遺伝子改変された非ヒト哺乳動物および非ヒト細胞
遺伝子改変された哺乳動物が、記載される。この哺乳動物は、マンナン結合レクチン会合型セリンプロテアーゼであるＭＡＳＰ−２を欠く。その哺乳動物の生成のための方法および構築物もまた、記載される。そのような哺乳動物は、補体系の障害のためのモデルとして有用であり、そしてそのような障害のための処置の同定において有用である。会合型タンパク質Ｍａｐ１９を欠く哺乳動物もまた、記載される。そのような哺乳動物は、ＭＡＳＰ−２もまた欠き得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物（特に、遺伝子改変された非ヒト齧歯類（例えば、マウス））に関し、これらは、いかなる内因性のマンナン結合レクチン会合型（ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）セリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ−２）ポリペプチドも生成しない。本発明はまた、遺伝子改変された非ヒト細胞（特に、胚性幹細胞）（特に、齧歯類細胞（例えば、マウス細胞））に関し、これらは、いかなる内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドも生成しない。本発明はまた、遺伝子改変された非ヒト細胞（特に、胚性幹細胞）およびそれらから生成される遺伝子改変された非ヒト哺乳動物、ならびに内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子がゲノムから欠失しているかまたは破壊されている非ヒト哺乳動物および非ヒト細胞の生成における上記の使用に関する。本発明の局面はまた、いかなる内因性のマンナン結合レクチン会合型タンパク質１９（ＭＡｐ１９）タンパク質も生成しない、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物および非ヒト細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
補体系は、微生物感染および他の急性傷害に対する炎症性応答を開始して増幅するための早期作用機構を提供する（Ｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｍ．Ｋ．およびＪ．Ｐ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ，１９９３，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。補体活性化は、潜在的病原体に対する有益な最前線の防御を提供するが、防御的炎症性応答を促進する補体の活性化はまた、宿主に対して潜在的な脅威も示し得る（非特許文献１；非特許文献２）。例えば、Ｃ３タンパク質分解性産物およびＣ５タンパク質分解性産物は、好中球を動員して活性化する。これらの活性化された細胞は、破壊的酵素を無差別に放出して、器官損傷を引き起こし得る。さらに、補体活性化は、近傍の宿主細胞上および微生物標的上における溶解性補体成分の沈着を引き起こし得、これによって、宿主細胞の溶解が生じる。
【０００３】
補体系は、多数の急性疾患状態および慢性疾患状態（心筋梗塞、脳卒中後の血管再生、ＡＲＤＳ、再灌流傷害、敗血症性ショック、熱傷後の毛細血管漏出、心肺バイパス後の炎症、移植拒絶、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、およびアルツハイマー病が挙げられる）の病因に寄与すると関係付けられている。これらの状態のほぼすべてにおいて、補体は、原因ではないが、病因に関与するいくつかの要因のうちの１つではある。それにも関わらず、補体活性化は、主要な病理学的機構であり得、これらの疾患状態のうちの多くにおける臨床的コントロールのための有効な目標を示す。種々の疾患状態における補体媒介性組織傷害の重要性について高まりつつある認識は、有効な補体阻害薬物についての必要性を明確に示す。補体活性化を特異的に標的化して阻害する薬物は、ヒトのための使用について認可されていない。
【０００４】
現在、補体系は、３つの別個の経路（古典的経路、レクチン経路、および副経路）を介して活性化され得ることが、広く受け入れられている。古典的経路は、通常は、外来粒子（すなわち、抗原）に結合している抗体によって誘発され、従って、これには、特定の抗体の生成のためにその抗原に前もって曝露されていることが必要である。古典的経路の活性化は、免疫応答の発生に関係するので、古典的経路は、後天的免疫系の一部である。対照的に、レクチン経路および副経路は、クローン性（ｃｌｏｎａｌ）免疫とは独立しており、先天性免疫系の一部である。
【０００５】
古典的経路の活性化における第一の段階は、抗原結合型ＩｇＧおよび抗原結合型ＩｇＭに対する、特異的認識分子Ｃ１ｑの結合である。補体系の活性化は、セリンプロテアーゼであるチモーゲンの連続的活性化を生じる。Ｃ１ｑは、Ｃ１と呼ばれる複合体として、Ｃ１ｒおよびＣｌｓというセリンプロテアーゼプロ酵素と会合する。免疫複合体に対するＣ１ｑの結合の際に、Ｃ１ｒのＡｒｇ−Ｉｌｅ部位の自己タンパク質分解性切断の後に、Ｃ１ｓのＣ１ｒ活性化が生じ、これによって、Ｃ４およびＣ２を切断する能力を獲得する。Ｃ４が２つのフラグメント（Ｃ４ａおよびＣ４ｂと呼ばれる）へと切断されると、Ｃ４ｂフラグメントは、隣接するヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することが可能になり、その後、活性化したＣ２のＣ２ｂフラグメントとの非共有結合を介してＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）が生成する。Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）は、Ｃ３を活性化して、Ｃ５コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ）の生成と、微生物溶解を引き起こし得る膜攻撃複合体（Ｃ５ｂ−９）の形成とをもたらす。活性化形態のＣ３およびＣ４（Ｃ３ｂおよびＣ４ｂ）は、外来標的表面上に共有結合的に沈着され、これらは、複数の食細胞上の補体レセプターによって認識される。
【０００６】
独立して、レクチン経路による補体系の活性化における第一の段階もまた、特定の認識分子の結合であり、この後に、会合型セリンプロテアーゼが活性化する。しかし、Ｃ１ｑによる免疫複合体の結合ではなく、レクチン経路における上記認識分子は、血清糖質結合タンパク質（マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）、Ｈ−フィコリン、Ｍ−フィコリン、およびＬ−フィコリン）である（非特許文献３）。Ｉｋｅｄａらは、Ｃ１ｑと同様に、ＭＢＬが、酵母のマンナンで覆われた赤血球に結合する際にＣ４依存的様式で補体系を活性化し得ることを、初めて実証した（非特許文献４）。ＭＢＬ（コレクチンタンパク質ファミリーのメンバーである）は、ピラノース環の赤道面において方向付けられた３−ヒドロキシル基および４−ヒドロキシル基によって糖質と結合する、カルシウム依存性レクチンである。従って、ＭＢＬに対する著名なリガンドは、Ｄ−マンノースおよびＮ‐アセチル−Ｄ−グルコサミンであるが、この立体的要件に適合しない糖質は、ＭＢＬに対して検出可能な親和性を有さない（非特許文献５）。ＭＢＬと一価糖との間の相互作用は、非常に弱く、解離定数は、代表的は、２ｍＭの範囲にある。ＭＢＬは、複数の単糖残基と同時に相互作用することによって、グリカンリガンドへの緊密な特異的結合を達成する（非特許文献６）。ＭＢＬは、微生物（例えば、細菌、酵母、寄生生物、および特定のウイルス）を共通して飾る糖質パターンを認識する。対照的に、ＭＢＬは、Ｄ−ガラクトースおよびシアリン酸（哺乳動物の血漿および細胞表面糖タンパク質上に存在する「成熟」複合糖結合体を通常は飾る、最後から２番目の糖および最後の糖である）を認識しない。この結合特異性は、自己活性化から防御するのを助けると考えられる。しかし、ＭＢＬは、哺乳動物細胞の小胞体およびゴルジ装置中に封鎖されているＮ結合型糖タンパク質および糖脂質上にある高マンノース「前駆体」グリカンのクラスターに対して、高い親和性で結合する（非特許文献７）。従って、損傷した細胞は、ＭＢＬ結合を介するレクチン経路活性化のための潜在的標的である。
【０００７】
フィコリンは、ＭＢＬとは異なる型のレクチンドメイン（フィブリノーゲン様ドメインと呼ばれる）を保有する。フィコリンは、Ｃａ＋＋非依存性様式で糖残基に結合する。ヒトにおいて、３種類のフィコリン（Ｌ−フィコリン、Ｍ−フィコリン、およびＨ−フィコリン）が、同定されている。血清フィコリンであるＬ−フィコリンおよびＨ−フィコリンの両方が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに対して特異性を共通して有するが、Ｈ−フィコリンはまた、Ｎ−アセチル−Ｄ‐ガラクトサミンにも結合する。Ｌ−フィコリン、Ｈ−フィコリン、およびＭＢＬの糖特異性の差は、種々のレクチンが、相補的でありかつ標的が異なるが重複する、糖結合体であり得ることを意味する。この概念は、レクチン経路における公知のレクチンのうち、Ｌ−フィコリンのみが、リポテイコ酸（すべてのグラム陽性細菌において見出される細胞壁糖結合体である）に特異的に結合するという、最近の報告によって支持される（非特許文献８）。コレクチン（すなわち、ＭＢＬ）およびフィコリンは、アミノ酸配列の有意な類似性を有さない。しかし、この２つのタンパク質群は、類似するドメイン構成を有し、Ｃ１ｑと同様に、オリゴマー構造体になるようにアセンブルする。このオリゴマー構造体は、多部位結合の可能性を最大にする。ＭＢＬの血清濃度は、健常集団において大きく変動し、これは、ＭＢＬ遺伝子のプロモーター領域およびコード領域の両方における多型／変異によって遺伝的に制御される。急性期タンパク質として、ＭＢＬの発現は、炎症の間にさらにアップレギュレートされる。Ｌ−フィコリンは、ＭＢＬと同様の濃度で血清中に存在する。従って、レクチン経路のＬ−フィコリン部門は、潜在的には、ＭＢＬ部門と強さが匹敵する。ＭＢＬおよびフィコリンはまた、オプソニンとして機能し得る。オプソニンは、これらのタンパク質と食細胞レセプターとの相互作用を必要とする（非特許文献９；非特許文献１０）。しかし、食細胞上のレセプターの正体は、確立されていない。
【０００８】
ヒトＭＢＬは、そのコラーゲン様ドメインを介して、独特なＣ１ｒ／Ｃ１ｓ様セリンプロテアーゼ（ＭＢＬ会合型（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）と呼ばれる）と特異的かつ高親和性の相互作用を形成する。現在までに、３種のＭＡＳＰが、記載されている。まず、１つの酵素「ＭＡＳＰ」が、同定されており、補体カスケードの開始を担う（すなわち、Ｃ２およびＣ４を切断する）酵素として特徴付けられている（非特許文献１１）。後に、ＭＡＳＰは、実際には、２つのプロテアーゼ（ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２）の混合物であることがわかった（非特許文献１２）。しかし、ＭＢＬ−ＭＡＳＰ−２複合体のみで、補体活性化のためには十分であることが、実証された（非特許文献１３）。さらに、ＭＡＳＰ−２のみが、高い割合でＣ２およびＣ４を切断した（非特許文献１４）。従って、ＭＡＳＰ−２は、Ｃ４およびＣ２を活性化してＣ３コンバターゼであるＣ４ｂ２ａを生成することを担う、プロテアーゼである。このことが、Ｃ１複合体との重要な差異である。Ｃ１複合体において、２つの特定のセリンプロテアーゼ（Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ）の協働作用が、補体系の活性化をもたらす。最近、第三の新規なプロテアーゼであるＭＡＳＰ−３が、単離された（非特許文献１５）。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３は、同じ遺伝子の選択的スプライス産物である（非特許文献１６）。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３の生物学的機能は、解明されるべきままの状態である。
【０００９】
ＭＡＳＰは、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ（Ｃ１複合体の酵素成分である）と同じドメイン構成を共有する（非特許文献１７）。これらのドメインとしては、Ｎ末端Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ／ウニ（ｓｅａ ｕｒｃｈｉｎ）Ｕｅｇｆ／骨形成タンパク質（ＣＵＢ）ドメイン、上皮増殖因子様ドメイン、第二ＣＵＢドメイン、直列型補体制御タンパク質ドメイン、およびセリンプロテアーゼドメインが挙げられる。Ｃ１プロテアーゼにおいてと同様に、ＭＡＳＰ−２の活性化は、セリンプロテアーゼドメインに隣接したＡｒｇ−Ｉｌｅ結合の切断を介して生じ、これによって、この酵素は、ジスルフィド結合したＡ鎖およびＢ鎖へと分割される。後者は、セリンプロテアーゼドメインからなる。最近、ＭＡＳＰ−２の遺伝的に決定された欠損が、記載された（非特許文献１８）。一ヌクレオチドの変異が、ＣＵＢ１ドメインにおけるＡｓｐ−Ｇｌｙ交換をもたらし、ＭＡＰＳ−２がＭＢＬに結合できないようにする。
【００１０】
ＭＢＬはまた、１９ｋＤａのＭＢＬ会合型（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質（ＭＡｐ１９）（非特許文献１９）または小ＭＢＬ会合型（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質（ｓＭＡＰ）（非特許文献２０）と呼ばれる、非酵素タンパク質と会合する。ＭＡｐ１９は、ＭＡＳＰ２遺伝子産物の選択的スプライシングによって形成される。これは、ＭＡＳＰ−２の最初の２つのドメインの後に、４つの独特のアミノ酸からなる余分な配列を含む。ＭＡｐ１９の生物学的機能は、未知である。ＭＡＳＰ−１遺伝子およびＭＡＳＰ−２遺伝子は、それぞれ、第３染色体および第１染色体に位置する（非特許文献２１）。
【００１１】
数種の証拠によって、種々のＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体が存在し、血清中の全ＭＡＳＰの大部分は、ＭＢＬと複合体形成していないことが、示唆される（非特許文献２２）。Ｈ−フィコリンおよびＬ−フィコリンの両方が、ＭＡＳＰと会合し、レクチン補体経路を活性化する。ＭＢＬも同様である（非特許文献２３；非特許文献２４）。レクチン経路および古典的経路の両方が、共通するＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ）を形成し、この２つの経路は、この段階で合流する。
【００１２】
レクチン経路は、感染に対する宿主防御において主要な役割を有すると広く考えられている。宿主防御にＭＢＬが関与することについての強力な証拠は、機能的ＭＢＬの血清レベルが減少した患者の分析に由来する（非特許文献２５）。そのような患者は、再発性の細菌感染および真菌感染に対する感受性を示す。これらの症状は、通常は、人生の初期において、母体由来抗体力価が弱まる見かけ上脆弱な期間の間であるが、すべての抗体応答レパートリーが発達する前に、明らかである。この症状は、しばしば、ＭＢＬのコラーゲン性部分中のいくつかの部位における変異から生じ、これは、ＭＢＬオリゴマーの適切な機能を妨害する。しかし、ＭＢＬは、補体とは独立してオプソニンとして機能し得るので、感染に対する感受性の増加が、どの程度まで、補体活性化の減損に起因するのは、わからない。
【００１３】
非感染性ヒト疾患の病因に古典的補体経路および第二補体経路の両方を関連付ける広範な証拠が存在するが、レクチン経路の役割は、ちょうど解明され始めたばかりである。最近の研究は、レクチン経路の活性化が、虚血／再灌流傷害における補体活性化および関連する炎症を担い得るという証拠を提供する。Ｃｏｌｌａｒｄら（２０００）は、酸化的ストレスに供された培養内皮細胞が、ＭＢＬに結合して、ヒト血清に曝露された際にＣ３の沈着を示すことを報告した（非特許文献２６）。さらに、遮断性抗ＭＢＬモノクローナル抗体によるヒト血清の処理は、ＭＢＬの結合および補体活性化を阻害した。これらの所見は、ラットＭＢＬに対する遮断抗体で処理されたラットが、コントロール抗体で処理されたラットよりも冠状動脈の閉塞に際して有意に少ない心筋損傷を示した、心筋虚血−再灌流ラットモデルに拡張された（非特許文献２７）。酸化的ストレスの後の脈管内皮に対するＭＢＬ結合の分子機構は、不明である。最近の研究は、酸化的ストレス後のレクチン経路の活性化が、糖結合体へのＭＢＬの結合によってではなく、脈管内皮サイトケラチンへのＭＢＬの結合によって媒介され得ることを示唆する（非特許文献２８）。他の研究は、虚血／再灌流傷害の病因に、古典的経路および副経路を関係付けた。この疾患におけるレクチン経路の役割は、意見が分かれる状態のままである（非特許文献２９）。
【００１４】
古典的経路およびレクチン経路とは対照的に、他の２つの経路においてＣ１ｑおよびレクチンが実施する認識機能を満たす副経路のイニシエーターは、見出されていない。現在、副経路は、外来表面または他の異常な表面（細菌、酵母、ウイルス感染細胞、または損傷組織）によって自発的に誘発されることが、広範に受け入れられている。副経路に直接関与する４種の血漿タンパク質（Ｃ３、Ｂ因子、Ｄ因子、およびプロペルジン）が、存在する。ネイティブＣ３からのＣ３ｂのタンパク質分解性生成が、副経路が機能するために必要である。副経路のＣ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）は、Ｃ３ｂを必須サブユニットとして含むので、副経路を介する第一のＣ３ｂの起源に関する疑問は、難解な問題を提示し、かなりの研究を刺激した。
【００１５】
Ｃ３は、チオエステル結合として公知である希少な翻訳後修飾を含む、タンパク質ファミリーに（Ｃ４およびα−２マクログロブリンとともに）属する。そのチオエステル基は、システインから３アミノ酸離れたスルフヒドリル基にその末端カルボニル基が結合している、グルタミンから構成される。この結合は、不安定であり、グルタミンの電気誘引性カルボニル基は、ヒドロキシル基またはアミノ基を介して、他の分子と共有結合を形成し得る。このチオエステル結合は、インタクトなＣ３の疎水性ポケット中に封鎖された場合には、かなり安定である。しかし、Ｃ３からＣ３ａおよびＣ３ｂへのタンパク質分解性切断は、Ｃ３ｂ上の非常に反応性が高いチオエステル結合の露出をもたらし、この機構によって、標的に対してＣ３ｂが共有結合する。補体標的に対するＣ３ｂの共有結合におけるその十分に記載された役割に加えて、Ｃ３チオエステルはまた、副経路を誘発する際に中心的役割を果たすと考えられている。広く受け入れられている「緩慢進行（ｔｉｃｋ−ｏｖｅｒ）理論」に従うと、副経路は、液相のコンバターゼであるＣ３ｂＢｂの生成によって開始される。このコンバターゼは、Ｃ３と、加水分解されたチオエステル（Ｃ３ｂ；Ｃ３Ｈ２０）およびＢ因子とから形成される（非特許文献３０）。Ｃ３ｂ様ｉＣ３が、ネイティブＣ３から、このタンパク質中の内部チオエステルの緩徐な自発的加水分解によって生成される（非特許文献３１）。Ｃ３ｂＢｂコンバターゼの活性を介して、Ｃ３ｂ分子が、標的表面上に沈着され、それによって、副経路が開始される。
【００１６】
副経路の活性化のイニシエーターに関して、ほとんど知られていない。アクチベーターとしては、酵母細胞壁（ザイモサン）、多くの純粋な多糖、ウサギ赤血球、特定の免疫グロブリン、ウイルス、真菌、細菌、動物腫瘍細胞、寄生生物、および損傷細胞が挙げられると考えられる。これらのアクチベーターに共通する唯一の特徴は、糖質の存在であるが、糖質構造の複雑性および多様性は、共有される分子機構を確立することを困難にする。このことが、認識される。
【００１７】
副経路はまた、レクチン／古典的経路のＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）に、強力な増幅ループを提供し得る。なぜなら、生成されるどのＣ３ｂも、Ｂ因子とともに、さらなる副経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）の形成に関与し得るからである。副経路Ｃ３コンバターゼは、プロペルジンの結合によって安定化される。プロペルジンは、副経路のＣ３コンバターゼの半減期を、６〜１０倍に延長する。Ｃ３コンバターゼにＣ３ｂを添加すると、副経路のＣ５コンバターゼの形成をもたらす。
【００１８】
３つすべての経路（すなわち、古典的経路、レクチン経路、および副経路）は、Ｃ５にて合流すると考えられている。Ｃ５は、切断されて、複数の炎症促進効果を有する産物を形成する。合流した経路は、終末（ｔｅｒｍｉｎａｌ）補体経路と呼ばれる。Ｃ５ａは、最も強力なアナフィラトキシンであり、平滑筋および脈管の緊張の変化、ならびに脈管透過性を誘導する。これはまた、好中球および単球の両方の強力なケモタキシンおよびアクチベーターである。Ｃ５ａ媒介性細胞活性化は、複数のさらなる炎症メディエーター（サイトカイン、加水分解性酵素、アラキドン酸代謝産物、および反応性酸素種が挙げられる）の放出を誘導することによって、炎症性応答を有意に増幅し得る。Ｃ５の切断は、Ｃ５ｂ−９（膜攻撃複合体（ＭＡＣ）としても公知である）の形成をもたらす。部分溶解性（ｓｕｂｌｙｔｉｃ）ＭＡＣ沈着が、溶解性孔形成複合体としてのその役割に加えて、炎症において重要な役割を果たし得るという、強力な証拠が、現在存在する。
【非特許文献１】Ｋａｌｌｉ，Ｋ．Ｒ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．（１９９４）１５：４１７〜４３１
【非特許文献２】Ｍｏｒｇａｎ，Ｂ．Ｐ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．（１９９４）２４：２１９〜２２８
【非特許文献３】Ｌｕ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２００２）１５７２：３８７〜４００
【非特許文献４】Ｉｋｅｄａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）２６２：７４５１〜７４５４
【非特許文献５】Ｗｅｉｓ，Ｗ．Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３６０：１２７〜１３４
【非特許文献６】Ｌｅｅ，Ｒ．Ｔ．ら、Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９９２）２９９：１２９〜１３６
【非特許文献７】Ｍａｙｎａｒｄ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）２５７：３７８８〜３７９４
【非特許文献８】Ｌｙｎｃｈ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００４）１７２：１１９８〜１２０２
【非特許文献９】Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．（１９８９）１６９：１７３３
【非特許文献１０】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：２４４８〜５４
【非特許文献１１】Ｊｉ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５０：５７１〜５７８
【非特許文献１２】Ｔｈｉｅｌ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８６：５０６〜５１０
【非特許文献１３】Ｖｏｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６５：２０９３〜２１００
【非特許文献１４】Ａｍｂｒｕｓ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０：１３７４〜１３８２
【非特許文献１５】Ｄａｈｌ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１５：１２７〜３５
【非特許文献１６】Ｓｔｏｖｅｒら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００３）４：３７４〜３８４
【非特許文献１７】Ｓｉｍ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２０００）２８：５４５
【非特許文献１８】Ｓｔｅｎｇａａｒｄ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００３）３４９：５５４〜５６０
【非特許文献１９】Ｓｔｏｖｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６２：３４８１〜９０
【非特許文献２０】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１１：８５９〜８６３
【非特許文献２１】Ｓｃｈｗａｅｂｌｅ，Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）２０５：４５５〜４６６
【非特許文献２２】Ｔｈｉｅｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６５：８７８〜８８７
【非特許文献２３】Ｄａｈｌ．Ｍ．Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１５：１２７〜３５
【非特許文献２４】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）１６８：３５０２〜３５０６
【非特許文献２５】Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ，．Ｄ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２００２）１５７２：４０１〜４１３
【非特許文献２６】Ｃｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０００）１５６：１５４９〜１５５６
【非特許文献２７】Ｊｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００１）１０４：１４１３〜１４１８，２００１
【非特許文献２８】Ｃｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００１）１５９：１０４５〜１０５４
【非特許文献２９】Ｒｉｅｄｅｒｍａｎｎ，Ｎ．Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００３）１６２：３６３〜３６７
【非特許文献３０】Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．（１９８４）７：１４３〜１６２
【非特許文献３１】Ｐａｎｇｂｕｒｎ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８１）１５４：８５６〜８６７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、ＭＡＳＰ−２遺伝子の標的化破壊を含み、かつレクチン補体経路が欠損している、ノックアウト生物をここに作製した。そのような生物は、健康および疾患における、レクチン経路欠損の役割を研究するためのモデルとして有用である。その生物は、再灌流傷害、心筋梗塞、脳卒中、および移植などの障害についての実験モデルとして、潜在的に有用である。その生物はまた、治療ツールとして使用するための、ヒトＭＡＳＰ−２に対する抗体の生成のためにも有用であり得る。本発明者らはまた、ＭＡｐ１９の生成が欠損した生物を作製した。
【００２０】
従って、本発明は、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または遺伝子改変された非ヒト細胞を提供し、これらは、内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない。本発明はまた、遺伝子改変されたマウスまたはトランスジェニックマウスを提供し、その生殖細胞は、破壊されたＭＡＳＰ−２遺伝子を含む。本発明はさらに、遺伝子改変されたトランスジェニックマウスまたはその子孫を提供し、その体細胞および生殖細胞は、内因性ＭＡＳＰ−２を含まない。
【００２１】
本発明の一局面において、上記の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞は、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない。
【００２２】
本明細書において、内因性とは、真正であり（ａｔｕｔｈｅｎｔｉｃ）、ネイティブであり、異種（ｆｏｒｅｉｇｎ）ではなく、そして遺伝子操作（例えば、遺伝子標的化または遺伝子導入）によって改変されていないものとして、定義される。
【００２３】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞は、すべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列または本質的にすべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列の標的化欠失によって取得可能である。この欠失は、すべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子と介在配列（完全なエキソン／イントロンの除去もしくは完全な（ｃｌｅａｎ）欠失）の欠失であっても、ＭＡＳＰ−２遺伝子の発現が防止されるような内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列の広範な部分の欠失による本質的にすべての内因性ＭＡＳＰ−２配列の欠失であってもよい。標的化破壊は、相同組換えプロセスによって、または組換え−切り出しプロセス（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え）によって、実施され得る。従って、本発明は、相同組換え法によって取得可能な、本明細書中に記載されるような遺伝子改変された非ヒト哺乳動物もしくはトランスジェニック非ヒト哺乳動物、または遺伝子改変された非ヒト哺乳動物細胞もしくはトランスジェニック非ヒト哺乳動物細胞（好ましくは、本明細書中に記載されるような、胚性幹細胞）をさらに提供する。
【００２４】
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系は、Ｚｏｕら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３；２６２，１２７１〜１２７４）に記載される。これは、哺乳動物細胞において作動し、かつマウスにおいて遺伝子標的化実験のために使用されて生殖系列中の標的遺伝子の「完全な（ｃｌｅａｎ）」欠失を生成し、そして（Ｃｒｅリコンビナーゼの調節された発現に基づく）条件付き様式で遺伝子を不活化した、系を記載する。
