遺伝子組み換えされた細胞が合胞体の機能を変える効果を監視するための分析システム
本発明は、合胞体細胞のリズムおよび収縮性を変える遺伝子構造物の能力を決定する方法を提供する。さらに、本発明は合胞体細胞のリズムおよび収縮性を変える遺伝子構造物を構築する方法を提供する。最終的に、本発明は合胞体細胞と結合する能力を有する遺伝子構造物を構築する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は２００４年７月１９日に出願された暫定的な米国特許出願第６０/５８９,４１６の利益を要求するものであり、その内容は参考のためここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は米国政府ＮＩＧ ＮＨＬＢＩ助成金第ＨＬ−２８９５３のサポートでなされた。従って、米国政府は本発明に一定の権利を持っている。
【０００３】
この出願を通じて、様々な刊行物が数字によって参照される。完全な引用は、明細書の終わりの部分に見出されるであろう。全体としてこれらの刊行物の開示は、ここに記述され請求される発明の日現在従来技術を当業者に対してより完全に記述するために、この出願に参考としてここに組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
電子ペースメーカーは、現在心臓ブロックと他の電気生理学的異常箇所の治療の頼みの綱であるけれども、最適なものではない。それらの欠点の中には、限定された電池寿命、心臓の中への永久のカテーテル移植の必要性、及び自律神経液に対する反応の欠如がある（１）。これらの理由で、いくつかの遺伝子治療アプローチが潜在的な選択肢として探究されている。これらは、野生型遺伝子Ｋｉｒ２．１（４）と共に表現されるとき、内部の整流電流を抑制するためβ２−アドレナリン性レセプターが使用するドミナントネガティブコンストラクトの過剰発現、及びペースメーカージーン（ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｇｅｎｅ）、ＨＣＮ２、を持たせたベクターの心房（５）または索枝システム（ｂｕｎｄｌｅ ｂｒａｎｃｈ ｓｙｓｔｅｍ）内部への注入のどちらかを含む（６）。これらのアプローチ（２−６）のいくつかに固有の問題は、必要な遺伝子を届けるためのウィルスの使用である。ベクターは、今まで伝染の可能性をほとんど持たなない複製欠損性なアデノウィルスであったけれども、これらは、潜在的な炎症性の反応と同様に、ペースメーカー機能を一時的に改良する可能性を取り入れるだけである。レトロウィルス及び他のベクターの使用は生物学的なペースメーカーにおいていまだ試みられていないけれども、電子ペースメーカーの現在の成功を与えられた、発がん性と不当な感染性の危険を伴う。ヒト胎児の幹細胞をペースメーカーを作るために使う試みがまだ始まったばかりであり、適切な細胞系統の識別、ペースメーカー細胞以外のラインの中への分化、及び腫瘍形成の可能性についての問題を有する（総説（７）を参照されたい）。
【非特許文献１】Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｒｄｉａｃ Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ： ２００１； ５７１−５９８
【非特許文献２】Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８；１０１：３３７−３４３
【非特許文献３】Ｈｅａｒｔ． ２００１；８６：５５９−５６２
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ． ２００２；４１９：１３２−１３３
【非特許文献５】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００３；１０７：１１０６−１１０９
【非特許文献６】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００４；１０９：５０６−５１２
【非特許文献７】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００２；９１：８６６−８７６
【非特許文献８】Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． ２００２；８：２３５−２４５
【非特許文献９】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０００；８６：１０６２−１０６８
【非特許文献１０】Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ （Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ）． ２０００；２７９：Ｈ４２９−Ｈ４３６
【非特許文献１１】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０００；８６：ｅ４２−ｅ４９
【非特許文献１２】Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９９９；２７７：Ｈ９４０−Ｈ９４６
【非特許文献１３】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． １９９４；７５：７２２−７３２
【非特許文献１４】Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． １９８１；２９：１３４９−１３５３
【非特許文献１５】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００１；８８：ｅ８４−ｅ８７
【非特許文献１６】Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００１；２６８：１６４６−１６５２
【非特許文献１７】Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９８１；３１４：３７７−３９３
【非特許文献１８】Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９８２；３２９：４８５−５０７
【非特許文献１９】Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００２；２８２：Ｃ５０１−Ｃ５０７
【非特許文献２０】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００２；９１：１８９−２０１
【非特許文献２１】Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００２；５：５５５−５６５
【非特許文献２２】Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２０００；６：１２８２−１２８６
【非特許文献２３】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００３；１０８：ＩＶ−５４８．Ａｂｓｔｒａｃｔ．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は合胞体細胞のリズムを変える遺伝子構造物（ｇｅｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の能力を決定するための方法を提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ｉ）遺伝子構造物を合胞体細胞に接触させ；及び（ｉｉ）接触された合胞体細胞のリズムが、遺伝子構造物が接触されなかった合胞体細胞におけるものと異なっているかどうかを決定し、結果的に遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変えるかどうかを決定する。
【０００６】
本発明は合胞体細胞の収縮性を変更する遺伝子構造物の能力を決定するための方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ｉ）遺伝子構造物を合胞体細胞に接触させ；及び（ｉｉ）接触された合胞体細胞の収縮性が、遺伝子構造物が接触されなかった合胞体細胞におけるものと異なっているかどうか決定し、結果的に遺伝子構造物が合胞体細胞の収縮性を変えるかどうか決定する。
【０００７】
本発明は合胞体細胞への遺伝子構造物の結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を決定する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、遺伝子構造物を合胞体細胞と接触させ；（ｂ）接触された合胞体細胞のリズムを決定し；及び（ｃ）遺伝子構造物と接触するよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、合胞体細胞への遺伝子構造物の結合は、接触された合胞体細胞のリズムが遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される。
【０００８】
本発明は、合胞体細胞のリズムを変えることができる遺伝子構造物を製造する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変える能力は、接触された合胞体細胞のリズムが遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と；及び（ｅ）合胞体細胞のリズムを変える能力を持つと決定された、段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【０００９】
本発明は、合胞体細胞の収縮性を変える能力を有する遺伝子構造物を製造する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞の収縮性を決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞の収縮性で決定された収縮性と比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞の収縮性を変える能力は、接触された合胞体細胞の収縮性が遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞の収縮性と異なることで示される段階と；及び（ｅ）合胞体細胞の収縮性を変える能力を持つと決定された、段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【００１０】
最終的に、本発明は合胞体細胞と結合する能力を有する遺伝子構造物を製造するための方法を提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、遺伝子構造物の合胞体細胞への結合は、接触された合胞体細胞のリズムが遺伝子構造物に接触するより前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と；及び（ｅ）合胞体細胞と結合していることが決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
図面に関する簡単な記述
図１Ａ−１Ｃ ｍＨＣＮ２遺伝子でトランスフェクトされたｈＭＳＣ中のＩｆの機能発現。
Ｉｆは、ｍＨＣＮ２遺伝子をトランスフェクトしたｈＭＳＣで現れる（Ｂ）が、トランスフェクトしていない幹細胞では現れない（Ａ）。（Ｃ）は、ボルツマン方程式によってＩｆの規格化されたテール電流にフィッティングされ、中点が−９１．８±０．９ｍＶ、傾きが８．８±０．５ｍＶ（ｎ＝９）である。Ｉｆは、活性化の閾値が−６０ｍＶで、−１４０ｍＶ付近で完全に活性化された。挿入図は、Ｉｆ活性化曲線を構築するのに使用される代表的なテール電流を示す。電圧プロトコルは、−３０ｍＶで保持され、１．５秒間過分極され−４０から−１６０ｍＶの間−１０ｍＶ毎の増加の後、１．５秒の電圧ステップで＋２０ｍＶとし、テール電流を記録した。
【００１２】
図２Ａ−２Ｄ Ｃｓ＋の細胞外での適用の効果及びＩｆの逆転電位の測定
Ｉｆは、４ｍｍｏｌ／ＬのＣｓ＋の外部添加の前に（Ａ）、添加の間（Ｂ）、及び添加の後に（Ｃ）記録された。（Ｄ）は、Ｃｓ＋が存在しない状況下における完全に活性化されたＩｆのＩ−Ｖ関係である。電圧プロトコルは、−３０ｍＶで保持され、−１５０ｍＶで２秒間過分極され、その後完全に活性化された電流−電圧関係を構築するのに必要なテール電流を記録するため−１５０から＋２０ｍＶの間の電圧に１．５秒間脱分極され、その後０．５秒ステップで−１０ｍＶとした。
【００１３】
図３Ａ−３Ｄ ｍＨＣＮ２遺伝子でトランスフェクトされたｈＭＳＣにおけるイソプロテレノール（ＩＳＯ）によるＩｆ活性化のモジュレーション
ＩＳＯが存在しない状態で（Ａ）、及び１×１０−６ｍｏｌ／ＬでＩＳＯが存在する状態でのＩｆ活性化。（Ｃ）は、コントロールされた（ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＩＳＯ、及び二段階パルスプロトコルを用いてウォッシュアウト（ｗａｓｈｏｕｔ）されたＩｆ活性化の電圧依存性。（Ｄ）テール電流の規格化密度へのボルツマンフィッティング。活性化曲線は、図１に示すのと同様のプロトコルで構築された。二つのパルスのプロトコルは、−３０ｍＶに保持された電位から初期化された。最初のステップは１．５秒間、−１００ｍＶまで、その後の第２ステップは１秒間、−１５０ｍＶまでであった。その後電圧は１秒間＋１５ｍＶに上げられて、電流を迅速に非活性化し、及び次に保持電位に戻された。
【００１４】
図４Ａ−４Ｄ ＩＳＯの存在下におけるアセチルコリン（ＡＣｈ）によるＩｆの活性化のモジュレーション
ＩＳＯが存在する状態で、ＡＣｈが存在しない状態（Ａ）、及びＡＣｈが（１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）存在する状態でのＩｆ活性化。（Ｃ）ＩＳＯ（１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）単独及びＩＳＯ＋ＡＣｈに関する、図３Ｃと同様な二段階プロトコル。（Ｄ）規格化電流へのボルツマンフィッティング。活性化曲線は、図１と同様なプロトコルで構築された。
【００１５】
図５Ａ−５Ｂ ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおけるペースメーカー機能
ＥＧＦＰのみトランスフェクトされた（Ａ）及びｍＨＣＮ２とＥＧＦＰとをトランスフェクトされた（Ｂ）ｈＭＳＣで４から５日間同時培養されたネズミ新生児心室筋細胞の自発的な電気活動。実験は３５℃で行なわれた。
【００１６】
図６ ｉｎ ｓｉｔｕにおけるイヌの心臓のペースメーカー機能
上から下へ、ＥＣＧはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＡＶＲ、ＡＶＬ及びＡＶＦを誘導する。左側、洞調律における二つの拍及び迷走神経の刺激の開始（矢印）は、ＬＶ前面壁心外膜においてｍＨＣＮ２トランスフェクトｈＭＳＣを移植した７日後研究されたイヌに洞停止をもたらす。中央、迷走神経の刺激が続く間、心室固有のエスケープフォーカス（ｅｓｃａｐｅ ｆｏｃｕｓ）が、規則正しいリズムを持って現れる。右側、迷走神経の刺激が停止して（矢印）、ポストベーガル（ｐｏｓｔｖａｇａｌ）洞性頻拍が存在する。
【００１７】
図７Ａ−７Ｄ ｈＭＳＣ注入サイトのヘマトキシン及びエオシン染色
（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色は、好塩基性染色された幹細胞及び通常の心筋を示す。（Ｂ）及び（Ｃ）イヌの心筋内で、それぞれ、ｈＭＳＣの結節のビメンチン及びＣＤ４４の染色を示す。（Ｄ）心筋で分散しているビメンチンによって染色された細胞の細部。倍率Ｘ１ＯＯ（Ａ）及びＸ４００（ＢからＤ）。
【００１８】
図８ ｈＭＳＣ−イヌの心室筋細胞のペア間のギャップジャンクション
（Ａ）ｈＭＳＣ筋細胞の位相コントラスト顕微鏡像及びピペット１及び２の位置。（Ｂ）イヌ筋細胞に印加された圧力ランプ（Ｖ１＝±１００ｍＶ；Ｖ２＝０）は、ホールセルモードで筋細胞、Ｉ１、及びｈＭＳＣ、Ｉ２、に取り付けられたパッチピペットを通じて電流を引き起こした。上げられた（ｓｔｅｐｐｅｄ）筋細胞から記録された電流、Ｉ１、は二つの成分、筋細胞のジャンクション電流（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｕｒｒｅｎｔ）及び膜電流、の合計を表す。上げられていない（ｎｏｎｓｔｅｐｐｅｄ）ｈＭＳＣから記録されるミラー電流、Ｉ２、はｈＭＳＣ−筋細胞ペア間のジャンクション電流（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｕｒｒｅｎｔ）、Ｉｊ、に対応する。（Ｃ）注入サイトと心筋との間の界面の領域におけるＣｘ４３の免疫染色。ＤＡＰＩ染色は核を示す。矢印は、紫、挿入されたディスク；白、ｈＭＳＣの間のＣｘ４３染色；赤、ｈＭＳＣと筋細胞との間のＣｘ４３染色。挿入図はもう１匹の動物からのセクションが染色されたＤＡＰＩ及びＥＧＦＰ免疫抗体、パラホルムアルデヒド固定を受け、及び注入サイトがｈＭＳＣを含有することを確かめるために反ＥＧＦＰ（ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ）及びＤＡＰＩで免疫染色された。Ｍが心筋；Ｓ、ｈＭＳＣを示す。
【００１９】
定義
この出願で使われるように、ここに特に明確に与えられる以外では、次の用語のそれぞれが、以下に説明する意味を有する。
【００２０】
ここに使われるように、「投与する」ことは、当業者に知られている様々な方法及びデリバリーシステムを用いて、達成または実施されてよい。投与は、例えば、静脈を通して、経口で、経鼻で、移植を通じて、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、及び皮下に実施されてよい。以下のデリバリーシステムは、多数の通常使用される薬学的に受容できるキャリアを用いて、すぐに使用可能な方法による配合物の投与に対して想定された多くの実施形態の代表にすぎない。
【００２１】
ここに使われるように、「エージェント」は、制限なしで、有機化合物、核酸、ポリペプチド、脂質及び炭水化物を含むべきである。エージェントは、例えば、構造及び／又は機能に関して知られているエージェントと、構造又は機能に関して知られていないものとを含む。特定の実施形態では、エージェントが所定の構造と、憂うつのような、非神経障害に関連した効果を有することが知られているが、しかし神経障害に関連した所定の効果を持つことは知られない。
【００２２】
ここに使われるように、「心臓の筋細胞」は、分離されるか、又は培養液中で、電流を起こすことができる、心臓の筋肉又は通道組織から生じた筋細胞であることを意味する。
【００２３】
ここに使われるように、「遺伝子構造物」は遺伝子組み換えされた細胞を意味するべきである。
【００２４】
ここに使われるように、「ＨＥＲＧ遺伝子」は、単離された心臓の筋細胞から記録されるＩＫｒ電流を生成するヒトのｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子を意味する。
【００２５】
ここに使われるように、「被験者」は、どんな動物でも、例えばヒト以外の霊長類、マウス、ラット、テンジクネズミ、イヌ、猫、又はうさぎを意味するべきである。
【００２６】
ここに使われるように、「合胞体細胞」は、心臓、膀胱、肝臓、又は消化管等の、合胞体構造からの細胞をさす。
【００２７】
本発明は合胞体細胞のリズムを変える遺伝子構造物の能力を決定するための方法を提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ｉ）合胞体細胞を遺伝子構造物と接触する段階と；及び（ｉｉ）接触された合胞体細胞のリズムが、遺伝子構造物と接触されなかった合胞体細胞にけるリズムと異なっているかどうか決定し、それによって遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変えるかどうか決定する段階。
【００２８】
すぐに使用できる方法の１つの実施形態では、方法は以下の段階を含む：（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、遺伝子構造物を合胞体細胞と接触させ；（ｂ）接触された合胞体細胞のリズムを決定し；及び（ｃ）遺伝子構造物と接触するよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変える能力は、接触された合胞体細胞のリズムが、遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される。
【００２９】
段階（ｂ）は、例えば、以下の段階を含む：（ｉ）遺伝子構造物に接触された合胞体細胞に染料を投与する；及び（ｉｉ）接触された合胞体細胞のリズムをフォトダイオードで監視する。使われる染料はＣａ認識染料又は感圧染料であってよい。もう１つの実施形態では、段階（ｂ）がエッジ検出の使用を含む。さらなる実施形態では、段階（ｂ）は試験ウェルに埋め込まれた電極の使用を含む。さらなる実施形態では、段階（ｂ）が試験ウェル内のガラスパッチ電極の使用を含む。
【００３０】
合胞体細胞は、心臓の筋細胞、哺乳動物の膀胱、哺乳動物の肝臓、細動脈、哺乳動物の胃腸管、上皮組織から生じる腫瘍又は平滑筋組織から始まる腫瘍からであってよい。
【００３１】
本発明は、合胞体細胞の収縮性を変更する遺伝子構造物の能力を決定するための方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ｉ）遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；及び（ｉｉ）接触された合胞体細胞の収縮性が、遺伝子構造物が接触されなかった合胞体細胞の収縮性と異なっているかどうか決定し、それによって遺伝子構造物が合胞体細胞の収縮性を変更するかどうか決定する段階。
【００３２】
すぐに使用できる方法の１つの実施形態では、方法は、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と、（ｂ）接触された合胞体細胞の収縮性を決定する段階と；（ｃ）遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞の収縮性で決定された収縮性と比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞の収縮性を変える能力が、接触された合胞体細胞の収縮性が遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞の収縮性と異なっていることで示される。
【００３３】
本発明は合胞体細胞への遺伝子構造物の結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を決定する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、合胞体細胞を遺伝子構造物と接触させ；（ｂ）接触された合胞体細胞のリズムを決定し；及び（ｃ）遺伝子構造物と接触するよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、合胞体細胞への遺伝子構造物の結合は、接触された合胞体細胞のリズムが、遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なるときに示される。
