酵素活性を向上させるための組成物およびその利用
【課題】本発明は、簡便、且つ効果的に酵素活性を向上させる組成物、当該組成物を含むキット、および当該組成物を用いることにより酵素活性を向上させる方法を提供する。
【解決手段】本発明にかかる組成物は、分子内に少なくとも１組以上のカチオンとアニオンとの双性イオンを有するベタインであって、（ａ）カチオンとアニオンと間のスペーサー長が少なくともＣ１以上である、および／または（ｂ）アンモニウム基の置換基がＣ２以上であるベタインを含む。
【解決手段】本発明にかかる組成物は、分子内に少なくとも１組以上のカチオンとアニオンとの双性イオンを有するベタインであって、（ａ）カチオンとアニオンと間のスペーサー長が少なくともＣ１以上である、および／または（ｂ）アンモニウム基の置換基がＣ２以上であるベタインを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性を向上させるための組成物およびその利用に関する。具体的には、例えばα−グルコシダーゼといった加水分解酵素等の各種酵素活性を向上させることができる化合物を含む組成物およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、酵素反応は、反応プロセスの過程で反応速度が頭打ちになる。酵素活性を向上させることができれば、例えば酵素反応の反応速度が向上し、酵素反応産物の生産効率が向上する等の工業的メリットが生じるため重要な課題である。
【０００３】
酵素活性を向上させる方法としては、一般的に酵素タンパク質を構成するアミノ酸を変異させて酵素タンパク質の構造を変化させる方法（部位特異的変異法）、アルコールまたは高分子（例えば、ポリエチレングリコール等）等を酵素反応溶液に添加する方法が知られている。
【０００４】
例えば、非特許文献１から３には、上記部位特異的変異法により酵素活性を向上させる方法が開示されている。
【０００５】
また、非特許文献４には、アルコールを酵素反応溶液に添加することにより酵素活性を向上させる方法が開示されている。さらに、非特許文献５には、ポリエチレングリコールを酵素反応溶液に添加することにより酵素活性を向上させる方法が開示されている。
【０００６】
また、非特許文献６には、高ＮａＣｌ濃度条件下では酵素活性が阻害されるが、グリシンベタインを添加することにより、高ＮａＣｌ濃度条件下での酵素活性の阻害が軽減され、酵素の安定性が向上することが記載されている。
【０００７】
また、非特許文献７には、グリシン添加により酵素の至適ｐＨが上昇すること、および酵素活性が向上することが記載されている。一方、グリシンの代わりにメチルグリシンエステルまたはエチルグリシンエステルを添加したとしても酵素活性向上効果が見られないことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】M. Hashida, B. F. Henrik, Trends Glycosci. Glycotech., 12, 389 (2000).
【非特許文献２】T. A. Kunkel, J. D. Roberts, R. A. Zakour, Methods in Enzymology, 154, 367 (1987).
【非特許文献３】松沢洋著、タンパク質工学の基礎（応用生命科学シリーズ）東京化学同人
【非特許文献４】S. N. Timasheff, Adv. Protein Chem., 51, 355 (1998).
【非特許文献５】K. Hayashi, M. Nakazwa, Y. Ishizaki, N. Hiraoka, A. Obayashi, Nucleic Acids Res., 14, 7817 (1986).
【非特許文献６】A. Pollard and R. G. Wyn Jones, Planta, 144, 291 (1979).
