遺伝子探索ベクター隣接ゲノム配列の同定方法、及び酸化ストレス感受性変異体
【課題】ＧＳベクターが挿入された遺伝子を特定するため実用的な方法、個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定する方法、並びに当該方法により酸化ストレスに対する抵抗性に関連する遺伝子及びそれがコードしているタンパク質を提供する。
【解決手段】遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定し、該遺伝子をゲノムに挿入された動物の中から、特定の表現型を有する個体を選別し、挿入されたゲノムにおける遺伝子を網羅的に同定する。また、特定された１７種の酸化ストレス感受性遺伝子、及びそれがコードするタンパク質。さらに、特定された１７種の遺伝子のうちの少なくとも１種の遺伝子が欠損した動物、及び当該動物を用いた抗酸化物質のスクリーニング方法。
【解決手段】遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定し、該遺伝子をゲノムに挿入された動物の中から、特定の表現型を有する個体を選別し、挿入されたゲノムにおける遺伝子を網羅的に同定する。また、特定された１７種の酸化ストレス感受性遺伝子、及びそれがコードするタンパク質。さらに、特定された１７種の遺伝子のうちの少なくとも１種の遺伝子が欠損した動物、及び当該動物を用いた抗酸化物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法、及びその方法により特定された特定の表現型に関連する遺伝子、好ましくは酸化ストレス感受性遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムを、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素で消化し、得られた断片をプライマーエクステンション法により複製し、複製された断片をアダプターライゲーション法により２本鎖ＤＮＡを生成させ、次いでこの断片を鋳型としてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行ない、得られた断片の塩基配列を決定することからなる、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法、及びその方法により特定された表１に記載のＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７で示される１７種の酸化ストレス感受性遺伝子に関する。
さらに、本発明は、前記方法により特定された１７種の遺伝子のうちの少なくとも１種の遺伝子が欠損した動物、及び当該動物を用いた抗酸化物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
好気性生物は酸素を取り込み、代謝系に利用して高エネルギーを得ている。この作用は細胞のミトコンドリアにより行われているが、ミトコンドリアが消費する酸素の０．４〜４％はエネルギーの産生に利用されるのではなく、活性酸素種になると言われている。この酸素の一部は、スーパーオキシド（Ｏ２・−）や、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ペルオキシ亜硝酸イオン（ＯＮＯＯ−）、そしてヒドロキシラジカル（・ＯＨ）などの非常に反応性の高い活性酸素種（ＲＯＳ）に変化する。これらのＲＯＳは、生体防御や細胞内シグナル伝達などに利用されており、生体内において重要な役割を担っているが、その一方では、高い反応性によりＤＮＡや脂質等の生体分子を酸化変性させ、様々な細胞障害を誘発させる原因となることが知られている。このように生体内における活性酸素種（ＲＯＳ）は、生体機能における「両刃の刃」となっており、通常は、役割を終えたＲＯＳは、生体に存在するＲＯＳを消去する抗酸化物質により速やかに還元消去される。しかしながら、過剰に生成したＲＯＳが生体恒常性を損なうとき、ＲＯＳは臓器レベルの障害を誘発し、動脈硬化・腎不全などの重篤な疾患を惹起すると共に、老化の原因のひとつであるとされている。
【０００３】
多くの研究の結果、老化と酸化ストレスとの関係が明らかにされてきている。例えば、カタラーゼやスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などの抗酸化酵素の過剰発現は、酸化ストレスに対する抵抗性を強化し、同時に寿命を長くすることが報告されてきている（非特許文献１参照）。また、メチオニンスーパーオキシドリダクターゼＡの過剰発現もまた酸化ストレスに対する抵抗性を強化し、同時に寿命を長くすることが報告されてきている（非特許文献２参照）。しかしながら、生体の抗酸化機構に関与している遺伝子のいくつかだけが報告されてきているだけであり、これらの遺伝子を網羅的に解析することは未だ行われてきていない。
本発明者らは、ショウジョウバエの酸化ストレスに対する抵抗性を測定するための方法を開発し、酸化ストレスに強いショウジョウバエの選別を可能にしてきた。そして、GSベクターを挿入した３７種のショウジョウバエについて酸化ストレスに対する抵抗性と寿命の関連性を検討してきた結果、抗酸化ストレスと寿命には相関性があり、ＧＳ３０５６、ＧＳ２２０９、ＧＳ３０４７及びＧＳ２１３８の４種の系統が強い抗酸化ストレスを示すと共に寿命も内外ことを見出してきた（非特許文献３参照）。
【０００４】
一方、本発明者らは、遺伝子を探索するためのベクターとしてＧＳベクター（Gene Search Vector）を開発してきた（非特許文献４、及び特許文献１参照）。このＧＳベクターは、マーカー遺伝子（例えば、白眼遺伝子（White gene）など）の両端に逆向きに１対のＵＡＳ配列−プロモーター領域−Ｐエレメント配列を有するものである。ＵＡＳ配列は、ＧＡＬ４の標的となるエンハンサー配列であり、Ｐエレメントはトランスポゾンの１種の配列である。このＧＳベクターを導入し、得られた個体をＧＡＬ４発現系の個体と交配させてＦ１雑種を作成する。このＦ１雑種はＧＡＬ４とＵＡＳエンハンサーにより、ＧＳベクターが挿入された位置の遺伝子を強制発現することになる。強制発現されたｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法などにより同定することにより、遺伝子を探索することが可能となる。本発明者らは、この方法により、長寿関連遺伝子の探索方法を開発してきた（特許文献２参照）。
このＧＳベクターを用いた方法では、Ｐエレメントとしてショウジョウバエのトランスポゾンを有しており、ゲノムにランダムに挿入して突然変異を作製するためのベクターとして極めて有用であるが、このトランスポゾンのよりＧＳベクターが挿入された遺伝子を特定するためには、発現したｍＲＮＡによる方法では特定が困難なことが多いだけでなく、解析に膨大な時間が必要であった。また、ＧＳベクターが挿入された遺伝子を特定するための他の方法としては、ＧＳベクターが挿入されたゲノムのベクター／ゲノム接合部を含む断片を特異的に増幅して配列を決定する方法が有効となる。このような方法として、ベクター／ゲノム接合部を含む断片をセルフゲーションによって環状化したＤＮＡを鋳型として、増幅するＩｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法が考えられる。しかし、この方法ではライゲーション時に鋳型ＤＮＡを低濃度に希釈するために、大きな容量で反応を行う必要がある。また、ゲノム上の制限酵素サイトがベクター端部に近い場合、ベクターの内部配列とゲノム配列とを区別するのが困難な場合があった。
【０００５】
このように、関連性のある遺伝子を網羅的に探索する方法としてＧＳベクターを用いる方法は有効ではあるが、ＧＳベクターが挿入された遺伝子を特定することが困難な場合が多く、ＧＳベクターが挿入されて特定の形質を発現している個体が特定されても、当該遺伝子を特定することが困難であった。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−３２９８６号
【特許文献２】特開２００３−１７４８８７号
【非特許文献１】Sun J. and Tower J., Mol. Cell Biol., 19, 216-228, 1999.
【非特許文献２】Ruan H., Tang XD., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 2748-2753, 2002.
【非特許文献３】T. Kaneuchi, T. Togawa, et al., Biogerontology, 4, 157-165, 2003.
【非特許文献４】G. Toba, T. Ohsako, et al., Genetics, 151, 725-737, 1999.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＧＳベクターが挿入された遺伝子を特定するため実用的な方法を提供することである。また、本発明は、個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定する方法を提供するものである。
さらに、本発明の目的は、酸化ストレスに対する抵抗性に関連する遺伝子及びそれがコードしているタンパク質を提供することである。より詳細には、本発明は、個体レベルにおける酸化ストレスに対する抵抗性に関連する遺伝子及びそれがコードしているタンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＧＳベクターが挿入された遺伝子を特定するため実用的な方法を検討してきた。その結果、ＧＳベクターが挿入されたゲノムＤＮＡを、３’末端が突出する断片を生成する制限酵素により消化し、これをプライマーエクステンション法によりベクター／ゲノム接合部を含む断片を特異的に複製し、得られた断片をアダプターライゲーション法により、その３’末端側に２本鎖ＤＮＡをライゲーションし、生成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、これを増幅し、これをシークエンスすることにより目的の遺伝子の塩基配列を簡便に、かつ効率よく決定することができることを見出した。
さらに、この方法により、酸化ストレスに強い個体における酸化ストレスに関連する遺伝子を網羅的に解析することに成功した。
【０００９】
即ち、本発明は、次の（１）〜（５）の工程、
（１）遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムを、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素で消化する工程、
（２）前記（１）の工程で消化されて生成した断片をプライマーエクステンション法によりベクター／ゲノム接合部を含む断片を複製する工程、
（３）得られた断片をアダプターライゲーション法により、その３’末端側に２本鎖ＤＮＡをライゲーションして２本鎖ＤＮＡを生成させる工程、
（４）生成させた２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、これを増幅する工程、
（５）得られた断片の塩基配列を決定する工程、
により、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法に関する。以下、本発明のこの方法をベクターＰＣＲ法と略称することもある。
また、本発明は、前記方法により特定された酸化ストレス感受性遺伝子、及び当該遺伝子がコードしているタンパク質に関する。より詳細には、本発明は、下記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子のいずれかに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子、及び当該遺伝子がコードしているタンパク質に関する。さらに詳細には本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性である遺伝子であって、下記の表２に示されるＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子、及び当該遺伝子がコードしているタンパク質に関する。
【００１０】
また、本発明は、前記方法により特定された酸化ストレス感受性遺伝子、及び当該遺伝子がコードしているタンパク質に関する。より詳細には、本発明は、下記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子のいずれかの塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子を含有してなる酸化ストレスに対する抵抗性調節用組成物、又は当該遺伝子がコードしているタンパク質を含有してなる酸化ストレスに対する抵抗性調節用組成物に関する。さらに詳細には本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性である遺伝子であって、下記の表２に示されるＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子を含有してなる酸化ストレスに対する抵抗性調節用組成物、及び当該遺伝子がコードしているタンパク質を含有してなる酸化ストレスに対する抵抗性調節用組成物に関する。
さらに、本発明は、前記方法により特定された酸化ストレス感受性遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。より詳細には、本発明は、下記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子のいずれかの塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。さらに詳細には本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性である遺伝子であって、下記の表２に示されるＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。
また、本発明は、前記方法により特定された酸化ストレス感受性遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。より詳細には、本発明は、下記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子のいずれかの塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。さらに詳細には本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性である遺伝子であって、下記の表２に示されるＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。
【００１１】
