遺伝子発現のステロイド受容体調節
本発明は、代謝および発現調節に影響されない非哺乳類宿主細胞（例えば、真菌）における新規ステロイド誘導発現系を提供する。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属で発現されるヒト・エストロゲン受容体遺伝子が、構成的プロモータ下で、機能的であることが示された。アスペルギルス、酵母、およびエストロゲン受容体結合部位（ＥＲＥ）を含む合成配列からの調節配列を有するレポーター遺伝子は、ホルモン誘導体誘導因子に応答して発現される。その誘導因子が存在しない場合、プロモータはサイレントであり、コンストラクトおよび誘導因子の濃度に依存して、発現レベルが中等度から非常に高いものに変えられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概ね誘導性発現系の分野に関する。特に、本発明は遺伝子発現の調整または調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ステロイド・ホルモンは、原形質膜を透過して拡散し、標的受容体に結合して活性化させる。活性化に応じて、ステロイド受容体が結合することでＤＮＡの転写が調節される。このような生理学的遺伝子調節方法が、多数の遺伝子発現系の青写真として使われていた。
【０００３】
ステロイド・ホルモンが特定の細胞型で一部の遺伝子の転写を誘導可能であることは、周知である。ステロイド反応性遺伝子（ホルモン・レセプター／ホルモン複合体によるクロマチンとの相互作用を介して）の転写活性化は、遺伝子に付随するエンハンサー配列に対する複合体の結合を介してもたらされる。
【０００４】
多数のステロイド・ホルモンおよび甲状腺ホルモン反応性転写調節単位が同定されている。これらの例として、糖質コルチコイド、アルドステロン、およびアンドロゲン・ホルモンに反応するマウス乳癌ウイルス５’末端の長い反復配列（ＭＴＶ ＬＴＲ）と、糖質コルチコイド、エストロゲン、および甲状腺ホルモンに反応にする哺乳類の成長ホルモン遺伝子のための転写制御単位と、エストロゲンに反応する哺乳類のプロラクチン遺伝子およびプロゲステロン受容体遺伝子のための転写制御単位と、プロゲステロンに反応する鳥類のオボアルブミン遺伝子のための転写制御単位と、糖質コルチコイドに反応する哺乳類のメタロチオネイン遺伝子転写調節単位とが挙げられる。
【０００５】
活性転写複合体がプロモータ部位で集合すると転写の開始が起こり、次に転写が開始されるところを指示する。プロモータ領域はいくつかのドメインを含み、それらの領域はプロモータの全機能にとって必要である。これらのドメインの最初のものは、構造遺伝子の直上流にあり、一般にコード領域の直ぐ上流の約７０塩基対（ｂｐ）であるコンセンサス配列を含むコア・プロモータ領域を形成している。コア・プロモータ領域は特徴的なＣＡＡＴおよびＴＡＴＡボックスに加えて周辺配列を含んでおり、構造遺伝子の転写開始点を定める転写開始配列を表す。コア・プロモータ領域の正確な長さは可変的ではあるが、当業者によってかなり認識され得る。この領域は、ある程度の違いはあるが、すべてのプロモータに存在する。
【０００６】
コア・プロモータ領域は、完全プロモータ活性を与えるには不十分である。調節配列は、通常コアから上流で、プロモータの残りの部分を構成する。調節配列は、発現レベルと、発現の空間的および時間的パターンと、プロモータの重要なサブセットについて誘導可能な発現とを決定する。これらは、細胞内および細胞外シグナルに反応する。
【０００７】
上流側エレメント（「ホルモン反応エレメント」または「ＨＲＥ」）に結合した場合、ステロイド受容体によって転写が活性化または抑制される。これらのＨＲＥは特異的なエンハンサー配列であって、特定のホルモン受容体によって認識されることから、異なった反応が異なったホルモン類によって引き起こされることを確実にする。例えば、１７β−エストラジオールまたはエストロゲン誘導体（例えばジエチルスチルベストロールまたはゼラレノン）等のリガンドは、エストロゲン受容体のリガンド結合部位に結合する。この結合イベントは、受容体の構造変化と細胞質から核へのリガンド−受容体複合体の移動を誘発するもので、受容体が上記特異的ＨＲＥを認識し、ＨＩＲＥ拡散配列に結合し、転写機構とポジティブまたはネガティブに相互作用することで、遺伝子発現に影響を及ぼす。
【０００８】
各ステロイド受容体は、ＤＮＡ上のＨＲＥ部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを包含する。これらの結合ドメインの特徴は十分に調べられている（（Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，８８９−８９５（１９８８）；Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ ４６，６４５−６５２（１９８６））。ステロイド受容体は、さらに、構造的および／または機能的相同性の領域を共有する。これらの領域の各々の較正は、異なるドメインに分けられ、各ドメインがホルモン遺伝子スーパーファミリーの全てのメンバーで保存されている。これらのドメインは、可変Ｎ末端領域（ドメインＡ／Ｂ）、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合領域（ドメインＣ）、ヒンジ領域（ドメインＤ）、Ｃ末端リガンド結合領域（ドメインＥ）、および可変Ｃ末端（ドメインＦ）に対応する。Ｅｖａｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，８８９−８９５（１９８８）を参照せよ。
【０００９】
Ｎ末端ドメインは、大きさおよび配列が高度に可変であり、スーパーファミリーのメンバー間で十分に保存されていない。この特定のドメインは、転写活性化の修飾で機能する（Ｂｏｃｑｕｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１７，２５８１−２５９５（１９８９）；Ｔｏｒａら、Ｃｅｌｌ，５９，４７７−４８７（１９８９））。
【００１０】
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤは）クロマチン上の特異的な標的遺伝子の転写制御単位内で特異的なＨＲＥに対する受容体を標的にする（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ａｎｄ Ｗａｈｌｉ，Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１２５−１５３（１９９１））。
【００１１】
リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、受容体同族リガンドの認識および結合にとって不可欠である。リガンド結合ドメインも、転写活性化機能を備えている。要するに、ＬＢＤは受容体のホルモン反応の特異性および選択性の決定を補助する。ＬＢＤは、核ホルモン受容体スーパーファミリーの個々のメンバー間で相同性がかなり変化することが周知である。（Ｅｖａｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，８８９−８９５（１９８８）；Ｐ．Ｊ．Ｆｕｌｌｅｒ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，５，３０９２−３０９９（１９９１）；Ｍａｎｇｅ］ｓｄｏｒｆ ｅｔら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．８３，８３５−８３９（１９９５））。
【００１２】
Ｎ末端領域に存在する機能（ＬＢＤおよびＤＢＤ）は、互いに独立している。これらのドメインが核受容体間で交換されうることが示されている（Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２５，７５−７８（１９８７））。そのような交換の結果が「キメラ核ホルモン受容体」である。
【００１３】
十分に特徴づけられ、かつ細菌に存在する天然の調節系がいくつか存在する。そのような系は、ＤＮＡ結合タンパク質とその標的ＤＮＡ配列との相互作用を利用して、遺伝子発現の誘導、強化、減衰、または抑制をおこなう。十分に特徴づけられた遺伝子活性系は、偽巣性コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）の硝酸同化系である。経路誘導および窒素代謝産物抑制は、偽巣性コウジ菌での窒素代謝を調整する。経路特異的転写活性因子ＮｉｒＡは、経路導入を媒介する（総説として、Ｓｃａｚｚｏｃｃｈｉｏ ａｎｄ Ａｒｓｔ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｎｉｔｒａｔｅ Ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ，Ｗｒａｙ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ Ｋｉｎｇｈｏｍ，Ｊ．Ｒ．（ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．２９９−３１３（１９８９）を参照せよ）。硝酸還元酵素（ｎｉａＤ）と亜硝酸レダクターゼ（ｎｉｉＡ）をコードする遺伝子が硝酸塩の有用性に応じて同時制御されることがすでに示されている（Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，５６８８−５６９９（１９９５））。ＮｉｒＡの結合が細胞内硝酸塩と転写因子のいわゆるＧＡＴＡ因子ファミリーである機能的なＡｒｅＡタンパク質とに依存していることが示されている（Ｎａｒｅｎｄｊａ，Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４４（２），５７３−５８３（２００２）；Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ａｒｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６２，５８６−５９６（１９９８）；およびＳｃａｚｚｏｃｃｈｉｏ，Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３，１２６−１３１（２０００）、さらにその中で引用された文献）。ＧＡＴＡ因子は、ヒトから糸状菌に至るまでの真核生物界に存在し、脊椎動物の細胞分化（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｒ．Ｋ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，１２（４），４１６−４２２（２００２））、植物病原性菌類における病原因子（Ｖｏｉｓａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３，７０９１−７１００（１９９３））、または菌類および酵母の一次代謝（Ｇｏｍｅｚら、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，５０（１），２７７−８９（２００３），Ｍａｇａｓａｎｉｋ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，２００２，Ｇｅｎｅ，２９０：１−１８）の多様化プロセスを調整する。例として、偽巣性コウジ菌（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｔｓ）のＡｒｅＡ、アカパンビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）Ｎｉｔ２、さらに酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｄａ１８０、ＧＩｎ３、Ｎｉｌｌ、およびＮｉ１２の相同体が挙げられる。前述した全ての遺伝子が窒素獲得の調節に関与している。さらなる例として、いくつかの菌類でのシデロホア生合成のアカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）での光シグナル伝達の調節因子が挙げられ、また植物ＧＡＴＡ因子もあるが、その機能はまだ知られていない。
【００１４】
これら天然の調節系のいくつかは、酵母または他の微生物系で利用され、代謝産物に依存するヘテロ遺伝子発現系を構築することで、活性化または抑制遺伝子発現応答を生ずる。これらの系が、標的配列の発現に対して一定の制御レベルを与える一方で、それらの系は宿主細胞の代謝系に究極的に影響を及ぼし、宿主細胞遺伝子に対して不要な多面的発現効果を示す。重金属または炭素源を特定の生理学的活性および遺伝子発現の誘導因子として用いることで、付加的な負荷を宿主細胞にかける。なぜなら、該細胞が並外れて高レベルの誘導因子を代謝して、そこから回復しようとするからである。
【００１５】
レトロウイルス・ベクターは、テトラサイクリン誘導系を哺乳類細胞宿主に導入するために用いられ、目的とする遺伝子を発現させる。しかし、酵母および微生物株は、レトロウイルス・ベクター送達法を受け入れない。
【００１６】
哺乳類および微生物細胞での代謝産物誘導をベースとした系の多くは、誘導因子による遺伝子発現の活性化が相対的に遅く、かつ不十分であることから制限される。
【００１７】
典型的な生物薬剤学的プロセスは、細胞増殖と生産とがカップリングされた構成的プロモータを使用する。発酵プロセスを通じて、可能な限り最大限の数の細胞が可能な限り最も短時間で治療的なタンパク質を産生することが直感的に考えられる。このように、高力価の優良なタンパク質を産生するために、生産相から増殖相を脱カップリングさせることが有利である。旺盛的プロモータ下で産生されるタンパク質は、以下に詳しく述べるように、分解、共有結合修飾、および宿主細胞の代謝による干渉を受けうる。したがって、酵母および他の微生物株等、複合的な遺伝的環境における遺伝子の発現は、空間的および時間的に、インビボで操作される目的とするタンパク質を生成するために個々の遺伝子の発現をストリンジェントに制御することを可能とする系から大きな利益を得ると思われる。
【００１８】
一般に、時間的および空間的な、治療的タンパク質のストリンジェントな遺伝子発現制御の重要な態様は、所定の最小培地、安価な成分、低濃度の誘導因子での使用を含む（例えば、誘導因子の保存および取り扱いは一般に危険な操作（メタノールの除去等）をほとんど必要としない）。誘導プロセスがすばやく開始され（好ましくは誘導後数分以内）、誘導因子は化学的に安定でなければならず、培地中で長時間インキュベートした後に生物学的活性がなければならない。また、誘導因子は、化合物と拮抗可能であり、発酵ブロスから容易に除去可能なものでなければならない。
【００１９】
誘導可能な遺伝子発現を、優先的に異種タンパク質発現に対して用いることが可能である。これらのタンパク質を治療的なものとすることが可能である。
【００２０】
誘導可能な遺伝子発現は、増殖細胞を増殖させて十分な密度にする。それに続く遺伝子発現の誘導によって、生産相が開始される。また、所望のタンパク質産物の産生速度は、発酵中に加えられる誘導因子の濃度による直接的修飾を受けることができる。誘導因子が存在しない場合、目的とする遺伝子が発現されないことから、産物の発現が誘導されるまで、異種タンパク質発現の潜在的毒性効果が回避される。
【００２１】
発現の間、該発現の駆動に必要な誘導因子化合物による変化によって毒性がもたらされ、炭素源の取り込みが制限される可能性がある。例えば、メチル栄養要求性酵母（例えばピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ｓｐ）のＡｏｘプロモータは炭素利用度を制限することが可能である。さらに、発現を可能にするのに必要な特定の媒体組成物は、一般に効率的な生物体量蓄積を妨げる。例えば、ａｌｃプロモータ発現系は、通常、低グルコース濃度下でのみ機能する。これらの発現系は、ａｌｃ系等の代謝活性に由来するＧＡＰＤＨまたは誘導系等の強力な構成的プロモータに依存する。したがって、必要なことは、代謝および発現調節に影響されない安価な誘導因子の存在下で遺伝子発現を調節する誘導可能な発現系である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要約）
標的ホルモン反応性配列に対するステロイド受容体（例えば、エストロゲン受容体）の特異性、同様に同族受容体に対するステロイド類（例えば、エストロゲンおよびエストロゲン様分子）の高親和性と、ステロイド受容体およびリガンドの十分研究された化学的および生理学的特性は、非哺乳類宿主細胞での高効率的に調整された誘導可能な発現系に対する基礎を構成する。さらに、ホルモン類（例えば、ジエチルスチルボエストロール（ＤＥＳ））を容易に拮抗させること、または生化学的方法によって培地から取り除くことができる。したがって、糸状菌のステロイド誘導プロモータ発現系が得られる。一実施形態では、系は、
（ｉ）宿主細胞での発現に応じて、コードされた核ホルモン・ステロイド受容体を産生する核ホルモン・ステロイド受容体または第１の核酸と、
（ｉｉ）（ａ）転写されうる標的ヌクレオチド配列、（ｂ）プロモータ・コア、（ｃ）少なくとも一つのホルモン・ステロイド反応エレメント、および（ｄ）スタッファー・フラグメントを有する第２の核酸であって、（ａ）標的ヌクレオチド配列が（ｂ）プロモータ・コアに作動可能に結合し、また（ｄ）スタッファー・フラグメントが（ｂ）と（ｃ）との間に並列することで、核ホルモン・ステロイドの存在下で、プロモータ・コアからの標的ヌクレオチド配列の発現を誘導する、第２の核酸
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
