酢酸菌ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｕｓＩＦＯ３１９１が産生するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤
【課題】本発明は、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株が生産するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤を提供する。
【解決手段】酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤。
【解決手段】酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が生産するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖類は、植物、動物は勿論、多様な微生物によって菌体外へ産生或いは、菌体構成成分として分布している。微生物産生多糖類には、接着性、増粘性、乳化性、保湿性等の諸特性を示し、この特性を利用した増粘剤、食品基材、医療用素材等の用途などが知られる。
【０００３】
微生物産生多糖類は、多くの微生物により生産され、その構造、特製、機能は多岐に渡っている。ホモ多糖であるセルロースは増粘剤や生体適合性材料及び食品などの用途に使用されている。また、微生物が生産するヘテロ多糖は医薬品、化粧品及び食品原料としても利用されている。このように多くの微生物生産多糖類が、その抗腫瘍活性や、食品素材及び化学品素材としての活用が期待されている。
【０００４】
酢酸菌の産生する菌体外多糖類はセルロースに代表されるホモ多糖類のみでなく、ヘテロ多糖も生産することが報告されている。酢酸菌の生産するホモ多糖類については、ナタデココなどの食品或いはバイオセルロースとして高級スピーカー用振動版に利用されている。一方、酢酸菌の生産するヘテロ多糖については免疫賦活活性、抗腫瘍活性、アレルギー抑制効果等に関する医薬品（特許文献１及び特許文献２）、食品等への応用に関する報告が見られるが、化粧品原料、特に美白剤原料としての有用性に関する評価事例は報告されていない。従って、本発明では酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191の生産するヘテロ多糖の化粧品原料としての利用方法に関するものである。
【０００５】
メラニンは広く生物界に存在している色素の一つであり、紫外線による皮膚ダメージからの保護や活性酸素種の除去等の役割を持つ。メラニンが過剰に生産されることにより、皮膚のシミやソバカスなどが発生することは周知の事実である。従って、メラニンの過剰生産を抑制することにより皮膚のしみやそばかすなどの発生を抑えることが可能である。
【０００６】
メラニンの生合成は、アミノ酸の一種であるチロシンが酵素チロシナーゼにより酸化された後、非酵素的重合を含む数段階の過程を経て行われる。メラニンの生合成を抑制する物質は、美白剤の有効成分として利用されており、多数の天然物或いは合成化合物などから、美白効果を持つ有効成分が探索されている。メラニン生成の過程を抑制する物質はメラニン生合成の抑制効果を持つことが期待され、酵素チロシナーゼの阻害剤をはじめ、種々のメカニズムによりメラニン生合成を抑制する物質が、美白剤原料として利用されている。
【０００７】
種々の微生物由来の多糖類に保湿剤、美白剤としての機能に関する報告がなされている。これらの多糖類は、例えば乳酸菌が生産する多糖類として分子量９０万以上で、グルコース、ガラクトース、ラムノース等の単糖が糖鎖を構成しており、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が生産する多糖類とは構成単糖が異なっている（特許文献３）。また、アルカリゲネス等バクテリアの一部の菌種も多糖類を生産することが報告されており、海洋性細菌或いはアルカリゲネス・レータス等の細菌類の生産する多糖類に関して化粧品原料、特に美白剤原料としての利用に関する記述があるが、これらの多糖類は、１００万〜１５０万で、グルコース、ガラクトース、ラムノースなどの単糖が糖鎖を構成しており、本発明に示した酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が生産する多糖類とは構成単糖及び分子量が異なっている（特許文献４）。
【０００８】
本発明の酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するヘテロ多糖は、公知の化合物である（非特許文献１）。しかしながら、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191の生産するヘテロ多糖がメラニン生産抑制作用を有するという報告はこれまでなされていない。
【特許文献１】特開２００４−０５９５４７
【特許文献２】特開２００４−０５９５４９
【特許文献３】特許第２９７１０２７号公報
【特許文献４】特許第３８０２０１１号公報
【特許文献５】特開平８−４０８６８号公報
【非特許文献１】S. Moonmangmee, Y. Akakabe, Y. Sone, H. Toyama, O. Adachi and K. Matsushita: Structural comparison of pellicle polysaccharides from Acetobacter strains. 2001年3月の農芸化学会
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、美白剤原料として使用できる天然物を求めて、鋭意研究を進めていたところ、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するヘテロ多糖にメラニンの生合成を抑制する効果があることを見出した。従って、本発明は、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が生産するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１） 本発明は、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤に関する。
（２） 本発明は、ヘテロ多糖がラムノース、グルコースおよびキシロースからなる３つの糖を少なくとも含有する、請求項１に記載のメラニン生産抑制剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖は、細胞におけるメラニン合成を抑制する。さらに、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖は、細胞増殖に影響を与えない濃度域においても、メラニン産生を促進するαＭＳＨの添加効果を抑制できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に用いる、Acetobacter pasteurianuus IFO3191株は、酢酸菌に分類されるものであり、その定義は、進化的にアルファープロテオバクテリアに属し、植物（特に花、果実）を生息場所にする絶対好気性バクテリアで、糖やアルコールを不完全酸化する能力をもつことを生理的特徴とする一群（例えば、アルコールを酢酸まで酸化するがＣＯ2までの完全酸化をしない）であると定義される。
【００１３】
本発明に用いるAcetobacter pasteurianuus IFO3191株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（NBRC）より入手できる。
【００１４】