さらに、本発明は、前記方法により特定された酸化ストレス感受性遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた、又は当該遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエを用いて抗酸化物質をスクリーニングする方法に関する。より詳細には、本発明は、下記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子のいずれかの塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた、又は当該遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエに、試験物質を投与若しくは接触させ、又は試験物質の存在する環境下で飼育して、当該動物の試験物質に対する反応を測定することからなる、試験物質の抗酸化作用をスクリーニングする方法に関する。さらに詳細には本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性である遺伝子であって、下記の表２に示されるＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた、又は当該遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエに、試験物質を投与若しくは接触させ、又は試験物質の存在する環境下で飼育して、当該動物の試験物質に対する反応を測定することからなる、試験物質の抗酸化作用をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）がゲノムに挿入された動物の中から、特定の表現型を有する個体を選別し、選別された個体における遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を、前記した本発明のベクターＰＣＲ法により同定することからなる個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定する方法に関する。
【００１２】
本発明をより詳細に説明すれば、以下のとおりとなる。
（１）次の（Ａ）〜（Ｅ）の工程、
（Ａ）遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムを、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素で消化する工程、
（Ｂ）前記（Ａ）の工程で消化されて生成した断片をプライマーエクステンション法によりベクター／ゲノム接合部を含む断片を複製する工程、
（Ｃ）得られた断片をアダプターライゲーション法により、その３’末端側に２本鎖ＤＮＡをライゲーションして２本鎖ＤＮＡを生成させる工程、
（Ｄ）生成させた２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、これを増幅する工程、
（Ｅ）得られた断片の塩基配列を決定する工程、
により、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法。
（２）３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素が、Ｈｈａｌである前記（１）に記載の方法。
（３）プライマーエクステンション法により複製された断片が、３’末端においてＡ（アデニン）が１塩基突出した断片である前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）がゲノムに挿入されたショウジョウバエの中から、特定の表現型を有する個体を選別し、選別された個体における遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法により同定することからなる個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定する方法。
（５）個体の表現型が、酸化ストレスに対する抵抗性である前記（４）に記載の方法。
（６）前記（４）に記載の方法の方法により個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定された遺伝子。
（７）個体の表現型が、酸化ストレスに対する抵抗性である前記（６）に記載の遺伝子。
（８）遺伝子が、ショウジョウバエ由来のものである前記（６）又は（７）に記載の遺伝子。
（９）酸化ストレスに対する抵抗性である前記（８）に記載の遺伝子が、ＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７のいずれかである前記（８）に記載の遺伝子。
（１０）酸化ストレスに対する抵抗性である前記（８）に記載の遺伝子が、ＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子である前記（８）又は（９）に記載の遺伝子。
（１１）前記（９）又は（１０）に記載の遺伝子がコードしているタンパク質。
（１２）前記（９）又は（１０）に記載の遺伝子の少なくとも１種の遺伝子をゲノム中に有するショウジョウバエにおいて、当該遺伝子を欠損させたショウジョウバエ。
（１３）前記（１２）に記載のショウジョウバエに、食品又は食品素材を投与又は接触させて、当該ショウジョウバエの食品又は食品素材に対する反応を測定することからなる、食品又は食品素材の抗酸化作用をスクリーニングする方法。
【００１３】
次に、本発明の遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法についてより具体的に説明する。
図１は遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）の構成の例を示したものである。この例は、特許文献１に記載されているＧＳベクターの例である。中心部のマーカー遺伝子（図１の白抜きの部分）があり、この例ではマーカー遺伝子として白眼遺伝子（White gene）が使用されている。その５’末端及び３’末端（逆向き配列である）にＧＡＬ４が標的とするＵＡＳエンハンサーが結合しており、さらにその両方の先にプロモーターが、この例ではヒートショックタンパク質ｈｓｐ７０遺伝子のコアプロモーターが結合している。そして、その両方の先にさらにトランスポゾン活性を有するＰエレメントが結合している。このＧＳベクターは、両末端に結合しているトランスポゾンの作用により、ゲノム中のランダムな位置に挿入される。ゲノムへの挿入は通常のトランスポゾンの挿入と同様に行うことができる。この例のＧＳベクターは、両向きの配列を備えているので、いずれの方向から挿入されても発現可能に設計されている。そして、プロモーター領域の下流側に転写開始点（図１では鈎付き矢印で示されている。）を設けている。
【００１４】
次に、本発明の遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法の概要を模式的にして、図２に示す。図２の上段の２本の線はゲノムＤＮＡを示し、線上の太く示されている箇所は挿入されたＧＳベクターを示している。
まず、ＧＳベクターが挿入されているゲノムを抽出する。抽出されるゲノムＤＮＡは、全ＤＮＡであってもよいが、標的とする部位だけのゲノムＤＮＡ、例えば第２染色体とか第３染色体とか、又はこれらの断片であってもよい。このようにして抽出されたゲノムＤＮＡを用いて、
（１）遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムを、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素で消化し、消化された断片を得る。
図２では消化される部位をゲノムの２本線に矢印で示している。
このときに使用される制限酵素は、平滑末端を生じるものではなく、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素を用いることが本発明の特徴のひとつである。もう一つの特徴は、ＧＳベクター中に当該制限酵素による切断部位を有していることである。したがって、この工程で得られる断片は、５’末端側がＧＳベクターの塩基配列を有しており、３’末端側が突出した形になっている。
この工程で使用される制限酵素としては、ＧＳベクター中に切断部位があり、かつ３’末端側が突出した形の断片を生成するものであれば、特に制限はなく、好ましい制限酵素としては、Ｈｈａｌなどが挙げられる。
【００１５】
次いで、工程（１）で得られたＤＮＡ断片を、次の
（２）前記（１）の工程で消化されて生成した断片をプライマーエクステンション法によりベクター／ゲノム接合部を含む断片を複製する工程、
で処理する。このときに使用されるプライマーとしては、得られたＤＮＡ断片の５’末端はＧＳベクター由来の塩基配列を有しているので、ＧＳベクター内の任意の塩基配列に適合するように選定することができる。
この工程で使用される好ましいプライマーの例を次に示す。
フォーワードプライマーの例：
ＧＳＶ２：５’−ＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣ−３’
ＧＳＶ３：５’−ＣＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＴＣＧ−３’
ＧＳＶ６：５’−ＧＣＡＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧ−３’
ＧＳＶ７：５’−ＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧＴＧ−３’
（前記プライマー中のＧＳＶの名称は本発明者らが命名したものである。）
リバースプライマーの例：
５’−ＣＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧ−３’
この工程では、このようなプライマーを用いて、Ｔａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼにより、ベクター／ゲノム接合部を含む断片を特異的に複製することができる。このとき、複製酵素の特性により複製されたＤＮＡ鎖の３’端に１塩基のＡ（アデニン）が鋳型に非依存的に付加されることになる。このように、プライマーエクステンション法において、３’端にＡを付加するＤＮＡ合成酵素を使うことは、本発明の方法の特徴の一つである。図２の（２）の段階を参照されたい。
【００１６】
次いで、
（３）得られた断片をアダプターライゲーション法により、その３’末端側に２本鎖ＤＮＡをライゲーションして２本鎖ＤＮＡを生成させる工程、
を行う。このために、相補鎖にＴ（チミン）が１塩基突出した２本鎖ＤＮＡを使用する。使用される２本鎖ＤＮＡの塩基配列や長さは特に制限はないが、長さは次の工程で行われるＰＣＲ法におけるプライマーを用意することができる長さであればよい。通常は１０〜５０ｍｅｒ、好ましくは１０〜３０ｍｅｒ程度である。好ましい２本鎖ＤＮＡの例を示すと次のものが挙げられる。
５’−ＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣ−３’
３’−ＴＣＴＴＡＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＡＴＧＧＣ−５’
この工程で使用される酵素も、通常のアダプターライゲーション法に使用される酵素であれば特に制限はない。
この処理により、ライゲーションされた２本鎖ＤＮＡが生成される。
【００１７】
得られた２本鎖ＤＮＡの断片の５’末端はＧＳベクターに由来する塩基配列を有しており、また３’末端は前記の工程でライゲーションしたオリゴヌクレオチドの塩基配列を有している。したがって、
（４）生成させた２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、これを増幅する工程、
におけるプライマーは前記した塩基配列に基づいて任意に選定することができる。
この工程におけるＰＣＲ法としては、通常の単純に増幅する場合のＰＣＲ法であるが、前記で例示したように末端が平滑末端とならないようなライゲーションを行った場合には、突出末端が切断されることになるので、この工程のＰＣＲ法は２段階に分けて行うのが好ましい。この工程におけるＰＣＲ法は、通常のＰＣＲ法と同様に行うことができる。
この工程で使用される好ましいプライマーを例示する。
第一段目のプライマーセット：
フォーワードプライマー：
配列４：５’−ＧＣＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧ−３’
ＧＳＶ２：５’−ＧＡＡＣＴＣＴＧＡＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧ−３’
ＧＳＶ３：５’−ＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＧＡＡＴＴＡＧＧＣＣＴＴＣＴＡＧ−３’
ＧＳＶ６：５’−ＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣ−３’
ＧＳＶ７：５’−ＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧ−３’
（前記プライマー中のＧＳＶの名称は本発明者らが命名したものである。）
リバースプライマー：
５’−ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＴＡＣ−３’
第二段目のプライマーセット：
フォーワードプライマー：
配列６：５’−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣ−３’
５’−ＣＣＡＣＧＴＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＣ−３’
リバースプライマー
５’−ＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＴＡＣＴＣＧＣ−３’
【００１８】
以上のようにして増幅されたＤＮＡ断片を用いて、
（５）得られた断片の塩基配列を決定する工程、
を行う。これらのＤＮＡ断片の塩基配列の決定法も特に制限はない。公知のいずれの決定法も使用することができ、ＤＮＡ断片の長さや、特性に応じて適宜選定することができる。
例えば、次のプライマー：
５’−ＴＣＧＴＣＣＧＣＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＣＣＴＣ−３’
５’−ＣＴＣＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣＡＡＴＡＣＧＡＣＡＣＴＣ−３’
のセットを用いて常法に従って配列決定を行うことができる。
【００１９】
本発明の遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法（以下、ベクターＰＣＲ法と称することもある。）は、遺伝子を発現させる必要も無く、また前記したインバース−ＰＣＲ法による欠点を解決するものであり、信頼性も高く、さらに、全ての反応を１００μｌ以下の容量でも実行することができ、簡便に行うことができる。また、本発明の方法における各工程は、既に機械化が進展している工程であり、全工程を自動化することも可能であり、大量の資料を少量の容器で確実に信頼性よく、かつ迅速に処理することができる。
本発明のベクターＰＣＲ法を用いることにより、個体レベルでの発現遺伝子の特定を行うことができる。ＧＳベクターが挿入された動物、例えばショウジョウバエの作成手法は非特許文献４や特許文献１に開示されているが、従来ＧＳベクターが挿入されている部位の遺伝子を特定することができる方法が確立されておらず、ＧＳベクターによる遺伝子の探索が実用的な域に達していなかった。本発明は、この大きな障害となっていた手法を確立させるものであり、本発明により特定の機能を有する遺伝子の探索が、極めて簡便に活確実に行えることになる。
