遺伝子解析方法
【課題】キャピラリー管内での再結合ＤＮＡによる標的ＤＮＡのピーク歪みを防止できる 遺伝子解析方法を提供する
【解決手段】標識剤を修飾させた標的ＤＮＡと前記標的ＤＮＡと相補なＤＮＡとが２本鎖を形成して磁気ビーズに結合した磁気ビーズ複合体を形成させる第１のステップと、前記磁気ビーズ複合体を密閉流路内に注入する第２のステップと、前記密閉流路内にプローブＤＮＡを高分子化合物に結合させたコンジュゲート体を充填させさせながら外部磁界により前記磁気ビーズ複合体を前記密閉流路内の特定部に捕捉する第３のステップと、前記捕捉された磁気ビーズ複合体から前記標的ＤＮＡを分離するための熱を与える第４のステップと、前記分離した標的ＤＮＡを前記密閉流路内で電気泳動させる第５のステップとからなる遺伝子解析方法。
【解決手段】標識剤を修飾させた標的ＤＮＡと前記標的ＤＮＡと相補なＤＮＡとが２本鎖を形成して磁気ビーズに結合した磁気ビーズ複合体を形成させる第１のステップと、前記磁気ビーズ複合体を密閉流路内に注入する第２のステップと、前記密閉流路内にプローブＤＮＡを高分子化合物に結合させたコンジュゲート体を充填させさせながら外部磁界により前記磁気ビーズ複合体を前記密閉流路内の特定部に捕捉する第３のステップと、前記捕捉された磁気ビーズ複合体から前記標的ＤＮＡを分離するための熱を与える第４のステップと、前記分離した標的ＤＮＡを前記密閉流路内で電気泳動させる第５のステップとからなる遺伝子解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡにおける一部の塩基配列の違いを検出する遺伝子解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ;一塩基多型と呼ばれる。）が注目されている。このＳＮＰは、ヒトや動物に普遍に見られるが、同じ種でも個体によりＳＮＰが異なる。すなわちＳＮＰの違いを調べることにより、各個人の疾患に対する罹患率や薬剤に対する効果や感受性を予測し、個人に合わせた医療を行うことが出来る。さらには、ヒトや動物の親子関係の特定ができると考えられる。
【０００３】
ＳＮＰを調べる方法として、アフィニティキャピラリー電気泳動法を利用した遺伝子診断装置と遺伝子診断方法がある。この方法は、まず、電荷を持たない高分子化合物と目的の１本鎖ＤＮＡ（以下“標的ＤＮＡ”と称する）に相補的な１本鎖ＤＮＡ（以下“プローブＤＮＡ”と称する）とを結合させることで、キャピラリー管内で移動しない化合物（以下“コンジュゲート体”と称する）を作製する。
【０００４】
このコンジュゲート体を電気浸透流が起きないようにコーティングされたキャピラリー管に充填した後、陰極側から標的ＤＮＡを注入して電圧を印加する。このとき標的ＤＮＡにＳＮＰを有するＤＮＡはコンジュゲート体との結合強度が強く、ＳＮＰを有さないＤＮＡはコンジュゲート体との結合強度が弱い。この両者の親和性の違いから標的ＤＮＡに含まれるＳＮＰの有無を判別する（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００５】
前記手法においては、標的ＤＮＡが１本鎖状態である必要があるが、標的ＤＮＡを得るために用いるＰＣＲ反応よって得られるＰＣＲ産物は２本鎖ＤＮＡの状態であるため、測定の前処理において２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡにする必要がある。そのため、ＰＣＲ産物に変性剤を混合し熱変性処理を行った後キャピラリー管に注入していた。
【０００６】
しかし、キャピラリー管内では変性剤の濃度が薄まるため標的ＤＮＡと相補な１本鎖ＤＮＡ（以下“相補ＤＮＡ”と称する）が再び結合し、２本鎖に戻ったＤＮＡ（以下“再結合ＤＮＡ”と称する）が生じる。この再結合ＤＮＡのピークは、検出すべき標的ＤＮＡのピークに隣接して生じるので、検出すべき標的ＤＮＡのピーク形状を歪ませてしまう。標的ＤＮＡの定量測定にはピーク面積を利用するが、この標的ＤＮＡのピーク歪みのために定量測定が出来ないという問題があった。そこで、キャピラリー管内において遅延用ＤＮＡコンジュゲート体を用いて相補ＤＮＡの電気泳動速度を遅延させることで、再結合ＤＮＡを抑制する方法が考案された（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００２−３４０８５７号公報
【非特許文献１】Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｂａｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＤＮＡ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｃｏｎｊｙｕｇａｔｅ：Ｋａｅ Ｓａｔｏ，Ａｋｉｒａ Ｉｎｏｕｅ，Ｋａｚｕｏ Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍｉｚｕｏ Ｍａｅｄａ：Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００５，（２６）３０７６−３０８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記従来の構成では、遅延用ＤＮＡコンジュゲート体はキャピラリー管内のみにあるため、キャピラリー管に注入する前に熱変性されたＰＣＲ産物に再結合ＤＮＡが生じ、標的ＤＮＡと再結合ＤＮＡとが混在したままキャピラリー管に注入されてしまう。その結果、検出すべき標的ＤＮＡのピーク歪みが生じ、正確な定量測定が出来ないという課題を有していた。
【０００８】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、キャピラリー管内での再結合ＤＮＡによる標的ＤＮＡのピーク歪みを防止できる遺伝子解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために本発明の遺伝子解析方法は、標識剤を修飾させた標的ＤＮＡと前記標的ＤＮＡと相補なＤＮＡとが２本鎖を形成して磁気ビーズに結合した磁気ビーズ複合体を形成させる第１のステップと、前記磁気ビーズ複合体を密閉流路内に注入する第２のステップと、前記密閉流路内にプローブＤＮＡを高分子化合物に結合させたコンジュゲート体を充填させさせながら外部磁界により前記磁気ビーズ複合体を前記密閉流路内の特定部に捕捉する第３のステップと、前記捕捉された磁気ビーズ複合体から前記標的ＤＮＡを分離するための熱を与える第４のステップと、前記分離した標的ＤＮＡを前記密閉流路内で電気泳動させる第５のステップからなることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の遺伝子解析方法によれば、再結合ＤＮＡがキャピラリー管に注入することを完全に防止できるので、検出すべき標的ＤＮＡのピークを正しく測定することが出来、正確な標的ＤＮＡの定量測定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の遺伝子解析装置と遺伝子解析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１２】
（実施の形態１）
＜磁気ビーズ複合体の作製＞
図１を用いて、本発明の実施の形態１における磁気ビーズ複合体の詳細を説明する。本発明の実施の形態１で解析する標的ＤＮＡは、植物、動物、また人の細胞や血液等から入手したＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲ反応を利用して目的の部分を増幅したものである。
【００１３】