【００２５】
Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１に由来する３８ｋＤａのリコンビナーゼタンパク質であり、これは、ｌｏｘＰ部位の間にある分子内（切除的もしくは反転的）および分子間（組込み的）での部位特異的組換えを媒介する。この系の概説について、Ｓａｕｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；１９９３、Ｖｏｌ．２２５，８９０〜９００を参照のこと。ｌｏｘＰ部位（クロスオーバーする座）は、８ｂｐの非対称スペーサー領域によって隔てられた２つの１３ｂｐ逆方向反復からなる。１分子のＣｒｅが、１つの逆方向反復に結合するか、または２つのＣｒｅ分子が、１つのｌｏｘＰ部位と整列する。この組換えは、上記の非対称スペーサー領域において生じる。その８塩基はまた、この部位の方向性を担う。互いに反対方向を向く２つのｌｏｘＰ配列は、介在ＤＮＡ片を逆向きにし、順（ｄｉｒｅｃｔ）方向にある２つの部位は、それらの部位の間にある介在ＤＮＡの切除を指令し、１つのｌｏｘＰ部位を後ろに残す。この正確なＤＡＮ除去は、遺伝子を排除するため（遺伝子欠失）または遺伝子を活性化するために、使用され得る。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系はまた、遺伝子を導入するために（遺伝子導入）、使用され得る。順（ｄｉｒｅｃｔ）方向にある２つのｌｏｘＰ部位が両方から隣接する遺伝子は、「フロックス（ｆｌｏｘｅｄ）遺伝子」と呼ばれる。
【００２６】
Ｚｏｕら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９４；４（１２）１０９９〜２００３）は、マウス胚性幹細胞においてＣｒｅ−ｌｏｘＰ系を使用して、マウス遺伝子Ｃｇ１を対応するヒト遺伝子Ｃｇ１で置換することを記載する。Ｃｇ１は、ＩｇＧ１抗体の重鎖の定常領域をコードする。ｌｏｘＰ部位が標的遺伝子配列（この場合は、マウスＣｇ１）の３’末端にクローン化されており、標的遺伝子の５’側の位置に、目的の変異体遺伝子（この場合は、ヒトＣｇ１）、ｌｏｘＰ部位、ネガティブ選択マーカー（ＨＳＶ−ｔｋ）、およびポジティブ選択マーカー（ｎｅｏｒ）からなる挿入が、なされた、標的化構築物が、作製された。この構築物において、ｌｏｘＰ部位は、順（ｄｉｒｅｃｔ）方向にあった。この標的化構築物は、ＥＳ細胞中へのトランスフェクションによって導入され、形質転換体が、ネオマイシン耐性によってＧ４１８において選択された。Ｃｒｅ構築物が、形質転換細胞中に導入されて、Ｃｒｅの一過性発現が達成された。組換え（これは、２つのｌｏｘＰ部位の間の配列（ＨＳＶ−ｔｋ、ｎｅｏｒ、および内因性標的遺伝子であるマウスＣｇ１をコードする）の切除である）が、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する細胞においてのみ、生じた。ヒトＣｇ１配列が、ｌｏｘＰ部位の外側に位置し、従って、マウスゲノム中に挿入された状態のままであった。アシクロビルまたはガンシクロビルを使用するネガティブ選択が、欠失が生じた細胞を同定するために使用された。なぜなら、ＨＳＶ−ｔｋを発現しない細胞（すなわち、内因性マウスＣｇ１遺伝子もまた欠失している細胞）のみが、その培地において生存可能であったからである。
【００２７】
従って、Ｚｏｕら（１９９４）は、ヒトＣｇ１遺伝子を導入し、その後に１つの内因性Ｉｇ重鎖定常領域遺伝子Ｃｇ１を欠失させるために、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を使用した。ＩｇＨマウスＣｇ１の膜貫通部分および細胞質部分をコードするエキソンは、ヒト配列によって置換されなかった。これらは、マウスにおけるヒト化ＩｇＧ１の膜発現およびシグナル伝達を破壊する危険を最小限にするために、保持された。導入されたヒトＣｇ１遺伝子は、マウス生殖細胞系を介して伝達され、生じた変異体マウスは、κ軽鎖と（マウス定常領域の代わりに）ヒト定常領域とを発現するマウスと、交配させられた。両方の挿入についてホモ接合性であるマウスは、ヒト化κ鎖を保有するＩｇＧ１抗体を生成する。
【００２８】
標的化欠失のための部位特異的組換え方法において、２つの部位特異的組換え配列によって両方から隣接される核酸配列領域が、切除される；この切除された領域は、外因性配列（例えば、組換え体または組換え遺伝子を同定するための選択マーカー）で置換され得る。
【００２９】
本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞は、そのゲノム中に組み込まれた、１つ以上の選択マーカーを含み得る。
【００３０】
上記選択マーカーは、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のうちの１つ以上である。２つ以上の選択マーカーが、使用され得る。
【００３１】
従って、本発明はまた、内因性ＭＡＳＰ−２ペプチドを含まず、かつ選択マーカーをコードする１つ以上の遺伝子を含む、非ヒト哺乳動物または非ヒト哺乳動物細胞（好ましくは齧歯類細胞、より好ましくはマウス細胞、最も好ましくはマウス胚性幹細胞）を提供する。
【００３２】
本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物は、齧歯類、マウス、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなどであり得るが、好ましくは齧歯類であり、より好ましくはネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）であり、最も好ましくはマウス（ｍｏｕｓｅ）である。本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物細胞は、胚性幹細胞または卵母細胞であり、好ましくは齧歯類、マウス、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、またはネコなどの細胞であり、好ましくは齧歯類の細胞であり、より好ましくはネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）の細胞であり、最も好ましくはマウス（ｍｏｕｓｅ）の細胞である。マウスは、取り扱いおよび育種が容易にあるので、特に好ましい。
【００３３】
本発明は、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子が存在しないか、またはこの遺伝子が非機能性である程度になるまで部分的に存在しない、マウスを提供する。部分的に存在しないとは、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列が、機能的内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子産物をＭＡＳＰ−２遺伝子座にコードしない（すなわち、機能的内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子産物がその遺伝子座から発現され得ない）程度まで、欠失もしくは破壊されたことを、意味する。
【００３４】
本発明はさらに、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子が存在しないかまたは部分的に存在しない、非ヒト哺乳動物胚性幹（ＥＳ）細胞を提供する。
【００３５】
上記の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物（好ましくは齧歯類、より好ましくはマウス）は、１つ以上の機能的に活性なＭＡＳＰ−２遺伝子（好ましくは、１つ以上の機能的に活性なヒトＭＡＳＰ−２遺伝子）を発現可能な適合性の非ヒト哺乳動物と交配させられ得る。例えば、欠失変異体マウスが、１つ以上の機能的に活性なヒトＭＡＰＳ−２遺伝子を発現可能なマウスと交配させられ得る。この交配のヘテロ接合性子孫（Ｆ１）は、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子を発現可能ではなく、代わりに外来（好ましくはヒト）ＭＡＳＰ−２遺伝子のみを発現可能な非ヒト哺乳動物（好ましくはマウス）のヘテロ接合性子孫およびホモ接合性子孫（Ｆ２）を生成するように、同系交配させられ得る。
【００３６】
本発明は、本明細書中に記載されるような遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来するか、または本明細書中に記載されるような遺伝子改変された非ヒト細胞に由来する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を提供し、本発明は、本明細書中に記載されるような遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来する遺伝子改変された非ヒト細胞を提供する。
【００３７】
本発明は、遺伝子改変された非ヒト細胞を生成するための方法を提供する。この方法は、
非ヒト細胞を、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子の代わりに組込むための標的化構築物でトランスフェクトする工程（この標的化構築物は、標的化組換え配列と選択マーカーとを含む）；および
上記選択マーカーが存在する細胞を選択する工程；
を包含する。
【００３８】
上記の遺伝子改変された非ヒト細胞は、胚性幹細胞または卵母細胞であることが、好ましい。上記の遺伝子改変された非ヒト細胞は、齧歯類細胞（より好ましくはマウス細胞）であり得る。
【００３９】
適切な任意のクローニングベクターが、上記の標的化構築物を生成するために使用され得る。クローニングストラテジーは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載される。望ましくは、上記の標的化構築物は、１つ以上のマーカー遺伝子を保有し得る。選択マーカーが、公知であり、特に適切なものは、ポジティブ選択を可能にするものである。特に対象とされるのは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子（「ｎｅｏ」）（これは、Ｇ４１８に対する耐性を付与する）の使用である。また適切なのは、プロマイシン耐性遺伝子（「ｐｕｒｏ」）またはハイグロマイシン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子および／またはプロマイシン耐性遺伝子が、好ましい。
【００４０】
上記の標的化構築物において、標的遺伝子の上流および／または下流は、相同的ダブルクロスオーバーが生じたかどうかの同定（ネガティブ選択）を提供する遺伝子であり得る。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）が、ネガティブ選択マーカーとして使用され得る。なぜなら、チミジンキナーゼを生成する細胞は、アシクロビルまたはガンシクロビルによって死滅させられ得るからである。
【００４１】
一旦、標的化構築物が調製され、そして望ましくないあらゆる配列が除去された後には、上記構築物は、標的細胞（例えば、ＥＳ細胞または卵母細胞）中に導入され得る。標的細胞中にＤＮＡを導入するための任意の簡便な技術が、使用され得る。従来の遺伝子標的化（通常は２０ｋｂまでの構築物）のために、ＤＮＡは、最も頻繁には、エレクトロポレーションによって導入される（Ｚｏｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，２１５４〜６２，１９９５）。一方、二次改変（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ媒介性組込み）のためには、エレクトロポレーションは、より小さい構築物の組込みのために使用され得、他の方法（例えば、リポフェクションおよびＹＡＣ（酵母人工染色体）についての酵母スフェロプラスト／細胞融合、および染色体フラグメントもしくは哺乳動物人工染色体についてのリン酸カルシウム媒介性ＤＮＡ移入（これらは、数百ｋｂ〜Ｍｂ範囲の組込みを可能にする）が、使用され得る。従って、エレクトロポレーションは、小さいＤＮＡフラグメント（５０ｋｂまで）を標的細胞中に導入するために好ましい技術であり、列挙された他の方法は、より大きなＤＮＡ配列（＞５０ｋｂ）の導入のために適切でありかつおそらく有利である。
【００４２】
標的細胞の形質転換またはトランスフェクションの後、これらの細胞は、ポジティブマーカーおよび／またはネガティブマーカーによって選択され得る。上記のように、ポジティブマーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子および／またはプロマイシン耐性遺伝子）が、使用され得る。その後、望ましい表現型を有する細胞が、制限分析、電気泳動、サザンブロット分析、ＰＣＲなどによってさらに分析され得る。
【００４３】
ＰＣＲもまた、相同組換えの存在を検出するために使用され得る。標的化構築物内の配列に対して相補的であるＰＣＲプライマー、およびその構築物の外側かつ標的遺伝子座にある配列に対して相補的であるＰＣＲプライマーが、使用され得る。ＤＮＡ分子は、上記の両方のプライマーがその相補的配列に結合可能である場合にのみ、すなわち、相同組換えが生じた場合にのみ、ＰＣＲ反応において取得される。配列決定によって確認される予期されるサイズのフラグメントの実証は、相同組換えが生じたという結論を支持する。
【００４４】
ゲノム中にマーカー遺伝子が存在することは、組込みが生じたことを示すが、相同組込みが生じたかどうかを決定することが、必要である。これを達成するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、組込み位置を確立するためにサザンブロットハイブリダイゼーションによるＤＮＡ分析を使用する。インサートに対するプローブと、相同組込みが生じる隣接領域に対して遠位にある５’領域および３’領域にある配列に対するプローブとの両方を使用することによって、相同標的化が達成されたことが、示され得る。利点は、標的化ＤＮＡに隣接する外部プローブと、（例えば、選択マーカー遺伝子によって）新たに導入された制限部位に隣接する外部プローブとが、標的化された変化の同定のために使用され得ることである。
【００４５】
例えば上記の方法によって取得可能な、本明細書中に記載されるような胚性幹細胞が、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の生成のために使用され得る。
【００４６】
上記のプロセスは、胚性幹細胞におけるＭＡＳＰ−２遺伝子座を不活化するためにまず実施され得、その後、その細胞は、宿主の胚盤胞中に注入され得、キメラ動物へと発達させられ得る。適切な方法は、例えば、Ｈｏｇａｎら（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｆ．およびＬａｃｙ，Ｅ．（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に記載される。キメラ動物は、ヘテロ接合性宿主を取得するために交配させられる。その後、そのヘテロ接合性宿主の育種によって、ホモ接合性宿主が、取得され得る。
【００４７】
従って、本発明は、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法を提供し、その方法において、本明細書中に記載されるような胚性幹細胞が、宿主胚盤胞中に導入されてキメラ動物へと発達させられる。
【００４８】
これは、
（ａ）本明細書中に記載されるような非ヒト哺乳動物胚性幹細胞を、適合性の非ヒト哺乳動物胚盤胞中に導入すること；および
（ｂ）（ａ）において取得された胚盤胞を、適合性の非ヒト哺乳動物代理母（ｆｏｓｔｅｒ ｍｏｔｈｅｒ）中に移植してキメラ非ヒト哺乳動物を取得すること；そして
必要に応じて、選択マーカーについて、および／またはすべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列もしくは本質的にすべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列の欠失について、スクリーニングすること；
によって特徴付けられる方法によって、達成され得る。
【００４９】
これらの方法によって生成されるキメラ非ヒト哺乳動物は、ヘテロ接合性子孫を取得するために交配させられ得る。そのヘテロ接合性子孫は、ホモ接合性子孫を取得するために同系交配させられ得る。
【００５０】
本明細書中に記載される本発明の方法を使用して、それ自体が何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸配列は含まない、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物が、取得され得る。
【００５１】
本発明は、１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法を提供する。その方法は、
それ自体が何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸配列は含まない遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を、１つ以上の外因性遺伝子をコードしかつその外因性遺伝子を発現可能な適合性の非ヒト哺乳動物と交配させて、１つ以上の外因性遺伝子についてヘテロ接合性である子孫を取得すること；および
必要に応じて、そのヘテロ接合性子孫を同系交配させて、上記の１つ以上の外因性遺伝子についてホモ接合性の子孫を生成すること；
によって特徴付けられる。
【００５２】
外因性遺伝子とは、宿主の非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞に対して外来性（すなわち、非ネイティブ）である遺伝子である。
【００５３】
従って、本発明は、外来（好ましくはヒト）ＭＡＳＰ−２遺伝子を発現可能な非ヒト哺乳動物（好ましくは齧歯類、より好ましくはマウス）を生成するために使用され得、この生成は、機能的に活性な（内因性）ＭＡＳＰ−２遺伝子を発現不能な本明細書中に記載されるような遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を、１つ以上の機能的に活性な外来（好ましくはヒト）ＭＡＳＰ−２遺伝子を発現可能な適合性の非ヒト哺乳動物（好ましくは齧歯類、より好ましくはマウス）と交配させることによる。これによって、１つ以上の機能的に活性な望ましい形質の外因性（好ましくはヒト）遺伝子を有する選択された子孫（ヘテロ接合性またはホモ接合性）を生成するための種間遺伝子交換／遺伝子座交換が、その非ヒト哺乳動物の対応する遺伝子がサイレント化されているかまたは除去されているバックグラウンドにおいて可能になる。そのような非ヒト哺乳動物は、上記の外因性遺伝子に対する抗体の生成において有用であり得る。本発明は、そのような抗体の生成方法、およびそのような方法において生成された抗体を、さらに提供する。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはその部分に対して特異的に結合する、抗体産生哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、および霊長類（ヒトを包含する））由来の抗体およびその抗体フラグメントを包含する。例示的抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および組換え抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体、マウス−ヒト抗体、マウス−霊長類抗体、ヒトモノクローナル抗体、および抗イディオタイプ抗体が挙げられ、これらは、インタクトな分子であっても、そのフラグメントであってもよい。
【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「抗体フラグメント」とは、全長抗ＭＡＳＰ−２抗体に由来する部分または全長抗ＭＡＳＰ−２抗体に関連する部分を指し、一般的には、その抗原結合領域または可変領域を包含する。抗体フラグメントの例示的例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントとは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを包含し、これらのドメインは、一本のポリペプチド鎖中に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドは、そのＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、これによって、そのｓｃＦｖは、抗原結合のために望ましい構造を形成することが可能である。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「キメラ抗体」とは、非ヒト種（例えば、齧歯類）抗体に由来する可変ドメインおよび相補性決定領域を含む組換えタンパク質であり、一方、その抗体分子の残りは、ヒト抗体に由来する。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」とは、ヒト抗体フレームワーク中に移植された非ヒト免疫グロブリン由来の特定の相補性決定領域と適合する最小限の配列を含む、キメラ抗体である。ヒト化抗体は、代表的には、その抗体の相補性決定領域のみが非ヒト起源である、組換えタンパク質である。
【００５９】
ＭＡＳＰ−２に対するポリクローナル抗体は、当業者にとって周知である方法を使用して、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはその免疫原性部分で動物を免疫することによって、調製され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ」Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ編），１０５ｐを参照のこと。ＭＡＳＰ−２ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント（無機質ゲル（例えば、水酸化アルミニウムまたはフロイントアジュバント（完全もしくは不完全））、界面活性剤（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが挙げられる）の使用を介して、増加させられ得る。ポリクローナル抗体は、代表的には、動物（例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジ）において惹起される。あるいは、本発明において有用な抗ＭＡＳＰ−２抗体はまた、類人霊長類に由来し得る。ヒヒにおいて診断的に有用な抗体および治療的に有用な抗体を惹起するための一般的技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇらの国際特許出願公開番号９１／１１４６５およびＬｏｓｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０，１９９０において見出され得る。その後、免疫学的に活性な抗体を含有する血清が、当該分野で周知の標準的手順を使用して、そのような免疫された動物の血液から生成される。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２抗体は、モノクローナル抗体であり得る。抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、１つのＭＡＳＰ−２エピトープに対する。本明細書中で使用される場合、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、この修飾語は、特定の何らかの方法によるその抗体の生成を必要とするものとは解釈されるべきではない。モノクローナル抗体は、培養中の連続的細胞株による抗体分子の生成を提供する任意の技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５によって記載されるハイブリドーマ方法）を使用して取得され得るか、またはそれらは、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって生成され得る。モノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８，１９９１およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７，１９９１において記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。そのような抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスが挙げられる）であり得る。
【００６１】
例えば、モノクローナル抗体は、適切な哺乳動物（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）に、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはその部分を含む組成物を注射することによって、取得され得る。所定の期間の後、脾細胞が、そのマウスから回収され、細胞培地中に懸濁される。その後、その脾細胞は、不死細胞株と融合されて、ハイブリドーマを形成する。形成されたハイブリドーマは、細胞培養にて増殖させられて、それがＭＡＳＰ−２に対するモノクローナル抗体を生成する能力についてスクリーニングされる。
【００６２】
ヒトモノクローナル抗体は、抗原性チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を生成するように操作されたトランスジェニックマウスの使用を介して、取得され得る。この技術において、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座のエレメントが、内因性免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座の標的化破壊を含む胚性幹細胞に由来するマウス系統中に導入される。そのトランスジェニックマウスは、ヒト抗原（例えば、本明細書中に記載されるようなＭＡＳＰ−２抗原）に対して特異的なヒト抗体を合成し得る。そのマウスは、そのような動物に由来するＢ細胞を、適切な骨髄腫細胞株に、従来のＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ技術を使用して融合することによって、ヒトＭＡＳＰ−２抗体分泌ハイブリドーマを生成するために使用され得る。ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニックマウスが、（例えば、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ、およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎａｎｄａｌｅ，Ｎ．Ｊ．から）市販されている。トランスジェニックマウスからヒト抗体を取得するための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３，１９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６，１９９４；およびＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９，１９９４によって記載されている。
【００６３】
モノクローナル抗体は、種々の充分に確立された技術によって、ハイブリドーマ培養物から単離および精製され得る。そのような単離技術としては、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いるアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、２．７．１〜２．２７．１２頁、および２．９．１〜２．９．３頁；Ｂａｉｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０，ｐ．７９〜１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９２）を参照のこと）が挙げられる。
【００６４】
本発明の方法において有用なモノクローナル抗体としては、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体中の、対応する配列と同じであるかもしくは相同であり、それらの鎖の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体中の、対応する配列と同じであるかもしくは相同である、キメラ抗体；ならびにそのような抗体のフラグメントが挙げられる（米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１〜６８５５，１９８４）。本発明において有用なキメラ抗体の一形態は、ヒト化モノクローナル抗ＭＡＳＰ−２抗体である。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラ抗体であり、これは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖に由来する非ヒト（例えば、マウス）相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト可変ドメイン中に移入することによって、生成される。代表的には、その後、ヒト抗体の残基が、非ヒト対応物のフレームワーク領域中で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中でもドナー抗体中でも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるためになされる。一般的には、上記ヒト化抗体は、少なくとも１つ（代表的には２つ）の可変ドメインのうちの実質的にすべてを含み、その超可変ループのうちのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そのＦｖフレームワーク領域のうちのすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃ）の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２９，１９８８、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６，１９９２を参照のこと。
