遺伝子発現情報に基づく薬物有害反応の予測方法
【課題】薬物有害反応を予測できる遺伝子を同定する方法および薬物の薬物有害反応を予測する方法を提供すること。
【解決手段】薬物の１日最大使用量と最高血中濃度の相関に基づいて、薬物の１日最大使用量１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の各範囲における回帰直線の中央位置に相当する最高血中濃度の値±１０％を至適の薬物曝露濃度とする、上記方法、ならびに、ヒト由来の細胞を、被検薬物に、該薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析して、被検薬物の有害反応を予測する方法であって、至適の薬物曝露濃度及び遺伝子が、上記方法によって決定される濃度および遺伝子であることとする、上記方法。
【解決手段】薬物の１日最大使用量と最高血中濃度の相関に基づいて、薬物の１日最大使用量１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の各範囲における回帰直線の中央位置に相当する最高血中濃度の値±１０％を至適の薬物曝露濃度とする、上記方法、ならびに、ヒト由来の細胞を、被検薬物に、該薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析して、被検薬物の有害反応を予測する方法であって、至適の薬物曝露濃度及び遺伝子が、上記方法によって決定される濃度および遺伝子であることとする、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現情報に基づく薬物有害反応の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の新薬開発プロセスでは、まず、ラット、マウスなどの動物を用いて安全性および有効性を検討し、安全性および有効性が確認された薬物についてのみ、ヒトを対象とする臨床試験を行う。しかし、齧歯類などの実験動物では薬物有害反応（毒性）が確認されず、臨床試験（ヒト）で初めて薬物有害反応を示したり、数千例を検討して初めて薬物有害反応を示す薬物が現れることがあり、その場合、その薬物の開発や販売が中止されることがある。ここまでの開発プロセスで１０年以上かかるといわれており、コストもかかる。このように臨床試験段階になって開発を中止したり販売を中止せざるを得ない状況になることを避けるため、薬物を動物または細胞に曝露し、遺伝子発現解析を行って、ゲノムレベルで毒性発現メカニズムの解明や毒性予測を行う、いわゆるトキシコゲノミクスが発展しつつある。
【０００３】
トキシコゲノミクスについて、例えば非特許文献１に、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラットに、強い腎毒性剤のシスプラチン等を大量（例えば０．１〜５ｍｇ／ｋｇ）に投与してラットの腎臓に障害を起こさせ、その腎臓からＲＮＡを抽出し、マイクロアレイで遺伝子発現を分析して毒性発現メカニズムを検討し、発現に変化のあった遺伝子に基づいてクラスタリングを行って、腎臓毒性のバイオマーカーとして使用できる遺伝子を選択することが開示されている。
【０００４】
また、非特許文献２に、ＨａｎＢｒｌ：Ｗｉｓｔｅｒ雄ラットに強い肝毒性の化合物（例えばアフラトキシンＢ１など２６種類）を投与して肝障害を起こさせ、その肝臓からＲＮＡを抽出し、マイクロアレイで肝細胞の遺伝子発現を分析し、サポートベクターマシンを用いて遺伝子を分類し、肝障害のバイオマーカーとして使用し得る遺伝子を同定することが開示されている。
【０００５】
しかし、これらの実験では、腎障害または肝障害が当然起きる量を実験動物に投与しており、実際の臨床における投与の条件と大きく異なる。また、薬物に対する生体反応のヒトと動物間の種差が存在するため、実験動物による薬物有害反応の研究には限界がある。更に、多数の薬物の有害反応の予測を、より効率的に行える手法が求められている。
【０００６】
また、特許文献１には、サンプルを薬物に曝露し、サンプルに含まれる少なくとも２つの遺伝子の薬物に対する反応をモニタリングし、遺伝子における薬物の反応の相違をコントラスト分析し、各遺伝子のサマリースコアを構築してロジスティック回帰を行い、その結果により薬物の毒性に関する予測モデルを提供することが開示されている。
【０００７】
特許文献２には、被検薬物を細胞又は微生物に接触させ、特定遺伝子の転写により生成されるＲＮＡを標的ＲＮＡとして、標的ＲＮＡ中の特定配列と同一または相補的な配列のＲＮＡを特異的に増幅させる工程と、増幅工程により増幅されたＲＮＡを検出することにより、特定遺伝子の発現によって標的ＲＮＡが転写されたか否かを検知する工程を含む被検薬物の薬効又は毒性の評価方法が開示されている。
【０００８】
特許文献３には、被検薬物の肝毒性を予測する方法であって、被検薬物の存在下または不存在下で肝細胞をインキュベーションし、被検薬物の存在下または不存在下でのバイオマーカーペプチドのレベルを比較し、被検薬物の存在下でのバイオマーカーのポリペプチドが上昇した場合、その薬物は肝毒性を起こすと予測する方法が開示されている。
【０００９】
【非特許文献１】Ｒｕｐｅｓｈ Ｐ．Ａｍｉｎら，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ−Ｂａｓｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｒｅｎａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ"，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｍａｒｃｈ ２００４，ｖｏｌ．１１２，Ｎｏ．４，ｐ．４６５−４７９
【非特許文献２】Ｇｕｉｄｏ Ｓｔｅｉｎｅｒら，“Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ Ｔｏｘｉｃａｎｔｓ ｂｙ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ”，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ ２００４，Ｖｏｌ．１１２，Ｎｏ．１２，ｐ．１２３６−１２４８
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１９２６７１号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１０８９３０号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／０２６５８８９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、安全、容易、迅速に、コストをかけずに、多くの薬物について臨床（ヒト）での薬物の使用に近い条件で有害反応を予測できる遺伝子の同定方法、およびその遺伝子を用いた薬物有害反応を予測する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記問題を解決すべく、ヒトの細胞への薬物の曝露濃度、曝露時間、データの分析方法などを鋭意検討し、本発明を完成した。
【００１２】
即ち本発明は、以下の特徴を有する。
（１）ヒト由来の細胞を、薬物有害反応を現す薬物および現さない薬物に、薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析し、薬物有害反応に関与する遺伝子を同定することを含む、薬物有害反応を予測するための遺伝子を同定する方法であって、
薬物の１日最大使用量と最高血中濃度の相関に基づいて、薬物の１日最大使用量１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の各範囲における回帰直線の中央位置に相当する最高血中濃度の値±１０％を至適の薬物曝露濃度とすることを特徴とする、上記方法。
（２）至適の薬物曝露濃度が、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μｇ／ｍｌ±１０％、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ±１０％、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌ±１０％である、（１）に記載の方法。
（３）薬物の薬理作用により分類された複数の薬物グループ間で、発現が変化した遺伝子数のばらつきが最も少ない時間を薬物の曝露時間として決定することをさらに含む、（１）または（２）に記載の方法。
（４）薬物の曝露時間が１２〜４８時間である、（３）に記載の方法。
（５）ヒト由来の細胞がプライマリー細胞または不死化細胞である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）遺伝子発現の変化を、ハイブリダイゼーションまたは定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出する、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）統計学的手法がサポートベクターマシンである、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）薬物有害反応が腎障害である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）ヒト由来の細胞を、被検薬物に、該薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析して、被検薬物の有害反応を予測する方法であって、
至適の薬物曝露濃度及び遺伝子が、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法によって決定される濃度および遺伝子であることを特徴とする、上記方法。
（１０）至適の薬物曝露濃度が、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μｇ／ｍｌ±１０％、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ±１０％、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌ±１０％である、（９）に記載の方法。
【００１３】
（１１）薬物の薬理作用により分類された複数の薬物グループ間で、発現が変化した遺伝子数のばらつきが最も少ない時間を薬物の曝露時間として決定することをさらに含む、（９）または（１０）に記載の方法。
（１２）薬物の曝露時間が１２〜４８時間である、（１１）に記載の方法。
（１３）ヒト由来の細胞がプライマリー細胞または不死化細胞である、（９）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）遺伝子発現の変化を、ハイブリダイゼーションまたは定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出する、（９）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）統計学的手法が、サポートベクターマシンである、（９）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）薬物有害反応が腎障害である、（９）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）予測遺伝子が、配列番号１〜３２で表される塩基配列および該塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む腎障害予測遺伝子からなる群から選択される、（９）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）（１７）で定義された腎障害予測遺伝子の塩基配列および該塩基配列の少なくとも１５塩基からなる断片配列からなる群から選択された塩基配列を含むＤＮＡが固定された、薬物腎障害予測用ＤＮＡ固定化担体。
（１９）担体が、石英、ガラスまたはポリマーである、（１８）に記載の担体。
（２０）ＤＮＡマイクロアレイである、（１８）または（１９）に記載の担体。
【００１４】
本明細書において、薬物有害反応とは、投与された薬物に起因する生体に対するあらゆる有害な反応をいい、当該薬物との因果関係が否定できないものをいう。
【００１５】
本明細書において、薬物のヒトにおける１日最大使用量とは、医薬品の添付文書に基づく１日に使用される最大の用量をいう。
【００１６】
本明細書において、薬物のヒトにおける最高血中濃度とは、ヒトへの薬物投与後の血中濃度の極大値をいい、医薬品の添付文書などに例えばＣｍａｘ値として記載されている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、薬物有害反応の予測に用いることができる遺伝子を効率的かつ簡易に同定することができる。また、明らかに薬物有害反応を起こす毒性の強い薬物以外の薬物でもその有害反応を調べることができる。更に、ヒト細胞における薬物有害反応を、一度に多くの候補薬物について、安全、容易、迅速に低コストで調べることができ、その精度も高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１．薬物有害反応の予測遺伝子を同定する方法
本発明の薬物有害反応を予測するための遺伝子を同定する方法は、ヒト由来の細胞を、薬物有害反応を現す薬物および現さない薬物に、薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析し、薬物有害反応に関与する遺伝子を同定することを含む方法であって、薬物の１日最大使用量と最高血中濃度の相関に基づいて、薬物の１日最大使用量１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の各範囲における回帰直線の中央位置に相当する最高血中濃度の値±１０％を至適の薬物曝露濃度とすることを特徴とする。