ＰＣＲ増幅は図１（ａ）のように標的ＤＮＡ１１１の一端の塩基配列を含むプライマー１００（以後、“フォワード側プライマー”と称する。）には標識剤１０３（図１ではＣｙ５）を、相補ＤＮＡ１１２の一端の塩基配列を含むプライマー１０１（以後、“リバース側プライマー”と称する。）にはｂｉｏｔｉｎ１０４を修飾させたものを用いる。こうしてＰＣＲ増幅して得た図１（ｂ）に対し、アビジンが表面にコーティングされた磁気ビーズ１０５を結合させ、図１（ｃ）に示す結合体１１０（以後、“磁気ビーズ複合体”と称する）を作製する。
【００１４】
ここで、ＰＣＲ産物に含まれる標的ＤＮＡは、目的の部分以外で同じ塩基配列が存在しない長さ以上で、１本鎖になったときに自己で高次構造を形成しない長さ以下である４０塩基以上、２００塩基以下が望ましい。
【００１５】
また、標識剤は検出部で標的ＤＮＡを検出する際に標識となる物質であればよく、例えばＣｙ５、ＦＩＴＣ等の蛍光物質、ルテニウム等の発光物質が挙げられる。また、標識剤を用いず、吸光度で標的ＤＮＡを検出する手法を用いても良い。
【００１６】
また、磁気ビーズと図１（ｂ）との結合手法はアビジンービオチン結合に限らず、色々な化学結合の手法があり、例えばアミノ結合、エステル結合、カルボニル結合、イミノ結合などが挙げられる。
【００１７】
＜コンジュゲート体の作製＞
次にコンジュゲート体の詳細について説明する。図２に示すようにコンジュゲート体１１０は電荷を持たない高分子化合物１２１と１本鎖ＤＮＡ１２２（以下“プローブＤＮＡ”と称する）とが結合した構造をしている。ここで、プローブＤＮＡ１２２は標的ＤＮＡをプローブＤＮＡ１２２との結合力が強い結合型ＤＮＡと、プローブＤＮＡとの結合力が弱い非結合型ＤＮＡに分離するよう設計される。このためプローブＤＮＡ１２２の配列は、標的ＤＮＡ中のＳＮＰ部位を含む領域に相補な配列を有するように設計される。
【００１８】
ここで、プローブＤＮＡ１２２の長さは５塩基以下の場合は、標的ＤＮＡとの結合能力が十分でなく、１９塩基以上の場合は標的ＤＮＡとの結合力が強すぎて、結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡの両方と特異的に結合してしまうため好ましくない。よって、プローブＤＮＡ１２２は６塩基以上１８塩基以下の長さが好ましい。また、プローブＤＮＡ１２２の濃度は標的ＤＮＡの濃度に対して１０〜６００倍とするのが好ましい。これは１０倍以下だと標的ＤＮＡがコンジュゲート体と十分に結合出来ず標的ＤＮＡのピークが現れない。また標的ＤＮＡのピークを得る上限は、実用上は６００倍のプローブＤＮＡ１２２濃度で十分である。これを越える過剰なプローブＤＮＡ１２２を与えても、標的ＤＮＡが示すピークの識別精度の向上には寄与しない。
【００１９】
また、プローブＤＮＡと結合させる高分子化合物は標的ＤＮＡの電気泳動速度に対して十分遅い速度で電気泳動する物質で構成されるものであり、例えば一般的に使用されるリニアポリマーであるアクリルアミドやポリエチレングリコールが挙げられる。また、高分子化合物の代わりにガラスビーズや磁気ビーズなどを使用しても良い。
【００２０】
＜標的ＤＮＡの解析方法＞
続いて、図３を用いて標的ＤＮＡの解析方法について説明する。
【００２１】
（ａ）磁気ビーズ複合体の注入
図３（ａ）に密閉流路に磁気ビーズ複合体を注入する方法を示す。３０１は密閉流路で磁石３０４と高温部３０５とが中央部に配置されている。また、密閉流路３０１の一端は磁気ビーズ複合体３０６の入った容器３０７に挿入されており、他の一端は密閉された液溜め容器３０２に挿入されている。密閉された液溜め容器３０２には外部からの指示で作動するポンプ３０３が接続されている。ポンプ３０３によって密閉された液溜め容器３０２の空気を吸引することで、磁気ビーズ複合体３０６を吸引して図中矢印の方向へ密閉流路３０１内に磁気ビーズ複合体３０６を注入できる。本実施例では、ポンプによる吸引により磁気ビーズ複合体３０６を密閉流路３０１内に注入する方法を示すが、これに限定されるものでは無く、ポンプによる加圧、又は遠心力を用いた方法などを適宜用いればよい。
【００２２】
（ｂ）コンジュゲート体の充填
次に、図３（ｂ）に密閉流路にコンジュゲート体を充填する方法を示す。磁気ビーズ複合体３０６の入った容器３０７をコンジュゲート体３０８の入った容器３０９に交換してコンジュゲート体３０８を密閉流路３０１内に充填する この時、密閉流路３０１内の磁気ビーズ複合体３０６はコンジュゲート体３０８の充填によって矢印の方向に移動して磁石３０４上の位置に到達し、磁石３０４の配置された密閉流路３０１の部位に捕捉される。なお、このときの密閉流路３０１内部のコンジュゲート体の流速は、磁石３０４が磁気ビーズ複合体に含まれる磁気ビーズを吸引して捕捉できる流速にすることが重要である。適切な流速は、磁気ビーズのサイズ、密閉流路３０１の直径、コンジュゲート体３０８の粘度、磁石３０４の吸引力、吸着力に関係があり、事前に実験などで適切な流速を定めておくと良い。以上のようにして、密閉流路３０１をコンジュゲート体で満たし、磁石３０４を用いて標的ＤＮＡを含む磁気ビーズ複合体を捕捉する。
【００２３】
（ｃ）標的ＤＮＡの検出
次に、密閉された液溜め容器３０２、容器３０９を緩衝液３１０の入った容器３１１、容器３１２に交換する。また、容器３１１、容器３１２には図３（ｃ）のようにそれぞれ陽極側の電極３１３、陰極側の電極３１４が収容されていて、電源部３１５により電極３１３と電極３１４に電圧を印加すれば密閉流路３０１の両端に電圧を掛けることができる。
【００２４】
ここで緩衝液３１０には、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐH７．２〜ｐH８程度）緩衝液等を利用するのが適当である。また、緩衝液３１０には必要に応じてＤＮＡ結合制御剤が混入される。ＤＮＡ結合制御剤としては、コンジュゲート体に対する標的ＤＮＡの結合を促進する塩化マグネシウム等の結合促進剤が挙げられる。結合促進剤としての他の電解質を選ぶことで、ＤＮＡに対する多様な泳動速度の制御が可能になるものである。
【００２５】
この状態で、高温部３０５の温度を標的ＤＮＡが相補ＤＮＡから分離する温度まで上昇させ、標的ＤＮＡを磁気ビーズ複合体から分離させる。このときの様子を示したのが図４である。図４において（ａ）は高温部３０５の温度を標的ＤＮＡと相補ＤＮＡが分離する温度まで上昇させる前のイメージ図である。（ａ）において、標的ＤＮＡ１１１は磁気ビーズ１０５に結合された相補ＤＮＡ１１２と2本鎖を形成しており、磁石３０４に捕捉されている。
【００２６】
そして、図４（ｂ）は高温部３０５の温度を標的ＤＮＡと相補ＤＮＡが分離する温度まで上昇させた時のイメージ図である。図４（ｂ）において、標的ＤＮＡ１１１は相補ＤＮＡ１１２から分離しているので、磁石３０４の拘束を受けない状態である。２本鎖を分離させる時の温度は９４℃以上にすればどのような２本鎖ＤＮＡでも分離することができる。しかし、ここでは９４℃より低い温度でも標的ＤＮＡ１１１と相補ＤＮＡ１１２の間で形成される２本鎖の融解温度以上であれば良い。高温部３０５はヒーターをサーミスタなどの温度測定素子でモニタリングしながら駆動させる構成が好ましいが、温度を標的ＤＮＡ１１１と相補ＤＮＡ１１２が分離する温度まで上昇させることが出来、尚且つ磁石３０４のキュリー点を越えない温度以内に設定することが出来る構成であれば別の構成に置き換えることも可能である。
【００２７】
相補ＤＮＡ１１２から分離した標的ＤＮＡ１１１は、電源部３１５によって密閉流路３０１の両端に所定の電圧を印加すれば、標的ＤＮＡ１１１は相補ＤＮＡ１１２と分離して磁石３０４による拘束を受けなくなるため、分離部３１６の方向へ電気泳動される。
【００２８】