本発明に用いる、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するとは、本発明に用いるヘテロ多糖を酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が菌体内で合成することを意味するが、合成されたヘテロ多糖は菌体表面に存在していても、菌体外に存在していてもよい。
【００１５】
本発明に用いる、ヘテロ多糖とは、２種類以上の単糖からなる多糖を意味する。また、多糖とは、単糖がグリコシド結合によって重合した糖を意味する。そして、本発明に用いる、ヘテロ多糖には、糖以外にも脂質やたんぱく質や核酸などが含まれてもいてもよい。好ましいヘテロ多糖は、ラムノース、グルコースおよびキシロースの３つの糖を構成糖として少なくとも含む。特に好ましいヘテロ多糖は、ラムノース、グルコースおよびキシロースの３つの糖を構成糖として少なくとも含み、各構成単糖のモル比率が、１：１：１である。また、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ：Gel Permeation Chromatography））により測定されるヘテロ多糖の分子量が１０万〜１２万を示すものである。
【００１６】
本発明で用いる、ヘテロ多糖がラムノース、グルコースおよびキシロースからなる３つの糖を少なくとも含有するとは、ヘテロ多糖を酸加水分解により単糖にしたとき、ラムノース、グルコースおよびキシロースの３つの単糖がすくなくとも検出されるということを意味する。なお、ヘテロ多糖中における、これら３つの糖の結合形態は特に限定されない。
【００１７】
本発明に用いる、メラニン生産抑制剤とは、細胞、例えばメラニン形成細胞におけるメラニン合成を阻害する物質を意味する。ここで、メラニンとは、皮膚のメラニン形成細胞において形成される色素を意味する。ここで、細胞とは、哺乳動物細胞、好ましくはヒトの細胞を意味する。
【００１８】
また、本発明に用いる、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株が産生するヘテロ多糖は、以下の工程：
酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株を増やして回収する工程；
集めた前記酢酸菌を液体中で破砕して抽出する工程；
前記抽出液中から前記酢酸菌の破砕物、ＤＮＡ、タンパク質などを除去する工程；
場合により、さらに抽出液を濃縮および／または抽出液から沈殿物を得る工程；
を含む方法により調製されるものであってもよい。
【００１９】
酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株を増やすことは、例えば、前記酢酸菌を培養することでできる。前記酢酸菌を培養する方法は、前記酢酸菌を培養できれば限定されないが、例えばポテト培地などの液体培地中において、前記酢酸菌の最適温度、たとえば３０℃で震盪培養することでできる。前記酢酸菌の回収は、遠心分離やろ過などによりできるが、菌を集めることができる方法であれば限定されない。また、前記酢酸菌の破砕と抽出は、液体中での超音波処理、フレンチプレッシャーセルプレスなどでできるが、破砕方法は、前記酢酸菌を破砕できれば限定されない。また、破砕と抽出の時に用いる液体には、たとえば、水や水溶液などの水性液体を用いることができるが糖を溶解する液体であれば限定されない。抽出液中から前記酢酸菌の破砕物、ＤＮＡ、タンパク質を除去する方法は、たとえば、破砕物の除去には遠心分離やろ過、ＤＮＡやタンパク質の除去には、ＤＮＡ分解酵素処理やタンパク質分解酵素処理および陰イオン交換法による処理などによりできるが、抽出液中から前記酢酸菌の破砕物、ＤＮＡ、タンパク質を除去できる方法であれば限定されない。抽出液を濃縮することは、抽出液を濃縮できる方法であれば限定されないが、例えば限外ろ過法や凍結乾燥法またはロータリーエバポレーターなど用いた方法で濃縮できる。抽出液から沈殿物を得ることは、抽出液にアルコール、例えばイソプロパノールを加えることにより沈殿を得ることができる。
【００２０】
以下、本発明の実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
酢酸菌多糖類の単離精製
酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株を定常期（Ｋｌｅｔｔ ｕｎｉｔ ３００）に達するまで、ポテト培地（０．５％グルコース、２．０％グリセロール、１．０％ポリペプトン、ポテト抽出物２００ｍｌを加えて最終容量を1Lとする。）を用いて３Lエーレンマイヤーフラスコ中で３０℃、２００ｒｐｍで震盪培養した。なお、ポテト抽出物は、皮を取り棒状に細切した約２００ｇのジャガイモに、１Ｌの蒸留水を加え、煮沸するまで加熱し、更に３０分ほど煮沸後、ガーゼでろ過したものをポテト抽出物として調製した。続いて、４℃、９０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理にて菌体７〜８ｇ湿重量を回収した。
【００２２】
菌体７〜８ｇ湿重量を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）５０ｍｌで２回洗浄した後、同緩衝液７０〜８０ｍｌに菌体を懸濁した。５０ｍｌずつプラスチックチューブに分注して、超音波処理（トミーＵＤ２０１ 出力５）を２０分間実施した後、菌体の破砕物を９０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により除去した。得られた上清に５０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ（シグマ；上清１００ｍｌに対して５ｍｇ）を加えて、３７℃にて一昼夜反応させて、更にプロテインナーゼＫ（濃度１００μｇ／ｍｌ）（シグマ；上清１００ｍｌに対して１０ｍｇ）を加え、３７℃にて一昼夜反応させた。その後、その溶液を透析チューブ（分子量１２０００−１４０００カット）に入れ、１Ｌの０．１％ ＳＤＳを含む２５ｍＭ Trisバッファー（ｐＨ８．５）に対して１日透析をした。透析後、９０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により沈殿物を除去した後、上清をＤＥＡＥ−セルロースカラム（ワットマン；１００mL）に添加後、０．１％ ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）３００ｍｌによる溶出を実施して、素通り画分（２００ｍｌ）を集めて、フェノール硫酸法により発色がＯＤ０．１以上の多糖類溶出画分（１００ｍｌ）を分取精製した。精製試料（３０micromol/mL）１容量に対して、２容量のイソプロパノールを加え、沈殿を取得し、乾燥させたものを水におよそ１０ｍｇ／ｍｌで懸濁し、精製多糖類画分とした。
【００２３】
フェノール硫酸法は以下に示す操作にて実施した。試験管に試料５００μｌを取り、フェノール試薬（５％Ｗ／Ｖフェノール溶液）を等量加えて十分攪拌する。次に濃硫酸２．５ｍｌを加えてすばやく攪拌する。室温にて２０分以上放置した後、４９０ｎｍの吸収を分光光度計にて測定する。
【実施例２】
【００２４】
酢酸菌多糖類の構成糖分析
ＴＬＣ分析
精製多糖を最終濃度２Ｎのトリフルオロ酢酸を加え１２１℃、１時間で加水分解の後、ＴＬＣ分析に供した。展開溶媒はｎ−プロパノール／水 ８５／１５（Ｖ／Ｖ）を用いて、アニリン−ジフェニルアミン−リン酸試薬（アニリン４ｍｌ，ジフェニルアミン４ｇ，アセトン２００ｍｌ及び８５％リン酸２０ｍｌを混合）を用いて発色した。標準単糖との比較から構成単糖を同定した（図１）。その結果、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖はラムノース、キシロースおよびグルコースを構成糖とすることを確認した。