一実施形態では、本発明は、調節タンパク質（（ステロイド・タンパク質等の核ホルモン））に作動可能に結合した第１のプロモータと、標的核酸分子（例えば、遺伝子）に作動可能に結合した調節可能（例えば誘導可能）なプロモータとを含む調節された遺伝子発現カセットであって、上記調節可能なプロモータは効果的外来性誘導因子の存在下で調節タンパク質によって活性化され、誘導因子の投与が標的遺伝子の発現を引き起こし、誘導因子のアンタゴニストの除去または添加が発現を停止させる、遺伝子発現カセットを提供する。別の実施形態では、上記調節タンパク質は、調節タンパク質が結合するプロモータ領域を含まない核酸分子に物理的に結合している核酸コントラストから発現される。しかし、調節タンパク質をコードする遺伝子と発現されうる標的遺伝子または配列が同じ核酸コンストラクトにあってもよいことは、理解される。この場合、第１のカセットによって産生された調節タンパク質である適当な誘導因子の存在は、第２のカセットで誘導プロモータからの転写を刺激することで、標的遺伝子の発現を活性化させる。あるいは、一方または両方のコンストラクトを安定的に宿主細胞ゲノムに組み込ませることが可能である。
【００２４】
別の実施形態では、ステロイド受容体結合部位がｎｉｒＡ遺伝子のプロモータに導入される。コア誘導プロモータは、作動可能に標的遺伝子または配列と結合されている。そのような配列がｃＤＮＡまたはＤＮＡであってもよいことが理解される。コア・プロモータは、特徴的なＣＡＡＴおよびＴＡＴＡボックス、それに加えて周辺配列によって定義され、構造遺伝子のための転写開始点を定義する転写開始配列を表す。コア・プロモータ領域の直上流は、「スタッファー・フラグメント」であり、その長さは約７５〜２５０ｂｐのあいだ、好ましくは約１００〜２００ｂｐ、さらに好ましくは約１００〜１５０ｂｐのあいだにあり、コア・プロモータに機械的に結合した転写機構とさらに上流のＨＩＲＥ結合ステロイド受容体とのあいだに最適空間を設ける。この間隔およびスペーサーのヌクレオチド組成物は、標的核酸、例えば目的とする遺伝子の発現の調節（すなわち、活性化または抑制）にとってクリティカルである。異なる間隔で複数のＥＲＥを含むプロモータ・フラグメントは、機能的ではないと考えられる（図８）。
【００２５】
転写活性化タンパク質が影響を及ぼすために使用することができる遺伝子活性化のいくつかの十分確立されたモードが存在する。例えば、活性因子は、転写の効率的な開始が可能となるヒストンのシフティングまたはクロマチン構造の変更を介して、コア・プロモータですでに組み立てられた転写機構と直接接触することを介して、転写にとって必須な因子の動員を介して、転写因子とポリメラーゼとが適当に接触できるようにＤＮＡ内の一カ所または複数箇所に屈曲またはねじれを設けることを介して、またはＤＮＡに１つまたは複数の屈曲もしくはねじれを設けることで、転写に必要な構成要素の効率的な結合を可能にすることを介して、影響を及ぼすことが可能である。これらのモードのいずれかが、遺伝子がここで活性化および発現されるメカニズムを表すことが可能であると理解される。
【００２６】
一実施形態では、本発明の系および方法で用いられる宿主細胞は、非哺乳類宿主細胞、好ましくは真菌（例えば酵母）または細菌細胞である。哺乳類細胞系よりも複雑であることがわかっている内因性核受容体および他の受容体共同調節タンパク質を欠いていることから、酵母、真菌、および／または細菌細胞系を用いる。それは、当業者がパラメータを変えて、巨大な母集団から所望の方法でふるまう珍しい細胞を選択させる遺伝学的および生化学的スクリーニングおよび選択技術に対して、容易に修正可能であることから、有利でもある。酵母および糸状菌は、両方とも、組換えタンパク質（細胞内型および分泌型）の生産に首尾良く使われている（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，Ｊ．Ｌ．およびＪ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４（１），４５−６６（２０００）；Ｈａｒｋｋｉ，Ａ．ら、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（６），５９６（１９８９）；Ｂｅｒｋａ，Ｒ．Ｍ．ら、Ａｂｓｔｒ．ＰａｐｅｒｓＡｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０３，１２１−ＢＩＯＴ（１９９２）；Ｓｖｅｔｉｎａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３），２４５−２５１（１９９２））。
【００２７】
別の実施形態では、本明細書中に開示されたステロイド誘導プロモータ発現系は、当業者によって、単細胞酵母、例えば限定されるものではないが、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびクルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）に容易に移される。一実施形態において、エストロゲン誘導プロモータ・エレメントは、酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子が欠損しているウラシル栄養素要求株である酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＹＪＮ１６５株で操作される（Ｎｅｔｔら、Ｙｅａｓｔ，２０（１５），１２７９−９０（２００３））。酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５、または他の適当な選択マーカーを持つ１組のプラスミドと、ｐＥＲＥ−ＵＲＡ−ｎｉｒＡ、ｐＥＲＥ−ＪＵＮＫ−ｎｉｒＡ、およびｐＥＲＥ−ＵＲＡ−ＪＵＮＫ（図１３）等の誘導プロモータ・カセットのライブラリー、あるいは本明細書に記載もしくは当業者に周知のそのようなエレメントの別の組み合わせとによって、本発明の誘導プロモータ発現系が作られる。好ましくは、誘導エレメントが目的とする遺伝子の上流でクローニングされ、誘導エレメントを目的とする遺伝子と相同的組み込み（相同的組み込みが選択された場合）の標的エレメントを含む全ＤＮＡエレメント（例えばＨＩＳ３およびＨＩＳ４遺伝子（Ｃｏｓａｎｏら、Ｙｅａｓｔ，１４（９），８６１−７（１９９８）））、適当な選択マーカー、誘導プロモータ・エレメント、ならびに目的とする遺伝子を含む全ＤＮＡエレメントが、当業者に周知の方法、例えばキメラ的コンピテント細胞を用いることで、形質転換され、さらに好ましくは宿主細胞ゲノムに組み込まれる（Ｈａｎａｈａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０４，６３−１１３（１９９１））。
【００２８】
別の実施形態では、選択マーカーと、強力なＧＡＰＤＨプロモータ、または当業者に周知の他のプロモータによって駆動されるステロイド（例えば、エストロゲン）受容体をコードする遺伝子と、好ましくは、ＨＩＳ３およびＨＩＳ４遺伝子等の組み込み遺伝子座、または他の適当な遺伝子座に対して標的するための宿主細胞のゲノムに由来する配列（Ｃｏｓａｎｏら、Ｙｅａｓｔ，１４（９），８６１−７（１９９８））とを、目的とする細胞に形質転換させることができ、相同組かえによって宿主ゲノムに組み込むことができる。
【００２９】
本発明の誘導系は、いくつかの利点を提供する。すなわち、非哺乳類宿主で転写を完全にスイッチ・オンまたはスイッチ・オフすることが可能であることである。誘導系は、安価な誘導因子（例えばＤＥＳ）を低濃度（１０ｐＭ〜１０ｎＭ）で用いるのに適している。さらに、誘導系は誘導中に何ら代謝的なスイッチを持たない。発酵条件を最適化する能力、安価な培地の使用、異種タンパク質分泌能力、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）、封入小体の欠失、導入遺伝子の遺伝学的安定性を含む他の利点によって、糸状菌最適宿主でタンパク質を産生する。
【００３０】
本発明の核酸（例えば、同族核ホルモン受容体をコードする核酸、コア・プロモータおよび標的遺伝子コンストラクトと作動可能に結合したホルモン反応性エレメントとを含む核酸）を宿主細胞のゲノム（染色体）に組み込むことが可能である。組み込みは、十分確立された技術にしがたって、ゲノムによる組み換えを促進する配列の含有によって、促進することができる。あるいは、ＤＮＡ配列（別個にゲノム（染色体）から複製される）を用いて、目的とする遺伝子（ホルモン受容体および／または作動可能に結合した標的遺伝子）を染色体外遺伝子座（例えば、複製プラスミド）から発現させることが可能である。
【００３１】
核酸コンストラクトの導入は、限定されることなしに、本明細書中では「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」のことをいう。形質転換は、任意の入手可能な技術によって達成することが可能である。そのような技術として、塩化カルシウムまたは酢酸リチウム形質転換、電気穿孔法、ファージ・トランスフェクション、および直接注入が挙げられる。当業者は、選択した宿主細胞に応じて、該宿主細胞に核酸を導入するための適当な方法を選択することが可能である。
【００３２】
栄養素要求性、抗生物質抵抗性、または感受性遺伝子とまたは感度が高い遺伝子と相補的な遺伝子等のマーカー遺伝子を、目的の核酸コンストラクトを含んでいるクローンを同定する際に使うことが可能である。例えば、マーカーの存在は、その後の形質転換体の選択に有用である。例えば、酵母では、ＵＲＡ３、ＨＩＳ４、ＳＵＣ２、Ｇ４１８、ＢＬＡ、またはＳＨ ＢＬＥ（および、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）では、ａｒｇＢ、ｐｙｒＧ、ｒｉｂｏＢ、ｎｉａＤ、ｈｙｇＢ遺伝子）遺伝子をもちいてもよい。または、周知の遺伝子操作技術を用いて、ステロイド感受性の増加または減衰を行うことも可能である（例えば、所望の表現型または形質を持つ宿主細胞に対する適当なスクリーニングまたは選択と併せて、ランダムまたは直接的な化学または酵素的突然変異技術を用いた多剤耐性遺伝子欠失、ＡＢＣ輸送対欠失、またはノックアウト）。
【００３３】
宿主細胞に対して、２種類の核酸分子（例えば、異なる２つのベクター）、すなわちステロイド受容体をコードする第１の核酸と、プロモータ・コアに作動可能に結合した転写される核酸、該プロモータ・コアの５’末端に結合したスタッファー・フラグメント、該スタッファー・フラグメントの５’末端に結合した少なくとも１つのステロイド反応エレメントを有する第２の核酸ベクターとによる共形質転換をおこなうことが可能である。これら２種類の核酸分子のいずれかもしくは両方が、宿主染色体の中に組み込まれる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、標的核酸配列は宿主細胞から分泌される糖タンパク質をコードする。それなりに、このことは細胞標的配列またはシグナル・ペプチドの存在に依存する。真核細胞では、分泌のためにタンパク質が細胞膜または多くの内部細胞小器官のうちの１つを標的にすることができる。細胞内タンパク質は、細胞質、核、または特定の細胞小器官（例えばミトコンドリアまたは葉緑体）を標的にすることができる。例えば、遺伝子工学的技術を用いてシグナル・ペプチドを細胞質タンパク質（例えばグロビン、本来そのような配列を持たない）に付加してもよい。これによって、小胞体（ＥＲ）に入り、分割されたシグナル配列を持つ改変タンパク質が得られる。よって、このタンパク質はＥＲおよびゴルジ装置を介して細胞表面を標的にする。
【００３５】
（代謝産物非依存調節発現系）
上述の通り、核ホルモン（例えば酵母、真菌、および細菌のステロイド誘導系）を使用することの大きな利点は、ステロイド受容体反応性誘導因子分子が宿主真菌、酵母、または細菌微生物の代謝経路に対して、けして影響を及ぼすことなく利用可能であるということである。異種タンパク質発現における細胞の生理学的シグナルからの独立は、当技術分野では達成困難であった。本発明は、ＨＥＲ存在下でネガティブおよびポジティブ・エレメントの組み合わせを含む代謝および発現調節には依存しない非哺乳類宿主細胞（例えば、真菌）での新規ステロイド調節発現系を提供する。本発明はまた、炭素および窒素調節に影響されない糸状菌および酵母での遺伝子発現を調節するための方法を提供する。本明細書中に例示したエストロゲン誘導発現系は、代謝および発育制御に影響されない（図６）。中間の発現レベル（微調整と同様に）は、異なる誘導因子濃度によるエレメントのモジュール方式の組み合わせによって、達成される。
【００３６】
（誘導因子分子）
誘導因子化合物は、宿主細胞が増殖している培地または培養液中に容易に添加される。誘導因子化合物は、細胞によって取り込まれ、あるいは細胞膜を介して受動的に拡散し、その同族受容体に結合して、該受容体の形態的変化を誘導し、同族ホルモン反応エレメントへの結合が可能になる。方法は、培地から誘導因子を取り除くこと（すなわち、カラム・クロマトグラフィの使用）、または該培地から誘導因子活性を取り除くこと（すなわち、誘導因子に拮抗する化合物の添加によって）を可能にする十分に確立されたものである。このことは、下等真核および細菌宿主細胞での以前の誘導可能な発現系および方法に対する改善を示している。
【００３７】
エストロゲン受容体に結合し、かつ標的核酸からの遺伝子発現を誘導または抑制するリガンドの例として、１７β−エストラジオール、ジエチルスチルベンストロール（ＤＥＳ）、ゼアラレノン（ＺＯＮ）、固定環４−ヒドロキシタモキシフェン、非ステロイド性スチルベン類似体、タモキシフェン、選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭＳ）のいずれか、４−１−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−フェニレンチル］フェノキシ酢酸、ラロキシフェン、エストロゲン、ＩＣ１１６４３８４（ＥＲアンタゴニスト）、およびＩＣ１８２，７８０が挙げられる。他の周知のリガンド（およびその同族受容体）として、コルチゾール（ＣＯＲＴ受容体）、アンドロゲン（アンドロゲン受容体）、プロゲステロン（プロゲステロン受容体）、アルドステロン（鉱質コルチコイド受容体）、ならびにトリヨードチロニン（Ｔ３受容体）、ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｄ３受容体）、およびレチノイド（オールトランス・レチン酸および９−シス・レチン酸）受容体（各々ＲＡＲおよびＲＸＲ）の２つの種類を含む非ステロイド・ホルモンが挙げられる。エストロゲン受容体基質の濃度を変えることで、同様にＲＩＰ１４０（遺伝子発現を経てインビボで合成または外因的に付加）等のエストロゲン受容体共同因子の添加によって、転写活性化または抑制のレベルが影響されることが、十分に理解される。
【００３８】
植物および真菌由来ステロイド様化合物もまた、ステロイド受容体媒介遺伝子発現の誘導に用いることが可能である。植物由来エストロゲン化合物として、フラボン、イソフラボン、フラバノン、クマリン、カルコン、および真菌エストロゲンが挙げられる。フィトエストロゲンおよび植物リグナン（大豆製品で豊富に見つかる）は、強力なエストロゲン的性質を持つ。８−プレニルナリンゲニン（８−ＰＮ）は、ホップおよびビールに存在するフィトエストロゲンであり、その機能性はＩＣＩ １８２，７８０によって阻害され、また１７β−エストラジオールの作用を模倣する。甘草粗エキス（グラブリジン）由来の主要なイソフラビンは、インビボおよびインビトロで、エストロゲン受容体アゴニストの度合いの変化を示す。グラグレンおよびイソリキリチゲニン（２’，４’，４−３ヒドロキシ・カルコン）は、エストロゲン受容体に結合することが知られており、アゴニスト活性（両方とも、甘草粗エキスに由来）を示す。植物病原性のフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株、例えばデオキシニバレノール（Ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ、ＤＯＮ）またはゼラレノンはエストロゲンを模倣したものであり、ｈＥＲを活性化する。したがって、上記植物のいずれか、または真菌に由来するエストロゲン様化合物例を、エストロゲン受容体媒介遺伝子発現の誘導に用いることが可能である。
【００３９】
（スタッファー・フラグメント）
スタッファー・フラグメントは、「活性化」ホルモン（例えばステロイド）受容体とコア・プロモータ結合ポリメラーゼとの間に最適な間隔を与える。この最適間隔は、クロマチン構造の履歴および変更が妥当にシフトすることを規定することで、転写を効率的に開始させ、コア・プロモータですでに組み立てられる転写機構との直接接触を規定し、転写のために必要な因子の動員のために、アクセスできる核酸を規定し、ＤＮＡに適当な１カ所または複数箇所の屈曲またはねじれを与えることで、転写因子とポリメラーゼとのあいだに適当な接触を可能にし、さもなければＤＮＡに適当な１カ所または複数箇所の屈曲またはねじれを与えることで、転写に必要な構成要素の効率的な結合を可能にする。これらのモードのいずれかがスタッファー・フラグメントが働く機構を示すことができ、それによって遺伝子の発現または抑制が可能となる。
【００４０】
好ましいスタッファー・フラグメントの長さは、約７５〜約２５０ヌクレオチドである。より望ましくは、スタッファー・フラグメントの長さは、約１００〜約２００ヌクレオチドであり、さらに好ましくは約１００〜約１５０ヌクレオチドである。当業者は、ランダム・スタッファー・フラグメント核酸を、当技術分野で十分に確立された方法を用いて、所望の長さおよび遺伝子発現活性についてスクリーニングすることが可能であることを認識する。好ましいスタッファー配列は、図３に示すように、ＵＲＡ ３核酸フラグメントを含み（配列番号１）、またｎｉｒＡＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓプロモータの９７ｂｐフラグメント（ＡＴＧを含む）を含む。選択されたｎｉｒＡプロモータＤＮＡフラグメントと共にＵＲＡ３スタッファー・フラグメントは、ＤＥＳ（図１）および（図７）によって誘導されたＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓでの所望の遺伝子発現を与える。ＵＲＡ３プロモータ・フラグメントとＮｉｒＡ遺伝子プロモータ・フラグメントとの特定の組み合わせは、スタッファー領域がない場合、ＥＲの不能性をもたらし、ホルモン刺激後のレポーター遺伝子発現を活性化させる。例えば、ｕｒａ３フラグメントと、ＣＴがリッチな配列と付加的なＴＡＴＡ配列を含むｎｉｒＡプロモータ・フラグメントとの直接融合は、ＤＥＳによって誘導可能ではないコンストラクトを与える（実施例２参照）。スタッファー・フラグメントの選択および改善は、特に所望の遺伝子発現特性を与えるかどうかを基礎として、おこなうことが可能である。