分離部３１６は、相補ＤＮＡ１１２から分離した標的ＤＮＡ１１１を結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡに分離する部分で、分離に最適な所定の温度に調整される。この時の温度はコンジュゲート体と標的ＤＮＡ１１１の結合力の差に基づいて標的ＤＮＡ１１１を結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡとに分離できるように高温部３０５より低温且つ、１５℃〜６０℃の範囲で所定の温度プラスマイナス１℃以下に制御できるのが好ましい。また、分離部３１６は、ペルチェ素子をサーミスタなどの温度測定素子でモニタリングしながら駆動して温度制御する構成が好ましいが、１５℃〜６０℃の範囲をプラスマイナス１℃以下の精度で温度制御できる構成であれば別の構成に置き換えることも可能である。
【００２９】
つづいて、標的ＤＮＡ１１１の検出方法について説明する。標的ＤＮＡ１１１の検出はフォワード側の５´末端に標識された蛍光色素Ｃｙ５に、検出部４００内部のレーザー４０１（６３５ｎｍ）を照射して発せられる６６０ｎｍの蛍光を、フォトダイオード４０２で検出することによって行われる。
【００３０】
具体的に述べると、レーザー４０１から照射される光（６３５ｎｍ）は、ＤＮＡを標識する蛍光物質Ｃｙ５の吸収波長域であり、蛍光物質Ｃｙ５を励起できる励起パワーが必要である。ダイクロイックミラー４０３は、波長６３５ｎｍ付近の光を反射し、波長６７０ｎｍ付近の光を透過する特性を持ち、励起光はダイクロイックミラー４０３で反射される。さらに、励起光は、対物レンズ４０４により集光され、密閉流路３０１中を電気泳動する標的ＤＮＡ１１１へ照射される。
【００３１】
標的ＤＮＡ１１１に修飾させた蛍光物質１０３は、励起光を照射され、蛍光を発する。蛍光は、対物レンズ４０４、ダイクロイックミラー４０３、集光レンズ４０５を通り、フォトダイオード４０２で受光され電気信号に変換される。電気信号はアンプ４０６によって増幅され、その後Ａ／Ｄコンバータ４０７でディジタル変換して制御演算部３１７に取り込む。なお、制御演算部３１７は時計計測機能を有しており（図示なし）、泳動開始時間からの経過時間を測定することが出来る。
【００３２】
ここで、相補ＤＮＡ１１２は磁気ビーズ１０５の影響により電気泳動してもほとんど動かないので、標的ＤＮＡ１１１が電気泳動途中に相補ＤＮＡ１１２と再結合ＤＮＡを形成することがなくなり、検出部４００では標的ＤＮＡのみを検出することが出来るため、高精度な定量分析が可能になる。
【００３３】
以下、具体的な条件や材料を示して本発明の実施の形態をより詳細に説明するが、本発明はこれに記載したＰＣＲ産物や調整条件その他に限定されるものではない。
【００３４】
（実施例１）
＜ＰＣＲ産物の調整＞
ＰＣＲの増幅はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて増幅した。鋳型はｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。フォワード側のプライマーＤＮＡは蛍光色素、ここではＣｙ５で標識した、５´−（Ｃｙ５）−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３´（フォワードプライマー、配列表１）を、リバース側のプライマーは５´−（ｂｉｏｔｉｎ）−ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣ−３´（リバースプライマー、配列表２）を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるよう加えた。反応サイクルは以下の通りである。９５℃−１０分、（９５℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−３０秒）３０サイクル、７２℃−５分。これにより、６０ｂｐのＰＣＲ産物を作製した。
【００３５】
＜ＰＣＲ産物の精製＞
前記ＰＣＲ産物を Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ Ｓｙｓｔｅｍを用いて精製した。（収率３０％、終濃度１５０ｎＭ）
＜磁気ビーズ複合体の作製＞
磁気ビーズは（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製；ＣＭ０１Ｎ／５８９６、平均粒径０．３５μｍ）を用いた。この磁気ビーズはビーズ表面にストレプトアビジンがコーティングされている。また、ＰＣＲ産物は前項で精製したＰＣＲ産物を１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液）に溶解させ、１００ｎＭに調製したものを用いた。
【００３６】
まず、磁気ビーズを１ｍｇ採取し、ＴＴＬバッファー（終濃度：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）, ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０, １Ｍ ＬｉＣｌ）で洗浄後、２０μＬのＴＴＬバッファーに置換した。その後、（１００ｎＭの）ＰＣＲ産物を５μＬ添加し、室温で１５分穏やかに振とうした。溶液を除去し、残留した磁気ビーズを０．１５ＭのＮａＯＨで洗浄後、ＴＴバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）, ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。洗浄後、ＴＴＥバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）, ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０, ２０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶液を置換し、磁気ビーズ複合体を得た。
【００３７】
＜緩衝液の調整＞
Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．４）終濃度５０ｍＭで使用した。
【００３８】
＜コンジュゲート体の作製＞
第１の標的ＤＮＡに相補的な塩基配列を持つアミノ化ＤＮＡ（プローブ）を１ｍＭになるように水またはＴＥ（ｐＨ７．４）を加えて調整した。アミノ化ＤＮＡ（プローブ）の配列は５´−ＡＣＣＡＧＣ−３´（配列表３）である。分子量２０，０００のＮＨＳ−ＰＥＧにＤＭＳＯを４４５μｌ加え、２０℃で３時間振とう後、分子量１０，０００を分画する透析膜を用いて、一晩透析した後、乾燥した。コンジュゲート体１２０は１００μＭになるよう緩衝液で溶かした。
【００３９】
＜遺伝子解析装置によるSNP測定＞
密閉流路５はコーティングされた内径１００μｍのキャピラリー管（大塚電子製）を使用した。そして、ポンプ３０３によって磁気ビーズ複合体を密閉流路３０１内に１ｃｍ／秒の速度で２秒間注入し、続いてコンジュゲート体を同じくポンプ３０３によって１ｃｍ／秒の速度で密閉流路３０１内に充填した。その後、高温部３０５を９５℃になるよう制御して１分間加熱した。
【００４０】
その後、電源部３１５によって電極３１３、電極３１４間へ６ｋＶの電圧を印加して密閉流路３０１内の標的ＤＮＡを３０℃に温度制御した分離部３１６中で電気泳動させ、前記標的ＤＮＡを前記コンジュゲート体に対する親和性の差によって、結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡに分離した。検出部１０では検出フィルターでレーザー１０ａから照射される６３５ｎｍの励起光をカットして標的ＤＮＡに標識しているＣｙ５の６６０ｎｍの蛍光をフォトダイオード１０ｂで検出してアンプ１０ｃで増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１０ｄでアナログ信号をディジタル化して制御演算部１１に取り込んだ。