【非特許文献７】V. Vathipadiekal, A. Verma, M. Rao, Biol. Chem., 388, 61 (2007).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記従来の酵素タンパク質を構成するアミノ酸を変異させて酵素タンパク質の構造を変化させる方法では、たとえ酵素タンパク質の立体構造が決定されていたとしても、どのように立体構造を改変すれば酵素活性が向上するかについて予測することは難しいため、酵素活性を効果的に改良することは困難であることは当業者に広く知られている。また、かかる方法は、目的の酵素タンパク質毎にアミノ酸変異を検討する必要があり、非常に手間がかかるという問題を有する。
【００１０】
また、酵素反応溶液にアルコールまたは高分子（例えば、ポリエチレングリコール等）等を酵素反応溶液に添加する方法では、これらの物質の添加により酵素タンパク質の安定性が向上する結果として、酵素活性が向上すると考えられている。かかる方法は、アミノ酸を変異させる方法と比べて簡便且つ汎用性があるが、酵素活性を向上させる効果は低いという問題を有する。従って、さらに酵素活性向上効果に優れた物質が求められている。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便、且つ効果的に酵素活性を向上させる組成物、および当該組成物の利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、特定の構造を有するベタインを酵素反応溶液に添加することにより、酵素活性が顕著に向上することを本発明者らが発見し、本発明を完成させるに至った。ベタインのような比較的低分子の物質を添加して酵素活性を顕著に向上させるという報告はこれまでに無く、またベタインに酵素活性を向上させる効果があるということも一切知られていない。特定の構造を有するベタインに酵素活性を顕著に向上させる効果があるということは、本発明者らが初めて見出し、ここに開示するものである。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１３】
本発明にかかる組成物は、酵素活性を向上させるために用いられる組成物であって、
当該組成物が、以下の一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴としている：
【００１４】
【化１】
【００１５】
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ｒ６はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ａ１は長周期型周期表における５Ｂ族元素、かつ
Ｚ１は−ＣＯＯ、−ＳＯ３、−ＮＯ３、または−ＨＰＯ４を表し、かつ
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ６が炭素数１以上の基である。
【００１６】
また、本発明にかかる組成物は、酵素活性を向上させるために用いられる組成物であって、
当該組成物が、以下の一般式（１’）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴としている：
【００１７】
【化２】
【００１８】
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ｒ６はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ６が炭素数１以上の基である。
【００１９】
また、本発明にかかる組成物は、上記Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、末端に極性官能基を含まない基であることが好ましい。
【００２０】
また、本発明にかかる組成物は、上記酵素は、加水分解酵素であることが好ましい。
【００２１】
本発明にかかる酵素反応キットは、本発明にかかる組成物と対象酵素とを含むことを特徴としている。
【００２２】
本発明にかかる方法は、酵素活性を向上させる方法であって、本発明にかかる組成物を酵素反応系に加える工程を含むことを特徴としている。
【００２３】
なお、上記非特許文献６は、高ＮａＣｌ濃度条件下における酵素の安定性の向上に、グリシンベタインが寄与することを示すに過ぎない。また、非特許文献７はそもそもグリシンに関する文献であり、グリシンベタインをはじめとするベタインに酵素活性を向上させる効果があることを示す文献ではない。また非特許文献７にはグリシンの代わりにメチルグリシンエステルまたはエチルグリシンエステルを添加した場合に酵素活性向上効果が見られないことが記載されているため、当業者であれば、グリシンに類似した物質であっても、僅かな構造の変化により酵素活性向上効果が失われるということを理解する。よって、本発明にかかる組成物は、非特許文献６や非特許文献７の記載に基づいて容易に想到し得るものではない。
【発明の効果】
【００２４】
上記本発明にかかる組成物は、従来用いられるポリエチレングリコール等の添加剤と比較して、非常に優れた酵素活性向上効果を奏するものである。よって、本発明にかかる組成物を用いることによって、簡便、且つ効果的に酵素活性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】各種ベタイン（化合物１〜８）の構造を示す図である。
【図２】各種ベタインの添加によるα−グルコシダーゼの活性比を表すグラフである。
【図３】各種ベタインについて、添加濃度とα−グルコシダーゼ活性に及ぼす効果を表すグラフである。
【図４】高濃度の化合物６存在下におけるα−グルコシダーゼタンパク質の沈殿の有無を示すグラフである。
【図５】分子内に１組の双性イオンを持つベタインの製造スキームを示す図である。
【図６】化合物６を用い、Saccharomyces由来のα−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図７】化合物６を用い、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図８】化合物６を用い、Bakers Yeast由来のα−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図９】化合物４を用い、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図１０】化合物５を用い、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図１１】化合物４〜６のいずれかを用い、Almond由来のβ−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図１２】化合物４〜６のいずれかを用い、Calf intestine由来のアルカリホスファターゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図１３】化合物４〜６のいずれかを用い、Chicken heart由来の乳酸脱水素酵素を用いた場合の、反応時間（分）に対して、基質であるピルビン酸の消費と共に減少したＮＡＤＨの濃度を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りである。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００２７】