【００２５】
ＧＣＭＳ分析
精製多糖は、ガスクロマトグラフィー質量分析装置にて分析した。精製多糖を、最終濃度２Ｎのトリフルオロ酢酸による１２１℃、１時間の加水分解の後、重水素化ホウ素ナトリウムにより還元し、無水酢酸／ピリジンによりアセチル化した。反応終了後、トルエンを加えて減圧乾固して、更にジクロロメタンで抽出した後、アルジトールアセテート誘導体をＧＣＭＳ（島津ＧＣＭＳ ＱＰ５０５０Ａ）で分析した。分析はＤＢ−ＷＡＸキャピラリーカラム（０．２５ｍｍ×６０ｍ）を用いて、１９０℃、４分間、２２０℃まで１℃／ｍｉｎの昇温後、２０分間保持のタイムプログラムにて実施した。分析は試料１μｇを用いて実施した。
また、あらかじめ作成しておいた検量線と各構成糖のピーク面積から求めた構成糖のモル比から、各構成糖のモル比はラムノース：キシロース：グルコース＝１：１：１であった。
【００２６】
精製多糖を上記のように酸加水分解（alditol acetate誘導体化）して、標準のラムノース、リキソース、キシロース、グルコースおよびガラクトースを同様に処理してＧＣＭＳ分析に供した。標準単糖の溶出時間との比較から、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖はラムノース、キシロースおよびグルコースを構成糖とすることを確認した。ＧＣＭＳチャートを図２に示す。
【実施例３】
【００２７】
分子量の計測
実施例１に準じて、精製した酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生する精製ヘテロ多糖の最終標品を用いて分子量の算定を実施した。精製多糖の平均分子量算定は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００（アマシャムバイオサイエンス１．６ｃｍ×９０ｃｍ）サイズ排除カラムクロマトグラフィーにより実施した。溶出は０．１％ＳＤＳを含有する０．１ＭＮａＣｌを６０ｍｌ／時間の割合で実施した。糖含量はフェノール硫酸法による４９０ｎｍ比色定量により実施した。標準分子量曲線は、プルラン（昭和電工製）Ｐ２００（１８６ｋＤａ）、Ｐ１００（１００ｋＤａ）、Ｐ５０（５０ｋＤａ）及びＰ２０（２０ｋＤａ）を用いて作成した。分子量標準の溶出容量との比較から、IFO3191株多糖はそその分子量がおよそ１００-１２０kDaと算出された（図３）。
【実施例４】
【００２８】
メラニン生産抑制試験
実施例１に示した精製法により取得した精製酢酸菌ヘテロ多糖画分１５０ｍｇ／ｍｌを使用して、メラニン産生抑制効果を調べた。すなわち、プラスチック培養シャーレ（直径６０ｍｍ、ＦＡＬＣＯＮ ３５１００７）に１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、インビトロジェン社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＳＩＧＭＡ社製）と共に１×１０5のマウスメラノーマＢ１６細胞（理化学研究所細胞バンクＲＣＢ０５５７株）を播種して、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件下で一日インキュベートした。一日後、所定の濃度となるように調整した酢酸菌ヘテロ多糖を加えた１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）と培地交換を実施した。酢酸菌ヘテロ多糖は乾燥物を１５０ｍｇ／ｍｌ濃度として蒸留水に溶解したものをあらかじめ、０．２μｍのセルロースアセテートフィルターによるろ過滅菌を実施して、使用時まで−２０℃にて凍結保存したものを使用時に解凍して使用した。
【００２９】
酢酸菌ヘテロ多糖を含む培地に交換後、更に、プラスチック培養シャーレを３７℃、５％ＣＯ2の培養条件下で３日間培養した。一方、酢酸菌ヘテロ多糖と同量の滅菌蒸留水を添加した培地で培養したプラスチック培養シャーレをコントロールとした。培地交換３日後、各濃度の多糖類を添加したプラスチック培養シャーレ中のマウスメラノーマＢ１６細胞を０．２５％トリプシン（コスモバイオ社製 トリプシン液）処理により回収して、メラニン産生抑制効果の検討に用いた。マウスメラノーマＢ１６細胞を遠心分離（６６００ｒｐｍ×１ｍｉｎ）により回収して、ＰＢＳにて一回洗浄した後細胞を写真撮影した。メラニン生産抑制効果の評価は、酢酸菌ヘテロ多糖で処理したマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度と酢酸菌ヘテロ多糖で処理していないコントロールのマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度とを目視にて比較して判定した。
【００３０】
５００μｇ／ｍｌ酢酸菌ヘテロ多糖で処理したマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度は、コントロールのマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度と比較してやや白色化が認められた。１０００μｇ／ｍｌ酢酸菌ヘテロ多糖で処理したマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度は、コントロールのマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度と比較して白色化が中程度であった。１５００μｇ／ｍｌ酢酸菌ヘテロ多糖で処理したマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度は、コントロールのマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度と比較して白色化が大きかった（図４）。
【実施例５】
【００３１】
αＭＳＨによるメラニン生産亢進の抑制試験
αＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン、株式会社ペプチド研究所 αＭＳＨ）は通常紫外線を浴びたその皮膚で産生されるホルモンであり、メラノサイトに作用すると、特異的受容体を介した一連の反応により、チロシナーゼを活性化してメラニン産生が促進される。
【００３２】
実施例１に示した精製法により取得した精製酢酸菌ヘテロ多糖を使用して、αＭＳＨ（α-Melanocyte Stimulating Hormone）メラノサイト刺激ホルモンによるメラニン生産亢進の抑制効果を調べた。すなわち、プラスチック培養シャーレ（直径６０ｍｍ）に１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）と共に１×１０5のマウスメラノーマＢ１６細胞を播種して、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件下で一日インキュベートした。一日後、所定濃度となるように調整した酢酸菌ヘテロ多糖及びαＭＳＨを最終濃度２００μＭとなるように添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）と培地交換を実施した。一方、酢酸菌ヘテロ多糖と同量の滅菌蒸留水を添加した培地で培養したプラスチック培養シャーレをコントロールとした。各濃度の多糖類を添加したプラスチック培養シャーレ中のマウスメラノーマＢ１６細胞を０．２５％トリプシン処理により回収して、メラニン産生抑制効果の検討に用いた。マウスメラノーマＢ１６細胞を遠心分離により回収して、ＰＢＳにて一回洗浄した後細胞を写真撮影した。
【００３３】