【００４１】
（比較例）
比較例として、従来の方法を用いて実施例１と同じ標的ＤＮＡの解析を行った。
【００４２】
＜ＰＣＲ産物の調整＞
ＰＣＲの増幅はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて増幅した。鋳型はｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。フォワード側のプライマーＤＮＡは蛍光色素、ここではＣｙ５で標識した、５´−（Ｃｙ５）−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３´（フォワード側プライマー、配列表２）（配列表の番号は１から）を、リバース側のプライマーは５´−ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣ−３´（リバース側プライマー、配列表３）を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるよう加えた。反応サイクルは以下の通りである。９５℃−１０分、（９５℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−３０秒）３０サイクル、７２℃−５分。これにより、６０ｂｐのＰＣＲ産物を作製した。本発明の実施例１ではリバース側のプライマーにｂｉｏｔｉｎを修飾させているが、従来の方法ではｂｉｏｔｉｎを修飾させない。
【００４３】
＜ＰＣＲ産物の変性＞
比較例ではＰＣＲ産物を２本鎖から１本鎖にする変性処理を行った。具体的には、ＰＣＲ産物２μｌに、変性剤としてホルムアミドを４０μｌを加え、９５℃で５分間熱した後、氷冷した。
【００４４】
＜緩衝液の調整＞
本発明の実施例１と同じ緩衝液を使用した。
【００４５】
＜コンジュゲート体の作製＞
本発明の実施例１と同じコンジュゲート体を使用した。
【００４６】
＜遺伝子解析装置によるＳＮＰ測定＞
比較例においても本発明の実施例１と同様の遺伝子解析装置を用いるが、測定の工程が異なる。
【００４７】
まず、ポンプ３０３によってコンジュゲート体を密閉流路３０１内に充填する。その後、ＰＣＲ産物をポンプ３０３によって１ｃｍ／秒の速度で密閉流路３０１内に２秒間注入してから、電極３１３、電極３１４間へ６ｋＶの電圧を印加して密閉流路３０１内の標的ＤＮＡを３０℃に温度制御した分離部３１６中で電気泳動させ、前記標的ＤＮＡを前記コンジュゲート体に対する親和性の差によって、結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡに分離した。検出部１０では検出フィルターでレーザー１０ａから照射される６３５ｎｍの励起光をカットして標的ＤＮＡに標識しているＣｙ５の６６０ｎｍの蛍光をフォトダイオード１０ｂで検出してアンプ１０ｃで増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１０ｄでアナログ信号をディジタル化して制御演算部１１に取り込んだ。
【００４８】
（実施例１と比較例の比較）
図５に本発明の実施例１での検出波形を示し、図６に従来技術である比較例の検出波形を示す。図５に示すように、実施例１では、時間の早い方から順に非結合型ＤＮＡのピーク２００と結合型ＤＮＡのピーク２０１とが検出された。しかい、図６の従来法（比較例）で見られる再結合ＤＮＡのピーク２０３は検出されていない。
【００４９】
一方、図６に示すように、比較例での検出波形では、時間の早い方から順にプライマーのピーク２０２、非結合型ＤＮＡのピーク２０３、結合型ＤＮＡのピーク２０１が検出された。図５と図６とを比較すると明らかな様に、非結合型ＤＮＡ２００と結合型ＤＮＡ２０１のピークの間に再結合ＤＮＡ２０３によるピークが生じており、そのため、結合型ＤＮＡ２０１の形に歪が生じている。この結果から明らかなように、本発明による磁気ビーズ複合体を電気泳動する前に捕捉し、この磁気ビーズ複合体に結合した相補ＤＮＡから標的ＤＮＡを分離することで、従来、遺伝子解析の際に課題となっていた電気泳動時に生じる再結合ＤＮＡの発生を除去することが出来る。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明にかかる遺伝子解析方法は、電気泳動時に生じる再結合ＤＮＡの発生を除去することが出来るので、正確に生体物質の状態を解析する方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】（ａ）本発明の実施の形態１における鋳型ＤＮＡとプライマーの構成図（ｂ）本発明の実施の形態１におけるＰＣＲ産物の構成図（ｃ）本発明の実施の形態１における磁気ビーズ複合体の構成図
【図２】本発明の実施の形態１におけるコンジュゲート体の構成図
【図３】（ａ）本発明の実施の形態１における磁気ビーズ複合体を充填する様子を示した図（ｂ）本発明の実施の形態１におけるコンジュゲート体を充填する様子を示した図（ｃ）本発明の実施の形態１における標的ＤＮＡの検出を行う装置の構成を示した図
【図４】（ａ）高温部によって温度を上昇させる前の標的ＤＮＡの様子を示した図（ｂ）高温部によって温度を上昇させた後の標的ＤＮＡの様子を示した図
【図５】本発明の実施例１における検出波形を示す図
【図６】従来の構成である比較例における検出波形を示す図
【符号の説明】
【００５２】
１００ フォワード側プライマー
１０１ リバース側プライマー
１０２ 鋳型ＤＮＡ
１０３ 標識剤
１０４ ｂｉｏｔｉｎ
１０５ 磁気ビーズ
１１０ 磁気ビーズ複合体
１１１ 標的ＤＮＡ
１１２ 相補ＤＮＡ
１２０ コンジュゲート体
１２１ 高分子化合物
１２２ プローブＤＮＡ
２００ 非結合型ＤＮＡ
２０１ 結合型ＤＮＡ
２０２ プライマー
２０３ 再結合ＤＮＡ
３０１ 密閉流路
３０２ 密閉された液溜め容器
３０３ ポンプ
３０４ 磁石
３０５ 高温部
３０６ 磁気ビーズ複合体
３０７ 磁気ビーズ複合体を入れる容器
３０８ コンジュゲート体
３０９ コンジュゲート体を入れる容器
３１０ 緩衝液
３１１ 緩衝液を入れる容器
３１２ 緩衝液を入れる容器
３１３ 陽極側の電極
３１４ 陰極側の電極
３１５ 電源部
３１６ 分離部
３１７ 制御演算部
４０１ レーザー
４０２ フォトダイオード
４０３ ダイクロックミラー
４０４ 対物レンズ
４０５ 集光レンズ
４０６ アンプ
４０７ Ａ／Ｄコンバータ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡにおける一部の塩基配列の違いを検出する遺伝子解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ;一塩基多型と呼ばれる。）が注目されている。このＳＮＰは、ヒトや動物に普遍に見られるが、同じ種でも個体によりＳＮＰが異なる。すなわちＳＮＰの違いを調べることにより、各個人の疾患に対する罹患率や薬剤に対する効果や感受性を予測し、個人に合わせた医療を行うことが出来る。さらには、ヒトや動物の親子関係の特定ができると考えられる。
【０００３】
ＳＮＰを調べる方法として、アフィニティキャピラリー電気泳動法を利用した遺伝子診断装置と遺伝子診断方法がある。この方法は、まず、電荷を持たない高分子化合物と目的の１本鎖ＤＮＡ（以下“標的ＤＮＡ”と称する）に相補的な１本鎖ＤＮＡ（以下“プローブＤＮＡ”と称する）とを結合させることで、キャピラリー管内で移動しない化合物（以下“コンジュゲート体”と称する）を作製する。
【０００４】