【００４１】
より好ましい実施形態では、ＪＵＮＫエレメントに一般に結合したＵＲＡ３核酸フラグメントに一般に結合したエストロゲン反応エレメントの組み合わせによって、ａｌｃＡのものと等しいレベルで転写が開始される（図９）。ＪＵＮＫエレメントとして、限定されるものではないが、任意のヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。しかし、好ましくはＥ．ｃｏｌｉのβ−ラクタマーゼである。その組み合わせについて驚くべきことは、ＪＵＮＫエレメントの相対的位置が劇的に誘導のレベルに影響するということである（図９）。ＪＵＮＫエレメントによる誘導可能な発現系をスクリーニングして修飾し、所望のレベルに発現を調節する。今日まで、他のモチーフと組み合わせたＥＲＥの活性化に対するプロモータ・セット・アップの影響は、酵母または糸状菌では決定されなかった。したがって、本発明は、相対的に簡易で、かついかなる代謝産物にも影響されずに調節しうる誘導発現系の必要について言及する。
【００４２】
（ステロイド反応エレメント）
ホルモン反応エレメント（ＨＲＥ）は、ホルモンによる遺伝子発現活性化に必要である短いシス作用配列（大きさが約２０塩基対）である。ＨＲＥを、さもなければホルモン非反応性であるコード配列に、作動可能に結合することができる。そのような結合は、現在ホルモン反応性である遺伝子を規定する。ＨＲＥは、ホルモンまたはリガンドの有無に対する依存性にもとづいて、他のエンハンサー配列から区別される。
【００４３】
ステロイド受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニスト・リガンドの結合は、ほとんどの場合、受容体の二量体化をもたらす。例えば、エストロゲン受容体αおよびβをホモ二量体化することができ、それほど多くはないが、ヘテロ二量体化することができる。リガンド結合受容体は、標的遺伝子の調節領域にある配列（ステロイド応答エレメント）を認識して該配列に結合する。同族反応エレメントに結合した受容体によってＤＮＡの屈曲が誘導することが可能であり、該屈曲は重要な転写構成要素の相互作用を促進する。一旦結合すると、受容体は一般の転写因子、共同活性因子、抑制因子、およびクロマチン再構築を制御するタンパク質、標的遺伝子発現の活性化または抑制のためのシグナルとして機能することが可能である。
【００４４】
一実施形態では、修飾活性因子タンパク質を用いた遺伝子抑制を達成するモードは、活性領域に突然変異を起こさせ、ＥＲＥが天然のエンハンサー配列と重なっているプロモータを構築することを介する。したがって、エストロゲンによる突然変異ヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）遺伝子発現の活性化、ｈＥＲタンパク質はＥＲＥと結合して天然の活性因子と競合する。
【００４５】
十分に特徴づけられ、かつこのようにして機能するステロイド受容体の例は、エストロゲン受容体である。活性化エストロゲン受容体は、ＤＮＡ配列（エストロゲン反応エレメント、またはＥＲＥ）と高親和性で結合する。エストロゲン受容体は、二量体の頭合せ配列にあるパリンドローム繰り返しに結合する。最小のＥＲＥコンセンサス配列は、配列番号２によって定まる（５’−ＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣ−３’、式中、ｎは任意のヌクレオチド）。
【００４６】
本明細書中で用いられるように、改変ＨＲＥとは、遺伝子工学的技術（例えば、ヌクレオチド置換および欠失）を用いて、組み換え的に産生されたＨＲＥのことをいう。また、本発明のＨＲＥは、当技術分野で十分に確立された技術（自動ヌクレオチド合成等）を用いて、インビトロで合成することが可能である。
【００４７】
目的のステロイド受容体をコードする核酸コンストラクトが、天然に生ずるステロイド受容体をコードすることに限定されるものではないことが、理解されるべきである。キメラ受容体を構築して遺伝子発現系で用いることは周知である。
【００４８】
（ステロイド受容体）
ホルモン（例えば、目的とするステロイド受容体）をコードしている核酸は、当業者に周知の技術を用いて構築してもよい。ステロイド受容体スーパーファミリーの分子性状に基づいて、上記したように、新規核ホルモン受容体が構築され、以前に記述されている（例えば、ＥＰ ０７９８ ３７８ Ａ２を参照せよ）。インビボで受容体タンパク質を発現する遺伝的コンストラクトを調製する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，（１９９４およびＳｕｐｐｓ．ｔｏ ２００２）を参照せよ）。ステロイド受容体コード化核酸コンストラクトの複数のコピーが、最適な発現のために一体化されてもよい。さらに、ステロイド受容体が構成的に、または調整された方法で、転写されてもよい。当技術分野の状況を鑑みれば、受容体の調節された発現を求めることが可能であり、またそのような調整を生成する方法は周知である。異なる受容体のＬＢＤおよび／またはＤＢＤを含むキメラ受容体をキメラ結合によって産生することが可能である。しかし、最も好ましくは、カップリングが、必要なステロイド受容体ドメインをコードする核酸配列を融合することで、標準的な分子生物学的方法によるＤＮＡレベルで達成される。上記したように、ステロイド受容体は、一般的な転写因子、共同活性因子、抑制因子、クロマチン再構成を調節するタンパク質、標的遺伝子発現の活性化または抑制のためのシグナルとして機能することができる（例えば、受容体遺伝子技術を用いる）。
【００４９】
（コア・プロモータ）
コア・プロモータは、任意のトランス活性化タンパク質が存在しない場合に、通常は「オフ」状態にある天然のコア・プロモータを代表するものであってもよい。言い換えれば、遺伝子発現の実質的なレベルは、ＲＮＡポリメラーゼと組み合わさって「活性化タンパク質」が存在する場合のみ、イニシエートされる。そのようなプロモータの例として、ｎｉｒＡプロモータがあり、該プロモータは一般的な転写因子とポリメラーゼ・タンパク質・サブユニットが集合する。当業者に周知のことは、コア・プロモータのＴＡＴＡ配列（転写開始部位の約２５ヌクレオチド上流に位置）がＴＡＴＡ結合タンパク質によって認識され、またこの初期結合が他の転写結合因子と転写に必要なＲＮＡポリメラーゼとの集合プロセスをトリガーする。しかし、プロモータの性質があれば、現在構成された設定での高レベルの転写が適当に開始される。適当な上流（５’）配列が活性ステロイド・ホルモン受容体によって結合される。一旦結合すると、これらの配列は、スタッファー・フラグメントと組み合わさって、所望の遺伝子発現活性化を与える。
【００５０】
コア・プロモータは、一般の転写因子とポリメラーゼとの完全な相補体が適当に結合する上で要求される配列に依存して、長さが変えることが可能である。
【００５１】
好ましいコア・プロモータは、ｎｉｒＡプロモータ（配列番号３）である。ｎｉｒＡプロモータの９４ｂｐフラグメントもまた好ましい（配列番号４）。付加的なＣＴリッチ配列およびＴＡＴＡ配列を含むｎｉｒＡプロモータの２８７ｂｐフラグメントまた、遺伝的コンストラクトに取り込み可能ではあるが、このコンストラクトは、活性化されたｈＥＲとＥＲＥとによって引き起こされる活性化機能が欠けている（配列番号５）。また、他の実施形態は完全長プロモータｎｉｒＡ（配列番号６）のフラグメントによって、３８２ｂｐフラグメントを利用する。さらに、ランダム・スタッファー配列は、遺伝子発現活性化および／または抑制に基づいて選択可能である。方法は、遺伝子発現の修飾、減衰、抑制、または活性化をおこなう配列のスクリーニングまたは選択に対して、十分に開発されている。
【００５２】
（目的とするタンパク質をコードしている標的遺伝子）
標的遺伝子核酸配列は、本明細書中に含まれる情報および参照文献ならびに当業者に公知の技術を用いて調整する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，（１９９４）を参照せよ）。これらの技術として、（ｉ）目的とする配列（例えば、ゲノム源から）を増幅するためにポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いること、（ｉｉ）化学合成、ならびに（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製が含まれる。発現される配列に対して制限酵素認識部位５’および３’を同定し、そのオリジナルの源もしくはベクターから発現される配列を切り離し、該配列を系の存在下で適当なプロモータに作動可能に結合することを含む。別の組み換えアプローチは、適当なＰＣＲプライマーによって、目的とする配列を増幅させることである。関連配列に対する修飾は、例えば、部位定方向突然変異誘発を介して、取り込まれることが理解される。
【００５３】
好ましい実施形態では、例えば、改変下等真核宿主でステロイド誘導することで本発明の標的ヌクレオチド配列から発現した組み換えタンパク質を、ＷＯ ０２／００８７９で開示される方法（その明細書を本明細書中に援用する）を使用して、さらに改変して「ヒト様」糖タンパク質（すなわち、ヒトの相対物に対して、実質的に同一ではない場合、類似している糖タンパク質）とすることが可能である。本明細書中に開示される単細胞および多細胞真菌は、現在開示されている調節可能な遺伝子発現系で用いられる。通常単細胞および多細胞真菌を含む下等真核生物（通常、Ｎ−グリカンを含んでいる高マンノースを生産する）を修飾して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２等のＮ−グリカンまたはヒト・グリコシル化経路沿った他の構造を生成することが可能である。そのような真菌として、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ，Ａ．ａｗａｍｏｒｉ，Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ，Ａ．ｓａｉｔｏｉ，Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｉｐｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｔｌｉｕｍ ｓｐ．、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａが挙げられる。同様に、メチロトローフ酵母が用いられ、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｔａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．、ａｎｄ Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｓｐ．が挙げられる。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが、より好ましい実施形態の宿主である。
【００５４】
（構成的プロモータ）
ステロイド受容体のプロモータ駆動発現は、好ましくは構成的プロモータである。構成的プロモータのよく知られた例が存在する。構成プロモータの例として、例えば、ＧＡＰＤＨ（ＴＤＨ３）、ＡＤＨ１、エノラーゼ・プロモータ、またはグルセルアルデヒド−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ）プロモータが挙げられる。構成的プロモータは、本明細書中ではプロモータとして定義されており、該プロモータは誘導因子を必要とせず、また目的とする標的遺伝子の活性化または抑制に対して有効である一定量のステロイド受容体の直接発現に対して、かなりアクティブである。
【００５５】
現在開示された発明は、以下の非限定的実施例と添付の図面とによって、さらに詳しく説明する。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
（核酸コンストラクトおよび株の形質転換）
以下は、目的とする株の形質転換に用いられるプラスミドを構築するための一般的な戦略である。
【００５７】
（プラスミドｐｈＥＲｐｙｒ４の構成（図１））
プラスミドＹｅｐ９０−ＨＥＧＯ（Ｐｉｅｒｒａｔら、１９９２）のｈＥＲ含有１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを、ヒト・エストロゲン受容体１（Ａｃｃ．ＮＭ００１２５）の発現を駆動するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｚ３２５２４）由来の構成プロモータｇｐｄＡを有するｐＢＫＳＩＩ＋主鎖（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）内のＰｇｐｄ−ＴｔｒｐｃコンストラクトのＮｃｏＩ部位にクローニングした。末端配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ Ｘ０２３９０）由来のｔｒｐＣターミネータを有する。マーカー遺伝子は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ（Ａｃｃ．Ｕ０５１９２）由来のｐｙｒ４（オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ）である。結果として生ずるＰｇｐｄ−ｈＥＲ−Ｔｔｒｐｃカセットを、ＳｐｅＩ／ＣｌａＩフラグメントとして、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉのｐｙｒ４遺伝子を選択マーカーとして含むプラスミドにクローニングすることで、プラスミドｐｈＥＲｐｙｒ４が得られる。
【００５８】
（ｌａｃＺレポーター・コンストラクトの一般的構造）
シス作用エレメント：３つの構成エストロゲン反応エレメント（ＥＲＥ）は、遺伝学的にＵＲＡ３ スタッファー・フラグメントの５’末端に結合している。スタッファー・フラグメントの３’末端は、ＡＴＧを含むＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓのｎｉｒＡプロモータの一部の５’末端に遺伝学的に結合する（図５Ａおよび５Ｃ）。
【００５９】
（プラスミドｐＲＭ２１２４の構成（図２））
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ａｃｅ．Ｍ１２９２６，８９−２０５塩基）（Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓら、１９９２）とＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｍ６８９００）のｎｉｒＡプロモータの３８７ｂｐフラグメントとが後に続く３ｘＥＲＥ配列を、ＰＣＲを用いて増殖させ、ＢａｍＨＩ／ＢｇＩＩＩフラグメントとして、ｐＡＮ９２３−４２ＢｇＩＩＩのＢａｍＨＩ部位に、クローニングさせた（Ｐｕｎｔら、Ｇｅｎｅ ９３，１０１−１０９（１９９０））。構造遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ由来のレポーターｌａｃＺである（Ａｃｃ．Ｖ００２９６）。マーカー遺伝子はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｅ．ＡＢ０２０７３７）由来のａｒｇＢである。ターミネータ配列として、ＡＳｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｘ０１２３９０）由来のｔｒｐＣターミネータを含む（Ａｃｃ．Ｘ０１２３９０）。
【００６０】
（プラスミドｐＲＭ２１１９の構成（図３））
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ａｃｅ．Ｍ１２９２６，８９−２０５塩基）（Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓら、１９９２）とＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｍ６８９００）のｎｉｒＡプロモータの２９２ｂｐフラグメントとが後に続く３ｘＥＲＥ配列を、ＰＣＲを用いて増殖させ、ＢａｍＨＩ／ＢｇＩＩＩフラグメントとして、ｐＡＮ９２３−４２ＢｇＩＩＩのＢａｍＨＩ部位に、クローニングさせた（Ｐｕｎｔら、Ｇｅｎｅ ９３，１０１−１０９（１９９０））。構造遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ由来のレポーターｌａｃＺである（Ａｃｃ．Ｖ００２９６）。マーカー遺伝子はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｅ．ＡＢ０２０７３７）由来のａｒｇＢである。ターミネータ配列として、ＡＳｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｘ０２３９０）由来のｔｒｐＣターミネータを含む。レポーター遺伝子発現は、誘導体が対外から供給された場合にこのコンストラクトを有する酵母細胞で、何ら観察されない。
【００６１】
（プラスミドｐＲＭ２０８５の構成（図４））
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ａｃｅ．Ｍ１２９２６，８９−２０５塩基）（Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓら、１９８８）とＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｍ６８９００）のｎｉｒＡプロモータの９４ｂｐフラグメントとが後に続く３ｘＥＲＥ配列を、ＰＣＲを用いて増殖させ、ＢａｍＨＩ／ＢｇＩＩＩフラグメントとして、ｐＡＮ９２３−４２ＢｇＩＩＩのＢａｍＨＩ部位に、クローニングさせた（Ｖａｎ Ｇａｒｃｏｍら、１９８６）。構造遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ由来のレポーターｌａｃＺである（Ａｃｃ．Ｖ００２９６）。マーカー遺伝子はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｅ．ＡＢ０２０７３７）由来のａｒｇＢである。ターミネータ配列として、ＡＳｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｘ０２３９０）由来のｔｒｐＣターミネータを含む。