【００２０】
したがって、本発明は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）がゲノムに挿入された動物の中から、特定の表現型を有する個体を選別し、選別された個体における遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を、本発明のベクターＰＣＲ法により同定することからなる個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定する方法を提供するものである。
本発明のこの方法における「表現型」としては、ＧＳベクターの挿入により獲得又は喪失したものであれば特に制限はなく、生物学における表現型であってもよく、また変薬剤感受性や機能性食品に対する感受性などのような特定の物質に対する応答性であってもよい。さらに、器官に異常や奇形を生じるような「表現型」であってもよい。本明細書においては、酸化ストレスに対する感受性に基づく「表現型」による選別と、当該「表現型」に関連する遺伝子の同定法について具体的に開示する。
本発明のこの方法における動物としては、ＧＳベクターを挿入することができるもの、即ち、トランスポゾン活性を有するベクターをゲノム中に挿入することが可能なものであればよいが、特にショウジョウバエが好ましい。ショウジョウバエは飼育が容易で、体型も小さく、生活環も約１０日余りと短く、低コスト化が可能であるばかりでなく、遺伝子の研究材料として古くから研究されてきており高度な解析技術が確立されており、かつヒトと相同な遺伝子を多数有していることから、モデル動物として特に好ましいものである。
また、発現系についても前記の説明で例示してきたＧＡＬ系とＵＡＳエンハンサー系に限定されるものではなく、他の発現系を適用することも可能である。
【００２１】
さらに、本発明のこの方法によって特定された高感受性系統の動物、好ましくはショウジョウバエを使って、有用な薬剤や機能性食品素材を評価するシステムを構築することもできる。例えば、特定された感受性に関連する遺伝子を欠損又は過剰発現するモデル動物を作成して、当該モデル動物における試験物質に対する感受性を測定することにより、試験物質に生体に及ぼす作用効果を簡便にかつ確実にスクリーニングすることができる。本明細書では、酸化ストレスについてさらに具体的に後述するが、酸化ストレスに限定されるものではなく、例えば、（１）人体が接触または吸引する成分を含む材料や塗料を使用した生活用品、薬品、飲食品、化粧品などの健康に及ぼす影響の評価、（２）上記に関する新規有用素材の探索および開発、（３）上記に関する有害物質の評価、除去法の開発、（４）ヒトや家畜の病気の予防、診断、治療法の開発、及び（５）病気につよい動植物（家畜）などの品種改良などに、本発明のこの方法を適用することができる。
【００２２】
本発明者らは、非特許文献３に記載されている酸化ストレスに対するショウジョウバエの試験装置を用いて、ＧＳベクターが挿入されたショウジョウバエとＧＡＬ４発現系のショウジョウバエとのＦ１雑種のショウジョウバエを用いて酸化ストレスに対する感受性に基づく個体の選別を行った。
このようにして選別された個体から、本発明のベクターＰＣＲ法を用いて、ＧＳ系統のゲノムに挿入されたベクターに隣接するゲノム配列を特異的に増幅し、約１１，０００系統の配列を決定した。これらの決定された塩基配列を用いて、データベースによりブラスト検索（Blast search）を行い、挿入位置にある遺伝子を特定した。その結果、半数以上の挿入が遺伝子の転写開始点近傍にあることが判明した（図３参照）。ＧＳベクターはＧＡＬ転写因子に依存した強制転写機能を有するため，転写開始点近傍にある挿入系統をＧＡＬ４発現系統に交配することにより、その遺伝子を強制発現することができる。挿入位置が判明したＧＳ系統のショウジョウバエについて、過酸化水素水を含む培地で飼育し、酸化ストレスに対する抵抗性を確認した。その結果、次の表１に示される１７種の遺伝子のいずれかを強制発現したものが抵抗性を示した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
表１中における＊印は、ＧＳ系統をｈｓ−ＧＡＬ４系統に交配し、そのＦ１雄（各９６個体）について、過酸化水素を含む培地で飼育したときの生存率を、対照群（ベクター挿入をもたない系統とｈｓ−ＧＡＬ４系統と交配したＦ１個体）との相対値で示した。生存期間の測定方法はカネウチらの方法（Kaneuchi et al, Biogerontology, 4,157-165 (2003)）による。表１中の＊＊印は、今回えられた表現型に基づいて、それぞれの遺伝子に本発明者らが付した新名称である。
表１中の「ＧＳ系統」は、ＧＳ系統ショウジョウバエの系統の番号を示し、「ベクター近接遺伝子」はブラスト検索でヒットした遺伝子の名称を示している。
表１に示されるように、ＧＳ系統の９００２、９０３３、９０４３、９０５７、９１７１、９３３２、９３４５、９７５１、９９２５、９９５６、１０４７５、１０５０３、１０５１４、１０６３６、１１０９５、１１３２３、及び１１３９７から、ＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７の１７種の遺伝子を確認することができた。
【００２５】
これらの遺伝子の塩基配列に基づいて、データベースによりブラスト検索（Blast search）を行い、３８種の構造遺伝子（タンパク質をコードしていると推定される塩基配列を有する遺伝子）を確認した。これらの中には同じ遺伝子のアイソフォームも含まれている。即ち、ＯｘＲ１からは、ＣＧ１００８２−ＲＡとＣＧ１００８２−ＲＢと命名される２種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ２からは、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、及びＣＧ３１３０５−ＲＪと命名される７種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ３からは、ＣＧ７４０５−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ４からは、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、及びＣＧ８５２２−ＲＣと命名される３種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ５からは、ＣＧ１０１６５−ＲＡとＣＧ１０１６５−ＲＢと命名される２種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ６からは、ＣＧ９８０４−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ７からは、ＣＧ１３６４５−ＲＡとＣＧ１３６４５−ＲＢと命名される２種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ８からは、ＣＧ１１５１８−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ９からは、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、及びＣＧ５６７０−ＲＨと命名される８種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１０からは、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、及びＣＧ１０２７２−ＲＤと命名される４種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１１からは、ＣＧ１２４５−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１２からは、ＣＧ１３１１−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１３からは、ＣＧ１５０９２−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１４からは、ＣＧ３２１００−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１５からは、ＣＧ１０９３９−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１６からは、ＣＧ８０６７−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１７からは、ＣＧ１００５５−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。
即ち、本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性に関連する、ＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる遺伝子、及び当該遺伝子がコードするタンパク質を提供するものである。
これらの３８種の遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、表２に示されるＮＣＢＩアクセッション番号に基づいてＮＣＢＩにアクセスすることにより入手することができる。
これらの３８種の遺伝子をまとめて、次の表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
表２中の配列番号は、本発明の遺伝子の番号を奇数の番号で示し、ＧＳ系統は前記表１に示したＧＳ系統を示し、ＯｘＲ番号は前記表１に示したＯｘＲの番号を示し、遺伝子名は検索された遺伝子の名称を示し、ＮＣＢＩ番号はＮＣＢＩのアクセッション番号を示し、塩基数は当該遺伝子の全塩基数を示し、ＣＤＳ番号はＯＲＦの塩基番号を示し、アミノ酸数は当該遺伝子がコードしているタンパク質のアミノ酸数を示す。
【００２８】
この表１に挙げた遺伝子は何らかの機能により生体の酸化ストレスに対する抵抗性に関与していることは前記した過酸化水素を含む培地での飼育実験からも明らかであるが、このような酸化ストレスに対する抵抗性のメカニズムについては必ずしも解明されていない。カタラーゼやＳＯＤのような還元による抵抗性によるものかもしれないし、酸化物（ＲＯＳ）の生成の抑制によるものかもしれないし、また個体における体質的なものによるものかもしれない。いずれにしても、本発明のこの方法による特徴は、メカニズムに関係なく関連する遺伝子を網羅的に探索することが可能となっていることである。そして、細胞レベルでのスクリーニング法とは異なり個体レベル、即ち個体の体質による関連性についても網羅的に探索することができることである。
したがって、本発明は、前記した酸化ストレス感受性遺伝子又は当該遺伝子がコードしているタンパク質を含有してなる酸化ストレスに対する抵抗性調節用組成物を提供するものである。本発明の酸化ストレス感受性遺伝子は、前記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子の塩基配列を有するものだけでなく、当該塩基配列と少なくとも５０％以上、好ましくは７０％又は８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子であればよい。これらの遺伝子がコードしているタンパク質のアミノ酸配列に基づくならば、アミノ酸配列において少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上又は９０％、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質が包含される。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法としては、次の（１）から（３）、
（１）本発明で示された酸化ストレス感受性遺伝子の少なくとも１種の遺伝子が欠損又は過剰に発現しているモデル動物、好ましくはショウジョウバエに、
（２）試験物質を投与若しくは接触させ、又は試験物質の存在する環境下で飼育して、
（３）当該試験物質による、当該動物の試験物質に対する反応を測定する、
ことからなるものである。
この方法における動物としては、昆虫、は虫類、両生類などが挙げられるが、昆虫が好ましい。特に好ましい昆虫としては、ショウジョウバエが挙げられる。ショウジョウバエは飼育が容易で、体型も小さく、生活環も約１０日余りと短く、低コスト化が可能であるばかりでなく、遺伝子の研究材料として古くから研究されてきており高度な解析技術が確立されており、かつヒトと相同な遺伝子を多数有していることから、モデル動物として特に好ましいものである。
本発明のスクリーニングする方法により、酸化ストレスに対する抵抗性を調整することができる物質を探索することができる。このような物質としては、抗酸化作用を有する化学物質のみならず、人体が接触または吸引する成分を含む材料や塗料を使用した生活用品、薬品、飲食品、化粧品などが挙げられる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のベクターＰＣＲ法は、遺伝子を発現させる必要も無く、また前記したインバース−ＰＣＲ法による欠点を解決するものであり、信頼性も高く、さらに、全ての反応を１００μｌ以下の容量でも実行することができ、簡便に行うことができる。また、本発明の方法における各工程は、既に機械化が進展している工程であり、全工程を自動化することも可能であり、大量の資料を少量の容器で確実に信頼性よく、かつ迅速に処理することができる。したがって、本発明のベクターＰＣＲ法を使用することにより、特定された感受性に関連する遺伝子を欠損又は過剰発現するモデル動物を作成して、当該モデル動物における試験物質に対する感受性を測定することにより、試験物質に生体に及ぼす作用効果を簡便にかつ確実にスクリーニングすることができるようになる。
また、本発明により提供される酸化ストレスに対する抵抗性に関与する遺伝子は個体の酸化ストレスに対する抵抗性を調整することができるものであり、当該遺伝子を欠損させたり、当該遺伝子を過剰に発現するモデル動物を作成して各種の試験物質をスクリーニングすることができる。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
ＧＳベクターの構築
Ｐエレメント形質転換ベクターｐＣa ＳpeＲ３（Gene 74:445-456, 1988 ）に対してＰＣＲ法を用いて変異を導入し、５’Ｐ末端近傍のＰ転移酵素コード領域内にＥcoＲＩ部位を作成した。ｐＵＡＳＴ（Development 118:401-415, 1993 ）のｈｐｓ７０遺伝子由来コアプロモーターを連結したＵＡＳの５個のタンデムリピートを５’Ｐ末端近傍のＥcoＲＩ部位と、３’ｐ末端近傍のマルチクローニングサイトにあるＸhoＩ部位に挿入し、図１にその構成を模式的に示したＧＳベクターを作成した。なおこのＧＳベクターは、２組のＵＡＳエンハンサー／プロモーターの間にマーカー遺伝子として白眼遺伝子を有しており、全長は５，２５４ｂｐである。
【実施例２】
【００３３】
ＧＳベクターの挿入