このコンジュゲート体を電気浸透流が起きないようにコーティングされたキャピラリー管に充填した後、陰極側から標的ＤＮＡを注入して電圧を印加する。このとき標的ＤＮＡにＳＮＰを有するＤＮＡはコンジュゲート体との結合強度が強く、ＳＮＰを有さないＤＮＡはコンジュゲート体との結合強度が弱い。この両者の親和性の違いから標的ＤＮＡに含まれるＳＮＰの有無を判別する（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００５】
前記手法においては、標的ＤＮＡが１本鎖状態である必要があるが、標的ＤＮＡを得るために用いるＰＣＲ反応よって得られるＰＣＲ産物は２本鎖ＤＮＡの状態であるため、測定の前処理において２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡにする必要がある。そのため、ＰＣＲ産物に変性剤を混合し熱変性処理を行った後キャピラリー管に注入していた。
【０００６】
しかし、キャピラリー管内では変性剤の濃度が薄まるため標的ＤＮＡと相補な１本鎖ＤＮＡ（以下“相補ＤＮＡ”と称する）が再び結合し、２本鎖に戻ったＤＮＡ（以下“再結合ＤＮＡ”と称する）が生じる。この再結合ＤＮＡのピークは、検出すべき標的ＤＮＡのピークに隣接して生じるので、検出すべき標的ＤＮＡのピーク形状を歪ませてしまう。標的ＤＮＡの定量測定にはピーク面積を利用するが、この標的ＤＮＡのピーク歪みのために定量測定が出来ないという問題があった。そこで、キャピラリー管内において遅延用ＤＮＡコンジュゲート体を用いて相補ＤＮＡの電気泳動速度を遅延させることで、再結合ＤＮＡを抑制する方法が考案された（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００２−３４０８５７号公報
【非特許文献１】Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｂａｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＤＮＡ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｃｏｎｊｙｕｇａｔｅ：Ｋａｅ Ｓａｔｏ，Ａｋｉｒａ Ｉｎｏｕｅ，Ｋａｚｕｏ Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍｉｚｕｏ Ｍａｅｄａ：Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２００５，（２６）３０７６−３０８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記従来の構成では、遅延用ＤＮＡコンジュゲート体はキャピラリー管内のみにあるため、キャピラリー管に注入する前に熱変性されたＰＣＲ産物に再結合ＤＮＡが生じ、標的ＤＮＡと再結合ＤＮＡとが混在したままキャピラリー管に注入されてしまう。その結果、検出すべき標的ＤＮＡのピーク歪みが生じ、正確な定量測定が出来ないという課題を有していた。
【０００８】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、キャピラリー管内での再結合ＤＮＡによる標的ＤＮＡのピーク歪みを防止できる遺伝子解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために本発明の遺伝子解析方法は、標識剤を修飾させた標的ＤＮＡと前記標的ＤＮＡと相補なＤＮＡとが２本鎖を形成して磁気ビーズに結合した磁気ビーズ複合体を形成させる第１のステップと、前記磁気ビーズ複合体を密閉流路内に注入する第２のステップと、前記密閉流路内にプローブＤＮＡを高分子化合物に結合させたコンジュゲート体を充填させさせながら外部磁界により前記磁気ビーズ複合体を前記密閉流路内の特定部に捕捉する第３のステップと、前記捕捉された磁気ビーズ複合体から前記標的ＤＮＡを分離するための熱を与える第４のステップと、前記分離した標的ＤＮＡを前記密閉流路内で電気泳動させる第５のステップからなることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の遺伝子解析方法によれば、再結合ＤＮＡがキャピラリー管に注入することを完全に防止できるので、検出すべき標的ＤＮＡのピークを正しく測定することが出来、正確な標的ＤＮＡの定量測定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の遺伝子解析装置と遺伝子解析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１２】
（実施の形態１）
＜磁気ビーズ複合体の作製＞
図１を用いて、本発明の実施の形態１における磁気ビーズ複合体の詳細を説明する。本発明の実施の形態１で解析する標的ＤＮＡは、植物、動物、また人の細胞や血液等から入手したＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲ反応を利用して目的の部分を増幅したものである。
【００１３】
ＰＣＲ増幅は図１（ａ）のように標的ＤＮＡ１１１の一端の塩基配列を含むプライマー１００（以後、“フォワード側プライマー”と称する。）には標識剤１０３（図１ではＣｙ５）を、相補ＤＮＡ１１２の一端の塩基配列を含むプライマー１０１（以後、“リバース側プライマー”と称する。）にはｂｉｏｔｉｎ１０４を修飾させたものを用いる。こうしてＰＣＲ増幅して得た図１（ｂ）に対し、アビジンが表面にコーティングされた磁気ビーズ１０５を結合させ、図１（ｃ）に示す結合体１１０（以後、“磁気ビーズ複合体”と称する）を作製する。
【００１４】
ここで、ＰＣＲ産物に含まれる標的ＤＮＡは、目的の部分以外で同じ塩基配列が存在しない長さ以上で、１本鎖になったときに自己で高次構造を形成しない長さ以下である４０塩基以上、２００塩基以下が望ましい。
【００１５】
また、標識剤は検出部で標的ＤＮＡを検出する際に標識となる物質であればよく、例えばＣｙ５、ＦＩＴＣ等の蛍光物質、ルテニウム等の発光物質が挙げられる。また、標識剤を用いず、吸光度で標的ＤＮＡを検出する手法を用いても良い。
【００１６】
また、磁気ビーズと図１（ｂ）との結合手法はアビジンービオチン結合に限らず、色々な化学結合の手法があり、例えばアミノ結合、エステル結合、カルボニル結合、イミノ結合などが挙げられる。
【００１７】
＜コンジュゲート体の作製＞
次にコンジュゲート体の詳細について説明する。図２に示すようにコンジュゲート体１１０は電荷を持たない高分子化合物１２１と１本鎖ＤＮＡ１２２（以下“プローブＤＮＡ”と称する）とが結合した構造をしている。ここで、プローブＤＮＡ１２２は標的ＤＮＡをプローブＤＮＡ１２２との結合力が強い結合型ＤＮＡと、プローブＤＮＡとの結合力が弱い非結合型ＤＮＡに分離するよう設計される。このためプローブＤＮＡ１２２の配列は、標的ＤＮＡ中のＳＮＰ部位を含む領域に相補な配列を有するように設計される。
【００１８】
ここで、プローブＤＮＡ１２２の長さは５塩基以下の場合は、標的ＤＮＡとの結合能力が十分でなく、１９塩基以上の場合は標的ＤＮＡとの結合力が強すぎて、結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡの両方と特異的に結合してしまうため好ましくない。よって、プローブＤＮＡ１２２は６塩基以上１８塩基以下の長さが好ましい。また、プローブＤＮＡ１２２の濃度は標的ＤＮＡの濃度に対して１０〜６００倍とするのが好ましい。これは１０倍以下だと標的ＤＮＡがコンジュゲート体と十分に結合出来ず標的ＤＮＡのピークが現れない。また標的ＤＮＡのピークを得る上限は、実用上は６００倍のプローブＤＮＡ１２２濃度で十分である。これを越える過剰なプローブＤＮＡ１２２を与えても、標的ＤＮＡが示すピークの識別精度の向上には寄与しない。
【００１９】
