゲンやＸ線照射の有無には影響されないことが分かった。
【００６６】
また、図１０に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞内のｐ５３ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。ｐ５３ｍＲＮＡの発現量の測定結果も、図９に示す結果と同様に、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の間では、ｐ５３ｍＲＮＡ量については、有意な差は認められなかった。
【００６７】
また、図１１に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞内のｐ３００ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。ｐ３００は、ｐ５３の分解に寄与することが知られているタンパク質である。ＥＲＥｐ５３Ｐｃ又はＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを感染した場合には、ｐ５３Ｐｃ又はｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを感染した場合と比較して、ｐ３００ｍＲＮＡ量が少なくなっていた。また、ｐ３００ｍＲＮＡ量も、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の間では有意な差は認められなかった。即ち、本結果から、ＥＲＥｐ５３Ｐｃ又はＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスは、感染時のエストロゲンやＸ線照射の有無には影響されず、感染した細胞内でｐ５３が有効に機能していることが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする、ウイルスベクター。
【請求項２】
外来遺伝子が癌抑制遺伝子である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体である、請求項１又は２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がプロリンをコードしている、請求項１乃至３のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項５】
外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がアルギニンをコードしている、請求項１乃至３のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項６】
アデノウイルスベクターである、請求項１乃至５のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項７】
外来遺伝子の５’末端にエストロゲン応答配列の３’末端に直接結合している、請求項１乃至６のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載のウイルスベクターを含む、医薬組成物。
【請求項９】
遺伝子治療に使用される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
外来遺伝子としてｐ５３遺伝子又はその変異体を含有するウイルスベクターを含み、癌の治療に使用される、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がプロリンをコードしており、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有する癌患者に対して適用される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がアルギニンをコードしており、エストロゲン受容体を発現していない癌細胞を保有する癌患者に対して適用される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加されたｐ５３遺伝子又はその変異体からなる、融合遺伝子。
【請求項１】
エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする、ウイルスベクター。
【請求項２】
外来遺伝子が癌抑制遺伝子である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体である、請求項１又は２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がプロリンをコードしている、請求項１乃至３のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項５】
外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がアルギニンをコードしている、請求項１乃至３のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項６】
アデノウイルスベクターである、請求項１乃至５のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項７】
外来遺伝子の５’末端にエストロゲン応答配列の３’末端に直接結合している、請求項１乃至６のいずれかに記載のウイルスベクター。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載のウイルスベクターを含む、医薬組成物。
【請求項９】
遺伝子治療に使用される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
外来遺伝子としてｐ５３遺伝子又はその変異体を含有するウイルスベクターを含み、癌の治療に使用される、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がプロリンをコードしており、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有する癌患者に対して適用される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がアルギニンをコードしており、エストロゲン受容体を発現していない癌細胞を保有する癌患者に対して適用される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加されたｐ５３遺伝子又はその変異体からなる、融合遺伝子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１３−４８６１８（Ｐ２０１３−４８６１８Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１６８８６１（Ｐ２０１２−１６８８６１）
【出願日】平成２４年７月３０日（２０１２．７．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 社団法人日本産科婦人科学会 「日本産科婦人科学会雑誌 Ｖｏｌ．６３ Ｎｏ．２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１ 第６３回学術講演会 抄録」 平成２３年２月１日
【出願人】（５０６１２２３２７）公立大学法人大阪市立大学 (122)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月３０日（２０１２．７．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 社団法人日本産科婦人科学会 「日本産科婦人科学会雑誌 Ｖｏｌ．６３ Ｎｏ．２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１ 第６３回学術講演会 抄録」 平成２３年２月１日
【出願人】（５０６１２２３２７）公立大学法人大阪市立大学 (122)
【Ｆターム（参考）】
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