【００３４】
本発明は、合胞体細胞のリズムを変えることができる遺伝子構造物を製造する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変える能力は、接触された合胞体細胞のリズムが遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と；及び合胞体細胞のリズムを変える能力を持つと決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【００３５】
本発明は、合胞体細胞の収縮性を変える能力を有する遺伝子構造物を製造する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞の収縮性を決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞の収縮性で決定された収縮性と比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞の収縮性を変える能力は、接触された合胞体細胞の収縮性が遺伝子構造物に接触するより前の同じ合胞体細胞の収縮性と異なることで示される段階と；及び（ｅ）合胞体細胞の収縮性を変える能力を持つと決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【００３６】
最終的に、本発明は合胞体細胞と結合する能力を有する遺伝子構造物を製造するための方法を提供し、前記方法は以下を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変える能力は、接触された合胞体細胞のリズムが遺伝子構造物に接触するより前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と；及び（ｅ）合胞体細胞と結合したことが決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【００３７】
本発明は続く実験の詳細のセクションで例証される。このセクションは本発明の理解を助けるために説明されるが、そうするように意図されるものではなく、及び、後続するクレームで説明されるように、どのような面からも本発明を制限すると解釈されるべきではない。
【００３８】
実験の詳細
概要
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）が心臓に生物学的ペースメーカーを輸送する能力が試験された。エレクトロポレーションによって、心臓ペースメーカー遺伝子、ｍＨＣＮ２、でトランスフェクトされたｈＭＳＣは、高レベルのＣｓ＋センシティブ電流（−１５０ｍＶにおいて３１．１±３．８ｐＡ／ｐＦ）を発現し、拡張期電位の範囲において活性化して、逆転電位が−３７．５±１．０ｍＶであり、Ｉｆに類似した発現電流を裏付けた。発現電流はイソプロテレノールに応答して、活性化において１１ｍＶ陽性にシフトした。アセチルコリンは直接的な効果を持たなかったが、イソプロテレノールの存在下で、活性化が陰性に１５ｍＶシフトした。トランスフェクトされたｈＭＳＣは、カバーガラスの局所的領域上部に培養され新生児ラットの心室筋細胞で覆われたとき、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拍動数に影響した。同時培養物の拍動数は、ｈＭＳＣが（ＥＧＦＰのみを発現する）コントロールプラスミドでトランスフェクトされたとき９３±１６ｂｐｍであり、ｈＭＳＣがＥＧＦＰ＋ｍＨＣＮ２（Ｐ＜０．０５）の双方を発現するとき、１６１±４ｂｐｍであった。次にコントロールプラスミドまたはｍＨＣＮ２遺伝子構造物のどちらかをトランスフェクトされた１０６のｈＭＳＣが、ｉｎ ｓｉｔｕでイヌの左心室壁内の心外膜下に注入された。洞停止の間、全ての制御（ＥＧＦＰ）心臓は自発的なリズムを有した（４５±１ｂｐｍ、右側起源が２、左側起源が２）。ＥＧＦＰ＋ｍＨＣＮ２グループにおいて、動物６体のうち５体が左側起源の自発的なリズムを現した（拍動数＝６１±５ｂｐｍ；Ｐ＜０．０５）。さらに、注入された領域の免疫染色は、隣接する筋細胞とギャップジャンクションを形成するｈＭＳＣの存在を示した。これらの知見は、遺伝子組み換えされたｈＭＳＣがｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで機能的なＨＣＮ２チャネルを発現できることを示し、心筋細胞内のＨＣＮ２遺伝子の過剰発現をまねて、ペースメーカー遺伝子の、心臓内部への、または他の電気的な合胞体への新規の輸送システムを示す。
【００３９】
ｈＭＳＣは、ＥＧＦＰ同様にマウスＨＣＮ２（ｍＨＣＮ２）を発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで機能的なｍＨＣＮ２チャネルを発現することができるベクター構造物のエレクトロポレーションによって効果的にトランスフェクトされる。ｈＭＳＣにおけるＨＣＮ２発現は、同時培養された新生児ラット心室筋細胞の拍動数を変更するのに十分な、及びイヌの心室を駆動するのに十分なＩｆベースの電流を与え、アデノウィルス構造物によるＨＣＮ２の過剰発現を模倣する。（５）ｈＭＳＣがコネキシン蛋白質を作り、イヌの心筋細胞と電気的に結合する機能的なギャップジャンクションを形成することが示された。すなわち、ペースメーカー遺伝子を心臓内部に輸送するためのプラットフォームとして遺伝子組み換えされたｈＭＳＣを使用したｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療システムが開発された。
【００４０】
材料及び方法
ヒトの間葉幹細胞メンテナンスとトランスフェクション
ヒトの間葉幹細胞（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ ｈＭＳＣ；間葉幹細胞、ヒトの骨髄）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ／ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ）から購入され、及びＭＳＣ成長媒体（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ ＭＳＣＧＭ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）内で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下において３７℃で培養された。細胞は２代から４代まで使用された。完全長ｍＨＣＮ２ ｃＤＮＡは、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングされた。細胞は、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ａｍａｘａ）技術を用いてエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた。（８）２４から４８時間後のＥＧＦＰの発現から、３０％から４５％のトランスフェクション効率が明らかとなった。
【００４１】
ｈＭＳＣ中で発現されるＩＨＣＮ２のパッチクランプ研究
ホールセルパッチクランプが、コントロールｈＭＳＣ及びｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣにおける膜電流を調べるために使用され、前記遺伝子はペースメーカー電流、Ｉｆのα−サブユニットをエンコードする。発現Ｉｆ（すなわち、ＩＨＣＮ２）は、Ａｘｏｐａｔｃｈ−１Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）増幅器によって電圧クランプの下で測定された。パッチ電極抵抗は、シーリングの前に４〜６ＭΩであった。細胞は、約０．５分間でチャンバ溶液を完全に変える重力灌流システムを用いて終始灌流された。灌流溶液だけではなく、バス温度も３５±０．５℃で一定に保たれた。ピペット溶液は、（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）ＫＣｌ ５０、Ｋ−アスパラギン酸塩 ８０、ＭｇＣｌ２ １、Ｍｇ−ＡＴＰ ３、ＥＧＴＡ １０、及びＨＥＰＥＳ １０で満たされた（ｐＨはＫＯＨで７．２に調整された）。外液は、（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）ＮａＣｌ １３７．７、ＫＣｌ ５．４、ＮａＯＨ ２．３、ＣａＣｌ２ １．８、ＭｇＣｌ２ １、グルコース １０、ＨＥＰＥＳ ５、及びＢａＣｌ２ ２を含むものだった（ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整された）。膜容量は、電圧クランプステップを適用することによって測定され、電流密度は、容量あたりのピーク電流の値として表された。
【００４２】
ギャップジャンクションの二重（ｄｕａｌ）パッチクランプ研究
イヌの心臓の心室筋細胞は上述のように単離された。（９）筋細胞の第一段階の培養は、マウス筋細胞に関して記述された手順を用いて保たれた。（１０）それらは、マウスラミニン（１０μｇ／ｍＬ）が前もってコートされたカバーガラス上部で２.５％ウシ胎児の血清（ＦＢＳ）及び１％ＰＳを含むＭＥＭ中で０．５から１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で培養された。５％ＣＯ２のインキュベータ内における３７℃での１時間の培養後に、培地は、ＦＢＳフリーＭＥＭに変更された。ｈＭＳＣが追加され、同時培養物は５％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ内で保たれた。Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が、全ての実験において同時培養物内でｈＭＳＣをＨｅＬａ細胞から区別するために用いられた。（１１）
【００４３】
接着細胞を有するカバーガラスは、（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）ＮａＣｌ １５０、ＫＣｌ １０、ＣａＣｌ２ ２、ＨＥＰＥＳ ５（ｐＨ ７．４）、及びグルコース ５を含むバス溶液が室温（≒２２℃）で灌流された実験チャンバに移送された。パッチピペットは、（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）Ｋ＋アスパラギン酸− １２０、ＮａＣｌ １０、ＭｇＡＴＰ ３、ＨＥＰＥＳ ５（ｐＨ７．２）、及びＥＧＴＡ １０（ｐＣａ≒８）を含む、０．２２μｍ孔を通してろ過された溶液で満たされ、ピペットの抵抗は１〜２ＭΩと測定された。実験は、二重電圧クランプを用いて細胞ペアにおいて実施された。この方法は、膜電位（Ｖｍ）の制御及び関連するジャンクション電流（Ｉｊ）の測定を可能にする。
【００４４】
同時培養物における活動電位の記録
ｈＭＳＣが、初期のプレーティングを直径約４ｍｍの円形領域に制限するためにクローニングシリンダを用いて、フィブロネクチンで被覆された９×２２ｍｍのカバーガラス上部で培養された。細胞は、ＥＧＦＰ単独、またはＥＧＦＰ＋ｍＨＣＮ２のどちらかを発現した。４時間後に、クローニングシリンダははずされ、上述のように準備されたネズミ新生児の心室筋細胞（１２）がカバーガラス全体の上に培養された。４から５日後に、カバーガラスは灌流チャンバ内に配置され３５℃で保持され、活動電位は穿孔されたパッチ電極（１２）及び（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）ＮａＣｌ １４０、ＮａＯＨ ２．３、ＭｇＣｌ２ １、ＫＣｌ ５．４、ＣａＣｌ２ １．０、ＨＥＰＥＳ ５、及びグルコース１０；ｐＨ７．４を含む標準的な生理溶液を用いてカバーガラスの中心近くから記録された。ピペット溶液は、（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）アスパラギン酸 １３０、ＫＯＨ １４６、ＮａＣｌ １０、ＣａＣｌ２ ２、ＥＧＴＡ−ＫＯＨ ５、Ｍｇ−ＡＴＰ ２、及びＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ １０；ｐＨ ７．２を含むものだった。記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００増幅器及びＰＣｌａｍｐ８ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行なわれた。穿孔パッチ技術が使用され、アムホテリシンＢ（４００μｇ／ｍＬ、ｓｉｇｍａ）がピペット溶液に追加された。
【００４５】
イヌ心室のＩｎ Ｖｉｖｏ研究
幹細胞は前述のように準備された。殺菌した条件の下で、ナトリウムチオペンタール導入（１７ｍｇ／ｋｇＩＶ）及び吸入イソフルラン（１.５〜２.５％）麻酔の後に、２３から２７キログラムの雑種のイヌ（Ｔｅａｍ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｄａｙｖｉｌｌｅ、コネティカット）が心嚢切開を受けた。ＨＣＮ２＋ＧＦＰ又はＧＦＰを単独で含む１０６ｈＭＳＣは、心外膜におよそ２ミリの深さに、２１ゲージの針によって０．６ｍＬの溶液を左心室前壁に心外膜下注入された。動物は心臓のリズムが監視された間、４から１０日間回復した。その後、それらは上述のように、イソフルランで麻酔された。両方の頸部迷走神経幹が分離され、開胸され、ＥＣＧが監視された。段階的な左右の迷走神経刺激は、標準的な技術で行なわれ、エスケープペースメーカー機能（ｅｓｃａｐｅ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）が起こってよいように洞リズムを抑制した。組織学の研究のために、組織がそれから取り除かれた。
【００４６】
組織学的方法
特に示されなければ、心臓組織のサンプルは１０％緩衝ホルマリンで固定化されて、パラフィンに埋め込まれ、４又は６マイクロメータに区画された。ホルマリン固定化セクションの幾つかがヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で通常の方法で染色された。ビメンチン及びヒトＣＤ４４に対して取り上げられたモノクロナールネズミ免疫抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）がアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法を適用して使われた。（１４）免疫組織化学的に染色された組織がヘマトキシリンでその後対比染色された。免疫組織化学的染色に関するポジティブ及びネガティブの制御が使用された。ｈＭＳＣは、ＣＤ４４染色によって、繊維芽細胞と区別された。ビメンチン免疫抗体はｈＭＣＳを強く染色するが、同じく大抵の間葉組織を染色する。他のセクションが、ワックスを取り除くため処理され、６分間キシレンへ露出することによって、三つのリンス液で、その後同様に１００％、９５％、５０％エタノール、脱イオン水、及びＰＢＳに露出することによって再度水和された。その後セクションは１０分間３０％の過酸化水素にさらされて、５０分間ＰＢＳで再びすすがれた。再水和されたセクションは、０.０１ｍｏｌ/Ｌのクエン酸緩衝液にさらされ、１０分間沸騰状態に加熱されて、その後室温に冷やされた。コネキシン４３（Ｃｘ４３；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）に対して取り上げられたポリクロナール免疫抗体が使われた。
【００４７】
統計値
結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計的有意性は、独立データ（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｄａｔａ）に関してスチューデントｔ−検定で決定された。Ｐ＜０.０５の値が有意とみなされた。
【００４８】
結果
ｍＨＣＮ２を用いたｈＭＳＣのトランスフェクション及びペースメーカー電流の実証
トランスフェクトされていないｈＭＳＣは、過分極の間、有意な時間依存電流を示さなかった（図１Ａ）。ＭＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣは、過分極で大きな時間依存内向き電流を発現し、−１６０ｍＶまで活性化され、続く段階の間２０ｍＶに非活性化された（図１Ｂ）。図１Ｃは、ｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣにおいて記録されたテール電流から構築されるＩｆ活性化曲線を示す（サンプル電流の挿入図を参照されたい）。データはボルツマン二状態モデルでフィッティングされ、中点（Ｖ５０）は−９１．８±０．９ｍＶであり、傾斜因子は８．８±０．５ｍＶ（ｎ＝９）であって、卵母細胞及びＨＥＫ２９３細胞におけるｍＨＣＮ２発現に関する値と同様であった。（１５、１６）Ｉｆ電流密度が大きく、すべての他の調製品において、その減少が遅いことが明らかであったので、これらの値は近似値である。結果は、もしそれらがうまくギャップジャンクションによって心室筋細胞に結合するなら、ｈＭＳＣにおいてＩｆが拡張期電位で活性化されるべきであることを示唆する。図２で例証された実験は、発現電流がＩｆであったことを確認するために実行された。電圧プロトコルから（図２の説明文を参照されたい）、我々は−３７.５±１.０ｍＶ（ｎ＝８）の逆転電位を決定することができた。５．４ｍｍｏｌ／Ｌの細胞外［Ｋ＋］が与えられ、この逆転電位は、Ｉｆチャネルの［Ｎａ＋］及び［Ｋ＋］に対する混合された選択性と矛盾しない。（１７）発現電流を遮断するＣｓ＋の効果が試験された。Ｃｓ＋（４ｍｍｏｌ／Ｌ）は、可逆的に内向き電流を遮断したが、外向きの非活性化テール電流（ｏｕｔｗａｒｄ ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔａｉｌ ｃｕｒｒｅｎｔ）の効果はほとんどなく、ＩｆのＣｓ＋遮断と矛盾しない。（１８）図２Ｄにおいて、Ｉｆのような電流に関する完全に活性化されたＩ−Ｖ関係が構築された。プロットは、生データからの二つの主要な測定結果を補強する。第１に、内向きであって外向きではないＩｆのような電流は、Ｃｓ＋によって遮断され、第２にゼロ電流はＩｆについて既に知られた性質と矛盾しない混合された選択性を示す。−１５０ｍＶにおける別のプロトコルＩｆ密度は、３１．１±３．８ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝１７）であった。トランスフェクトされたｈＭＳＣの膜容量は１１０．８±９．０ｐＦ（ｎ＝１７）であった。
【００４９】
ＩＨＣＮ２の神経液性調節
電気的ペースメーカーに対する生物学的ペースメーカーの潜在的な有利な点は、それらのホルモン調節である。ｈＭＳＣにおいて記録されたＩｆ上のβ−アドレナリン作用性物質及びムスカリン様作用物質が試験された（図３及び４）。図３Ａ及び３Ｂは、イソプロテレノール内の−８０及び−１００ｍＶにおける電流がコントロール下でのものよりも大きいのに対して、双方の条件における電流が−１６０ｍＶにおいてほぼ等しいことを示す。この電圧に依存する相違は、活性化曲線におけるシフト（図３Ｄ）に関して予測される。半活性化電圧（Ｖ５０）は、コントロール下において−９６±０．９ｍＶであり、イソプロテレノール中において８４．４±０．２ｍＶであった（ｎ＝４、Ｐ＜０.０１）。傾斜因子は、コントロール下において１０．９±０．５ｍＶであり、イソプロテレノール中において１１．０±０．２ｍＶであった（Ｐ＞０.０５）。活性化におけるシフトを説明するために２パルスプロトコルを用いると、イソプロテレノールの存在下での時間依存電圧は、第１ステップに応答してコントロール下より大きく、第２ステップに応答して小さい（図３Ｃ）。これは、Ｉｆ活性化におけるＩＳＯ誘起陽性シフトと矛盾しない。アセチルコリンは、ムスカリン様受容体の欠如、または、ｃＡＭＰのベースレベルが低くアデニルシクラーゼのアセチルコリン阻害によってさらに低減されることがないこと、のどちらかに起因して、時間依存電圧に直接影響しなかった（ｎ＝３）。従って、アセチルコリンがイソプロテレノール（図４）の作用を無効にすることができたか否かにかかわらず、それはさらにテストされた。−８０及び−１００ｍＶの段階的な過分極への応答の試験によって、アセチルコリンの添加が膜電流を低減することが示された。しかしながら、それらは−１６０ｍＶにおいてほとんど同一であり（図４Ａ及び４Ｂ）、アセチルコリンによって誘起された活性化における陰性シフトと矛盾しない。図４Ｄは、イソプロテレノール、及びイソプロテレノール＋アセチルコリンにおける活性化曲線を示す。Ｖ５０はイソプロテレノールに関して、−９１.３±１．１ｍＶであり、イソプロテレノール＋アセチルコリンに関して−１０６．６±０．８ｍＶであった（ｎ＝３、Ｐ＜０.０５）。傾斜因子は、イソプロテレノールにおいて１４．６±０．９ｍＶ、及び１１．１±０．９ｍＶであった（ｎ＝３、Ｐ＜０.０５）。２パルスプロトコルが、同様に使われた（図４Ｃ）。第１電圧ステップへの応答はイソプロテレノール＋アセチルコリンにおけるものと比較してイソプロテレノールにおけるものの方が大きいのに対して、第２ステップに関しては逆である。これは、アセチルコリンの添加によって誘起された活性化における陰性シフトとやはり矛盾しない。これらの結果は、ｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣがβ−アドレナリン作用性及びムスカリン様作用物質に応答すべきであることを示す。
【００５０】
ｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣのモジュレーションの心臓筋細胞によるインパルス開始
ｈＭＳＣにおいてペースメーカー遺伝子を発現したので、ｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣが、結合された心臓細胞の興奮性に影響を与えることができると仮定された。拡張期電位の最大値は、ＥＧＦＰ発現ｈＭＳＣで同時培養されたネズミ新生児の心室筋細胞において−７４±１ｍＶ（ｎ＝５）、ｍＨＣＮ２発現ｈＭＳＣで同時培養された筋細胞において−６７±２ｍＶ（ｎ＝６）であった（Ｐ＜０．０５）。自発的な拍動数（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒａｔｅ）は、前者のグループ（ｎ＝５）で９３±１６ｂｐｍ、及び後者のグループ（ｎ＝６、Ｐ＜０．０５）で１６１±４ｂｐｍであった。低減された拡張期電位の最大値は、ｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣにおける発現電流の閾値電位で観察されたものと矛盾せず、電気的に結合された筋細胞におけるこの脱分極電流の影響を示す。代表的な活動電位は図５に示される。
【００５１】