【００６２】
（ｐＥＲＥ ＵＲＡ ＪＵＮＫの構成）
ｐＲＭ２０８５のｎｉｒＡプロモータ・フラグメントを破棄し、ｐＢＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のａｍｐＲ遺伝子のＯＲＦの９４ｂｐフラグメントで置き換えた。
【００６３】
（ｐＥＲＥ ＪＵＮＫ ｎｉｒＡの構成）
ｐＲＭ２０８５のＵＲＡ３プロモータ・フラグメントを破棄し、ｐＢＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のａｍｐＲ遺伝子のＯＲＦの１１７ｂｐフラグメントで置き換えた。
【００６４】
（ｐＲＭ ａｌｃＡの構成）
ｐＲＭ２０８５のＥＲＥ ＵＲＡ ｎｉｒＡカセットを破棄し、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのａｌｃＡプロモータの４２７ｂｐフラグメントで置き換えた（Ｇｗｙｎｎｅ，Ｄ．１ら、Ｇｅｎｅ ５１，２０５−２１６（１９８７））。
【００６５】
（実施例２）
（培養条件）
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株を、適当なサプリメントを含む最小培地（Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏら、１９５３）で、１２〜１４時間、３７℃、１８０ｒｐｍで増殖させた。異なる誘導因子濃度を試験するために、この株を濾過して回収し、異なる誘導因子濃度を含む新鮮な培地にアリコートを移し、さらに８時間にわたって増殖をおこなった。終わりには、菌糸体を濾過によって収集し、液体窒素で凍結した。タイムカーブ実験のために、株を収集してさらに２４時間増殖させ、２、４、６、８、および２４時間後に試料を採取して液体窒素で凍結した。大きくなった、そして、２４時間の試料はされた、そして、液体窒素で凍結した。図９は、誘導因子、エタノール（ａｌｃ）またはＤＥＳ（ｈＥＲ）のいずれかによって、活性化させた後のレポーター・コンストラクトの発現レベルを示す。等量の真菌菌体量を新鮮な培地に移し、アリコートをアゴニストによる誘導にかけた。所望の時点でサンプリングをおこなった後、湿潤細胞ペレットを記載通りに処理した。
【００６６】
（実施例３）
（レポーター酵素アッセイ）
ＮａＰＯ４緩衝液およびガラスビーズ（０．７５〜１．０ｍｍ）を凍結した菌糸に添加し、ハイベード・リボライザー（Ｈｙｂａｉｄ ＲｉｂｏＬｙｓｅｒ）を用いて細胞の破砕をおこなった。細胞片を遠沈殿法によって分離し、上清を酵素アッセイに用いた。タンパク質濃度は、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）のＢＳＡアッセイを用いて決定し、特異的β−ガラクトシダーゼ活性はインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールを用いて測定した。図１０は、実験の全セットを通じて使用された反応条件下で、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）によって得たタンパク質標準曲線（表１）である。所定の試料のタンパク質濃度の決定は、これらの標準条件に基づいておこなった。また、特異的酵素活性レベル（単位β−ガラクトシダーゼ）はタンパク質１ｍｇあたりの単位（単位／ｍｇタンパク質）に相関した。
【００６７】
較正曲線をプロットして、ＤＥＳ［μｇ／μｌ」の濃度とタンパク質濃度［単位／ｍｇ］との相関関係を示す。試料のタンパク質濃度は、１ｍｇのタンパク質あたりの単位として、特異的活性の発現が決定される（表２）。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２−１】
【００７０】
【表２−２】
（実施例４）
（異なるリガンド濃度でのプレート上での増殖試験／Ｘ Ｇａｌ活性試験）
０．１ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｍＭ、および１μＭのＤＥＳ誘導体を、形質転換株（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｒｇＢ２、ｒｉｂｏＡ１，ｐｙｒＧ８９、ｐｙｒｏＡ４）でのＬａｃＺに対するＸｇａｌ基質を有する培地プレートに対して添加することで、エストロゲン受容体導入をおこなった。図６。結果は、２０μＭまでの濃度のＤＥＳ濃度が野生型株の増殖に影響をおよぼさないことを示している。１ｎＭ ＤＥＳでのレポーター・コンストラクトの活性化は、形質転換された真菌でみいだされる。ｈＥＲによって形質転換された株の増殖抑制は、レポーター・コンストラクトによって形質転換された株で１００ｎＭのＤＥＳで示された。
【００７１】
（実施例５）
（液体培養でのＸ Ｇａｌ活性試験）
図７は、Ｘｇａｌ含有液体培養でのβ−Ｇａｌ活性のためのアッセイを示す。１単位は、２８℃で１分間あたりに１ｎＭのＯＮＰＧを加水分解する酵素の量として定義される。結果によれば、誘導体ＤＥＳ（１ｎＭおよび１０ｍＭ）は、βＧａｌ活性に基づいたＬａｃＺの発現を強く誘導した。実施例３を参照せよ。
【００７２】
（実施例６）
（ｐＲＭコンストラクトのβ−ｇａｌ活性）
異なる濃度のＤＥＳを用いてβ−ｇａｌ活性を測定した。表３は、異なるｐＲＭレセプター・コンストラクトを用いた誘導レベルを示す。図８は、表３のアッセイをグラフ表示したものである。
【００７３】
【表３】
（実施例７）
（ｐＥＲＥコンストラクトでのβ−ｇａｌ活性）
各ｐＥＲＥコンストラクトでのβ−ｇａｌ活性を、１ｎＭ ＤＥＳによる誘導後にアッセイした。ａｌｃＡ発現もまた、比較のためにアッセイした。実施例３を参照せよ。ｐＥＲＥ ＵＲＡ Ｊｕｎｋの組み合わせによって、最も高い誘導レベルが得られた。表４は、時間経過に伴うｐＥＲＥコンストラクトでのβ−ｇａｌレベルの誘導を示す。
【００７４】
【表４】
（実施例８）
（異なる炭素および窒素源を用いてｐＥＲＥ ＵＲＡ ｎｉｒＡコンストラクトでのβＧＡｌ活性）
異なる炭素および窒素源を含む所定のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ最小培地を用いて、標準的な条件下で株の増殖をおこなった。１ｎＭのＤＥＳによる誘導８時間後に、培養物を採取し、特異的β−ガラクトシダーゼ活性を測定してタンパク質１ｍあたりの単位として表した。標準として、炭素源として１％グルコース上で、また窒素源として５ｍＭアンモニア上で増殖した培養物を採取して分析し、それらの三重反復試料あたり平均してタンパク質１ｍｇあたりの平均単位として用い、参照発現レベル（すなわち、１００％）の設定に用いた。表５および６（図１１および１２は表５および６のグラフ表示である）は、異なる濃度ならびに異なる炭素源および窒素源で増殖させた培養物から得た参照レベルの百分率である（Ｇｌｕ：グルコース、Ａｒａ：アラビノース、Ｘｙｌ：キシロース、ＭＭ：最小培地）
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
（参考文献）
【００７７】
【表７】
（配列表）
（配列番号１）
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ１２９２６
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１１７ｂｐ ｕｒａ３ プロモータ
（配列番号２）
５’−ＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣ−３’
式中、ｎは任意のヌクレオチド
（配列番号３）
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ８６９００
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｎｉｒＡ プロモータ
（配列番号４）
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ８６９００
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｎｉｒＡ プロモータの９４ｂｐフラグメント
（配列番号５）
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ８６９００
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｎｉｒＡ プロモータの２８７ｂｐフラグメント
（配列番号６）
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ８６９００
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｎｉｒＡ プロモータの３８２ｂｐフラグメント
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１はｐｈＥＲｐｙｒ４のプラスミド・マップを示す。
【図２】図２はｐＲＭ２１２４のプラスミド・マップを示す。
【図３】図３はｐＲＭ２１２９のプラスミド・マップを示す。
【図４】図４はｐＲＭ２０８５のプラスミド・マップを示す。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、ＵＲＡ３、ｎｉｒＡプロモータ（続いてレポーター・タンパク質に結合）に遺伝的に結合した３つの連続的なエストロゲン反応エレメントの構造を示す。
【図６】図６は、異なるリガンド濃度でＸｇａｌプレート上で形質転換されたＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓａｒｇＢ２、ｒｉｂｏＡ１、ｐｙｒＧ、ｐｙｒｏＡ４の増殖活性を示す。
【図７】Ｘｇａｌを含む液体培養でのβ−Ｇａｌ活性についてのアッセイの結果を示す。
【図８】ｐＲＭ２０８５、ｐＲＭ２１１９、および ｐＲＭ２１２４で形質転換したＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓでのβ−Ｇａｌ活性についてのアッセイを示す。
【図９】ａｌｃＡ発現と比較して、ｐＥＲＥレポーター・コンストラクトにより形質転換されたＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓでのβ−Ｇａｌ活性のアッセイを示す。
【図１０】タンパク質濃度の較正曲線を示す。
【図１１】異なる代謝産物でのβ−Ｇａｌ活性のアッセイを示す。
【図１２】異なる代謝産物でのβ−Ｇａｌ活性のアッセイを示す。
【図１３】ＪＵＮＫエレメント修飾タンパク質を含むプラスミドを示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概ね誘導性発現系の分野に関する。特に、本発明は遺伝子発現の調整または調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ステロイド・ホルモンは、原形質膜を透過して拡散し、標的受容体に結合して活性化させる。活性化に応じて、ステロイド受容体が結合することでＤＮＡの転写が調節される。このような生理学的遺伝子調節方法が、多数の遺伝子発現系の青写真として使われていた。
【０００３】
ステロイド・ホルモンが特定の細胞型で一部の遺伝子の転写を誘導可能であることは、周知である。ステロイド反応性遺伝子（ホルモン・レセプター／ホルモン複合体によるクロマチンとの相互作用を介して）の転写活性化は、遺伝子に付随するエンハンサー配列に対する複合体の結合を介してもたらされる。
【０００４】
多数のステロイド・ホルモンおよび甲状腺ホルモン反応性転写調節単位が同定されている。これらの例として、糖質コルチコイド、アルドステロン、およびアンドロゲン・ホルモンに反応するマウス乳癌ウイルス５’末端の長い反復配列（ＭＴＶ ＬＴＲ）と、糖質コルチコイド、エストロゲン、および甲状腺ホルモンに反応にする哺乳類の成長ホルモン遺伝子のための転写制御単位と、エストロゲンに反応する哺乳類のプロラクチン遺伝子およびプロゲステロン受容体遺伝子のための転写制御単位と、プロゲステロンに反応する鳥類のオボアルブミン遺伝子のための転写制御単位と、糖質コルチコイドに反応する哺乳類のメタロチオネイン遺伝子転写調節単位とが挙げられる。
【０００５】
活性転写複合体がプロモータ部位で集合すると転写の開始が起こり、次に転写が開始されるところを指示する。プロモータ領域はいくつかのドメインを含み、それらの領域はプロモータの全機能にとって必要である。これらのドメインの最初のものは、構造遺伝子の直上流にあり、一般にコード領域の直ぐ上流の約７０塩基対（ｂｐ）であるコンセンサス配列を含むコア・プロモータ領域を形成している。コア・プロモータ領域は特徴的なＣＡＡＴおよびＴＡＴＡボックスに加えて周辺配列を含んでおり、構造遺伝子の転写開始点を定める転写開始配列を表す。コア・プロモータ領域の正確な長さは可変的ではあるが、当業者によってかなり認識され得る。この領域は、ある程度の違いはあるが、すべてのプロモータに存在する。
【０００６】
コア・プロモータ領域は、完全プロモータ活性を与えるには不十分である。調節配列は、通常コアから上流で、プロモータの残りの部分を構成する。調節配列は、発現レベルと、発現の空間的および時間的パターンと、プロモータの重要なサブセットについて誘導可能な発現とを決定する。これらは、細胞内および細胞外シグナルに反応する。
【０００７】
上流側エレメント（「ホルモン反応エレメント」または「ＨＲＥ」）に結合した場合、ステロイド受容体によって転写が活性化または抑制される。これらのＨＲＥは特異的なエンハンサー配列であって、特定のホルモン受容体によって認識されることから、異なった反応が異なったホルモン類によって引き起こされることを確実にする。例えば、１７β−エストラジオールまたはエストロゲン誘導体（例えばジエチルスチルベストロールまたはゼラレノン）等のリガンドは、エストロゲン受容体のリガンド結合部位に結合する。この結合イベントは、受容体の構造変化と細胞質から核へのリガンド−受容体複合体の移動を誘発するもので、受容体が上記特異的ＨＲＥを認識し、ＨＩＲＥ拡散配列に結合し、転写機構とポジティブまたはネガティブに相互作用することで、遺伝子発現に影響を及ぼす。
【０００８】
各ステロイド受容体は、ＤＮＡ上のＨＲＥ部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを包含する。これらの結合ドメインの特徴は十分に調べられている（（Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，８８９−８９５（１９８８）；Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ ４６，６４５−６５２（１９８６））。ステロイド受容体は、さらに、構造的および／または機能的相同性の領域を共有する。これらの領域の各々の較正は、異なるドメインに分けられ、各ドメインがホルモン遺伝子スーパーファミリーの全てのメンバーで保存されている。これらのドメインは、可変Ｎ末端領域（ドメインＡ／Ｂ）、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合領域（ドメインＣ）、ヒンジ領域（ドメインＤ）、Ｃ末端リガンド結合領域（ドメインＥ）、および可変Ｃ末端（ドメインＦ）に対応する。Ｅｖａｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，８８９−８９５（１９８８）を参照せよ。
【０００９】
Ｎ末端ドメインは、大きさおよび配列が高度に可変であり、スーパーファミリーのメンバー間で十分に保存されていない。この特定のドメインは、転写活性化の修飾で機能する（Ｂｏｃｑｕｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１７，２５８１−２５９５（１９８９）；Ｔｏｒａら、Ｃｅｌｌ，５９，４７７−４８７（１９８９））。
【００１０】
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤは）クロマチン上の特異的な標的遺伝子の転写制御単位内で特異的なＨＲＥに対する受容体を標的にする（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ａｎｄ Ｗａｈｌｉ，Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１２５−１５３（１９９１））。
【００１１】
リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は、受容体同族リガンドの認識および結合にとって不可欠である。リガンド結合ドメインも、転写活性化機能を備えている。要するに、ＬＢＤは受容体のホルモン反応の特異性および選択性の決定を補助する。ＬＢＤは、核ホルモン受容体スーパーファミリーの個々のメンバー間で相同性がかなり変化することが周知である。（Ｅｖａｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，８８９−８９５（１９８８）；Ｐ．Ｊ．Ｆｕｌｌｅｒ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，５，３０９２−３０９９（１９９１）；Ｍａｎｇｅ］ｓｄｏｒｆ ｅｔら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．８３，８３５−８３９（１９９５））。
【００１２】
Ｎ末端領域に存在する機能（ＬＢＤおよびＤＢＤ）は、互いに独立している。これらのドメインが核受容体間で交換されうることが示されている（Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２５，７５−７８（１９８７））。そのような交換の結果が「キメラ核ホルモン受容体」である。