また、プローブＤＮＡと結合させる高分子化合物は標的ＤＮＡの電気泳動速度に対して十分遅い速度で電気泳動する物質で構成されるものであり、例えば一般的に使用されるリニアポリマーであるアクリルアミドやポリエチレングリコールが挙げられる。また、高分子化合物の代わりにガラスビーズや磁気ビーズなどを使用しても良い。
【００２０】
＜標的ＤＮＡの解析方法＞
続いて、図３を用いて標的ＤＮＡの解析方法について説明する。
【００２１】
（ａ）磁気ビーズ複合体の注入
図３（ａ）に密閉流路に磁気ビーズ複合体を注入する方法を示す。３０１は密閉流路で磁石３０４と高温部３０５とが中央部に配置されている。また、密閉流路３０１の一端は磁気ビーズ複合体３０６の入った容器３０７に挿入されており、他の一端は密閉された液溜め容器３０２に挿入されている。密閉された液溜め容器３０２には外部からの指示で作動するポンプ３０３が接続されている。ポンプ３０３によって密閉された液溜め容器３０２の空気を吸引することで、磁気ビーズ複合体３０６を吸引して図中矢印の方向へ密閉流路３０１内に磁気ビーズ複合体３０６を注入できる。本実施例では、ポンプによる吸引により磁気ビーズ複合体３０６を密閉流路３０１内に注入する方法を示すが、これに限定されるものでは無く、ポンプによる加圧、又は遠心力を用いた方法などを適宜用いればよい。
【００２２】
（ｂ）コンジュゲート体の充填
次に、図３（ｂ）に密閉流路にコンジュゲート体を充填する方法を示す。磁気ビーズ複合体３０６の入った容器３０７をコンジュゲート体３０８の入った容器３０９に交換してコンジュゲート体３０８を密閉流路３０１内に充填する この時、密閉流路３０１内の磁気ビーズ複合体３０６はコンジュゲート体３０８の充填によって矢印の方向に移動して磁石３０４上の位置に到達し、磁石３０４の配置された密閉流路３０１の部位に捕捉される。なお、このときの密閉流路３０１内部のコンジュゲート体の流速は、磁石３０４が磁気ビーズ複合体に含まれる磁気ビーズを吸引して捕捉できる流速にすることが重要である。適切な流速は、磁気ビーズのサイズ、密閉流路３０１の直径、コンジュゲート体３０８の粘度、磁石３０４の吸引力、吸着力に関係があり、事前に実験などで適切な流速を定めておくと良い。以上のようにして、密閉流路３０１をコンジュゲート体で満たし、磁石３０４を用いて標的ＤＮＡを含む磁気ビーズ複合体を捕捉する。
【００２３】
（ｃ）標的ＤＮＡの検出
次に、密閉された液溜め容器３０２、容器３０９を緩衝液３１０の入った容器３１１、容器３１２に交換する。また、容器３１１、容器３１２には図３（ｃ）のようにそれぞれ陽極側の電極３１３、陰極側の電極３１４が収容されていて、電源部３１５により電極３１３と電極３１４に電圧を印加すれば密閉流路３０１の両端に電圧を掛けることができる。
【００２４】
ここで緩衝液３１０には、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐH７．２〜ｐH８程度）緩衝液等を利用するのが適当である。また、緩衝液３１０には必要に応じてＤＮＡ結合制御剤が混入される。ＤＮＡ結合制御剤としては、コンジュゲート体に対する標的ＤＮＡの結合を促進する塩化マグネシウム等の結合促進剤が挙げられる。結合促進剤としての他の電解質を選ぶことで、ＤＮＡに対する多様な泳動速度の制御が可能になるものである。
【００２５】
この状態で、高温部３０５の温度を標的ＤＮＡが相補ＤＮＡから分離する温度まで上昇させ、標的ＤＮＡを磁気ビーズ複合体から分離させる。このときの様子を示したのが図４である。図４において（ａ）は高温部３０５の温度を標的ＤＮＡと相補ＤＮＡが分離する温度まで上昇させる前のイメージ図である。（ａ）において、標的ＤＮＡ１１１は磁気ビーズ１０５に結合された相補ＤＮＡ１１２と2本鎖を形成しており、磁石３０４に捕捉されている。
【００２６】
そして、図４（ｂ）は高温部３０５の温度を標的ＤＮＡと相補ＤＮＡが分離する温度まで上昇させた時のイメージ図である。図４（ｂ）において、標的ＤＮＡ１１１は相補ＤＮＡ１１２から分離しているので、磁石３０４の拘束を受けない状態である。２本鎖を分離させる時の温度は９４℃以上にすればどのような２本鎖ＤＮＡでも分離することができる。しかし、ここでは９４℃より低い温度でも標的ＤＮＡ１１１と相補ＤＮＡ１１２の間で形成される２本鎖の融解温度以上であれば良い。高温部３０５はヒーターをサーミスタなどの温度測定素子でモニタリングしながら駆動させる構成が好ましいが、温度を標的ＤＮＡ１１１と相補ＤＮＡ１１２が分離する温度まで上昇させることが出来、尚且つ磁石３０４のキュリー点を越えない温度以内に設定することが出来る構成であれば別の構成に置き換えることも可能である。
【００２７】
相補ＤＮＡ１１２から分離した標的ＤＮＡ１１１は、電源部３１５によって密閉流路３０１の両端に所定の電圧を印加すれば、標的ＤＮＡ１１１は相補ＤＮＡ１１２と分離して磁石３０４による拘束を受けなくなるため、分離部３１６の方向へ電気泳動される。
【００２８】
分離部３１６は、相補ＤＮＡ１１２から分離した標的ＤＮＡ１１１を結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡに分離する部分で、分離に最適な所定の温度に調整される。この時の温度はコンジュゲート体と標的ＤＮＡ１１１の結合力の差に基づいて標的ＤＮＡ１１１を結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡとに分離できるように高温部３０５より低温且つ、１５℃〜６０℃の範囲で所定の温度プラスマイナス１℃以下に制御できるのが好ましい。また、分離部３１６は、ペルチェ素子をサーミスタなどの温度測定素子でモニタリングしながら駆動して温度制御する構成が好ましいが、１５℃〜６０℃の範囲をプラスマイナス１℃以下の精度で温度制御できる構成であれば別の構成に置き換えることも可能である。
【００２９】
つづいて、標的ＤＮＡ１１１の検出方法について説明する。標的ＤＮＡ１１１の検出はフォワード側の５´末端に標識された蛍光色素Ｃｙ５に、検出部４００内部のレーザー４０１（６３５ｎｍ）を照射して発せられる６６０ｎｍの蛍光を、フォトダイオード４０２で検出することによって行われる。
【００３０】
具体的に述べると、レーザー４０１から照射される光（６３５ｎｍ）は、ＤＮＡを標識する蛍光物質Ｃｙ５の吸収波長域であり、蛍光物質Ｃｙ５を励起できる励起パワーが必要である。ダイクロイックミラー４０３は、波長６３５ｎｍ付近の光を反射し、波長６７０ｎｍ付近の光を透過する特性を持ち、励起光はダイクロイックミラー４０３で反射される。さらに、励起光は、対物レンズ４０４により集光され、密閉流路３０１中を電気泳動する標的ＤＮＡ１１１へ照射される。
【００３１】
標的ＤＮＡ１１１に修飾させた蛍光物質１０３は、励起光を照射され、蛍光を発する。蛍光は、対物レンズ４０４、ダイクロイックミラー４０３、集光レンズ４０５を通り、フォトダイオード４０２で受光され電気信号に変換される。電気信号はアンプ４０６によって増幅され、その後Ａ／Ｄコンバータ４０７でディジタル変換して制御演算部３１７に取り込む。なお、制御演算部３１７は時計計測機能を有しており（図示なし）、泳動開始時間からの経過時間を測定することが出来る。
【００３２】
ここで、相補ＤＮＡ１１２は磁気ビーズ１０５の影響により電気泳動してもほとんど動かないので、標的ＤＮＡ１１１が電気泳動途中に相補ＤＮＡ１１２と再結合ＤＮＡを形成することがなくなり、検出部４００では標的ＤＮＡのみを検出することが出来るため、高精度な定量分析が可能になる。
【００３３】
以下、具体的な条件や材料を示して本発明の実施の形態をより詳細に説明するが、本発明はこれに記載したＰＣＲ産物や調整条件その他に限定されるものではない。
【００３４】
（実施例１）
＜ＰＣＲ産物の調整＞