監視チャンバは、マルチ電極アレイ（ＭＥＡｓ）、プレ−及びフィルター増幅器、データ取得ボード及びソフトウェアからなるＰＣベースのデータ取得システム（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）である。ＭＥＡは、５０×５０ｍｍガラス基板、該ガラス基板の中央に埋め込まれた６０窒化チタンの１．４×１．４ｍｍマトリックス、金のコンタクト、窒化シリコンで絶縁され、電極間の距離が各々２００μｍである直径３０μｍの電極（マトリックスの角部には電極が存在しない）からなる。培養物は、記録電極の四つの外部列の各々から２ｍｍの位置に配置された刺激電極（２５０μｍ×５０μｍ）の四つのペアのうち一つを用いて刺激された。データは、１２−ビットの精度で１０ｋＨｚにおいて記録された。データ記録を可能にするために、ＭＥＡはインキュベータから取り除かれ、新鮮な培養媒体で常に灌流され、３７℃で５％ＣＯ２及び９５％空気からなるガス混合物で飽和された。
【００５２】
無処置イヌ心臓における生物学的ペースメーカーとしてのｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣ
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｍＨＣＮ２発現ｈＭＳＣの筋細胞への機能的な結合が実証され、それらはその後ペースメーカー機能が実証可能であるかどうか試すために（材料と方法参照）ｉｎ ｓｉｔｕでイヌの心臓に注入された。洞停止の間、エスケープペースメーカー機能は左または右心室から生じてよく、ここで起こったように、四頭のうち二頭の動物がＥＧＦＰを発現するｈＭＳＣを受けて左の、及び二頭が右の心室補充リズム（ｅｓｃａｐｅ ｒｈｙｔｈｍｓ）を発現させた。対照的に、ＥＧＦＰ＋ｍＨＣＮ２を発現するｈＭＳＣを受けた六頭のうち五頭の動物が、左心室から生じて、ペースマップされたリズムを発現し、その生じる位置はｈＭＳＣ注入の位置に近い。さらに、これらの動物の心室特有の拍動数（ｉｄｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｒａｔｅｓ）は、ＥＧＦＰ単独を発現するｈＭＳＣを受けた動物において６１．５±５対４５±１ｂｐｍだった（Ｐ＜０．０５）。代表的な実験は、図６に示される。
【００５３】
ｈＭＳＣ注入サイトのヘマトキシリン及びエオシン染色は、通常の心臓筋細胞及びニードルトラックに隣接する好塩基性浸潤の高密度領域を示した（図７Ａ）。ｈＭＳＣは、それらのサイズ（直径１０から２０μｍ）、大きな高色素性核、及びマトリックスを持たない、乏しい、深い好塩基性細胞質によって容易に同定される。ｈＭＳＣはＨ＆Ｅ染色の特徴的な外観を有するけれども、免疫組織化学的染色を用いることによってそれらはより正確に同定される。ｈＭＳＣは、間葉性起源の細胞のマーカーである、ビメンチンに関して強く染色された（例えば、図７Ｂ）。同じ領域は、ヒトＣＤ４４に関しても陽性であった（例えば、図７Ｃ）。ｈＭＳＣと心筋との間の交互嵌合は非常に明瞭であった（例えば、図７Ｄ）。
【００５４】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ及びＩｎ Ｖｉｖｏにおいて心筋細胞とのギャップジャンクションを形成するｈＭＳＣ
ｈＭＳＣが電気的に心筋細胞と結合するかどうか試すために、ｈＭＳＣがイヌ成体の心室筋細胞と同時培養された。筋細胞は分離されて、ｈＭＳＣとの同時培養の前に、１２から７２時間の間培養された。ｈＭＳＣを筋細胞培養物に添加した後、６から１２時間結合が測定された。初期の観察は、幹細胞が心臓の細胞に結合することを明らかにする。図８Ａは、同時培養中のｈＭＳＣ筋細胞ペアの一例を示す；これまでのところ観察された四つのうちの一つである。非対応のペアの同定に関して、ｈＭＳＣはＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識を付けられた。（１１）双極性の電圧ランププロトコルが、２００ｍＶ/１５秒の速度で（Ｖ１及びＶ２参照）±１００ｍＶの範囲でトランスジャンクション電圧Ｖｊ（Ｖ２−Ｖ１）を変えるために用いられ、図８Ｂに示される。ランプパルスは、筋細胞（Ｖ１）に印加され、一方でｈＭＳＣの膜電位は０ｍＶ（Ｖ２）で保たれた。関連づけられた姉妹電流、Ｉ１及びＩ２、はそれぞれ筋細胞及びｈＭＳＣから記録された。電流は電圧ランププロファイルに従い、非対応のｈＭＳＣ−筋細胞ペアのギャップジャンクション結合を実証した。電流、Ｉ２、は、非ステップｈＭＳＣから得られ、結合電流Ｉｊを反映する。この記録は、ｈＭＳＣが心室筋細胞に有効に結合していることを実証する。図８Ｃは、イヌ心臓内部へのｈＭＳＣの注入サイトのアンチＣｘ４３免疫抗体による免疫組織化学的染色を示す。横線が心筋層中に現れる（紫の矢印を参照）のに対して、Ｃｘ４３に関する小さな斑点状の染色がｈＭＳＣ間にみられた（白い矢印）。ｈＭＳＣと筋細胞との間の界面にもＣｘ４３染色がある（赤い矢印）。図８Ｃの挿入図は、ＥＧＦＰプラスＨＣＮ２を発現するｈＭＳＣを注入された（０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩バッファ内で４％のパラホルムアルデヒドで、ｐＨ７．４、４℃において固定化され、その後、Ｗａｌｃｏｔｔら（１５）によって記述されるように、処理された）心筋層片の一部分を示す。第２の免疫抗体からＥＧＦＰへの赤い染色はｈＭＳＣの局在化を示すのに対して、青の染色は細胞核を示す。クラスター化された細胞の有意の大部分はｈＭＳＣである。
【００５５】
議論
ペースメーカー移植は、完全な心臓ブロック又は洞結節機能障害に対する主要な治療法である。現在の治療は信頼性が高く、罹病率が低い電子装置を使う。それにもかかわらず、それらが本来の組織の生物学的な反応性に欠けるから、このような装置は最適ではない。最近、いくつかのアプローチが生物学的なペースメーカー機能を提供するために試みられた。これらの試みの中には、β２−アドレナリン作用性レセプターの上方制御(ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ)、バックグラウンドのＫ＋電流ＩＫｌの下方制御(ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ)及び我々自身のＨＣＮ２遺伝子の過剰発現に関する以前の研究、内因性の心臓ペースメーカー電流Ｉｆの分子相関物があった。（２−６）これらのうち後者の研究において、左心房内または隣接する索糸システム内の局所的なＨＣＮ２過剰発現は、Ｉｆのような電流、及び受容体筋細胞内のｉｎ ｓｉｔｕペースメーカー機能の両方を誘起する。Ｉｆコンダクタンスの唯一の電圧依存性は、活動電位プラトーの間ではなく、心拡張期の間電流をもたらし、活動電位波形の有意の交替に付随する可能性がある合併症を制限する。アデノウィルス構造が心臓にＨＣＮ２遺伝子を届けるために使われたけれども（５、６）、アデノウィルスがエピソームであり、及びそれらが輸送する核酸がゲノムに統合しないから、このアプローチは最適ではない。他のウィルスのシステムには、生体内でそれらの使用を妨げる多くの重大な欠点が伴う。
【００５６】
生物学的ペースメーカーを製造するための代わりの手段は胚幹細胞によるものであり、心臓の系統に沿って区別されることができて、心臓のリズムの細胞ベースの制御に関するプラットフォームを提供する可能性がある。胚幹細胞が機能的なギャップジャンクションを作って、及び自発的な電気の活動を生み出すことができる。（２０）しかしながら、それらの免疫原性のために、拒絶反応が重大な要件である。さらに、ｈＭＳＣと同じように、胚幹細胞調製が空間的に均一ではなく、及び、ｉｎ ｖｉｖｏの生物学的ペースメーカーを設計することにおいて、両方の細胞ベースのシステムの適切なエンジニアリングは難問を提起する。
【００５７】
いくつかの理由で、ｈＭＳＣは遺伝子輸送用途のための魅力的な細胞の伝達手段である。それらは、通常の臨床手順を通じて比較的多数得られてよい。ｈＭＳＣは、培養物中で容易に拡張され、長期のトランスジーン発現をする性能がある。（２１）それらの管理は、自己由来、または銀行経由であってよく、それらが免疫的に優先であってよい証拠が与えられる。（２２）そのようなペースメーカーの長期機能は、ｍＨＣＮ２の長期発現に基づき、代わりにｈＭＳＣのゲノム内部への統合を必要とする。ランダムな統合は、細胞サイクルまたは腫瘍抑制内に含まれる遺伝子の分裂（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）の可能性を増大するか、または後成的変化の原因となる可能性がある。しかしながら、ここで使用されるｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクション方法は、ＤＮＡ統合サイト（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）が使用される前に評価されること、及び細胞キャリアがフェイル−セーフデスメカニズムで遺伝子工学的に作り変えることを可能にする。
【００５８】
この研究の目的は心臓内部へのペースメーカー遺伝子の全身性輸送において遺伝子改変されたｈＭＳＣをプラットフォームとして使用することの実現可能性をテストすることであった。ＨＣＮ２がこの研究のためにモデルシステムの役割をした。遺伝子組み換えされたｈＭＳＣはＩｆのような電流を発現して、及び同時培養されたネズミ新生児の筋細胞の自発的な拍動数を増加することができ、及びイヌの心臓内で迷走神経によって引き起こされた洞停止の間に心室リズムを生じさせることができた。ＥＧＦＰのみを発現するコントロールｈＭＳＣはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのどちらであってもこれらの効果を及ぼさなかった。このように、ｍＨＣＮ２遺伝子でトランスフェクトされたｈＭＳＣの電気的効果はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏシステムにおける筋細胞内での同じ遺伝子の過剰発現の効果と類似していた。これらの知見はｈＭＳＣが心臓移植のためのペースメーカー遺伝子の輸送に対する代替的なアプローチとして使われるかもしれないことを示唆する。
【００５９】
洞結節筋細胞でＨＣＮ遺伝子は心臓の興奮に必要な内向き電流を生成する。洞房結節細胞と異なり、ｍＨＣＮ２によってトランスフェクトされたｈＭＳＣは興奮しにくく、なぜならそれらは活動電位を生成するために必要とされる他の電流に欠けるからである。しかしながら、これらの細胞は結合した筋細胞に広がる脱分極電流を生成することができ、筋細胞を閾値にさせる。ｈＭＳＣがペースメーカー遺伝子を含んで、及びギャップジャンクションを経由して心筋細胞に結合する限り、それらが標準的な主要なペースメーカー、洞房結節と同様の方法で、心臓のペースメーカーとしての役割を果たすであろうことは仮定される。それは、ｈＭＳＣがイヌの心筋細胞と電気的に結合するギャップジャンクションを形成する二重のパッチテクニックを使って実証された。移植されたｈＭＳＣと心筋細胞との間の結合も、アンチ−コネキシン４３免疫抗体を用いて、ｈＭＳＣ注入サイトから単離された組織の免疫組織学的染色によって同様に示された。注入サイトの内部で、細胞のクラスターはビメンチン及びＣＤ４４陽性であり、及びそれは同じく有意な大多数の細胞のクラスターがＥＧＦＰ陽性であることも実証し、その結果それらがｈＭＳＣであると同定した。最近の報告は、マウスＭＳＣが０.００５％の融合速度（ｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ）でｉｎ ｖｉｖｏでマウス筋細胞と融合することができることを示唆した。（２３）この可能性は除外されなかったが、しかしＭｏｒｉｍｏｔｏらによって報告された融合速度では、（２３）注入された百万の細胞のうちたった５０のｈＭＳＣが融合するであろう。
【００６０】
この研究で使われたアプローチには限界がある。最初に、ｈＭＳＣは規則正しい収縮のために最適なサイトではなく、自由な壁心筋層に輸送された。しかしながら、最近カテーテルアプローチがペースメーカー遺伝子をイヌの左の索枝システムに挿入するために使われた。（６）このような位置はペースメーカーが自由な壁に存在するという状態で、より規則的な及び通常の活性化及び収縮の可能性を提供する。このアプローチがｈＭＳＣのために使われる前に、細胞の損傷または破壊なしでｈＭＳＣのサイズの細胞の注入を最適化するためにカテーテルを改良する必要があるかもしれない。
【００６１】
もう１つの質問は、これらのペースメーカーの有効性の持続時間に関連している。本研究は遺伝子輸送システムとしてｈＭＳＣを使用することの実現可能性を実証することに専心している。ｉｎ ｖｉｖｏの研究が３から１０日続いたのみであるため、一時的なトランスフェクションは十分なものであった。このアプローチが臨床的に適切であるとみなされ得る前に、はるかに長い研究期間が必要とされるであろう。この点に関して、トランスフェクトされた細胞は、安定して発現する細胞を選択する抗生物質上に成長されるとき、少なくとも３カ月間それらの緑の蛍光発光を維持する。これはｍＨＣＮ２を発現する安定したクローンに関する選択を示し、発現の持続性がより長期の研究に大きな困難を与えないことはありそうである。しかしながら、ｈＭＳＣの分化状態がｉｎ ｓｉｔｕで長期の間に変化させられるか、またはこのような分化がｍＨＣＮ２発現または生物物理学的特性に影響を与えるかどうか、が明確にされなくてはならない。さらに、ヒトの遺伝子にシーケンスで非常に近いが、完全に同一でないハツカネズミ遺伝子がここでは使われた。ヒトの遺伝子を使うことは最も有利であるであるだけではなく、神経液性反応と同様、活性化及び回復特性を最適化するための種々の突然変異を検証することは望ましいであろう。このようなアプローチは現在探究されている。
【００６２】
イヌの心臓にｍＨＣＮ２を発現するｈＭＳＣを輸送することは、ｈＭＳＣベースの生物学的ペースメーカーを調製することの実現可能性の実証だけではなく、一般的な原則の最初の具体的な例である：ｈＭＳＣが合胞体組織の機能に影響を与えるいろいろな遺伝子を輸送するために使われてよい。１つの代替的な潜在的な心臓血管用途は、心室平滑筋を過分極して緩和を誘起するＫ＋チャンネル遺伝子の輸送である。実際に、ｈＭＳＣによって運ばれる有効搭載量は膜チャンネルに制限される必要がない：ギャップジャンクションを貫通できる遺伝子プロダクトまたは低分子（ＭＷ＜１０００、小さい方の直径＜１．２ｎｍ）はｈＭＳＣに組み込まれることができ、及びその治療の目標として合胞体組織に輸送されることができる。
【００６３】
参考文献
１．Ｚｉｖｉｎ Ａ， Ｂａｒｄｙ ＧＨ． Ｃａｒｄｉａｃ ｐａｃｅｍａｋｅｒｓ． Ｉｎ： Ｓｐｏｏｎｅｒ ＰＭ， Ｒｏｓｅｎ ＭＲ， ｅｄｓ． Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｒｄｉａｃ Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ： ２００１； ５７１−５９８．
【００６４】
２．Ｅｄｅｌｂｅｒｇ ＪＭ， Ａｉｒｄ ＷＣ， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＲＤ． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｃａｒｄｉａｃ ｃｈｒｏｎｏｔｒｏｐｙ ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ β２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃＤＮＡ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９８； １０１： ３３７−３４３．
【００６５】
３．Ｅｄｅｌｂｅｒｇ ＪＭ， Ｈｕａｎｇ ＤＴ， Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ ＭＥ， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＲＤ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃａｒｄｉａｃ ｃｈｒｏｎｏｔｒｏｐｙ． Ｈｅａｒｔ． ２００１； ８６： ５５９−５６２．
【００６６】
４．Ｍｉａｋｅ Ｊ， Ｍａｒｂａｎ Ｅ， Ｎｕｓｓ ＨＢ． Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ： ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｃｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００２； ４１９： １３２−１３３．
【００６７】
５．Ｑｕ Ｊ， Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖ ＡＮ， Ｄａｎｉｌｏ Ｐ Ｊｒ， Ｓｌａｐａｋｏｖａ Ｉ， Ｃｏｈｅｎ ＩＳ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＢ， Ｒｏｓｅｎ ＭＲ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｉｎ ｃａｎｉｎｅ ｈｅａｒｔ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００３； １０７： １１０６−１１０９．
【００６８】
６．Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖ ＡＮ， Ｓｏｓｕｎｏｖ ＥＡ， Ｑｕ Ｊ， Ｓｈｌａｐａｋｏｖａ Ｉ， Ａｎｙｕｋｈｏｖｓｋｙ ＥＰ， Ｌｉｕ Ｌ， Ｊａｎｓｅ ＭＪ， Ｂｒｉｎｋ ＰＲ， Ｃｏｈｅｎ ＩＳ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＢ， Ｄａｎｉｌｏ Ｐ Ｊｒ， Ｒｏｓｅｎ ＭＲ． Ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｎｉｎｅ ｌｅｆｔ ｂｕｎｄｌｅ ｂｒａｎｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｅｓｃａｐｅ リズムｓ ｈａｖｉｎｇ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｒａｔｅｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００４； １０９： ５０６−５１２．
【００６９】
７．Ｇｅｐｓｔｅｉｎ Ｌ． Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００２； ９１： ８６６− ８７６．
【００７０】
８．Ｈａｍｍ Ａ， Ｋｒｏｔｔ Ｎ， Ｂｒｅｉｂａｃｈ Ｉ， Ｂｌｉｎｄｔ Ｒ， Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ＡＫ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． ２００２； ８： ２３５−２４５．
【００７１】
９．Ｙｕ Ｈ， Ｇａｏ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｗｙｍｏｒｅ Ｒ， Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ Ｓ， ＭｃＫｉｎｎｏｎ Ｄ， Ｒｏｓｅｎ ＭＲ， Ｃｏｈｅｎ ＩＳ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｔｏ ｉｎ ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ ａｎｄ ｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｔｈｅ ｃａｎｉｎｅ ｈｅａｒｔ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０００； ８６： １０６２−１０６８．
【００７２】
１０．Ｚｈｏｕ ＹＹ， Ｗａｎｇ ＳＱ， Ｚｈｕ ＷＺ， Ｃｈｒｕｓｃｉｎｓｋｉ Ａ， Ｋｏｂｉｌｋａ ＢＫ， Ｚｉｍａｎ Ｂ， Ｗａｎｇ Ｓ， Ｌａｋａｔｔａ ＥＧ， Ｃｈｅｎｇ Ｈ， Ｘｉａｏ ＲＰ． Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ： ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ （Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ）． ２０００； ２７９： Ｈ４２９−Ｈ４３６．
【００７３】
１１．Ｖａｌｉｕｎａｓ Ｖ， Ｗｅｉｎｇａｒｔ Ｒ， Ｂｒｉｎｋ ＰＲ． Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｂｙ ｃｏｎｎｅｘｉｎｓ ４０ ａｎｄ ４３． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０００； ８６： ｅ４２−ｅ４９．
【００７４】
１２．Ｐｒｏｔａｓ Ｌ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＢ． Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ Ｉｃａ，Ｌ ｖｉａ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｙ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９９９； ２７７： Ｈ９４０−Ｈ９４６．
【００７５】
１３．Ｒｏｓｅｎｓｈｔｒａｕｋｈ Ｌ， Ｄａｎｉｌｏ Ｐ Ｊｒ， Ａｎｙｕｋｈｏｖｓｋｙ ＥＰ， Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ＳＦ， Ｒｙｂｉｎ Ｖ， Ｂｒｉｔｔａｉｎ−Ｖａｌｅｎｔｉ Ｋ， Ｍｏｌｉｎａ− Ｖｉａｍｏｎｔｅ Ｖ， Ｒｏｓｅｎ ＭＲ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｖａｇａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｒｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｅｔｈａｌ ａｒリズムｉａｓ ｉｎ ｃａｔｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． １９９４； ７５： ７２２−７３２．
【００７６】
１４．Ｈｓｕ Ｓ， Ｒａｉｎｅ Ｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ， ａｖｉｄｉｎ， ａｎｄ ｂｉｏｔｉｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． １９８１； ２９： １３４９−１３５３．
【００７７】