重要なことは、薬物曝露濃度および曝露時間の決定と、その薬物曝露濃度での薬物有害反応に関与する遺伝子の同定である。
【００１９】
（１）本発明に用いる細胞
薬物に曝露する細胞はヒト由来細胞であり、好ましくはプライマリー細胞（すなわち、初代培養細胞）または不死化細胞、例えばＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ感染により増殖能を獲得したＥＢＶ不死化末梢血リンパ球細胞、不死化Ｂ細胞などを用いることができ、特に限定されない。これらの細胞はセルバンク（理化学研究所バイオソースセンター）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などから入手可能である。また、例えば日本国内において本発明を適用する場合、日本人由来の細胞が好ましいと考えられる。
【００２０】
（２）本発明に用いる薬物
曝露に用いる薬物は、薬物有害反応を現す薬物と現さない薬物の両方を含むように選択し、細胞をそれらの薬物に曝露したときに、細胞の遺伝子が相対的に異なる発現を示せば特に限定されない。例えば、薬物有害反応を現す薬物により発現が変化するが、薬物有害反応を現さない薬物では発現が変化しない遺伝子が、薬物有害反応の予測遺伝子の候補となり得る。本発明は、例えば日本または外国で医薬品として承認されている薬物の有害反応を予測できる遺伝子を同定することを含むので、例えば、医薬品の添付文書の記載から薬物有害反応を現す薬物および現さない薬物を選択することができる。薬物有害反応が腎障害の場合、曝露する薬物の腎障害の有無は、その薬物の添付文書に臨床上の副作用としてヒトにおいて腎機能障害、急性腎不全などが現れた等の記載から分別できる。他の薬物有害反応、例えば、肝障害、肺障害、消化管障害、神経障害などについても同様である。
【００２１】
（３）薬物曝露濃度の決定方法
本発明者らは、薬物の１日最大使用量と最高血中濃度（Ｃｍａｘ値）が相関関係を有することを見出した。
１日最大使用量とＣｍａｘ値が分かっている８０種類の薬物（薬物有害反応を現す薬物、現さない薬物を含む）について、薬物の添付文書中の用法の１日あたり最大使用量（ｍｇ）（ｐｅｒ ｋｇ記載のものは６０ｋｇとして、体表面積記載のものは１．５ｍ２で計算）と、Ｃｍａｘ（μｇ／ｍｌ）（複数のＣｍａｘ値が記載されていた場合には大きい方の数字を採用）を調べた。そして、グラフのＸ軸に１日最大使用量（ｌｏｇ）、Ｙ軸にＣｍａｘ値（ｌｏｇ）をとってプロットし、これらの相関係数を求めたところ、約０．８６であり（図１）、比較的高い正の相関があることが分かった。次に、Ｘ軸の１日最大使用量を、１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の範囲に分け、各範囲における回帰直線の中央位置に相当するＹ軸のＣｍａｘ値±１０％を至適の薬物曝露濃度とした。
【００２２】
このようにして決定された好ましい薬物曝露濃度は、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μｇ／ｍｌ±１０％、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ±１０％、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌ±１０％である（図１）。これらの薬物曝露濃度は、どの薬物有害反応にも、どの薬物にも適用可能である。また、薬物曝露濃度を、各範囲に応じてそれぞれ１つだけ、即ち０．０５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌに決定してもよい。
【００２３】
従来の薬物曝露実験では、各薬物に応じて異なる幅のある薬物曝露濃度で煩雑な実験が行なわれていたが、本発明では、薬物曝露実験を上記３つの薬物曝露濃度で行えばよく、実験が簡便化される。また、上記３つの薬物曝露濃度を用いることにより、薬物有害反応関連遺伝子を適正かつ容易に同定することを可能にし、その遺伝子発現の変化を検出することによって、薬物の有害反応を容易に評価することができる。
【００２４】
（４）薬物曝露時間の決定方法
薬物曝露時間は、多数の薬物について検討する場合、実験の簡易性、迅速性、実験条件の統一などを勘案すると、同じ曝露時間に揃えることが好ましい。本発明では、薬物の薬理作用により分類された複数の薬物グループ間で、発現が変化した遺伝子数のばらつきが最も少ない時間を薬物曝露時間として、以下のように決定される。
ある共通した薬物有害反応（例えば腎障害、肝障害など）を現すことが分かっている複数の薬物を、薬理作用によりいくつかの薬物グループに分類する。そして薬物グループごとに、上記（３）で決定された薬物曝露濃度で、曝露時間を例えば１０分、６０分、６時間、２４時間として、ヒト細胞を薬物に曝露する実験を行う。
【００２５】
曝露前と上記時間が経過した曝露後の細胞のＲＮＡを抽出する。フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ラジオアイソトープ（例えば３２Ｐ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃなど）、ビオチン、ローダミン、ジゴキシゲニンなどを用いて、抽出したＲＮＡから標識ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを合成する。
【００２６】
上記標識ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡについてハイブリダイゼーション（例えばＤＮＡマイクロアレイ法、サザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマクロアレイ法など）または定量ＲＴ−ＰＣＲを行う。
【００２７】
ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で行うことができる。ストリンジェントな条件は、例えば３０〜５０℃で２〜６×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、その後、０．１〜１×ＳＳＣ、０．１〜０．２％ＳＤＳ中、室温での洗浄などの条件を含む。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）である。
【００２８】
市販のヒトゲノム解析用ＤＮＡマイクロアレイ（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を使用する場合は、その取扱説明書に記載されている方法およびハイブリダイゼーション条件に厳密に従うことが望ましい。
【００２９】
定量ＲＴ−ＰＣＲは、生体組織由来のＲＮＡから逆転写（ＲＴ）によりｃＤＮＡを調製し、１対のプライマーを、鋳型としてのｃＤＮＡとハイブリダイズさせてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、生成した２本鎖ＤＮＡを、内部標準物質（例えばβ−アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子）を用いて定量することを含む。
【００３０】
ハイブリダイゼーションまたは定量ＲＴ−ＰＣＲにより、遺伝子発現の変化を測定し、各薬物曝露時間、各薬物グループごとに、薬物有害反応を現す薬物に細胞を曝露したときの発現量に変化が見られた遺伝子の発現量の平均と、薬物有害反応を現さない薬物に曝露したときの遺伝子の発現量の平均の比をとって薬物グループ間で相対的に比較し、各薬物グループごとに、発現量が変化した遺伝子の数を決定し、その遺伝子の数のばらつきが最も少ないときの曝露時間を、至適の薬物曝露時間とする（図２）。
【００３１】
また、薬物曝露時間を決定する際に、例えばボルケーノプロット法を用いることができる。
ボルケーノプロットとは、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ（上記薬物グループのそれぞれにおける、薬物有害反応を表す薬物に曝露した細胞の遺伝子の発現量の平均と、薬物有害反応を現さない薬物に曝露した細胞の遺伝子の発現量の平均との比であり、値が１未満の場合、例えば０．７５であれば、有害反応を現さない薬物に曝露していない細胞の遺伝子の発現量の平均よりも２５％低いことを意味し、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値は約−１．３になる）と有意差（ｐ値）の関係を表す手法である。具体的には、グラフのＸ軸にＦｏｌｄ値の対数（２を底とする）、Ｙ軸にｐ値の対数（１０を底とする）をとり、例えばＸ軸で−１．０以下または＋１．０以上（つまり２倍以上の発現変化）でかつＹ軸で１．３以上（数値が大きいほどその効果が真であると期待される）に該当するプロット数（遺伝子数）を数え(図３)、全ての薬物グループにおいてどの薬物曝露時間であれば遺伝子数のばらつきが最も少ないかを検討することにより、本発明における薬物曝露時間を決定することができる。
このようにして決定された好ましい薬物曝露時間は、１２〜４８時間、より好ましくは２２〜２６時間、更に好ましくは２３〜２５時間である。これらの曝露時間は、肝障害などの他の障害にも適用可能である。
【００３２】
（５）ＲＮＡサンプルおよびデータのフィルタリング
ヒト由来細胞から抽出したＲＮＡの質が悪いと、信頼性のあるデータが得られない。そこで、ＲＮＡサンプルを以下の２つのパラメータで評価して、分解、劣化、不純物混入等したＲＮＡサンプルを排除することが好ましい。
【００３３】
（ｉ）ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比
核酸の吸光度のピークは約２６０ｎｍにあり、約２６０ｎｍ以外にピークが見られる場合、その核酸溶液はコンタミネーションを起こしている可能性がある。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比は、好ましくは１．８〜２．０である。
【００３４】
（ｉｉ）ｒＲＮＡの２８Ｓ／１８Ｓ比
ＲＮＡサンプルを例えば電気泳動で分析すると、２８Ｓ ＲＮＡ、１８Ｓ ＲＮＡ等のピークが現れる。２８Ｓ ＲＮＡは特に分解されやすいので、ＲＮＡが分解されていると２８Ｓ ＲＮＡのピークが下がって幅が広くなったり、ベースラインが上がるので劣化が判断できる。２８Ｓ／１８Ｓ比は、好ましくは１．２以上、より好ましくは１．６〜２．４である。
【００３５】
また、ＲＮＡサンプルとＤＮＡチップを用いた実験後のデータについて、そのデータを解析するか否かを決定するフィルタリングを以下の３つのパラメータに基づいて行うことが好ましい。
【００３６】
（ｉｉｉ）パーセントプレゼント
パーセントプレゼントとは、全トランスクリプト中で発現有り（Ｐ）と判断されたトランスクリプトの割合（％）をいう。
パーセントプレゼントは、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐシステムのソフトウエア（ＧＣＯＳソフト、ＭＡＳソフト）においてパラメータとして出力される。パーセントプレゼントは好ましくは２５％以上である。
【００３７】
（ｉｖ）β−アクチンの３’末端／５’末端比
ＲＮＡが分解されていると、ラベリングを行ったときに５’末端側が標識できなくなるが、３’末端側は標識できることを利用して、ハウスキーピング遺伝子の１つであるβ−アクチンのＲＮＡの３’末端／５’末端比を調べる。
β−アクチンの３’末端と５’末端それぞれの発現量の比は、最も好ましくは１であるが、ラベリングシステムなどの要因により値が様々に変化する。従って、例えば、それぞれのラベリングシステムで３’末端／５’末端比のデータを集めておき、本発明で用いたいＲＮＡサンプルについて３’末端／５’末端比がはずれ値であった場合、そのサンプルは排除する。
【００３８】
（ｖ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の３’末端／５’末端比
β−アクチンと同様に、ＧＡＰＤＨのＲＮＡの３’末端と５’末端の発現量から、３’末端／５’末端比を調べ、はずれ値を示すＲＮＡサンプルは排除する。
（（ｉｖ）および（ｖ）の参考文献：Ｙａｓｕｏ Ｏｓｈｉｍａら，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ３’／５’ ｒａｔｉｏ ｏｆ Ａｃｔｉｎ ａｎｄ Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧＡＰＤＨ）”，Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００３，ｐｐ．４７２〜４３３）
【００３９】
（６）予測遺伝子の同定
上記（３）及び（４）の方法により決定された薬物曝露濃度および薬物曝露時間で曝露されたヒト由来の細胞の遺伝子発現を、ハイブリダイゼーションで検出し、例えばサポートベクターマシン（ＳＭＶ）を用いて予測遺伝子を同定することができる。ハイブリダイゼーションにＤＮＡチップを用いる場合、ＤＮＡチップから得られるデータについてノーマライゼーション、ノイズリダクションを行うことが好ましい。
【００４０】
（ｉ）ノーマライゼーション（補正）
各シグナル強度（数値化データ）の総計や中間値から補正係数を算出し、各シグナル強度を補正するグローバルノーマライゼーション、発現量が一定と推定できる遺伝子（ハウスキーピング遺伝子など）のシグナル強度から補正係数を算出し、各シグナル強度を補正するノーマライゼーションなどを行うことができる。
【００４１】
（ｉｉ）ノイズリダクション