ＰＣＲの増幅はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて増幅した。鋳型はｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。フォワード側のプライマーＤＮＡは蛍光色素、ここではＣｙ５で標識した、５´−（Ｃｙ５）−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３´（フォワードプライマー、配列表１）を、リバース側のプライマーは５´−（ｂｉｏｔｉｎ）−ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣ−３´（リバースプライマー、配列表２）を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるよう加えた。反応サイクルは以下の通りである。９５℃−１０分、（９５℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−３０秒）３０サイクル、７２℃−５分。これにより、６０ｂｐのＰＣＲ産物を作製した。
【００３５】
＜ＰＣＲ産物の精製＞
前記ＰＣＲ産物を Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ Ｓｙｓｔｅｍを用いて精製した。（収率３０％、終濃度１５０ｎＭ）
＜磁気ビーズ複合体の作製＞
磁気ビーズは（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製；ＣＭ０１Ｎ／５８９６、平均粒径０．３５μｍ）を用いた。この磁気ビーズはビーズ表面にストレプトアビジンがコーティングされている。また、ＰＣＲ産物は前項で精製したＰＣＲ産物を１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液）に溶解させ、１００ｎＭに調製したものを用いた。
【００３６】
まず、磁気ビーズを１ｍｇ採取し、ＴＴＬバッファー（終濃度：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）, ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０, １Ｍ ＬｉＣｌ）で洗浄後、２０μＬのＴＴＬバッファーに置換した。その後、（１００ｎＭの）ＰＣＲ産物を５μＬ添加し、室温で１５分穏やかに振とうした。溶液を除去し、残留した磁気ビーズを０．１５ＭのＮａＯＨで洗浄後、ＴＴバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）, ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。洗浄後、ＴＴＥバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）, ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０, ２０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶液を置換し、磁気ビーズ複合体を得た。
【００３７】
＜緩衝液の調整＞
Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．４）終濃度５０ｍＭで使用した。
【００３８】
＜コンジュゲート体の作製＞
第１の標的ＤＮＡに相補的な塩基配列を持つアミノ化ＤＮＡ（プローブ）を１ｍＭになるように水またはＴＥ（ｐＨ７．４）を加えて調整した。アミノ化ＤＮＡ（プローブ）の配列は５´−ＡＣＣＡＧＣ−３´（配列表３）である。分子量２０，０００のＮＨＳ−ＰＥＧにＤＭＳＯを４４５μｌ加え、２０℃で３時間振とう後、分子量１０，０００を分画する透析膜を用いて、一晩透析した後、乾燥した。コンジュゲート体１２０は１００μＭになるよう緩衝液で溶かした。
【００３９】
＜遺伝子解析装置によるSNP測定＞
密閉流路５はコーティングされた内径１００μｍのキャピラリー管（大塚電子製）を使用した。そして、ポンプ３０３によって磁気ビーズ複合体を密閉流路３０１内に１ｃｍ／秒の速度で２秒間注入し、続いてコンジュゲート体を同じくポンプ３０３によって１ｃｍ／秒の速度で密閉流路３０１内に充填した。その後、高温部３０５を９５℃になるよう制御して１分間加熱した。
【００４０】
その後、電源部３１５によって電極３１３、電極３１４間へ６ｋＶの電圧を印加して密閉流路３０１内の標的ＤＮＡを３０℃に温度制御した分離部３１６中で電気泳動させ、前記標的ＤＮＡを前記コンジュゲート体に対する親和性の差によって、結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡに分離した。検出部１０では検出フィルターでレーザー１０ａから照射される６３５ｎｍの励起光をカットして標的ＤＮＡに標識しているＣｙ５の６６０ｎｍの蛍光をフォトダイオード１０ｂで検出してアンプ１０ｃで増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１０ｄでアナログ信号をディジタル化して制御演算部１１に取り込んだ。
【００４１】
（比較例）
比較例として、従来の方法を用いて実施例１と同じ標的ＤＮＡの解析を行った。
【００４２】
＜ＰＣＲ産物の調整＞
ＰＣＲの増幅はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて増幅した。鋳型はｒａｓ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。フォワード側のプライマーＤＮＡは蛍光色素、ここではＣｙ５で標識した、５´−（Ｃｙ５）−ＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧ−３´（フォワード側プライマー、配列表２）（配列表の番号は１から）を、リバース側のプライマーは５´−ＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣ−３´（リバース側プライマー、配列表３）を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるよう加えた。反応サイクルは以下の通りである。９５℃−１０分、（９５℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−３０秒）３０サイクル、７２℃−５分。これにより、６０ｂｐのＰＣＲ産物を作製した。本発明の実施例１ではリバース側のプライマーにｂｉｏｔｉｎを修飾させているが、従来の方法ではｂｉｏｔｉｎを修飾させない。
【００４３】
＜ＰＣＲ産物の変性＞
比較例ではＰＣＲ産物を２本鎖から１本鎖にする変性処理を行った。具体的には、ＰＣＲ産物２μｌに、変性剤としてホルムアミドを４０μｌを加え、９５℃で５分間熱した後、氷冷した。
【００４４】
＜緩衝液の調整＞
本発明の実施例１と同じ緩衝液を使用した。
【００４５】
＜コンジュゲート体の作製＞
本発明の実施例１と同じコンジュゲート体を使用した。
【００４６】
＜遺伝子解析装置によるＳＮＰ測定＞
比較例においても本発明の実施例１と同様の遺伝子解析装置を用いるが、測定の工程が異なる。
【００４７】
まず、ポンプ３０３によってコンジュゲート体を密閉流路３０１内に充填する。その後、ＰＣＲ産物をポンプ３０３によって１ｃｍ／秒の速度で密閉流路３０１内に２秒間注入してから、電極３１３、電極３１４間へ６ｋＶの電圧を印加して密閉流路３０１内の標的ＤＮＡを３０℃に温度制御した分離部３１６中で電気泳動させ、前記標的ＤＮＡを前記コンジュゲート体に対する親和性の差によって、結合型ＤＮＡと非結合型ＤＮＡに分離した。検出部１０では検出フィルターでレーザー１０ａから照射される６３５ｎｍの励起光をカットして標的ＤＮＡに標識しているＣｙ５の６６０ｎｍの蛍光をフォトダイオード１０ｂで検出してアンプ１０ｃで増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１０ｄでアナログ信号をディジタル化して制御演算部１１に取り込んだ。