１５．Ｙｕ Ｈ， Ｗｕ Ｊ， Ｐｏｔａｐｏｖａ Ｉ， Ｗｙｍｏｒｅ ＲＴ， Ｈｏｌｍｅｓ Ｂ， Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ Ｊ， Ｐａｎ Ｚ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｓｈｉ Ｗ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＢ， Ｅｌ− Ｍａｇｈｒａｂｉ ＭＲ， Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｗ， Ｄｉｘｏｎ Ｊ， ＭｃＫｉｎｎｏｎ Ｄ， Ｃｏｈｅｎ ＩＳ， Ｗｙｍｏｒｅ Ｒ． ＭｉｎＫ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ １： Ａ β ｓｕｂｕｎｉｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ＨＣＮ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｓｕｂｕｎｉｔ ｆａｍｉｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｅｄｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００１； ８８： ｅ８４−ｅ８７．
【００７８】
１６．Ｍｏｏｓｍａｎｇ Ｓ， Ｓｔｉｅｂｅｒ Ｊ， Ｚｏｎｇ Ｘ， Ｂｉｅｌ Ｍ， Ｈｏｆｍａｎｎ Ｆ， Ｌｕｄｗｉｇ Ａ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００１； ２６８： １６４６−１６５２．
【００７９】
１７．ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ Ｄ． Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｏｎｉｃ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎ ｃａｌｆ Ｐｕｒｋｉｎｊｅ ｆｉｂｒｅｓ． Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９８１； ３１４： ３７７−３９３．
【００８０】
１８．ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ Ｄ． Ｂｌｏｃｋ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｎ ｃａｌｆ Ｐｕｒｋｉｎｊｅ ｆｉｂｒｅｓ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ， ｃａｅｓｉｕｍ ａｎｄ ｒｕｂｉｄｉｕｍ． Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９８２； ３２９： ４８５−５０７．
【００８１】
１９．Ｗａｌｃｏｔｔ Ｂ， Ｍｏｏｒｅ ＬＣ， Ｂｉｒｚｇａｌｉｓ Ａ， Ｃｌａｒｏｓ Ｎ， Ｖａｌｉｕｎａｓ Ｖ， Ｏｔｔ Ｔ， Ｗｉｌｌｅｃｋｅ Ｃ， Ｂｒｉｎｋ ＰＲ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｌｕｉｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｒｉｍａｌ ｇｌａｎｄｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００２； ２８２： Ｃ５０１−Ｃ５０７．
【００８２】
２０．Ｂｏｈｅｌｅｒ ＫＲ， Ｃｚｙ Ｊ， Ｔｗｅｅｄｉｅ Ｄ， Ｙａｎｇ ＨＴ， Ａｎｉｓｉｍｏｖ ＳＶ， Ｗｏｂｕｓ ＡＭ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００２； ９１： １８９−２０１．
【００８３】
２１．Ｚｈａｎｇ ＸＹ， Ｌａ Ｒｕｓｓａ ＶＦ， Ｂａｏ Ｌ， Ｋｏｌｌｓ Ｊ， Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｐ， Ｒｅｉｓｅｒ Ｊ． Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ− ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００２； ５： ５５５−５６５．
【００８４】
２２．Ｌｉｅｃｈｔｙ ＫＷ， ＭａｃＫｅｎｚｉｅ ＴＣ， Ｓｈａａｂａｎ ＡＦ， Ｒａｄｕ Ａ， Ｍｏｓｅｌｅｙ ＡＭ， Ｄｅａｎｓ Ｒ， Ｍａｒｓｈａｋ ＤＲ， Ｆｌａｋｅ ＡＷ． Ｈｕｍａｎ ｍｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｎｇｒａｆｔ ａｎｄ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｓｉｔｅ− ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｅｅｐ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２０００； ６： １２８２− １２８６．
【００８５】
２３．Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｙ， Ｄａｖｉｓ ＢＨ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｏｓ Ｅ−Ｊ， ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ＭＤ， Ｔａｙｌｏｒ Ｄ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｕｓｅ ｗｉｔｈ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００３； １０８： ＩＶ−５４８． Ａｂｓｔｒａｃｔ．
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ｍＨＣＮ２遺伝子をトランスフェクションしたｈＭＳＣｓ中のＩｆの機能発現。
【図２】Ｃｓ＋の細胞外での適用の効果及びＩｆの反転電位の測定。
【図３】ｍＨＣＮ２遺伝子をトランスフェクションしたｈＭＳＣｓにおけるイソプロテレノール（ＩＳＯ）によるＩｆ活性化の修正。
【図４】ＩＳＯの存在下におけるアセチルコリン（ＡＣｈ）によるＩｆの活性化の修正。
【図５】ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおけるペースメーカー機能。
【図６】ｉｎ ｓｉｔｕのイヌの心臓におけるペースメーカー機能。
【図７】ｈＭＳＣｓ注入サイトのヘマトキシン及びエオシン染色。
【図８】ｈＭＳＣ−イヌの心室筋細胞のペア間のギャップジャンクション。
【技術分野】
【０００１】
この出願は２００４年７月１９日に出願された暫定的な米国特許出願第６０/５８９,４１６の利益を要求するものであり、その内容は参考のためここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は米国政府ＮＩＧ ＮＨＬＢＩ助成金第ＨＬ−２８９５３のサポートでなされた。従って、米国政府は本発明に一定の権利を持っている。
【０００３】
この出願を通じて、様々な刊行物が数字によって参照される。完全な引用は、明細書の終わりの部分に見出されるであろう。全体としてこれらの刊行物の開示は、ここに記述され請求される発明の日現在従来技術を当業者に対してより完全に記述するために、この出願に参考としてここに組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
電子ペースメーカーは、現在心臓ブロックと他の電気生理学的異常箇所の治療の頼みの綱であるけれども、最適なものではない。それらの欠点の中には、限定された電池寿命、心臓の中への永久のカテーテル移植の必要性、及び自律神経液に対する反応の欠如がある（１）。これらの理由で、いくつかの遺伝子治療アプローチが潜在的な選択肢として探究されている。これらは、野生型遺伝子Ｋｉｒ２．１（４）と共に表現されるとき、内部の整流電流を抑制するためβ２−アドレナリン性レセプターが使用するドミナントネガティブコンストラクトの過剰発現、及びペースメーカージーン（ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｇｅｎｅ）、ＨＣＮ２、を持たせたベクターの心房（５）または索枝システム（ｂｕｎｄｌｅ ｂｒａｎｃｈ ｓｙｓｔｅｍ）内部への注入のどちらかを含む（６）。これらのアプローチ（２−６）のいくつかに固有の問題は、必要な遺伝子を届けるためのウィルスの使用である。ベクターは、今まで伝染の可能性をほとんど持たなない複製欠損性なアデノウィルスであったけれども、これらは、潜在的な炎症性の反応と同様に、ペースメーカー機能を一時的に改良する可能性を取り入れるだけである。レトロウィルス及び他のベクターの使用は生物学的なペースメーカーにおいていまだ試みられていないけれども、電子ペースメーカーの現在の成功を与えられた、発がん性と不当な感染性の危険を伴う。ヒト胎児の幹細胞をペースメーカーを作るために使う試みがまだ始まったばかりであり、適切な細胞系統の識別、ペースメーカー細胞以外のラインの中への分化、及び腫瘍形成の可能性についての問題を有する（総説（７）を参照されたい）。
【非特許文献１】Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｒｄｉａｃ Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ： ２００１； ５７１−５９８
【非特許文献２】Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８；１０１：３３７−３４３
【非特許文献３】Ｈｅａｒｔ． ２００１；８６：５５９−５６２
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ． ２００２；４１９：１３２−１３３
【非特許文献５】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００３；１０７：１１０６−１１０９
【非特許文献６】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００４；１０９：５０６−５１２
【非特許文献７】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００２；９１：８６６−８７６
【非特許文献８】Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． ２００２；８：２３５−２４５
【非特許文献９】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０００；８６：１０６２−１０６８
【非特許文献１０】Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ （Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ）． ２０００；２７９：Ｈ４２９−Ｈ４３６
【非特許文献１１】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０００；８６：ｅ４２−ｅ４９
【非特許文献１２】Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９９９；２７７：Ｈ９４０−Ｈ９４６
【非特許文献１３】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． １９９４；７５：７２２−７３２
【非特許文献１４】Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． １９８１；２９：１３４９−１３５３
【非特許文献１５】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００１；８８：ｅ８４−ｅ８７
【非特許文献１６】Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００１；２６８：１６４６−１６５２
【非特許文献１７】Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９８１；３１４：３７７−３９３
【非特許文献１８】Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９８２；３２９：４８５−５０７
【非特許文献１９】Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００２；２８２：Ｃ５０１−Ｃ５０７
【非特許文献２０】Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００２；９１：１８９−２０１
【非特許文献２１】Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００２；５：５５５−５６５
【非特許文献２２】Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２０００；６：１２８２−１２８６
【非特許文献２３】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００３；１０８：ＩＶ−５４８．Ａｂｓｔｒａｃｔ．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は合胞体細胞のリズムを変える遺伝子構造物（ｇｅｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の能力を決定するための方法を提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ｉ）遺伝子構造物を合胞体細胞に接触させ；及び（ｉｉ）接触された合胞体細胞のリズムが、遺伝子構造物が接触されなかった合胞体細胞におけるものと異なっているかどうかを決定し、結果的に遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変えるかどうかを決定する。
【０００６】
本発明は合胞体細胞の収縮性を変更する遺伝子構造物の能力を決定するための方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ｉ）遺伝子構造物を合胞体細胞に接触させ；及び（ｉｉ）接触された合胞体細胞の収縮性が、遺伝子構造物が接触されなかった合胞体細胞におけるものと異なっているかどうか決定し、結果的に遺伝子構造物が合胞体細胞の収縮性を変えるかどうか決定する。
【０００７】
本発明は合胞体細胞への遺伝子構造物の結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を決定する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、遺伝子構造物を合胞体細胞と接触させ；（ｂ）接触された合胞体細胞のリズムを決定し；及び（ｃ）遺伝子構造物と接触するよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、合胞体細胞への遺伝子構造物の結合は、接触された合胞体細胞のリズムが遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される。
【０００８】
本発明は、合胞体細胞のリズムを変えることができる遺伝子構造物を製造する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変える能力は、接触された合胞体細胞のリズムが遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と；及び（ｅ）合胞体細胞のリズムを変える能力を持つと決定された、段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【０００９】
本発明は、合胞体細胞の収縮性を変える能力を有する遺伝子構造物を製造する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞の収縮性を決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞の収縮性で決定された収縮性と比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞の収縮性を変える能力は、接触された合胞体細胞の収縮性が遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞の収縮性と異なることで示される段階と；及び（ｅ）合胞体細胞の収縮性を変える能力を持つと決定された、段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【００１０】
最終的に、本発明は合胞体細胞と結合する能力を有する遺伝子構造物を製造するための方法を提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、遺伝子構造物の合胞体細胞への結合は、接触された合胞体細胞のリズムが遺伝子構造物に接触するより前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と；及び（ｅ）合胞体細胞と結合していることが決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
図面に関する簡単な記述
図１Ａ−１Ｃ ｍＨＣＮ２遺伝子でトランスフェクトされたｈＭＳＣ中のＩｆの機能発現。
Ｉｆは、ｍＨＣＮ２遺伝子をトランスフェクトしたｈＭＳＣで現れる（Ｂ）が、トランスフェクトしていない幹細胞では現れない（Ａ）。（Ｃ）は、ボルツマン方程式によってＩｆの規格化されたテール電流にフィッティングされ、中点が−９１．８±０．９ｍＶ、傾きが８．８±０．５ｍＶ（ｎ＝９）である。Ｉｆは、活性化の閾値が−６０ｍＶで、−１４０ｍＶ付近で完全に活性化された。挿入図は、Ｉｆ活性化曲線を構築するのに使用される代表的なテール電流を示す。電圧プロトコルは、−３０ｍＶで保持され、１．５秒間過分極され−４０から−１６０ｍＶの間−１０ｍＶ毎の増加の後、１．５秒の電圧ステップで＋２０ｍＶとし、テール電流を記録した。
【００１２】
図２Ａ−２Ｄ Ｃｓ＋の細胞外での適用の効果及びＩｆの逆転電位の測定
Ｉｆは、４ｍｍｏｌ／ＬのＣｓ＋の外部添加の前に（Ａ）、添加の間（Ｂ）、及び添加の後に（Ｃ）記録された。（Ｄ）は、Ｃｓ＋が存在しない状況下における完全に活性化されたＩｆのＩ−Ｖ関係である。電圧プロトコルは、−３０ｍＶで保持され、−１５０ｍＶで２秒間過分極され、その後完全に活性化された電流−電圧関係を構築するのに必要なテール電流を記録するため−１５０から＋２０ｍＶの間の電圧に１．５秒間脱分極され、その後０．５秒ステップで−１０ｍＶとした。
【００１３】
図３Ａ−３Ｄ ｍＨＣＮ２遺伝子でトランスフェクトされたｈＭＳＣにおけるイソプロテレノール（ＩＳＯ）によるＩｆ活性化のモジュレーション
ＩＳＯが存在しない状態で（Ａ）、及び１×１０−６ｍｏｌ／ＬでＩＳＯが存在する状態でのＩｆ活性化。（Ｃ）は、コントロールされた（ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＩＳＯ、及び二段階パルスプロトコルを用いてウォッシュアウト（ｗａｓｈｏｕｔ）されたＩｆ活性化の電圧依存性。（Ｄ）テール電流の規格化密度へのボルツマンフィッティング。活性化曲線は、図１に示すのと同様のプロトコルで構築された。二つのパルスのプロトコルは、−３０ｍＶに保持された電位から初期化された。最初のステップは１．５秒間、−１００ｍＶまで、その後の第２ステップは１秒間、−１５０ｍＶまでであった。その後電圧は１秒間＋１５ｍＶに上げられて、電流を迅速に非活性化し、及び次に保持電位に戻された。
【００１４】
図４Ａ−４Ｄ ＩＳＯの存在下におけるアセチルコリン（ＡＣｈ）によるＩｆの活性化のモジュレーション
ＩＳＯが存在する状態で、ＡＣｈが存在しない状態（Ａ）、及びＡＣｈが（１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）存在する状態でのＩｆ活性化。（Ｃ）ＩＳＯ（１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ）単独及びＩＳＯ＋ＡＣｈに関する、図３Ｃと同様な二段階プロトコル。（Ｄ）規格化電流へのボルツマンフィッティング。活性化曲線は、図１と同様なプロトコルで構築された。
【００１５】
図５Ａ−５Ｂ ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおけるペースメーカー機能
ＥＧＦＰのみトランスフェクトされた（Ａ）及びｍＨＣＮ２とＥＧＦＰとをトランスフェクトされた（Ｂ）ｈＭＳＣで４から５日間同時培養されたネズミ新生児心室筋細胞の自発的な電気活動。実験は３５℃で行なわれた。
【００１６】
図６ ｉｎ ｓｉｔｕにおけるイヌの心臓のペースメーカー機能
上から下へ、ＥＣＧはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＡＶＲ、ＡＶＬ及びＡＶＦを誘導する。左側、洞調律における二つの拍及び迷走神経の刺激の開始（矢印）は、ＬＶ前面壁心外膜においてｍＨＣＮ２トランスフェクトｈＭＳＣを移植した７日後研究されたイヌに洞停止をもたらす。中央、迷走神経の刺激が続く間、心室固有のエスケープフォーカス（ｅｓｃａｐｅ ｆｏｃｕｓ）が、規則正しいリズムを持って現れる。右側、迷走神経の刺激が停止して（矢印）、ポストベーガル（ｐｏｓｔｖａｇａｌ）洞性頻拍が存在する。
【００１７】
図７Ａ−７Ｄ ｈＭＳＣ注入サイトのヘマトキシン及びエオシン染色
（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色は、好塩基性染色された幹細胞及び通常の心筋を示す。（Ｂ）及び（Ｃ）イヌの心筋内で、それぞれ、ｈＭＳＣの結節のビメンチン及びＣＤ４４の染色を示す。（Ｄ）心筋で分散しているビメンチンによって染色された細胞の細部。倍率Ｘ１ＯＯ（Ａ）及びＸ４００（ＢからＤ）。
【００１８】
図８ ｈＭＳＣ−イヌの心室筋細胞のペア間のギャップジャンクション
（Ａ）ｈＭＳＣ筋細胞の位相コントラスト顕微鏡像及びピペット１及び２の位置。（Ｂ）イヌ筋細胞に印加された圧力ランプ（Ｖ１＝±１００ｍＶ；Ｖ２＝０）は、ホールセルモードで筋細胞、Ｉ１、及びｈＭＳＣ、Ｉ２、に取り付けられたパッチピペットを通じて電流を引き起こした。上げられた（ｓｔｅｐｐｅｄ）筋細胞から記録された電流、Ｉ１、は二つの成分、筋細胞のジャンクション電流（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｕｒｒｅｎｔ）及び膜電流、の合計を表す。上げられていない（ｎｏｎｓｔｅｐｐｅｄ）ｈＭＳＣから記録されるミラー電流、Ｉ２、はｈＭＳＣ−筋細胞ペア間のジャンクション電流（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｕｒｒｅｎｔ）、Ｉｊ、に対応する。（Ｃ）注入サイトと心筋との間の界面の領域におけるＣｘ４３の免疫染色。ＤＡＰＩ染色は核を示す。矢印は、紫、挿入されたディスク；白、ｈＭＳＣの間のＣｘ４３染色；赤、ｈＭＳＣと筋細胞との間のＣｘ４３染色。挿入図はもう１匹の動物からのセクションが染色されたＤＡＰＩ及びＥＧＦＰ免疫抗体、パラホルムアルデヒド固定を受け、及び注入サイトがｈＭＳＣを含有することを確かめるために反ＥＧＦＰ（ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ）及びＤＡＰＩで免疫染色された。Ｍが心筋；Ｓ、ｈＭＳＣを示す。
【００１９】
定義
この出願で使われるように、ここに特に明確に与えられる以外では、次の用語のそれぞれが、以下に説明する意味を有する。