ノイズリダクションは、プローブの局所的な物理的、化学的変化が周囲のプローブの測定値に影響を及ぼすことが原因となるチップ内のノイズや、サンプルの生物学的なばらつき、ハイブリダイゼーションのプロトコール、実験環境のばらつき、時間のずれ、チップ製造の際の不均一低などのチップ間のノイズを、減少させる。この手法は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３を用いて行うことができる。
【００４２】
（ｉｉｉ）ボルケーノプロット法によるフィルタリングおよびＳＶＭによる予測遺伝子の同定
上記遺伝子発現のデータを、ボルケーノプロットを用いてフィルターにかけることにより、可能性のある予測遺伝子を絞り込むことができる。例えばｐ値０．０５以下で、かつ例えばＦｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ１．６以上となるデータの遺伝子を予測遺伝子とする。ボルケーノプロットは、例えばＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３を用いて行うことができる。
また、更に別の統計学的分析方法を用いて、より好ましい予測遺伝子を同定することができる。本発明ではハイブリダイゼーションから得られる多数のデータを分析することから、サポートベクターマシン（ＳＶＭともいう）を用いることが好ましい。
【００４３】
ＳＶＭは、２クラスのデータの分類を行う学習機械である。予測空間に２つのグループを分ける識別平面を見出し、プロットが平面のどちら側にあるのかによりプロットを分類する。識別平面は一番近いプロットの距離（マージン：あるベクトルの方向で図った、学習データのクラス間の距離）ができるだけ大きくなるように計算される。ニューラルネットワークは線形の識別器であるが、カーネルトリックを使った非線形投射された空間を用いるＳＶＭは、より複雑なデータを分類することができる。さらにソフトマージンを用いれば多少の識別誤りを許すように制約を緩めることができる。ＳＶＭを用いて、既知のグループのサンプル群（トレーニングセットともいう）から、予測遺伝子を選び出す。ＳＶＭは、例えばＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３のソフトウエアを用いることができる。
【００４４】
具体的には、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３のＳＶＭのクロスバリデーション法を用い、トレーニングセットとして上記（４）の手順で得たハイブリダイゼーションあるいは定量ＲＴ−ＰＣＲの予測遺伝子のデータを与え、予測効率（予測正確性、予測感度、予測特異性および陽性尤度比、下記表１参照）が極大となるパラメータを探る。次に、ＳＶＭに、予測効率を極大とするパラメータと、トレーニングセットとして上記クロスバリデーション法で用いたハイブリダイゼーションの予測遺伝子のデータを与えて、予測空間と識別平面を見出す。
【００４５】
予測空間と識別平面を見出すとき、予測正確性が好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは極大になるように、ソフトマージンのファクター（Ｄｉａｇｏｎａｌ Ｓｃａｌｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒともいう）を設定することが好ましい。
【００４６】
本明細書における予測正確性、予測感度、予測特異性、陽性尤度比は、以下のように与えられる。
【００４７】
【表１】
予測正確性＝（ａ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）
予測感度＝ａ／（ａ＋ｃ）
予測特異性＝ｄ／（ｂ＋ｄ）
陽性尤度比＝｛ａ／（ａ＋ｃ）｝／｛ｂ／（ｂ＋ｄ）｝
【００４８】
予測正確性が例えば極大になったＤｉａｇｏｎａｌ Ｓｃａｌｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒと、上記トレーニングセットと、上記（４）と同じ手法で得た別のハイブリダイゼーションのデータをテストセットとして、ＳＶＭに与え、予測遺伝子を選び出す。
【００４９】
このようにして同定された予測遺伝子は、その塩基配列に対して好ましくは７０％、７５％、より好ましくは８０％、８５％、更に好ましくは９０％、９５％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する遺伝子も含まれる。同一性は、同一塩基数／全塩基数×１００（％）で与えられ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムにより検索することができる。
【００５０】
２．被検薬物の有害反応を予測する方法
上記１．の手法に従って、被検薬物について予測遺伝子のデータ（テストセット）を得る。次に、上記トレーニングセット、テストセットおよびパラメータをコンピュータに入力して出力する。コンピュータのソフトとして、例えばＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３のソフトウエアを用いることができる。
【００５１】
３．薬物有害反応予測用ＤＮＡ固定化担体
上記１．により同定された予測遺伝子のＤＮＡ、または１５塩基以上のそのＤＮＡ断片、例えば１５塩基〜全塩基、２０塩基〜全塩基、３０塩基〜全塩基、４０塩基〜全塩基、５０塩基〜全塩基、１００塩基〜全塩基、１５０塩基〜全塩基、２００塩基〜全塩基、あるいは前記ＤＮＡまたはＤＮＡ断片と７０％、７５％、より好ましくは８０％、８５％、更に好ましくは９０％、９５％、９８％、９９％以上の同一性を有するＤＮＡを固定した、薬物有害反応予測用ＤＮＡ固定化担体を作製できる。
【００５２】
固定化するＤＮＡは、ホスホアミダイト法、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法などで合成できる。例えばホスホアミダイト法では、担体に結合した３’末端ヌクレオシドを出発物質とし、この５’側に新たなヌクレオチドモノマーを付加する反応が繰り返されて、３’から５’方向へのＤＮＡ鎖伸長反応が行われる。好ましくは２０〜２００塩基、より好ましくは３０〜１５０塩基、更に好ましくは５０〜１００塩基のＤＮＡを合成する。ＤＮＡ合成のために、市販のＤＮＡ自動合成機を用いることができる。
【００５３】
ベクターにＤＮＡを組み込んでクローニングし、ＰＣＲ反応を用いてＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲ反応サイクルは、例えば変性工程で約９０〜９８℃、約１５秒〜５分、アニーリング工程で約３６〜６５℃、約３０秒〜１０分、伸長工程で約６５〜７５℃、約３０秒〜１０分を、約２０〜５０回サイクル行えばよい。ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲバッファー（例えば５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４〜９．０、２５℃）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、鋳型ＤＮＡ、ｄＮＴＰ、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどを含む。
【００５４】
増幅したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動などによって精製し、担体に固定化する。担体は特に限定されないが、例えば石英、ガラス、ポリマーなどの担体が好ましい。担体の形状は特に限定されず、その全体または一部が平坦な面を有する担体が好ましい。例えばスライドガラス（ポリＬ−リシンコート、シリレン化、シラン化などを行ってもよい）、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。固定化する際、市販のスポッティング装置などを用いてもよい。特にＤＮＡマイクロアレイについては多くの作製装置が市販されており、作製方法も担体上に直接ＤＮＡを合成する方法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）もある。例えばＤＮＡマイクロアレイについては、細胞工学別冊、ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法、村松正明、那波宏之監修、秀潤社、ｐ．２６−３４、サザンブロットについては、実験医学別冊、改訂第４版、新遺伝子工学ハンドブック、村松正實ら編、羊土社、ｐ．９０−９４、ＤＮＡマクロアレイについては、実験医学別冊、ポストゲノム時代の実験講座１、ゲノム機能研究プロトコール、辻本豪三ら編、羊土社、ｐ．７８−８３を参照して作製することができる。
【００５５】
以下、本発明の実施例を示すが、それらは単なる例示であり、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
薬物曝露濃度の決定
国内で医薬品として承認されている約２００種類の薬物について、腎障害の有無を添付文書の記載により分類した。腎障害を現す薬物を表２、腎障害を現さない薬物を表３に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
【表３】
【００５９】
上記表２及び３に記載の薬物のうち、１日最大使用量とＣｍａｘ値が分かった８０種類の薬物について、Ｘ軸に１日最大使用量（ｌｏｇ）、Ｙ軸にＣｍａｘ値（ｌｏｇ）をとってグラフを描いたところ、相関係数は０．８５９であり、Ｆｉｓｈｅｒのｒのｚ変換によるｐ値は、＜０．０００１であった（図１）。１日最大使用量を１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の３つの範囲に分け、各範囲における回帰直線の中央位置に相当する最高血中濃度の値±１０％を薬物曝露濃度とし、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μg／ｍｌ、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌとした。表２および３に、添付文書に記載された１日最大使用量および決定された薬物曝露濃度を示す。
【実施例２】
【００６０】
薬物曝露時間の決定
腎障害を現すことが知られている薬物を、以下の５つのグループに分けた。
グループ１：白金抗腫瘍化合物（シスプラチン、ネダプラチン、カルボプラチン）
グループ２：カルバペネム系抗生物質（イミペネム・シタスタチン（ＩＰＭ−ＣＳ）、パニペネム・ベタミプロン（ＰＡＰＭ−ＢＰ））
グループ３：アミノグリコシド系抗生物質（アミカシン（ＡＭＫ）、トブラマイシン（ＴＯＢ）、ジベカシン（ＤＫＢ）、ゲンタマイシン（ＧＭ）、イセパシン（ＩＳＰ））
グループ４：セファロスポリン系抗生物質（セフォゾプラン（ＣＺＯＰ）、セフタジジム（ＣＡＺ））
グループ５：免疫抑制剤（シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＰＳＣ−８３３、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、グスペリムス（ＮＫＴ−０１））
【００６１】
ヒト由来細胞（日本人由来ＥＢＶ不死化末梢血リンパ球細胞ＨＥＶ００３４、理化学研究所から入手）を、上記薬物曝露濃度の決定方法に従った曝露濃度で曝露し、曝露前、曝露後１０分、６０分、６時間、２４時間の遺伝子発現をＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭＨＧ−Ｕ１３３ ＤＮＡマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）で、添付文書に記載の手順に従って調べた。スキャナーはＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、解析ソフトはＧＣＯＳ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）を使用した。
【００６２】
薬物に曝露していない細胞のデータと比較して２倍以上の発現変化がみられ、かつ有意水準がｐ＜０．０１の遺伝子を選択し、更にボルケーノプロットによるフィルタリングを行った。グラフのＸ軸にＦｏｌｄ値の対数、Ｙ軸にｐ値の対数をとった散布図を描き、Ｘ軸で−１．０以下かつＹ軸で１．３以上にプロットされた遺伝子を下方制御された遺伝子、Ｘ軸で＋１．０以上かつＹ軸で１．３以上にプロットされた遺伝子を上方制御された遺伝子とした。例としてグループ５の免疫抑制剤に１０分間曝露させた場合と、免疫抑制剤の溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）に曝露した場合についてのボルケーノプロットのグラフを図３に示す。有意に発現が変化した遺伝子２９０のうち、２５遺伝子が下方制御された遺伝子、２６５遺伝子が上方制御された遺伝子（いずれも黒のドット）と同定された。
【００６３】
他のグループの薬物についても同様にして、各曝露時間での発現に変化があった遺伝子数を調べた。免疫抑制剤の場合、曝露時間１０分で発現変化を示す遺伝子数が最も多かったが、白金抗腫瘍化合物、カルバペネム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質では、時間経過に依存して発現変化を示す遺伝子数が増加する傾向が見られた。できるだけ多くのグループで、発現変化を示す遺伝子ができるだけ多く見られた（すなわち、遺伝子数のばらつきが最も少ない）時間を薬物曝露時間として決定した。図２から、薬物曝露時間を２４時間とした。
【実施例３】
【００６４】
腎障害予測遺伝子の同定と薬物の腎障害の予測