【００６５】
ヒト化モノクローナル抗体を生成するための技術はまた、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２，１９８６；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５，１９９２；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７，１９９２；Ｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４，１９９３；Ｓｕｄｈｉｒ編，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）；Ｋｅｌｌｅｙ「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄら編，ｐ３９９〜４３４（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９６）；ならびにＱｕｅｅｎら、米国特許第５，６９３，７６２号（１９９７）によって、記載されている。さらに、特定のマウス抗体領域に由来するヒト化抗体を合成する商業的実体（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡ）が、存在する。
【００６６】
本発明は、インタクトな免疫グロブリン分子にのみならず、周知のフラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる）にもまた、さらに拡張される。抗体分子のほんの小さな部分（パラトープ）のみが、そのエピトープに対するその抗体の結合に関与することは、当該分野で周知である（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹを参照のこと）。その抗体のｐＦｃ’領域およびＦｃ領域は、古典的補体経路のエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。そのｐＦｃ’領域が酵素的に切断されている抗体、またはそのｐＦｃ’領域を含まずに生成された抗体は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれ、インタクトな抗体の抗原結合部位を両方とも保持する。単離されたＦ（ａｂ’）２フラグメントは、その２つの抗原結合部位が原因で、二価モノクローナルフラグメントと呼ばれる。同様に、そのＦｃ領域が酵素的に切断されている抗体、またはそのＦｃ領域を含まずに生成された抗体は、Ｆａｂフラグメントと呼ばれ、これは、インタクトな抗体分子の抗原結合部位のうちの１つを保持する。
【００６７】
抗体フラグメントは、（例えば、従来の方法による抗体全体のペプシン消化またはパパイン消化による）タンパク質分解性加水分解によって、取得され得る。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成され得て、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓフラグメントを提供し得る。このフラグメントは、チオール還元剤を使用してさらに切断され得て、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価フラグメントを生成し得る。必要に応じて、その切断反応は、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基に対するブロック基を使用して、実施され得る。代替法として、ペプシンを使用する酵素的切断が、２つの一価Ｆａｂフラグメントと１つのＦｃフラグメントとを直接生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，米国特許第４，３３１，６４７号；Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，１９５９；Ｅｄｅｒｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９６７）；ならびにＣｏｌｉｇａｎ，２．８．１〜２．８．１０頁および２．１０〜２．１０．４頁によって、記載されている。
【００６８】
いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域を欠いている抗体フラグメントの使用が、古典的補体経路の活性化（これは、Ｆｃが上記Ｆｃγレセプターへ結合する際に開始される）を回避するために好ましい。Ｆｃγレセプター相互作用を回避するＭＡｂが生成され得る方法がいくつか存在する。例えば、モノクローナル抗体の上記Ｆｃ領域は、タンパク質分解酵素（例えば、フィシン消化）による部分的消化を用いて化学的に切断され得る。それによって、例えば、抗原結合抗体フラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ）２フラグメントが生成され得る（Ｍａｒｉａｎｉ，Ｍら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：６９−７１，１９９１））。あるいは、上記ヒトγ４ ＩｇＧアイソタイプ（これは、Ｆｃγレセプターに結合しない）は、本明細書で記載されるヒト化抗体の構築の間に使用され得る。上記Ｆｃドメインを欠く、抗体、単鎖抗体および抗原結合ドメインはまた、本明細書中に記載される組換え技術を用いて操作され得る。
【００６９】
あるいは、上記重鎖Ｆｖ領域および軽鎖Ｆｖ領域が接続されているＭＡＳＰ−２に対して特異的な単一のペプチド鎖結合分子が作られ得る。上記Ｆｖフラグメントは、単鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）を形成するために、ペプチドリンカーによって接続され得る。これらの単鎖抗原結合タンパク質は、オリゴヌクレオチドによって接続されているＶＨドメインとＶＬドメインとをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。上記構造遺伝子は、発現ベクター中に挿入され、この発現ベクターは、その後、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入される。上記組換え宿主細胞は、リンカーペプチドで上記２つのＶドメインが架橋された単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖを生成するための方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら，「Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ」 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：９７，１９９１；Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３，１９８８；Ｌａｄｎｅｒら，米国特許第４，９４６，７７８号；およびＰａｃｋら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１，１９９３によって記載されている。
【００７０】
１つ以上の外因性遺伝子を発現し得る遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または遺伝的に改変された非ヒト細胞を生成する方法が提供され、この方法は、それ自体が何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸配列を含まない本明細書に記載される非ヒト哺乳動物細胞へ、１つ以上の外因性遺伝子を導入することを含む。上記非ヒト哺乳動物細胞が、胚性幹細胞または卵母細胞であることが好ましい。上記非ヒト哺乳動物細胞がＥＳ細胞である場合、１つ以上の外因性遺伝子がトランスフェクションによって導入されることが望ましい。上記非ヒト哺乳動物細胞が、卵母細胞（卵細胞）である場合、１つ以上の外因性遺伝子がＤＮＡマイクロインジェクションによって導入されることが好ましい。好ましくは、上記１つ以上の１つ以上の外因性遺伝子は、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞のゲノムに挿入され、最も好ましくは、上記１つ以上の外因性遺伝子が、非内因性の部位特異的組換え配列に挿入される。
【００７１】
本発明は、本明細書中に記載の方法によって取得され得る１つ以上の外因性遺伝子を発現し得る非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞を提供し、外因性ＭＡＳＰ−２（好ましくは、ヒトＭＡＳＰ−２）の生成における、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞の使用を提供する。
【００７２】
それ自体が内因性ＭＡｐ １９ポリペプチドをコードする核酸配列を含まないという点で特徴づけられる、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または遺伝子改変された非ヒト哺乳動物細胞もまた、本発明によって提供される。このような哺乳動物は、上記のＭＡＳＰ−２欠損性の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物と同じ目的でまたは類似の目的のために、かつ同じ様式でまたは類似の様式で、有用であり得る。従って、別段述べなければ、当業者は、ＭＡＳＰ−２欠損性哺乳動物に関する、ならびにこのような哺乳動物から得ることができる抗体および他の生成物に関する、ならびにこのような哺乳動物を伴う方法に関する上記の記述が、ＭＡｐ １９欠損性哺乳動物に等しく適用できることを理解する。
【００７３】
本発明は、レクチン補体経路応答を欠くという点で特徴づけられる、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または遺伝子改変された非ヒト哺乳動物細胞をさらに提供する。
【００７４】
本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物は、齧歯類、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなどであり得るが、好ましくは、齧歯類、より好ましくは、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）、最も好ましくは、マウス（ｍｏｕｓｅ）である。本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物細胞は、胚性幹細胞または卵母細胞であり得る；そして好ましくは、齧歯類細胞、マウス細胞（ｍｕｒｉｎｅ）、ヒツジ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、イヌ細胞またはネコ細胞などであり、好ましくは、齧歯類細胞であり、より好ましくは、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）細胞であり、最も好ましくは、マウス（ｍｏｕｓｅ）細胞である。マウス（ｍｏｕｓｅ）は、取り扱いおよび繁殖が容易であるので、特に好ましい。
【００７５】
本発明は、機能的なレクチン補体経路応答が全く存在しないマウス（ｍｏｕｓｅ）を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
（図面の詳細な説明）
図１、図２および図３は、マウス（ｍｏｕｓｅ）ＭＡＳＰ−２ノックアウトおよびマウス（ｍｏｕｓｅ）ＭＡｐ １９ノックアウトの標的化を示すマップを、および標的化において使用される構築物を示す。図４は、ヒトＭＡＳＰ−２遺伝子およびヒトＭＡｐ １９遺伝子を、ノックアウトマウス（ｍｏｕｓｅ）へ導入するために使用されるミニ遺伝子構築物を示す。マウス（ｍｏｕｓｅ）ＭＡＳＰ−２のｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１３８９３の下で入手可能である。
【００７７】
本発明者らは、遺伝子標的化技術および／またはトランスジーン技術のいずれかによって、５つの異なるマウス（ｍｏｕｓｅ）系統を生成した。これらの系統は、補体のレクチン経路のマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ２遺伝子生成物ＭＡＳＰ−２（すなわち、セリンプロテアーゼ（ＭＷ ７４０９５ Ｄａ））および／またはＭＡｐ１９（ｓＭＡＰともいわれる）（すなわち、レクチン経路開始複合体と関連する１９０７５Ｄａ ＭＷの選択的ＭＡＳＰ２遺伝子生成物）のいずれかについて選択的に充足性（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）であるように設計される。本発明者らは、マウスＭＡＳＰ−２遺伝子生成物が欠損した３つの系統を記載する：１つの系統は、セリンプロテアーゼＭＡＳＰ−２を欠損しているが、ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰが充足性であり（構築物が図１に示される）、１つの系統は、ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰが欠損しており（構築物が図２に示される）、そして１つの系統は、ＭＡＳＰ−２とＭＡｐ１９／ｓＭＡＰの両方が欠損している（構築物が図３に示される）。
【００７８】
欠損の確認を、ｍＲＮＡ転写実験の検出および／またはウェスタンブロッティング実験によって行った。核酸検出は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機器を使用する時間分離（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲによって行ったが、ウェスタンブロッティングによって発見を確認した。
【００７９】
さらに、ノックアウトマウス（ｍｏｕｓｅ）においてヒトＭＡＳＰ−２またはヒトＭＡｐ １９を発現するために、２つのヒトミニ遺伝子構築物を確立した（図４を参照のこと）。
【００８０】
ここでＭＡＳＰ−２について言及すると、図１の構築物は、遺伝子標的化ベクターｐＫＯ−ＮＴＫＶ １９０１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）において確立し、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＥＳ細胞株Ｅ１４．１ａ（遺伝子バックグラウンド ＳＶ１２９ Ｏｌａ）をトランスフェクトするために使用した。染色体ＤＮＡの中に構築物を組み込んだトランスフェクトされた細胞を、ネオマイシン耐性を介して選択し、組換え事象を、ｐＫＯ−ＮＴＫＶに含まれるＴＫ遺伝子によって媒介されるチミジンキナーゼ（ＴＫ）活性の喪失を介して選択した。トランスフェクション後に回収した６００個のＥＳ細胞クローンから、上記遺伝子標的化構築物の単一の組み込みおよび上記マウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ２遺伝子内の上記標的化事象を、上記標的化構築物中に含まれるネオマイシンカセットに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブと上記標的化構築物の外側に位置するマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ２遺伝子に対して特異的なプローブとを使用するサザンブロット分析によって確認した。本発明者らは、４種の異なる細胞クローンを同定した。これらクローンにおいて、選択的標的化および組換え事象が発生し、これらクローンを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＬｅｉｃｅｓｔｅｒのＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｕｎｉｔの中で、胚移植技術によって、キメラを作製するために使用した。キメラを、遺伝子バックグラウンドＣ５７／ＢＬ６に対して戻し交配し、彼らの生殖細胞系列において破壊した遺伝子が伝達されたトランスジェニックオスを作出した。このような「生殖細胞系列伝達」マウスをメス（遺伝子バックグラウンドＣ５７／ＢＬ６）と交配させることで、Ｆ１を生成すると、その子孫のうちの５０％が、破壊したＭＡＳＰ２遺伝子に関してヘテロ接合性を示した。これらのヘテロ接合性マウス（ｍｏｕｓｅ）を異種交配させると、ホモ接合性のＭＡＳＰ２欠損性子孫、ヘテロ接合性マウス（ｍｏｕｓｅ）および野生型マウス（ｍｏｕｓｅ）が、それぞれ１：２：１の比で作出された。
【００８１】
第１のＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）系統（以下、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳと称する）を、図１に記載される標的化構築物を使用して樹立した。この選択されたストラテジーは、セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを含め、ＭＡＳＰ−２のＣ末端をコードする３つのエキソン（エキソン１０、１１、および１２）を破壊するが、その破壊は、他のＭＡＳＰ２遺伝子生成物ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰをコードするエキソンからは非常に遠く離れている。
【００８２】
図１に記載される破壊構築物で作られた、得られたマウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳは、繁殖能がありかつ生存能があり、破壊された対立遺伝子に関してホモ接合性の場合、ＭＡＳＰ−２に関して標的化された欠損を含む。ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰ（すなわち、ＭＡＳＰ２遺伝子の選択的遺伝子生成物）は、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベル（ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによって決定される）の両方において存在する。これらのマウス（ｍｏｕｓｅ）は、他の２つのレクチン経路会合型セリンプロテアーゼ（すなわち、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３）を発現する。
【００８３】
図５に示されるように、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）の血漿は、レクチン経路特異的Ｃ４切断アッセイにおいて示される、マンナンコーティングプレート（図５Ａ）上およびザイモサンコーティングプレート（図５Ｂ）上での、レクチン経路媒介性補体活性化を完全に欠損している。これは、ＭＡＳＰ−１でもＭＡＳＰ−３でもなく、ＭＡＳＰ−２が、補体活性化のレクチン経路のエフェクター成分であることを明らかに実証している。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３は、生理的条件下で、残りのレクチン経路活性を維持するために、ＭＡＳＰ−２機能的活性の喪失を補償できない。この結果および藤田禎三教授の研究チームの以前に記載された知見（ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３を欠損しているが、レクチン経路媒介性補体活性化における欠損はない遺伝子標的化マウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を作った）は、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３が、補体系の活性化に（あるとしても）わずかにしか関与していないことを実証する。
【００８４】
ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）の血漿を分析することによって達成された別の基本的な知見は、図６に示される。ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）を、現時点での教科書的な知見に従って、補体活性化の機能的に活性な第３の経路（すなわち、ザイモサンのような活性化表面に対して他の２つの経路とは独立して、Ｃ３を切断する副経路）を形成するはずである補体因子Ｃ３、Ｂ因子、Ｄ因子、およびプロペルジンの存在について分析した。図６に示されるように、ＭＡＳＰ−２が欠損している血漿において、マンナンコーティングプレート上で（図６Ａ）およびザイモサンコーティングプレート上で（図６Ｂ）、Ｃ３活性化は、Ｃ３ｂ沈着によって示されるように、全く起こらないかまたはわずかしか起こらない。このことは、ＭＡＳＰ−２は、上記副経路を開始するために最初のＣ３ｂを与えることを要することを明らかに実証する。ＭＡＳＰ−２の非存在下では、最初のＣ３ｂは、レクチン経路によって提供されず、ザイモサン（副経路活性化の確立したアクチベーター表面）に関しても提供されず、Ｃ３の副経路媒介性切断は観察できない。高濃度のＭＡＳＰ−２欠損性血清において認められるわずかな切断活性は、使用される実験条件下で、残りの古典的経路活性から生じ得る。
【００８５】
図５〜図７において示されるデータを得ることにおいて使用されるＣ３切断アッセイおよびＣ４切断アッセイは、Ｌｙｎｃｈ，Ｎ．Ｊ．；Ｒｏｓｃｈｅｒ，Ｓ．；Ｈａｒｔｕｎｇ，Ｔ．，Ｍｏｒａｔｈ，Ｓ．；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．；Ｍａｅｎｎｅｌ，Ｄ．Ｎ．；Ｋｕｒａｙａ，Ｍ．；Ｆｕｊｉｌａ，Ｔ．；Ｓｃｈｗａｅｂｌｅ ＷＪ． Ｌ−ｆｉｃｏｌｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ Ｂｉｎｄｓ ｔｏ Ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ Ａｃｉｄ，ａ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ ｏｆ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ Ｌｅｃｔｉｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：１１９８−１２０２（２００４）；ならびにＰｅｔｅｒｓｅｎ ＳＶ，Ｔｈｉｅｌ Ｓ，Ｊｅｎｓｅｎ Ｌ，Ｓｔｅｆｆｅｎｓｅｎ Ｒ，Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ ＪＣ． Ａｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５７：１０７−１１６（２００１）において記載されている。
【００８６】
ＭＡＳＰ−２の非存在が、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）におけるレクチン経路依存性Ｃ４活性化の喪失の直接の原因であったことを確認するために、組換えＭＡＳＰ−２タンパク質を血清サンプルに添加することの影響を、Ｃ４切断アッセイにおいて試験した。機能的に活性なマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ−２組換えタンパク質および触媒的に不活性なマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ−２Ａ（この不活性なＭＡＳＰ−２Ａにおいて、セリンプロテアーゼドメインにおける活性部位セリン残基が、アラニン残基で置換されている）組換えタンパク質を、Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ．１１（１）：４７−５０（２００５）に記載されるように生成した。４匹のＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）からプールした血清を、漸増するタンパク質濃度の組換えマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ−２または不活性な組換えマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ−２Ａのとともに予めインキュベートし、Ｃ４コンベルターゼ活性を、上記のようにアッセイした。図１２に示されるように、機能的に活性なマウス（ｍｕｒｉｎｅ）組換えＭＡＳＰ−２タンパク質（白三角として示される）を、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）から得られた血清に添加すると、タンパク質濃度依存性様式においてレクチン経路依存性Ｃ４活性化が回復したのに対して、触媒的に不活性なマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ−２Ａタンパク質（星として示す）は、Ｃ４活性化を回復させなかった。図１２に示される結果は、プールされた正常マウス（ｍｏｕｓｅ）血清（点線として示される）で観察されたＣ４活性化に対して正規化される。
【００８７】
図１３は、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）において古典的経路が機能していることを実証する。この実験において、野生型マウス（ｍｏｕｓｅ）およびＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）から得た未処理血清サンプルおよびＣ１ｑ除去血清サンプルを、免疫複合体（ＢＳＡを添加し、次いでウサギ抗ＢＳＡを添加することによってその場で作製した）でコーティングしたプレートに各々添加した。結合したＣ３ｂを、抗Ｃ３ｃ抗体で検出した。図１３に示されるように、このＣ３ｂ沈着は、野生型（Ｃ１ｑ除去した野生型血清は、白丸として示す）およびＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）（Ｃ１ｑ除去したＭＡＳＰ２−／−ＣＳ血清を、白三角として示す）の両方においてＣ１ｑ依存性であった。この野生型コントロール血清（×として示す）およびＭＡＳＰ２−／−ＣＳ血清（黒三角として示す）はともに、Ｃ３ｂ沈着によって示されるＣ３活性化を示す。
【００８８】
第２のＭＡＳＰ２遺伝子標的化マウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を、図２において記載される遺伝子破壊構築物を使用して樹立した。ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰを欠損するが、ＭＡＳＰ−２充足性のマウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を作出するために、エキソン５（このエキソンは、ＭＡＳＰ２遺伝子のＭＡｐ １９／ｓＭＡＰ特異的ｍＲＮＡ転写物の生成を担う）を、ｌｏｘＰ部位が両方から隣接するネオマイシンカセットによって置き換えた。この遺伝子標的化構築物を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｍｏｕｓｅ）系統に由来する胚性幹細胞株をトランスフェクトするために使用した。ネオマイシン耐性に対する選択の後、形質転換体を同定するために、このＣｒｅ／ｌｏｘＰ系を、上記構築物のｌｏｘＰ配列間にあるマーカー遺伝子を切り出すために使用する。これは、ＭＡＳＰ−２のエキソン５を欠きかつ残りのエキソンを破壊するマーカー遺伝子がないマウス（ｍｏｕｓｅ）を生じる。従って、このマウス（ｍｏｕｓｅ）は、ＭＡｐ １９について欠損性である（なぜなら、エキソン５がないからである）が、ＭＡＳＰ−２について充足性である（なぜなら、残りのエキソンは存在しており、その遺伝子は破壊されていないからである）ように設計される。しかし、本発明者らは、ウェスタンブロットによって決定されるように（データは示さず）、ＭＡＳＰ−２のタンパク質発現がＭＡｐ１９欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）において減少していることに注目している。破壊された対立遺伝子についてホモ接合性であるときに生成したこのＭＡｐ１９／ｓＭＡＰ欠損性マウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統は、繁殖能がありかつ生存能があり、以降、ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰ−／−ＴＦと称される。
【００８９】
図７は、ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰ−／−ＴＦマウス（ｍｏｕｓｅ）が、マンナンコーティングプレート上でのレクチン経路媒介性補体活性化を欠損していることを示す実験結果を示す。図５について使用されたものと同じアッセイを、この実験において使用した。
【００９０】
第３のＭＡＳＰ２遺伝子標的化マウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を、上記のＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）についてのものと同じ様式で、図３において記載される遺伝子破壊構築物を使用して樹立した。ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２を欠損するマウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を作出するために、エキソン５（このエキソンは、ＭＡＳＰ２遺伝子のＭＡｐ１９／ｓＭＡＰ特異的ｍＲＮＡ転写物の生成を担う）を、ネオマイシンカセットで置き換えた。図２に言及して記載される構築物とは異なり、図３の構築物は、ｌｏｘＰ配列を含まない。従って、使用されるマーカー遺伝子は、切り出すことができない。よって、得られるマウス（ｍｏｕｓｅ）系統は、ＭＡＳＰ−２のエキソン５を欠くが、残りのＭＡＳＰ−２エキソンは、マーカー遺伝子の存在によって破壊される。従って、得られたマウス（ｍｏｕｓｅ）は、ＭＡｐ １９およびＭＡＳＰ−２の両方を欠損している。この構築物を用いて作出した遺伝子標的化マウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を、以降、ＭＡＳＰ−２／ＭＡｐ１９ −／−と称する。
【００９１】