【００２０】
ここに使われるように、「投与する」ことは、当業者に知られている様々な方法及びデリバリーシステムを用いて、達成または実施されてよい。投与は、例えば、静脈を通して、経口で、経鼻で、移植を通じて、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、及び皮下に実施されてよい。以下のデリバリーシステムは、多数の通常使用される薬学的に受容できるキャリアを用いて、すぐに使用可能な方法による配合物の投与に対して想定された多くの実施形態の代表にすぎない。
【００２１】
ここに使われるように、「エージェント」は、制限なしで、有機化合物、核酸、ポリペプチド、脂質及び炭水化物を含むべきである。エージェントは、例えば、構造及び／又は機能に関して知られているエージェントと、構造又は機能に関して知られていないものとを含む。特定の実施形態では、エージェントが所定の構造と、憂うつのような、非神経障害に関連した効果を有することが知られているが、しかし神経障害に関連した所定の効果を持つことは知られない。
【００２２】
ここに使われるように、「心臓の筋細胞」は、分離されるか、又は培養液中で、電流を起こすことができる、心臓の筋肉又は通道組織から生じた筋細胞であることを意味する。
【００２３】
ここに使われるように、「遺伝子構造物」は遺伝子組み換えされた細胞を意味するべきである。
【００２４】
ここに使われるように、「ＨＥＲＧ遺伝子」は、単離された心臓の筋細胞から記録されるＩＫｒ電流を生成するヒトのｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子を意味する。
【００２５】
ここに使われるように、「被験者」は、どんな動物でも、例えばヒト以外の霊長類、マウス、ラット、テンジクネズミ、イヌ、猫、又はうさぎを意味するべきである。
【００２６】
ここに使われるように、「合胞体細胞」は、心臓、膀胱、肝臓、又は消化管等の、合胞体構造からの細胞をさす。
【００２７】
本発明は合胞体細胞のリズムを変える遺伝子構造物の能力を決定するための方法を提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ｉ）合胞体細胞を遺伝子構造物と接触する段階と；及び（ｉｉ）接触された合胞体細胞のリズムが、遺伝子構造物と接触されなかった合胞体細胞にけるリズムと異なっているかどうか決定し、それによって遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変えるかどうか決定する段階。
【００２８】
すぐに使用できる方法の１つの実施形態では、方法は以下の段階を含む：（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、遺伝子構造物を合胞体細胞と接触させ；（ｂ）接触された合胞体細胞のリズムを決定し；及び（ｃ）遺伝子構造物と接触するよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変える能力は、接触された合胞体細胞のリズムが、遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される。
【００２９】
段階（ｂ）は、例えば、以下の段階を含む：（ｉ）遺伝子構造物に接触された合胞体細胞に染料を投与する；及び（ｉｉ）接触された合胞体細胞のリズムをフォトダイオードで監視する。使われる染料はＣａ認識染料又は感圧染料であってよい。もう１つの実施形態では、段階（ｂ）がエッジ検出の使用を含む。さらなる実施形態では、段階（ｂ）は試験ウェルに埋め込まれた電極の使用を含む。さらなる実施形態では、段階（ｂ）が試験ウェル内のガラスパッチ電極の使用を含む。
【００３０】
合胞体細胞は、心臓の筋細胞、哺乳動物の膀胱、哺乳動物の肝臓、細動脈、哺乳動物の胃腸管、上皮組織から生じる腫瘍又は平滑筋組織から始まる腫瘍からであってよい。
【００３１】
本発明は、合胞体細胞の収縮性を変更する遺伝子構造物の能力を決定するための方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ｉ）遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；及び（ｉｉ）接触された合胞体細胞の収縮性が、遺伝子構造物が接触されなかった合胞体細胞の収縮性と異なっているかどうか決定し、それによって遺伝子構造物が合胞体細胞の収縮性を変更するかどうか決定する段階。
【００３２】
すぐに使用できる方法の１つの実施形態では、方法は、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と、（ｂ）接触された合胞体細胞の収縮性を決定する段階と；（ｃ）遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞の収縮性で決定された収縮性と比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞の収縮性を変える能力が、接触された合胞体細胞の収縮性が遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞の収縮性と異なっていることで示される。
【００３３】
本発明は合胞体細胞への遺伝子構造物の結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を決定する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む、（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、合胞体細胞を遺伝子構造物と接触させ；（ｂ）接触された合胞体細胞のリズムを決定し；及び（ｃ）遺伝子構造物と接触するよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、合胞体細胞への遺伝子構造物の結合は、接触された合胞体細胞のリズムが、遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なるときに示される。
【００３４】
本発明は、合胞体細胞のリズムを変えることができる遺伝子構造物を製造する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変える能力は、接触された合胞体細胞のリズムが遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と；及び合胞体細胞のリズムを変える能力を持つと決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【００３５】
本発明は、合胞体細胞の収縮性を変える能力を有する遺伝子構造物を製造する方法をさらに提供し、前記方法は以下の段階を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞の収縮性を決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞の収縮性で決定された収縮性と比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞の収縮性を変える能力は、接触された合胞体細胞の収縮性が遺伝子構造物に接触するより前の同じ合胞体細胞の収縮性と異なることで示される段階と；及び（ｅ）合胞体細胞の収縮性を変える能力を持つと決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【００３６】
最終的に、本発明は合胞体細胞と結合する能力を有する遺伝子構造物を製造するための方法を提供し、前記方法は以下を含む：（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有することが知られている細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と；（ｃ）接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と；（ｄ）遺伝子構造物と接触させる前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、遺伝子構造物が合胞体細胞のリズムを変える能力は、接触された合胞体細胞のリズムが遺伝子構造物に接触するより前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と；及び（ｅ）合胞体細胞と結合したことが決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階。
【００３７】
本発明は続く実験の詳細のセクションで例証される。このセクションは本発明の理解を助けるために説明されるが、そうするように意図されるものではなく、及び、後続するクレームで説明されるように、どのような面からも本発明を制限すると解釈されるべきではない。
【００３８】
実験の詳細
概要
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）が心臓に生物学的ペースメーカーを輸送する能力が試験された。エレクトロポレーションによって、心臓ペースメーカー遺伝子、ｍＨＣＮ２、でトランスフェクトされたｈＭＳＣは、高レベルのＣｓ＋センシティブ電流（−１５０ｍＶにおいて３１．１±３．８ｐＡ／ｐＦ）を発現し、拡張期電位の範囲において活性化して、逆転電位が−３７．５±１．０ｍＶであり、Ｉｆに類似した発現電流を裏付けた。発現電流はイソプロテレノールに応答して、活性化において１１ｍＶ陽性にシフトした。アセチルコリンは直接的な効果を持たなかったが、イソプロテレノールの存在下で、活性化が陰性に１５ｍＶシフトした。トランスフェクトされたｈＭＳＣは、カバーガラスの局所的領域上部に培養され新生児ラットの心室筋細胞で覆われたとき、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拍動数に影響した。同時培養物の拍動数は、ｈＭＳＣが（ＥＧＦＰのみを発現する）コントロールプラスミドでトランスフェクトされたとき９３±１６ｂｐｍであり、ｈＭＳＣがＥＧＦＰ＋ｍＨＣＮ２（Ｐ＜０．０５）の双方を発現するとき、１６１±４ｂｐｍであった。次にコントロールプラスミドまたはｍＨＣＮ２遺伝子構造物のどちらかをトランスフェクトされた１０６のｈＭＳＣが、ｉｎ ｓｉｔｕでイヌの左心室壁内の心外膜下に注入された。洞停止の間、全ての制御（ＥＧＦＰ）心臓は自発的なリズムを有した（４５±１ｂｐｍ、右側起源が２、左側起源が２）。ＥＧＦＰ＋ｍＨＣＮ２グループにおいて、動物６体のうち５体が左側起源の自発的なリズムを現した（拍動数＝６１±５ｂｐｍ；Ｐ＜０．０５）。さらに、注入された領域の免疫染色は、隣接する筋細胞とギャップジャンクションを形成するｈＭＳＣの存在を示した。これらの知見は、遺伝子組み換えされたｈＭＳＣがｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで機能的なＨＣＮ２チャネルを発現できることを示し、心筋細胞内のＨＣＮ２遺伝子の過剰発現をまねて、ペースメーカー遺伝子の、心臓内部への、または他の電気的な合胞体への新規の輸送システムを示す。
【００３９】
ｈＭＳＣは、ＥＧＦＰ同様にマウスＨＣＮ２（ｍＨＣＮ２）を発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで機能的なｍＨＣＮ２チャネルを発現することができるベクター構造物のエレクトロポレーションによって効果的にトランスフェクトされる。ｈＭＳＣにおけるＨＣＮ２発現は、同時培養された新生児ラット心室筋細胞の拍動数を変更するのに十分な、及びイヌの心室を駆動するのに十分なＩｆベースの電流を与え、アデノウィルス構造物によるＨＣＮ２の過剰発現を模倣する。（５）ｈＭＳＣがコネキシン蛋白質を作り、イヌの心筋細胞と電気的に結合する機能的なギャップジャンクションを形成することが示された。すなわち、ペースメーカー遺伝子を心臓内部に輸送するためのプラットフォームとして遺伝子組み換えされたｈＭＳＣを使用したｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療システムが開発された。
【００４０】
材料及び方法
ヒトの間葉幹細胞メンテナンスとトランスフェクション
ヒトの間葉幹細胞（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ ｈＭＳＣ；間葉幹細胞、ヒトの骨髄）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ／ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ）から購入され、及びＭＳＣ成長媒体（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ ＭＳＣＧＭ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）内で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下において３７℃で培養された。細胞は２代から４代まで使用された。完全長ｍＨＣＮ２ ｃＤＮＡは、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングされた。細胞は、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ａｍａｘａ）技術を用いてエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた。（８）２４から４８時間後のＥＧＦＰの発現から、３０％から４５％のトランスフェクション効率が明らかとなった。
【００４１】
ｈＭＳＣ中で発現されるＩＨＣＮ２のパッチクランプ研究
ホールセルパッチクランプが、コントロールｈＭＳＣ及びｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣにおける膜電流を調べるために使用され、前記遺伝子はペースメーカー電流、Ｉｆのα−サブユニットをエンコードする。発現Ｉｆ（すなわち、ＩＨＣＮ２）は、Ａｘｏｐａｔｃｈ−１Ｂ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）増幅器によって電圧クランプの下で測定された。パッチ電極抵抗は、シーリングの前に４〜６ＭΩであった。細胞は、約０．５分間でチャンバ溶液を完全に変える重力灌流システムを用いて終始灌流された。灌流溶液だけではなく、バス温度も３５±０．５℃で一定に保たれた。ピペット溶液は、（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）ＫＣｌ ５０、Ｋ−アスパラギン酸塩 ８０、ＭｇＣｌ２ １、Ｍｇ−ＡＴＰ ３、ＥＧＴＡ １０、及びＨＥＰＥＳ １０で満たされた（ｐＨはＫＯＨで７．２に調整された）。外液は、（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）ＮａＣｌ １３７．７、ＫＣｌ ５．４、ＮａＯＨ ２．３、ＣａＣｌ２ １．８、ＭｇＣｌ２ １、グルコース １０、ＨＥＰＥＳ ５、及びＢａＣｌ２ ２を含むものだった（ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整された）。膜容量は、電圧クランプステップを適用することによって測定され、電流密度は、容量あたりのピーク電流の値として表された。
【００４２】
ギャップジャンクションの二重（ｄｕａｌ）パッチクランプ研究
イヌの心臓の心室筋細胞は上述のように単離された。（９）筋細胞の第一段階の培養は、マウス筋細胞に関して記述された手順を用いて保たれた。（１０）それらは、マウスラミニン（１０μｇ／ｍＬ）が前もってコートされたカバーガラス上部で２.５％ウシ胎児の血清（ＦＢＳ）及び１％ＰＳを含むＭＥＭ中で０．５から１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で培養された。５％ＣＯ２のインキュベータ内における３７℃での１時間の培養後に、培地は、ＦＢＳフリーＭＥＭに変更された。ｈＭＳＣが追加され、同時培養物は５％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ内で保たれた。Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が、全ての実験において同時培養物内でｈＭＳＣをＨｅＬａ細胞から区別するために用いられた。（１１）
【００４３】
接着細胞を有するカバーガラスは、（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）ＮａＣｌ １５０、ＫＣｌ １０、ＣａＣｌ２ ２、ＨＥＰＥＳ ５（ｐＨ ７．４）、及びグルコース ５を含むバス溶液が室温（≒２２℃）で灌流された実験チャンバに移送された。パッチピペットは、（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）Ｋ＋アスパラギン酸− １２０、ＮａＣｌ １０、ＭｇＡＴＰ ３、ＨＥＰＥＳ ５（ｐＨ７．２）、及びＥＧＴＡ １０（ｐＣａ≒８）を含む、０．２２μｍ孔を通してろ過された溶液で満たされ、ピペットの抵抗は１〜２ＭΩと測定された。実験は、二重電圧クランプを用いて細胞ペアにおいて実施された。この方法は、膜電位（Ｖｍ）の制御及び関連するジャンクション電流（Ｉｊ）の測定を可能にする。
【００４４】
同時培養物における活動電位の記録
ｈＭＳＣが、初期のプレーティングを直径約４ｍｍの円形領域に制限するためにクローニングシリンダを用いて、フィブロネクチンで被覆された９×２２ｍｍのカバーガラス上部で培養された。細胞は、ＥＧＦＰ単独、またはＥＧＦＰ＋ｍＨＣＮ２のどちらかを発現した。４時間後に、クローニングシリンダははずされ、上述のように準備されたネズミ新生児の心室筋細胞（１２）がカバーガラス全体の上に培養された。４から５日後に、カバーガラスは灌流チャンバ内に配置され３５℃で保持され、活動電位は穿孔されたパッチ電極（１２）及び（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）ＮａＣｌ １４０、ＮａＯＨ ２．３、ＭｇＣｌ２ １、ＫＣｌ ５．４、ＣａＣｌ２ １．０、ＨＥＰＥＳ ５、及びグルコース１０；ｐＨ７．４を含む標準的な生理溶液を用いてカバーガラスの中心近くから記録された。ピペット溶液は、（ｍｍｏｌ／Ｌ単位）アスパラギン酸 １３０、ＫＯＨ １４６、ＮａＣｌ １０、ＣａＣｌ２ ２、ＥＧＴＡ−ＫＯＨ ５、Ｍｇ−ＡＴＰ ２、及びＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ １０；ｐＨ ７．２を含むものだった。記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００増幅器及びＰＣｌａｍｐ８ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で行なわれた。穿孔パッチ技術が使用され、アムホテリシンＢ（４００μｇ／ｍＬ、ｓｉｇｍａ）がピペット溶液に追加された。
【００４５】
イヌ心室のＩｎ Ｖｉｖｏ研究
幹細胞は前述のように準備された。殺菌した条件の下で、ナトリウムチオペンタール導入（１７ｍｇ／ｋｇＩＶ）及び吸入イソフルラン（１.５〜２.５％）麻酔の後に、２３から２７キログラムの雑種のイヌ（Ｔｅａｍ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｄａｙｖｉｌｌｅ、コネティカット）が心嚢切開を受けた。ＨＣＮ２＋ＧＦＰ又はＧＦＰを単独で含む１０６ｈＭＳＣは、心外膜におよそ２ミリの深さに、２１ゲージの針によって０．６ｍＬの溶液を左心室前壁に心外膜下注入された。動物は心臓のリズムが監視された間、４から１０日間回復した。その後、それらは上述のように、イソフルランで麻酔された。両方の頸部迷走神経幹が分離され、開胸され、ＥＣＧが監視された。段階的な左右の迷走神経刺激は、標準的な技術で行なわれ、エスケープペースメーカー機能（ｅｓｃａｐｅ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）が起こってよいように洞リズムを抑制した。組織学の研究のために、組織がそれから取り除かれた。
【００４６】
組織学的方法
特に示されなければ、心臓組織のサンプルは１０％緩衝ホルマリンで固定化されて、パラフィンに埋め込まれ、４又は６マイクロメータに区画された。ホルマリン固定化セクションの幾つかがヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で通常の方法で染色された。ビメンチン及びヒトＣＤ４４に対して取り上げられたモノクロナールネズミ免疫抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）がアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法を適用して使われた。（１４）免疫組織化学的に染色された組織がヘマトキシリンでその後対比染色された。免疫組織化学的染色に関するポジティブ及びネガティブの制御が使用された。ｈＭＳＣは、ＣＤ４４染色によって、繊維芽細胞と区別された。ビメンチン免疫抗体はｈＭＣＳを強く染色するが、同じく大抵の間葉組織を染色する。他のセクションが、ワックスを取り除くため処理され、６分間キシレンへ露出することによって、三つのリンス液で、その後同様に１００％、９５％、５０％エタノール、脱イオン水、及びＰＢＳに露出することによって再度水和された。その後セクションは１０分間３０％の過酸化水素にさらされて、５０分間ＰＢＳで再びすすがれた。再水和されたセクションは、０.０１ｍｏｌ/Ｌのクエン酸緩衝液にさらされ、１０分間沸騰状態に加熱されて、その後室温に冷やされた。コネキシン４３（Ｃｘ４３；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）に対して取り上げられたポリクロナール免疫抗体が使われた。
【００４７】
統計値
結果は、平均±ＳＥＭとして表される。統計的有意性は、独立データ（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｄａｔａ）に関してスチューデントｔ−検定で決定された。Ｐ＜０.０５の値が有意とみなされた。
【００４８】
結果
ｍＨＣＮ２を用いたｈＭＳＣのトランスフェクション及びペースメーカー電流の実証