【００４８】
（実施例１と比較例の比較）
図５に本発明の実施例１での検出波形を示し、図６に従来技術である比較例の検出波形を示す。図５に示すように、実施例１では、時間の早い方から順に非結合型ＤＮＡのピーク２００と結合型ＤＮＡのピーク２０１とが検出された。しかい、図６の従来法（比較例）で見られる再結合ＤＮＡのピーク２０３は検出されていない。
【００４９】
一方、図６に示すように、比較例での検出波形では、時間の早い方から順にプライマーのピーク２０２、非結合型ＤＮＡのピーク２０３、結合型ＤＮＡのピーク２０１が検出された。図５と図６とを比較すると明らかな様に、非結合型ＤＮＡ２００と結合型ＤＮＡ２０１のピークの間に再結合ＤＮＡ２０３によるピークが生じており、そのため、結合型ＤＮＡ２０１の形に歪が生じている。この結果から明らかなように、本発明による磁気ビーズ複合体を電気泳動する前に捕捉し、この磁気ビーズ複合体に結合した相補ＤＮＡから標的ＤＮＡを分離することで、従来、遺伝子解析の際に課題となっていた電気泳動時に生じる再結合ＤＮＡの発生を除去することが出来る。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明にかかる遺伝子解析方法は、電気泳動時に生じる再結合ＤＮＡの発生を除去することが出来るので、正確に生体物質の状態を解析する方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】（ａ）本発明の実施の形態１における鋳型ＤＮＡとプライマーの構成図（ｂ）本発明の実施の形態１におけるＰＣＲ産物の構成図（ｃ）本発明の実施の形態１における磁気ビーズ複合体の構成図
【図２】本発明の実施の形態１におけるコンジュゲート体の構成図
【図３】（ａ）本発明の実施の形態１における磁気ビーズ複合体を充填する様子を示した図（ｂ）本発明の実施の形態１におけるコンジュゲート体を充填する様子を示した図（ｃ）本発明の実施の形態１における標的ＤＮＡの検出を行う装置の構成を示した図
【図４】（ａ）高温部によって温度を上昇させる前の標的ＤＮＡの様子を示した図（ｂ）高温部によって温度を上昇させた後の標的ＤＮＡの様子を示した図
【図５】本発明の実施例１における検出波形を示す図
【図６】従来の構成である比較例における検出波形を示す図
【符号の説明】
【００５２】
１００ フォワード側プライマー
１０１ リバース側プライマー
１０２ 鋳型ＤＮＡ
１０３ 標識剤
１０４ ｂｉｏｔｉｎ
１０５ 磁気ビーズ
１１０ 磁気ビーズ複合体
１１１ 標的ＤＮＡ
１１２ 相補ＤＮＡ
１２０ コンジュゲート体
１２１ 高分子化合物
１２２ プローブＤＮＡ
２００ 非結合型ＤＮＡ
２０１ 結合型ＤＮＡ
２０２ プライマー
２０３ 再結合ＤＮＡ
３０１ 密閉流路
３０２ 密閉された液溜め容器
３０３ ポンプ
３０４ 磁石
３０５ 高温部
３０６ 磁気ビーズ複合体
３０７ 磁気ビーズ複合体を入れる容器
３０８ コンジュゲート体
３０９ コンジュゲート体を入れる容器
３１０ 緩衝液
３１１ 緩衝液を入れる容器
３１２ 緩衝液を入れる容器
３１３ 陽極側の電極
３１４ 陰極側の電極
３１５ 電源部
３１６ 分離部
３１７ 制御演算部
４０１ レーザー
４０２ フォトダイオード
４０３ ダイクロックミラー
４０４ 対物レンズ
４０５ 集光レンズ
４０６ アンプ
４０７ Ａ／Ｄコンバータ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識剤を修飾させた標的ＤＮＡと前記標的ＤＮＡと相補なＤＮＡとが２本鎖を形成して磁気ビーズに結合した磁気ビーズ複合体を形成させる第１のステップと、
前記磁気ビーズ複合体を密閉流路内に注入する第２のステップと、
前記密閉流路内にプローブＤＮＡを高分子化合物に結合させたコンジュゲート体を充填させさせながら外部磁界により前記磁気ビーズ複合体を前記密閉流路内の特定部に捕捉する第３のステップと、
前記捕捉された磁気ビーズ複合体から前記標的ＤＮＡを分離するための熱を与える第４のステップと、
前記分離した標的ＤＮＡを前記密閉流路内で電気泳動させる第５のステップ
とからなる遺伝子解析方法。
【請求項２】
前記第１のステップにおける前記磁気ビーズ複合体は、前記相補なＤＮＡの末端が前記磁気ビーズに結合していることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項３】
前記磁気ビーズのサイズは前記流路の内径よりも小さいことを特徴とした請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項４】
前記第４のステップにおける磁気ビーズ複合体に与える熱の温度は、前記２本鎖の融解温度以上であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項５】
前記プローブＤＮＡは、前記標的ＤＮＡのＳＮＰ部位を含む塩基配列と相補な塩基配列を持つことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項６】
前記標識剤は、蛍光物質あるいは発光物質であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項１】
標識剤を修飾させた標的ＤＮＡと前記標的ＤＮＡと相補なＤＮＡとが２本鎖を形成して磁気ビーズに結合した磁気ビーズ複合体を形成させる第１のステップと、
前記磁気ビーズ複合体を密閉流路内に注入する第２のステップと、
前記密閉流路内にプローブＤＮＡを高分子化合物に結合させたコンジュゲート体を充填させさせながら外部磁界により前記磁気ビーズ複合体を前記密閉流路内の特定部に捕捉する第３のステップと、
前記捕捉された磁気ビーズ複合体から前記標的ＤＮＡを分離するための熱を与える第４のステップと、
前記分離した標的ＤＮＡを前記密閉流路内で電気泳動させる第５のステップ
とからなる遺伝子解析方法。
【請求項２】
前記第１のステップにおける前記磁気ビーズ複合体は、前記相補なＤＮＡの末端が前記磁気ビーズに結合していることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項３】
前記磁気ビーズのサイズは前記流路の内径よりも小さいことを特徴とした請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項４】
前記第４のステップにおける磁気ビーズ複合体に与える熱の温度は、前記２本鎖の融解温度以上であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項５】
前記プローブＤＮＡは、前記標的ＤＮＡのＳＮＰ部位を含む塩基配列と相補な塩基配列を持つことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【請求項６】
前記標識剤は、蛍光物質あるいは発光物質であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−６５８８０（Ｐ２００９−６５８８０Ａ）
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３６１６７（Ｐ２００７−２３６１６７）
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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