更に、回収した細胞ペレットを１Ｎ ＮａＯＨ/１０％ＤＭＳＯ溶液（１５０μｌ）で溶解した後、細胞溶解液（１００μｌ）をマイクロプレート（ＮＵＮＣ社製４３０４３１）に移し、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（バイオテック社製、ＥＸ８００）で測定してメラニン生産量の定量を実施した。メラニンの定量は４９０ｎｍにおける吸光度をメラニン量の指標としてデータはコントロール細胞と比較して％換算した。
【００３４】
また、マウスメラノーマＢ１６細胞の増殖に対するαＭＳＨと酢酸菌ヘテロ多糖の影響を評価するために、０．２５％トリプシン処理により回収した細胞についてコールターカウンター（ベックマンコールター社、Ｚ１）による細胞数計測を実施した。コールターカウンターによる細胞数の測定は、所定容量に調整した細胞浮遊液の一部を回収して、１０ｍｌのコールターカウンター用希釈液（ベックマンコールター社 アイソトインＩＩ）に加え、十分に混合した後実施した。細胞浮遊液の添加量は、適当な希釈倍率となるように任意に設定した。
【００３５】
図５は、αＭＳＨ単独時のメラニン生産量または細胞数を１００としたときの相対として表している。αＭＳＨ単独で処理した場合（図５中の＋αＭＳＨ）、未処理（図５中のー）と比較して、メラニン生産量の増加（図５中の＋αＭＳＨのメラニン生産量は１００であるのに対して−のメラニン生産量は約４０である）がみとめられる。αＭＳＨに１００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖を添加した場合、メラニン生産量の増加が抑制された（図５中の１００μｇ／ｍｌのメラニン生産量は約８０である）。αＭＳＨに５００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖を添加した場合、メラニン生産量の増加がより抑制された（図５中の５００μｇ／ｍｌのメラニン生産量は約６０である）。
【００３６】
これによりマウスＢ１６メラノーマ細胞に対して、αＭＳＨを作用させて、メラニン産生を促進する際に、同時に１００μｇ／ｍｌ以上の濃度で酢酸菌ヘテロ多糖を添加すると、メラニン増加が抑制されることが確認された。
【００３７】
一方、細胞数については、αＭＳＨ単独で処理した場合（図５中の＋αＭＳＨ）、未処理（図５中の−）と比較して、細胞数の増加はわずか（図５中の＋αＭＳＨの細胞数は１００であるのに対して−の細胞数は約９５である）である。αＭＳＨに１００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖を添加した場合、細胞数のわずかな増加が認められた（図５中の１００μｇ／ｍｌの細胞数は１０５である）。αＭＳＨに５００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖を添加した場合、細胞数の増加は抑制された（図５中の５００μｇ／ｍｌの細胞数は約８０である）。
【００３８】
これより、酢酸菌ヘテロ多糖は、細胞の増殖に影響することなく、αＭＳＨ作用によるメラニン生産を抑制できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の酢酸菌が生産するメラニン生産抑制作用を有する多糖類は、化粧品原料、特に美白用化粧品原料として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】精製多糖を酸加水分解した後、ＴＬＣにて分析に供した。精製多糖類のＴＬＣ分析を図１に示す。標準の糖との比較から、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖はラムノース、キシロースおよびグルコースを構成糖とすることを確認した。展開溶媒：ｎ−プロパノール：H2O = 85:15 (V/V)；発色法：アニリン−ジフェニルアミン-リン酸 試薬（4 mL of aniline, 4 g of diphenylamine, 200 mL of acetone, and 20 mL of 85％ phosphoric acid）；グルコース標準品（和光純薬 特級）（レーン１）、ラムノース標準品（和光純薬 特級）（レーン２）、キシロース標準品（和光純薬 特級）（レーン３）、精製多糖類加水分解物（レーン４および５）、ガラクトース標準品（和光純薬 特級）（レーン６）、リキソース標準品（和光純薬 特級）（レーン７）、アラビノース標準品（和光純薬 特級）（レーン８）
【図２】精製多糖を酸加水分解（alditol acetate誘導体化）してＧＣＭＳ分析に供した、精製多糖類のＧＣＭＳチャートを図２に示す。また、標準のラムノース、リキソース、キシロース、グルコースおよびガラクトースを同様に処理してＧＣＭＳ分析に供した、標準単糖のＧＣＭＳチャートを図２に示す。標準単糖の溶出時間との比較から、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖はラムノース、キシロースおよびグルコースを構成糖とすることを確認した。上チャートは精製多糖を酸加水分解（alditol acetate誘導体化）して分析したもの。下チャートは標準のラムノース、リキソース、キシロース、グルコースおよびガラクトースを同様に処理して分析したもの。
【図３】IFO3191多糖類Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００による分子量算定。分析条件：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００（アマシャムバイオサイエンス１．６ｃｍ×９０ｃｍ）、溶出液（移動相）は０．１％ＳＤＳを含有０．１ＭＮａＣｌ、流量６０ｍｌ／時間。糖含量はフェノール硫酸法による４９０ｎｍ比色定量により実施。標準分子量曲線は、プルラン（昭和電工製）Ｐ２００（１８６ｋＤａ）、Ｐ１００（１００ｋＤａ）、Ｐ５０（５０ｋＤａ）及びＰ２０（２０ｋＤａ）を用いて作成。
【図４】酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖のメラニン産生抑制効果。500、1000、1500μｇ／ｍｌは、培地中の酢酸菌ヘテロ多糖の終濃度をあらわす。コントロールは、酢酸菌ヘテロ多糖と同量の滅菌蒸留水を添加した培地を表す。−、±、＋、＋＋は、目視による白色化の判定基準を示す。−：白色化しない、±：やや白色化する、＋：白色化が中程度、＋＋：白色化が大きい
【図５】酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖のαＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）によるメラニン産生亢進効果の抑制効果。＋αＭＳＨはαＭＳＨ（最終濃度２００μＭ）単独処理を表す。−は、αＭＳＨとヘテロ多糖の両方ともないことを表す。１００μｇ／ｍｌは、１００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖とαＭＳＨ（最終濃度２００μＭ）の両方で処理したことを表す。５００μg/m＋αＭＳＨは、５００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖とαＭＳＨ（最終濃度２００μＭ）の両方で処理したことを表す。メラニン生産量と細胞数は、αＭＳＨ（最終濃度２００μＭ）単独処理時を１００としたときの相対数として表している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が生産するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖類は、植物、動物は勿論、多様な微生物によって菌体外へ産生或いは、菌体構成成分として分布している。微生物産生多糖類には、接着性、増粘性、乳化性、保湿性等の諸特性を示し、この特性を利用した増粘剤、食品基材、医療用素材等の用途などが知られる。
