酵母細胞原形質膜による抗体ライブラリー提示
本発明は、宿主細胞に発現したとき、原形質膜の細胞外表面に提示されうる抗体またはその断片に関する。本発明は、複数の原形質膜提示抗体を含むライブラリー、および所望の特性を有する抗体またはその断片のライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母細胞の原形質膜の細胞外表面に提示されうる抗体の異種集団をコードするポリヌクレオチドを含む、ライブラリー。
【請求項２】
前記抗体の異種集団が、IgA、IgE、IgM、IgD、IgYおよびIgGからなる群より選択される免疫グロブリンタイプのものである、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項３】
前記抗体の異種集団が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または合成抗体である、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項４】
前記抗体の異種集団が、ヒト抗体である、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項５】
前記抗体の異種集団が、抗原結合断片である、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項６】
前記抗原結合断片が、一本鎖Fv（scFv）；Fabフラグメント；F(ab')フラグメント；およびFcフラグメントからなる群より選択される、請求項5に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記抗原結合断片が、Fc領域に融合している、請求項5または6に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記抗体の異種集団が、重鎖可変領域配列のライブラリーおよび／または軽鎖可変領域配列のライブラリーを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記抗体が、細胞表面に該抗体をターゲッティングするアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列が、上記抗体の重鎖または軽鎖のC末端に融合している、請求項1〜8のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項１０】
前記抗体が、細胞表面に該抗体をターゲッティングするアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列が、上記Fc領域のC末端に融合している、請求項7に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列が、膜貫通ドメインを含む、請求項9または10に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列が、GPIアンカードメインを含む、請求項9または10に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記膜貫通ドメインが、トロンボモジュリン、Ax12p、またはSwp1pに由来する、請求項11に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記膜貫通ドメインが、配列番号2、4、または6に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項11に記載のライブラリー。
【請求項１５】
酵母細胞の原形質膜の細胞外表面に抗体の異種集団を提示する方法であって、
a）請求項1〜14のいずれか一項に記載のライブラリーで酵母細胞の集団を形質転換するステップ；および
b）上記酵母細胞の集団を、該酵母細胞集団の原形質膜の細胞外表面での抗体の提示を可能にする条件下で培養するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１６】
前記酵母細胞の集団が、細胞壁がタンパク質抗原または抗体もしくはその断片に対して透過性となるように、該細胞壁を十分多孔性にする遺伝子突然変異を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵母細胞の集団が、mnn9における遺伝子突然変異、またはmnn9のオーソログを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵母細胞の集団が、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、ハンセヌラ(Hansenula)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウィア（Yarrowia）属、デバリオミセス(Debaryomyces)属、およびカンジダ(Candida)属からなる群より選択される属のものである、請求項15または16に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵母細胞の集団が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、およびヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵母細胞の集団が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵母細胞の集団が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
所望の結合特性を有する抗体を単離する方法であって、
a）請求項1〜14のいずれか一項に記載のライブラリーを含む酵母細胞の集団を、該酵母細胞集団の原形質膜の細胞外表面での抗体の提示を可能にする条件下で培養するステップ；
b）上記酵母細胞を抗体リガンドと接触させるステップ；ならびに、
c）上記抗体リガンドの結合に基づき、上記酵母細胞をソーティング(sorting)し、これにより、所望の結合特性を有する抗体を発現する少なくとも1個の細胞を単離するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２３】
所望の結合特性を有する抗体を単離する方法であって、
a）請求項1〜14のいずれか一項に記載のライブラリーを含む酵母細胞の集団を、該酵母細胞集団の原形質膜の細胞外表面での抗体の提示を可能にする条件下で培養するステップ；
b）上記酵母細胞を、細胞壁が抗体リガンドに対して透過性となるように、該細胞壁を十分多孔性にする酵素と接触させるステップ；
c）上記酵母細胞を抗体リガンドと接触させるステップ；ならびに、
d）上記抗体リガンドの結合に基づき、上記酵母細胞をソーティング(sorting)し、これにより、所望の結合特性を有する抗体を発現する少なくとも1個の細胞を単離するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２４】
前記リガンドを、検出可能な物質で標識する、請求項22または23に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出可能な物質が、蛍光マーカー、ビオチン、ストレプトアビジン、およびペプチドタグからなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