欠損型のマウスＭＡＳＰ−２および／または欠損型のマウスＭＡｐ１９のいずれかを、ヒトＭＡＳＰ−２またはヒトＭＡｐ１９のいずれかで置き換えるために、２つのミニ遺伝子構築物を、図４に記載されるように確立した。図４Ａは、ヒトＭＡＳＡＰ−２遺伝子のプロモーター領域を用いて、ヒトＭＡＳＰ−２をコードするミニ遺伝子構築物を記載する。この構築物は、最初の３つのエキソン（エキソン１〜エキソン３）の後に、その後の８つのエキソンのコード配列を表すｃＤＮＡ配列が続いており、それによって、ＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼの全長をコードしている。遺伝子組換えにより発現されるヒトＭＡＳＰ−２によって欠損型マウスＭＡＳＰ−２遺伝子を置き換えるために、このミニ遺伝子構築物（ミニｈＭＡＳＰ−２と呼ぶ）を、ＭＡＳＰ−２−／−ＣＳの受精卵に注入した。ＭＡＳＰ−２ミニ遺伝子構築物の配列（配列番号１）を、図１０に示す。
【００９２】
図４Ｂは、ヒトＭＡＳＰ−２遺伝子のプロモーター領域を使用する、ヒトＭＡｐ１９／ｓＭＡＰをコードするミニ遺伝子構築物を記載する。この構築物は、最初の３つのエキソン（エキソン１〜エキソン３）の後に、その後の２つのエキソンのコード配列を表すｃＤＮＡ配列が続いており、それによって、ＭＡｐ１９の全長をコードしている。遺伝子組換えにより発現されるヒトＭＡｐ１９によって欠損型マウスＭＡｐ１９遺伝子を置き換えるために、このミニ遺伝子構築物（ミニｈＭＡｐ１９と呼ぶ）を、ＭＡＳＰ−２−／−ＣＳの受精卵に注入した。ＭＡｐ１９ミニ遺伝子構築物の配列（配列番号２）を、図１１に示す。
【００９３】
図１０および図１１の両方に示される配列の最初の部分は、ヒトＭＡＳＰ−２のプロモーターおよび最初の３つのエキソンを表し、そして、これは、両方の構築物において同一である。各配列の第２の部分は、後に続く８つのエキソン（図１０）または後に続く２つのエキソン（図１１）のいずれかのｃＤＮＡコード配列を表す。関連のペプチド配列もまた、図１１に示されるが、図１０のコード部分は、大文字で示される。
【００９４】
ＭＡＳＰ−２阻害因子についてスクリーニングするためのモデルとして使用するための、ヒトＭＡＳＰ ２を発現するＭＡＳＰ ２−／−ノックアウトマウスは、以下のようにして作製し得る。上記のＭＡＳＰ ２−／−マウスと、上記のヒトＭＡＳＰ ２トランスジーン構築物を発現するＭＡＳＰ ２−／−マウス（ヒトＭＡＳＰ ２のノックイン）とを交配させ、そして、マウスＭＡＳＰ−２−／−、マウスＭＡｐ１９＋、ヒトＭＡＳＰ−２＋である子孫を使用して、ヒトＭＡＳＰ−２阻害因子を同定する。
【００９５】
このような動物モデルは、ヒト抗ＭＡＳＰ−２抗体、ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドおよびＭＡＳＰ−２阻害性非ペプチド、ならびに、ＭＡＳＰ−２阻害因子を含有する組成物のような、ＭＡＳＰ−２阻害因子の同定および効力についての、試験物質として使用され得る。例えば、動物モデルは、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を誘発することが公知の化合物または因子に曝露され、そして、ＭＡＳＰ−２阻害因子が、この曝露された動物における疾患症状の減少を導くのに十分な時間および濃度で、この動物モデルに投与される。
【００９６】
さらに、マウスＭＡＳＰ−２−／−、マウスＭＡｐ１９＋、ヒトＭＡＳＰ−２＋のマウスを用いて、ＭＡＳＰ−２関連疾患に関与する１以上の細胞型を含有する細胞株を作製し得、この細胞株は、その障害についての細胞培養モデルとして使用され得る。トランスジェニック動物からの持続的な細胞株の作製は、当該分野で周知である。例えば、Ｓｍａｌｌら，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５：６４２−４８（１９８５）を参照のこと。
【００９７】
レクチン依存性のＭＡＳＰ−２補体活性化系が、腹部大動脈瘤の修復後の再灌流期に活性化されることを示す実験結果を、図８に示す。これは、虚血性の再灌流傷害を有する患者における、ＭＢＬレベルの変化を示すグラフである。腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）修復を受けた患者は、虚血性の再灌流傷害に供され、この虚血性の再灌流傷害は、大体において、補体の活性化により媒介される。本発明者らは、ＡＡＡ修復を受けた患者における虚血−再灌流傷害において、補体のレクチン経路の役割を調べた。
【００９８】
選択的な腎臓下ＡＡＡ修復を受けた患者は、手順の間の４つの規定された時点（時点１：麻酔の導入期、時点２：大動脈のクランプの直前、時点３：大動脈のクランプを取り外す直前、時点４：再灌流の間）において、（動脈経路を介して）その橈骨動脈から、全身性の血液サンプルを採取した。大きな開腹手術を受けた患者をコントロールとして用い、そして、導入期と、手順の開始から２時間後に血液サンプルを採取した。ＥＬＩＳＡ技術を用いて、患者の血漿を、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）のレベルについてアッセイした。ＭＢＬは、ＭＢＬ会合型セリンプロテアーゼＭＡＳＰ−２の活性化を通じて、レクチン経路の活性化を開始する、血漿パターン認識分子である。本発明者らは、血漿ＭＢＬの消費を、再灌流中に生じるレクチン経路活性化についてのパラメータとして使用した。
【００９９】
結果は図８に示される。ＡＡＡ修復を受けている２３名の患者および８名のコントロール患者を採用した。大きな腹部手術を受けているコントロール群から取得した血漿サンプルにおいてごく少量のＭＢＬの消費が観察されたが、ＡＡＡ患者は、血漿ＭＢＬレベルの有意な減少を示す（平均して約４１％）。
【０１００】
示されるデータは、補体系のレクチン経路がＡＡＡ修復後の再灌流段階において活性化されるという強力な指標を提供する。これは、虚血−再灌流傷害に対して二次的なものであるようである。なぜなら、大きな虚血−再灌流傷害を伴わずに大きな腹部手術を受けている患者のコントロール血清は、ＭＢＬ血漿レベルのわずかな減少を示すのみであるからである。再灌流傷害における補体活性化の十分に確立された寄与の点から見ると、本発明者らは、虚血性内皮細胞におけるレクチン経路の活性化は再灌流傷害の病理において重要な因子であり、そしてレクチン経路活性の特異的な一過性の遮断は、一過性の虚血性傷害を伴う手術における疾患の結果（すなわち、心筋梗塞、腸梗塞、熱傷、移植および脳卒中）に対して有意な治療的インパクトを有すると結論付ける。これらの結果はまた、レクチン経路を欠く生物がこの経路の研究のための、または虚血性傷害に対する処置の開発のための、モデル生物として非常に有用であることを確認する。
【０１０１】
最後に、図９は、本明細書に記載される実験から得られた情報に基づく関連するレクチン経路を要約するフローチャートである。本発明者らは、ＭＡＳＰ２が副補体経路活性化を惹起するために必要であることを同定した。ＭＡＳＰ ２ −／−ノックアウトマウスモデルの使用を通して、本発明者らは、Ｃ３ｂ沈着を阻害することが可能であることを示した。これは、古典的経路を完全なままにしながら、レクチン依存性のＭＡＳＰ−２経路を介する副補体経路活性化における開始段階であり、したがって、レクチン依存性のＭＡＳＰ ２活性化を、古典的経路の関与の非存在下での副補体活性化のための必要条件として確立する。したがって、本発明は、免疫系の古典的（Ｃ１ｑ依存性の）経路成分を完全なままにしながら、レクチン媒介性の副補体経路活性化に関連する細胞傷害を阻害するための治療標的としてのＭＡＳＰ−２の使用を示唆する。
【０１０２】
さらに、ここで、レクチン経路を介するＭＡＳＰ−２媒介性補体活性化は、古典的経路の関与の非存在下での副活性化経路の惹起のための必要条件として確立されたので、本発明者らは、この知見をさらに、ＭＡｐ１９がＭＳＡＰ−２タンパク質発現の調節および補体のレクチン経路活性化ルートにおいて生物学的役割を有し得ると拡張した。ＭＡｐ１９の欠損（すなわち、Ｍａｐ１９ −／−）についての遺伝子標的化マウスモデルの使用を通して、本発明者らは、古典的経路を完全なままにしながらレクチン経路活性化とＭＳＡＰ−２依存性のレクチン経路を介するＣ４沈着とを阻害し得ることを示した。したがって、本発明は、免疫系の古典的（Ｃ１ｑ依存性の）経路成分を完全なままにしながら、レクチン媒介性の副補体経路活性化に関連する細胞傷害を阻害するための治療標的としてのＭＡｐ１９の使用を示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に従って、ＭＡＳＰ−２ノックアウトのために使用される構築物と一緒に、ノックアウト実験のためにマウスＭＡＳＰ−２を標的化することを示すマップを示す。
【図２】図２は、ＭＡｐ １９欠損性／ＭＡＳＰ−２充足（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）哺乳動物の生成において有用な、本発明の一実施形態に従って、ノックアウト実験のために（マウスＭＡＳＰ−２遺伝子のエキソン５として）ＭＡｐ １９を標的化するために有用なｌｏｘＰ構築物を示す。
【図３】図３は、ＭＡｐ １９とＭＡＳＰ−２とを欠損する哺乳動物の生成において有用なノックアウト実験のために、ＭＡｐ １９を標的化するために有用な代替構築物を示す。
【図４】図４は、トランスジェニック動物の生成のための、（Ａ）ヒトＭＡＳＰ−２ミニ遺伝子構築物および（Ｂ）ヒトＭＡｐ １９ミニ遺伝子構築物を示す。
【図５】図５は、ＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）がレクチン経路媒介性Ｃ４活性化を欠くことを示す実験結果を示す。
【図６】図６は、ＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）がレクチン経路媒介性Ｃ３活性化を欠くことを示す実験結果を示す。
【図７】図７は、ＭＡｐ１９欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）がレクチン経路媒介性Ｃ４活性化を欠くことを示す実験結果を示す。
【図８】図８は、虚血性再灌流傷害を有する患者におけるＭＢＬレベルの変化を示すグラフである。
【図９】図９は、図５、図６および図７に記載されるＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）およびＭＡｐ−１９欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）での実験から得られた結果をまとめるフローチャートである。
【図１０−１】図１０は、図４ＡのＭＡＳＰ−２ミニ遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１０−２】図１０は、図４ＡのＭＡＳＰ−２ミニ遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１１−１】図１１は、図４ＢのＭＡｐ １９ミニ遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図１１−２】図１１は、図４ＢのＭＡｐ １９ミニ遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図１２】図１２は、組換えＭＡＳＰ−２タンパク質が、ＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）においてレクチン経路媒介性Ｃ４活性化を再構成することを示す実験結果を示す。
【図１３】図１３は、古典的経路が、ＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）において機能することを示す実験結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物（特に、遺伝子改変された非ヒト齧歯類（例えば、マウス））に関し、これらは、いかなる内因性のマンナン結合レクチン会合型（ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）セリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ−２）ポリペプチドも生成しない。本発明はまた、遺伝子改変された非ヒト細胞（特に、胚性幹細胞）（特に、齧歯類細胞（例えば、マウス細胞））に関し、これらは、いかなる内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドも生成しない。本発明はまた、遺伝子改変された非ヒト細胞（特に、胚性幹細胞）およびそれらから生成される遺伝子改変された非ヒト哺乳動物、ならびに内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子がゲノムから欠失しているかまたは破壊されている非ヒト哺乳動物および非ヒト細胞の生成における上記の使用に関する。本発明の局面はまた、いかなる内因性のマンナン結合レクチン会合型タンパク質１９（ＭＡｐ１９）タンパク質も生成しない、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物および非ヒト細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
補体系は、微生物感染および他の急性傷害に対する炎症性応答を開始して増幅するための早期作用機構を提供する（Ｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｍ．Ｋ．およびＪ．Ｐ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ，１９９３，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。補体活性化は、潜在的病原体に対する有益な最前線の防御を提供するが、防御的炎症性応答を促進する補体の活性化はまた、宿主に対して潜在的な脅威も示し得る（非特許文献１；非特許文献２）。例えば、Ｃ３タンパク質分解性産物およびＣ５タンパク質分解性産物は、好中球を動員して活性化する。これらの活性化された細胞は、破壊的酵素を無差別に放出して、器官損傷を引き起こし得る。さらに、補体活性化は、近傍の宿主細胞上および微生物標的上における溶解性補体成分の沈着を引き起こし得、これによって、宿主細胞の溶解が生じる。
【０００３】
補体系は、多数の急性疾患状態および慢性疾患状態（心筋梗塞、脳卒中後の血管再生、ＡＲＤＳ、再灌流傷害、敗血症性ショック、熱傷後の毛細血管漏出、心肺バイパス後の炎症、移植拒絶、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、およびアルツハイマー病が挙げられる）の病因に寄与すると関係付けられている。これらの状態のほぼすべてにおいて、補体は、原因ではないが、病因に関与するいくつかの要因のうちの１つではある。それにも関わらず、補体活性化は、主要な病理学的機構であり得、これらの疾患状態のうちの多くにおける臨床的コントロールのための有効な目標を示す。種々の疾患状態における補体媒介性組織傷害の重要性について高まりつつある認識は、有効な補体阻害薬物についての必要性を明確に示す。補体活性化を特異的に標的化して阻害する薬物は、ヒトのための使用について認可されていない。
【０００４】
現在、補体系は、３つの別個の経路（古典的経路、レクチン経路、および副経路）を介して活性化され得ることが、広く受け入れられている。古典的経路は、通常は、外来粒子（すなわち、抗原）に結合している抗体によって誘発され、従って、これには、特定の抗体の生成のためにその抗原に前もって曝露されていることが必要である。古典的経路の活性化は、免疫応答の発生に関係するので、古典的経路は、後天的免疫系の一部である。対照的に、レクチン経路および副経路は、クローン性（ｃｌｏｎａｌ）免疫とは独立しており、先天性免疫系の一部である。
【０００５】
古典的経路の活性化における第一の段階は、抗原結合型ＩｇＧおよび抗原結合型ＩｇＭに対する、特異的認識分子Ｃ１ｑの結合である。補体系の活性化は、セリンプロテアーゼであるチモーゲンの連続的活性化を生じる。Ｃ１ｑは、Ｃ１と呼ばれる複合体として、Ｃ１ｒおよびＣｌｓというセリンプロテアーゼプロ酵素と会合する。免疫複合体に対するＣ１ｑの結合の際に、Ｃ１ｒのＡｒｇ−Ｉｌｅ部位の自己タンパク質分解性切断の後に、Ｃ１ｓのＣ１ｒ活性化が生じ、これによって、Ｃ４およびＣ２を切断する能力を獲得する。Ｃ４が２つのフラグメント（Ｃ４ａおよびＣ４ｂと呼ばれる）へと切断されると、Ｃ４ｂフラグメントは、隣接するヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することが可能になり、その後、活性化したＣ２のＣ２ｂフラグメントとの非共有結合を介してＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）が生成する。Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）は、Ｃ３を活性化して、Ｃ５コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ）の生成と、微生物溶解を引き起こし得る膜攻撃複合体（Ｃ５ｂ−９）の形成とをもたらす。活性化形態のＣ３およびＣ４（Ｃ３ｂおよびＣ４ｂ）は、外来標的表面上に共有結合的に沈着され、これらは、複数の食細胞上の補体レセプターによって認識される。
【０００６】
独立して、レクチン経路による補体系の活性化における第一の段階もまた、特定の認識分子の結合であり、この後に、会合型セリンプロテアーゼが活性化する。しかし、Ｃ１ｑによる免疫複合体の結合ではなく、レクチン経路における上記認識分子は、血清糖質結合タンパク質（マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）、Ｈ−フィコリン、Ｍ−フィコリン、およびＬ−フィコリン）である（非特許文献３）。Ｉｋｅｄａらは、Ｃ１ｑと同様に、ＭＢＬが、酵母のマンナンで覆われた赤血球に結合する際にＣ４依存的様式で補体系を活性化し得ることを、初めて実証した（非特許文献４）。ＭＢＬ（コレクチンタンパク質ファミリーのメンバーである）は、ピラノース環の赤道面において方向付けられた３−ヒドロキシル基および４−ヒドロキシル基によって糖質と結合する、カルシウム依存性レクチンである。従って、ＭＢＬに対する著名なリガンドは、Ｄ−マンノースおよびＮ‐アセチル−Ｄ−グルコサミンであるが、この立体的要件に適合しない糖質は、ＭＢＬに対して検出可能な親和性を有さない（非特許文献５）。ＭＢＬと一価糖との間の相互作用は、非常に弱く、解離定数は、代表的は、２ｍＭの範囲にある。ＭＢＬは、複数の単糖残基と同時に相互作用することによって、グリカンリガンドへの緊密な特異的結合を達成する（非特許文献６）。ＭＢＬは、微生物（例えば、細菌、酵母、寄生生物、および特定のウイルス）を共通して飾る糖質パターンを認識する。対照的に、ＭＢＬは、Ｄ−ガラクトースおよびシアリン酸（哺乳動物の血漿および細胞表面糖タンパク質上に存在する「成熟」複合糖結合体を通常は飾る、最後から２番目の糖および最後の糖である）を認識しない。この結合特異性は、自己活性化から防御するのを助けると考えられる。しかし、ＭＢＬは、哺乳動物細胞の小胞体およびゴルジ装置中に封鎖されているＮ結合型糖タンパク質および糖脂質上にある高マンノース「前駆体」グリカンのクラスターに対して、高い親和性で結合する（非特許文献７）。従って、損傷した細胞は、ＭＢＬ結合を介するレクチン経路活性化のための潜在的標的である。
【０００７】
フィコリンは、ＭＢＬとは異なる型のレクチンドメイン（フィブリノーゲン様ドメインと呼ばれる）を保有する。フィコリンは、Ｃａ＋＋非依存性様式で糖残基に結合する。ヒトにおいて、３種類のフィコリン（Ｌ−フィコリン、Ｍ−フィコリン、およびＨ−フィコリン）が、同定されている。血清フィコリンであるＬ−フィコリンおよびＨ−フィコリンの両方が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに対して特異性を共通して有するが、Ｈ−フィコリンはまた、Ｎ−アセチル−Ｄ‐ガラクトサミンにも結合する。Ｌ−フィコリン、Ｈ−フィコリン、およびＭＢＬの糖特異性の差は、種々のレクチンが、相補的でありかつ標的が異なるが重複する、糖結合体であり得ることを意味する。この概念は、レクチン経路における公知のレクチンのうち、Ｌ−フィコリンのみが、リポテイコ酸（すべてのグラム陽性細菌において見出される細胞壁糖結合体である）に特異的に結合するという、最近の報告によって支持される（非特許文献８）。コレクチン（すなわち、ＭＢＬ）およびフィコリンは、アミノ酸配列の有意な類似性を有さない。しかし、この２つのタンパク質群は、類似するドメイン構成を有し、Ｃ１ｑと同様に、オリゴマー構造体になるようにアセンブルする。このオリゴマー構造体は、多部位結合の可能性を最大にする。ＭＢＬの血清濃度は、健常集団において大きく変動し、これは、ＭＢＬ遺伝子のプロモーター領域およびコード領域の両方における多型／変異によって遺伝的に制御される。急性期タンパク質として、ＭＢＬの発現は、炎症の間にさらにアップレギュレートされる。Ｌ−フィコリンは、ＭＢＬと同様の濃度で血清中に存在する。従って、レクチン経路のＬ−フィコリン部門は、潜在的には、ＭＢＬ部門と強さが匹敵する。ＭＢＬおよびフィコリンはまた、オプソニンとして機能し得る。オプソニンは、これらのタンパク質と食細胞レセプターとの相互作用を必要とする（非特許文献９；非特許文献１０）。しかし、食細胞上のレセプターの正体は、確立されていない。
【０００８】
ヒトＭＢＬは、そのコラーゲン様ドメインを介して、独特なＣ１ｒ／Ｃ１ｓ様セリンプロテアーゼ（ＭＢＬ会合型（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）と呼ばれる）と特異的かつ高親和性の相互作用を形成する。現在までに、３種のＭＡＳＰが、記載されている。まず、１つの酵素「ＭＡＳＰ」が、同定されており、補体カスケードの開始を担う（すなわち、Ｃ２およびＣ４を切断する）酵素として特徴付けられている（非特許文献１１）。後に、ＭＡＳＰは、実際には、２つのプロテアーゼ（ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２）の混合物であることがわかった（非特許文献１２）。しかし、ＭＢＬ−ＭＡＳＰ−２複合体のみで、補体活性化のためには十分であることが、実証された（非特許文献１３）。さらに、ＭＡＳＰ−２のみが、高い割合でＣ２およびＣ４を切断した（非特許文献１４）。従って、ＭＡＳＰ−２は、Ｃ４およびＣ２を活性化してＣ３コンバターゼであるＣ４ｂ２ａを生成することを担う、プロテアーゼである。このことが、Ｃ１複合体との重要な差異である。Ｃ１複合体において、２つの特定のセリンプロテアーゼ（Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ）の協働作用が、補体系の活性化をもたらす。最近、第三の新規なプロテアーゼであるＭＡＳＰ−３が、単離された（非特許文献１５）。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３は、同じ遺伝子の選択的スプライス産物である（非特許文献１６）。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３の生物学的機能は、解明されるべきままの状態である。
【０００９】
ＭＡＳＰは、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ（Ｃ１複合体の酵素成分である）と同じドメイン構成を共有する（非特許文献１７）。これらのドメインとしては、Ｎ末端Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ／ウニ（ｓｅａ ｕｒｃｈｉｎ）Ｕｅｇｆ／骨形成タンパク質（ＣＵＢ）ドメイン、上皮増殖因子様ドメイン、第二ＣＵＢドメイン、直列型補体制御タンパク質ドメイン、およびセリンプロテアーゼドメインが挙げられる。Ｃ１プロテアーゼにおいてと同様に、ＭＡＳＰ−２の活性化は、セリンプロテアーゼドメインに隣接したＡｒｇ−Ｉｌｅ結合の切断を介して生じ、これによって、この酵素は、ジスルフィド結合したＡ鎖およびＢ鎖へと分割される。後者は、セリンプロテアーゼドメインからなる。最近、ＭＡＳＰ−２の遺伝的に決定された欠損が、記載された（非特許文献１８）。一ヌクレオチドの変異が、ＣＵＢ１ドメインにおけるＡｓｐ−Ｇｌｙ交換をもたらし、ＭＡＰＳ−２がＭＢＬに結合できないようにする。
【００１０】
ＭＢＬはまた、１９ｋＤａのＭＢＬ会合型（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質（ＭＡｐ１９）（非特許文献１９）または小ＭＢＬ会合型（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質（ｓＭＡＰ）（非特許文献２０）と呼ばれる、非酵素タンパク質と会合する。ＭＡｐ１９は、ＭＡＳＰ２遺伝子産物の選択的スプライシングによって形成される。これは、ＭＡＳＰ−２の最初の２つのドメインの後に、４つの独特のアミノ酸からなる余分な配列を含む。ＭＡｐ１９の生物学的機能は、未知である。ＭＡＳＰ−１遺伝子およびＭＡＳＰ−２遺伝子は、それぞれ、第３染色体および第１染色体に位置する（非特許文献２１）。
【００１１】
数種の証拠によって、種々のＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合体が存在し、血清中の全ＭＡＳＰの大部分は、ＭＢＬと複合体形成していないことが、示唆される（非特許文献２２）。Ｈ−フィコリンおよびＬ−フィコリンの両方が、ＭＡＳＰと会合し、レクチン補体経路を活性化する。ＭＢＬも同様である（非特許文献２３；非特許文献２４）。レクチン経路および古典的経路の両方が、共通するＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ａ）を形成し、この２つの経路は、この段階で合流する。
【００１２】
レクチン経路は、感染に対する宿主防御において主要な役割を有すると広く考えられている。宿主防御にＭＢＬが関与することについての強力な証拠は、機能的ＭＢＬの血清レベルが減少した患者の分析に由来する（非特許文献２５）。そのような患者は、再発性の細菌感染および真菌感染に対する感受性を示す。これらの症状は、通常は、人生の初期において、母体由来抗体力価が弱まる見かけ上脆弱な期間の間であるが、すべての抗体応答レパートリーが発達する前に、明らかである。この症状は、しばしば、ＭＢＬのコラーゲン性部分中のいくつかの部位における変異から生じ、これは、ＭＢＬオリゴマーの適切な機能を妨害する。しかし、ＭＢＬは、補体とは独立してオプソニンとして機能し得るので、感染に対する感受性の増加が、どの程度まで、補体活性化の減損に起因するのは、わからない。
【００１３】
非感染性ヒト疾患の病因に古典的補体経路および第二補体経路の両方を関連付ける広範な証拠が存在するが、レクチン経路の役割は、ちょうど解明され始めたばかりである。最近の研究は、レクチン経路の活性化が、虚血／再灌流傷害における補体活性化および関連する炎症を担い得るという証拠を提供する。Ｃｏｌｌａｒｄら（２０００）は、酸化的ストレスに供された培養内皮細胞が、ＭＢＬに結合して、ヒト血清に曝露された際にＣ３の沈着を示すことを報告した（非特許文献２６）。さらに、遮断性抗ＭＢＬモノクローナル抗体によるヒト血清の処理は、ＭＢＬの結合および補体活性化を阻害した。これらの所見は、ラットＭＢＬに対する遮断抗体で処理されたラットが、コントロール抗体で処理されたラットよりも冠状動脈の閉塞に際して有意に少ない心筋損傷を示した、心筋虚血−再灌流ラットモデルに拡張された（非特許文献２７）。酸化的ストレスの後の脈管内皮に対するＭＢＬ結合の分子機構は、不明である。最近の研究は、酸化的ストレス後のレクチン経路の活性化が、糖結合体へのＭＢＬの結合によってではなく、脈管内皮サイトケラチンへのＭＢＬの結合によって媒介され得ることを示唆する（非特許文献２８）。他の研究は、虚血／再灌流傷害の病因に、古典的経路および副経路を関係付けた。この疾患におけるレクチン経路の役割は、意見が分かれる状態のままである（非特許文献２９）。
【００１４】
古典的経路およびレクチン経路とは対照的に、他の２つの経路においてＣ１ｑおよびレクチンが実施する認識機能を満たす副経路のイニシエーターは、見出されていない。現在、副経路は、外来表面または他の異常な表面（細菌、酵母、ウイルス感染細胞、または損傷組織）によって自発的に誘発されることが、広範に受け入れられている。副経路に直接関与する４種の血漿タンパク質（Ｃ３、Ｂ因子、Ｄ因子、およびプロペルジン）が、存在する。ネイティブＣ３からのＣ３ｂのタンパク質分解性生成が、副経路が機能するために必要である。副経路のＣ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）は、Ｃ３ｂを必須サブユニットとして含むので、副経路を介する第一のＣ３ｂの起源に関する疑問は、難解な問題を提示し、かなりの研究を刺激した。
【００１５】
Ｃ３は、チオエステル結合として公知である希少な翻訳後修飾を含む、タンパク質ファミリーに（Ｃ４およびα−２マクログロブリンとともに）属する。そのチオエステル基は、システインから３アミノ酸離れたスルフヒドリル基にその末端カルボニル基が結合している、グルタミンから構成される。この結合は、不安定であり、グルタミンの電気誘引性カルボニル基は、ヒドロキシル基またはアミノ基を介して、他の分子と共有結合を形成し得る。このチオエステル結合は、インタクトなＣ３の疎水性ポケット中に封鎖された場合には、かなり安定である。しかし、Ｃ３からＣ３ａおよびＣ３ｂへのタンパク質分解性切断は、Ｃ３ｂ上の非常に反応性が高いチオエステル結合の露出をもたらし、この機構によって、標的に対してＣ３ｂが共有結合する。補体標的に対するＣ３ｂの共有結合におけるその十分に記載された役割に加えて、Ｃ３チオエステルはまた、副経路を誘発する際に中心的役割を果たすと考えられている。広く受け入れられている「緩慢進行（ｔｉｃｋ−ｏｖｅｒ）理論」に従うと、副経路は、液相のコンバターゼであるＣ３ｂＢｂの生成によって開始される。このコンバターゼは、Ｃ３と、加水分解されたチオエステル（Ｃ３ｂ；Ｃ３Ｈ２０）およびＢ因子とから形成される（非特許文献３０）。Ｃ３ｂ様ｉＣ３が、ネイティブＣ３から、このタンパク質中の内部チオエステルの緩徐な自発的加水分解によって生成される（非特許文献３１）。Ｃ３ｂＢｂコンバターゼの活性を介して、Ｃ３ｂ分子が、標的表面上に沈着され、それによって、副経路が開始される。
【００１６】
副経路の活性化のイニシエーターに関して、ほとんど知られていない。アクチベーターとしては、酵母細胞壁（ザイモサン）、多くの純粋な多糖、ウサギ赤血球、特定の免疫グロブリン、ウイルス、真菌、細菌、動物腫瘍細胞、寄生生物、および損傷細胞が挙げられると考えられる。これらのアクチベーターに共通する唯一の特徴は、糖質の存在であるが、糖質構造の複雑性および多様性は、共有される分子機構を確立することを困難にする。このことが、認識される。
【００１７】