前記の実施例１で作成したＧＳベクターをショウジョウバエ（y w 系統：東京都立大より入手）に導入し、遺伝子導入ハエを作成した。次いで、転移酵素delta2-3を用いてＧＳベクターを転移させ、６１３のＧＳベクター挿入系統を作成した。その内訳は、ＧＳベクターの転移先がＸ染色体であるもの１４７系統、第２染色体であるもの２２６系統、第３染色体であるもの２３７系統、第４染色体であるもの３系統であった。また、３９４系統（64％）は少なくとも１つの検出可能な表現型（例えば、致死性や成体構造の欠損）を示した。
【実施例３】
【００３４】
ＧＳ系ショウジョウバエの作成
実施例１で作成したＧＳベクター挿入系統のうち、何らかの検出可能な表現型を示した３９４系統から１６３系統を無作為に選択し、ＧＡＬ４発現系統とを交配させて子孫（Ｆ１）個体を産出させ、転写因子ＧＡＬ４によって強制的に発現させた転写産物を分析した。なお、ＧＡＬ４発現系統としては、dpp-ＧＡＬ４、sev-ＧＡＬ４、hs- ＧＡＬ４、29ＢＤ- ＧＡＬ４およびc355- ＧＡＬ４（いずれもBloomington Stock Centerより入手）を使用した。
【実施例４】
【００３５】
酸化ストレス抵抗性のショウジョウバエの選択
非特許文献３に記載の装置を用いて、実施例３で作成したショウジョウバエを試験した。その結果表１の「ＧＳ系統」の欄に示される１７系統のものを選別した。
【実施例５】
【００３６】
ＧＳベクターの挿入部位の遺伝子の特定
選別されてきたショウジョウバエのゲノムＤＮＡを抽出し、３’突出型断片を生成する制限酵素ＨｈａＩにより消化した。ベクターの一部に対応している次のプライマー
フォーワードプライマーの例：
ＧＳＶ２：５’−ＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣ−３’
ＧＳＶ３：５’−ＣＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＴＣＧ−３’
ＧＳＶ６：５’−ＧＣＡＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧ−３’
ＧＳＶ７：５’−ＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧＴＧ−３’
（前記プライマー中のＧＳＶの名称は本発明者らが命名したものである。）
リバースプライマーの例：
５’−ＣＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧ−３’
を用いて、Ｔａｑポリメラーゼにより、ベクター／ゲノム接合部を含む断片を特異的に複製した（プライマーエクステンション）。このとき、複製酵素の特性により、複製されたＤＮＡ鎖の３’端に１塩基のＡが鋳型非依存的に付加された。この突出したＡに対合するＴを３’端に突出する次に示す
５’−ＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣ−３’
３’−ＴＣＴＴＡＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＡＴＧＧＣ−５’
２本鎖ＤＮＡをライゲーションした（アダプターライゲーション）。これによって生成される２本鎖ＤＮＡを鋳型として、さらに次のプライマーのセット
フォーワードプライマー：
配列４：５’−ＧＣＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧ−３’
ＧＳＶ２：５’−ＧＡＡＣＴＣＴＧＡＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧ−３’
ＧＳＶ３：５’−ＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＧＡＡＴＴＡＧＧＣＣＴＴＣＴＡＧ−３’
ＧＳＶ６：５’−ＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣ−３’
ＧＳＶ７：５’−ＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧ−３’
（前記プライマー中のＧＳＶの名称は本発明者らが命名したものである。）
リバースプライマー：
５’−ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＴＡＣ−３’
を用いて１回目のＰＣＲを行った。続いて、次に示すプライマー
フォーワードプライマー：
配列６：５’−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣ−３’
５’−ＣＣＡＣＧＴＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＣ−３’
リバースプライマー
５’−ＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＴＡＣＴＣＧＣ−３’
を用いて、２回目のＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物をシークエンス反応の鋳型として、次に示すプライマー
５’−ＴＣＧＴＣＣＧＣＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＣＣＴＣ−３’
５’−ＣＴＣＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣＡＡＴＡＣＧＡＣＡＣＴＣ−３’
を用いて配列を決定した。
この結果、ＧＳ系統のゲノムに挿入されたベクターに隣接するゲノム配列を特異的に増幅し、配列を決定した（１１，０００系統）。それらを用いて、Ｂｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈを行い、挿入位置にある遺伝子を特定した。
その結果、半数以上の挿入が遺伝子の転写開始点近傍にあることが判明した（図３参照）。ＧＳベクターはＧＡＬ転写因子に依存した強制転写機能を有するため，転写開始点近傍にある挿入系統をＧＡＬ４発現系統に交配することにより、その遺伝子を強制発現することができる。挿入位置が判明したＧＳ系統について、過酸化水素水を含む培地で飼育したところ、表１に示す１７個の遺伝子を強制発現したものが抵抗性を示した。
この結果、同定されたＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７の１７種の遺伝子を表１に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）による遺伝子の探索のための新規な遺伝子の同定方法を提供し、この方法により個体レベルでの各種の感受性遺伝子の探索を可能し、酸化ストレスに対する感受性遺伝子の同定に成功したものであり、個体レベルでの酸化ストレスに対する抵抗性を調整できる新規な遺伝子を提供するものである。また、本発明はこれらの遺伝子による、新規なスクリーニング方法を提供するものである。
したがって、本発明は、医薬産業、化粧品産業、食品産業、さらに健康産業などの各種の産業分野において利用可能性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）の構成を例示したものである。
【図２】図２は、本発明の遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法の概要を模式的に示したものである。
【図３】図３は、本発明の遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法により解析された遺伝子の転写開始点からＧＳベクターの挿入部位までの距離を頻度グラフで示したものである。グラフの縦軸は挿入頻度（％）を示し、横軸は転写開始点からＧＳベクターの挿入部位までの距離（ｋｂ）を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３９】
配列番号１ ： プライマーＧＳＶ２の塩基配列
配列番号２ ： プライマーＧＳＶ３の塩基配列
配列番号３ ： プライマーＧＳＶ６の塩基配列
配列番号４ ： プライマーＧＳＶ７の塩基配列
配列番号５ ： リバースプライマー
配列番号６ ： アダプターライゲーション用オリゴヌクレオチド
配列番号７ ： アダプターライゲーション用オリゴヌクレオチド
配列番号８ ： 前記配列４で示されるオリゴヌクレオチド
配列番号９ ： プライマーＧＳＶ２の塩基配列
配列番号１０： プライマーＧＳＶ３の塩基配列
配列番号１１： プライマーＧＳＶ６の塩基配列
配列番号１２： プライマーＧＳＶ７の塩基配列
配列番号１３： リバースプライマー
配列番号１４： 前記配列６で示されるオリゴヌクレオチド
配列番号１５： フォーワードプライマー
配列番号１６： リバースプライマー
配列番号１７： フォーワードプライマー
配列番号１８： リバースプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法、及びその方法により特定された特定の表現型に関連する遺伝子、好ましくは酸化ストレス感受性遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムを、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素で消化し、得られた断片をプライマーエクステンション法により複製し、複製された断片をアダプターライゲーション法により２本鎖ＤＮＡを生成させ、次いでこの断片を鋳型としてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行ない、得られた断片の塩基配列を決定することからなる、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法、及びその方法により特定された表１に記載のＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７で示される１７種の酸化ストレス感受性遺伝子に関する。
さらに、本発明は、前記方法により特定された１７種の遺伝子のうちの少なくとも１種の遺伝子が欠損した動物、及び当該動物を用いた抗酸化物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
好気性生物は酸素を取り込み、代謝系に利用して高エネルギーを得ている。この作用は細胞のミトコンドリアにより行われているが、ミトコンドリアが消費する酸素の０．４〜４％はエネルギーの産生に利用されるのではなく、活性酸素種になると言われている。この酸素の一部は、スーパーオキシド（Ｏ２・−）や、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ペルオキシ亜硝酸イオン（ＯＮＯＯ−）、そしてヒドロキシラジカル（・ＯＨ）などの非常に反応性の高い活性酸素種（ＲＯＳ）に変化する。これらのＲＯＳは、生体防御や細胞内シグナル伝達などに利用されており、生体内において重要な役割を担っているが、その一方では、高い反応性によりＤＮＡや脂質等の生体分子を酸化変性させ、様々な細胞障害を誘発させる原因となることが知られている。このように生体内における活性酸素種（ＲＯＳ）は、生体機能における「両刃の刃」となっており、通常は、役割を終えたＲＯＳは、生体に存在するＲＯＳを消去する抗酸化物質により速やかに還元消去される。しかしながら、過剰に生成したＲＯＳが生体恒常性を損なうとき、ＲＯＳは臓器レベルの障害を誘発し、動脈硬化・腎不全などの重篤な疾患を惹起すると共に、老化の原因のひとつであるとされている。
【０００３】
多くの研究の結果、老化と酸化ストレスとの関係が明らかにされてきている。例えば、カタラーゼやスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などの抗酸化酵素の過剰発現は、酸化ストレスに対する抵抗性を強化し、同時に寿命を長くすることが報告されてきている（非特許文献１参照）。また、メチオニンスーパーオキシドリダクターゼＡの過剰発現もまた酸化ストレスに対する抵抗性を強化し、同時に寿命を長くすることが報告されてきている（非特許文献２参照）。しかしながら、生体の抗酸化機構に関与している遺伝子のいくつかだけが報告されてきているだけであり、これらの遺伝子を網羅的に解析することは未だ行われてきていない。
本発明者らは、ショウジョウバエの酸化ストレスに対する抵抗性を測定するための方法を開発し、酸化ストレスに強いショウジョウバエの選別を可能にしてきた。そして、GSベクターを挿入した３７種のショウジョウバエについて酸化ストレスに対する抵抗性と寿命の関連性を検討してきた結果、抗酸化ストレスと寿命には相関性があり、ＧＳ３０５６、ＧＳ２２０９、ＧＳ３０４７及びＧＳ２１３８の４種の系統が強い抗酸化ストレスを示すと共に寿命も内外ことを見出してきた（非特許文献３参照）。
【０００４】
一方、本発明者らは、遺伝子を探索するためのベクターとしてＧＳベクター（Gene Search Vector）を開発してきた（非特許文献４、及び特許文献１参照）。このＧＳベクターは、マーカー遺伝子（例えば、白眼遺伝子（White gene）など）の両端に逆向きに１対のＵＡＳ配列−プロモーター領域−Ｐエレメント配列を有するものである。ＵＡＳ配列は、ＧＡＬ４の標的となるエンハンサー配列であり、Ｐエレメントはトランスポゾンの１種の配列である。このＧＳベクターを導入し、得られた個体をＧＡＬ４発現系の個体と交配させてＦ１雑種を作成する。このＦ１雑種はＧＡＬ４とＵＡＳエンハンサーにより、ＧＳベクターが挿入された位置の遺伝子を強制発現することになる。強制発現されたｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法などにより同定することにより、遺伝子を探索することが可能となる。本発明者らは、この方法により、長寿関連遺伝子の探索方法を開発してきた（特許文献２参照）。
このＧＳベクターを用いた方法では、Ｐエレメントとしてショウジョウバエのトランスポゾンを有しており、ゲノムにランダムに挿入して突然変異を作製するためのベクターとして極めて有用であるが、このトランスポゾンのよりＧＳベクターが挿入された遺伝子を特定するためには、発現したｍＲＮＡによる方法では特定が困難なことが多いだけでなく、解析に膨大な時間が必要であった。また、ＧＳベクターが挿入された遺伝子を特定するための他の方法としては、ＧＳベクターが挿入されたゲノムのベクター／ゲノム接合部を含む断片を特異的に増幅して配列を決定する方法が有効となる。このような方法として、ベクター／ゲノム接合部を含む断片をセルフゲーションによって環状化したＤＮＡを鋳型として、増幅するＩｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法が考えられる。しかし、この方法ではライゲーション時に鋳型ＤＮＡを低濃度に希釈するために、大きな容量で反応を行う必要がある。また、ゲノム上の制限酵素サイトがベクター端部に近い場合、ベクターの内部配列とゲノム配列とを区別するのが困難な場合があった。
【０００５】
このように、関連性のある遺伝子を網羅的に探索する方法としてＧＳベクターを用いる方法は有効ではあるが、ＧＳベクターが挿入された遺伝子を特定することが困難な場合が多く、ＧＳベクターが挿入されて特定の形質を発現している個体が特定されても、当該遺伝子を特定することが困難であった。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−３２９８６号
【特許文献２】特開２００３−１７４８８７号
【非特許文献１】Sun J. and Tower J., Mol. Cell Biol., 19, 216-228, 1999.