【０００３】
微生物産生多糖類は、多くの微生物により生産され、その構造、特製、機能は多岐に渡っている。ホモ多糖であるセルロースは増粘剤や生体適合性材料及び食品などの用途に使用されている。また、微生物が生産するヘテロ多糖は医薬品、化粧品及び食品原料としても利用されている。このように多くの微生物生産多糖類が、その抗腫瘍活性や、食品素材及び化学品素材としての活用が期待されている。
【０００４】
酢酸菌の産生する菌体外多糖類はセルロースに代表されるホモ多糖類のみでなく、ヘテロ多糖も生産することが報告されている。酢酸菌の生産するホモ多糖類については、ナタデココなどの食品或いはバイオセルロースとして高級スピーカー用振動版に利用されている。一方、酢酸菌の生産するヘテロ多糖については免疫賦活活性、抗腫瘍活性、アレルギー抑制効果等に関する医薬品（特許文献１及び特許文献２）、食品等への応用に関する報告が見られるが、化粧品原料、特に美白剤原料としての有用性に関する評価事例は報告されていない。従って、本発明では酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191の生産するヘテロ多糖の化粧品原料としての利用方法に関するものである。
【０００５】
メラニンは広く生物界に存在している色素の一つであり、紫外線による皮膚ダメージからの保護や活性酸素種の除去等の役割を持つ。メラニンが過剰に生産されることにより、皮膚のシミやソバカスなどが発生することは周知の事実である。従って、メラニンの過剰生産を抑制することにより皮膚のしみやそばかすなどの発生を抑えることが可能である。
【０００６】
メラニンの生合成は、アミノ酸の一種であるチロシンが酵素チロシナーゼにより酸化された後、非酵素的重合を含む数段階の過程を経て行われる。メラニンの生合成を抑制する物質は、美白剤の有効成分として利用されており、多数の天然物或いは合成化合物などから、美白効果を持つ有効成分が探索されている。メラニン生成の過程を抑制する物質はメラニン生合成の抑制効果を持つことが期待され、酵素チロシナーゼの阻害剤をはじめ、種々のメカニズムによりメラニン生合成を抑制する物質が、美白剤原料として利用されている。
【０００７】
種々の微生物由来の多糖類に保湿剤、美白剤としての機能に関する報告がなされている。これらの多糖類は、例えば乳酸菌が生産する多糖類として分子量９０万以上で、グルコース、ガラクトース、ラムノース等の単糖が糖鎖を構成しており、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が生産する多糖類とは構成単糖が異なっている（特許文献３）。また、アルカリゲネス等バクテリアの一部の菌種も多糖類を生産することが報告されており、海洋性細菌或いはアルカリゲネス・レータス等の細菌類の生産する多糖類に関して化粧品原料、特に美白剤原料としての利用に関する記述があるが、これらの多糖類は、１００万〜１５０万で、グルコース、ガラクトース、ラムノースなどの単糖が糖鎖を構成しており、本発明に示した酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が生産する多糖類とは構成単糖及び分子量が異なっている（特許文献４）。
【０００８】
本発明の酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するヘテロ多糖は、公知の化合物である（非特許文献１）。しかしながら、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191の生産するヘテロ多糖がメラニン生産抑制作用を有するという報告はこれまでなされていない。
【特許文献１】特開２００４−０５９５４７
【特許文献２】特開２００４−０５９５４９
【特許文献３】特許第２９７１０２７号公報
【特許文献４】特許第３８０２０１１号公報
【特許文献５】特開平８−４０８６８号公報
【非特許文献１】S. Moonmangmee, Y. Akakabe, Y. Sone, H. Toyama, O. Adachi and K. Matsushita: Structural comparison of pellicle polysaccharides from Acetobacter strains. 2001年3月の農芸化学会
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、美白剤原料として使用できる天然物を求めて、鋭意研究を進めていたところ、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するヘテロ多糖にメラニンの生合成を抑制する効果があることを見出した。従って、本発明は、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が生産するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１） 本発明は、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤に関する。
（２） 本発明は、ヘテロ多糖がラムノース、グルコースおよびキシロースからなる３つの糖を少なくとも含有する、請求項１に記載のメラニン生産抑制剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖は、細胞におけるメラニン合成を抑制する。さらに、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖は、細胞増殖に影響を与えない濃度域においても、メラニン産生を促進するαＭＳＨの添加効果を抑制できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に用いる、Acetobacter pasteurianuus IFO3191株は、酢酸菌に分類されるものであり、その定義は、進化的にアルファープロテオバクテリアに属し、植物（特に花、果実）を生息場所にする絶対好気性バクテリアで、糖やアルコールを不完全酸化する能力をもつことを生理的特徴とする一群（例えば、アルコールを酢酸まで酸化するがＣＯ2までの完全酸化をしない）であると定義される。
【００１３】
本発明に用いるAcetobacter pasteurianuus IFO3191株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（NBRC）より入手できる。
【００１４】
本発明に用いる、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するとは、本発明に用いるヘテロ多糖を酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が菌体内で合成することを意味するが、合成されたヘテロ多糖は菌体表面に存在していても、菌体外に存在していてもよい。
【００１５】
本発明に用いる、ヘテロ多糖とは、２種類以上の単糖からなる多糖を意味する。また、多糖とは、単糖がグリコシド結合によって重合した糖を意味する。そして、本発明に用いる、ヘテロ多糖には、糖以外にも脂質やたんぱく質や核酸などが含まれてもいてもよい。好ましいヘテロ多糖は、ラムノース、グルコースおよびキシロースの３つの糖を構成糖として少なくとも含む。特に好ましいヘテロ多糖は、ラムノース、グルコースおよびキシロースの３つの糖を構成糖として少なくとも含み、各構成単糖のモル比率が、１：１：１である。また、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ：Gel Permeation Chromatography））により測定されるヘテロ多糖の分子量が１０万〜１２万を示すものである。