単離した酵母細胞からポリヌクレオチドを単離するステップをさらに含み、その際、このポリヌクレオチドが、所望の結合特性を有する抗体またはその断片をコードする、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記所望の結合特性が、特定の抗原に対する結合である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記所望の結合特性が、特定の抗原に対する結合増大である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記所望の結合特性が、特定の抗原に対する結合低減である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記所望の結合特性が、エフェクター分子に対する結合である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記所望の結合特性が、エフェクター分子に対する結合増大である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記所望の結合特性が、エフェクター分子に対する結合低減である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記エフェクター分子が、Clq、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIAからなる群より選択される、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
さらに以下：
i）ステップ（c）で単離した少なくとも1個の細胞由来の、所望の結合特性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを、真核細胞での発現のために適合させたベクターにクローニングするステップ；ならびに
ii）上記抗体を上記真核細胞において発現させ、その際、上記抗体の特性を決定することにより所望の結合特性を確認するステップ
を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項３５】
さらに以下：
i）ステップ（c）で単離した少なくとも1個の細胞由来の、所望の結合特性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを、原核生物での発現のために適合させたベクターにクローニングするステップ；ならびに
ii）上記抗体を上記原核生物において発現させ、その際、上記抗体の特性を決定することにより所望の結合特性を確認するステップ
を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項３６】
さらに以下：
i）ステップ（d）で単離した少なくとも1個の細胞由来の、所望の結合特性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを、真核細胞での発現のために適合させたベクターにクローニングするステップ；ならびに
ii）上記抗体を上記真核細胞において発現させ、その際、上記抗体の特性を決定することにより所望の結合特性を確認するステップ
を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項３７】
さらに以下：
i）ステップ（d）で単離した少なくとも1個の細胞由来の、所望の結合特性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを、原核生物での発現のために適合させたベクターにクローニングするステップ；ならびに
ii）上記抗体を上記原核生物において発現させ、その際、上記抗体の特性を決定することにより所望の結合特性を確認するステップ
を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項３８】
前記真核細胞が、哺乳動物、昆虫および酵母細胞からなる群より選択される、請求項34または36に記載の方法。
【請求項３９】
前記酵母細胞の集団が、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属からなる群より選択される属のものである、請求項22〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
酵母細胞の原形質膜の細胞外表面に提示されうる抗体の異種集団をコードするポリヌクレオチドを含む、ライブラリー。
【請求項２】
前記抗体の異種集団が、IgA、IgE、IgM、IgD、IgYおよびIgGからなる群より選択される免疫グロブリンタイプのものである、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項３】
前記抗体の異種集団が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または合成抗体である、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項４】
前記抗体の異種集団が、ヒト抗体である、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項５】
前記抗体の異種集団が、抗原結合断片である、請求項1に記載のライブラリー。
【請求項６】
前記抗原結合断片が、一本鎖Fv（scFv）；Fabフラグメント；F(ab')フラグメント；およびFcフラグメントからなる群より選択される、請求項5に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記抗原結合断片が、Fc領域に融合している、請求項5または6に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記抗体の異種集団が、重鎖可変領域配列のライブラリーおよび／または軽鎖可変領域配列のライブラリーを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記抗体が、細胞表面に該抗体をターゲッティングするアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列が、上記抗体の重鎖または軽鎖のC末端に融合している、請求項1〜8のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項１０】
前記抗体が、細胞表面に該抗体をターゲッティングするアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列が、上記Fc領域のC末端に融合している、請求項7に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列が、膜貫通ドメインを含む、請求項9または10に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列が、GPIアンカードメインを含む、請求項9または10に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記膜貫通ドメインが、トロンボモジュリン、Ax12p、またはSwp1pに由来する、請求項11に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記膜貫通ドメインが、配列番号2、4、または6に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項11に記載のライブラリー。
【請求項１５】
酵母細胞の原形質膜の細胞外表面に抗体の異種集団を提示する方法であって、
a）請求項1〜14のいずれか一項に記載のライブラリーで酵母細胞の集団を形質転換するステップ；および
b）上記酵母細胞の集団を、該酵母細胞集団の原形質膜の細胞外表面での抗体の提示を可能にする条件下で培養するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１６】
前記酵母細胞の集団が、細胞壁がタンパク質抗原または抗体もしくはその断片に対して透過性となるように、該細胞壁を十分多孔性にする遺伝子突然変異を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵母細胞の集団が、mnn9における遺伝子突然変異、またはmnn9のオーソログを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵母細胞の集団が、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、ハンセヌラ(Hansenula)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウィア（Yarrowia）属、デバリオミセス(Debaryomyces)属、およびカンジダ(Candida)属からなる群より選択される属のものである、請求項15または16に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵母細胞の集団が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、およびヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵母細胞の集団が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵母細胞の集団が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