【非特許文献２】Ruan H., Tang XD., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 2748-2753, 2002.
【非特許文献３】T. Kaneuchi, T. Togawa, et al., Biogerontology, 4, 157-165, 2003.
【非特許文献４】G. Toba, T. Ohsako, et al., Genetics, 151, 725-737, 1999.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＧＳベクターが挿入された遺伝子を特定するため実用的な方法を提供することである。また、本発明は、個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定する方法を提供するものである。
さらに、本発明の目的は、酸化ストレスに対する抵抗性に関連する遺伝子及びそれがコードしているタンパク質を提供することである。より詳細には、本発明は、個体レベルにおける酸化ストレスに対する抵抗性に関連する遺伝子及びそれがコードしているタンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＧＳベクターが挿入された遺伝子を特定するため実用的な方法を検討してきた。その結果、ＧＳベクターが挿入されたゲノムＤＮＡを、３’末端が突出する断片を生成する制限酵素により消化し、これをプライマーエクステンション法によりベクター／ゲノム接合部を含む断片を特異的に複製し、得られた断片をアダプターライゲーション法により、その３’末端側に２本鎖ＤＮＡをライゲーションし、生成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、これを増幅し、これをシークエンスすることにより目的の遺伝子の塩基配列を簡便に、かつ効率よく決定することができることを見出した。
さらに、この方法により、酸化ストレスに強い個体における酸化ストレスに関連する遺伝子を網羅的に解析することに成功した。
【０００９】
即ち、本発明は、次の（１）〜（５）の工程、
（１）遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムを、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素で消化する工程、
（２）前記（１）の工程で消化されて生成した断片をプライマーエクステンション法によりベクター／ゲノム接合部を含む断片を複製する工程、
（３）得られた断片をアダプターライゲーション法により、その３’末端側に２本鎖ＤＮＡをライゲーションして２本鎖ＤＮＡを生成させる工程、
（４）生成させた２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、これを増幅する工程、
（５）得られた断片の塩基配列を決定する工程、
により、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法に関する。以下、本発明のこの方法をベクターＰＣＲ法と略称することもある。
また、本発明は、前記方法により特定された酸化ストレス感受性遺伝子、及び当該遺伝子がコードしているタンパク質に関する。より詳細には、本発明は、下記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子のいずれかに記載の塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子、及び当該遺伝子がコードしているタンパク質に関する。さらに詳細には本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性である遺伝子であって、下記の表２に示されるＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子、及び当該遺伝子がコードしているタンパク質に関する。
【００１０】
また、本発明は、前記方法により特定された酸化ストレス感受性遺伝子、及び当該遺伝子がコードしているタンパク質に関する。より詳細には、本発明は、下記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子のいずれかの塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子を含有してなる酸化ストレスに対する抵抗性調節用組成物、又は当該遺伝子がコードしているタンパク質を含有してなる酸化ストレスに対する抵抗性調節用組成物に関する。さらに詳細には本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性である遺伝子であって、下記の表２に示されるＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子を含有してなる酸化ストレスに対する抵抗性調節用組成物、及び当該遺伝子がコードしているタンパク質を含有してなる酸化ストレスに対する抵抗性調節用組成物に関する。
さらに、本発明は、前記方法により特定された酸化ストレス感受性遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。より詳細には、本発明は、下記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子のいずれかの塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。さらに詳細には本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性である遺伝子であって、下記の表２に示されるＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。
また、本発明は、前記方法により特定された酸化ストレス感受性遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。より詳細には、本発明は、下記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子のいずれかの塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。さらに詳細には本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性である遺伝子であって、下記の表２に示されるＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエに関する。
【００１１】
さらに、本発明は、前記方法により特定された酸化ストレス感受性遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた、又は当該遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエを用いて抗酸化物質をスクリーニングする方法に関する。より詳細には、本発明は、下記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子のいずれかの塩基配列、又は当該塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた、又は当該遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエに、試験物質を投与若しくは接触させ、又は試験物質の存在する環境下で飼育して、当該動物の試験物質に対する反応を測定することからなる、試験物質の抗酸化作用をスクリーニングする方法に関する。さらに詳細には本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性である遺伝子であって、下記の表２に示されるＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子の少なくとも１種の遺伝子を欠損させた、又は当該遺伝子の発現を増強させた動物、好ましくはショウジョウバエに、試験物質を投与若しくは接触させ、又は試験物質の存在する環境下で飼育して、当該動物の試験物質に対する反応を測定することからなる、試験物質の抗酸化作用をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）がゲノムに挿入された動物の中から、特定の表現型を有する個体を選別し、選別された個体における遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を、前記した本発明のベクターＰＣＲ法により同定することからなる個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定する方法に関する。
【００１２】
本発明をより詳細に説明すれば、以下のとおりとなる。
（１）次の（Ａ）〜（Ｅ）の工程、
（Ａ）遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムを、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素で消化する工程、
（Ｂ）前記（Ａ）の工程で消化されて生成した断片をプライマーエクステンション法によりベクター／ゲノム接合部を含む断片を複製する工程、
（Ｃ）得られた断片をアダプターライゲーション法により、その３’末端側に２本鎖ＤＮＡをライゲーションして２本鎖ＤＮＡを生成させる工程、
（Ｄ）生成させた２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、これを増幅する工程、
（Ｅ）得られた断片の塩基配列を決定する工程、
により、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法。
（２）３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素が、Ｈｈａｌである前記（１）に記載の方法。
（３）プライマーエクステンション法により複製された断片が、３’末端においてＡ（アデニン）が１塩基突出した断片である前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）がゲノムに挿入されたショウジョウバエの中から、特定の表現型を有する個体を選別し、選別された個体における遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法により同定することからなる個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定する方法。
（５）個体の表現型が、酸化ストレスに対する抵抗性である前記（４）に記載の方法。
（６）前記（４）に記載の方法の方法により個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定された遺伝子。
（７）個体の表現型が、酸化ストレスに対する抵抗性である前記（６）に記載の遺伝子。
（８）遺伝子が、ショウジョウバエ由来のものである前記（６）又は（７）に記載の遺伝子。
（９）酸化ストレスに対する抵抗性である前記（８）に記載の遺伝子が、ＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７のいずれかである前記（８）に記載の遺伝子。
（１０）酸化ストレスに対する抵抗性である前記（８）に記載の遺伝子が、ＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子である前記（８）又は（９）に記載の遺伝子。
（１１）前記（９）又は（１０）に記載の遺伝子がコードしているタンパク質。
（１２）前記（９）又は（１０）に記載の遺伝子の少なくとも１種の遺伝子をゲノム中に有するショウジョウバエにおいて、当該遺伝子を欠損させたショウジョウバエ。
（１３）前記（１２）に記載のショウジョウバエに、食品又は食品素材を投与又は接触させて、当該ショウジョウバエの食品又は食品素材に対する反応を測定することからなる、食品又は食品素材の抗酸化作用をスクリーニングする方法。
【００１３】
次に、本発明の遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法についてより具体的に説明する。
図１は遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）の構成の例を示したものである。この例は、特許文献１に記載されているＧＳベクターの例である。中心部のマーカー遺伝子（図１の白抜きの部分）があり、この例ではマーカー遺伝子として白眼遺伝子（White gene）が使用されている。その５’末端及び３’末端（逆向き配列である）にＧＡＬ４が標的とするＵＡＳエンハンサーが結合しており、さらにその両方の先にプロモーターが、この例ではヒートショックタンパク質ｈｓｐ７０遺伝子のコアプロモーターが結合している。そして、その両方の先にさらにトランスポゾン活性を有するＰエレメントが結合している。このＧＳベクターは、両末端に結合しているトランスポゾンの作用により、ゲノム中のランダムな位置に挿入される。ゲノムへの挿入は通常のトランスポゾンの挿入と同様に行うことができる。この例のＧＳベクターは、両向きの配列を備えているので、いずれの方向から挿入されても発現可能に設計されている。そして、プロモーター領域の下流側に転写開始点（図１では鈎付き矢印で示されている。）を設けている。
【００１４】
次に、本発明の遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法の概要を模式的にして、図２に示す。図２の上段の２本の線はゲノムＤＮＡを示し、線上の太く示されている箇所は挿入されたＧＳベクターを示している。
まず、ＧＳベクターが挿入されているゲノムを抽出する。抽出されるゲノムＤＮＡは、全ＤＮＡであってもよいが、標的とする部位だけのゲノムＤＮＡ、例えば第２染色体とか第３染色体とか、又はこれらの断片であってもよい。このようにして抽出されたゲノムＤＮＡを用いて、