トランスフェクトされていないｈＭＳＣは、過分極の間、有意な時間依存電流を示さなかった（図１Ａ）。ＭＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣは、過分極で大きな時間依存内向き電流を発現し、−１６０ｍＶまで活性化され、続く段階の間２０ｍＶに非活性化された（図１Ｂ）。図１Ｃは、ｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣにおいて記録されたテール電流から構築されるＩｆ活性化曲線を示す（サンプル電流の挿入図を参照されたい）。データはボルツマン二状態モデルでフィッティングされ、中点（Ｖ５０）は−９１．８±０．９ｍＶであり、傾斜因子は８．８±０．５ｍＶ（ｎ＝９）であって、卵母細胞及びＨＥＫ２９３細胞におけるｍＨＣＮ２発現に関する値と同様であった。（１５、１６）Ｉｆ電流密度が大きく、すべての他の調製品において、その減少が遅いことが明らかであったので、これらの値は近似値である。結果は、もしそれらがうまくギャップジャンクションによって心室筋細胞に結合するなら、ｈＭＳＣにおいてＩｆが拡張期電位で活性化されるべきであることを示唆する。図２で例証された実験は、発現電流がＩｆであったことを確認するために実行された。電圧プロトコルから（図２の説明文を参照されたい）、我々は−３７.５±１.０ｍＶ（ｎ＝８）の逆転電位を決定することができた。５．４ｍｍｏｌ／Ｌの細胞外［Ｋ＋］が与えられ、この逆転電位は、Ｉｆチャネルの［Ｎａ＋］及び［Ｋ＋］に対する混合された選択性と矛盾しない。（１７）発現電流を遮断するＣｓ＋の効果が試験された。Ｃｓ＋（４ｍｍｏｌ／Ｌ）は、可逆的に内向き電流を遮断したが、外向きの非活性化テール電流（ｏｕｔｗａｒｄ ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔａｉｌ ｃｕｒｒｅｎｔ）の効果はほとんどなく、ＩｆのＣｓ＋遮断と矛盾しない。（１８）図２Ｄにおいて、Ｉｆのような電流に関する完全に活性化されたＩ−Ｖ関係が構築された。プロットは、生データからの二つの主要な測定結果を補強する。第１に、内向きであって外向きではないＩｆのような電流は、Ｃｓ＋によって遮断され、第２にゼロ電流はＩｆについて既に知られた性質と矛盾しない混合された選択性を示す。−１５０ｍＶにおける別のプロトコルＩｆ密度は、３１．１±３．８ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝１７）であった。トランスフェクトされたｈＭＳＣの膜容量は１１０．８±９．０ｐＦ（ｎ＝１７）であった。
【００４９】
ＩＨＣＮ２の神経液性調節
電気的ペースメーカーに対する生物学的ペースメーカーの潜在的な有利な点は、それらのホルモン調節である。ｈＭＳＣにおいて記録されたＩｆ上のβ−アドレナリン作用性物質及びムスカリン様作用物質が試験された（図３及び４）。図３Ａ及び３Ｂは、イソプロテレノール内の−８０及び−１００ｍＶにおける電流がコントロール下でのものよりも大きいのに対して、双方の条件における電流が−１６０ｍＶにおいてほぼ等しいことを示す。この電圧に依存する相違は、活性化曲線におけるシフト（図３Ｄ）に関して予測される。半活性化電圧（Ｖ５０）は、コントロール下において−９６±０．９ｍＶであり、イソプロテレノール中において８４．４±０．２ｍＶであった（ｎ＝４、Ｐ＜０.０１）。傾斜因子は、コントロール下において１０．９±０．５ｍＶであり、イソプロテレノール中において１１．０±０．２ｍＶであった（Ｐ＞０.０５）。活性化におけるシフトを説明するために２パルスプロトコルを用いると、イソプロテレノールの存在下での時間依存電圧は、第１ステップに応答してコントロール下より大きく、第２ステップに応答して小さい（図３Ｃ）。これは、Ｉｆ活性化におけるＩＳＯ誘起陽性シフトと矛盾しない。アセチルコリンは、ムスカリン様受容体の欠如、または、ｃＡＭＰのベースレベルが低くアデニルシクラーゼのアセチルコリン阻害によってさらに低減されることがないこと、のどちらかに起因して、時間依存電圧に直接影響しなかった（ｎ＝３）。従って、アセチルコリンがイソプロテレノール（図４）の作用を無効にすることができたか否かにかかわらず、それはさらにテストされた。−８０及び−１００ｍＶの段階的な過分極への応答の試験によって、アセチルコリンの添加が膜電流を低減することが示された。しかしながら、それらは−１６０ｍＶにおいてほとんど同一であり（図４Ａ及び４Ｂ）、アセチルコリンによって誘起された活性化における陰性シフトと矛盾しない。図４Ｄは、イソプロテレノール、及びイソプロテレノール＋アセチルコリンにおける活性化曲線を示す。Ｖ５０はイソプロテレノールに関して、−９１.３±１．１ｍＶであり、イソプロテレノール＋アセチルコリンに関して−１０６．６±０．８ｍＶであった（ｎ＝３、Ｐ＜０.０５）。傾斜因子は、イソプロテレノールにおいて１４．６±０．９ｍＶ、及び１１．１±０．９ｍＶであった（ｎ＝３、Ｐ＜０.０５）。２パルスプロトコルが、同様に使われた（図４Ｃ）。第１電圧ステップへの応答はイソプロテレノール＋アセチルコリンにおけるものと比較してイソプロテレノールにおけるものの方が大きいのに対して、第２ステップに関しては逆である。これは、アセチルコリンの添加によって誘起された活性化における陰性シフトとやはり矛盾しない。これらの結果は、ｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣがβ−アドレナリン作用性及びムスカリン様作用物質に応答すべきであることを示す。
【００５０】
ｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣのモジュレーションの心臓筋細胞によるインパルス開始
ｈＭＳＣにおいてペースメーカー遺伝子を発現したので、ｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣが、結合された心臓細胞の興奮性に影響を与えることができると仮定された。拡張期電位の最大値は、ＥＧＦＰ発現ｈＭＳＣで同時培養されたネズミ新生児の心室筋細胞において−７４±１ｍＶ（ｎ＝５）、ｍＨＣＮ２発現ｈＭＳＣで同時培養された筋細胞において−６７±２ｍＶ（ｎ＝６）であった（Ｐ＜０．０５）。自発的な拍動数（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒａｔｅ）は、前者のグループ（ｎ＝５）で９３±１６ｂｐｍ、及び後者のグループ（ｎ＝６、Ｐ＜０．０５）で１６１±４ｂｐｍであった。低減された拡張期電位の最大値は、ｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣにおける発現電流の閾値電位で観察されたものと矛盾せず、電気的に結合された筋細胞におけるこの脱分極電流の影響を示す。代表的な活動電位は図５に示される。
【００５１】
監視チャンバは、マルチ電極アレイ（ＭＥＡｓ）、プレ−及びフィルター増幅器、データ取得ボード及びソフトウェアからなるＰＣベースのデータ取得システム（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）である。ＭＥＡは、５０×５０ｍｍガラス基板、該ガラス基板の中央に埋め込まれた６０窒化チタンの１．４×１．４ｍｍマトリックス、金のコンタクト、窒化シリコンで絶縁され、電極間の距離が各々２００μｍである直径３０μｍの電極（マトリックスの角部には電極が存在しない）からなる。培養物は、記録電極の四つの外部列の各々から２ｍｍの位置に配置された刺激電極（２５０μｍ×５０μｍ）の四つのペアのうち一つを用いて刺激された。データは、１２−ビットの精度で１０ｋＨｚにおいて記録された。データ記録を可能にするために、ＭＥＡはインキュベータから取り除かれ、新鮮な培養媒体で常に灌流され、３７℃で５％ＣＯ２及び９５％空気からなるガス混合物で飽和された。
【００５２】
無処置イヌ心臓における生物学的ペースメーカーとしてのｍＨＣＮ２でトランスフェクトされたｈＭＳＣ
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｍＨＣＮ２発現ｈＭＳＣの筋細胞への機能的な結合が実証され、それらはその後ペースメーカー機能が実証可能であるかどうか試すために（材料と方法参照）ｉｎ ｓｉｔｕでイヌの心臓に注入された。洞停止の間、エスケープペースメーカー機能は左または右心室から生じてよく、ここで起こったように、四頭のうち二頭の動物がＥＧＦＰを発現するｈＭＳＣを受けて左の、及び二頭が右の心室補充リズム（ｅｓｃａｐｅ ｒｈｙｔｈｍｓ）を発現させた。対照的に、ＥＧＦＰ＋ｍＨＣＮ２を発現するｈＭＳＣを受けた六頭のうち五頭の動物が、左心室から生じて、ペースマップされたリズムを発現し、その生じる位置はｈＭＳＣ注入の位置に近い。さらに、これらの動物の心室特有の拍動数（ｉｄｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｒａｔｅｓ）は、ＥＧＦＰ単独を発現するｈＭＳＣを受けた動物において６１．５±５対４５±１ｂｐｍだった（Ｐ＜０．０５）。代表的な実験は、図６に示される。
【００５３】
ｈＭＳＣ注入サイトのヘマトキシリン及びエオシン染色は、通常の心臓筋細胞及びニードルトラックに隣接する好塩基性浸潤の高密度領域を示した（図７Ａ）。ｈＭＳＣは、それらのサイズ（直径１０から２０μｍ）、大きな高色素性核、及びマトリックスを持たない、乏しい、深い好塩基性細胞質によって容易に同定される。ｈＭＳＣはＨ＆Ｅ染色の特徴的な外観を有するけれども、免疫組織化学的染色を用いることによってそれらはより正確に同定される。ｈＭＳＣは、間葉性起源の細胞のマーカーである、ビメンチンに関して強く染色された（例えば、図７Ｂ）。同じ領域は、ヒトＣＤ４４に関しても陽性であった（例えば、図７Ｃ）。ｈＭＳＣと心筋との間の交互嵌合は非常に明瞭であった（例えば、図７Ｄ）。
【００５４】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ及びＩｎ Ｖｉｖｏにおいて心筋細胞とのギャップジャンクションを形成するｈＭＳＣ
ｈＭＳＣが電気的に心筋細胞と結合するかどうか試すために、ｈＭＳＣがイヌ成体の心室筋細胞と同時培養された。筋細胞は分離されて、ｈＭＳＣとの同時培養の前に、１２から７２時間の間培養された。ｈＭＳＣを筋細胞培養物に添加した後、６から１２時間結合が測定された。初期の観察は、幹細胞が心臓の細胞に結合することを明らかにする。図８Ａは、同時培養中のｈＭＳＣ筋細胞ペアの一例を示す；これまでのところ観察された四つのうちの一つである。非対応のペアの同定に関して、ｈＭＳＣはＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識を付けられた。（１１）双極性の電圧ランププロトコルが、２００ｍＶ/１５秒の速度で（Ｖ１及びＶ２参照）±１００ｍＶの範囲でトランスジャンクション電圧Ｖｊ（Ｖ２−Ｖ１）を変えるために用いられ、図８Ｂに示される。ランプパルスは、筋細胞（Ｖ１）に印加され、一方でｈＭＳＣの膜電位は０ｍＶ（Ｖ２）で保たれた。関連づけられた姉妹電流、Ｉ１及びＩ２、はそれぞれ筋細胞及びｈＭＳＣから記録された。電流は電圧ランププロファイルに従い、非対応のｈＭＳＣ−筋細胞ペアのギャップジャンクション結合を実証した。電流、Ｉ２、は、非ステップｈＭＳＣから得られ、結合電流Ｉｊを反映する。この記録は、ｈＭＳＣが心室筋細胞に有効に結合していることを実証する。図８Ｃは、イヌ心臓内部へのｈＭＳＣの注入サイトのアンチＣｘ４３免疫抗体による免疫組織化学的染色を示す。横線が心筋層中に現れる（紫の矢印を参照）のに対して、Ｃｘ４３に関する小さな斑点状の染色がｈＭＳＣ間にみられた（白い矢印）。ｈＭＳＣと筋細胞との間の界面にもＣｘ４３染色がある（赤い矢印）。図８Ｃの挿入図は、ＥＧＦＰプラスＨＣＮ２を発現するｈＭＳＣを注入された（０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩バッファ内で４％のパラホルムアルデヒドで、ｐＨ７．４、４℃において固定化され、その後、Ｗａｌｃｏｔｔら（１５）によって記述されるように、処理された）心筋層片の一部分を示す。第２の免疫抗体からＥＧＦＰへの赤い染色はｈＭＳＣの局在化を示すのに対して、青の染色は細胞核を示す。クラスター化された細胞の有意の大部分はｈＭＳＣである。
【００５５】
議論
ペースメーカー移植は、完全な心臓ブロック又は洞結節機能障害に対する主要な治療法である。現在の治療は信頼性が高く、罹病率が低い電子装置を使う。それにもかかわらず、それらが本来の組織の生物学的な反応性に欠けるから、このような装置は最適ではない。最近、いくつかのアプローチが生物学的なペースメーカー機能を提供するために試みられた。これらの試みの中には、β２−アドレナリン作用性レセプターの上方制御(ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ)、バックグラウンドのＫ＋電流ＩＫｌの下方制御(ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ)及び我々自身のＨＣＮ２遺伝子の過剰発現に関する以前の研究、内因性の心臓ペースメーカー電流Ｉｆの分子相関物があった。（２−６）これらのうち後者の研究において、左心房内または隣接する索糸システム内の局所的なＨＣＮ２過剰発現は、Ｉｆのような電流、及び受容体筋細胞内のｉｎ ｓｉｔｕペースメーカー機能の両方を誘起する。Ｉｆコンダクタンスの唯一の電圧依存性は、活動電位プラトーの間ではなく、心拡張期の間電流をもたらし、活動電位波形の有意の交替に付随する可能性がある合併症を制限する。アデノウィルス構造が心臓にＨＣＮ２遺伝子を届けるために使われたけれども（５、６）、アデノウィルスがエピソームであり、及びそれらが輸送する核酸がゲノムに統合しないから、このアプローチは最適ではない。他のウィルスのシステムには、生体内でそれらの使用を妨げる多くの重大な欠点が伴う。
【００５６】
生物学的ペースメーカーを製造するための代わりの手段は胚幹細胞によるものであり、心臓の系統に沿って区別されることができて、心臓のリズムの細胞ベースの制御に関するプラットフォームを提供する可能性がある。胚幹細胞が機能的なギャップジャンクションを作って、及び自発的な電気の活動を生み出すことができる。（２０）しかしながら、それらの免疫原性のために、拒絶反応が重大な要件である。さらに、ｈＭＳＣと同じように、胚幹細胞調製が空間的に均一ではなく、及び、ｉｎ ｖｉｖｏの生物学的ペースメーカーを設計することにおいて、両方の細胞ベースのシステムの適切なエンジニアリングは難問を提起する。
【００５７】
いくつかの理由で、ｈＭＳＣは遺伝子輸送用途のための魅力的な細胞の伝達手段である。それらは、通常の臨床手順を通じて比較的多数得られてよい。ｈＭＳＣは、培養物中で容易に拡張され、長期のトランスジーン発現をする性能がある。（２１）それらの管理は、自己由来、または銀行経由であってよく、それらが免疫的に優先であってよい証拠が与えられる。（２２）そのようなペースメーカーの長期機能は、ｍＨＣＮ２の長期発現に基づき、代わりにｈＭＳＣのゲノム内部への統合を必要とする。ランダムな統合は、細胞サイクルまたは腫瘍抑制内に含まれる遺伝子の分裂（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）の可能性を増大するか、または後成的変化の原因となる可能性がある。しかしながら、ここで使用されるｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクション方法は、ＤＮＡ統合サイト（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）が使用される前に評価されること、及び細胞キャリアがフェイル−セーフデスメカニズムで遺伝子工学的に作り変えることを可能にする。
【００５８】
この研究の目的は心臓内部へのペースメーカー遺伝子の全身性輸送において遺伝子改変されたｈＭＳＣをプラットフォームとして使用することの実現可能性をテストすることであった。ＨＣＮ２がこの研究のためにモデルシステムの役割をした。遺伝子組み換えされたｈＭＳＣはＩｆのような電流を発現して、及び同時培養されたネズミ新生児の筋細胞の自発的な拍動数を増加することができ、及びイヌの心臓内で迷走神経によって引き起こされた洞停止の間に心室リズムを生じさせることができた。ＥＧＦＰのみを発現するコントロールｈＭＳＣはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのどちらであってもこれらの効果を及ぼさなかった。このように、ｍＨＣＮ２遺伝子でトランスフェクトされたｈＭＳＣの電気的効果はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏシステムにおける筋細胞内での同じ遺伝子の過剰発現の効果と類似していた。これらの知見はｈＭＳＣが心臓移植のためのペースメーカー遺伝子の輸送に対する代替的なアプローチとして使われるかもしれないことを示唆する。
【００５９】
洞結節筋細胞でＨＣＮ遺伝子は心臓の興奮に必要な内向き電流を生成する。洞房結節細胞と異なり、ｍＨＣＮ２によってトランスフェクトされたｈＭＳＣは興奮しにくく、なぜならそれらは活動電位を生成するために必要とされる他の電流に欠けるからである。しかしながら、これらの細胞は結合した筋細胞に広がる脱分極電流を生成することができ、筋細胞を閾値にさせる。ｈＭＳＣがペースメーカー遺伝子を含んで、及びギャップジャンクションを経由して心筋細胞に結合する限り、それらが標準的な主要なペースメーカー、洞房結節と同様の方法で、心臓のペースメーカーとしての役割を果たすであろうことは仮定される。それは、ｈＭＳＣがイヌの心筋細胞と電気的に結合するギャップジャンクションを形成する二重のパッチテクニックを使って実証された。移植されたｈＭＳＣと心筋細胞との間の結合も、アンチ−コネキシン４３免疫抗体を用いて、ｈＭＳＣ注入サイトから単離された組織の免疫組織学的染色によって同様に示された。注入サイトの内部で、細胞のクラスターはビメンチン及びＣＤ４４陽性であり、及びそれは同じく有意な大多数の細胞のクラスターがＥＧＦＰ陽性であることも実証し、その結果それらがｈＭＳＣであると同定した。最近の報告は、マウスＭＳＣが０.００５％の融合速度（ｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ）でｉｎ ｖｉｖｏでマウス筋細胞と融合することができることを示唆した。（２３）この可能性は除外されなかったが、しかしＭｏｒｉｍｏｔｏらによって報告された融合速度では、（２３）注入された百万の細胞のうちたった５０のｈＭＳＣが融合するであろう。
【００６０】
この研究で使われたアプローチには限界がある。最初に、ｈＭＳＣは規則正しい収縮のために最適なサイトではなく、自由な壁心筋層に輸送された。しかしながら、最近カテーテルアプローチがペースメーカー遺伝子をイヌの左の索枝システムに挿入するために使われた。（６）このような位置はペースメーカーが自由な壁に存在するという状態で、より規則的な及び通常の活性化及び収縮の可能性を提供する。このアプローチがｈＭＳＣのために使われる前に、細胞の損傷または破壊なしでｈＭＳＣのサイズの細胞の注入を最適化するためにカテーテルを改良する必要があるかもしれない。
【００６１】
もう１つの質問は、これらのペースメーカーの有効性の持続時間に関連している。本研究は遺伝子輸送システムとしてｈＭＳＣを使用することの実現可能性を実証することに専心している。ｉｎ ｖｉｖｏの研究が３から１０日続いたのみであるため、一時的なトランスフェクションは十分なものであった。このアプローチが臨床的に適切であるとみなされ得る前に、はるかに長い研究期間が必要とされるであろう。この点に関して、トランスフェクトされた細胞は、安定して発現する細胞を選択する抗生物質上に成長されるとき、少なくとも３カ月間それらの緑の蛍光発光を維持する。これはｍＨＣＮ２を発現する安定したクローンに関する選択を示し、発現の持続性がより長期の研究に大きな困難を与えないことはありそうである。しかしながら、ｈＭＳＣの分化状態がｉｎ ｓｉｔｕで長期の間に変化させられるか、またはこのような分化がｍＨＣＮ２発現または生物物理学的特性に影響を与えるかどうか、が明確にされなくてはならない。さらに、ヒトの遺伝子にシーケンスで非常に近いが、完全に同一でないハツカネズミ遺伝子がここでは使われた。ヒトの遺伝子を使うことは最も有利であるであるだけではなく、神経液性反応と同様、活性化及び回復特性を最適化するための種々の突然変異を検証することは望ましいであろう。このようなアプローチは現在探究されている。
【００６２】
イヌの心臓にｍＨＣＮ２を発現するｈＭＳＣを輸送することは、ｈＭＳＣベースの生物学的ペースメーカーを調製することの実現可能性の実証だけではなく、一般的な原則の最初の具体的な例である：ｈＭＳＣが合胞体組織の機能に影響を与えるいろいろな遺伝子を輸送するために使われてよい。１つの代替的な潜在的な心臓血管用途は、心室平滑筋を過分極して緩和を誘起するＫ＋チャンネル遺伝子の輸送である。実際に、ｈＭＳＣによって運ばれる有効搭載量は膜チャンネルに制限される必要がない：ギャップジャンクションを貫通できる遺伝子プロダクトまたは低分子（ＭＷ＜１０００、小さい方の直径＜１．２ｎｍ）はｈＭＳＣに組み込まれることができ、及びその治療の目標として合胞体組織に輸送されることができる。
【００６３】
参考文献
１．Ｚｉｖｉｎ Ａ， Ｂａｒｄｙ ＧＨ． Ｃａｒｄｉａｃ ｐａｃｅｍａｋｅｒｓ． Ｉｎ： Ｓｐｏｏｎｅｒ ＰＭ， Ｒｏｓｅｎ ＭＲ， ｅｄｓ． Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｒｄｉａｃ Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ： ２００１； ５７１−５９８．
【００６４】
２．Ｅｄｅｌｂｅｒｇ ＪＭ， Ａｉｒｄ ＷＣ， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＲＤ． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｃａｒｄｉａｃ ｃｈｒｏｎｏｔｒｏｐｙ ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ β２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃＤＮＡ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９８； １０１： ３３７−３４３．
【００６５】
３．Ｅｄｅｌｂｅｒｇ ＪＭ， Ｈｕａｎｇ ＤＴ， Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ ＭＥ， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＲＤ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃａｒｄｉａｃ ｃｈｒｏｎｏｔｒｏｐｙ． Ｈｅａｒｔ． ２００１； ８６： ５５９−５６２．
【００６６】
４．Ｍｉａｋｅ Ｊ， Ｍａｒｂａｎ Ｅ， Ｎｕｓｓ ＨＢ． Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ： ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｃｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００２； ４１９： １３２−１３３．
【００６７】
５．Ｑｕ Ｊ， Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖ ＡＮ， Ｄａｎｉｌｏ Ｐ Ｊｒ， Ｓｌａｐａｋｏｖａ Ｉ， Ｃｏｈｅｎ ＩＳ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＢ， Ｒｏｓｅｎ ＭＲ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｉｎ ｃａｎｉｎｅ ｈｅａｒｔ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００３； １０７： １１０６−１１０９．
【００６８】