副経路はまた、レクチン／古典的経路のＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）に、強力な増幅ループを提供し得る。なぜなら、生成されるどのＣ３ｂも、Ｂ因子とともに、さらなる副経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）の形成に関与し得るからである。副経路Ｃ３コンバターゼは、プロペルジンの結合によって安定化される。プロペルジンは、副経路のＣ３コンバターゼの半減期を、６〜１０倍に延長する。Ｃ３コンバターゼにＣ３ｂを添加すると、副経路のＣ５コンバターゼの形成をもたらす。
【００１８】
３つすべての経路（すなわち、古典的経路、レクチン経路、および副経路）は、Ｃ５にて合流すると考えられている。Ｃ５は、切断されて、複数の炎症促進効果を有する産物を形成する。合流した経路は、終末（ｔｅｒｍｉｎａｌ）補体経路と呼ばれる。Ｃ５ａは、最も強力なアナフィラトキシンであり、平滑筋および脈管の緊張の変化、ならびに脈管透過性を誘導する。これはまた、好中球および単球の両方の強力なケモタキシンおよびアクチベーターである。Ｃ５ａ媒介性細胞活性化は、複数のさらなる炎症メディエーター（サイトカイン、加水分解性酵素、アラキドン酸代謝産物、および反応性酸素種が挙げられる）の放出を誘導することによって、炎症性応答を有意に増幅し得る。Ｃ５の切断は、Ｃ５ｂ−９（膜攻撃複合体（ＭＡＣ）としても公知である）の形成をもたらす。部分溶解性（ｓｕｂｌｙｔｉｃ）ＭＡＣ沈着が、溶解性孔形成複合体としてのその役割に加えて、炎症において重要な役割を果たし得るという、強力な証拠が、現在存在する。
【非特許文献１】Ｋａｌｌｉ，Ｋ．Ｒ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．（１９９４）１５：４１７〜４３１
【非特許文献２】Ｍｏｒｇａｎ，Ｂ．Ｐ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．（１９９４）２４：２１９〜２２８
【非特許文献３】Ｌｕ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２００２）１５７２：３８７〜４００
【非特許文献４】Ｉｋｅｄａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）２６２：７４５１〜７４５４
【非特許文献５】Ｗｅｉｓ，Ｗ．Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３６０：１２７〜１３４
【非特許文献６】Ｌｅｅ，Ｒ．Ｔ．ら、Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９９２）２９９：１２９〜１３６
【非特許文献７】Ｍａｙｎａｒｄ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）２５７：３７８８〜３７９４
【非特許文献８】Ｌｙｎｃｈ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００４）１７２：１１９８〜１２０２
【非特許文献９】Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．（１９８９）１６９：１７３３
【非特許文献１０】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：２４４８〜５４
【非特許文献１１】Ｊｉ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５０：５７１〜５７８
【非特許文献１２】Ｔｈｉｅｌ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８６：５０６〜５１０
【非特許文献１３】Ｖｏｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６５：２０９３〜２１００
【非特許文献１４】Ａｍｂｒｕｓ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０：１３７４〜１３８２
【非特許文献１５】Ｄａｈｌ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１５：１２７〜３５
【非特許文献１６】Ｓｔｏｖｅｒら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００３）４：３７４〜３８４
【非特許文献１７】Ｓｉｍ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２０００）２８：５４５
【非特許文献１８】Ｓｔｅｎｇａａｒｄ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００３）３４９：５５４〜５６０
【非特許文献１９】Ｓｔｏｖｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６２：３４８１〜９０
【非特許文献２０】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１１：８５９〜８６３
【非特許文献２１】Ｓｃｈｗａｅｂｌｅ，Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）２０５：４５５〜４６６
【非特許文献２２】Ｔｈｉｅｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６５：８７８〜８８７
【非特許文献２３】Ｄａｈｌ．Ｍ．Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１５：１２７〜３５
【非特許文献２４】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）１６８：３５０２〜３５０６
【非特許文献２５】Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ，．Ｄ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２００２）１５７２：４０１〜４１３
【非特許文献２６】Ｃｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０００）１５６：１５４９〜１５５６
【非特許文献２７】Ｊｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００１）１０４：１４１３〜１４１８，２００１
【非特許文献２８】Ｃｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００１）１５９：１０４５〜１０５４
【非特許文献２９】Ｒｉｅｄｅｒｍａｎｎ，Ｎ．Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００３）１６２：３６３〜３６７
【非特許文献３０】Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．（１９８４）７：１４３〜１６２
【非特許文献３１】Ｐａｎｇｂｕｒｎ，Ｍ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８１）１５４：８５６〜８６７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、ＭＡＳＰ−２遺伝子の標的化破壊を含み、かつレクチン補体経路が欠損している、ノックアウト生物をここに作製した。そのような生物は、健康および疾患における、レクチン経路欠損の役割を研究するためのモデルとして有用である。その生物は、再灌流傷害、心筋梗塞、脳卒中、および移植などの障害についての実験モデルとして、潜在的に有用である。その生物はまた、治療ツールとして使用するための、ヒトＭＡＳＰ−２に対する抗体の生成のためにも有用であり得る。本発明者らはまた、ＭＡｐ１９の生成が欠損した生物を作製した。
【００２０】
従って、本発明は、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または遺伝子改変された非ヒト細胞を提供し、これらは、内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない。本発明はまた、遺伝子改変されたマウスまたはトランスジェニックマウスを提供し、その生殖細胞は、破壊されたＭＡＳＰ−２遺伝子を含む。本発明はさらに、遺伝子改変されたトランスジェニックマウスまたはその子孫を提供し、その体細胞および生殖細胞は、内因性ＭＡＳＰ−２を含まない。
【００２１】
本発明の一局面において、上記の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞は、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない。
【００２２】
本明細書において、内因性とは、真正であり（ａｔｕｔｈｅｎｔｉｃ）、ネイティブであり、異種（ｆｏｒｅｉｇｎ）ではなく、そして遺伝子操作（例えば、遺伝子標的化または遺伝子導入）によって改変されていないものとして、定義される。
【００２３】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞は、すべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列または本質的にすべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列の標的化欠失によって取得可能である。この欠失は、すべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子と介在配列（完全なエキソン／イントロンの除去もしくは完全な（ｃｌｅａｎ）欠失）の欠失であっても、ＭＡＳＰ−２遺伝子の発現が防止されるような内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列の広範な部分の欠失による本質的にすべての内因性ＭＡＳＰ−２配列の欠失であってもよい。標的化破壊は、相同組換えプロセスによって、または組換え−切り出しプロセス（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え）によって、実施され得る。従って、本発明は、相同組換え法によって取得可能な、本明細書中に記載されるような遺伝子改変された非ヒト哺乳動物もしくはトランスジェニック非ヒト哺乳動物、または遺伝子改変された非ヒト哺乳動物細胞もしくはトランスジェニック非ヒト哺乳動物細胞（好ましくは、本明細書中に記載されるような、胚性幹細胞）をさらに提供する。
【００２４】
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系は、Ｚｏｕら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３；２６２，１２７１〜１２７４）に記載される。これは、哺乳動物細胞において作動し、かつマウスにおいて遺伝子標的化実験のために使用されて生殖系列中の標的遺伝子の「完全な（ｃｌｅａｎ）」欠失を生成し、そして（Ｃｒｅリコンビナーゼの調節された発現に基づく）条件付き様式で遺伝子を不活化した、系を記載する。
【００２５】
Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１に由来する３８ｋＤａのリコンビナーゼタンパク質であり、これは、ｌｏｘＰ部位の間にある分子内（切除的もしくは反転的）および分子間（組込み的）での部位特異的組換えを媒介する。この系の概説について、Ｓａｕｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；１９９３、Ｖｏｌ．２２５，８９０〜９００を参照のこと。ｌｏｘＰ部位（クロスオーバーする座）は、８ｂｐの非対称スペーサー領域によって隔てられた２つの１３ｂｐ逆方向反復からなる。１分子のＣｒｅが、１つの逆方向反復に結合するか、または２つのＣｒｅ分子が、１つのｌｏｘＰ部位と整列する。この組換えは、上記の非対称スペーサー領域において生じる。その８塩基はまた、この部位の方向性を担う。互いに反対方向を向く２つのｌｏｘＰ配列は、介在ＤＮＡ片を逆向きにし、順（ｄｉｒｅｃｔ）方向にある２つの部位は、それらの部位の間にある介在ＤＮＡの切除を指令し、１つのｌｏｘＰ部位を後ろに残す。この正確なＤＡＮ除去は、遺伝子を排除するため（遺伝子欠失）または遺伝子を活性化するために、使用され得る。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系はまた、遺伝子を導入するために（遺伝子導入）、使用され得る。順（ｄｉｒｅｃｔ）方向にある２つのｌｏｘＰ部位が両方から隣接する遺伝子は、「フロックス（ｆｌｏｘｅｄ）遺伝子」と呼ばれる。
【００２６】
Ｚｏｕら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９４；４（１２）１０９９〜２００３）は、マウス胚性幹細胞においてＣｒｅ−ｌｏｘＰ系を使用して、マウス遺伝子Ｃｇ１を対応するヒト遺伝子Ｃｇ１で置換することを記載する。Ｃｇ１は、ＩｇＧ１抗体の重鎖の定常領域をコードする。ｌｏｘＰ部位が標的遺伝子配列（この場合は、マウスＣｇ１）の３’末端にクローン化されており、標的遺伝子の５’側の位置に、目的の変異体遺伝子（この場合は、ヒトＣｇ１）、ｌｏｘＰ部位、ネガティブ選択マーカー（ＨＳＶ−ｔｋ）、およびポジティブ選択マーカー（ｎｅｏｒ）からなる挿入が、なされた、標的化構築物が、作製された。この構築物において、ｌｏｘＰ部位は、順（ｄｉｒｅｃｔ）方向にあった。この標的化構築物は、ＥＳ細胞中へのトランスフェクションによって導入され、形質転換体が、ネオマイシン耐性によってＧ４１８において選択された。Ｃｒｅ構築物が、形質転換細胞中に導入されて、Ｃｒｅの一過性発現が達成された。組換え（これは、２つのｌｏｘＰ部位の間の配列（ＨＳＶ−ｔｋ、ｎｅｏｒ、および内因性標的遺伝子であるマウスＣｇ１をコードする）の切除である）が、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する細胞においてのみ、生じた。ヒトＣｇ１配列が、ｌｏｘＰ部位の外側に位置し、従って、マウスゲノム中に挿入された状態のままであった。アシクロビルまたはガンシクロビルを使用するネガティブ選択が、欠失が生じた細胞を同定するために使用された。なぜなら、ＨＳＶ−ｔｋを発現しない細胞（すなわち、内因性マウスＣｇ１遺伝子もまた欠失している細胞）のみが、その培地において生存可能であったからである。
【００２７】
従って、Ｚｏｕら（１９９４）は、ヒトＣｇ１遺伝子を導入し、その後に１つの内因性Ｉｇ重鎖定常領域遺伝子Ｃｇ１を欠失させるために、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を使用した。ＩｇＨマウスＣｇ１の膜貫通部分および細胞質部分をコードするエキソンは、ヒト配列によって置換されなかった。これらは、マウスにおけるヒト化ＩｇＧ１の膜発現およびシグナル伝達を破壊する危険を最小限にするために、保持された。導入されたヒトＣｇ１遺伝子は、マウス生殖細胞系を介して伝達され、生じた変異体マウスは、κ軽鎖と（マウス定常領域の代わりに）ヒト定常領域とを発現するマウスと、交配させられた。両方の挿入についてホモ接合性であるマウスは、ヒト化κ鎖を保有するＩｇＧ１抗体を生成する。
【００２８】
標的化欠失のための部位特異的組換え方法において、２つの部位特異的組換え配列によって両方から隣接される核酸配列領域が、切除される；この切除された領域は、外因性配列（例えば、組換え体または組換え遺伝子を同定するための選択マーカー）で置換され得る。
【００２９】
本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞は、そのゲノム中に組み込まれた、１つ以上の選択マーカーを含み得る。
【００３０】
上記選択マーカーは、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のうちの１つ以上である。２つ以上の選択マーカーが、使用され得る。
【００３１】
従って、本発明はまた、内因性ＭＡＳＰ−２ペプチドを含まず、かつ選択マーカーをコードする１つ以上の遺伝子を含む、非ヒト哺乳動物または非ヒト哺乳動物細胞（好ましくは齧歯類細胞、より好ましくはマウス細胞、最も好ましくはマウス胚性幹細胞）を提供する。
【００３２】
本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物は、齧歯類、マウス、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなどであり得るが、好ましくは齧歯類であり、より好ましくはネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）であり、最も好ましくはマウス（ｍｏｕｓｅ）である。本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物細胞は、胚性幹細胞または卵母細胞であり、好ましくは齧歯類、マウス、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、またはネコなどの細胞であり、好ましくは齧歯類の細胞であり、より好ましくはネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）の細胞であり、最も好ましくはマウス（ｍｏｕｓｅ）の細胞である。マウスは、取り扱いおよび育種が容易にあるので、特に好ましい。
【００３３】
本発明は、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子が存在しないか、またはこの遺伝子が非機能性である程度になるまで部分的に存在しない、マウスを提供する。部分的に存在しないとは、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列が、機能的内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子産物をＭＡＳＰ−２遺伝子座にコードしない（すなわち、機能的内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子産物がその遺伝子座から発現され得ない）程度まで、欠失もしくは破壊されたことを、意味する。
【００３４】
本発明はさらに、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子が存在しないかまたは部分的に存在しない、非ヒト哺乳動物胚性幹（ＥＳ）細胞を提供する。
【００３５】
上記の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物（好ましくは齧歯類、より好ましくはマウス）は、１つ以上の機能的に活性なＭＡＳＰ−２遺伝子（好ましくは、１つ以上の機能的に活性なヒトＭＡＳＰ−２遺伝子）を発現可能な適合性の非ヒト哺乳動物と交配させられ得る。例えば、欠失変異体マウスが、１つ以上の機能的に活性なヒトＭＡＰＳ−２遺伝子を発現可能なマウスと交配させられ得る。この交配のヘテロ接合性子孫（Ｆ１）は、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子を発現可能ではなく、代わりに外来（好ましくはヒト）ＭＡＳＰ−２遺伝子のみを発現可能な非ヒト哺乳動物（好ましくはマウス）のヘテロ接合性子孫およびホモ接合性子孫（Ｆ２）を生成するように、同系交配させられ得る。
【００３６】
本発明は、本明細書中に記載されるような遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来するか、または本明細書中に記載されるような遺伝子改変された非ヒト細胞に由来する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を提供し、本発明は、本明細書中に記載されるような遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来する遺伝子改変された非ヒト細胞を提供する。
【００３７】
本発明は、遺伝子改変された非ヒト細胞を生成するための方法を提供する。この方法は、
非ヒト細胞を、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子の代わりに組込むための標的化構築物でトランスフェクトする工程（この標的化構築物は、標的化組換え配列と選択マーカーとを含む）；および
上記選択マーカーが存在する細胞を選択する工程；
を包含する。
【００３８】
上記の遺伝子改変された非ヒト細胞は、胚性幹細胞または卵母細胞であることが、好ましい。上記の遺伝子改変された非ヒト細胞は、齧歯類細胞（より好ましくはマウス細胞）であり得る。
【００３９】
適切な任意のクローニングベクターが、上記の標的化構築物を生成するために使用され得る。クローニングストラテジーは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載される。望ましくは、上記の標的化構築物は、１つ以上のマーカー遺伝子を保有し得る。選択マーカーが、公知であり、特に適切なものは、ポジティブ選択を可能にするものである。特に対象とされるのは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子（「ｎｅｏ」）（これは、Ｇ４１８に対する耐性を付与する）の使用である。また適切なのは、プロマイシン耐性遺伝子（「ｐｕｒｏ」）またはハイグロマイシン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子および／またはプロマイシン耐性遺伝子が、好ましい。
【００４０】
上記の標的化構築物において、標的遺伝子の上流および／または下流は、相同的ダブルクロスオーバーが生じたかどうかの同定（ネガティブ選択）を提供する遺伝子であり得る。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）が、ネガティブ選択マーカーとして使用され得る。なぜなら、チミジンキナーゼを生成する細胞は、アシクロビルまたはガンシクロビルによって死滅させられ得るからである。
【００４１】
一旦、標的化構築物が調製され、そして望ましくないあらゆる配列が除去された後には、上記構築物は、標的細胞（例えば、ＥＳ細胞または卵母細胞）中に導入され得る。標的細胞中にＤＮＡを導入するための任意の簡便な技術が、使用され得る。従来の遺伝子標的化（通常は２０ｋｂまでの構築物）のために、ＤＮＡは、最も頻繁には、エレクトロポレーションによって導入される（Ｚｏｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，２１５４〜６２，１９９５）。一方、二次改変（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ媒介性組込み）のためには、エレクトロポレーションは、より小さい構築物の組込みのために使用され得、他の方法（例えば、リポフェクションおよびＹＡＣ（酵母人工染色体）についての酵母スフェロプラスト／細胞融合、および染色体フラグメントもしくは哺乳動物人工染色体についてのリン酸カルシウム媒介性ＤＮＡ移入（これらは、数百ｋｂ〜Ｍｂ範囲の組込みを可能にする）が、使用され得る。従って、エレクトロポレーションは、小さいＤＮＡフラグメント（５０ｋｂまで）を標的細胞中に導入するために好ましい技術であり、列挙された他の方法は、より大きなＤＮＡ配列（＞５０ｋｂ）の導入のために適切でありかつおそらく有利である。
【００４２】
標的細胞の形質転換またはトランスフェクションの後、これらの細胞は、ポジティブマーカーおよび／またはネガティブマーカーによって選択され得る。上記のように、ポジティブマーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子および／またはプロマイシン耐性遺伝子）が、使用され得る。その後、望ましい表現型を有する細胞が、制限分析、電気泳動、サザンブロット分析、ＰＣＲなどによってさらに分析され得る。
【００４３】
ＰＣＲもまた、相同組換えの存在を検出するために使用され得る。標的化構築物内の配列に対して相補的であるＰＣＲプライマー、およびその構築物の外側かつ標的遺伝子座にある配列に対して相補的であるＰＣＲプライマーが、使用され得る。ＤＮＡ分子は、上記の両方のプライマーがその相補的配列に結合可能である場合にのみ、すなわち、相同組換えが生じた場合にのみ、ＰＣＲ反応において取得される。配列決定によって確認される予期されるサイズのフラグメントの実証は、相同組換えが生じたという結論を支持する。
【００４４】
ゲノム中にマーカー遺伝子が存在することは、組込みが生じたことを示すが、相同組込みが生じたかどうかを決定することが、必要である。これを達成するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、組込み位置を確立するためにサザンブロットハイブリダイゼーションによるＤＮＡ分析を使用する。インサートに対するプローブと、相同組込みが生じる隣接領域に対して遠位にある５’領域および３’領域にある配列に対するプローブとの両方を使用することによって、相同標的化が達成されたことが、示され得る。利点は、標的化ＤＮＡに隣接する外部プローブと、（例えば、選択マーカー遺伝子によって）新たに導入された制限部位に隣接する外部プローブとが、標的化された変化の同定のために使用され得ることである。
【００４５】
例えば上記の方法によって取得可能な、本明細書中に記載されるような胚性幹細胞が、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の生成のために使用され得る。
【００４６】
上記のプロセスは、胚性幹細胞におけるＭＡＳＰ−２遺伝子座を不活化するためにまず実施され得、その後、その細胞は、宿主の胚盤胞中に注入され得、キメラ動物へと発達させられ得る。適切な方法は、例えば、Ｈｏｇａｎら（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｆ．およびＬａｃｙ，Ｅ．（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に記載される。キメラ動物は、ヘテロ接合性宿主を取得するために交配させられる。その後、そのヘテロ接合性宿主の育種によって、ホモ接合性宿主が、取得され得る。
【００４７】
従って、本発明は、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法を提供し、その方法において、本明細書中に記載されるような胚性幹細胞が、宿主胚盤胞中に導入されてキメラ動物へと発達させられる。
【００４８】
これは、
（ａ）本明細書中に記載されるような非ヒト哺乳動物胚性幹細胞を、適合性の非ヒト哺乳動物胚盤胞中に導入すること；および
（ｂ）（ａ）において取得された胚盤胞を、適合性の非ヒト哺乳動物代理母（ｆｏｓｔｅｒ ｍｏｔｈｅｒ）中に移植してキメラ非ヒト哺乳動物を取得すること；そして
必要に応じて、選択マーカーについて、および／またはすべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列もしくは本質的にすべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列の欠失について、スクリーニングすること；
によって特徴付けられる方法によって、達成され得る。
【００４９】
これらの方法によって生成されるキメラ非ヒト哺乳動物は、ヘテロ接合性子孫を取得するために交配させられ得る。そのヘテロ接合性子孫は、ホモ接合性子孫を取得するために同系交配させられ得る。
【００５０】
本明細書中に記載される本発明の方法を使用して、それ自体が何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸配列は含まない、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物が、取得され得る。
【００５１】
本発明は、１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法を提供する。その方法は、
それ自体が何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸配列は含まない遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を、１つ以上の外因性遺伝子をコードしかつその外因性遺伝子を発現可能な適合性の非ヒト哺乳動物と交配させて、１つ以上の外因性遺伝子についてヘテロ接合性である子孫を取得すること；および
必要に応じて、そのヘテロ接合性子孫を同系交配させて、上記の１つ以上の外因性遺伝子についてホモ接合性の子孫を生成すること；
によって特徴付けられる。
【００５２】
外因性遺伝子とは、宿主の非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞に対して外来性（すなわち、非ネイティブ）である遺伝子である。
【００５３】
従って、本発明は、外来（好ましくはヒト）ＭＡＳＰ−２遺伝子を発現可能な非ヒト哺乳動物（好ましくは齧歯類、より好ましくはマウス）を生成するために使用され得、この生成は、機能的に活性な（内因性）ＭＡＳＰ−２遺伝子を発現不能な本明細書中に記載されるような遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を、１つ以上の機能的に活性な外来（好ましくはヒト）ＭＡＳＰ−２遺伝子を発現可能な適合性の非ヒト哺乳動物（好ましくは齧歯類、より好ましくはマウス）と交配させることによる。これによって、１つ以上の機能的に活性な望ましい形質の外因性（好ましくはヒト）遺伝子を有する選択された子孫（ヘテロ接合性またはホモ接合性）を生成するための種間遺伝子交換／遺伝子座交換が、その非ヒト哺乳動物の対応する遺伝子がサイレント化されているかまたは除去されているバックグラウンドにおいて可能になる。そのような非ヒト哺乳動物は、上記の外因性遺伝子に対する抗体の生成において有用であり得る。本発明は、そのような抗体の生成方法、およびそのような方法において生成された抗体を、さらに提供する。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはその部分に対して特異的に結合する、抗体産生哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、および霊長類（ヒトを包含する））由来の抗体およびその抗体フラグメントを包含する。例示的抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および組換え抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体、マウス−ヒト抗体、マウス−霊長類抗体、ヒトモノクローナル抗体、および抗イディオタイプ抗体が挙げられ、これらは、インタクトな分子であっても、そのフラグメントであってもよい。