日本人由来ＥＢＶ不死化末梢血リンパ球細胞ＨＥＶ００３４ヒト由来細胞を約１．０×１０６個／ｍｌになるようにカルチャーディッシュに添加し、薬物を各曝露濃度になるように添加し、２４時間、３７℃でインキュベーションした。２４時間後、ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ社）のプロトコールに従い、細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出ＲＮＡサンプルのフィルタリングを行い、（ｉ）ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比が１．８以上、（ｉｉ）ｒＲＮＡの２８Ｓ／１８Ｓ比が１．６以上のサンプルを選択したところ、上記表２と表３の薬物２００種類中、実際に曝露実験を行った薬物１８０種類のうち、ＤＮＡマイクロアレイの解析に使用できるものは１２５種類になった。その薬物を表４に示す（表中のサンプルＩＤは、表２及び３のサンプルＩＤに対応する）。
【００６５】
【表４】
【００６６】
次に、Ｏｖａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍキット（ＮｕＧＥＮ社）のプロトコールに従ってｃＤＮＡの合成を行い、ビオチン標識されたｃＤＮＡを量産・精製した。得られた標識ｃＤＮＡを上記キットのプロトコールに記載された条件下で処理して、標識ｃＤＮＡを断片化した。これらの標識ｃＤＮＡを用いてＤＮＡマイクロアレイ法を行った。ＤＮＡマイクロアレイはＧｅｎｅＣｈｉｐ ＨＧ−Ｕ１３３キットを用い、そのプロトコールに従った。スキャナーはＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）を用い、スキャン画像を数値化したデータについてノーマライゼーションを行った。ノーマライゼーションは、数値化データ０．０１未満を、０．０１の発現とし、ハウスキーピング遺伝子の数値化データ、プローブセットごとの数値化データをチップごとに補正した。補正係数の算出は、各チップ内の９９のハウスキーピング遺伝子の中の中央値を示したものの値でチップ間のノーマライゼーションを行った。ここで、ハウスキーピング遺伝子は、腎障害のノーマライゼーション用ハウスキーピング遺伝子を用いた（以下、Ｂｅｔｔｅｒ ＨＫ遺伝子ともいう）。Ｂｅｔｔｅｒ ＨＫ遺伝子とは、Ｇｕｔｔｅ，ＡＪ，Ｄｚａｕ，ＶＪ，Ｇｌｕｅｃｋ，ＳＢ：Ｆｕｔｈｅｒ ｄｉｆｉｉｎｇ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ， ｏｒ “ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ，” ｇｅｎｅｓ Ｆｏｃｕｓ ｏｎ ”Ａ ｃｏｍｐｅｄｉｕｍ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ，”Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２，ｐｐ．９５−９６（２００１）に報告されているハウスキーピング遺伝子を、本発明の実験系（ヒト由来細胞を薬物に曝露してＤＮＡマイクロアレイで遺伝子発現を検出してデータ分析する）に用いて、変動の大きい２ＳＤ（標準偏差）を超える遺伝子を除き、残りの遺伝子を用いてさらに本発明の実験系に用いて変動の大きい遺伝子を除く、という作業を繰り返し、残った遺伝子である。Ｂｅｔｔｅｒ ＨＫ遺伝子９９個を遺伝子名で以下に示す（遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）などのデータバンクから入手できる）。
【００６７】
ＡＢＣＦ１、ＡＣＴＢ３４、ＡＮＡＰＣ５、ＡＲＦ１、ＡＲＦ３、ＡＳＣＣ３Ｌ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｂ、ＡＴＰ６Ｖ０Ｅ、ＢＡＴ１、Ｃ１Ｄ、Ｃ２ｏｒｆ２４、ＣＡＮＸ、ＣＡＰＮＳ１、ＣＢＸ３、ＣＦＬ１、ＣＯＸ４Ｉ１、ＤＡＤ１、ＤＤＸ５、ＤＵＬＬＡＲＤ、ＥＥＦ２、ＥＩＦ３Ｓ５、ＥＩＦ３Ｓ７、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＲＨ、ＦＡＵ、ＦＮＴＡ、ＧＡＰＤ、ＧＤＩ２、ＧＵＫ１、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＨＩＮＴ１、ＨＮＲＰＡ１、ＨＮＲＰＣ、ＨＮＲＰＤ、ＨＮＲＰＫ、ＨＮＲＰＭ、ＨＳＰＣ１１７、ＨＳＰＣＢ、ＩＫ、ＩＬＦ２、ＪＴＢ、ＫＡＲＳ、ＫＨＤＲＢＳ１、ＭＧＣ２７４９、ＭＹＳＴ２、ＮＡＲＳ、ＮＥＤＤ５、ＮＯＮＯ、ＮＰＭ１、ＯＡＺ１、ＰＡＲＫ７、ＰＲＰＦ８、ＰＳＭＢ２、ＲＨＯＡ、ＲＮＰ２４、ＲＮＰＳ１、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ４、ＲＰＬ６、ＲＰＬ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ３、ＳＦＲＳ９、ＳＬＣ２５Ａ３、ＳＭＡＰ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＰＡＧ７、ＳＲＰ１４、ＳＴＡＲＤ７、ＴＡＦ１０、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＣＥＢ２、ＵＳＰ２２、ＹＹ１、ＺＮＦ１４６、ＺＮＦ２５９。
【００６８】
次に、ノイズリダクションを行った。ノイズリダクションは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３のＦｉｌｔｅｒ ｏｎ Ｆｌａｇｓ機能を用いて、１２５サンプル中７５サンプル以上のサンプルで、ＰまたはＭのフラグ（ＰまたはＭのフラグならば適、Ａのフラグは不適を示す）を有するトランスクリプトのみを以下の解析に用いることとした。これは、６０％以上のトランスクリプトで発現ありと判断されていないものは、ノイズによる変動が大きく解析に影響し、解析結果が一定しないという経験値に基づき採用したノイズリダクション法である。この時点で、解析データにある４５０６３トランスクリプトが９３５１トランスクリプトに減少した。
【００６９】
また、得られたＤＮＡチップのデータについてのフィルタリングを、以下のパラメータで行った：（ｉｉｉ）パーセントプレゼントが２５％以上、（ｉｖ）β−アクチンのＲＮＡの３’末端／５’末端比が＜１００、（ｖ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの３’末端／５’末端比が＜１０。
【００７０】
更に、ボルケーノプロットにより腎障害を現す薬物と現さない薬物のデータを比較してフィルタリングを行った。ｐ値０．０５以下で、かつＦｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ１．６以上のデータの遺伝子のみを選択したところ、上記９３５１トランスクリプトが８９トランスクリプトに減少し、この８９の遺伝子を予測遺伝子の候補とした。ボルケーノプロットは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３を用いて行った。
【００７１】
次に、上記ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３のＳＶＭ計算機能のクロスバリデーション機能を用いて、上記８９の候補の腎障害予測遺伝子のデータ（ｄａｔａ ｓｅｔ ２００５）を与えた。予測効率が極大となる点を探り、この予測効率を極大とするパラメータを探った。パラメータを探るのに考えうる様々なパラメータを入力し、結果を評価することを繰り返すことで、最良の結果を示すパラメータを調べた。そのパラメータは以下の通りである。
【００７２】
【表５】
【００７３】
なお、表５のＤｉａｇｏｎａｌ Ｓｃａｌｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒは、例えば２０−４０のように、より広い値でも可能である。
【００７４】
ここで、上記８９の遺伝子のうち、３２個の遺伝子が腎障害予測遺伝子として絞り込まれた。３２個の腎障害予測遺伝子を以下の表６及び配列番号１〜３２に示す。
【００７５】
【表６】
【００７６】
ＳＶＭに上記パラメータと上記ｄａｔａ ｓｅｔ ２００５を与えて、予測空間と識別平面を見出した。次に表４に記載の薬物の別のマイクロアレイの腎障害予測遺伝子のデータ（ｄａｔａ ｓｅｔ ２００６）を与えて、結果を評価した。薬物有害反応の予測正確性等の評価を行ったところ、予測正確性＝８２．９％、予測特異性＝８５．０％、予測感度＝８０．６％、陽性尤度比＝５．３７であった。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、トキシコゲノミクスの分野で広く適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】薬物の１日最大使用量とＣｍａｘ値の相関を示す。
【図２】各曝露時間における５つの薬物グループでの発現量が有意に変化した遺伝子数を示す。
【図３】免疫抑制剤についてのボルケーノプロットを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現情報に基づく薬物有害反応の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の新薬開発プロセスでは、まず、ラット、マウスなどの動物を用いて安全性および有効性を検討し、安全性および有効性が確認された薬物についてのみ、ヒトを対象とする臨床試験を行う。しかし、齧歯類などの実験動物では薬物有害反応（毒性）が確認されず、臨床試験（ヒト）で初めて薬物有害反応を示したり、数千例を検討して初めて薬物有害反応を示す薬物が現れることがあり、その場合、その薬物の開発や販売が中止されることがある。ここまでの開発プロセスで１０年以上かかるといわれており、コストもかかる。このように臨床試験段階になって開発を中止したり販売を中止せざるを得ない状況になることを避けるため、薬物を動物または細胞に曝露し、遺伝子発現解析を行って、ゲノムレベルで毒性発現メカニズムの解明や毒性予測を行う、いわゆるトキシコゲノミクスが発展しつつある。
【０００３】
トキシコゲノミクスについて、例えば非特許文献１に、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラットに、強い腎毒性剤のシスプラチン等を大量（例えば０．１〜５ｍｇ／ｋｇ）に投与してラットの腎臓に障害を起こさせ、その腎臓からＲＮＡを抽出し、マイクロアレイで遺伝子発現を分析して毒性発現メカニズムを検討し、発現に変化のあった遺伝子に基づいてクラスタリングを行って、腎臓毒性のバイオマーカーとして使用できる遺伝子を選択することが開示されている。
【０００４】
また、非特許文献２に、ＨａｎＢｒｌ：Ｗｉｓｔｅｒ雄ラットに強い肝毒性の化合物（例えばアフラトキシンＢ１など２６種類）を投与して肝障害を起こさせ、その肝臓からＲＮＡを抽出し、マイクロアレイで肝細胞の遺伝子発現を分析し、サポートベクターマシンを用いて遺伝子を分類し、肝障害のバイオマーカーとして使用し得る遺伝子を同定することが開示されている。
【０００５】
しかし、これらの実験では、腎障害または肝障害が当然起きる量を実験動物に投与しており、実際の臨床における投与の条件と大きく異なる。また、薬物に対する生体反応のヒトと動物間の種差が存在するため、実験動物による薬物有害反応の研究には限界がある。更に、多数の薬物の有害反応の予測を、より効率的に行える手法が求められている。
【０００６】
また、特許文献１には、サンプルを薬物に曝露し、サンプルに含まれる少なくとも２つの遺伝子の薬物に対する反応をモニタリングし、遺伝子における薬物の反応の相違をコントラスト分析し、各遺伝子のサマリースコアを構築してロジスティック回帰を行い、その結果により薬物の毒性に関する予測モデルを提供することが開示されている。
【０００７】
特許文献２には、被検薬物を細胞又は微生物に接触させ、特定遺伝子の転写により生成されるＲＮＡを標的ＲＮＡとして、標的ＲＮＡ中の特定配列と同一または相補的な配列のＲＮＡを特異的に増幅させる工程と、増幅工程により増幅されたＲＮＡを検出することにより、特定遺伝子の発現によって標的ＲＮＡが転写されたか否かを検知する工程を含む被検薬物の薬効又は毒性の評価方法が開示されている。
【０００８】
特許文献３には、被検薬物の肝毒性を予測する方法であって、被検薬物の存在下または不存在下で肝細胞をインキュベーションし、被検薬物の存在下または不存在下でのバイオマーカーペプチドのレベルを比較し、被検薬物の存在下でのバイオマーカーのポリペプチドが上昇した場合、その薬物は肝毒性を起こすと予測する方法が開示されている。
【０００９】
【非特許文献１】Ｒｕｐｅｓｈ Ｐ．Ａｍｉｎら，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ−Ｂａｓｅｄ Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｒｅｎａｌ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ"，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｍａｒｃｈ ２００４，ｖｏｌ．１１２，Ｎｏ．４，ｐ．４６５−４７９
【非特許文献２】Ｇｕｉｄｏ Ｓｔｅｉｎｅｒら，“Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ Ｔｏｘｉｃａｎｔｓ ｂｙ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ”，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ ２００４，Ｖｏｌ．１１２，Ｎｏ．１２，ｐ．１２３６−１２４８