６．Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖ ＡＮ， Ｓｏｓｕｎｏｖ ＥＡ， Ｑｕ Ｊ， Ｓｈｌａｐａｋｏｖａ Ｉ， Ａｎｙｕｋｈｏｖｓｋｙ ＥＰ， Ｌｉｕ Ｌ， Ｊａｎｓｅ ＭＪ， Ｂｒｉｎｋ ＰＲ， Ｃｏｈｅｎ ＩＳ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＢ， Ｄａｎｉｌｏ Ｐ Ｊｒ， Ｒｏｓｅｎ ＭＲ． Ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｎｉｎｅ ｌｅｆｔ ｂｕｎｄｌｅ ｂｒａｎｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｅｓｃａｐｅ リズムｓ ｈａｖｉｎｇ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｒａｔｅｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００４； １０９： ５０６−５１２．
【００６９】
７．Ｇｅｐｓｔｅｉｎ Ｌ． Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００２； ９１： ８６６− ８７６．
【００７０】
８．Ｈａｍｍ Ａ， Ｋｒｏｔｔ Ｎ， Ｂｒｅｉｂａｃｈ Ｉ， Ｂｌｉｎｄｔ Ｒ， Ｂｏｓｓｅｒｈｏｆｆ ＡＫ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． ２００２； ８： ２３５−２４５．
【００７１】
９．Ｙｕ Ｈ， Ｇａｏ Ｊ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｗｙｍｏｒｅ Ｒ， Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ Ｓ， ＭｃＫｉｎｎｏｎ Ｄ， Ｒｏｓｅｎ ＭＲ， Ｃｏｈｅｎ ＩＳ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｔｏ ｉｎ ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ ａｎｄ ｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｔｈｅ ｃａｎｉｎｅ ｈｅａｒｔ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０００； ８６： １０６２−１０６８．
【００７２】
１０．Ｚｈｏｕ ＹＹ， Ｗａｎｇ ＳＱ， Ｚｈｕ ＷＺ， Ｃｈｒｕｓｃｉｎｓｋｉ Ａ， Ｋｏｂｉｌｋａ ＢＫ， Ｚｉｍａｎ Ｂ， Ｗａｎｇ Ｓ， Ｌａｋａｔｔａ ＥＧ， Ｃｈｅｎｇ Ｈ， Ｘｉａｏ ＲＰ． Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ： ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ （Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ）． ２０００； ２７９： Ｈ４２９−Ｈ４３６．
【００７３】
１１．Ｖａｌｉｕｎａｓ Ｖ， Ｗｅｉｎｇａｒｔ Ｒ， Ｂｒｉｎｋ ＰＲ． Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｂｙ ｃｏｎｎｅｘｉｎｓ ４０ ａｎｄ ４３． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０００； ８６： ｅ４２−ｅ４９．
【００７４】
１２．Ｐｒｏｔａｓ Ｌ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＢ． Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ Ｉｃａ，Ｌ ｖｉａ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｙ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９９９； ２７７： Ｈ９４０−Ｈ９４６．
【００７５】
１３．Ｒｏｓｅｎｓｈｔｒａｕｋｈ Ｌ， Ｄａｎｉｌｏ Ｐ Ｊｒ， Ａｎｙｕｋｈｏｖｓｋｙ ＥＰ， Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ＳＦ， Ｒｙｂｉｎ Ｖ， Ｂｒｉｔｔａｉｎ−Ｖａｌｅｎｔｉ Ｋ， Ｍｏｌｉｎａ− Ｖｉａｍｏｎｔｅ Ｖ， Ｒｏｓｅｎ ＭＲ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｖａｇａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｒｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｅｔｈａｌ ａｒリズムｉａｓ ｉｎ ｃａｔｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． １９９４； ７５： ７２２−７３２．
【００７６】
１４．Ｈｓｕ Ｓ， Ｒａｉｎｅ Ｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ， ａｖｉｄｉｎ， ａｎｄ ｂｉｏｔｉｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． １９８１； ２９： １３４９−１３５３．
【００７７】
１５．Ｙｕ Ｈ， Ｗｕ Ｊ， Ｐｏｔａｐｏｖａ Ｉ， Ｗｙｍｏｒｅ ＲＴ， Ｈｏｌｍｅｓ Ｂ， Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ Ｊ， Ｐａｎ Ｚ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｓｈｉ Ｗ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＢ， Ｅｌ− Ｍａｇｈｒａｂｉ ＭＲ， Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｗ， Ｄｉｘｏｎ Ｊ， ＭｃＫｉｎｎｏｎ Ｄ， Ｃｏｈｅｎ ＩＳ， Ｗｙｍｏｒｅ Ｒ． ＭｉｎＫ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ １： Ａ β ｓｕｂｕｎｉｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ＨＣＮ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｓｕｂｕｎｉｔ ｆａｍｉｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｅｄｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００１； ８８： ｅ８４−ｅ８７．
【００７８】
１６．Ｍｏｏｓｍａｎｇ Ｓ， Ｓｔｉｅｂｅｒ Ｊ， Ｚｏｎｇ Ｘ， Ｂｉｅｌ Ｍ， Ｈｏｆｍａｎｎ Ｆ， Ｌｕｄｗｉｇ Ａ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００１； ２６８： １６４６−１６５２．
【００７９】
１７．ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ Ｄ． Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｏｎｉｃ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎ ｃａｌｆ Ｐｕｒｋｉｎｊｅ ｆｉｂｒｅｓ． Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９８１； ３１４： ３７７−３９３．
【００８０】
１８．ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ Ｄ． Ｂｌｏｃｋ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｎ ｃａｌｆ Ｐｕｒｋｉｎｊｅ ｆｉｂｒｅｓ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ， ｃａｅｓｉｕｍ ａｎｄ ｒｕｂｉｄｉｕｍ． Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９８２； ３２９： ４８５−５０７．
【００８１】
１９．Ｗａｌｃｏｔｔ Ｂ， Ｍｏｏｒｅ ＬＣ， Ｂｉｒｚｇａｌｉｓ Ａ， Ｃｌａｒｏｓ Ｎ， Ｖａｌｉｕｎａｓ Ｖ， Ｏｔｔ Ｔ， Ｗｉｌｌｅｃｋｅ Ｃ， Ｂｒｉｎｋ ＰＲ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｌｕｉｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｒｉｍａｌ ｇｌａｎｄｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００２； ２８２： Ｃ５０１−Ｃ５０７．
【００８２】
２０．Ｂｏｈｅｌｅｒ ＫＲ， Ｃｚｙ Ｊ， Ｔｗｅｅｄｉｅ Ｄ， Ｙａｎｇ ＨＴ， Ａｎｉｓｉｍｏｖ ＳＶ， Ｗｏｂｕｓ ＡＭ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２００２； ９１： １８９−２０１．
【００８３】
２１．Ｚｈａｎｇ ＸＹ， Ｌａ Ｒｕｓｓａ ＶＦ， Ｂａｏ Ｌ， Ｋｏｌｌｓ Ｊ， Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｐ， Ｒｅｉｓｅｒ Ｊ． Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ− ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００２； ５： ５５５−５６５．
【００８４】
２２．Ｌｉｅｃｈｔｙ ＫＷ， ＭａｃＫｅｎｚｉｅ ＴＣ， Ｓｈａａｂａｎ ＡＦ， Ｒａｄｕ Ａ， Ｍｏｓｅｌｅｙ ＡＭ， Ｄｅａｎｓ Ｒ， Ｍａｒｓｈａｋ ＤＲ， Ｆｌａｋｅ ＡＷ． Ｈｕｍａｎ ｍｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｎｇｒａｆｔ ａｎｄ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｓｉｔｅ− ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｅｅｐ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２０００； ６： １２８２− １２８６．
【００８５】
２３．Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｙ， Ｄａｖｉｓ ＢＨ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｏｓ Ｅ−Ｊ， ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ＭＤ， Ｔａｙｌｏｒ Ｄ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｕｓｅ ｗｉｔｈ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００３； １０８： ＩＶ−５４８． Ａｂｓｔｒａｃｔ．
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ｍＨＣＮ２遺伝子をトランスフェクションしたｈＭＳＣｓ中のＩｆの機能発現。
【図２】Ｃｓ＋の細胞外での適用の効果及びＩｆの反転電位の測定。
【図３】ｍＨＣＮ２遺伝子をトランスフェクションしたｈＭＳＣｓにおけるイソプロテレノール（ＩＳＯ）によるＩｆ活性化の修正。
【図４】ＩＳＯの存在下におけるアセチルコリン（ＡＣｈ）によるＩｆの活性化の修正。
【図５】ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおけるペースメーカー機能。
【図６】ｉｎ ｓｉｔｕのイヌの心臓におけるペースメーカー機能。
【図７】ｈＭＳＣｓ注入サイトのヘマトキシン及びエオシン染色。
【図８】ｈＭＳＣ−イヌの心室筋細胞のペア間のギャップジャンクション。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と、
（ｉｉ）前記接触された合胞体細胞におけるリズムが、前記遺伝子構造に接触されていない合胞体細胞におけるものと比較して異なるかどうかを決定し、その結果前記遺伝子構造が前記合胞体細胞のリズムを変えるかどうかを決定する段階と、
を含む、合胞体細胞のリズムを変える遺伝子構造物の能力を決定する方法。
【請求項２】
（ａ）前記遺伝子構造物を前記合胞体細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで接触する段階と、
（ｂ）前記接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と、
（ｃ）前記遺伝子構造物の接触よりも前の同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較する段階と、を含み、
前記合胞体細胞のリズムを変える前記遺伝子構造物の能力は、前記接触された合胞体セルのリズムが、前記遺伝子構造物の接触よりも前の、同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子構造物が遺伝子組み換えされた幹細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子組み換えされた幹細胞が遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞が遺伝子でトランスフェクトされた、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子はＨＥＲＧ遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子構造物は合胞体細胞に結合することができる遺伝子組み換えされた細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記合胞体細胞が心筋細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記合胞体細胞が哺乳類の膀胱からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記合胞体細胞が哺乳類の肝臓からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記合胞体細胞が動脈からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記合胞体細胞が細動脈からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記合胞体細胞が哺乳類の胃腸管からとった細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記合胞体細胞が上皮組織から生じる腫瘍からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記合胞体細胞が平滑筋組織から生じる腫瘍からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記段階（ｂ）が、
（ｉ）前記遺伝子構造物に接触した前記合胞体細胞に染料を投与する段階と、
（ｉｉ）前記接触された合胞体細胞のリズムをフォトダイオードで監視する段階と、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記染料はＣａ−認識染料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｃａ−認識染料がｆｌｕｏ−３である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記染料が感圧染料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記段階（ｂ）がエッジ検出の使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記段階（ｂ）が試験ウェルに埋め込まれた電極の使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記電極の使用が、ひとつの１５０×３０μＭの刺激電極およびひとつの直径３０μｍの電極の使用を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試験ウェルは内側直径が少なくとも３ｍｍ×３ｍｍである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記段階（ｂ）が試験ウェル中のガラスパッチ電極の使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記試験ウェルは内側直径が少なくとも３ｍｍ×３ｍｍである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉ）遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と、
（ｉｉ）接触された前記合胞体細胞における収縮性が、前記遺伝子構造物が接触されていない合胞体細胞と異なるかどうか決定し、その結果前記遺伝子構造物が前記合胞体細胞の収縮性を変えるかどうかを決定する段階と、を含む、
合胞体細胞の収縮性を変えるための遺伝子構造物の能力を決定する方法。
【請求項２７】
（ａ）前記遺伝子構造物を前記合胞体細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触する段階と、
（ｂ）前記接触された合胞体細胞の収縮性を決定する段階と、
（ｃ）前記遺伝子構造物と接触するよりも前に同じ合胞体細胞の収縮性で決定された収縮性と比較する段階と、を含み、
前記遺伝子構造物の前記合胞体細胞の収縮性を変える能力が、前記接触された合胞体細胞の収縮性が前記遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞の収縮性と異なることで示される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子構造物が遺伝子組み換えされた幹細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子組み換えされた幹細胞が遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞が遺伝子でトランスフェクトされた、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子はＨＥＲＧ遺伝子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子構造物は合胞体細胞に結合することができる遺伝子組み換えされた細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記合胞体細胞が心筋細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記合胞体細胞が哺乳類の膀胱からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記合胞体細胞が哺乳類の肝臓からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記合胞体細胞が動脈からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記合胞体細胞が細動脈からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記合胞体細胞が哺乳類の胃腸管からとった細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記合胞体細胞が上皮組織から生じる腫瘍からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記合胞体細胞が平滑筋組織から生じる腫瘍からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）遺伝子構造物を合胞体細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで接触する段階と、
（ｂ）前記接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と、
（ｃ）前記遺伝子構造物と接触するよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較する段階と、を含み
前記合胞体細胞への前記遺伝子構造物の結合は、前記接触された合胞体細胞のリズムが、前記遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される、合胞体細胞への遺伝子構造物の結合を決定する方法。
【請求項４２】
前記遺伝子構造物が遺伝子組み換えされた幹細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記遺伝子組み換えされた幹細胞は遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞が遺伝子でトランスフェクトされた、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記遺伝子はＨＥＲＧ遺伝子である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記遺伝子構造物は合胞体細胞に結合することができる遺伝子組み換えされた細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記合胞体細胞が心筋細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記合胞体細胞が哺乳類の肝臓からとったものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記合胞体細胞が動脈からとったものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記合胞体細胞が細動脈からとったものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記合胞体細胞が哺乳類の胃腸管からの細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記合胞体細胞が上皮組織から生じる腫瘍からのものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記合胞体細胞が平滑筋組織から生じる腫瘍からのものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記段階（ｂ）が、