【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「抗体フラグメント」とは、全長抗ＭＡＳＰ−２抗体に由来する部分または全長抗ＭＡＳＰ−２抗体に関連する部分を指し、一般的には、その抗原結合領域または可変領域を包含する。抗体フラグメントの例示的例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントとは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを包含し、これらのドメインは、一本のポリペプチド鎖中に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドは、そのＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、これによって、そのｓｃＦｖは、抗原結合のために望ましい構造を形成することが可能である。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「キメラ抗体」とは、非ヒト種（例えば、齧歯類）抗体に由来する可変ドメインおよび相補性決定領域を含む組換えタンパク質であり、一方、その抗体分子の残りは、ヒト抗体に由来する。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」とは、ヒト抗体フレームワーク中に移植された非ヒト免疫グロブリン由来の特定の相補性決定領域と適合する最小限の配列を含む、キメラ抗体である。ヒト化抗体は、代表的には、その抗体の相補性決定領域のみが非ヒト起源である、組換えタンパク質である。
【００５９】
ＭＡＳＰ−２に対するポリクローナル抗体は、当業者にとって周知である方法を使用して、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはその免疫原性部分で動物を免疫することによって、調製され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ」Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ編），１０５ｐを参照のこと。ＭＡＳＰ−２ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント（無機質ゲル（例えば、水酸化アルミニウムまたはフロイントアジュバント（完全もしくは不完全））、界面活性剤（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが挙げられる）の使用を介して、増加させられ得る。ポリクローナル抗体は、代表的には、動物（例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジ）において惹起される。あるいは、本発明において有用な抗ＭＡＳＰ−２抗体はまた、類人霊長類に由来し得る。ヒヒにおいて診断的に有用な抗体および治療的に有用な抗体を惹起するための一般的技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇらの国際特許出願公開番号９１／１１４６５およびＬｏｓｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０，１９９０において見出され得る。その後、免疫学的に活性な抗体を含有する血清が、当該分野で周知の標準的手順を使用して、そのような免疫された動物の血液から生成される。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ＭＡＳＰ−２抗体は、モノクローナル抗体であり得る。抗ＭＡＳＰ−２モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、１つのＭＡＳＰ−２エピトープに対する。本明細書中で使用される場合、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、この修飾語は、特定の何らかの方法によるその抗体の生成を必要とするものとは解釈されるべきではない。モノクローナル抗体は、培養中の連続的細胞株による抗体分子の生成を提供する任意の技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５によって記載されるハイブリドーマ方法）を使用して取得され得るか、またはそれらは、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって生成され得る。モノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８，１９９１およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７，１９９１において記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。そのような抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスが挙げられる）であり得る。
【００６１】
例えば、モノクローナル抗体は、適切な哺乳動物（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）に、ＭＡＳＰ−２ポリペプチドまたはその部分を含む組成物を注射することによって、取得され得る。所定の期間の後、脾細胞が、そのマウスから回収され、細胞培地中に懸濁される。その後、その脾細胞は、不死細胞株と融合されて、ハイブリドーマを形成する。形成されたハイブリドーマは、細胞培養にて増殖させられて、それがＭＡＳＰ−２に対するモノクローナル抗体を生成する能力についてスクリーニングされる。
【００６２】
ヒトモノクローナル抗体は、抗原性チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を生成するように操作されたトランスジェニックマウスの使用を介して、取得され得る。この技術において、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座のエレメントが、内因性免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子座の標的化破壊を含む胚性幹細胞に由来するマウス系統中に導入される。そのトランスジェニックマウスは、ヒト抗原（例えば、本明細書中に記載されるようなＭＡＳＰ−２抗原）に対して特異的なヒト抗体を合成し得る。そのマウスは、そのような動物に由来するＢ細胞を、適切な骨髄腫細胞株に、従来のＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ技術を使用して融合することによって、ヒトＭＡＳＰ−２抗体分泌ハイブリドーマを生成するために使用され得る。ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニックマウスが、（例えば、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ、およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎａｎｄａｌｅ，Ｎ．Ｊ．から）市販されている。トランスジェニックマウスからヒト抗体を取得するための方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３，１９９４；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６，１９９４；およびＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９，１９９４によって記載されている。
【００６３】
モノクローナル抗体は、種々の充分に確立された技術によって、ハイブリドーマ培養物から単離および精製され得る。そのような単離技術としては、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いるアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、２．７．１〜２．２７．１２頁、および２．９．１〜２．９．３頁；Ｂａｉｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０，ｐ．７９〜１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９２）を参照のこと）が挙げられる。
【００６４】
本発明の方法において有用なモノクローナル抗体としては、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体中の、対応する配列と同じであるかもしくは相同であり、それらの鎖の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体中の、対応する配列と同じであるかもしくは相同である、キメラ抗体；ならびにそのような抗体のフラグメントが挙げられる（米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１〜６８５５，１９８４）。本発明において有用なキメラ抗体の一形態は、ヒト化モノクローナル抗ＭＡＳＰ−２抗体である。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラ抗体であり、これは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖に由来する非ヒト（例えば、マウス）相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト可変ドメイン中に移入することによって、生成される。代表的には、その後、ヒト抗体の残基が、非ヒト対応物のフレームワーク領域中で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中でもドナー抗体中でも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるためになされる。一般的には、上記ヒト化抗体は、少なくとも１つ（代表的には２つ）の可変ドメインのうちの実質的にすべてを含み、その超可変ループのうちのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そのＦｖフレームワーク領域のうちのすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃ）の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２９，１９８８、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６，１９９２を参照のこと。
【００６５】
ヒト化モノクローナル抗体を生成するための技術はまた、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２，１９８６；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５，１９９２；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７，１９９２；Ｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４，１９９３；Ｓｕｄｈｉｒ編，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）；Ｋｅｌｌｅｙ「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｌｅｌａｎｄら編，ｐ３９９〜４３４（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９６）；ならびにＱｕｅｅｎら、米国特許第５，６９３，７６２号（１９９７）によって、記載されている。さらに、特定のマウス抗体領域に由来するヒト化抗体を合成する商業的実体（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡ）が、存在する。
【００６６】
本発明は、インタクトな免疫グロブリン分子にのみならず、周知のフラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる）にもまた、さらに拡張される。抗体分子のほんの小さな部分（パラトープ）のみが、そのエピトープに対するその抗体の結合に関与することは、当該分野で周知である（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹを参照のこと）。その抗体のｐＦｃ’領域およびＦｃ領域は、古典的補体経路のエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。そのｐＦｃ’領域が酵素的に切断されている抗体、またはそのｐＦｃ’領域を含まずに生成された抗体は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれ、インタクトな抗体の抗原結合部位を両方とも保持する。単離されたＦ（ａｂ’）２フラグメントは、その２つの抗原結合部位が原因で、二価モノクローナルフラグメントと呼ばれる。同様に、そのＦｃ領域が酵素的に切断されている抗体、またはそのＦｃ領域を含まずに生成された抗体は、Ｆａｂフラグメントと呼ばれ、これは、インタクトな抗体分子の抗原結合部位のうちの１つを保持する。
【００６７】
抗体フラグメントは、（例えば、従来の方法による抗体全体のペプシン消化またはパパイン消化による）タンパク質分解性加水分解によって、取得され得る。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成され得て、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓフラグメントを提供し得る。このフラグメントは、チオール還元剤を使用してさらに切断され得て、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価フラグメントを生成し得る。必要に応じて、その切断反応は、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基に対するブロック基を使用して、実施され得る。代替法として、ペプシンを使用する酵素的切断が、２つの一価Ｆａｂフラグメントと１つのＦｃフラグメントとを直接生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，米国特許第４，３３１，６４７号；Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，１９５９；Ｅｄｅｒｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９６７）；ならびにＣｏｌｉｇａｎ，２．８．１〜２．８．１０頁および２．１０〜２．１０．４頁によって、記載されている。
【００６８】
いくつかの実施形態において、上記Ｆｃ領域を欠いている抗体フラグメントの使用が、古典的補体経路の活性化（これは、Ｆｃが上記Ｆｃγレセプターへ結合する際に開始される）を回避するために好ましい。Ｆｃγレセプター相互作用を回避するＭＡｂが生成され得る方法がいくつか存在する。例えば、モノクローナル抗体の上記Ｆｃ領域は、タンパク質分解酵素（例えば、フィシン消化）による部分的消化を用いて化学的に切断され得る。それによって、例えば、抗原結合抗体フラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ）２フラグメントが生成され得る（Ｍａｒｉａｎｉ，Ｍら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：６９−７１，１９９１））。あるいは、上記ヒトγ４ ＩｇＧアイソタイプ（これは、Ｆｃγレセプターに結合しない）は、本明細書で記載されるヒト化抗体の構築の間に使用され得る。上記Ｆｃドメインを欠く、抗体、単鎖抗体および抗原結合ドメインはまた、本明細書中に記載される組換え技術を用いて操作され得る。
【００６９】
あるいは、上記重鎖Ｆｖ領域および軽鎖Ｆｖ領域が接続されているＭＡＳＰ−２に対して特異的な単一のペプチド鎖結合分子が作られ得る。上記Ｆｖフラグメントは、単鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）を形成するために、ペプチドリンカーによって接続され得る。これらの単鎖抗原結合タンパク質は、オリゴヌクレオチドによって接続されているＶＨドメインとＶＬドメインとをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。上記構造遺伝子は、発現ベクター中に挿入され、この発現ベクターは、その後、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入される。上記組換え宿主細胞は、リンカーペプチドで上記２つのＶドメインが架橋された単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖを生成するための方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら，「Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ」 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：９７，１９９１；Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３，１９８８；Ｌａｄｎｅｒら，米国特許第４，９４６，７７８号；およびＰａｃｋら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１，１９９３によって記載されている。
【００７０】
１つ以上の外因性遺伝子を発現し得る遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または遺伝的に改変された非ヒト細胞を生成する方法が提供され、この方法は、それ自体が何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸配列を含まない本明細書に記載される非ヒト哺乳動物細胞へ、１つ以上の外因性遺伝子を導入することを含む。上記非ヒト哺乳動物細胞が、胚性幹細胞または卵母細胞であることが好ましい。上記非ヒト哺乳動物細胞がＥＳ細胞である場合、１つ以上の外因性遺伝子がトランスフェクションによって導入されることが望ましい。上記非ヒト哺乳動物細胞が、卵母細胞（卵細胞）である場合、１つ以上の外因性遺伝子がＤＮＡマイクロインジェクションによって導入されることが好ましい。好ましくは、上記１つ以上の１つ以上の外因性遺伝子は、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞のゲノムに挿入され、最も好ましくは、上記１つ以上の外因性遺伝子が、非内因性の部位特異的組換え配列に挿入される。
【００７１】
本発明は、本明細書中に記載の方法によって取得され得る１つ以上の外因性遺伝子を発現し得る非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞を提供し、外因性ＭＡＳＰ−２（好ましくは、ヒトＭＡＳＰ−２）の生成における、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞の使用を提供する。
【００７２】
それ自体が内因性ＭＡｐ １９ポリペプチドをコードする核酸配列を含まないという点で特徴づけられる、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または遺伝子改変された非ヒト哺乳動物細胞もまた、本発明によって提供される。このような哺乳動物は、上記のＭＡＳＰ−２欠損性の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物と同じ目的でまたは類似の目的のために、かつ同じ様式でまたは類似の様式で、有用であり得る。従って、別段述べなければ、当業者は、ＭＡＳＰ−２欠損性哺乳動物に関する、ならびにこのような哺乳動物から得ることができる抗体および他の生成物に関する、ならびにこのような哺乳動物を伴う方法に関する上記の記述が、ＭＡｐ １９欠損性哺乳動物に等しく適用できることを理解する。
【００７３】
本発明は、レクチン補体経路応答を欠くという点で特徴づけられる、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または遺伝子改変された非ヒト哺乳動物細胞をさらに提供する。
【００７４】
本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物は、齧歯類、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなどであり得るが、好ましくは、齧歯類、より好ましくは、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）、最も好ましくは、マウス（ｍｏｕｓｅ）である。本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物細胞は、胚性幹細胞または卵母細胞であり得る；そして好ましくは、齧歯類細胞、マウス細胞（ｍｕｒｉｎｅ）、ヒツジ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、イヌ細胞またはネコ細胞などであり、好ましくは、齧歯類細胞であり、より好ましくは、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）細胞であり、最も好ましくは、マウス（ｍｏｕｓｅ）細胞である。マウス（ｍｏｕｓｅ）は、取り扱いおよび繁殖が容易であるので、特に好ましい。
【００７５】
本発明は、機能的なレクチン補体経路応答が全く存在しないマウス（ｍｏｕｓｅ）を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
（図面の詳細な説明）
図１、図２および図３は、マウス（ｍｏｕｓｅ）ＭＡＳＰ−２ノックアウトおよびマウス（ｍｏｕｓｅ）ＭＡｐ １９ノックアウトの標的化を示すマップを、および標的化において使用される構築物を示す。図４は、ヒトＭＡＳＰ−２遺伝子およびヒトＭＡｐ １９遺伝子を、ノックアウトマウス（ｍｏｕｓｅ）へ導入するために使用されるミニ遺伝子構築物を示す。マウス（ｍｏｕｓｅ）ＭＡＳＰ−２のｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１３８９３の下で入手可能である。
【００７７】
本発明者らは、遺伝子標的化技術および／またはトランスジーン技術のいずれかによって、５つの異なるマウス（ｍｏｕｓｅ）系統を生成した。これらの系統は、補体のレクチン経路のマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ２遺伝子生成物ＭＡＳＰ−２（すなわち、セリンプロテアーゼ（ＭＷ ７４０９５ Ｄａ））および／またはＭＡｐ１９（ｓＭＡＰともいわれる）（すなわち、レクチン経路開始複合体と関連する１９０７５Ｄａ ＭＷの選択的ＭＡＳＰ２遺伝子生成物）のいずれかについて選択的に充足性（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）であるように設計される。本発明者らは、マウスＭＡＳＰ−２遺伝子生成物が欠損した３つの系統を記載する：１つの系統は、セリンプロテアーゼＭＡＳＰ−２を欠損しているが、ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰが充足性であり（構築物が図１に示される）、１つの系統は、ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰが欠損しており（構築物が図２に示される）、そして１つの系統は、ＭＡＳＰ−２とＭＡｐ１９／ｓＭＡＰの両方が欠損している（構築物が図３に示される）。
【００７８】
欠損の確認を、ｍＲＮＡ転写実験の検出および／またはウェスタンブロッティング実験によって行った。核酸検出は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機器を使用する時間分離（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲによって行ったが、ウェスタンブロッティングによって発見を確認した。
【００７９】
さらに、ノックアウトマウス（ｍｏｕｓｅ）においてヒトＭＡＳＰ−２またはヒトＭＡｐ １９を発現するために、２つのヒトミニ遺伝子構築物を確立した（図４を参照のこと）。
【００８０】
ここでＭＡＳＰ−２について言及すると、図１の構築物は、遺伝子標的化ベクターｐＫＯ−ＮＴＫＶ １９０１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）において確立し、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＥＳ細胞株Ｅ１４．１ａ（遺伝子バックグラウンド ＳＶ１２９ Ｏｌａ）をトランスフェクトするために使用した。染色体ＤＮＡの中に構築物を組み込んだトランスフェクトされた細胞を、ネオマイシン耐性を介して選択し、組換え事象を、ｐＫＯ−ＮＴＫＶに含まれるＴＫ遺伝子によって媒介されるチミジンキナーゼ（ＴＫ）活性の喪失を介して選択した。トランスフェクション後に回収した６００個のＥＳ細胞クローンから、上記遺伝子標的化構築物の単一の組み込みおよび上記マウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ２遺伝子内の上記標的化事象を、上記標的化構築物中に含まれるネオマイシンカセットに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブと上記標的化構築物の外側に位置するマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ２遺伝子に対して特異的なプローブとを使用するサザンブロット分析によって確認した。本発明者らは、４種の異なる細胞クローンを同定した。これらクローンにおいて、選択的標的化および組換え事象が発生し、これらクローンを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＬｅｉｃｅｓｔｅｒのＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｕｎｉｔの中で、胚移植技術によって、キメラを作製するために使用した。キメラを、遺伝子バックグラウンドＣ５７／ＢＬ６に対して戻し交配し、彼らの生殖細胞系列において破壊した遺伝子が伝達されたトランスジェニックオスを作出した。このような「生殖細胞系列伝達」マウスをメス（遺伝子バックグラウンドＣ５７／ＢＬ６）と交配させることで、Ｆ１を生成すると、その子孫のうちの５０％が、破壊したＭＡＳＰ２遺伝子に関してヘテロ接合性を示した。これらのヘテロ接合性マウス（ｍｏｕｓｅ）を異種交配させると、ホモ接合性のＭＡＳＰ２欠損性子孫、ヘテロ接合性マウス（ｍｏｕｓｅ）および野生型マウス（ｍｏｕｓｅ）が、それぞれ１：２：１の比で作出された。
【００８１】
第１のＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）系統（以下、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳと称する）を、図１に記載される標的化構築物を使用して樹立した。この選択されたストラテジーは、セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを含め、ＭＡＳＰ−２のＣ末端をコードする３つのエキソン（エキソン１０、１１、および１２）を破壊するが、その破壊は、他のＭＡＳＰ２遺伝子生成物ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰをコードするエキソンからは非常に遠く離れている。
【００８２】
図１に記載される破壊構築物で作られた、得られたマウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳは、繁殖能がありかつ生存能があり、破壊された対立遺伝子に関してホモ接合性の場合、ＭＡＳＰ−２に関して標的化された欠損を含む。ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰ（すなわち、ＭＡＳＰ２遺伝子の選択的遺伝子生成物）は、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベル（ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによって決定される）の両方において存在する。これらのマウス（ｍｏｕｓｅ）は、他の２つのレクチン経路会合型セリンプロテアーゼ（すなわち、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３）を発現する。
【００８３】
図５に示されるように、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）の血漿は、レクチン経路特異的Ｃ４切断アッセイにおいて示される、マンナンコーティングプレート（図５Ａ）上およびザイモサンコーティングプレート（図５Ｂ）上での、レクチン経路媒介性補体活性化を完全に欠損している。これは、ＭＡＳＰ−１でもＭＡＳＰ−３でもなく、ＭＡＳＰ−２が、補体活性化のレクチン経路のエフェクター成分であることを明らかに実証している。ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３は、生理的条件下で、残りのレクチン経路活性を維持するために、ＭＡＳＰ−２機能的活性の喪失を補償できない。この結果および藤田禎三教授の研究チームの以前に記載された知見（ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３を欠損しているが、レクチン経路媒介性補体活性化における欠損はない遺伝子標的化マウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を作った）は、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−３が、補体系の活性化に（あるとしても）わずかにしか関与していないことを実証する。
【００８４】
ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）の血漿を分析することによって達成された別の基本的な知見は、図６に示される。ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）を、現時点での教科書的な知見に従って、補体活性化の機能的に活性な第３の経路（すなわち、ザイモサンのような活性化表面に対して他の２つの経路とは独立して、Ｃ３を切断する副経路）を形成するはずである補体因子Ｃ３、Ｂ因子、Ｄ因子、およびプロペルジンの存在について分析した。図６に示されるように、ＭＡＳＰ−２が欠損している血漿において、マンナンコーティングプレート上で（図６Ａ）およびザイモサンコーティングプレート上で（図６Ｂ）、Ｃ３活性化は、Ｃ３ｂ沈着によって示されるように、全く起こらないかまたはわずかしか起こらない。このことは、ＭＡＳＰ−２は、上記副経路を開始するために最初のＣ３ｂを与えることを要することを明らかに実証する。ＭＡＳＰ−２の非存在下では、最初のＣ３ｂは、レクチン経路によって提供されず、ザイモサン（副経路活性化の確立したアクチベーター表面）に関しても提供されず、Ｃ３の副経路媒介性切断は観察できない。高濃度のＭＡＳＰ−２欠損性血清において認められるわずかな切断活性は、使用される実験条件下で、残りの古典的経路活性から生じ得る。
【００８５】
図５〜図７において示されるデータを得ることにおいて使用されるＣ３切断アッセイおよびＣ４切断アッセイは、Ｌｙｎｃｈ，Ｎ．Ｊ．；Ｒｏｓｃｈｅｒ，Ｓ．；Ｈａｒｔｕｎｇ，Ｔ．，Ｍｏｒａｔｈ，Ｓ．；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｍ．；Ｍａｅｎｎｅｌ，Ｄ．Ｎ．；Ｋｕｒａｙａ，Ｍ．；Ｆｕｊｉｌａ，Ｔ．；Ｓｃｈｗａｅｂｌｅ ＷＪ． Ｌ−ｆｉｃｏｌｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ Ｂｉｎｄｓ ｔｏ Ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ Ａｃｉｄ，ａ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ ｏｆ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ Ｌｅｃｔｉｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：１１９８−１２０２（２００４）；ならびにＰｅｔｅｒｓｅｎ ＳＶ，Ｔｈｉｅｌ Ｓ，Ｊｅｎｓｅｎ Ｌ，Ｓｔｅｆｆｅｎｓｅｎ Ｒ，Ｊｅｎｓｅｎｉｕｓ ＪＣ． Ａｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５７：１０７−１１６（２００１）において記載されている。
【００８６】
ＭＡＳＰ−２の非存在が、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）におけるレクチン経路依存性Ｃ４活性化の喪失の直接の原因であったことを確認するために、組換えＭＡＳＰ−２タンパク質を血清サンプルに添加することの影響を、Ｃ４切断アッセイにおいて試験した。機能的に活性なマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ−２組換えタンパク質および触媒的に不活性なマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ−２Ａ（この不活性なＭＡＳＰ−２Ａにおいて、セリンプロテアーゼドメインにおける活性部位セリン残基が、アラニン残基で置換されている）組換えタンパク質を、Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ．１１（１）：４７−５０（２００５）に記載されるように生成した。４匹のＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）からプールした血清を、漸増するタンパク質濃度の組換えマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ−２または不活性な組換えマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ−２Ａのとともに予めインキュベートし、Ｃ４コンベルターゼ活性を、上記のようにアッセイした。図１２に示されるように、機能的に活性なマウス（ｍｕｒｉｎｅ）組換えＭＡＳＰ−２タンパク質（白三角として示される）を、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）から得られた血清に添加すると、タンパク質濃度依存性様式においてレクチン経路依存性Ｃ４活性化が回復したのに対して、触媒的に不活性なマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＭＡＳＰ−２Ａタンパク質（星として示す）は、Ｃ４活性化を回復させなかった。図１２に示される結果は、プールされた正常マウス（ｍｏｕｓｅ）血清（点線として示される）で観察されたＣ４活性化に対して正規化される。
【００８７】
図１３は、ＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）において古典的経路が機能していることを実証する。この実験において、野生型マウス（ｍｏｕｓｅ）およびＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）から得た未処理血清サンプルおよびＣ１ｑ除去血清サンプルを、免疫複合体（ＢＳＡを添加し、次いでウサギ抗ＢＳＡを添加することによってその場で作製した）でコーティングしたプレートに各々添加した。結合したＣ３ｂを、抗Ｃ３ｃ抗体で検出した。図１３に示されるように、このＣ３ｂ沈着は、野生型（Ｃ１ｑ除去した野生型血清は、白丸として示す）およびＭＡＳＰ２−／−ＣＳマウス（ｍｏｕｓｅ）（Ｃ１ｑ除去したＭＡＳＰ２−／−ＣＳ血清を、白三角として示す）の両方においてＣ１ｑ依存性であった。この野生型コントロール血清（×として示す）およびＭＡＳＰ２−／−ＣＳ血清（黒三角として示す）はともに、Ｃ３ｂ沈着によって示されるＣ３活性化を示す。
【００８８】
第２のＭＡＳＰ２遺伝子標的化マウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を、図２において記載される遺伝子破壊構築物を使用して樹立した。ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰを欠損するが、ＭＡＳＰ−２充足性のマウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を作出するために、エキソン５（このエキソンは、ＭＡＳＰ２遺伝子のＭＡｐ １９／ｓＭＡＰ特異的ｍＲＮＡ転写物の生成を担う）を、ｌｏｘＰ部位が両方から隣接するネオマイシンカセットによって置き換えた。この遺伝子標的化構築物を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｍｏｕｓｅ）系統に由来する胚性幹細胞株をトランスフェクトするために使用した。ネオマイシン耐性に対する選択の後、形質転換体を同定するために、このＣｒｅ／ｌｏｘＰ系を、上記構築物のｌｏｘＰ配列間にあるマーカー遺伝子を切り出すために使用する。これは、ＭＡＳＰ−２のエキソン５を欠きかつ残りのエキソンを破壊するマーカー遺伝子がないマウス（ｍｏｕｓｅ）を生じる。従って、このマウス（ｍｏｕｓｅ）は、ＭＡｐ １９について欠損性である（なぜなら、エキソン５がないからである）が、ＭＡＳＰ−２について充足性である（なぜなら、残りのエキソンは存在しており、その遺伝子は破壊されていないからである）ように設計される。しかし、本発明者らは、ウェスタンブロットによって決定されるように（データは示さず）、ＭＡＳＰ−２のタンパク質発現がＭＡｐ１９欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）において減少していることに注目している。破壊された対立遺伝子についてホモ接合性であるときに生成したこのＭＡｐ１９／ｓＭＡＰ欠損性マウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統は、繁殖能がありかつ生存能があり、以降、ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰ−／−ＴＦと称される。
【００８９】
図７は、ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰ−／−ＴＦマウス（ｍｏｕｓｅ）が、マンナンコーティングプレート上でのレクチン経路媒介性補体活性化を欠損していることを示す実験結果を示す。図５について使用されたものと同じアッセイを、この実験において使用した。
【００９０】
第３のＭＡＳＰ２遺伝子標的化マウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を、上記のＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）についてのものと同じ様式で、図３において記載される遺伝子破壊構築物を使用して樹立した。ＭＡｐ１９／ｓＭＡＰおよびＭＡＳＰ−２を欠損するマウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を作出するために、エキソン５（このエキソンは、ＭＡＳＰ２遺伝子のＭＡｐ１９／ｓＭＡＰ特異的ｍＲＮＡ転写物の生成を担う）を、ネオマイシンカセットで置き換えた。図２に言及して記載される構築物とは異なり、図３の構築物は、ｌｏｘＰ配列を含まない。従って、使用されるマーカー遺伝子は、切り出すことができない。よって、得られるマウス（ｍｏｕｓｅ）系統は、ＭＡＳＰ−２のエキソン５を欠くが、残りのＭＡＳＰ−２エキソンは、マーカー遺伝子の存在によって破壊される。従って、得られたマウス（ｍｏｕｓｅ）は、ＭＡｐ １９およびＭＡＳＰ−２の両方を欠損している。この構築物を用いて作出した遺伝子標的化マウス（ｍｕｒｉｎｅ）系統を、以降、ＭＡＳＰ−２／ＭＡｐ１９ −／−と称する。
【００９１】
欠損型のマウスＭＡＳＰ−２および／または欠損型のマウスＭＡｐ１９のいずれかを、ヒトＭＡＳＰ−２またはヒトＭＡｐ１９のいずれかで置き換えるために、２つのミニ遺伝子構築物を、図４に記載されるように確立した。図４Ａは、ヒトＭＡＳＡＰ−２遺伝子のプロモーター領域を用いて、ヒトＭＡＳＰ−２をコードするミニ遺伝子構築物を記載する。この構築物は、最初の３つのエキソン（エキソン１〜エキソン３）の後に、その後の８つのエキソンのコード配列を表すｃＤＮＡ配列が続いており、それによって、ＭＡＳＰ−２セリンプロテアーゼの全長をコードしている。遺伝子組換えにより発現されるヒトＭＡＳＰ−２によって欠損型マウスＭＡＳＰ−２遺伝子を置き換えるために、このミニ遺伝子構築物（ミニｈＭＡＳＰ−２と呼ぶ）を、ＭＡＳＰ−２−／−ＣＳの受精卵に注入した。ＭＡＳＰ−２ミニ遺伝子構築物の配列（配列番号１）を、図１０に示す。
【００９２】
図４Ｂは、ヒトＭＡＳＰ−２遺伝子のプロモーター領域を使用する、ヒトＭＡｐ１９／ｓＭＡＰをコードするミニ遺伝子構築物を記載する。この構築物は、最初の３つのエキソン（エキソン１〜エキソン３）の後に、その後の２つのエキソンのコード配列を表すｃＤＮＡ配列が続いており、それによって、ＭＡｐ１９の全長をコードしている。遺伝子組換えにより発現されるヒトＭＡｐ１９によって欠損型マウスＭＡｐ１９遺伝子を置き換えるために、このミニ遺伝子構築物（ミニｈＭＡｐ１９と呼ぶ）を、ＭＡＳＰ−２−／−ＣＳの受精卵に注入した。ＭＡｐ１９ミニ遺伝子構築物の配列（配列番号２）を、図１１に示す。
【００９３】
図１０および図１１の両方に示される配列の最初の部分は、ヒトＭＡＳＰ−２のプロモーターおよび最初の３つのエキソンを表し、そして、これは、両方の構築物において同一である。各配列の第２の部分は、後に続く８つのエキソン（図１０）または後に続く２つのエキソン（図１１）のいずれかのｃＤＮＡコード配列を表す。関連のペプチド配列もまた、図１１に示されるが、図１０のコード部分は、大文字で示される。
【００９４】
ＭＡＳＰ−２阻害因子についてスクリーニングするためのモデルとして使用するための、ヒトＭＡＳＰ ２を発現するＭＡＳＰ ２−／−ノックアウトマウスは、以下のようにして作製し得る。上記のＭＡＳＰ ２−／−マウスと、上記のヒトＭＡＳＰ ２トランスジーン構築物を発現するＭＡＳＰ ２−／−マウス（ヒトＭＡＳＰ ２のノックイン）とを交配させ、そして、マウスＭＡＳＰ−２−／−、マウスＭＡｐ１９＋、ヒトＭＡＳＰ−２＋である子孫を使用して、ヒトＭＡＳＰ−２阻害因子を同定する。
【００９５】
このような動物モデルは、ヒト抗ＭＡＳＰ−２抗体、ＭＡＳＰ−２阻害性ペプチドおよびＭＡＳＰ−２阻害性非ペプチド、ならびに、ＭＡＳＰ−２阻害因子を含有する組成物のような、ＭＡＳＰ−２阻害因子の同定および効力についての、試験物質として使用され得る。例えば、動物モデルは、ＭＡＳＰ−２依存性の補体活性化を誘発することが公知の化合物または因子に曝露され、そして、ＭＡＳＰ−２阻害因子が、この曝露された動物における疾患症状の減少を導くのに十分な時間および濃度で、この動物モデルに投与される。
【００９６】
さらに、マウスＭＡＳＰ−２−／−、マウスＭＡｐ１９＋、ヒトＭＡＳＰ−２＋のマウスを用いて、ＭＡＳＰ−２関連疾患に関与する１以上の細胞型を含有する細胞株を作製し得、この細胞株は、その障害についての細胞培養モデルとして使用され得る。トランスジェニック動物からの持続的な細胞株の作製は、当該分野で周知である。例えば、Ｓｍａｌｌら，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５：６４２−４８（１９８５）を参照のこと。
【００９７】
レクチン依存性のＭＡＳＰ−２補体活性化系が、腹部大動脈瘤の修復後の再灌流期に活性化されることを示す実験結果を、図８に示す。これは、虚血性の再灌流傷害を有する患者における、ＭＢＬレベルの変化を示すグラフである。腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）修復を受けた患者は、虚血性の再灌流傷害に供され、この虚血性の再灌流傷害は、大体において、補体の活性化により媒介される。本発明者らは、ＡＡＡ修復を受けた患者における虚血−再灌流傷害において、補体のレクチン経路の役割を調べた。
【００９８】
選択的な腎臓下ＡＡＡ修復を受けた患者は、手順の間の４つの規定された時点（時点１：麻酔の導入期、時点２：大動脈のクランプの直前、時点３：大動脈のクランプを取り外す直前、時点４：再灌流の間）において、（動脈経路を介して）その橈骨動脈から、全身性の血液サンプルを採取した。大きな開腹手術を受けた患者をコントロールとして用い、そして、導入期と、手順の開始から２時間後に血液サンプルを採取した。ＥＬＩＳＡ技術を用いて、患者の血漿を、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）のレベルについてアッセイした。ＭＢＬは、ＭＢＬ会合型セリンプロテアーゼＭＡＳＰ−２の活性化を通じて、レクチン経路の活性化を開始する、血漿パターン認識分子である。本発明者らは、血漿ＭＢＬの消費を、再灌流中に生じるレクチン経路活性化についてのパラメータとして使用した。
【００９９】
結果は図８に示される。ＡＡＡ修復を受けている２３名の患者および８名のコントロール患者を採用した。大きな腹部手術を受けているコントロール群から取得した血漿サンプルにおいてごく少量のＭＢＬの消費が観察されたが、ＡＡＡ患者は、血漿ＭＢＬレベルの有意な減少を示す（平均して約４１％）。
【０１００】
示されるデータは、補体系のレクチン経路がＡＡＡ修復後の再灌流段階において活性化されるという強力な指標を提供する。これは、虚血−再灌流傷害に対して二次的なものであるようである。なぜなら、大きな虚血−再灌流傷害を伴わずに大きな腹部手術を受けている患者のコントロール血清は、ＭＢＬ血漿レベルのわずかな減少を示すのみであるからである。再灌流傷害における補体活性化の十分に確立された寄与の点から見ると、本発明者らは、虚血性内皮細胞におけるレクチン経路の活性化は再灌流傷害の病理において重要な因子であり、そしてレクチン経路活性の特異的な一過性の遮断は、一過性の虚血性傷害を伴う手術における疾患の結果（すなわち、心筋梗塞、腸梗塞、熱傷、移植および脳卒中）に対して有意な治療的インパクトを有すると結論付ける。これらの結果はまた、レクチン経路を欠く生物がこの経路の研究のための、または虚血性傷害に対する処置の開発のための、モデル生物として非常に有用であることを確認する。
【０１０１】
最後に、図９は、本明細書に記載される実験から得られた情報に基づく関連するレクチン経路を要約するフローチャートである。本発明者らは、ＭＡＳＰ２が副補体経路活性化を惹起するために必要であることを同定した。ＭＡＳＰ ２ −／−ノックアウトマウスモデルの使用を通して、本発明者らは、Ｃ３ｂ沈着を阻害することが可能であることを示した。これは、古典的経路を完全なままにしながら、レクチン依存性のＭＡＳＰ−２経路を介する副補体経路活性化における開始段階であり、したがって、レクチン依存性のＭＡＳＰ ２活性化を、古典的経路の関与の非存在下での副補体活性化のための必要条件として確立する。したがって、本発明は、免疫系の古典的（Ｃ１ｑ依存性の）経路成分を完全なままにしながら、レクチン媒介性の副補体経路活性化に関連する細胞傷害を阻害するための治療標的としてのＭＡＳＰ−２の使用を示唆する。
【０１０２】
さらに、ここで、レクチン経路を介するＭＡＳＰ−２媒介性補体活性化は、古典的経路の関与の非存在下での副活性化経路の惹起のための必要条件として確立されたので、本発明者らは、この知見をさらに、ＭＡｐ１９がＭＳＡＰ−２タンパク質発現の調節および補体のレクチン経路活性化ルートにおいて生物学的役割を有し得ると拡張した。ＭＡｐ１９の欠損（すなわち、Ｍａｐ１９ −／−）についての遺伝子標的化マウスモデルの使用を通して、本発明者らは、古典的経路を完全なままにしながらレクチン経路活性化とＭＳＡＰ−２依存性のレクチン経路を介するＣ４沈着とを阻害し得ることを示した。したがって、本発明は、免疫系の古典的（Ｃ１ｑ依存性の）経路成分を完全なままにしながら、レクチン媒介性の副補体経路活性化に関連する細胞傷害を阻害するための治療標的としてのＭＡｐ１９の使用を示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に従って、ＭＡＳＰ−２ノックアウトのために使用される構築物と一緒に、ノックアウト実験のためにマウスＭＡＳＰ−２を標的化することを示すマップを示す。
【図２】図２は、ＭＡｐ １９欠損性／ＭＡＳＰ−２充足（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）哺乳動物の生成において有用な、本発明の一実施形態に従って、ノックアウト実験のために（マウスＭＡＳＰ−２遺伝子のエキソン５として）ＭＡｐ １９を標的化するために有用なｌｏｘＰ構築物を示す。
【図３】図３は、ＭＡｐ １９とＭＡＳＰ−２とを欠損する哺乳動物の生成において有用なノックアウト実験のために、ＭＡｐ １９を標的化するために有用な代替構築物を示す。
【図４】図４は、トランスジェニック動物の生成のための、（Ａ）ヒトＭＡＳＰ−２ミニ遺伝子構築物および（Ｂ）ヒトＭＡｐ １９ミニ遺伝子構築物を示す。
【図５】図５は、ＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）がレクチン経路媒介性Ｃ４活性化を欠くことを示す実験結果を示す。
【図６】図６は、ＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）がレクチン経路媒介性Ｃ３活性化を欠くことを示す実験結果を示す。
【図７】図７は、ＭＡｐ１９欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）がレクチン経路媒介性Ｃ４活性化を欠くことを示す実験結果を示す。
【図８】図８は、虚血性再灌流傷害を有する患者におけるＭＢＬレベルの変化を示すグラフである。
【図９】図９は、図５、図６および図７に記載されるＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）およびＭＡｐ−１９欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）での実験から得られた結果をまとめるフローチャートである。
【図１０−１】図１０は、図４ＡのＭＡＳＰ−２ミニ遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１０−２】図１０は、図４ＡのＭＡＳＰ−２ミニ遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１１−１】図１１は、図４ＢのＭＡｐ １９ミニ遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図１１−２】図１１は、図４ＢのＭＡｐ １９ミニ遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図１２】図１２は、組換えＭＡＳＰ−２タンパク質が、ＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）においてレクチン経路媒介性Ｃ４活性化を再構成することを示す実験結果を示す。
【図１３】図１３は、古典的経路が、ＭＡＳＰ−２欠損性マウス（ｍｏｕｓｅ）において機能することを示す実験結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、何らかのＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項３】
請求項１〜２のうちのいずれかに記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、すべてのＭＡＳＰ−２遺伝子配列がゲノムに存在しないかまたは部分的に存在しない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、本質的にすべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列の標的化欠失によって取得可能であるかまたは取得される、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、１つ以上の選択マーカーがゲノム中に存在する、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、前記選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、およびハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される１つ以上の選択マーカーである、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項７】
マウスである、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
マウス細胞である、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項９】
胚性幹細胞である、請求項１〜６または請求項８のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項１０】
請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
請求項１〜６または請求項８または９のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞に由来する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来する、遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項１３】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子のエキソン１０、エキソン１１、およびエキソン１２がゲノムから欠失されている、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項１４】
遺伝子改変された非ヒト細胞を生成するための方法であって、該方法は、
非ヒト細胞を、ＭＡＳＰ−２遺伝子の上流またはＭＡＳＰ−２遺伝子内に組込むための標的化構築物でトランスフェクトする工程であって、該標的化構築物は、標的化組換え配列と選択マーカーとを含む、工程；
該選択マーカーが存在する細胞を選択する工程；および
該細胞を、該組換え配列の組込みについてスクリーニングする工程；
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト細胞はマウス細胞である、方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト細胞は胚性幹細胞である、方法。
【請求項１７】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の生成のための、請求項９に記載の胚性幹細胞または請求項１４〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法によって取得可能な細胞の使用。
【請求項１８】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法であって、請求項９に記載の胚性幹細胞または請求項１６に記載の方法によって取得可能な胚性幹細胞が、宿主胚盤胞中に導入されてキメラ動物へと発達させられる、方法。
【請求項１９】
１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法であって、該方法は、
何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない請求項１〜７または請求項１０または１１に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を、１つ以上の外因性遺伝子をコードしかつ該１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な適合性非ヒト哺乳動物と交配させて、該１つ以上の外因性遺伝子についてヘテロ接合性の子孫を取得する工程；および
必要に応じて、該ヘテロ接合性の子孫を同系交配させて、該１つ以上の外因性遺伝子についてホモ接合性の子孫を生成する工程；
によって特徴付けられる、方法。
【請求項２０】
１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞を生成するための方法であって、該方法は、
１つ以上の外因性遺伝子を、何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない請求項１〜６または請求項８、９または１１に記載の非ヒト哺乳動物細胞中に導入する工程；
によって特徴付けられる、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記非ヒト哺乳動物細胞は胚性幹細胞である、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子はトランスフェクションによって導入される、方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法であって、前記非ヒト哺乳動物細胞は卵母細胞（卵細胞）である、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子はＤＮＡマイクロインジェクションによって導入される、方法。
【請求項２５】
請求項２０〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子は前記非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞のゲノム中に挿入される、方法。
【請求項２６】
請求項１９〜２５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト哺乳動物はマウスである、方法。
【請求項２７】
請求項１９〜２６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記外因性遺伝子はＭＡＳＰ−２遺伝子である、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記ＭＡＳＰ−２遺伝子はヒトＭＡＳＰ−２遺伝子である、方法。
【請求項２９】
請求項１９〜２８のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記外因性遺伝子はヒト遺伝子である、方法。
【請求項３０】
請求項１４〜２９のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子のエキソン１０、エキソン１１、およびエキソン１２が欠失される、方法。
【請求項３１】
請求項１９〜２９のうちのいずれか１項に記載の方法によって取得可能な、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項３２】
抗体の生成における、請求項３１に記載の非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞の使用。
【請求項３３】
請求項３２に記載の使用であって、前記抗体は前記外因性遺伝子により生成されるタンパク質に対する、使用。
【請求項３４】
抗体の生成方法であって、
請求項３１に記載の非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞の使用；
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３２〜３４のうちのいずれか１項に記載の方法または使用であって、前記非ヒト哺乳動物は齧歯類である、方法または使用。
【請求項３６】
請求項３２〜３５のうちのいずれか１項に記載の方法または使用であって、前記非ヒト哺乳動物はマウスである、方法または使用。
【請求項３７】
請求項３４〜３６に記載の方法によって取得される、抗体。
【請求項３８】
医薬としての使用のための、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、内因性ＭＡｐ１９ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４０】
請求項３９に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、何らかのＭＡｐ１９ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４１】