＜１．本発明にかかる組成物＞
本発明にかかる組成物は、酵素活性を向上させるために用いられる組成物に関する。ここで「酵素活性を向上させる」対象となる「酵素」としては、特に限定されるものではなく、例えば、加水分解酵素（例えば、グルコシダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、フォスファターゼ等）、核酸合成酵素（例えば、ポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酸化還元酵素（デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ等）、トランスフェラーゼ、リガーゼ等を挙げることができる。後述する実施例では、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および乳酸脱水素酵素について、本発明にかかる組成物の効果（酵素活性を向上させる効果）を示した。実施例の結果から、本発明にかかる組成物による効果は、特定の酵素に対するものに限定されないことが分かる。
【００２８】
また、「酵素活性を向上させる」とは、例えば、本発明にかかる組成物存在下における酵素の反応速度に対する本発明にかかる組成物非存在下における酵素の反応速度の比（以下、「活性比」と称する）が、１より大きくなることを意味する。なお、上記「活性比」は、下記の式（１）を用いて求めることができる。
【００２９】
活性比
＝（組成物存在下の酵素の反応速度）／（組成物非存在下の酵素の反応速度）・・・（１）
なお、上記「酵素の反応速度」とは、基質大過剰の条件下における反応初期速度を示す。
【００３０】
例えば、加水分解酵素であるα−グルコシダーゼの反応速度は、紫外可視分光測定から加水分解をモニターできるα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシドを基質として用い、反応時間（分）に対する３９０ｎｍの波長における吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解産物であるｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０、３７℃）である７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて加水分解速度を算出することができる。
【００３１】
本発明にかかる組成物は、既述の一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含む組成物である。一般式（１）で表される化合物は、その構造から双性イオン化合物であることがわかる。特に記述の一般式（１’）で表される化合物は、ベタインに属することがわかる。なお、一般に「グリシンベタイン＝トリメチルグリシン」のことを単に「ベタイン」と称する場合があるが、本発明の説明においては「グリシンベタイン＝トリメチルグリシン」を「ベタイン」の下位概念であるとして、それぞれを区別する。
【００３２】
酵素反応系が水溶液系の場合、本発明にかかる組成物を構成する双性イオン化合物は、酵素反応溶液中で優先的に水和を起こす。その結果、基質、酵素、補酵素類は溶解体積が減少する、いわゆる排除体積効果が生じ、この排除体積効果によって基質、酵素、補酵素類の分子間での会合が促進し、酵素活性が向上するものと考えられる。また後述する実施例に示したように、本発明にかかる組成物を構成するベタインによれば、酵素の基質特異性を高めることができる。このように酵素の基質特異性を向上させることが、酵素活性の向上につながる一つの要因であると考えられる。
【００３３】
一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択される基である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て同一であっても、異なっていてもよい。また上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。ただし、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の末端には、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸基、リン酸基、アミド基、エポキシ基をはじめとする極性官能基が含まれないことが好ましい。
【００３４】
炭化水素のような疎水性官能基は、水分子と水素結合をするための正に帯電した水素や、非共有電子対を有していない。このような疎水性官能基の周囲に存在する水は、氷殻と呼ばれるネットワーク性の強い水分子のクラスターを形成する（クラスター化する）ことが知られている。
【００３５】
酵素反応系が水溶液系の場合、本発明にかかる組成物を構成する双性イオン化合物は、酵素反応溶液中で優先的に水和を起こす。双性イオン化合物の分子内に疎水性官能基が含まれる場合、双性イオン化合物と水和した水分子が双性イオン化合物の周囲でクラスター化する。このクラスター化した水分子は、溶質が溶解することができる水分子、いわゆるバルク水（自由水）とは異なり、溶質である酵素や基質が溶解することができない。この結果、上述したような「排除体積効果」が生じるものと考えられる。
【００３６】
一方、双性イオン化合物の分子内に水酸基のような極性官能基が含まれる場合、疎水性官能基の周囲に存在する水分子同士の結びつきが変化し、双性イオン化合物の周囲でクラスター化する水分子の数が減少する。この結果、双性イオン化合物の分子内に極性官能基が含まれない場合と比較して、「排除体積効果」が低減されるものと考えられる。従って、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の末端には、極性官能基が含まれないことが好ましい。
【００３７】
また一般式（１）において、Ｒ６はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基である。そして上記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。
【００３８】
また一般式（１）においてＡ１は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）をはじめとする長周期型周期表における５Ｂ族元素を表す。
【００３９】
また一般式（１）において、Ｚ１は−ＣＯＯ、−ＳＯ３、−ＮＯ３、または−ＨＰＯ４を表す。
【００４０】
さらに一般式（１）において下記の（I）または（II）の１つ以上が満たされる。
（I）Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ６が炭素数１以上の基である。
【００４１】