（１）遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムを、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素で消化し、消化された断片を得る。
図２では消化される部位をゲノムの２本線に矢印で示している。
このときに使用される制限酵素は、平滑末端を生じるものではなく、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素を用いることが本発明の特徴のひとつである。もう一つの特徴は、ＧＳベクター中に当該制限酵素による切断部位を有していることである。したがって、この工程で得られる断片は、５’末端側がＧＳベクターの塩基配列を有しており、３’末端側が突出した形になっている。
この工程で使用される制限酵素としては、ＧＳベクター中に切断部位があり、かつ３’末端側が突出した形の断片を生成するものであれば、特に制限はなく、好ましい制限酵素としては、Ｈｈａｌなどが挙げられる。
【００１５】
次いで、工程（１）で得られたＤＮＡ断片を、次の
（２）前記（１）の工程で消化されて生成した断片をプライマーエクステンション法によりベクター／ゲノム接合部を含む断片を複製する工程、
で処理する。このときに使用されるプライマーとしては、得られたＤＮＡ断片の５’末端はＧＳベクター由来の塩基配列を有しているので、ＧＳベクター内の任意の塩基配列に適合するように選定することができる。
この工程で使用される好ましいプライマーの例を次に示す。
フォーワードプライマーの例：
ＧＳＶ２：５’−ＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣ−３’
ＧＳＶ３：５’−ＣＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＴＣＧ−３’
ＧＳＶ６：５’−ＧＣＡＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧ−３’
ＧＳＶ７：５’−ＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧＴＧ−３’
（前記プライマー中のＧＳＶの名称は本発明者らが命名したものである。）
リバースプライマーの例：
５’−ＣＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧ−３’
この工程では、このようなプライマーを用いて、Ｔａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼにより、ベクター／ゲノム接合部を含む断片を特異的に複製することができる。このとき、複製酵素の特性により複製されたＤＮＡ鎖の３’端に１塩基のＡ（アデニン）が鋳型に非依存的に付加されることになる。このように、プライマーエクステンション法において、３’端にＡを付加するＤＮＡ合成酵素を使うことは、本発明の方法の特徴の一つである。図２の（２）の段階を参照されたい。
【００１６】
次いで、
（３）得られた断片をアダプターライゲーション法により、その３’末端側に２本鎖ＤＮＡをライゲーションして２本鎖ＤＮＡを生成させる工程、
を行う。このために、相補鎖にＴ（チミン）が１塩基突出した２本鎖ＤＮＡを使用する。使用される２本鎖ＤＮＡの塩基配列や長さは特に制限はないが、長さは次の工程で行われるＰＣＲ法におけるプライマーを用意することができる長さであればよい。通常は１０〜５０ｍｅｒ、好ましくは１０〜３０ｍｅｒ程度である。好ましい２本鎖ＤＮＡの例を示すと次のものが挙げられる。
５’−ＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣ−３’
３’−ＴＣＴＴＡＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＡＴＧＧＣ−５’
この工程で使用される酵素も、通常のアダプターライゲーション法に使用される酵素であれば特に制限はない。
この処理により、ライゲーションされた２本鎖ＤＮＡが生成される。
【００１７】
得られた２本鎖ＤＮＡの断片の５’末端はＧＳベクターに由来する塩基配列を有しており、また３’末端は前記の工程でライゲーションしたオリゴヌクレオチドの塩基配列を有している。したがって、
（４）生成させた２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、これを増幅する工程、
におけるプライマーは前記した塩基配列に基づいて任意に選定することができる。
この工程におけるＰＣＲ法としては、通常の単純に増幅する場合のＰＣＲ法であるが、前記で例示したように末端が平滑末端とならないようなライゲーションを行った場合には、突出末端が切断されることになるので、この工程のＰＣＲ法は２段階に分けて行うのが好ましい。この工程におけるＰＣＲ法は、通常のＰＣＲ法と同様に行うことができる。
この工程で使用される好ましいプライマーを例示する。
第一段目のプライマーセット：
フォーワードプライマー：
配列４：５’−ＧＣＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧ−３’
ＧＳＶ２：５’−ＧＡＡＣＴＣＴＧＡＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧ−３’
ＧＳＶ３：５’−ＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＧＡＡＴＴＡＧＧＣＣＴＴＣＴＡＧ−３’
ＧＳＶ６：５’−ＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣ−３’
ＧＳＶ７：５’−ＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧ−３’
（前記プライマー中のＧＳＶの名称は本発明者らが命名したものである。）
リバースプライマー：
５’−ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＴＡＣ−３’
第二段目のプライマーセット：
フォーワードプライマー：
配列６：５’−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣ−３’
５’−ＣＣＡＣＧＴＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＣ−３’
リバースプライマー
５’−ＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＴＡＣＴＣＧＣ−３’
【００１８】
以上のようにして増幅されたＤＮＡ断片を用いて、
（５）得られた断片の塩基配列を決定する工程、
を行う。これらのＤＮＡ断片の塩基配列の決定法も特に制限はない。公知のいずれの決定法も使用することができ、ＤＮＡ断片の長さや、特性に応じて適宜選定することができる。
例えば、次のプライマー：
５’−ＴＣＧＴＣＣＧＣＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＣＣＴＣ−３’
５’−ＣＴＣＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣＡＡＴＡＣＧＡＣＡＣＴＣ−３’
のセットを用いて常法に従って配列決定を行うことができる。
【００１９】
本発明の遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法（以下、ベクターＰＣＲ法と称することもある。）は、遺伝子を発現させる必要も無く、また前記したインバース−ＰＣＲ法による欠点を解決するものであり、信頼性も高く、さらに、全ての反応を１００μｌ以下の容量でも実行することができ、簡便に行うことができる。また、本発明の方法における各工程は、既に機械化が進展している工程であり、全工程を自動化することも可能であり、大量の資料を少量の容器で確実に信頼性よく、かつ迅速に処理することができる。
本発明のベクターＰＣＲ法を用いることにより、個体レベルでの発現遺伝子の特定を行うことができる。ＧＳベクターが挿入された動物、例えばショウジョウバエの作成手法は非特許文献４や特許文献１に開示されているが、従来ＧＳベクターが挿入されている部位の遺伝子を特定することができる方法が確立されておらず、ＧＳベクターによる遺伝子の探索が実用的な域に達していなかった。本発明は、この大きな障害となっていた手法を確立させるものであり、本発明により特定の機能を有する遺伝子の探索が、極めて簡便に活確実に行えることになる。
【００２０】
したがって、本発明は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）がゲノムに挿入された動物の中から、特定の表現型を有する個体を選別し、選別された個体における遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を、本発明のベクターＰＣＲ法により同定することからなる個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定する方法を提供するものである。
本発明のこの方法における「表現型」としては、ＧＳベクターの挿入により獲得又は喪失したものであれば特に制限はなく、生物学における表現型であってもよく、また変薬剤感受性や機能性食品に対する感受性などのような特定の物質に対する応答性であってもよい。さらに、器官に異常や奇形を生じるような「表現型」であってもよい。本明細書においては、酸化ストレスに対する感受性に基づく「表現型」による選別と、当該「表現型」に関連する遺伝子の同定法について具体的に開示する。
本発明のこの方法における動物としては、ＧＳベクターを挿入することができるもの、即ち、トランスポゾン活性を有するベクターをゲノム中に挿入することが可能なものであればよいが、特にショウジョウバエが好ましい。ショウジョウバエは飼育が容易で、体型も小さく、生活環も約１０日余りと短く、低コスト化が可能であるばかりでなく、遺伝子の研究材料として古くから研究されてきており高度な解析技術が確立されており、かつヒトと相同な遺伝子を多数有していることから、モデル動物として特に好ましいものである。
また、発現系についても前記の説明で例示してきたＧＡＬ系とＵＡＳエンハンサー系に限定されるものではなく、他の発現系を適用することも可能である。
【００２１】
さらに、本発明のこの方法によって特定された高感受性系統の動物、好ましくはショウジョウバエを使って、有用な薬剤や機能性食品素材を評価するシステムを構築することもできる。例えば、特定された感受性に関連する遺伝子を欠損又は過剰発現するモデル動物を作成して、当該モデル動物における試験物質に対する感受性を測定することにより、試験物質に生体に及ぼす作用効果を簡便にかつ確実にスクリーニングすることができる。本明細書では、酸化ストレスについてさらに具体的に後述するが、酸化ストレスに限定されるものではなく、例えば、（１）人体が接触または吸引する成分を含む材料や塗料を使用した生活用品、薬品、飲食品、化粧品などの健康に及ぼす影響の評価、（２）上記に関する新規有用素材の探索および開発、（３）上記に関する有害物質の評価、除去法の開発、（４）ヒトや家畜の病気の予防、診断、治療法の開発、及び（５）病気につよい動植物（家畜）などの品種改良などに、本発明のこの方法を適用することができる。
【００２２】
本発明者らは、非特許文献３に記載されている酸化ストレスに対するショウジョウバエの試験装置を用いて、ＧＳベクターが挿入されたショウジョウバエとＧＡＬ４発現系のショウジョウバエとのＦ１雑種のショウジョウバエを用いて酸化ストレスに対する感受性に基づく個体の選別を行った。
このようにして選別された個体から、本発明のベクターＰＣＲ法を用いて、ＧＳ系統のゲノムに挿入されたベクターに隣接するゲノム配列を特異的に増幅し、約１１，０００系統の配列を決定した。これらの決定された塩基配列を用いて、データベースによりブラスト検索（Blast search）を行い、挿入位置にある遺伝子を特定した。その結果、半数以上の挿入が遺伝子の転写開始点近傍にあることが判明した（図３参照）。ＧＳベクターはＧＡＬ転写因子に依存した強制転写機能を有するため，転写開始点近傍にある挿入系統をＧＡＬ４発現系統に交配することにより、その遺伝子を強制発現することができる。挿入位置が判明したＧＳ系統のショウジョウバエについて、過酸化水素水を含む培地で飼育し、酸化ストレスに対する抵抗性を確認した。その結果、次の表１に示される１７種の遺伝子のいずれかを強制発現したものが抵抗性を示した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
表１中における＊印は、ＧＳ系統をｈｓ−ＧＡＬ４系統に交配し、そのＦ１雄（各９６個体）について、過酸化水素を含む培地で飼育したときの生存率を、対照群（ベクター挿入をもたない系統とｈｓ−ＧＡＬ４系統と交配したＦ１個体）との相対値で示した。生存期間の測定方法はカネウチらの方法（Kaneuchi et al, Biogerontology, 4,157-165 (2003)）による。表１中の＊＊印は、今回えられた表現型に基づいて、それぞれの遺伝子に本発明者らが付した新名称である。
表１中の「ＧＳ系統」は、ＧＳ系統ショウジョウバエの系統の番号を示し、「ベクター近接遺伝子」はブラスト検索でヒットした遺伝子の名称を示している。
表１に示されるように、ＧＳ系統の９００２、９０３３、９０４３、９０５７、９１７１、９３３２、９３４５、９７５１、９９２５、９９５６、１０４７５、１０５０３、１０５１４、１０６３６、１１０９５、１１３２３、及び１１３９７から、ＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７の１７種の遺伝子を確認することができた。
【００２５】