請求項３９または請求項４０に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、すべてのＭＡｐ１９遺伝子配列がゲノムに存在しないかまたは部分的に存在しない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４２】
請求項３９〜４１のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、本質的にすべての内因性ＭＡｐ１９遺伝子配列の標的化欠失によって取得可能であるかまたは取得される、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４３】
請求項３９〜４２のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、１つ以上の選択マーカーがゲノム中に存在する、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４４】
請求項４３に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、前記選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、およびハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される１つ以上の選択マーカーである、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４５】
マウスである、請求項３９〜４４のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項４６】
マウス細胞である、請求項３９〜４４のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項４７】
胚性幹細胞である、請求項３９〜４４または請求項４６のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項４８】
請求項３９〜４５のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項４９】
請求項３９〜４４または請求項４６または４７のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞に由来する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項５０】
請求項３９〜４５のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来する、遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項５１】
請求項３９〜５０のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子のエキソン５が欠失されている、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項５２】
遺伝子改変された非ヒト細胞を生成するための方法であって、該方法は、
非ヒト細胞を、ＭＡｐ１９遺伝子の上流またはＭＡｐ１９遺伝子内に組込むための標的化構築物でトランスフェクトする工程であって、該標的化構築物は、標的化組換え配列と選択マーカーとを含む、工程；
該選択マーカーが存在する細胞を選択する工程；および
該細胞を、該組換え配列の組込みについてスクリーニングする工程；
を包含する、方法。
【請求項５３】
請求項５３に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト細胞はマウス細胞である、方法。
【請求項５４】
請求項５２または５３に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト細胞は胚性幹細胞である、方法。
【請求項５５】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の生成のための、請求項４７に記載の胚性幹細胞または請求項５２〜５４のうちのいずれか１項に記載の方法によって取得可能な細胞の使用。
【請求項５６】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法であって、請求項４７に記載の胚性幹細胞または請求項５４に記載の方法によって取得可能な胚性幹細胞が、宿主胚盤胞中に導入されてキメラ動物へと発達させられる、方法。
【請求項５７】
１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法であって、該方法は、
何らかの内因性ＭＡｐ１９ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない請求項３９〜４５または請求項４８または４９に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を、１つ以上の外因性遺伝子をコードしかつ該１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な適合性非ヒト哺乳動物と交配させて、該１つ以上の外因性遺伝子についてヘテロ接合性の子孫を取得する工程；および
必要に応じて、該ヘテロ接合性の子孫を同系交配させて、該１つ以上の外因性遺伝子についてホモ接合性の子孫を生成する工程；
によって特徴付けられる、方法。
【請求項５８】
１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞を生成するための方法であって、該方法は、
１つ以上の外因性遺伝子を、何らかの内因性ＭＡｐ１９ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない請求項３９〜４４または請求項４６、４７、または４９に記載の非ヒト哺乳動物細胞中に導入する工程；
によって特徴付けられる、方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、前記非ヒト哺乳動物細胞は胚性幹細胞である、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子はトランスフェクションによって導入される、方法。
【請求項６１】
請求項５８に記載の方法であって、前記非ヒト哺乳動物細胞は卵母細胞（卵細胞）である、方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子はＤＮＡマイクロインジェクションによって導入される、方法。
【請求項６３】
請求項５８〜６２のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子は前記非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞のゲノム中に挿入される、方法。
【請求項６４】
請求項５７〜６３のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト哺乳動物はマウスである、方法。
【請求項６５】
請求項５７〜６４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記外因性遺伝子はＭＡｐ１９遺伝子である、方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載の方法であって、前記ＭＡｐ１９遺伝子はヒトＭＡｐ１９遺伝子である、方法。
【請求項６７】
請求項５７〜６６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記外因性遺伝子はヒト遺伝子である、方法。
【請求項６８】
請求項５２〜６７のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子のエキソン５が欠失される、方法。
【請求項６９】
請求項５７〜６８のうちのいずれか１項に記載の方法によって取得可能な、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項７０】
抗体の生成における、請求項６９に記載の非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞の使用。
【請求項７１】
請求項７０に記載の使用であって、前記抗体は前記外因性遺伝子により生成されるタンパク質に対する、使用。
【請求項７２】
抗体の生成方法であって、
請求項６９に記載の非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞の使用；
を包含する、方法。
【請求項７３】
請求項７０〜７２のうちのいずれか１項に記載の方法または使用であって、前記非ヒト哺乳動物は齧歯類である、方法または使用。
【請求項７４】
請求項７０〜７３のうちのいずれか１項に記載の方法または使用であって、前記非ヒト哺乳動物はマウスである、方法または使用。
【請求項７５】
請求項７２〜７４に記載の方法によって取得される、抗体。
【請求項７６】
医薬としての使用のための、請求項７５に記載の抗体。
【請求項７７】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、レクチン補体経路応答を欠く、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項７８】
請求項３９〜５１のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸配列もまた含まない、非ヒト哺乳動物細胞または非ヒト細胞。
【請求項７９】
請求項３９〜５１のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸配列もまた含む、非ヒト哺乳動物細胞または非ヒト細胞。
【請求項１】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、何らかのＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項３】
請求項１〜２のうちのいずれかに記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、すべてのＭＡＳＰ−２遺伝子配列がゲノムに存在しないかまたは部分的に存在しない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、本質的にすべての内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子配列の標的化欠失によって取得可能であるかまたは取得される、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、１つ以上の選択マーカーがゲノム中に存在する、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、前記選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、およびハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される１つ以上の選択マーカーである、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項７】
マウスである、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
マウス細胞である、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項９】
胚性幹細胞である、請求項１〜６または請求項８のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項１０】
請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
請求項１〜６または請求項８または９のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞に由来する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来する、遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項１３】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子のエキソン１０、エキソン１１、およびエキソン１２がゲノムから欠失されている、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項１４】
遺伝子改変された非ヒト細胞を生成するための方法であって、該方法は、
非ヒト細胞を、ＭＡＳＰ−２遺伝子の上流またはＭＡＳＰ−２遺伝子内に組込むための標的化構築物でトランスフェクトする工程であって、該標的化構築物は、標的化組換え配列と選択マーカーとを含む、工程；
該選択マーカーが存在する細胞を選択する工程；および
該細胞を、該組換え配列の組込みについてスクリーニングする工程；
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト細胞はマウス細胞である、方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト細胞は胚性幹細胞である、方法。
【請求項１７】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の生成のための、請求項９に記載の胚性幹細胞または請求項１４〜１６のうちのいずれか１項に記載の方法によって取得可能な細胞の使用。
【請求項１８】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法であって、請求項９に記載の胚性幹細胞または請求項１６に記載の方法によって取得可能な胚性幹細胞が、宿主胚盤胞中に導入されてキメラ動物へと発達させられる、方法。
【請求項１９】
１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法であって、該方法は、
何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない請求項１〜７または請求項１０または１１に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を、１つ以上の外因性遺伝子をコードしかつ該１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な適合性非ヒト哺乳動物と交配させて、該１つ以上の外因性遺伝子についてヘテロ接合性の子孫を取得する工程；および
必要に応じて、該ヘテロ接合性の子孫を同系交配させて、該１つ以上の外因性遺伝子についてホモ接合性の子孫を生成する工程；
によって特徴付けられる、方法。
【請求項２０】
１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞を生成するための方法であって、該方法は、
１つ以上の外因性遺伝子を、何らかの内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない請求項１〜６または請求項８、９または１１に記載の非ヒト哺乳動物細胞中に導入する工程；
によって特徴付けられる、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記非ヒト哺乳動物細胞は胚性幹細胞である、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子はトランスフェクションによって導入される、方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法であって、前記非ヒト哺乳動物細胞は卵母細胞（卵細胞）である、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子はＤＮＡマイクロインジェクションによって導入される、方法。
【請求項２５】
請求項２０〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子は前記非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞のゲノム中に挿入される、方法。
【請求項２６】
請求項１９〜２５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト哺乳動物はマウスである、方法。
【請求項２７】
請求項１９〜２６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記外因性遺伝子はＭＡＳＰ−２遺伝子である、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記ＭＡＳＰ−２遺伝子はヒトＭＡＳＰ−２遺伝子である、方法。
【請求項２９】
請求項１９〜２８のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記外因性遺伝子はヒト遺伝子である、方法。
【請求項３０】
請求項１４〜２９のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子のエキソン１０、エキソン１１、およびエキソン１２が欠失される、方法。
【請求項３１】
請求項１９〜２９のうちのいずれか１項に記載の方法によって取得可能な、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項３２】
抗体の生成における、請求項３１に記載の非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞の使用。
【請求項３３】
請求項３２に記載の使用であって、前記抗体は前記外因性遺伝子により生成されるタンパク質に対する、使用。
【請求項３４】
抗体の生成方法であって、
請求項３１に記載の非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞の使用；
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３２〜３４のうちのいずれか１項に記載の方法または使用であって、前記非ヒト哺乳動物は齧歯類である、方法または使用。
【請求項３６】
請求項３２〜３５のうちのいずれか１項に記載の方法または使用であって、前記非ヒト哺乳動物はマウスである、方法または使用。
【請求項３７】
請求項３４〜３６に記載の方法によって取得される、抗体。
【請求項３８】
医薬としての使用のための、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、内因性ＭＡｐ１９ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４０】
請求項３９に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、何らかのＭＡｐ１９ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４１】
請求項３９または請求項４０に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、すべてのＭＡｐ１９遺伝子配列がゲノムに存在しないかまたは部分的に存在しない、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４２】
請求項３９〜４１のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、本質的にすべての内因性ＭＡｐ１９遺伝子配列の標的化欠失によって取得可能であるかまたは取得される、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４３】
請求項３９〜４２のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、１つ以上の選択マーカーがゲノム中に存在する、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４４】
請求項４３に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、前記選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、およびハイグロマイシン耐性遺伝子からなる群より選択される１つ以上の選択マーカーである、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項４５】
マウスである、請求項３９〜４４のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項４６】
マウス細胞である、請求項３９〜４４のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項４７】
胚性幹細胞である、請求項３９〜４４または請求項４６のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項４８】
請求項３９〜４５のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項４９】
請求項３９〜４４または請求項４６または４７のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト細胞に由来する、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物。
【請求項５０】
請求項３９〜４５のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に由来する、遺伝子改変された非ヒト細胞。
【請求項５１】
請求項３９〜５０のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子のエキソン５が欠失されている、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項５２】
遺伝子改変された非ヒト細胞を生成するための方法であって、該方法は、
非ヒト細胞を、ＭＡｐ１９遺伝子の上流またはＭＡｐ１９遺伝子内に組込むための標的化構築物でトランスフェクトする工程であって、該標的化構築物は、標的化組換え配列と選択マーカーとを含む、工程；
該選択マーカーが存在する細胞を選択する工程；および
該細胞を、該組換え配列の組込みについてスクリーニングする工程；
を包含する、方法。
【請求項５３】
請求項５３に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト細胞はマウス細胞である、方法。
【請求項５４】
請求項５２または５３に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト細胞は胚性幹細胞である、方法。
【請求項５５】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の生成のための、請求項４７に記載の胚性幹細胞または請求項５２〜５４のうちのいずれか１項に記載の方法によって取得可能な細胞の使用。
【請求項５６】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法であって、請求項４７に記載の胚性幹細胞または請求項５４に記載の方法によって取得可能な胚性幹細胞が、宿主胚盤胞中に導入されてキメラ動物へと発達させられる、方法。
【請求項５７】
１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を生成するための方法であって、該方法は、
何らかの内因性ＭＡｐ１９ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない請求項３９〜４５または請求項４８または４９に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を、１つ以上の外因性遺伝子をコードしかつ該１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な適合性非ヒト哺乳動物と交配させて、該１つ以上の外因性遺伝子についてヘテロ接合性の子孫を取得する工程；および
必要に応じて、該ヘテロ接合性の子孫を同系交配させて、該１つ以上の外因性遺伝子についてホモ接合性の子孫を生成する工程；
によって特徴付けられる、方法。
【請求項５８】
１つ以上の外因性遺伝子を発現可能な遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞を生成するための方法であって、該方法は、
１つ以上の外因性遺伝子を、何らかの内因性ＭＡｐ１９ポリペプチドをそれ自体がコードする核酸配列を含まない請求項３９〜４４または請求項４６、４７、または４９に記載の非ヒト哺乳動物細胞中に導入する工程；
によって特徴付けられる、方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、前記非ヒト哺乳動物細胞は胚性幹細胞である、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子はトランスフェクションによって導入される、方法。
【請求項６１】
請求項５８に記載の方法であって、前記非ヒト哺乳動物細胞は卵母細胞（卵細胞）である、方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子はＤＮＡマイクロインジェクションによって導入される、方法。
【請求項６３】
請求項５８〜６２のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記１つ以上の外因性遺伝子は前記非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞のゲノム中に挿入される、方法。
【請求項６４】
請求項５７〜６３のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記遺伝子改変された非ヒト哺乳動物はマウスである、方法。
【請求項６５】
請求項５７〜６４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記外因性遺伝子はＭＡｐ１９遺伝子である、方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載の方法であって、前記ＭＡｐ１９遺伝子はヒトＭＡｐ１９遺伝子である、方法。
【請求項６７】
請求項５７〜６６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記外因性遺伝子はヒト遺伝子である、方法。
【請求項６８】
請求項５２〜６７のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記内因性ＭＡＳＰ−２遺伝子のエキソン５が欠失される、方法。
【請求項６９】
請求項５７〜６８のうちのいずれか１項に記載の方法によって取得可能な、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項７０】
抗体の生成における、請求項６９に記載の非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞の使用。
【請求項７１】
請求項７０に記載の使用であって、前記抗体は前記外因性遺伝子により生成されるタンパク質に対する、使用。
【請求項７２】
抗体の生成方法であって、
請求項６９に記載の非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞の使用；
を包含する、方法。
【請求項７３】
請求項７０〜７２のうちのいずれか１項に記載の方法または使用であって、前記非ヒト哺乳動物は齧歯類である、方法または使用。
【請求項７４】
請求項７０〜７３のうちのいずれか１項に記載の方法または使用であって、前記非ヒト哺乳動物はマウスである、方法または使用。
【請求項７５】
請求項７２〜７４に記載の方法によって取得される、抗体。
【請求項７６】
医薬としての使用のための、請求項７５に記載の抗体。
【請求項７７】
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、レクチン補体経路応答を欠く、非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞。
【請求項７８】
請求項３９〜５１のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸配列もまた含まない、非ヒト哺乳動物細胞または非ヒト細胞。
【請求項７９】
請求項３９〜５１のうちのいずれか１項に記載の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または非ヒト細胞であって、内因性ＭＡＳＰ−２ポリペプチドをコードする核酸配列もまた含む、非ヒト哺乳動物細胞または非ヒト細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５０１３５７（Ｐ２００８−５０１３５７Ａ）
【公表日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２６５７７（Ｐ２００７−５２６５７７）
【出願日】平成１７年６月８日（２００５．６．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５００８６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２０２２２
【国際公開日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【出願人】（５０６４１０１２１）ユニバーシティ オブ レスター (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月８日（２００５．６．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０５００８６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２０２２２
【国際公開日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【出願人】（５０６４１０１２１）ユニバーシティ オブ レスター (4)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]