【００１３】
十分に特徴づけられ、かつ細菌に存在する天然の調節系がいくつか存在する。そのような系は、ＤＮＡ結合タンパク質とその標的ＤＮＡ配列との相互作用を利用して、遺伝子発現の誘導、強化、減衰、または抑制をおこなう。十分に特徴づけられた遺伝子活性系は、偽巣性コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）の硝酸同化系である。経路誘導および窒素代謝産物抑制は、偽巣性コウジ菌での窒素代謝を調整する。経路特異的転写活性因子ＮｉｒＡは、経路導入を媒介する（総説として、Ｓｃａｚｚｏｃｃｈｉｏ ａｎｄ Ａｒｓｔ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｎｉｔｒａｔｅ Ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ，Ｗｒａｙ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ Ｋｉｎｇｈｏｍ，Ｊ．Ｒ．（ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．２９９−３１３（１９８９）を参照せよ）。硝酸還元酵素（ｎｉａＤ）と亜硝酸レダクターゼ（ｎｉｉＡ）をコードする遺伝子が硝酸塩の有用性に応じて同時制御されることがすでに示されている（Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，５６８８−５６９９（１９９５））。ＮｉｒＡの結合が細胞内硝酸塩と転写因子のいわゆるＧＡＴＡ因子ファミリーである機能的なＡｒｅＡタンパク質とに依存していることが示されている（Ｎａｒｅｎｄｊａ，Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４４（２），５７３−５８３（２００２）；Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ａｒｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６２，５８６−５９６（１９９８）；およびＳｃａｚｚｏｃｃｈｉｏ，Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３，１２６−１３１（２０００）、さらにその中で引用された文献）。ＧＡＴＡ因子は、ヒトから糸状菌に至るまでの真核生物界に存在し、脊椎動物の細胞分化（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｒ．Ｋ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，１２（４），４１６−４２２（２００２））、植物病原性菌類における病原因子（Ｖｏｉｓａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３，７０９１−７１００（１９９３））、または菌類および酵母の一次代謝（Ｇｏｍｅｚら、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，５０（１），２７７−８９（２００３），Ｍａｇａｓａｎｉｋ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ，２００２，Ｇｅｎｅ，２９０：１−１８）の多様化プロセスを調整する。例として、偽巣性コウジ菌（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｔｓ）のＡｒｅＡ、アカパンビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）Ｎｉｔ２、さらに酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｄａ１８０、ＧＩｎ３、Ｎｉｌｌ、およびＮｉ１２の相同体が挙げられる。前述した全ての遺伝子が窒素獲得の調節に関与している。さらなる例として、いくつかの菌類でのシデロホア生合成のアカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）での光シグナル伝達の調節因子が挙げられ、また植物ＧＡＴＡ因子もあるが、その機能はまだ知られていない。
【００１４】
これら天然の調節系のいくつかは、酵母または他の微生物系で利用され、代謝産物に依存するヘテロ遺伝子発現系を構築することで、活性化または抑制遺伝子発現応答を生ずる。これらの系が、標的配列の発現に対して一定の制御レベルを与える一方で、それらの系は宿主細胞の代謝系に究極的に影響を及ぼし、宿主細胞遺伝子に対して不要な多面的発現効果を示す。重金属または炭素源を特定の生理学的活性および遺伝子発現の誘導因子として用いることで、付加的な負荷を宿主細胞にかける。なぜなら、該細胞が並外れて高レベルの誘導因子を代謝して、そこから回復しようとするからである。
【００１５】
レトロウイルス・ベクターは、テトラサイクリン誘導系を哺乳類細胞宿主に導入するために用いられ、目的とする遺伝子を発現させる。しかし、酵母および微生物株は、レトロウイルス・ベクター送達法を受け入れない。
【００１６】
哺乳類および微生物細胞での代謝産物誘導をベースとした系の多くは、誘導因子による遺伝子発現の活性化が相対的に遅く、かつ不十分であることから制限される。
【００１７】
典型的な生物薬剤学的プロセスは、細胞増殖と生産とがカップリングされた構成的プロモータを使用する。発酵プロセスを通じて、可能な限り最大限の数の細胞が可能な限り最も短時間で治療的なタンパク質を産生することが直感的に考えられる。このように、高力価の優良なタンパク質を産生するために、生産相から増殖相を脱カップリングさせることが有利である。旺盛的プロモータ下で産生されるタンパク質は、以下に詳しく述べるように、分解、共有結合修飾、および宿主細胞の代謝による干渉を受けうる。したがって、酵母および他の微生物株等、複合的な遺伝的環境における遺伝子の発現は、空間的および時間的に、インビボで操作される目的とするタンパク質を生成するために個々の遺伝子の発現をストリンジェントに制御することを可能とする系から大きな利益を得ると思われる。
【００１８】
一般に、時間的および空間的な、治療的タンパク質のストリンジェントな遺伝子発現制御の重要な態様は、所定の最小培地、安価な成分、低濃度の誘導因子での使用を含む（例えば、誘導因子の保存および取り扱いは一般に危険な操作（メタノールの除去等）をほとんど必要としない）。誘導プロセスがすばやく開始され（好ましくは誘導後数分以内）、誘導因子は化学的に安定でなければならず、培地中で長時間インキュベートした後に生物学的活性がなければならない。また、誘導因子は、化合物と拮抗可能であり、発酵ブロスから容易に除去可能なものでなければならない。
【００１９】
誘導可能な遺伝子発現を、優先的に異種タンパク質発現に対して用いることが可能である。これらのタンパク質を治療的なものとすることが可能である。
【００２０】
誘導可能な遺伝子発現は、増殖細胞を増殖させて十分な密度にする。それに続く遺伝子発現の誘導によって、生産相が開始される。また、所望のタンパク質産物の産生速度は、発酵中に加えられる誘導因子の濃度による直接的修飾を受けることができる。誘導因子が存在しない場合、目的とする遺伝子が発現されないことから、産物の発現が誘導されるまで、異種タンパク質発現の潜在的毒性効果が回避される。
【００２１】
発現の間、該発現の駆動に必要な誘導因子化合物による変化によって毒性がもたらされ、炭素源の取り込みが制限される可能性がある。例えば、メチル栄養要求性酵母（例えばピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ｓｐ）のＡｏｘプロモータは炭素利用度を制限することが可能である。さらに、発現を可能にするのに必要な特定の媒体組成物は、一般に効率的な生物体量蓄積を妨げる。例えば、ａｌｃプロモータ発現系は、通常、低グルコース濃度下でのみ機能する。これらの発現系は、ａｌｃ系等の代謝活性に由来するＧＡＰＤＨまたは誘導系等の強力な構成的プロモータに依存する。したがって、必要なことは、代謝および発現調節に影響されない安価な誘導因子の存在下で遺伝子発現を調節する誘導可能な発現系である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要約）
標的ホルモン反応性配列に対するステロイド受容体（例えば、エストロゲン受容体）の特異性、同様に同族受容体に対するステロイド類（例えば、エストロゲンおよびエストロゲン様分子）の高親和性と、ステロイド受容体およびリガンドの十分研究された化学的および生理学的特性は、非哺乳類宿主細胞での高効率的に調整された誘導可能な発現系に対する基礎を構成する。さらに、ホルモン類（例えば、ジエチルスチルボエストロール（ＤＥＳ））を容易に拮抗させること、または生化学的方法によって培地から取り除くことができる。したがって、糸状菌のステロイド誘導プロモータ発現系が得られる。一実施形態では、系は、
（ｉ）宿主細胞での発現に応じて、コードされた核ホルモン・ステロイド受容体を産生する核ホルモン・ステロイド受容体または第１の核酸と、
（ｉｉ）（ａ）転写されうる標的ヌクレオチド配列、（ｂ）プロモータ・コア、（ｃ）少なくとも一つのホルモン・ステロイド反応エレメント、および（ｄ）スタッファー・フラグメントを有する第２の核酸であって、（ａ）標的ヌクレオチド配列が（ｂ）プロモータ・コアに作動可能に結合し、また（ｄ）スタッファー・フラグメントが（ｂ）と（ｃ）との間に並列することで、核ホルモン・ステロイドの存在下で、プロモータ・コアからの標的ヌクレオチド配列の発現を誘導する、第２の核酸
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
一実施形態では、本発明は、調節タンパク質（（ステロイド・タンパク質等の核ホルモン））に作動可能に結合した第１のプロモータと、標的核酸分子（例えば、遺伝子）に作動可能に結合した調節可能（例えば誘導可能）なプロモータとを含む調節された遺伝子発現カセットであって、上記調節可能なプロモータは効果的外来性誘導因子の存在下で調節タンパク質によって活性化され、誘導因子の投与が標的遺伝子の発現を引き起こし、誘導因子のアンタゴニストの除去または添加が発現を停止させる、遺伝子発現カセットを提供する。別の実施形態では、上記調節タンパク質は、調節タンパク質が結合するプロモータ領域を含まない核酸分子に物理的に結合している核酸コントラストから発現される。しかし、調節タンパク質をコードする遺伝子と発現されうる標的遺伝子または配列が同じ核酸コンストラクトにあってもよいことは、理解される。この場合、第１のカセットによって産生された調節タンパク質である適当な誘導因子の存在は、第２のカセットで誘導プロモータからの転写を刺激することで、標的遺伝子の発現を活性化させる。あるいは、一方または両方のコンストラクトを安定的に宿主細胞ゲノムに組み込ませることが可能である。
【００２４】
別の実施形態では、ステロイド受容体結合部位がｎｉｒＡ遺伝子のプロモータに導入される。コア誘導プロモータは、作動可能に標的遺伝子または配列と結合されている。そのような配列がｃＤＮＡまたはＤＮＡであってもよいことが理解される。コア・プロモータは、特徴的なＣＡＡＴおよびＴＡＴＡボックス、それに加えて周辺配列によって定義され、構造遺伝子のための転写開始点を定義する転写開始配列を表す。コア・プロモータ領域の直上流は、「スタッファー・フラグメント」であり、その長さは約７５〜２５０ｂｐのあいだ、好ましくは約１００〜２００ｂｐ、さらに好ましくは約１００〜１５０ｂｐのあいだにあり、コア・プロモータに機械的に結合した転写機構とさらに上流のＨＩＲＥ結合ステロイド受容体とのあいだに最適空間を設ける。この間隔およびスペーサーのヌクレオチド組成物は、標的核酸、例えば目的とする遺伝子の発現の調節（すなわち、活性化または抑制）にとってクリティカルである。異なる間隔で複数のＥＲＥを含むプロモータ・フラグメントは、機能的ではないと考えられる（図８）。
【００２５】
転写活性化タンパク質が影響を及ぼすために使用することができる遺伝子活性化のいくつかの十分確立されたモードが存在する。例えば、活性因子は、転写の効率的な開始が可能となるヒストンのシフティングまたはクロマチン構造の変更を介して、コア・プロモータですでに組み立てられた転写機構と直接接触することを介して、転写にとって必須な因子の動員を介して、転写因子とポリメラーゼとが適当に接触できるようにＤＮＡ内の一カ所または複数箇所に屈曲またはねじれを設けることを介して、またはＤＮＡに１つまたは複数の屈曲もしくはねじれを設けることで、転写に必要な構成要素の効率的な結合を可能にすることを介して、影響を及ぼすことが可能である。これらのモードのいずれかが、遺伝子がここで活性化および発現されるメカニズムを表すことが可能であると理解される。
【００２６】
一実施形態では、本発明の系および方法で用いられる宿主細胞は、非哺乳類宿主細胞、好ましくは真菌（例えば酵母）または細菌細胞である。哺乳類細胞系よりも複雑であることがわかっている内因性核受容体および他の受容体共同調節タンパク質を欠いていることから、酵母、真菌、および／または細菌細胞系を用いる。それは、当業者がパラメータを変えて、巨大な母集団から所望の方法でふるまう珍しい細胞を選択させる遺伝学的および生化学的スクリーニングおよび選択技術に対して、容易に修正可能であることから、有利でもある。酵母および糸状菌は、両方とも、組換えタンパク質（細胞内型および分泌型）の生産に首尾良く使われている（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ，Ｊ．Ｌ．およびＪ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４（１），４５−６６（２０００）；Ｈａｒｋｋｉ，Ａ．ら、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（６），５９６（１９８９）；Ｂｅｒｋａ，Ｒ．Ｍ．ら、Ａｂｓｔｒ．ＰａｐｅｒｓＡｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０３，１２１−ＢＩＯＴ（１９９２）；Ｓｖｅｔｉｎａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３），２４５−２５１（１９９２））。
【００２７】
別の実施形態では、本明細書中に開示されたステロイド誘導プロモータ発現系は、当業者によって、単細胞酵母、例えば限定されるものではないが、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびクルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）に容易に移される。一実施形態において、エストロゲン誘導プロモータ・エレメントは、酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子が欠損しているウラシル栄養素要求株である酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＹＪＮ１６５株で操作される（Ｎｅｔｔら、Ｙｅａｓｔ，２０（１５），１２７９−９０（２００３））。酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５、または他の適当な選択マーカーを持つ１組のプラスミドと、ｐＥＲＥ−ＵＲＡ−ｎｉｒＡ、ｐＥＲＥ−ＪＵＮＫ−ｎｉｒＡ、およびｐＥＲＥ−ＵＲＡ−ＪＵＮＫ（図１３）等の誘導プロモータ・カセットのライブラリー、あるいは本明細書に記載もしくは当業者に周知のそのようなエレメントの別の組み合わせとによって、本発明の誘導プロモータ発現系が作られる。好ましくは、誘導エレメントが目的とする遺伝子の上流でクローニングされ、誘導エレメントを目的とする遺伝子と相同的組み込み（相同的組み込みが選択された場合）の標的エレメントを含む全ＤＮＡエレメント（例えばＨＩＳ３およびＨＩＳ４遺伝子（Ｃｏｓａｎｏら、Ｙｅａｓｔ，１４（９），８６１−７（１９９８）））、適当な選択マーカー、誘導プロモータ・エレメント、ならびに目的とする遺伝子を含む全ＤＮＡエレメントが、当業者に周知の方法、例えばキメラ的コンピテント細胞を用いることで、形質転換され、さらに好ましくは宿主細胞ゲノムに組み込まれる（Ｈａｎａｈａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０４，６３−１１３（１９９１））。
【００２８】
別の実施形態では、選択マーカーと、強力なＧＡＰＤＨプロモータ、または当業者に周知の他のプロモータによって駆動されるステロイド（例えば、エストロゲン）受容体をコードする遺伝子と、好ましくは、ＨＩＳ３およびＨＩＳ４遺伝子等の組み込み遺伝子座、または他の適当な遺伝子座に対して標的するための宿主細胞のゲノムに由来する配列（Ｃｏｓａｎｏら、Ｙｅａｓｔ，１４（９），８６１−７（１９９８））とを、目的とする細胞に形質転換させることができ、相同組かえによって宿主ゲノムに組み込むことができる。
【００２９】
本発明の誘導系は、いくつかの利点を提供する。すなわち、非哺乳類宿主で転写を完全にスイッチ・オンまたはスイッチ・オフすることが可能であることである。誘導系は、安価な誘導因子（例えばＤＥＳ）を低濃度（１０ｐＭ〜１０ｎＭ）で用いるのに適している。さらに、誘導系は誘導中に何ら代謝的なスイッチを持たない。発酵条件を最適化する能力、安価な培地の使用、異種タンパク質分泌能力、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）、封入小体の欠失、導入遺伝子の遺伝学的安定性を含む他の利点によって、糸状菌最適宿主でタンパク質を産生する。
【００３０】
本発明の核酸（例えば、同族核ホルモン受容体をコードする核酸、コア・プロモータおよび標的遺伝子コンストラクトと作動可能に結合したホルモン反応性エレメントとを含む核酸）を宿主細胞のゲノム（染色体）に組み込むことが可能である。組み込みは、十分確立された技術にしがたって、ゲノムによる組み換えを促進する配列の含有によって、促進することができる。あるいは、ＤＮＡ配列（別個にゲノム（染色体）から複製される）を用いて、目的とする遺伝子（ホルモン受容体および／または作動可能に結合した標的遺伝子）を染色体外遺伝子座（例えば、複製プラスミド）から発現させることが可能である。