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１９２６７１号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１０８９３０号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／０２６５８８９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、安全、容易、迅速に、コストをかけずに、多くの薬物について臨床（ヒト）での薬物の使用に近い条件で有害反応を予測できる遺伝子の同定方法、およびその遺伝子を用いた薬物有害反応を予測する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記問題を解決すべく、ヒトの細胞への薬物の曝露濃度、曝露時間、データの分析方法などを鋭意検討し、本発明を完成した。
【００１２】
即ち本発明は、以下の特徴を有する。
（１）ヒト由来の細胞を、薬物有害反応を現す薬物および現さない薬物に、薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析し、薬物有害反応に関与する遺伝子を同定することを含む、薬物有害反応を予測するための遺伝子を同定する方法であって、
薬物の１日最大使用量と最高血中濃度の相関に基づいて、薬物の１日最大使用量１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の各範囲における回帰直線の中央位置に相当する最高血中濃度の値±１０％を至適の薬物曝露濃度とすることを特徴とする、上記方法。
（２）至適の薬物曝露濃度が、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μｇ／ｍｌ±１０％、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ±１０％、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌ±１０％である、（１）に記載の方法。
（３）薬物の薬理作用により分類された複数の薬物グループ間で、発現が変化した遺伝子数のばらつきが最も少ない時間を薬物の曝露時間として決定することをさらに含む、（１）または（２）に記載の方法。
（４）薬物の曝露時間が１２〜４８時間である、（３）に記載の方法。
（５）ヒト由来の細胞がプライマリー細胞または不死化細胞である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）遺伝子発現の変化を、ハイブリダイゼーションまたは定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出する、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）統計学的手法がサポートベクターマシンである、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）薬物有害反応が腎障害である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）ヒト由来の細胞を、被検薬物に、該薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析して、被検薬物の有害反応を予測する方法であって、
至適の薬物曝露濃度及び遺伝子が、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法によって決定される濃度および遺伝子であることを特徴とする、上記方法。
（１０）至適の薬物曝露濃度が、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μｇ／ｍｌ±１０％、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ±１０％、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌ±１０％である、（９）に記載の方法。
【００１３】
（１１）薬物の薬理作用により分類された複数の薬物グループ間で、発現が変化した遺伝子数のばらつきが最も少ない時間を薬物の曝露時間として決定することをさらに含む、（９）または（１０）に記載の方法。
（１２）薬物の曝露時間が１２〜４８時間である、（１１）に記載の方法。
（１３）ヒト由来の細胞がプライマリー細胞または不死化細胞である、（９）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）遺伝子発現の変化を、ハイブリダイゼーションまたは定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出する、（９）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）統計学的手法が、サポートベクターマシンである、（９）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）薬物有害反応が腎障害である、（９）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）予測遺伝子が、配列番号１〜３２で表される塩基配列および該塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む腎障害予測遺伝子からなる群から選択される、（９）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）（１７）で定義された腎障害予測遺伝子の塩基配列および該塩基配列の少なくとも１５塩基からなる断片配列からなる群から選択された塩基配列を含むＤＮＡが固定された、薬物腎障害予測用ＤＮＡ固定化担体。
（１９）担体が、石英、ガラスまたはポリマーである、（１８）に記載の担体。
（２０）ＤＮＡマイクロアレイである、（１８）または（１９）に記載の担体。
【００１４】
本明細書において、薬物有害反応とは、投与された薬物に起因する生体に対するあらゆる有害な反応をいい、当該薬物との因果関係が否定できないものをいう。
【００１５】
本明細書において、薬物のヒトにおける１日最大使用量とは、医薬品の添付文書に基づく１日に使用される最大の用量をいう。
【００１６】
本明細書において、薬物のヒトにおける最高血中濃度とは、ヒトへの薬物投与後の血中濃度の極大値をいい、医薬品の添付文書などに例えばＣｍａｘ値として記載されている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、薬物有害反応の予測に用いることができる遺伝子を効率的かつ簡易に同定することができる。また、明らかに薬物有害反応を起こす毒性の強い薬物以外の薬物でもその有害反応を調べることができる。更に、ヒト細胞における薬物有害反応を、一度に多くの候補薬物について、安全、容易、迅速に低コストで調べることができ、その精度も高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１．薬物有害反応の予測遺伝子を同定する方法
本発明の薬物有害反応を予測するための遺伝子を同定する方法は、ヒト由来の細胞を、薬物有害反応を現す薬物および現さない薬物に、薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析し、薬物有害反応に関与する遺伝子を同定することを含む方法であって、薬物の１日最大使用量と最高血中濃度の相関に基づいて、薬物の１日最大使用量１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の各範囲における回帰直線の中央位置に相当する最高血中濃度の値±１０％を至適の薬物曝露濃度とすることを特徴とする。
重要なことは、薬物曝露濃度および曝露時間の決定と、その薬物曝露濃度での薬物有害反応に関与する遺伝子の同定である。
【００１９】
（１）本発明に用いる細胞
薬物に曝露する細胞はヒト由来細胞であり、好ましくはプライマリー細胞（すなわち、初代培養細胞）または不死化細胞、例えばＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ感染により増殖能を獲得したＥＢＶ不死化末梢血リンパ球細胞、不死化Ｂ細胞などを用いることができ、特に限定されない。これらの細胞はセルバンク（理化学研究所バイオソースセンター）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などから入手可能である。また、例えば日本国内において本発明を適用する場合、日本人由来の細胞が好ましいと考えられる。
【００２０】
（２）本発明に用いる薬物
曝露に用いる薬物は、薬物有害反応を現す薬物と現さない薬物の両方を含むように選択し、細胞をそれらの薬物に曝露したときに、細胞の遺伝子が相対的に異なる発現を示せば特に限定されない。例えば、薬物有害反応を現す薬物により発現が変化するが、薬物有害反応を現さない薬物では発現が変化しない遺伝子が、薬物有害反応の予測遺伝子の候補となり得る。本発明は、例えば日本または外国で医薬品として承認されている薬物の有害反応を予測できる遺伝子を同定することを含むので、例えば、医薬品の添付文書の記載から薬物有害反応を現す薬物および現さない薬物を選択することができる。薬物有害反応が腎障害の場合、曝露する薬物の腎障害の有無は、その薬物の添付文書に臨床上の副作用としてヒトにおいて腎機能障害、急性腎不全などが現れた等の記載から分別できる。他の薬物有害反応、例えば、肝障害、肺障害、消化管障害、神経障害などについても同様である。
【００２１】
（３）薬物曝露濃度の決定方法
本発明者らは、薬物の１日最大使用量と最高血中濃度（Ｃｍａｘ値）が相関関係を有することを見出した。
１日最大使用量とＣｍａｘ値が分かっている８０種類の薬物（薬物有害反応を現す薬物、現さない薬物を含む）について、薬物の添付文書中の用法の１日あたり最大使用量（ｍｇ）（ｐｅｒ ｋｇ記載のものは６０ｋｇとして、体表面積記載のものは１．５ｍ２で計算）と、Ｃｍａｘ（μｇ／ｍｌ）（複数のＣｍａｘ値が記載されていた場合には大きい方の数字を採用）を調べた。そして、グラフのＸ軸に１日最大使用量（ｌｏｇ）、Ｙ軸にＣｍａｘ値（ｌｏｇ）をとってプロットし、これらの相関係数を求めたところ、約０．８６であり（図１）、比較的高い正の相関があることが分かった。次に、Ｘ軸の１日最大使用量を、１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の範囲に分け、各範囲における回帰直線の中央位置に相当するＹ軸のＣｍａｘ値±１０％を至適の薬物曝露濃度とした。
【００２２】
このようにして決定された好ましい薬物曝露濃度は、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μｇ／ｍｌ±１０％、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ±１０％、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌ±１０％である（図１）。これらの薬物曝露濃度は、どの薬物有害反応にも、どの薬物にも適用可能である。また、薬物曝露濃度を、各範囲に応じてそれぞれ１つだけ、即ち０．０５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌに決定してもよい。
【００２３】
従来の薬物曝露実験では、各薬物に応じて異なる幅のある薬物曝露濃度で煩雑な実験が行なわれていたが、本発明では、薬物曝露実験を上記３つの薬物曝露濃度で行えばよく、実験が簡便化される。また、上記３つの薬物曝露濃度を用いることにより、薬物有害反応関連遺伝子を適正かつ容易に同定することを可能にし、その遺伝子発現の変化を検出することによって、薬物の有害反応を容易に評価することができる。
【００２４】
（４）薬物曝露時間の決定方法
薬物曝露時間は、多数の薬物について検討する場合、実験の簡易性、迅速性、実験条件の統一などを勘案すると、同じ曝露時間に揃えることが好ましい。本発明では、薬物の薬理作用により分類された複数の薬物グループ間で、発現が変化した遺伝子数のばらつきが最も少ない時間を薬物曝露時間として、以下のように決定される。
ある共通した薬物有害反応（例えば腎障害、肝障害など）を現すことが分かっている複数の薬物を、薬理作用によりいくつかの薬物グループに分類する。そして薬物グループごとに、上記（３）で決定された薬物曝露濃度で、曝露時間を例えば１０分、６０分、６時間、２４時間として、ヒト細胞を薬物に曝露する実験を行う。
【００２５】
曝露前と上記時間が経過した曝露後の細胞のＲＮＡを抽出する。フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ラジオアイソトープ（例えば３２Ｐ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃなど）、ビオチン、ローダミン、ジゴキシゲニンなどを用いて、抽出したＲＮＡから標識ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを合成する。
【００２６】
上記標識ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡについてハイブリダイゼーション（例えばＤＮＡマイクロアレイ法、サザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマクロアレイ法など）または定量ＲＴ−ＰＣＲを行う。
【００２７】
ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で行うことができる。ストリンジェントな条件は、例えば３０〜５０℃で２〜６×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、その後、０．１〜１×ＳＳＣ、０．１〜０．２％ＳＤＳ中、室温での洗浄などの条件を含む。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）である。
【００２８】
市販のヒトゲノム解析用ＤＮＡマイクロアレイ（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を使用する場合は、その取扱説明書に記載されている方法およびハイブリダイゼーション条件に厳密に従うことが望ましい。
【００２９】
定量ＲＴ−ＰＣＲは、生体組織由来のＲＮＡから逆転写（ＲＴ）によりｃＤＮＡを調製し、１対のプライマーを、鋳型としてのｃＤＮＡとハイブリダイズさせてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、生成した２本鎖ＤＮＡを、内部標準物質（例えばβ−アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子）を用いて定量することを含む。
【００３０】
ハイブリダイゼーションまたは定量ＲＴ−ＰＣＲにより、遺伝子発現の変化を測定し、各薬物曝露時間、各薬物グループごとに、薬物有害反応を現す薬物に細胞を曝露したときの発現量に変化が見られた遺伝子の発現量の平均と、薬物有害反応を現さない薬物に曝露したときの遺伝子の発現量の平均の比をとって薬物グループ間で相対的に比較し、各薬物グループごとに、発現量が変化した遺伝子の数を決定し、その遺伝子の数のばらつきが最も少ないときの曝露時間を、至適の薬物曝露時間とする（図２）。
【００３１】
また、薬物曝露時間を決定する際に、例えばボルケーノプロット法を用いることができる。
ボルケーノプロットとは、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ（上記薬物グループのそれぞれにおける、薬物有害反応を表す薬物に曝露した細胞の遺伝子の発現量の平均と、薬物有害反応を現さない薬物に曝露した細胞の遺伝子の発現量の平均との比であり、値が１未満の場合、例えば０．７５であれば、有害反応を現さない薬物に曝露していない細胞の遺伝子の発現量の平均よりも２５％低いことを意味し、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値は約−１．３になる）と有意差（ｐ値）の関係を表す手法である。具体的には、グラフのＸ軸にＦｏｌｄ値の対数（２を底とする）、Ｙ軸にｐ値の対数（１０を底とする）をとり、例えばＸ軸で−１．０以下または＋１．０以上（つまり２倍以上の発現変化）でかつＹ軸で１．３以上（数値が大きいほどその効果が真であると期待される）に該当するプロット数（遺伝子数）を数え(図３)、全ての薬物グループにおいてどの薬物曝露時間であれば遺伝子数のばらつきが最も少ないかを検討することにより、本発明における薬物曝露時間を決定することができる。
このようにして決定された好ましい薬物曝露時間は、１２〜４８時間、より好ましくは２２〜２６時間、更に好ましくは２３〜２５時間である。これらの曝露時間は、肝障害などの他の障害にも適用可能である。
【００３２】
（５）ＲＮＡサンプルおよびデータのフィルタリング
ヒト由来細胞から抽出したＲＮＡの質が悪いと、信頼性のあるデータが得られない。そこで、ＲＮＡサンプルを以下の２つのパラメータで評価して、分解、劣化、不純物混入等したＲＮＡサンプルを排除することが好ましい。
【００３３】
（ｉ）ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比
核酸の吸光度のピークは約２６０ｎｍにあり、約２６０ｎｍ以外にピークが見られる場合、その核酸溶液はコンタミネーションを起こしている可能性がある。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比は、好ましくは１．８〜２．０である。
【００３４】
（ｉｉ）ｒＲＮＡの２８Ｓ／１８Ｓ比
ＲＮＡサンプルを例えば電気泳動で分析すると、２８Ｓ ＲＮＡ、１８Ｓ ＲＮＡ等のピークが現れる。２８Ｓ ＲＮＡは特に分解されやすいので、ＲＮＡが分解されていると２８Ｓ ＲＮＡのピークが下がって幅が広くなったり、ベースラインが上がるので劣化が判断できる。２８Ｓ／１８Ｓ比は、好ましくは１．２以上、より好ましくは１．６〜２．４である。
【００３５】
また、ＲＮＡサンプルとＤＮＡチップを用いた実験後のデータについて、そのデータを解析するか否かを決定するフィルタリングを以下の３つのパラメータに基づいて行うことが好ましい。
【００３６】
（ｉｉｉ）パーセントプレゼント
パーセントプレゼントとは、全トランスクリプト中で発現有り（Ｐ）と判断されたトランスクリプトの割合（％）をいう。
パーセントプレゼントは、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐシステムのソフトウエア（ＧＣＯＳソフト、ＭＡＳソフト）においてパラメータとして出力される。パーセントプレゼントは好ましくは２５％以上である。
【００３７】
（ｉｖ）β−アクチンの３’末端／５’末端比
ＲＮＡが分解されていると、ラベリングを行ったときに５’末端側が標識できなくなるが、３’末端側は標識できることを利用して、ハウスキーピング遺伝子の１つであるβ−アクチンのＲＮＡの３’末端／５’末端比を調べる。
β−アクチンの３’末端と５’末端それぞれの発現量の比は、最も好ましくは１であるが、ラベリングシステムなどの要因により値が様々に変化する。従って、例えば、それぞれのラベリングシステムで３’末端／５’末端比のデータを集めておき、本発明で用いたいＲＮＡサンプルについて３’末端／５’末端比がはずれ値であった場合、そのサンプルは排除する。
【００３８】
（ｖ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の３’末端／５’末端比
β−アクチンと同様に、ＧＡＰＤＨのＲＮＡの３’末端と５’末端の発現量から、３’末端／５’末端比を調べ、はずれ値を示すＲＮＡサンプルは排除する。
（（ｉｖ）および（ｖ）の参考文献：Ｙａｓｕｏ Ｏｓｈｉｍａら，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ３’／５’ ｒａｔｉｏ ｏｆ Ａｃｔｉｎ ａｎｄ Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧＡＰＤＨ）”，Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００３，ｐｐ．４７２〜４３３）
【００３９】
（６）予測遺伝子の同定
上記（３）及び（４）の方法により決定された薬物曝露濃度および薬物曝露時間で曝露されたヒト由来の細胞の遺伝子発現を、ハイブリダイゼーションで検出し、例えばサポートベクターマシン（ＳＭＶ）を用いて予測遺伝子を同定することができる。ハイブリダイゼーションにＤＮＡチップを用いる場合、ＤＮＡチップから得られるデータについてノーマライゼーション、ノイズリダクションを行うことが好ましい。
【００４０】
（ｉ）ノーマライゼーション（補正）
各シグナル強度（数値化データ）の総計や中間値から補正係数を算出し、各シグナル強度を補正するグローバルノーマライゼーション、発現量が一定と推定できる遺伝子（ハウスキーピング遺伝子など）のシグナル強度から補正係数を算出し、各シグナル強度を補正するノーマライゼーションなどを行うことができる。
【００４１】
（ｉｉ）ノイズリダクション
ノイズリダクションは、プローブの局所的な物理的、化学的変化が周囲のプローブの測定値に影響を及ぼすことが原因となるチップ内のノイズや、サンプルの生物学的なばらつき、ハイブリダイゼーションのプロトコール、実験環境のばらつき、時間のずれ、チップ製造の際の不均一低などのチップ間のノイズを、減少させる。この手法は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３を用いて行うことができる。
【００４２】
（ｉｉｉ）ボルケーノプロット法によるフィルタリングおよびＳＶＭによる予測遺伝子の同定
上記遺伝子発現のデータを、ボルケーノプロットを用いてフィルターにかけることにより、可能性のある予測遺伝子を絞り込むことができる。例えばｐ値０．０５以下で、かつ例えばＦｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ１．６以上となるデータの遺伝子を予測遺伝子とする。ボルケーノプロットは、例えばＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３を用いて行うことができる。
また、更に別の統計学的分析方法を用いて、より好ましい予測遺伝子を同定することができる。本発明ではハイブリダイゼーションから得られる多数のデータを分析することから、サポートベクターマシン（ＳＶＭともいう）を用いることが好ましい。
【００４３】
ＳＶＭは、２クラスのデータの分類を行う学習機械である。予測空間に２つのグループを分ける識別平面を見出し、プロットが平面のどちら側にあるのかによりプロットを分類する。識別平面は一番近いプロットの距離（マージン：あるベクトルの方向で図った、学習データのクラス間の距離）ができるだけ大きくなるように計算される。ニューラルネットワークは線形の識別器であるが、カーネルトリックを使った非線形投射された空間を用いるＳＶＭは、より複雑なデータを分類することができる。さらにソフトマージンを用いれば多少の識別誤りを許すように制約を緩めることができる。ＳＶＭを用いて、既知のグループのサンプル群（トレーニングセットともいう）から、予測遺伝子を選び出す。ＳＶＭは、例えばＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３のソフトウエアを用いることができる。
【００４４】
具体的には、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３のＳＶＭのクロスバリデーション法を用い、トレーニングセットとして上記（４）の手順で得たハイブリダイゼーションあるいは定量ＲＴ−ＰＣＲの予測遺伝子のデータを与え、予測効率（予測正確性、予測感度、予測特異性および陽性尤度比、下記表１参照）が極大となるパラメータを探る。次に、ＳＶＭに、予測効率を極大とするパラメータと、トレーニングセットとして上記クロスバリデーション法で用いたハイブリダイゼーションの予測遺伝子のデータを与えて、予測空間と識別平面を見出す。
【００４５】
予測空間と識別平面を見出すとき、予測正確性が好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは極大になるように、ソフトマージンのファクター（Ｄｉａｇｏｎａｌ Ｓｃａｌｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒともいう）を設定することが好ましい。
【００４６】
本明細書における予測正確性、予測感度、予測特異性、陽性尤度比は、以下のように与えられる。
【００４７】
【表１】
予測正確性＝（ａ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）
予測感度＝ａ／（ａ＋ｃ）
予測特異性＝ｄ／（ｂ＋ｄ）
陽性尤度比＝｛ａ／（ａ＋ｃ）｝／｛ｂ／（ｂ＋ｄ）｝
【００４８】
予測正確性が例えば極大になったＤｉａｇｏｎａｌ Ｓｃａｌｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒと、上記トレーニングセットと、上記（４）と同じ手法で得た別のハイブリダイゼーションのデータをテストセットとして、ＳＶＭに与え、予測遺伝子を選び出す。
【００４９】
このようにして同定された予測遺伝子は、その塩基配列に対して好ましくは７０％、７５％、より好ましくは８０％、８５％、更に好ましくは９０％、９５％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する遺伝子も含まれる。同一性は、同一塩基数／全塩基数×１００（％）で与えられ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムにより検索することができる。
【００５０】
２．被検薬物の有害反応を予測する方法
上記１．の手法に従って、被検薬物について予測遺伝子のデータ（テストセット）を得る。次に、上記トレーニングセット、テストセットおよびパラメータをコンピュータに入力して出力する。コンピュータのソフトとして、例えばＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３のソフトウエアを用いることができる。
【００５１】
３．薬物有害反応予測用ＤＮＡ固定化担体
上記１．により同定された予測遺伝子のＤＮＡ、または１５塩基以上のそのＤＮＡ断片、例えば１５塩基〜全塩基、２０塩基〜全塩基、３０塩基〜全塩基、４０塩基〜全塩基、５０塩基〜全塩基、１００塩基〜全塩基、１５０塩基〜全塩基、２００塩基〜全塩基、あるいは前記ＤＮＡまたはＤＮＡ断片と７０％、７５％、より好ましくは８０％、８５％、更に好ましくは９０％、９５％、９８％、９９％以上の同一性を有するＤＮＡを固定した、薬物有害反応予測用ＤＮＡ固定化担体を作製できる。
【００５２】
固定化するＤＮＡは、ホスホアミダイト法、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法などで合成できる。例えばホスホアミダイト法では、担体に結合した３’末端ヌクレオシドを出発物質とし、この５’側に新たなヌクレオチドモノマーを付加する反応が繰り返されて、３’から５’方向へのＤＮＡ鎖伸長反応が行われる。好ましくは２０〜２００塩基、より好ましくは３０〜１５０塩基、更に好ましくは５０〜１００塩基のＤＮＡを合成する。ＤＮＡ合成のために、市販のＤＮＡ自動合成機を用いることができる。