【００１６】
本発明で用いる、ヘテロ多糖がラムノース、グルコースおよびキシロースからなる３つの糖を少なくとも含有するとは、ヘテロ多糖を酸加水分解により単糖にしたとき、ラムノース、グルコースおよびキシロースの３つの単糖がすくなくとも検出されるということを意味する。なお、ヘテロ多糖中における、これら３つの糖の結合形態は特に限定されない。
【００１７】
本発明に用いる、メラニン生産抑制剤とは、細胞、例えばメラニン形成細胞におけるメラニン合成を阻害する物質を意味する。ここで、メラニンとは、皮膚のメラニン形成細胞において形成される色素を意味する。ここで、細胞とは、哺乳動物細胞、好ましくはヒトの細胞を意味する。
【００１８】
また、本発明に用いる、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株が産生するヘテロ多糖は、以下の工程：
酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株を増やして回収する工程；
集めた前記酢酸菌を液体中で破砕して抽出する工程；
前記抽出液中から前記酢酸菌の破砕物、ＤＮＡ、タンパク質などを除去する工程；
場合により、さらに抽出液を濃縮および／または抽出液から沈殿物を得る工程；
を含む方法により調製されるものであってもよい。
【００１９】
酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株を増やすことは、例えば、前記酢酸菌を培養することでできる。前記酢酸菌を培養する方法は、前記酢酸菌を培養できれば限定されないが、例えばポテト培地などの液体培地中において、前記酢酸菌の最適温度、たとえば３０℃で震盪培養することでできる。前記酢酸菌の回収は、遠心分離やろ過などによりできるが、菌を集めることができる方法であれば限定されない。また、前記酢酸菌の破砕と抽出は、液体中での超音波処理、フレンチプレッシャーセルプレスなどでできるが、破砕方法は、前記酢酸菌を破砕できれば限定されない。また、破砕と抽出の時に用いる液体には、たとえば、水や水溶液などの水性液体を用いることができるが糖を溶解する液体であれば限定されない。抽出液中から前記酢酸菌の破砕物、ＤＮＡ、タンパク質を除去する方法は、たとえば、破砕物の除去には遠心分離やろ過、ＤＮＡやタンパク質の除去には、ＤＮＡ分解酵素処理やタンパク質分解酵素処理および陰イオン交換法による処理などによりできるが、抽出液中から前記酢酸菌の破砕物、ＤＮＡ、タンパク質を除去できる方法であれば限定されない。抽出液を濃縮することは、抽出液を濃縮できる方法であれば限定されないが、例えば限外ろ過法や凍結乾燥法またはロータリーエバポレーターなど用いた方法で濃縮できる。抽出液から沈殿物を得ることは、抽出液にアルコール、例えばイソプロパノールを加えることにより沈殿を得ることができる。
【００２０】
以下、本発明の実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
酢酸菌多糖類の単離精製
酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株を定常期（Ｋｌｅｔｔ ｕｎｉｔ ３００）に達するまで、ポテト培地（０．５％グルコース、２．０％グリセロール、１．０％ポリペプトン、ポテト抽出物２００ｍｌを加えて最終容量を1Lとする。）を用いて３Lエーレンマイヤーフラスコ中で３０℃、２００ｒｐｍで震盪培養した。なお、ポテト抽出物は、皮を取り棒状に細切した約２００ｇのジャガイモに、１Ｌの蒸留水を加え、煮沸するまで加熱し、更に３０分ほど煮沸後、ガーゼでろ過したものをポテト抽出物として調製した。続いて、４℃、９０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理にて菌体７〜８ｇ湿重量を回収した。
【００２２】
菌体７〜８ｇ湿重量を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）５０ｍｌで２回洗浄した後、同緩衝液７０〜８０ｍｌに菌体を懸濁した。５０ｍｌずつプラスチックチューブに分注して、超音波処理（トミーＵＤ２０１ 出力５）を２０分間実施した後、菌体の破砕物を９０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により除去した。得られた上清に５０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ（シグマ；上清１００ｍｌに対して５ｍｇ）を加えて、３７℃にて一昼夜反応させて、更にプロテインナーゼＫ（濃度１００μｇ／ｍｌ）（シグマ；上清１００ｍｌに対して１０ｍｇ）を加え、３７℃にて一昼夜反応させた。その後、その溶液を透析チューブ（分子量１２０００−１４０００カット）に入れ、１Ｌの０．１％ ＳＤＳを含む２５ｍＭ Trisバッファー（ｐＨ８．５）に対して１日透析をした。透析後、９０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により沈殿物を除去した後、上清をＤＥＡＥ−セルロースカラム（ワットマン；１００mL）に添加後、０．１％ ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）３００ｍｌによる溶出を実施して、素通り画分（２００ｍｌ）を集めて、フェノール硫酸法により発色がＯＤ０．１以上の多糖類溶出画分（１００ｍｌ）を分取精製した。精製試料（３０micromol/mL）１容量に対して、２容量のイソプロパノールを加え、沈殿を取得し、乾燥させたものを水におよそ１０ｍｇ／ｍｌで懸濁し、精製多糖類画分とした。
【００２３】
フェノール硫酸法は以下に示す操作にて実施した。試験管に試料５００μｌを取り、フェノール試薬（５％Ｗ／Ｖフェノール溶液）を等量加えて十分攪拌する。次に濃硫酸２．５ｍｌを加えてすばやく攪拌する。室温にて２０分以上放置した後、４９０ｎｍの吸収を分光光度計にて測定する。
【実施例２】
【００２４】
酢酸菌多糖類の構成糖分析
ＴＬＣ分析
精製多糖を最終濃度２Ｎのトリフルオロ酢酸を加え１２１℃、１時間で加水分解の後、ＴＬＣ分析に供した。展開溶媒はｎ−プロパノール／水 ８５／１５（Ｖ／Ｖ）を用いて、アニリン−ジフェニルアミン−リン酸試薬（アニリン４ｍｌ，ジフェニルアミン４ｇ，アセトン２００ｍｌ及び８５％リン酸２０ｍｌを混合）を用いて発色した。標準単糖との比較から構成単糖を同定した（図１）。その結果、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖はラムノース、キシロースおよびグルコースを構成糖とすることを確認した。
【００２５】
ＧＣＭＳ分析
精製多糖は、ガスクロマトグラフィー質量分析装置にて分析した。精製多糖を、最終濃度２Ｎのトリフルオロ酢酸による１２１℃、１時間の加水分解の後、重水素化ホウ素ナトリウムにより還元し、無水酢酸／ピリジンによりアセチル化した。反応終了後、トルエンを加えて減圧乾固して、更にジクロロメタンで抽出した後、アルジトールアセテート誘導体をＧＣＭＳ（島津ＧＣＭＳ ＱＰ５０５０Ａ）で分析した。分析はＤＢ−ＷＡＸキャピラリーカラム（０．２５ｍｍ×６０ｍ）を用いて、１９０℃、４分間、２２０℃まで１℃／ｍｉｎの昇温後、２０分間保持のタイムプログラムにて実施した。分析は試料１μｇを用いて実施した。
また、あらかじめ作成しておいた検量線と各構成糖のピーク面積から求めた構成糖のモル比から、各構成糖のモル比はラムノース：キシロース：グルコース＝１：１：１であった。
【００２６】