【００３１】
核酸コンストラクトの導入は、限定されることなしに、本明細書中では「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」のことをいう。形質転換は、任意の入手可能な技術によって達成することが可能である。そのような技術として、塩化カルシウムまたは酢酸リチウム形質転換、電気穿孔法、ファージ・トランスフェクション、および直接注入が挙げられる。当業者は、選択した宿主細胞に応じて、該宿主細胞に核酸を導入するための適当な方法を選択することが可能である。
【００３２】
栄養素要求性、抗生物質抵抗性、または感受性遺伝子とまたは感度が高い遺伝子と相補的な遺伝子等のマーカー遺伝子を、目的の核酸コンストラクトを含んでいるクローンを同定する際に使うことが可能である。例えば、マーカーの存在は、その後の形質転換体の選択に有用である。例えば、酵母では、ＵＲＡ３、ＨＩＳ４、ＳＵＣ２、Ｇ４１８、ＢＬＡ、またはＳＨ ＢＬＥ（および、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）では、ａｒｇＢ、ｐｙｒＧ、ｒｉｂｏＢ、ｎｉａＤ、ｈｙｇＢ遺伝子）遺伝子をもちいてもよい。または、周知の遺伝子操作技術を用いて、ステロイド感受性の増加または減衰を行うことも可能である（例えば、所望の表現型または形質を持つ宿主細胞に対する適当なスクリーニングまたは選択と併せて、ランダムまたは直接的な化学または酵素的突然変異技術を用いた多剤耐性遺伝子欠失、ＡＢＣ輸送対欠失、またはノックアウト）。
【００３３】
宿主細胞に対して、２種類の核酸分子（例えば、異なる２つのベクター）、すなわちステロイド受容体をコードする第１の核酸と、プロモータ・コアに作動可能に結合した転写される核酸、該プロモータ・コアの５’末端に結合したスタッファー・フラグメント、該スタッファー・フラグメントの５’末端に結合した少なくとも１つのステロイド反応エレメントを有する第２の核酸ベクターとによる共形質転換をおこなうことが可能である。これら２種類の核酸分子のいずれかもしくは両方が、宿主染色体の中に組み込まれる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、標的核酸配列は宿主細胞から分泌される糖タンパク質をコードする。それなりに、このことは細胞標的配列またはシグナル・ペプチドの存在に依存する。真核細胞では、分泌のためにタンパク質が細胞膜または多くの内部細胞小器官のうちの１つを標的にすることができる。細胞内タンパク質は、細胞質、核、または特定の細胞小器官（例えばミトコンドリアまたは葉緑体）を標的にすることができる。例えば、遺伝子工学的技術を用いてシグナル・ペプチドを細胞質タンパク質（例えばグロビン、本来そのような配列を持たない）に付加してもよい。これによって、小胞体（ＥＲ）に入り、分割されたシグナル配列を持つ改変タンパク質が得られる。よって、このタンパク質はＥＲおよびゴルジ装置を介して細胞表面を標的にする。
【００３５】
（代謝産物非依存調節発現系）
上述の通り、核ホルモン（例えば酵母、真菌、および細菌のステロイド誘導系）を使用することの大きな利点は、ステロイド受容体反応性誘導因子分子が宿主真菌、酵母、または細菌微生物の代謝経路に対して、けして影響を及ぼすことなく利用可能であるということである。異種タンパク質発現における細胞の生理学的シグナルからの独立は、当技術分野では達成困難であった。本発明は、ＨＥＲ存在下でネガティブおよびポジティブ・エレメントの組み合わせを含む代謝および発現調節には依存しない非哺乳類宿主細胞（例えば、真菌）での新規ステロイド調節発現系を提供する。本発明はまた、炭素および窒素調節に影響されない糸状菌および酵母での遺伝子発現を調節するための方法を提供する。本明細書中に例示したエストロゲン誘導発現系は、代謝および発育制御に影響されない（図６）。中間の発現レベル（微調整と同様に）は、異なる誘導因子濃度によるエレメントのモジュール方式の組み合わせによって、達成される。
【００３６】
（誘導因子分子）
誘導因子化合物は、宿主細胞が増殖している培地または培養液中に容易に添加される。誘導因子化合物は、細胞によって取り込まれ、あるいは細胞膜を介して受動的に拡散し、その同族受容体に結合して、該受容体の形態的変化を誘導し、同族ホルモン反応エレメントへの結合が可能になる。方法は、培地から誘導因子を取り除くこと（すなわち、カラム・クロマトグラフィの使用）、または該培地から誘導因子活性を取り除くこと（すなわち、誘導因子に拮抗する化合物の添加によって）を可能にする十分に確立されたものである。このことは、下等真核および細菌宿主細胞での以前の誘導可能な発現系および方法に対する改善を示している。
【００３７】
エストロゲン受容体に結合し、かつ標的核酸からの遺伝子発現を誘導または抑制するリガンドの例として、１７β−エストラジオール、ジエチルスチルベンストロール（ＤＥＳ）、ゼアラレノン（ＺＯＮ）、固定環４−ヒドロキシタモキシフェン、非ステロイド性スチルベン類似体、タモキシフェン、選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭＳ）のいずれか、４−１−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−フェニレンチル］フェノキシ酢酸、ラロキシフェン、エストロゲン、ＩＣ１１６４３８４（ＥＲアンタゴニスト）、およびＩＣ１８２，７８０が挙げられる。他の周知のリガンド（およびその同族受容体）として、コルチゾール（ＣＯＲＴ受容体）、アンドロゲン（アンドロゲン受容体）、プロゲステロン（プロゲステロン受容体）、アルドステロン（鉱質コルチコイド受容体）、ならびにトリヨードチロニン（Ｔ３受容体）、ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｄ３受容体）、およびレチノイド（オールトランス・レチン酸および９−シス・レチン酸）受容体（各々ＲＡＲおよびＲＸＲ）の２つの種類を含む非ステロイド・ホルモンが挙げられる。エストロゲン受容体基質の濃度を変えることで、同様にＲＩＰ１４０（遺伝子発現を経てインビボで合成または外因的に付加）等のエストロゲン受容体共同因子の添加によって、転写活性化または抑制のレベルが影響されることが、十分に理解される。
【００３８】
植物および真菌由来ステロイド様化合物もまた、ステロイド受容体媒介遺伝子発現の誘導に用いることが可能である。植物由来エストロゲン化合物として、フラボン、イソフラボン、フラバノン、クマリン、カルコン、および真菌エストロゲンが挙げられる。フィトエストロゲンおよび植物リグナン（大豆製品で豊富に見つかる）は、強力なエストロゲン的性質を持つ。８−プレニルナリンゲニン（８−ＰＮ）は、ホップおよびビールに存在するフィトエストロゲンであり、その機能性はＩＣＩ １８２，７８０によって阻害され、また１７β−エストラジオールの作用を模倣する。甘草粗エキス（グラブリジン）由来の主要なイソフラビンは、インビボおよびインビトロで、エストロゲン受容体アゴニストの度合いの変化を示す。グラグレンおよびイソリキリチゲニン（２’，４’，４−３ヒドロキシ・カルコン）は、エストロゲン受容体に結合することが知られており、アゴニスト活性（両方とも、甘草粗エキスに由来）を示す。植物病原性のフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株、例えばデオキシニバレノール（Ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ、ＤＯＮ）またはゼラレノンはエストロゲンを模倣したものであり、ｈＥＲを活性化する。したがって、上記植物のいずれか、または真菌に由来するエストロゲン様化合物例を、エストロゲン受容体媒介遺伝子発現の誘導に用いることが可能である。
【００３９】
（スタッファー・フラグメント）
スタッファー・フラグメントは、「活性化」ホルモン（例えばステロイド）受容体とコア・プロモータ結合ポリメラーゼとの間に最適な間隔を与える。この最適間隔は、クロマチン構造の履歴および変更が妥当にシフトすることを規定することで、転写を効率的に開始させ、コア・プロモータですでに組み立てられる転写機構との直接接触を規定し、転写のために必要な因子の動員のために、アクセスできる核酸を規定し、ＤＮＡに適当な１カ所または複数箇所の屈曲またはねじれを与えることで、転写因子とポリメラーゼとのあいだに適当な接触を可能にし、さもなければＤＮＡに適当な１カ所または複数箇所の屈曲またはねじれを与えることで、転写に必要な構成要素の効率的な結合を可能にする。これらのモードのいずれかがスタッファー・フラグメントが働く機構を示すことができ、それによって遺伝子の発現または抑制が可能となる。
【００４０】
好ましいスタッファー・フラグメントの長さは、約７５〜約２５０ヌクレオチドである。より望ましくは、スタッファー・フラグメントの長さは、約１００〜約２００ヌクレオチドであり、さらに好ましくは約１００〜約１５０ヌクレオチドである。当業者は、ランダム・スタッファー・フラグメント核酸を、当技術分野で十分に確立された方法を用いて、所望の長さおよび遺伝子発現活性についてスクリーニングすることが可能であることを認識する。好ましいスタッファー配列は、図３に示すように、ＵＲＡ ３核酸フラグメントを含み（配列番号１）、またｎｉｒＡＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓプロモータの９７ｂｐフラグメント（ＡＴＧを含む）を含む。選択されたｎｉｒＡプロモータＤＮＡフラグメントと共にＵＲＡ３スタッファー・フラグメントは、ＤＥＳ（図１）および（図７）によって誘導されたＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓでの所望の遺伝子発現を与える。ＵＲＡ３プロモータ・フラグメントとＮｉｒＡ遺伝子プロモータ・フラグメントとの特定の組み合わせは、スタッファー領域がない場合、ＥＲの不能性をもたらし、ホルモン刺激後のレポーター遺伝子発現を活性化させる。例えば、ｕｒａ３フラグメントと、ＣＴがリッチな配列と付加的なＴＡＴＡ配列を含むｎｉｒＡプロモータ・フラグメントとの直接融合は、ＤＥＳによって誘導可能ではないコンストラクトを与える（実施例２参照）。スタッファー・フラグメントの選択および改善は、特に所望の遺伝子発現特性を与えるかどうかを基礎として、おこなうことが可能である。
【００４１】
より好ましい実施形態では、ＪＵＮＫエレメントに一般に結合したＵＲＡ３核酸フラグメントに一般に結合したエストロゲン反応エレメントの組み合わせによって、ａｌｃＡのものと等しいレベルで転写が開始される（図９）。ＪＵＮＫエレメントとして、限定されるものではないが、任意のヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。しかし、好ましくはＥ．ｃｏｌｉのβ−ラクタマーゼである。その組み合わせについて驚くべきことは、ＪＵＮＫエレメントの相対的位置が劇的に誘導のレベルに影響するということである（図９）。ＪＵＮＫエレメントによる誘導可能な発現系をスクリーニングして修飾し、所望のレベルに発現を調節する。今日まで、他のモチーフと組み合わせたＥＲＥの活性化に対するプロモータ・セット・アップの影響は、酵母または糸状菌では決定されなかった。したがって、本発明は、相対的に簡易で、かついかなる代謝産物にも影響されずに調節しうる誘導発現系の必要について言及する。
【００４２】
（ステロイド反応エレメント）
ホルモン反応エレメント（ＨＲＥ）は、ホルモンによる遺伝子発現活性化に必要である短いシス作用配列（大きさが約２０塩基対）である。ＨＲＥを、さもなければホルモン非反応性であるコード配列に、作動可能に結合することができる。そのような結合は、現在ホルモン反応性である遺伝子を規定する。ＨＲＥは、ホルモンまたはリガンドの有無に対する依存性にもとづいて、他のエンハンサー配列から区別される。
【００４３】
ステロイド受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニスト・リガンドの結合は、ほとんどの場合、受容体の二量体化をもたらす。例えば、エストロゲン受容体αおよびβをホモ二量体化することができ、それほど多くはないが、ヘテロ二量体化することができる。リガンド結合受容体は、標的遺伝子の調節領域にある配列（ステロイド応答エレメント）を認識して該配列に結合する。同族反応エレメントに結合した受容体によってＤＮＡの屈曲が誘導することが可能であり、該屈曲は重要な転写構成要素の相互作用を促進する。一旦結合すると、受容体は一般の転写因子、共同活性因子、抑制因子、およびクロマチン再構築を制御するタンパク質、標的遺伝子発現の活性化または抑制のためのシグナルとして機能することが可能である。
【００４４】
一実施形態では、修飾活性因子タンパク質を用いた遺伝子抑制を達成するモードは、活性領域に突然変異を起こさせ、ＥＲＥが天然のエンハンサー配列と重なっているプロモータを構築することを介する。したがって、エストロゲンによる突然変異ヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）遺伝子発現の活性化、ｈＥＲタンパク質はＥＲＥと結合して天然の活性因子と競合する。
【００４５】
十分に特徴づけられ、かつこのようにして機能するステロイド受容体の例は、エストロゲン受容体である。活性化エストロゲン受容体は、ＤＮＡ配列（エストロゲン反応エレメント、またはＥＲＥ）と高親和性で結合する。エストロゲン受容体は、二量体の頭合せ配列にあるパリンドローム繰り返しに結合する。最小のＥＲＥコンセンサス配列は、配列番号２によって定まる（５’−ＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣ−３’、式中、ｎは任意のヌクレオチド）。
【００４６】
本明細書中で用いられるように、改変ＨＲＥとは、遺伝子工学的技術（例えば、ヌクレオチド置換および欠失）を用いて、組み換え的に産生されたＨＲＥのことをいう。また、本発明のＨＲＥは、当技術分野で十分に確立された技術（自動ヌクレオチド合成等）を用いて、インビトロで合成することが可能である。
【００４７】
目的のステロイド受容体をコードする核酸コンストラクトが、天然に生ずるステロイド受容体をコードすることに限定されるものではないことが、理解されるべきである。キメラ受容体を構築して遺伝子発現系で用いることは周知である。
【００４８】
（ステロイド受容体）
ホルモン（例えば、目的とするステロイド受容体）をコードしている核酸は、当業者に周知の技術を用いて構築してもよい。ステロイド受容体スーパーファミリーの分子性状に基づいて、上記したように、新規核ホルモン受容体が構築され、以前に記述されている（例えば、ＥＰ ０７９８ ３７８ Ａ２を参照せよ）。インビボで受容体タンパク質を発現する遺伝的コンストラクトを調製する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，（１９９４およびＳｕｐｐｓ．ｔｏ ２００２）を参照せよ）。ステロイド受容体コード化核酸コンストラクトの複数のコピーが、最適な発現のために一体化されてもよい。さらに、ステロイド受容体が構成的に、または調整された方法で、転写されてもよい。当技術分野の状況を鑑みれば、受容体の調節された発現を求めることが可能であり、またそのような調整を生成する方法は周知である。異なる受容体のＬＢＤおよび／またはＤＢＤを含むキメラ受容体をキメラ結合によって産生することが可能である。しかし、最も好ましくは、カップリングが、必要なステロイド受容体ドメインをコードする核酸配列を融合することで、標準的な分子生物学的方法によるＤＮＡレベルで達成される。上記したように、ステロイド受容体は、一般的な転写因子、共同活性因子、抑制因子、クロマチン再構成を調節するタンパク質、標的遺伝子発現の活性化または抑制のためのシグナルとして機能することができる（例えば、受容体遺伝子技術を用いる）。
【００４９】
（コア・プロモータ）
コア・プロモータは、任意のトランス活性化タンパク質が存在しない場合に、通常は「オフ」状態にある天然のコア・プロモータを代表するものであってもよい。言い換えれば、遺伝子発現の実質的なレベルは、ＲＮＡポリメラーゼと組み合わさって「活性化タンパク質」が存在する場合のみ、イニシエートされる。そのようなプロモータの例として、ｎｉｒＡプロモータがあり、該プロモータは一般的な転写因子とポリメラーゼ・タンパク質・サブユニットが集合する。当業者に周知のことは、コア・プロモータのＴＡＴＡ配列（転写開始部位の約２５ヌクレオチド上流に位置）がＴＡＴＡ結合タンパク質によって認識され、またこの初期結合が他の転写結合因子と転写に必要なＲＮＡポリメラーゼとの集合プロセスをトリガーする。しかし、プロモータの性質があれば、現在構成された設定での高レベルの転写が適当に開始される。適当な上流（５’）配列が活性ステロイド・ホルモン受容体によって結合される。一旦結合すると、これらの配列は、スタッファー・フラグメントと組み合わさって、所望の遺伝子発現活性化を与える。
【００５０】
コア・プロモータは、一般の転写因子とポリメラーゼとの完全な相補体が適当に結合する上で要求される配列に依存して、長さが変えることが可能である。
【００５１】
好ましいコア・プロモータは、ｎｉｒＡプロモータ（配列番号３）である。ｎｉｒＡプロモータの９４ｂｐフラグメントもまた好ましい（配列番号４）。付加的なＣＴリッチ配列およびＴＡＴＡ配列を含むｎｉｒＡプロモータの２８７ｂｐフラグメントまた、遺伝的コンストラクトに取り込み可能ではあるが、このコンストラクトは、活性化されたｈＥＲとＥＲＥとによって引き起こされる活性化機能が欠けている（配列番号５）。また、他の実施形態は完全長プロモータｎｉｒＡ（配列番号６）のフラグメントによって、３８２ｂｐフラグメントを利用する。さらに、ランダム・スタッファー配列は、遺伝子発現活性化および／または抑制に基づいて選択可能である。方法は、遺伝子発現の修飾、減衰、抑制、または活性化をおこなう配列のスクリーニングまたは選択に対して、十分に開発されている。
【００５２】
（目的とするタンパク質をコードしている標的遺伝子）