【００５３】
ベクターにＤＮＡを組み込んでクローニングし、ＰＣＲ反応を用いてＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲ反応サイクルは、例えば変性工程で約９０〜９８℃、約１５秒〜５分、アニーリング工程で約３６〜６５℃、約３０秒〜１０分、伸長工程で約６５〜７５℃、約３０秒〜１０分を、約２０〜５０回サイクル行えばよい。ＰＣＲ反応液は、ＰＣＲバッファー（例えば５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４〜９．０、２５℃）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、鋳型ＤＮＡ、ｄＮＴＰ、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどを含む。
【００５４】
増幅したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動などによって精製し、担体に固定化する。担体は特に限定されないが、例えば石英、ガラス、ポリマーなどの担体が好ましい。担体の形状は特に限定されず、その全体または一部が平坦な面を有する担体が好ましい。例えばスライドガラス（ポリＬ−リシンコート、シリレン化、シラン化などを行ってもよい）、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。固定化する際、市販のスポッティング装置などを用いてもよい。特にＤＮＡマイクロアレイについては多くの作製装置が市販されており、作製方法も担体上に直接ＤＮＡを合成する方法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）もある。例えばＤＮＡマイクロアレイについては、細胞工学別冊、ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法、村松正明、那波宏之監修、秀潤社、ｐ．２６−３４、サザンブロットについては、実験医学別冊、改訂第４版、新遺伝子工学ハンドブック、村松正實ら編、羊土社、ｐ．９０−９４、ＤＮＡマクロアレイについては、実験医学別冊、ポストゲノム時代の実験講座１、ゲノム機能研究プロトコール、辻本豪三ら編、羊土社、ｐ．７８−８３を参照して作製することができる。
【００５５】
以下、本発明の実施例を示すが、それらは単なる例示であり、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
薬物曝露濃度の決定
国内で医薬品として承認されている約２００種類の薬物について、腎障害の有無を添付文書の記載により分類した。腎障害を現す薬物を表２、腎障害を現さない薬物を表３に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
【表３】
【００５９】
上記表２及び３に記載の薬物のうち、１日最大使用量とＣｍａｘ値が分かった８０種類の薬物について、Ｘ軸に１日最大使用量（ｌｏｇ）、Ｙ軸にＣｍａｘ値（ｌｏｇ）をとってグラフを描いたところ、相関係数は０．８５９であり、Ｆｉｓｈｅｒのｒのｚ変換によるｐ値は、＜０．０００１であった（図１）。１日最大使用量を１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の３つの範囲に分け、各範囲における回帰直線の中央位置に相当する最高血中濃度の値±１０％を薬物曝露濃度とし、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μg／ｍｌ、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌとした。表２および３に、添付文書に記載された１日最大使用量および決定された薬物曝露濃度を示す。
【実施例２】
【００６０】
薬物曝露時間の決定
腎障害を現すことが知られている薬物を、以下の５つのグループに分けた。
グループ１：白金抗腫瘍化合物（シスプラチン、ネダプラチン、カルボプラチン）
グループ２：カルバペネム系抗生物質（イミペネム・シタスタチン（ＩＰＭ−ＣＳ）、パニペネム・ベタミプロン（ＰＡＰＭ−ＢＰ））
グループ３：アミノグリコシド系抗生物質（アミカシン（ＡＭＫ）、トブラマイシン（ＴＯＢ）、ジベカシン（ＤＫＢ）、ゲンタマイシン（ＧＭ）、イセパシン（ＩＳＰ））
グループ４：セファロスポリン系抗生物質（セフォゾプラン（ＣＺＯＰ）、セフタジジム（ＣＡＺ））
グループ５：免疫抑制剤（シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＰＳＣ−８３３、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、グスペリムス（ＮＫＴ−０１））
【００６１】
ヒト由来細胞（日本人由来ＥＢＶ不死化末梢血リンパ球細胞ＨＥＶ００３４、理化学研究所から入手）を、上記薬物曝露濃度の決定方法に従った曝露濃度で曝露し、曝露前、曝露後１０分、６０分、６時間、２４時間の遺伝子発現をＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭＨＧ−Ｕ１３３ ＤＮＡマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）で、添付文書に記載の手順に従って調べた。スキャナーはＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、解析ソフトはＧＣＯＳ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）を使用した。
【００６２】
薬物に曝露していない細胞のデータと比較して２倍以上の発現変化がみられ、かつ有意水準がｐ＜０．０１の遺伝子を選択し、更にボルケーノプロットによるフィルタリングを行った。グラフのＸ軸にＦｏｌｄ値の対数、Ｙ軸にｐ値の対数をとった散布図を描き、Ｘ軸で−１．０以下かつＹ軸で１．３以上にプロットされた遺伝子を下方制御された遺伝子、Ｘ軸で＋１．０以上かつＹ軸で１．３以上にプロットされた遺伝子を上方制御された遺伝子とした。例としてグループ５の免疫抑制剤に１０分間曝露させた場合と、免疫抑制剤の溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）に曝露した場合についてのボルケーノプロットのグラフを図３に示す。有意に発現が変化した遺伝子２９０のうち、２５遺伝子が下方制御された遺伝子、２６５遺伝子が上方制御された遺伝子（いずれも黒のドット）と同定された。
【００６３】
他のグループの薬物についても同様にして、各曝露時間での発現に変化があった遺伝子数を調べた。免疫抑制剤の場合、曝露時間１０分で発現変化を示す遺伝子数が最も多かったが、白金抗腫瘍化合物、カルバペネム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質では、時間経過に依存して発現変化を示す遺伝子数が増加する傾向が見られた。できるだけ多くのグループで、発現変化を示す遺伝子ができるだけ多く見られた（すなわち、遺伝子数のばらつきが最も少ない）時間を薬物曝露時間として決定した。図２から、薬物曝露時間を２４時間とした。
【実施例３】
【００６４】
腎障害予測遺伝子の同定と薬物の腎障害の予測
日本人由来ＥＢＶ不死化末梢血リンパ球細胞ＨＥＶ００３４ヒト由来細胞を約１．０×１０６個／ｍｌになるようにカルチャーディッシュに添加し、薬物を各曝露濃度になるように添加し、２４時間、３７℃でインキュベーションした。２４時間後、ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ社）のプロトコールに従い、細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出ＲＮＡサンプルのフィルタリングを行い、（ｉ）ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比が１．８以上、（ｉｉ）ｒＲＮＡの２８Ｓ／１８Ｓ比が１．６以上のサンプルを選択したところ、上記表２と表３の薬物２００種類中、実際に曝露実験を行った薬物１８０種類のうち、ＤＮＡマイクロアレイの解析に使用できるものは１２５種類になった。その薬物を表４に示す（表中のサンプルＩＤは、表２及び３のサンプルＩＤに対応する）。
【００６５】
【表４】
【００６６】
次に、Ｏｖａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍキット（ＮｕＧＥＮ社）のプロトコールに従ってｃＤＮＡの合成を行い、ビオチン標識されたｃＤＮＡを量産・精製した。得られた標識ｃＤＮＡを上記キットのプロトコールに記載された条件下で処理して、標識ｃＤＮＡを断片化した。これらの標識ｃＤＮＡを用いてＤＮＡマイクロアレイ法を行った。ＤＮＡマイクロアレイはＧｅｎｅＣｈｉｐ ＨＧ−Ｕ１３３キットを用い、そのプロトコールに従った。スキャナーはＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）を用い、スキャン画像を数値化したデータについてノーマライゼーションを行った。ノーマライゼーションは、数値化データ０．０１未満を、０．０１の発現とし、ハウスキーピング遺伝子の数値化データ、プローブセットごとの数値化データをチップごとに補正した。補正係数の算出は、各チップ内の９９のハウスキーピング遺伝子の中の中央値を示したものの値でチップ間のノーマライゼーションを行った。ここで、ハウスキーピング遺伝子は、腎障害のノーマライゼーション用ハウスキーピング遺伝子を用いた（以下、Ｂｅｔｔｅｒ ＨＫ遺伝子ともいう）。Ｂｅｔｔｅｒ ＨＫ遺伝子とは、Ｇｕｔｔｅ，ＡＪ，Ｄｚａｕ，ＶＪ，Ｇｌｕｅｃｋ，ＳＢ：Ｆｕｔｈｅｒ ｄｉｆｉｉｎｇ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ， ｏｒ “ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ，” ｇｅｎｅｓ Ｆｏｃｕｓ ｏｎ ”Ａ ｃｏｍｐｅｄｉｕｍ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ，”Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２，ｐｐ．９５−９６（２００１）に報告されているハウスキーピング遺伝子を、本発明の実験系（ヒト由来細胞を薬物に曝露してＤＮＡマイクロアレイで遺伝子発現を検出してデータ分析する）に用いて、変動の大きい２ＳＤ（標準偏差）を超える遺伝子を除き、残りの遺伝子を用いてさらに本発明の実験系に用いて変動の大きい遺伝子を除く、という作業を繰り返し、残った遺伝子である。Ｂｅｔｔｅｒ ＨＫ遺伝子９９個を遺伝子名で以下に示す（遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）などのデータバンクから入手できる）。
【００６７】
ＡＢＣＦ１、ＡＣＴＢ３４、ＡＮＡＰＣ５、ＡＲＦ１、ＡＲＦ３、ＡＳＣＣ３Ｌ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｂ、ＡＴＰ６Ｖ０Ｅ、ＢＡＴ１、Ｃ１Ｄ、Ｃ２ｏｒｆ２４、ＣＡＮＸ、ＣＡＰＮＳ１、ＣＢＸ３、ＣＦＬ１、ＣＯＸ４Ｉ１、ＤＡＤ１、ＤＤＸ５、ＤＵＬＬＡＲＤ、ＥＥＦ２、ＥＩＦ３Ｓ５、ＥＩＦ３Ｓ７、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＲＨ、ＦＡＵ、ＦＮＴＡ、ＧＡＰＤ、ＧＤＩ２、ＧＵＫ１、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＨＩＮＴ１、ＨＮＲＰＡ１、ＨＮＲＰＣ、ＨＮＲＰＤ、ＨＮＲＰＫ、ＨＮＲＰＭ、ＨＳＰＣ１１７、ＨＳＰＣＢ、ＩＫ、ＩＬＦ２、ＪＴＢ、ＫＡＲＳ、ＫＨＤＲＢＳ１、ＭＧＣ２７４９、ＭＹＳＴ２、ＮＡＲＳ、ＮＥＤＤ５、ＮＯＮＯ、ＮＰＭ１、ＯＡＺ１、ＰＡＲＫ７、ＰＲＰＦ８、ＰＳＭＢ２、ＲＨＯＡ、ＲＮＰ２４、ＲＮＰＳ１、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ４、ＲＰＬ６、ＲＰＬ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ３、ＳＦＲＳ９、ＳＬＣ２５Ａ３、ＳＭＡＰ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＰＡＧ７、ＳＲＰ１４、ＳＴＡＲＤ７、ＴＡＦ１０、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＣＥＢ２、ＵＳＰ２２、ＹＹ１、ＺＮＦ１４６、ＺＮＦ２５９。
【００６８】
次に、ノイズリダクションを行った。ノイズリダクションは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３のＦｉｌｔｅｒ ｏｎ Ｆｌａｇｓ機能を用いて、１２５サンプル中７５サンプル以上のサンプルで、ＰまたはＭのフラグ（ＰまたはＭのフラグならば適、Ａのフラグは不適を示す）を有するトランスクリプトのみを以下の解析に用いることとした。これは、６０％以上のトランスクリプトで発現ありと判断されていないものは、ノイズによる変動が大きく解析に影響し、解析結果が一定しないという経験値に基づき採用したノイズリダクション法である。この時点で、解析データにある４５０６３トランスクリプトが９３５１トランスクリプトに減少した。
【００６９】
また、得られたＤＮＡチップのデータについてのフィルタリングを、以下のパラメータで行った：（ｉｉｉ）パーセントプレゼントが２５％以上、（ｉｖ）β−アクチンのＲＮＡの３’末端／５’末端比が＜１００、（ｖ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの３’末端／５’末端比が＜１０。
【００７０】