精製多糖を上記のように酸加水分解（alditol acetate誘導体化）して、標準のラムノース、リキソース、キシロース、グルコースおよびガラクトースを同様に処理してＧＣＭＳ分析に供した。標準単糖の溶出時間との比較から、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖はラムノース、キシロースおよびグルコースを構成糖とすることを確認した。ＧＣＭＳチャートを図２に示す。
【実施例３】
【００２７】
分子量の計測
実施例１に準じて、精製した酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生する精製ヘテロ多糖の最終標品を用いて分子量の算定を実施した。精製多糖の平均分子量算定は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００（アマシャムバイオサイエンス１．６ｃｍ×９０ｃｍ）サイズ排除カラムクロマトグラフィーにより実施した。溶出は０．１％ＳＤＳを含有する０．１ＭＮａＣｌを６０ｍｌ／時間の割合で実施した。糖含量はフェノール硫酸法による４９０ｎｍ比色定量により実施した。標準分子量曲線は、プルラン（昭和電工製）Ｐ２００（１８６ｋＤａ）、Ｐ１００（１００ｋＤａ）、Ｐ５０（５０ｋＤａ）及びＰ２０（２０ｋＤａ）を用いて作成した。分子量標準の溶出容量との比較から、IFO3191株多糖はそその分子量がおよそ１００-１２０kDaと算出された（図３）。
【実施例４】
【００２８】
メラニン生産抑制試験
実施例１に示した精製法により取得した精製酢酸菌ヘテロ多糖画分１５０ｍｇ／ｍｌを使用して、メラニン産生抑制効果を調べた。すなわち、プラスチック培養シャーレ（直径６０ｍｍ、ＦＡＬＣＯＮ ３５１００７）に１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、インビトロジェン社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＳＩＧＭＡ社製）と共に１×１０5のマウスメラノーマＢ１６細胞（理化学研究所細胞バンクＲＣＢ０５５７株）を播種して、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件下で一日インキュベートした。一日後、所定の濃度となるように調整した酢酸菌ヘテロ多糖を加えた１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）と培地交換を実施した。酢酸菌ヘテロ多糖は乾燥物を１５０ｍｇ／ｍｌ濃度として蒸留水に溶解したものをあらかじめ、０．２μｍのセルロースアセテートフィルターによるろ過滅菌を実施して、使用時まで−２０℃にて凍結保存したものを使用時に解凍して使用した。
【００２９】
酢酸菌ヘテロ多糖を含む培地に交換後、更に、プラスチック培養シャーレを３７℃、５％ＣＯ2の培養条件下で３日間培養した。一方、酢酸菌ヘテロ多糖と同量の滅菌蒸留水を添加した培地で培養したプラスチック培養シャーレをコントロールとした。培地交換３日後、各濃度の多糖類を添加したプラスチック培養シャーレ中のマウスメラノーマＢ１６細胞を０．２５％トリプシン（コスモバイオ社製 トリプシン液）処理により回収して、メラニン産生抑制効果の検討に用いた。マウスメラノーマＢ１６細胞を遠心分離（６６００ｒｐｍ×１ｍｉｎ）により回収して、ＰＢＳにて一回洗浄した後細胞を写真撮影した。メラニン生産抑制効果の評価は、酢酸菌ヘテロ多糖で処理したマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度と酢酸菌ヘテロ多糖で処理していないコントロールのマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度とを目視にて比較して判定した。
【００３０】
５００μｇ／ｍｌ酢酸菌ヘテロ多糖で処理したマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度は、コントロールのマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度と比較してやや白色化が認められた。１０００μｇ／ｍｌ酢酸菌ヘテロ多糖で処理したマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度は、コントロールのマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度と比較して白色化が中程度であった。１５００μｇ／ｍｌ酢酸菌ヘテロ多糖で処理したマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度は、コントロールのマウスメラノーマＢ１６細胞の白色度と比較して白色化が大きかった（図４）。
【実施例５】
【００３１】
αＭＳＨによるメラニン生産亢進の抑制試験
αＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン、株式会社ペプチド研究所 αＭＳＨ）は通常紫外線を浴びたその皮膚で産生されるホルモンであり、メラノサイトに作用すると、特異的受容体を介した一連の反応により、チロシナーゼを活性化してメラニン産生が促進される。
【００３２】
実施例１に示した精製法により取得した精製酢酸菌ヘテロ多糖を使用して、αＭＳＨ（α-Melanocyte Stimulating Hormone）メラノサイト刺激ホルモンによるメラニン生産亢進の抑制効果を調べた。すなわち、プラスチック培養シャーレ（直径６０ｍｍ）に１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）と共に１×１０5のマウスメラノーマＢ１６細胞を播種して、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件下で一日インキュベートした。一日後、所定濃度となるように調整した酢酸菌ヘテロ多糖及びαＭＳＨを最終濃度２００μＭとなるように添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）と培地交換を実施した。一方、酢酸菌ヘテロ多糖と同量の滅菌蒸留水を添加した培地で培養したプラスチック培養シャーレをコントロールとした。各濃度の多糖類を添加したプラスチック培養シャーレ中のマウスメラノーマＢ１６細胞を０．２５％トリプシン処理により回収して、メラニン産生抑制効果の検討に用いた。マウスメラノーマＢ１６細胞を遠心分離により回収して、ＰＢＳにて一回洗浄した後細胞を写真撮影した。
【００３３】
更に、回収した細胞ペレットを１Ｎ ＮａＯＨ/１０％ＤＭＳＯ溶液（１５０μｌ）で溶解した後、細胞溶解液（１００μｌ）をマイクロプレート（ＮＵＮＣ社製４３０４３１）に移し、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（バイオテック社製、ＥＸ８００）で測定してメラニン生産量の定量を実施した。メラニンの定量は４９０ｎｍにおける吸光度をメラニン量の指標としてデータはコントロール細胞と比較して％換算した。
【００３４】
また、マウスメラノーマＢ１６細胞の増殖に対するαＭＳＨと酢酸菌ヘテロ多糖の影響を評価するために、０．２５％トリプシン処理により回収した細胞についてコールターカウンター（ベックマンコールター社、Ｚ１）による細胞数計測を実施した。コールターカウンターによる細胞数の測定は、所定容量に調整した細胞浮遊液の一部を回収して、１０ｍｌのコールターカウンター用希釈液（ベックマンコールター社 アイソトインＩＩ）に加え、十分に混合した後実施した。細胞浮遊液の添加量は、適当な希釈倍率となるように任意に設定した。
【００３５】