標的遺伝子核酸配列は、本明細書中に含まれる情報および参照文献ならびに当業者に公知の技術を用いて調整する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，（１９９４）を参照せよ）。これらの技術として、（ｉ）目的とする配列（例えば、ゲノム源から）を増幅するためにポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いること、（ｉｉ）化学合成、ならびに（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製が含まれる。発現される配列に対して制限酵素認識部位５’および３’を同定し、そのオリジナルの源もしくはベクターから発現される配列を切り離し、該配列を系の存在下で適当なプロモータに作動可能に結合することを含む。別の組み換えアプローチは、適当なＰＣＲプライマーによって、目的とする配列を増幅させることである。関連配列に対する修飾は、例えば、部位定方向突然変異誘発を介して、取り込まれることが理解される。
【００５３】
好ましい実施形態では、例えば、改変下等真核宿主でステロイド誘導することで本発明の標的ヌクレオチド配列から発現した組み換えタンパク質を、ＷＯ ０２／００８７９で開示される方法（その明細書を本明細書中に援用する）を使用して、さらに改変して「ヒト様」糖タンパク質（すなわち、ヒトの相対物に対して、実質的に同一ではない場合、類似している糖タンパク質）とすることが可能である。本明細書中に開示される単細胞および多細胞真菌は、現在開示されている調節可能な遺伝子発現系で用いられる。通常単細胞および多細胞真菌を含む下等真核生物（通常、Ｎ−グリカンを含んでいる高マンノースを生産する）を修飾して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２等のＮ−グリカンまたはヒト・グリコシル化経路沿った他の構造を生成することが可能である。そのような真菌として、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ，Ａ．ａｗａｍｏｒｉ，Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ，Ａ．ｓａｉｔｏｉ，Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｉｐｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｔｌｉｕｍ ｓｐ．、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａが挙げられる。同様に、メチロトローフ酵母が用いられ、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｔａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．、ａｎｄ Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｓｐ．が挙げられる。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが、より好ましい実施形態の宿主である。
【００５４】
（構成的プロモータ）
ステロイド受容体のプロモータ駆動発現は、好ましくは構成的プロモータである。構成的プロモータのよく知られた例が存在する。構成プロモータの例として、例えば、ＧＡＰＤＨ（ＴＤＨ３）、ＡＤＨ１、エノラーゼ・プロモータ、またはグルセルアルデヒド−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ）プロモータが挙げられる。構成的プロモータは、本明細書中ではプロモータとして定義されており、該プロモータは誘導因子を必要とせず、また目的とする標的遺伝子の活性化または抑制に対して有効である一定量のステロイド受容体の直接発現に対して、かなりアクティブである。
【００５５】
現在開示された発明は、以下の非限定的実施例と添付の図面とによって、さらに詳しく説明する。
【実施例】
【００５６】
（実施例１）
（核酸コンストラクトおよび株の形質転換）
以下は、目的とする株の形質転換に用いられるプラスミドを構築するための一般的な戦略である。
【００５７】
（プラスミドｐｈＥＲｐｙｒ４の構成（図１））
プラスミドＹｅｐ９０−ＨＥＧＯ（Ｐｉｅｒｒａｔら、１９９２）のｈＥＲ含有１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを、ヒト・エストロゲン受容体１（Ａｃｃ．ＮＭ００１２５）の発現を駆動するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｚ３２５２４）由来の構成プロモータｇｐｄＡを有するｐＢＫＳＩＩ＋主鎖（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）内のＰｇｐｄ−ＴｔｒｐｃコンストラクトのＮｃｏＩ部位にクローニングした。末端配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ Ｘ０２３９０）由来のｔｒｐＣターミネータを有する。マーカー遺伝子は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ（Ａｃｃ．Ｕ０５１９２）由来のｐｙｒ４（オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ）である。結果として生ずるＰｇｐｄ−ｈＥＲ−Ｔｔｒｐｃカセットを、ＳｐｅＩ／ＣｌａＩフラグメントとして、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉのｐｙｒ４遺伝子を選択マーカーとして含むプラスミドにクローニングすることで、プラスミドｐｈＥＲｐｙｒ４が得られる。
【００５８】
（ｌａｃＺレポーター・コンストラクトの一般的構造）
シス作用エレメント：３つの構成エストロゲン反応エレメント（ＥＲＥ）は、遺伝学的にＵＲＡ３ スタッファー・フラグメントの５’末端に結合している。スタッファー・フラグメントの３’末端は、ＡＴＧを含むＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓのｎｉｒＡプロモータの一部の５’末端に遺伝学的に結合する（図５Ａおよび５Ｃ）。
【００５９】
（プラスミドｐＲＭ２１２４の構成（図２））
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ａｃｅ．Ｍ１２９２６，８９−２０５塩基）（Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓら、１９９２）とＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｍ６８９００）のｎｉｒＡプロモータの３８７ｂｐフラグメントとが後に続く３ｘＥＲＥ配列を、ＰＣＲを用いて増殖させ、ＢａｍＨＩ／ＢｇＩＩＩフラグメントとして、ｐＡＮ９２３−４２ＢｇＩＩＩのＢａｍＨＩ部位に、クローニングさせた（Ｐｕｎｔら、Ｇｅｎｅ ９３，１０１−１０９（１９９０））。構造遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ由来のレポーターｌａｃＺである（Ａｃｃ．Ｖ００２９６）。マーカー遺伝子はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｅ．ＡＢ０２０７３７）由来のａｒｇＢである。ターミネータ配列として、ＡＳｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｘ０１２３９０）由来のｔｒｐＣターミネータを含む（Ａｃｃ．Ｘ０１２３９０）。
【００６０】
（プラスミドｐＲＭ２１１９の構成（図３））
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ａｃｅ．Ｍ１２９２６，８９−２０５塩基）（Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓら、１９９２）とＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｍ６８９００）のｎｉｒＡプロモータの２９２ｂｐフラグメントとが後に続く３ｘＥＲＥ配列を、ＰＣＲを用いて増殖させ、ＢａｍＨＩ／ＢｇＩＩＩフラグメントとして、ｐＡＮ９２３−４２ＢｇＩＩＩのＢａｍＨＩ部位に、クローニングさせた（Ｐｕｎｔら、Ｇｅｎｅ ９３，１０１−１０９（１９９０））。構造遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ由来のレポーターｌａｃＺである（Ａｃｃ．Ｖ００２９６）。マーカー遺伝子はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｅ．ＡＢ０２０７３７）由来のａｒｇＢである。ターミネータ配列として、ＡＳｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｘ０２３９０）由来のｔｒｐＣターミネータを含む。レポーター遺伝子発現は、誘導体が対外から供給された場合にこのコンストラクトを有する酵母細胞で、何ら観察されない。
【００６１】
（プラスミドｐＲＭ２０８５の構成（図４））
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ａｃｅ．Ｍ１２９２６，８９−２０５塩基）（Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓら、１９８８）とＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｍ６８９００）のｎｉｒＡプロモータの９４ｂｐフラグメントとが後に続く３ｘＥＲＥ配列を、ＰＣＲを用いて増殖させ、ＢａｍＨＩ／ＢｇＩＩＩフラグメントとして、ｐＡＮ９２３−４２ＢｇＩＩＩのＢａｍＨＩ部位に、クローニングさせた（Ｖａｎ Ｇａｒｃｏｍら、１９８６）。構造遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ由来のレポーターｌａｃＺである（Ａｃｃ．Ｖ００２９６）。マーカー遺伝子はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｅ．ＡＢ０２０７３７）由来のａｒｇＢである。ターミネータ配列として、ＡＳｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａｃｃ．Ｘ０２３９０）由来のｔｒｐＣターミネータを含む。
【００６２】
（ｐＥＲＥ ＵＲＡ ＪＵＮＫの構成）
ｐＲＭ２０８５のｎｉｒＡプロモータ・フラグメントを破棄し、ｐＢＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のａｍｐＲ遺伝子のＯＲＦの９４ｂｐフラグメントで置き換えた。
【００６３】
（ｐＥＲＥ ＪＵＮＫ ｎｉｒＡの構成）
ｐＲＭ２０８５のＵＲＡ３プロモータ・フラグメントを破棄し、ｐＢＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のａｍｐＲ遺伝子のＯＲＦの１１７ｂｐフラグメントで置き換えた。
【００６４】
（ｐＲＭ ａｌｃＡの構成）
ｐＲＭ２０８５のＥＲＥ ＵＲＡ ｎｉｒＡカセットを破棄し、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのａｌｃＡプロモータの４２７ｂｐフラグメントで置き換えた（Ｇｗｙｎｎｅ，Ｄ．１ら、Ｇｅｎｅ ５１，２０５−２１６（１９８７））。
【００６５】
（実施例２）
（培養条件）
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株を、適当なサプリメントを含む最小培地（Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏら、１９５３）で、１２〜１４時間、３７℃、１８０ｒｐｍで増殖させた。異なる誘導因子濃度を試験するために、この株を濾過して回収し、異なる誘導因子濃度を含む新鮮な培地にアリコートを移し、さらに８時間にわたって増殖をおこなった。終わりには、菌糸体を濾過によって収集し、液体窒素で凍結した。タイムカーブ実験のために、株を収集してさらに２４時間増殖させ、２、４、６、８、および２４時間後に試料を採取して液体窒素で凍結した。大きくなった、そして、２４時間の試料はされた、そして、液体窒素で凍結した。図９は、誘導因子、エタノール（ａｌｃ）またはＤＥＳ（ｈＥＲ）のいずれかによって、活性化させた後のレポーター・コンストラクトの発現レベルを示す。等量の真菌菌体量を新鮮な培地に移し、アリコートをアゴニストによる誘導にかけた。所望の時点でサンプリングをおこなった後、湿潤細胞ペレットを記載通りに処理した。
【００６６】
（実施例３）
（レポーター酵素アッセイ）
ＮａＰＯ４緩衝液およびガラスビーズ（０．７５〜１．０ｍｍ）を凍結した菌糸に添加し、ハイベード・リボライザー（Ｈｙｂａｉｄ ＲｉｂｏＬｙｓｅｒ）を用いて細胞の破砕をおこなった。細胞片を遠沈殿法によって分離し、上清を酵素アッセイに用いた。タンパク質濃度は、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）のＢＳＡアッセイを用いて決定し、特異的β−ガラクトシダーゼ活性はインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールを用いて測定した。図１０は、実験の全セットを通じて使用された反応条件下で、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）によって得たタンパク質標準曲線（表１）である。所定の試料のタンパク質濃度の決定は、これらの標準条件に基づいておこなった。また、特異的酵素活性レベル（単位β−ガラクトシダーゼ）はタンパク質１ｍｇあたりの単位（単位／ｍｇタンパク質）に相関した。
【００６７】
較正曲線をプロットして、ＤＥＳ［μｇ／μｌ」の濃度とタンパク質濃度［単位／ｍｇ］との相関関係を示す。試料のタンパク質濃度は、１ｍｇのタンパク質あたりの単位として、特異的活性の発現が決定される（表２）。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２−１】
【００７０】
【表２−２】
（実施例４）
（異なるリガンド濃度でのプレート上での増殖試験／Ｘ Ｇａｌ活性試験）
０．１ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｍＭ、および１μＭのＤＥＳ誘導体を、形質転換株（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｒｇＢ２、ｒｉｂｏＡ１，ｐｙｒＧ８９、ｐｙｒｏＡ４）でのＬａｃＺに対するＸｇａｌ基質を有する培地プレートに対して添加することで、エストロゲン受容体導入をおこなった。図６。結果は、２０μＭまでの濃度のＤＥＳ濃度が野生型株の増殖に影響をおよぼさないことを示している。１ｎＭ ＤＥＳでのレポーター・コンストラクトの活性化は、形質転換された真菌でみいだされる。ｈＥＲによって形質転換された株の増殖抑制は、レポーター・コンストラクトによって形質転換された株で１００ｎＭのＤＥＳで示された。
【００７１】
（実施例５）
（液体培養でのＸ Ｇａｌ活性試験）
図７は、Ｘｇａｌ含有液体培養でのβ−Ｇａｌ活性のためのアッセイを示す。１単位は、２８℃で１分間あたりに１ｎＭのＯＮＰＧを加水分解する酵素の量として定義される。結果によれば、誘導体ＤＥＳ（１ｎＭおよび１０ｍＭ）は、βＧａｌ活性に基づいたＬａｃＺの発現を強く誘導した。実施例３を参照せよ。
【００７２】
（実施例６）
（ｐＲＭコンストラクトのβ−ｇａｌ活性）
異なる濃度のＤＥＳを用いてβ−ｇａｌ活性を測定した。表３は、異なるｐＲＭレセプター・コンストラクトを用いた誘導レベルを示す。図８は、表３のアッセイをグラフ表示したものである。
【００７３】
【表３】
（実施例７）
（ｐＥＲＥコンストラクトでのβ−ｇａｌ活性）
各ｐＥＲＥコンストラクトでのβ−ｇａｌ活性を、１ｎＭ ＤＥＳによる誘導後にアッセイした。ａｌｃＡ発現もまた、比較のためにアッセイした。実施例３を参照せよ。ｐＥＲＥ ＵＲＡ Ｊｕｎｋの組み合わせによって、最も高い誘導レベルが得られた。表４は、時間経過に伴うｐＥＲＥコンストラクトでのβ−ｇａｌレベルの誘導を示す。
【００７４】
【表４】
（実施例８）
（異なる炭素および窒素源を用いてｐＥＲＥ ＵＲＡ ｎｉｒＡコンストラクトでのβＧＡｌ活性）
異なる炭素および窒素源を含む所定のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ最小培地を用いて、標準的な条件下で株の増殖をおこなった。１ｎＭのＤＥＳによる誘導８時間後に、培養物を採取し、特異的β−ガラクトシダーゼ活性を測定してタンパク質１ｍあたりの単位として表した。標準として、炭素源として１％グルコース上で、また窒素源として５ｍＭアンモニア上で増殖した培養物を採取して分析し、それらの三重反復試料あたり平均してタンパク質１ｍｇあたりの平均単位として用い、参照発現レベル（すなわち、１００％）の設定に用いた。表５および６（図１１および１２は表５および６のグラフ表示である）は、異なる濃度ならびに異なる炭素源および窒素源で増殖させた培養物から得た参照レベルの百分率である（Ｇｌｕ：グルコース、Ａｒａ：アラビノース、Ｘｙｌ：キシロース、ＭＭ：最小培地）
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
（参考文献）
【００７７】
【表７】
（配列表）
（配列番号１）
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ１２９２６
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１１７ｂｐ ｕｒａ３ プロモータ
（配列番号２）
５’−ＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣ−３’