（ｉ）前記遺伝子構造物に接触した前記合胞体細胞に染料を投与する段階と、
（ｉｉ）前記接触された合胞体細胞のリズムをフォトダイオードで監視する段階と、
を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記染料はＣａ−認識染料である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｃａ−認識染料がｆｌｕｏ−３である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記染料が感圧染料である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記段階（ｂ）がエッジ検出の使用を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５９】
前記段階（ｂ）が試験ウェルに埋め込まれた電極の使用を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項６０】
前記電極の使用が、ひとつの１５０×３０μＭの刺激電極およびひとつの直径３０μｍの電極の使用を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記試験ウェルは内側直径が少なくとも３ｍｍ×３ｍｍである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記段階（ｂ）が試験ウェル中のガラスパッチ電極の使用を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項６３】
前記試験ウェルは内側直径が少なくとも３ｍｍ×３ｍｍである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有する細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と、
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と、
（ｃ）前記接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と、
（ｄ）前記遺伝子構造物と接触させるよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、前記遺伝子構造物が前記合胞体細胞のリズムを変える能力は、前記接触された合胞体細胞のリズムが前記遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と、
（ｅ）前記合胞体細胞のリズムを変える能力を持つと決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階と、
を含む、合胞体細胞のリズムを変えることができる遺伝子構造物を製造する方法。
【請求項６５】
（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有する細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と、
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と、
（ｃ）前記接触された合胞体細胞の収縮性を決定する段階と、
（ｄ）前記遺伝子構造物と接触させるよりも前に同じ合胞体細胞の収縮性で決定された収縮性と比較し、前記遺伝子構造物が前記合胞体細胞の収縮性を変える能力は、前記接触された合胞体細胞の収縮性が前記遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞の収縮性と異なることで示される段階と、
（ｅ）前記合胞体細胞の収縮性を変える能力を持つと決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階、とを含む、
合胞体細胞の収縮性を変える能力を有する遺伝子構造物を製造する方法。
【請求項６６】
（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有する細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と、
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を前記合胞体細胞に接触する段階と、
（ｃ）前記接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と、
（ｄ）前記遺伝子構造物と接触させるよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、前記遺伝子構造物の前記合胞体細胞への結合が、前記接触された合胞体細胞のリズムが前記遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と、
（ｅ）前記合胞体細胞と結合されたと決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階とを含む、
合胞体細胞と結合する能力を有する遺伝子構造物を製造する方法。
【請求項１】
（ｉ）遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と、
（ｉｉ）前記接触された合胞体細胞におけるリズムが、前記遺伝子構造に接触されていない合胞体細胞におけるものと比較して異なるかどうかを決定し、その結果前記遺伝子構造が前記合胞体細胞のリズムを変えるかどうかを決定する段階と、
を含む、合胞体細胞のリズムを変える遺伝子構造物の能力を決定する方法。
【請求項２】
（ａ）前記遺伝子構造物を前記合胞体細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで接触する段階と、
（ｂ）前記接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と、
（ｃ）前記遺伝子構造物の接触よりも前の同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較する段階と、を含み、
前記合胞体細胞のリズムを変える前記遺伝子構造物の能力は、前記接触された合胞体セルのリズムが、前記遺伝子構造物の接触よりも前の、同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子構造物が遺伝子組み換えされた幹細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子組み換えされた幹細胞が遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞が遺伝子でトランスフェクトされた、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子はＨＥＲＧ遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子構造物は合胞体細胞に結合することができる遺伝子組み換えされた細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記合胞体細胞が心筋細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記合胞体細胞が哺乳類の膀胱からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記合胞体細胞が哺乳類の肝臓からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記合胞体細胞が動脈からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記合胞体細胞が細動脈からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記合胞体細胞が哺乳類の胃腸管からとった細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記合胞体細胞が上皮組織から生じる腫瘍からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記合胞体細胞が平滑筋組織から生じる腫瘍からとったものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記段階（ｂ）が、
（ｉ）前記遺伝子構造物に接触した前記合胞体細胞に染料を投与する段階と、
（ｉｉ）前記接触された合胞体細胞のリズムをフォトダイオードで監視する段階と、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記染料はＣａ−認識染料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｃａ−認識染料がｆｌｕｏ−３である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記染料が感圧染料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記段階（ｂ）がエッジ検出の使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記段階（ｂ）が試験ウェルに埋め込まれた電極の使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記電極の使用が、ひとつの１５０×３０μＭの刺激電極およびひとつの直径３０μｍの電極の使用を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試験ウェルは内側直径が少なくとも３ｍｍ×３ｍｍである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記段階（ｂ）が試験ウェル中のガラスパッチ電極の使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記試験ウェルは内側直径が少なくとも３ｍｍ×３ｍｍである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉ）遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と、
（ｉｉ）接触された前記合胞体細胞における収縮性が、前記遺伝子構造物が接触されていない合胞体細胞と異なるかどうか決定し、その結果前記遺伝子構造物が前記合胞体細胞の収縮性を変えるかどうかを決定する段階と、を含む、
合胞体細胞の収縮性を変えるための遺伝子構造物の能力を決定する方法。
【請求項２７】
（ａ）前記遺伝子構造物を前記合胞体細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触する段階と、
（ｂ）前記接触された合胞体細胞の収縮性を決定する段階と、
（ｃ）前記遺伝子構造物と接触するよりも前に同じ合胞体細胞の収縮性で決定された収縮性と比較する段階と、を含み、
前記遺伝子構造物の前記合胞体細胞の収縮性を変える能力が、前記接触された合胞体細胞の収縮性が前記遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞の収縮性と異なることで示される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子構造物が遺伝子組み換えされた幹細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子組み換えされた幹細胞が遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞が遺伝子でトランスフェクトされた、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子はＨＥＲＧ遺伝子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子構造物は合胞体細胞に結合することができる遺伝子組み換えされた細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記合胞体細胞が心筋細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記合胞体細胞が哺乳類の膀胱からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記合胞体細胞が哺乳類の肝臓からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記合胞体細胞が動脈からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記合胞体細胞が細動脈からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記合胞体細胞が哺乳類の胃腸管からとった細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記合胞体細胞が上皮組織から生じる腫瘍からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記合胞体細胞が平滑筋組織から生じる腫瘍からとったものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）遺伝子構造物を合胞体細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで接触する段階と、
（ｂ）前記接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と、
（ｃ）前記遺伝子構造物と接触するよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較する段階と、を含み
前記合胞体細胞への前記遺伝子構造物の結合は、前記接触された合胞体細胞のリズムが、前記遺伝子構造物と接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される、合胞体細胞への遺伝子構造物の結合を決定する方法。
【請求項４２】
前記遺伝子構造物が遺伝子組み換えされた幹細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記遺伝子組み換えされた幹細胞は遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記遺伝子組み換えされた間葉性幹細胞が遺伝子でトランスフェクトされた、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記遺伝子はＨＥＲＧ遺伝子である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記遺伝子構造物は合胞体細胞に結合することができる遺伝子組み換えされた細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記合胞体細胞が心筋細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記合胞体細胞が哺乳類の肝臓からとったものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記合胞体細胞が動脈からとったものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記合胞体細胞が細動脈からとったものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記合胞体細胞が哺乳類の胃腸管からの細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記合胞体細胞が上皮組織から生じる腫瘍からのものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記合胞体細胞が平滑筋組織から生じる腫瘍からのものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記段階（ｂ）が、
（ｉ）前記遺伝子構造物に接触した前記合胞体細胞に染料を投与する段階と、
（ｉｉ）前記接触された合胞体細胞のリズムをフォトダイオードで監視する段階と、
を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記染料はＣａ−認識染料である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｃａ−認識染料がｆｌｕｏ−３である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記染料が感圧染料である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記段階（ｂ）がエッジ検出の使用を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５９】
前記段階（ｂ）が試験ウェルに埋め込まれた電極の使用を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項６０】
前記電極の使用が、ひとつの１５０×３０μＭの刺激電極およびひとつの直径３０μｍの電極の使用を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記試験ウェルは内側直径が少なくとも３ｍｍ×３ｍｍである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記段階（ｂ）が試験ウェル中のガラスパッチ電極の使用を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項６３】
前記試験ウェルは内側直径が少なくとも３ｍｍ×３ｍｍである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有する細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と、
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と、
（ｃ）前記接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と、
（ｄ）前記遺伝子構造物と接触させるよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、前記遺伝子構造物が前記合胞体細胞のリズムを変える能力は、前記接触された合胞体細胞のリズムが前記遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と、
（ｅ）前記合胞体細胞のリズムを変える能力を持つと決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階と、
を含む、合胞体細胞のリズムを変えることができる遺伝子構造物を製造する方法。
【請求項６５】
（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有する細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と、
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を合胞体細胞に接触する段階と、
（ｃ）前記接触された合胞体細胞の収縮性を決定する段階と、
（ｄ）前記遺伝子構造物と接触させるよりも前に同じ合胞体細胞の収縮性で決定された収縮性と比較し、前記遺伝子構造物が前記合胞体細胞の収縮性を変える能力は、前記接触された合胞体細胞の収縮性が前記遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞の収縮性と異なることで示される段階と、
（ｅ）前記合胞体細胞の収縮性を変える能力を持つと決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階、とを含む、
合胞体細胞の収縮性を変える能力を有する遺伝子構造物を製造する方法。
【請求項６６】
（ａ）合胞体細胞と結合する性能を有する細胞を、遺伝子構造物を形成するための遺伝子と接触する段階と、
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、段階（ａ）の遺伝子構造物を前記合胞体細胞に接触する段階と、
（ｃ）前記接触された合胞体細胞のリズムを決定する段階と、
（ｄ）前記遺伝子構造物と接触させるよりも前に同じ合胞体細胞のリズムで決定されたリズムと比較し、前記遺伝子構造物の前記合胞体細胞への結合が、前記接触された合胞体細胞のリズムが前記遺伝子構造物に接触するよりも前の同じ合胞体細胞のリズムと異なることで示される段階と、
（ｅ）前記合胞体細胞と結合されたと決定された段階（ｄ）の遺伝子構造物を選択する段階とを含む、
合胞体細胞と結合する能力を有する遺伝子構造物を製造する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５０６４１６（Ｐ２００８−５０６４１６Ａ）
【公表日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２２６９８（Ｐ２００７−５２２６９８）
【出願日】平成１７年７月１９日（２００５．７．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５７３５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２０３２２
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（３０６０１８４５７）ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (25)
【出願人】（５０３０３５９９２）ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステイト・ユニヴァーシティ・オブ・ニューヨーク (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１９日（２００５．７．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５７３５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２０３２２
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（３０６０１８４５７）ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (25)
【出願人】（５０３０３５９９２）ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステイト・ユニヴァーシティ・オブ・ニューヨーク (7)
【Ｆターム（参考）】
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