これらの遺伝子の塩基配列に基づいて、データベースによりブラスト検索（Blast search）を行い、３８種の構造遺伝子（タンパク質をコードしていると推定される塩基配列を有する遺伝子）を確認した。これらの中には同じ遺伝子のアイソフォームも含まれている。即ち、ＯｘＲ１からは、ＣＧ１００８２−ＲＡとＣＧ１００８２−ＲＢと命名される２種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ２からは、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、及びＣＧ３１３０５−ＲＪと命名される７種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ３からは、ＣＧ７４０５−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ４からは、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、及びＣＧ８５２２−ＲＣと命名される３種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ５からは、ＣＧ１０１６５−ＲＡとＣＧ１０１６５−ＲＢと命名される２種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ６からは、ＣＧ９８０４−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ７からは、ＣＧ１３６４５−ＲＡとＣＧ１３６４５−ＲＢと命名される２種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ８からは、ＣＧ１１５１８−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ９からは、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、及びＣＧ５６７０−ＲＨと命名される８種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１０からは、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、及びＣＧ１０２７２−ＲＤと命名される４種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１１からは、ＣＧ１２４５−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１２からは、ＣＧ１３１１−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１３からは、ＣＧ１５０９２−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１４からは、ＣＧ３２１００−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１５からは、ＣＧ１０９３９−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１６からは、ＣＧ８０６７−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。ＯｘＲ１７からは、ＣＧ１００５５−ＲＡと命名される１種の遺伝子が検索された。
即ち、本発明は、酸化ストレスに対する抵抗性に関連する、ＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる遺伝子、及び当該遺伝子がコードするタンパク質を提供するものである。
これらの３８種の遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、表２に示されるＮＣＢＩアクセッション番号に基づいてＮＣＢＩにアクセスすることにより入手することができる。
これらの３８種の遺伝子をまとめて、次の表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
表２中の配列番号は、本発明の遺伝子の番号を奇数の番号で示し、ＧＳ系統は前記表１に示したＧＳ系統を示し、ＯｘＲ番号は前記表１に示したＯｘＲの番号を示し、遺伝子名は検索された遺伝子の名称を示し、ＮＣＢＩ番号はＮＣＢＩのアクセッション番号を示し、塩基数は当該遺伝子の全塩基数を示し、ＣＤＳ番号はＯＲＦの塩基番号を示し、アミノ酸数は当該遺伝子がコードしているタンパク質のアミノ酸数を示す。
【００２８】
この表１に挙げた遺伝子は何らかの機能により生体の酸化ストレスに対する抵抗性に関与していることは前記した過酸化水素を含む培地での飼育実験からも明らかであるが、このような酸化ストレスに対する抵抗性のメカニズムについては必ずしも解明されていない。カタラーゼやＳＯＤのような還元による抵抗性によるものかもしれないし、酸化物（ＲＯＳ）の生成の抑制によるものかもしれないし、また個体における体質的なものによるものかもしれない。いずれにしても、本発明のこの方法による特徴は、メカニズムに関係なく関連する遺伝子を網羅的に探索することが可能となっていることである。そして、細胞レベルでのスクリーニング法とは異なり個体レベル、即ち個体の体質による関連性についても網羅的に探索することができることである。
したがって、本発明は、前記した酸化ストレス感受性遺伝子又は当該遺伝子がコードしているタンパク質を含有してなる酸化ストレスに対する抵抗性調節用組成物を提供するものである。本発明の酸化ストレス感受性遺伝子は、前記の表１に示されるＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７として示される遺伝子の塩基配列を有するものだけでなく、当該塩基配列と少なくとも５０％以上、好ましくは７０％又は８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子であればよい。これらの遺伝子がコードしているタンパク質のアミノ酸配列に基づくならば、アミノ酸配列において少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上又は９０％、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質が包含される。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法としては、次の（１）から（３）、
（１）本発明で示された酸化ストレス感受性遺伝子の少なくとも１種の遺伝子が欠損又は過剰に発現しているモデル動物、好ましくはショウジョウバエに、
（２）試験物質を投与若しくは接触させ、又は試験物質の存在する環境下で飼育して、
（３）当該試験物質による、当該動物の試験物質に対する反応を測定する、
ことからなるものである。
この方法における動物としては、昆虫、は虫類、両生類などが挙げられるが、昆虫が好ましい。特に好ましい昆虫としては、ショウジョウバエが挙げられる。ショウジョウバエは飼育が容易で、体型も小さく、生活環も約１０日余りと短く、低コスト化が可能であるばかりでなく、遺伝子の研究材料として古くから研究されてきており高度な解析技術が確立されており、かつヒトと相同な遺伝子を多数有していることから、モデル動物として特に好ましいものである。
本発明のスクリーニングする方法により、酸化ストレスに対する抵抗性を調整することができる物質を探索することができる。このような物質としては、抗酸化作用を有する化学物質のみならず、人体が接触または吸引する成分を含む材料や塗料を使用した生活用品、薬品、飲食品、化粧品などが挙げられる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のベクターＰＣＲ法は、遺伝子を発現させる必要も無く、また前記したインバース−ＰＣＲ法による欠点を解決するものであり、信頼性も高く、さらに、全ての反応を１００μｌ以下の容量でも実行することができ、簡便に行うことができる。また、本発明の方法における各工程は、既に機械化が進展している工程であり、全工程を自動化することも可能であり、大量の資料を少量の容器で確実に信頼性よく、かつ迅速に処理することができる。したがって、本発明のベクターＰＣＲ法を使用することにより、特定された感受性に関連する遺伝子を欠損又は過剰発現するモデル動物を作成して、当該モデル動物における試験物質に対する感受性を測定することにより、試験物質に生体に及ぼす作用効果を簡便にかつ確実にスクリーニングすることができるようになる。
また、本発明により提供される酸化ストレスに対する抵抗性に関与する遺伝子は個体の酸化ストレスに対する抵抗性を調整することができるものであり、当該遺伝子を欠損させたり、当該遺伝子を過剰に発現するモデル動物を作成して各種の試験物質をスクリーニングすることができる。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
ＧＳベクターの構築
Ｐエレメント形質転換ベクターｐＣa ＳpeＲ３（Gene 74:445-456, 1988 ）に対してＰＣＲ法を用いて変異を導入し、５’Ｐ末端近傍のＰ転移酵素コード領域内にＥcoＲＩ部位を作成した。ｐＵＡＳＴ（Development 118:401-415, 1993 ）のｈｐｓ７０遺伝子由来コアプロモーターを連結したＵＡＳの５個のタンデムリピートを５’Ｐ末端近傍のＥcoＲＩ部位と、３’ｐ末端近傍のマルチクローニングサイトにあるＸhoＩ部位に挿入し、図１にその構成を模式的に示したＧＳベクターを作成した。なおこのＧＳベクターは、２組のＵＡＳエンハンサー／プロモーターの間にマーカー遺伝子として白眼遺伝子を有しており、全長は５，２５４ｂｐである。
【実施例２】
【００３３】
ＧＳベクターの挿入
前記の実施例１で作成したＧＳベクターをショウジョウバエ（y w 系統：東京都立大より入手）に導入し、遺伝子導入ハエを作成した。次いで、転移酵素delta2-3を用いてＧＳベクターを転移させ、６１３のＧＳベクター挿入系統を作成した。その内訳は、ＧＳベクターの転移先がＸ染色体であるもの１４７系統、第２染色体であるもの２２６系統、第３染色体であるもの２３７系統、第４染色体であるもの３系統であった。また、３９４系統（64％）は少なくとも１つの検出可能な表現型（例えば、致死性や成体構造の欠損）を示した。
【実施例３】
【００３４】
ＧＳ系ショウジョウバエの作成
実施例１で作成したＧＳベクター挿入系統のうち、何らかの検出可能な表現型を示した３９４系統から１６３系統を無作為に選択し、ＧＡＬ４発現系統とを交配させて子孫（Ｆ１）個体を産出させ、転写因子ＧＡＬ４によって強制的に発現させた転写産物を分析した。なお、ＧＡＬ４発現系統としては、dpp-ＧＡＬ４、sev-ＧＡＬ４、hs- ＧＡＬ４、29ＢＤ- ＧＡＬ４およびc355- ＧＡＬ４（いずれもBloomington Stock Centerより入手）を使用した。
【実施例４】
【００３５】
酸化ストレス抵抗性のショウジョウバエの選択
非特許文献３に記載の装置を用いて、実施例３で作成したショウジョウバエを試験した。その結果表１の「ＧＳ系統」の欄に示される１７系統のものを選別した。
【実施例５】
【００３６】
ＧＳベクターの挿入部位の遺伝子の特定
選別されてきたショウジョウバエのゲノムＤＮＡを抽出し、３’突出型断片を生成する制限酵素ＨｈａＩにより消化した。ベクターの一部に対応している次のプライマー
フォーワードプライマーの例：
ＧＳＶ２：５’−ＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣ−３’
ＧＳＶ３：５’−ＣＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＴＣＧ−３’
ＧＳＶ６：５’−ＧＣＡＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧ−３’
ＧＳＶ７：５’−ＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＧＴＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧＴＧ−３’
（前記プライマー中のＧＳＶの名称は本発明者らが命名したものである。）
リバースプライマーの例：
５’−ＣＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧ−３’
を用いて、Ｔａｑポリメラーゼにより、ベクター／ゲノム接合部を含む断片を特異的に複製した（プライマーエクステンション）。このとき、複製酵素の特性により、複製されたＤＮＡ鎖の３’端に１塩基のＡが鋳型非依存的に付加された。この突出したＡに対合するＴを３’端に突出する次に示す
５’−ＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣ−３’
３’−ＴＣＴＴＡＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＡＴＧＧＣ−５’
２本鎖ＤＮＡをライゲーションした（アダプターライゲーション）。これによって生成される２本鎖ＤＮＡを鋳型として、さらに次のプライマーのセット
フォーワードプライマー：
配列４：５’−ＧＣＧＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧ−３’
ＧＳＶ２：５’−ＧＡＡＣＴＣＴＧＡＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧ−３’
ＧＳＶ３：５’−ＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＧＡＡＴＴＡＧＧＣＣＴＴＣＴＡＧ−３’
ＧＳＶ６：５’−ＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣ−３’
ＧＳＶ７：５’−ＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧ−３’
（前記プライマー中のＧＳＶの名称は本発明者らが命名したものである。）
リバースプライマー：
５’−ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＴＡＣ−３’