所望の結合特性を有する抗体を単離する方法であって、
a）請求項1〜14のいずれか一項に記載のライブラリーを含む酵母細胞の集団を、該酵母細胞集団の原形質膜の細胞外表面での抗体の提示を可能にする条件下で培養するステップ；
b）上記酵母細胞を抗体リガンドと接触させるステップ；ならびに、
c）上記抗体リガンドの結合に基づき、上記酵母細胞をソーティング(sorting)し、これにより、所望の結合特性を有する抗体を発現する少なくとも1個の細胞を単離するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２３】
所望の結合特性を有する抗体を単離する方法であって、
a）請求項1〜14のいずれか一項に記載のライブラリーを含む酵母細胞の集団を、該酵母細胞集団の原形質膜の細胞外表面での抗体の提示を可能にする条件下で培養するステップ；
b）上記酵母細胞を、細胞壁が抗体リガンドに対して透過性となるように、該細胞壁を十分多孔性にする酵素と接触させるステップ；
c）上記酵母細胞を抗体リガンドと接触させるステップ；ならびに、
d）上記抗体リガンドの結合に基づき、上記酵母細胞をソーティング(sorting)し、これにより、所望の結合特性を有する抗体を発現する少なくとも1個の細胞を単離するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２４】
前記リガンドを、検出可能な物質で標識する、請求項22または23に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出可能な物質が、蛍光マーカー、ビオチン、ストレプトアビジン、およびペプチドタグからなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
単離した酵母細胞からポリヌクレオチドを単離するステップをさらに含み、その際、このポリヌクレオチドが、所望の結合特性を有する抗体またはその断片をコードする、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記所望の結合特性が、特定の抗原に対する結合である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記所望の結合特性が、特定の抗原に対する結合増大である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記所望の結合特性が、特定の抗原に対する結合低減である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記所望の結合特性が、エフェクター分子に対する結合である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記所望の結合特性が、エフェクター分子に対する結合増大である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記所望の結合特性が、エフェクター分子に対する結合低減である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記エフェクター分子が、Clq、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIAからなる群より選択される、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
さらに以下：
i）ステップ（c）で単離した少なくとも1個の細胞由来の、所望の結合特性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを、真核細胞での発現のために適合させたベクターにクローニングするステップ；ならびに
ii）上記抗体を上記真核細胞において発現させ、その際、上記抗体の特性を決定することにより所望の結合特性を確認するステップ
を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項３５】
さらに以下：
i）ステップ（c）で単離した少なくとも1個の細胞由来の、所望の結合特性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを、原核生物での発現のために適合させたベクターにクローニングするステップ；ならびに
ii）上記抗体を上記原核生物において発現させ、その際、上記抗体の特性を決定することにより所望の結合特性を確認するステップ
を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項３６】
さらに以下：
i）ステップ（d）で単離した少なくとも1個の細胞由来の、所望の結合特性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを、真核細胞での発現のために適合させたベクターにクローニングするステップ；ならびに
ii）上記抗体を上記真核細胞において発現させ、その際、上記抗体の特性を決定することにより所望の結合特性を確認するステップ
を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項３７】
さらに以下：
i）ステップ（d）で単離した少なくとも1個の細胞由来の、所望の結合特性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドを、原核生物での発現のために適合させたベクターにクローニングするステップ；ならびに
ii）上記抗体を上記原核生物において発現させ、その際、上記抗体の特性を決定することにより所望の結合特性を確認するステップ
を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項３８】
前記真核細胞が、哺乳動物、昆虫および酵母細胞からなる群より選択される、請求項34または36に記載の方法。
【請求項３９】
前記酵母細胞の集団が、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属からなる群より選択される属のものである、請求項22〜33のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２０１０−５１７５７７（Ｐ２０１０−５１７５７７Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４９２５２（Ｐ２００９−５４９２５２）
【出願日】平成２０年２月８日（２００８．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３３９８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１００８１６
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０４３３３９７２）メディミューン，エルエルシー (108)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月８日（２００８．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３３９８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１００８１６
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０４３３３９７２）メディミューン，エルエルシー (108)
【Ｆターム（参考）】
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