図５は、αＭＳＨ単独時のメラニン生産量または細胞数を１００としたときの相対として表している。αＭＳＨ単独で処理した場合（図５中の＋αＭＳＨ）、未処理（図５中のー）と比較して、メラニン生産量の増加（図５中の＋αＭＳＨのメラニン生産量は１００であるのに対して−のメラニン生産量は約４０である）がみとめられる。αＭＳＨに１００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖を添加した場合、メラニン生産量の増加が抑制された（図５中の１００μｇ／ｍｌのメラニン生産量は約８０である）。αＭＳＨに５００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖を添加した場合、メラニン生産量の増加がより抑制された（図５中の５００μｇ／ｍｌのメラニン生産量は約６０である）。
【００３６】
これによりマウスＢ１６メラノーマ細胞に対して、αＭＳＨを作用させて、メラニン産生を促進する際に、同時に１００μｇ／ｍｌ以上の濃度で酢酸菌ヘテロ多糖を添加すると、メラニン増加が抑制されることが確認された。
【００３７】
一方、細胞数については、αＭＳＨ単独で処理した場合（図５中の＋αＭＳＨ）、未処理（図５中の−）と比較して、細胞数の増加はわずか（図５中の＋αＭＳＨの細胞数は１００であるのに対して−の細胞数は約９５である）である。αＭＳＨに１００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖を添加した場合、細胞数のわずかな増加が認められた（図５中の１００μｇ／ｍｌの細胞数は１０５である）。αＭＳＨに５００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖を添加した場合、細胞数の増加は抑制された（図５中の５００μｇ／ｍｌの細胞数は約８０である）。
【００３８】
これより、酢酸菌ヘテロ多糖は、細胞の増殖に影響することなく、αＭＳＨ作用によるメラニン生産を抑制できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の酢酸菌が生産するメラニン生産抑制作用を有する多糖類は、化粧品原料、特に美白用化粧品原料として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】精製多糖を酸加水分解した後、ＴＬＣにて分析に供した。精製多糖類のＴＬＣ分析を図１に示す。標準の糖との比較から、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖はラムノース、キシロースおよびグルコースを構成糖とすることを確認した。展開溶媒：ｎ−プロパノール：H2O = 85:15 (V/V)；発色法：アニリン−ジフェニルアミン-リン酸 試薬（4 mL of aniline, 4 g of diphenylamine, 200 mL of acetone, and 20 mL of 85％ phosphoric acid）；グルコース標準品（和光純薬 特級）（レーン１）、ラムノース標準品（和光純薬 特級）（レーン２）、キシロース標準品（和光純薬 特級）（レーン３）、精製多糖類加水分解物（レーン４および５）、ガラクトース標準品（和光純薬 特級）（レーン６）、リキソース標準品（和光純薬 特級）（レーン７）、アラビノース標準品（和光純薬 特級）（レーン８）
【図２】精製多糖を酸加水分解（alditol acetate誘導体化）してＧＣＭＳ分析に供した、精製多糖類のＧＣＭＳチャートを図２に示す。また、標準のラムノース、リキソース、キシロース、グルコースおよびガラクトースを同様に処理してＧＣＭＳ分析に供した、標準単糖のＧＣＭＳチャートを図２に示す。標準単糖の溶出時間との比較から、酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖はラムノース、キシロースおよびグルコースを構成糖とすることを確認した。上チャートは精製多糖を酸加水分解（alditol acetate誘導体化）して分析したもの。下チャートは標準のラムノース、リキソース、キシロース、グルコースおよびガラクトースを同様に処理して分析したもの。
【図３】IFO3191多糖類Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００による分子量算定。分析条件：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００（アマシャムバイオサイエンス１．６ｃｍ×９０ｃｍ）、溶出液（移動相）は０．１％ＳＤＳを含有０．１ＭＮａＣｌ、流量６０ｍｌ／時間。糖含量はフェノール硫酸法による４９０ｎｍ比色定量により実施。標準分子量曲線は、プルラン（昭和電工製）Ｐ２００（１８６ｋＤａ）、Ｐ１００（１００ｋＤａ）、Ｐ５０（５０ｋＤａ）及びＰ２０（２０ｋＤａ）を用いて作成。
【図４】酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖のメラニン産生抑制効果。500、1000、1500μｇ／ｍｌは、培地中の酢酸菌ヘテロ多糖の終濃度をあらわす。コントロールは、酢酸菌ヘテロ多糖と同量の滅菌蒸留水を添加した培地を表す。−、±、＋、＋＋は、目視による白色化の判定基準を示す。−：白色化しない、±：やや白色化する、＋：白色化が中程度、＋＋：白色化が大きい
【図５】酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191株の産生するヘテロ多糖のαＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）によるメラニン産生亢進効果の抑制効果。＋αＭＳＨはαＭＳＨ（最終濃度２００μＭ）単独処理を表す。−は、αＭＳＨとヘテロ多糖の両方ともないことを表す。１００μｇ／ｍｌは、１００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖とαＭＳＨ（最終濃度２００μＭ）の両方で処理したことを表す。５００μg/m＋αＭＳＨは、５００μｇ／ｍｌのヘテロ多糖とαＭＳＨ（最終濃度２００μＭ）の両方で処理したことを表す。メラニン生産量と細胞数は、αＭＳＨ（最終濃度２００μＭ）単独処理時を１００としたときの相対数として表している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤。
【請求項２】
ヘテロ多糖がラムノース、グルコースおよびキシロースからなる３つの糖を少なくとも含有する、請求項１に記載のメラニン生産抑制剤。
【請求項１】
酢酸菌Acetobacter pasteurianuus IFO3191が産生するヘテロ多糖からなるメラニン生産抑制剤。
【請求項２】
ヘテロ多糖がラムノース、グルコースおよびキシロースからなる３つの糖を少なくとも含有する、請求項１に記載のメラニン生産抑制剤。
【図２】
【図３】
【図１】
【図４】
【図５】
【図３】
【図１】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２５５０２６（Ｐ２００８−２５５０２６Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９６６２１（Ｐ２００７−９６６２１）
【出願日】平成１９年４月２日（２００７．４．２）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（００００００２０６）宇部興産株式会社 (2,022)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２日（２００７．４．２）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（００００００２０６）宇部興産株式会社 (2,022)
【Ｆターム（参考）】
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