を用いて１回目のＰＣＲを行った。続いて、次に示すプライマー
フォーワードプライマー：
配列６：５’−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣ−３’
５’−ＣＣＡＣＧＴＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＣ−３’
リバースプライマー
５’−ＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＴＡＣＴＣＧＣ−３’
を用いて、２回目のＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物をシークエンス反応の鋳型として、次に示すプライマー
５’−ＴＣＧＴＣＣＧＣＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＣＣＴＣ−３’
５’−ＣＴＣＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣＡＡＴＡＣＧＡＣＡＣＴＣ−３’
を用いて配列を決定した。
この結果、ＧＳ系統のゲノムに挿入されたベクターに隣接するゲノム配列を特異的に増幅し、配列を決定した（１１，０００系統）。それらを用いて、Ｂｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈを行い、挿入位置にある遺伝子を特定した。
その結果、半数以上の挿入が遺伝子の転写開始点近傍にあることが判明した（図３参照）。ＧＳベクターはＧＡＬ転写因子に依存した強制転写機能を有するため，転写開始点近傍にある挿入系統をＧＡＬ４発現系統に交配することにより、その遺伝子を強制発現することができる。挿入位置が判明したＧＳ系統について、過酸化水素水を含む培地で飼育したところ、表１に示す１７個の遺伝子を強制発現したものが抵抗性を示した。
この結果、同定されたＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７の１７種の遺伝子を表１に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）による遺伝子の探索のための新規な遺伝子の同定方法を提供し、この方法により個体レベルでの各種の感受性遺伝子の探索を可能し、酸化ストレスに対する感受性遺伝子の同定に成功したものであり、個体レベルでの酸化ストレスに対する抵抗性を調整できる新規な遺伝子を提供するものである。また、本発明はこれらの遺伝子による、新規なスクリーニング方法を提供するものである。
したがって、本発明は、医薬産業、化粧品産業、食品産業、さらに健康産業などの各種の産業分野において利用可能性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）の構成を例示したものである。
【図２】図２は、本発明の遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法の概要を模式的に示したものである。
【図３】図３は、本発明の遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法により解析された遺伝子の転写開始点からＧＳベクターの挿入部位までの距離を頻度グラフで示したものである。グラフの縦軸は挿入頻度（％）を示し、横軸は転写開始点からＧＳベクターの挿入部位までの距離（ｋｂ）を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３９】
配列番号１ ： プライマーＧＳＶ２の塩基配列
配列番号２ ： プライマーＧＳＶ３の塩基配列
配列番号３ ： プライマーＧＳＶ６の塩基配列
配列番号４ ： プライマーＧＳＶ７の塩基配列
配列番号５ ： リバースプライマー
配列番号６ ： アダプターライゲーション用オリゴヌクレオチド
配列番号７ ： アダプターライゲーション用オリゴヌクレオチド
配列番号８ ： 前記配列４で示されるオリゴヌクレオチド
配列番号９ ： プライマーＧＳＶ２の塩基配列
配列番号１０： プライマーＧＳＶ３の塩基配列
配列番号１１： プライマーＧＳＶ６の塩基配列
配列番号１２： プライマーＧＳＶ７の塩基配列
配列番号１３： リバースプライマー
配列番号１４： 前記配列６で示されるオリゴヌクレオチド
配列番号１５： フォーワードプライマー
配列番号１６： リバースプライマー
配列番号１７： フォーワードプライマー
配列番号１８： リバースプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）〜（５）の工程、
（１）遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムを、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素で消化する工程、
（２）前記（１）の工程で消化されて生成した断片をプライマーエクステンション法によりベクター／ゲノム接合部を含む断片を複製する工程、
（３）得られた断片をアダプターライゲーション法により、その３’末端側に２本鎖ＤＮＡをライゲーションして２本鎖ＤＮＡを生成させる工程、
（４）生成させた２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、これを増幅する工程、
（５）得られた断片の塩基配列を決定する工程、
により、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法。
【請求項２】
３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素が、Ｈｈａｌである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマーエクステンション法により複製された断片が、３’末端においてＡ（アデニン）が１塩基突出した断片である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）がゲノムに挿入されたショウジョウバエの中から、特定の表現型を有する個体を選別し、選別された個体における遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を、請求項１〜３のいずれかに記載の方法により同定することからなる個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定する方法。
【請求項５】
個体の表現型が、酸化ストレスに対する抵抗性である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法の方法により個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定された遺伝子。
【請求項７】
個体の表現型が、酸化ストレスに対する抵抗性である請求項６に記載の遺伝子。
【請求項８】
遺伝子が、ショウジョウバエ由来のものである請求項６又は７に記載の遺伝子。
【請求項９】
酸化ストレスに対する抵抗性である請求項８に記載の遺伝子が、ＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７のいずれかである請求項８に記載の遺伝子。
【請求項１０】
酸化ストレスに対する抵抗性である請求項８に記載の遺伝子が、ＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子である請求項８又は９に記載の遺伝子。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の遺伝子がコードしているタンパク質。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の遺伝子の少なくとも１種の遺伝子をゲノム中に有するショウジョウバエにおいて、当該遺伝子を欠損させたショウジョウバエ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のショウジョウバエに、食品又は食品素材を投与又は接触させて、当該ショウジョウバエの食品又は食品素材に対する反応を測定することからなる、食品又は食品素材の抗酸化作用をスクリーニングする方法。
【請求項１】
次の（１）〜（５）の工程、
（１）遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムを、３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素で消化する工程、
（２）前記（１）の工程で消化されて生成した断片をプライマーエクステンション法によりベクター／ゲノム接合部を含む断片を複製する工程、
（３）得られた断片をアダプターライゲーション法により、その３’末端側に２本鎖ＤＮＡをライゲーションして２本鎖ＤＮＡを生成させる工程、
（４）生成させた２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って、これを増幅する工程、
（５）得られた断片の塩基配列を決定する工程、
により、遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を同定する方法。
【請求項２】
３’末端側が突出した形の断片を生成する制限酵素が、Ｈｈａｌである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマーエクステンション法により複製された断片が、３’末端においてＡ（アデニン）が１塩基突出した断片である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）がゲノムに挿入されたショウジョウバエの中から、特定の表現型を有する個体を選別し、選別された個体における遺伝子探索ベクター（ＧＳベクター）が挿入されたゲノムにおける遺伝子を、請求項１〜３のいずれかに記載の方法により同定することからなる個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定する方法。
【請求項５】
個体の表現型が、酸化ストレスに対する抵抗性である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法の方法により個体の特定の表現型に関連する遺伝子を網羅的に同定された遺伝子。
【請求項７】
個体の表現型が、酸化ストレスに対する抵抗性である請求項６に記載の遺伝子。
【請求項８】
遺伝子が、ショウジョウバエ由来のものである請求項６又は７に記載の遺伝子。
【請求項９】
酸化ストレスに対する抵抗性である請求項８に記載の遺伝子が、ＯｘＲ１〜ＯｘＲ１７のいずれかである請求項８に記載の遺伝子。
【請求項１０】
酸化ストレスに対する抵抗性である請求項８に記載の遺伝子が、ＣＧ１００８２−ＲＡ、ＣＧ１００８２−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＡ、ＣＧ３１３０５−ＲＢ、ＣＧ３１３０５−ＲＤ、ＣＧ３１３０５−ＲＦ、ＣＧ３１３０５−ＲＧ、ＣＧ３１３０５−ＲＩ、ＣＧ３１３０５−ＲＪ、ＣＧ７４０５−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＡ、ＣＧ８５２２−ＲＢ、ＣＧ８５２２−ＲＣ、ＣＧ１０１６５−ＲＡ、ＣＧ１０１６５−ＲＢ、ＣＧ９８０４−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＡ、ＣＧ１３６４５−ＲＢ、ＣＧ１１５１８−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＡ、ＣＧ５６７０−ＲＢ、ＣＧ５６７０−ＲＣ、ＣＧ５６７０−ＲＤ、ＣＧ５６７０−ＲＥ、ＣＧ５６７０−ＲＦ、ＣＧ５６７０−ＲＧ、ＣＧ５６７０−ＲＨ、ＣＧ１０２７２−ＲＡ、ＣＧ１０２７２−ＲＢ、ＣＧ１０２７２−ＲＣ、ＣＧ１０２７２−ＲＤ、ＣＧ１２４５−ＲＡ、ＣＧ１３１１−ＲＡ、ＣＧ１５０９２−ＲＡ、ＣＧ３２１００−ＲＡ、ＣＧ１０９３９−ＲＡ、ＣＧ８０６７−ＲＡ、及びＣＧ１００５５−ＲＡからなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、又は当該塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、酸化ストレスに対する抵抗性を有するタンパク質をコードしている遺伝子である請求項８又は９に記載の遺伝子。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の遺伝子がコードしているタンパク質。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の遺伝子の少なくとも１種の遺伝子をゲノム中に有するショウジョウバエにおいて、当該遺伝子を欠損させたショウジョウバエ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のショウジョウバエに、食品又は食品素材を投与又は接触させて、当該ショウジョウバエの食品又は食品素材に対する反応を測定することからなる、食品又は食品素材の抗酸化作用をスクリーニングする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−１２９９３４（Ｐ２００７−１２９９３４Ａ）
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３２４９８０（Ｐ２００５−３２４９８０）
【出願日】平成１７年１１月９日（２００５．１１．９）
【出願人】（３０５０２７４０１）公立大学法人首都大学東京 (385)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月９日（２００５．１１．９）
【出願人】（３０５０２７４０１）公立大学法人首都大学東京 (385)
【Ｆターム（参考）】
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