更に、ボルケーノプロットにより腎障害を現す薬物と現さない薬物のデータを比較してフィルタリングを行った。ｐ値０．０５以下で、かつＦｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ１．６以上のデータの遺伝子のみを選択したところ、上記９３５１トランスクリプトが８９トランスクリプトに減少し、この８９の遺伝子を予測遺伝子の候補とした。ボルケーノプロットは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３を用いて行った。
【００７１】
次に、上記ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３のＳＶＭ計算機能のクロスバリデーション機能を用いて、上記８９の候補の腎障害予測遺伝子のデータ（ｄａｔａ ｓｅｔ ２００５）を与えた。予測効率が極大となる点を探り、この予測効率を極大とするパラメータを探った。パラメータを探るのに考えうる様々なパラメータを入力し、結果を評価することを繰り返すことで、最良の結果を示すパラメータを調べた。そのパラメータは以下の通りである。
【００７２】
【表５】
【００７３】
なお、表５のＤｉａｇｏｎａｌ Ｓｃａｌｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒは、例えば２０−４０のように、より広い値でも可能である。
【００７４】
ここで、上記８９の遺伝子のうち、３２個の遺伝子が腎障害予測遺伝子として絞り込まれた。３２個の腎障害予測遺伝子を以下の表６及び配列番号１〜３２に示す。
【００７５】
【表６】
【００７６】
ＳＶＭに上記パラメータと上記ｄａｔａ ｓｅｔ ２００５を与えて、予測空間と識別平面を見出した。次に表４に記載の薬物の別のマイクロアレイの腎障害予測遺伝子のデータ（ｄａｔａ ｓｅｔ ２００６）を与えて、結果を評価した。薬物有害反応の予測正確性等の評価を行ったところ、予測正確性＝８２．９％、予測特異性＝８５．０％、予測感度＝８０．６％、陽性尤度比＝５．３７であった。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、トキシコゲノミクスの分野で広く適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】薬物の１日最大使用量とＣｍａｘ値の相関を示す。
【図２】各曝露時間における５つの薬物グループでの発現量が有意に変化した遺伝子数を示す。
【図３】免疫抑制剤についてのボルケーノプロットを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の細胞を、薬物有害反応を現す薬物および現さない薬物に、薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析し、薬物有害反応に関与する遺伝子を同定することを含む、薬物有害反応を予測するための遺伝子を同定する方法であって、
薬物の１日最大使用量と最高血中濃度の相関に基づいて、薬物の１日最大使用量１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の各範囲における回帰直線の中央位置に相当する最高血中濃度の値±１０％を至適の薬物曝露濃度とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
至適の薬物曝露濃度が、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μｇ／ｍｌ±１０％、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ±１０％、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌ±１０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬物の薬理作用により分類された複数の薬物グループ間で、発現が変化した遺伝子数のばらつきが最も少ない時間を薬物の曝露時間として決定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
薬物の曝露時間が１２〜４８時間である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒト由来の細胞がプライマリー細胞または不死化細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子発現の変化を、ハイブリダイゼーションまたは定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
統計学的手法がサポートベクターマシンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
薬物有害反応が腎障害である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ヒト由来の細胞を、被検薬物に、該薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析して、被検薬物の有害反応を予測する方法であって、
至適の薬物曝露濃度及び遺伝子が、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって決定される濃度および遺伝子であることを特徴とする、上記方法。
【請求項１０】
至適の薬物曝露濃度が、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μｇ／ｍｌ±１０％、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ±１０％、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌ±１０％である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
薬物の薬理作用により分類された複数の薬物グループ間で、発現が変化した遺伝子数のばらつきが最も少ない時間を薬物の曝露時間として決定することをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
薬物の曝露時間が１２〜４８時間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト由来の細胞がプライマリー細胞または不死化細胞である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子発現の変化を、ハイブリダイゼーションまたは定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
統計学的手法が、サポートベクターマシンである、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
薬物有害反応が腎障害である、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
予測遺伝子が、配列番号１〜３２で表される塩基配列および該塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む腎障害予測遺伝子からなる群から選択される、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１７で定義された腎障害予測遺伝子の塩基配列および該塩基配列の少なくとも１５塩基からなる断片配列からなる群から選択された塩基配列を含むＤＮＡが固定された、薬物腎障害予測用ＤＮＡ固定化担体。
【請求項１９】
担体が、石英、ガラスまたはポリマーである、請求項１８に記載の担体。
【請求項２０】
ＤＮＡマイクロアレイである、請求項１８または１９に記載の担体。
【請求項１】
ヒト由来の細胞を、薬物有害反応を現す薬物および現さない薬物に、薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析し、薬物有害反応に関与する遺伝子を同定することを含む、薬物有害反応を予測するための遺伝子を同定する方法であって、
薬物の１日最大使用量と最高血中濃度の相関に基づいて、薬物の１日最大使用量１０ｍｇ未満、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満、４００ｍｇ以上の各範囲における回帰直線の中央位置に相当する最高血中濃度の値±１０％を至適の薬物曝露濃度とすることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
至適の薬物曝露濃度が、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μｇ／ｍｌ±１０％、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ±１０％、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌ±１０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬物の薬理作用により分類された複数の薬物グループ間で、発現が変化した遺伝子数のばらつきが最も少ない時間を薬物の曝露時間として決定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
薬物の曝露時間が１２〜４８時間である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒト由来の細胞がプライマリー細胞または不死化細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子発現の変化を、ハイブリダイゼーションまたは定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
統計学的手法がサポートベクターマシンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
薬物有害反応が腎障害である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ヒト由来の細胞を、被検薬物に、該薬物のヒトにおける１日最大使用量範囲に応じて決定される至適の薬物曝露濃度で曝露し、細胞の遺伝子発現の変化を検出し、そのデータを統計学的手法により分析して、被検薬物の有害反応を予測する方法であって、
至適の薬物曝露濃度及び遺伝子が、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって決定される濃度および遺伝子であることを特徴とする、上記方法。
【請求項１０】
至適の薬物曝露濃度が、薬物のヒトにおける１日最大使用量が１０ｍｇ未満の場合０．０５μｇ／ｍｌ±１０％、１０ｍｇ以上４００ｍｇ未満の場合１．０μｇ／ｍｌ±１０％、４００ｍｇ以上の場合２０μｇ／ｍｌ±１０％である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
薬物の薬理作用により分類された複数の薬物グループ間で、発現が変化した遺伝子数のばらつきが最も少ない時間を薬物の曝露時間として決定することをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
薬物の曝露時間が１２〜４８時間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト由来の細胞がプライマリー細胞または不死化細胞である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子発現の変化を、ハイブリダイゼーションまたは定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
統計学的手法が、サポートベクターマシンである、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
薬物有害反応が腎障害である、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
予測遺伝子が、配列番号１〜３２で表される塩基配列および該塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含む腎障害予測遺伝子からなる群から選択される、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１７で定義された腎障害予測遺伝子の塩基配列および該塩基配列の少なくとも１５塩基からなる断片配列からなる群から選択された塩基配列を含むＤＮＡが固定された、薬物腎障害予測用ＤＮＡ固定化担体。
【請求項１９】
担体が、石英、ガラスまたはポリマーである、請求項１８に記載の担体。
【請求項２０】
ＤＮＡマイクロアレイである、請求項１８または１９に記載の担体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２２８６４４（Ｐ２００８−２２８６４４Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７２３５７（Ｐ２００７−７２３５７）
【出願日】平成１９年３月２０日（２００７．３．２０）
【出願人】（５０５２４６７８９）学校法人自治医科大学 (49)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２０日（２００７．３．２０）
【出願人】（５０５２４６７８９）学校法人自治医科大学 (49)
【Ｆターム（参考）】
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