式中、ｎは任意のヌクレオチド
（配列番号３）
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ８６９００
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｎｉｒＡ プロモータ
（配列番号４）
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ８６９００
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｎｉｒＡ プロモータの９４ｂｐフラグメント
（配列番号５）
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ８６９００
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｎｉｒＡ プロモータの２８７ｂｐフラグメント
（配列番号６）
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ８６９００
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｎｉｒＡ プロモータの３８２ｂｐフラグメント
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１はｐｈＥＲｐｙｒ４のプラスミド・マップを示す。
【図２】図２はｐＲＭ２１２４のプラスミド・マップを示す。
【図３】図３はｐＲＭ２１２９のプラスミド・マップを示す。
【図４】図４はｐＲＭ２０８５のプラスミド・マップを示す。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、ＵＲＡ３、ｎｉｒＡプロモータ（続いてレポーター・タンパク質に結合）に遺伝的に結合した３つの連続的なエストロゲン反応エレメントの構造を示す。
【図６】図６は、異なるリガンド濃度でＸｇａｌプレート上で形質転換されたＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓａｒｇＢ２、ｒｉｂｏＡ１、ｐｙｒＧ、ｐｙｒｏＡ４の増殖活性を示す。
【図７】Ｘｇａｌを含む液体培養でのβ−Ｇａｌ活性についてのアッセイの結果を示す。
【図８】ｐＲＭ２０８５、ｐＲＭ２１１９、および ｐＲＭ２１２４で形質転換したＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓでのβ−Ｇａｌ活性についてのアッセイを示す。
【図９】ａｌｃＡ発現と比較して、ｐＥＲＥレポーター・コンストラクトにより形質転換されたＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓでのβ−Ｇａｌ活性のアッセイを示す。
【図１０】タンパク質濃度の較正曲線を示す。
【図１１】異なる代謝産物でのβ−Ｇａｌ活性のアッセイを示す。
【図１２】異なる代謝産物でのβ−Ｇａｌ活性のアッセイを示す。
【図１３】ＪＵＮＫエレメント修飾タンパク質を含むプラスミドを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌でのステロイド誘導プロモータ発現系であって、該誘導プロモータ発現系を調節することができる、ステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項２】
糸状菌でのステロイド誘導プロモータ発現系であって、
（ａ）調節タンパク質に作動可能に結合した第１のプロモータと、
（ｂ）標的核酸分子に作動可能に結合した調節可能なプロモータとを有し、
該調節可能なプロモータは、効果的外来性誘導因子の存在下、該調節タンパク質によって活性化され、それにより、該誘導因子の投与は該標的核酸分子の発現を生じ、該誘導因子の除去または拮抗は該標的核酸分子の発現を止める、ステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項３】
前記調節タンパク質が、該調節タンパク質が結合するプロモータ領域を含む核酸分子に対して物理的に結合しない核酸コンストラクトから発現される、請求項１または２に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項４】
前記調節可能なプロモータがエストロゲン受容体である、請求項２に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項５】
前記プロモータは、活性化または抑制のためのスタッファー・フラグメントをさらに含む、請求項１または２に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項６】
ベクターであって、糸状菌で発現されるｐＲＭ２０８５、ｐＲＭ２１２４、ｐＲＭ２１１９、ｐＥＲＥ ＵＲＡ ＪＵＮＫ、ｐＥＲＥ ＵＲＡ ｎｉｒＡ、およびｐＥＲＥ ＪＵＮＫ ｎｉｒＡからなる群から選択されるベクター。
【請求項７】
前記糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ａ．ｓａｉｔｏｉ、Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｉｐｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項８】
単細胞酵母でのステロイド誘導プロモータ発現系であって、該誘導プロモータ発現系を調節することができる、ステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項９】
単細胞酵母でのステロイド誘導プロモータ発現系であって、
（ａ）調節タンパク質に作動可能に結合した第１のプロモータと、
（ｂ）標的核酸分子に作動可能に結合した調節可能なプロモータとを有し、
該調節可能なプロモータは、効果的外来性誘導因子の存在下、該調節タンパク質によって活性化され、それにより、該誘導因子の投与は該標的核酸分子の発現を生じ、該誘導因子の除去または拮抗は該標的核酸分子の発現を止める、ステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項１０】
前記調節タンパク質が、該調節タンパク質が結合するプロモータ領域を含む核酸分子に対して物理的に結合しない核酸コンストラクトから発現される、請求項９に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項１１】
前記調節可能なプロモータがエストロゲン受容体である、請求項８または９に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項１２】
前記プロモータは、活性化または抑制のためのスタッファー・フラグメントをさらに含む、請求項８または９に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項１３】
ベクターであって、メチロトローフ酵母で発現されるｐＲＭ２０８５、ｐＲＭ２１２４、ｐＲＭ２１１９、ｐＥＲＥ ＵＲＡ ＪＵＮＫ、ｐＥＲＥ ＵＲＡ ｎｉｒＡ、およびｐＥＲＥ ＪＵＮＫ ｎｉｒＡからなる群から選択されるベクター。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のステロイド誘導プロモータ発現系であって、該単細胞酵母は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．、およびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｓｐ．からなる群から選択される、ステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項１５】
糸状菌または単細胞酵母での遺伝子発現を調節するための方法であって、調節された遺伝子発現カセットを用いて標的核酸分子を誘導するステップを含み、該遺伝子発現セットが、
（ａ）調節タンパク質に作動可能に結合した第１のプロモータと、
（ｂ）標的核酸分子に作動可能に結合した調節可能なプロモータとを有し、
該調節可能なプロモータは、効果的外来性誘導因子の存在下、該調節タンパク質によって活性化され、それにより、該誘導因子の投与は標的遺伝子の発現を生じ、該誘導因子の除去または拮抗は発現を止める、方法。
【請求項１６】
糸状菌または単細胞酵母であって、調節することができる誘導プロモータ発現系を含む、糸状菌または単細胞酵母。
【請求項１７】
請求項１６に記載の糸状菌または単細胞酵母であって、
標的核酸分子が調節可能な遺伝子発現カセットによって制御され、該遺伝子発現セットが、
（ａ）調節タンパク質に作動可能に結合した第１のプロモータと、
（ｂ）標的核酸分子に作動可能に結合した調節可能なプロモータとを有し、
該調節可能なプロモータは、効果的外来性誘導因子の存在下、該調節タンパク質によって活性化され、それにより、該誘導因子の投与は標的遺伝子の発現を生じ、該誘導因子の除去または拮抗は発現を止める、糸状菌または単細胞酵母。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の糸状菌または単細胞酵母であって、該糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ａ．ｓａｉｔｏｉ、Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｉｐｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群から選択される、糸状菌または単細胞酵母。
【請求項１９】
請求項１６または１７に記載の糸状菌または単細胞酵母であって、該単細胞酵母は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．、およびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｓｐ．からなる群から選択される、糸状菌または単細胞酵母。
【請求項１】
糸状菌でのステロイド誘導プロモータ発現系であって、該誘導プロモータ発現系を調節することができる、ステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項２】
糸状菌でのステロイド誘導プロモータ発現系であって、
（ａ）調節タンパク質に作動可能に結合した第１のプロモータと、
（ｂ）標的核酸分子に作動可能に結合した調節可能なプロモータとを有し、
該調節可能なプロモータは、効果的外来性誘導因子の存在下、該調節タンパク質によって活性化され、それにより、該誘導因子の投与は該標的核酸分子の発現を生じ、該誘導因子の除去または拮抗は該標的核酸分子の発現を止める、ステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項３】
前記調節タンパク質が、該調節タンパク質が結合するプロモータ領域を含む核酸分子に対して物理的に結合しない核酸コンストラクトから発現される、請求項１または２に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項４】
前記調節可能なプロモータがエストロゲン受容体である、請求項２に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項５】
前記プロモータは、活性化または抑制のためのスタッファー・フラグメントをさらに含む、請求項１または２に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項６】
ベクターであって、糸状菌で発現されるｐＲＭ２０８５、ｐＲＭ２１２４、ｐＲＭ２１１９、ｐＥＲＥ ＵＲＡ ＪＵＮＫ、ｐＥＲＥ ＵＲＡ ｎｉｒＡ、およびｐＥＲＥ ＪＵＮＫ ｎｉｒＡからなる群から選択されるベクター。
【請求項７】
前記糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ａ．ｓａｉｔｏｉ、Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｉｐｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項８】
単細胞酵母でのステロイド誘導プロモータ発現系であって、該誘導プロモータ発現系を調節することができる、ステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項９】
単細胞酵母でのステロイド誘導プロモータ発現系であって、
（ａ）調節タンパク質に作動可能に結合した第１のプロモータと、
（ｂ）標的核酸分子に作動可能に結合した調節可能なプロモータとを有し、
該調節可能なプロモータは、効果的外来性誘導因子の存在下、該調節タンパク質によって活性化され、それにより、該誘導因子の投与は該標的核酸分子の発現を生じ、該誘導因子の除去または拮抗は該標的核酸分子の発現を止める、ステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項１０】
前記調節タンパク質が、該調節タンパク質が結合するプロモータ領域を含む核酸分子に対して物理的に結合しない核酸コンストラクトから発現される、請求項９に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項１１】
前記調節可能なプロモータがエストロゲン受容体である、請求項８または９に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項１２】
前記プロモータは、活性化または抑制のためのスタッファー・フラグメントをさらに含む、請求項８または９に記載のステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項１３】
ベクターであって、メチロトローフ酵母で発現されるｐＲＭ２０８５、ｐＲＭ２１２４、ｐＲＭ２１１９、ｐＥＲＥ ＵＲＡ ＪＵＮＫ、ｐＥＲＥ ＵＲＡ ｎｉｒＡ、およびｐＥＲＥ ＪＵＮＫ ｎｉｒＡからなる群から選択されるベクター。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のステロイド誘導プロモータ発現系であって、該単細胞酵母は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．、およびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｓｐ．からなる群から選択される、ステロイド誘導プロモータ発現系。
【請求項１５】
糸状菌または単細胞酵母での遺伝子発現を調節するための方法であって、調節された遺伝子発現カセットを用いて標的核酸分子を誘導するステップを含み、該遺伝子発現セットが、
（ａ）調節タンパク質に作動可能に結合した第１のプロモータと、
（ｂ）標的核酸分子に作動可能に結合した調節可能なプロモータとを有し、
該調節可能なプロモータは、効果的外来性誘導因子の存在下、該調節タンパク質によって活性化され、それにより、該誘導因子の投与は標的遺伝子の発現を生じ、該誘導因子の除去または拮抗は発現を止める、方法。
【請求項１６】
糸状菌または単細胞酵母であって、調節することができる誘導プロモータ発現系を含む、糸状菌または単細胞酵母。
【請求項１７】
請求項１６に記載の糸状菌または単細胞酵母であって、
標的核酸分子が調節可能な遺伝子発現カセットによって制御され、該遺伝子発現セットが、
（ａ）調節タンパク質に作動可能に結合した第１のプロモータと、
（ｂ）標的核酸分子に作動可能に結合した調節可能なプロモータとを有し、
該調節可能なプロモータは、効果的外来性誘導因子の存在下、該調節タンパク質によって活性化され、それにより、該誘導因子の投与は標的遺伝子の発現を生じ、該誘導因子の除去または拮抗は発現を止める、糸状菌または単細胞酵母。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の糸状菌または単細胞酵母であって、該糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ａ．ｓａｉｔｏｉ、Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｉｐｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａからなる群から選択される、糸状菌または単細胞酵母。
【請求項１９】
請求項１６または１７に記載の糸状菌または単細胞酵母であって、該単細胞酵母は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．、およびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｓｐ．からなる群から選択される、糸状菌または単細胞酵母。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００６−５１１２２０（Ｐ２００６−５１１２２０Ａ）
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６２５８２（Ｐ２００４−５６２５８２）
【出願日】平成１５年１２月２３日（２００３．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４１３５７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９４７
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月２３日（２００３．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４１３５７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９４７
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
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