なお、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６の炭素数は、一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体（以下「化合物等」という）が酵素−基質反応を行う反応溶液中に溶解する程度の条件であれば、炭素数の上限は特に限定されるものではない。
【００４２】
本発明にかかる組成物は、上記一般式（１）で表される化合物からなる群から選択される１つ以上の化合物が含まれていればよい。また本発明にかかる組成物には上記一般式（１）で表される化合物の塩、またはそれらの誘導体であってもよい。また２つ以上の化合物等が組成物に含まれる場合の配合比率は特に限定されるものではなく、酵素−基質反応に適した配合比率を適宜検討のうえ、採用すればよい。
【００４３】
なお本発明にかかる組成物に含まれる一般式（１）で表される化合物は、分子内に少なくとも１組以上のカチオンとアニオンとの双性イオンを有する双性イオン化合物（例えばベタイン）であって、（ａ）カチオンとアニオンと間のスペーサー長が少なくともＣ１以上である、および／または（ｂ）アンモニウム基の置換基がＣ２以上である双性イオン化合物（例えばベタイン）であるとも表現できる。
【００４４】
また本発明にかかる組成物は、既述の一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を主成分として含む（５０質量％以上、好ましくは７０質量％以上、最も好ましくは９０質量％以上）ものであればよいが、上記の他、酵素−基質反応の際に好適に使用されている緩衝剤、塩類、補酵素、界面活性剤、タンパク質等が含まれていてもよい。また本発明にかかる組成物は、既述の一般式（１）（または（１’））で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体そのものであってもよい。
【００４５】
上記、緩衝剤としては特に限定されるものではないが、トリス（ＴＲ１Ｓ）、トリジン（ＴＲｌＣ１ＮＥ）、ビスートリシン（ＢｌＳ-ＴＲ１Ｃ１ＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（Ｐ１ＰＥＳ）、キャプス（ＣＡＰＳ）、リン酸、酢酸、ホウ酸、炭酸等が挙げられる。
【００４６】
また上記塩としては特に限定されるものではないが、例えば塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、酢酸リチウム、塩化鉄、硫酸鉄、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、塩化カルシウム等が挙げられる。
【００４７】
また上記補酵素としては特に限定されるものではないが、例えば、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、トパキノン（ＴＰＱ）、リシンチロシルキノン（ＬＴＱ）等のキノン補酵素、チアミン二リン酸（ＴＰＰ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ビオチン、葉酸などのビタミン補酵素、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰＧ）等が挙げられる。
【００４８】
また上記界面活性剤としては特に限定されるものではないが、例えば、ＴＷＥＥＮ、ＴｒｉｔｏｎＸ、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられる。
【００４９】
また上記タンパク質としては特に限定されるものではないが、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、シャペロンタンパク質などが挙げられる。
【００５０】
さらに本発明にかかる組成物には、酵素活性を向上させることが公知である、ＰＥＧ、エタノール、グリセロール、アミノ酸等が、補助成分として含まれていてもよい。
【００５１】
また本発明にかかる組成物の状態は、特に限定されるものではなく、液体であっても、固体の状態であってもよい。
【００５２】
＜２．酵素反応キット＞
上記本発明にかかる組成物を用いて酵素反応キットを構成することができる。本発明にかかる酵素反応キットは、本発明にかかる組成物と対象酵素とを含んでいればよく、これらは別々の容器に充填されていてもよいし、同じ容器に充填されていてもよい。上記酵素反応キットは、本発明にかかる組成物を含んでいるため、上記対象酵素の酵素活性を向上させることができる。
【００５３】
なお、上記「対象酵素」とは、酵素活性を向上させる対象となる酵素を指す。上記「対象酵素」としては、特に限定されるものではなく、例えば、加水分解酵素（例えば、グルコシダーゼ等）、核酸合成酵素（例えば、ポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）等を挙げることができる。
【００５４】
本発明にかかる酵素反応キットには、さらに、既述の緩衝剤、塩類、補酵素、界面活性剤、タンパク質等が含まれていてもよい。
【００５５】
また上記酵素反応キットを構成する成分を格納するための１つ以上の容器（例えば、バイアル、管、アンプル、ビンなど）が含まれていてもよい。
【００５６】
なお、本発明に係る酵素反応キットを構成する「本発明にかかる組成物」は、既述の一般式（１）（または（１’））で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体そのものであってもよい。
【００５７】
＜３．酵素活性を向上させる方法＞
本発明にかかる酵素活性を向上させる方法は、本発明にかかる組成物を酵素反応系に加える工程を含む。なお、上記「酵素反応系」とは、酵素活性を向上させる対象となる酵素（以下、「対象酵素」という）を少なくとも含む系を意味する。なお酵素反応系には、上記対象酵素以外に、例えば、既述の緩衝剤、塩類、補酵素、界面活性剤、タンパク質等の酵素反応に必要なものがさらに含まれていてもよい。上記「酵素反応系」の一例として溶液系である酵素反応溶液を挙げることができるが、本発明はこれに限定されない。なお、上記酵素反応系には、上記対象酵素の基質がさらに含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。上記酵素反応系に対象酵素の基質が含まれていない場合は、上記酵素反応系に対象酵素の基質を加える工程が、本発明にかかる酵素活性を向上させる方法に含まれていてもよい。
【００５８】
例えば、α−グルコシダーゼによる加水分解反応において、α−グルコシダーゼの活性を向上させる場合には、α−グルコシダーゼおよびα−グルコシダーゼの基質を含む酵素反応系に、本発明にかかる組成物を加えればよい。酵素反応の反応条件は、用いられる酵素に応じて適宜設定すればよい。
【００５９】
上記「対象酵素」としては、特に限定されるものではなく、例えば、加水分解酵素（例えば、グルコシダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、フォスファターゼ等）、核酸合成酵素（例えば、ポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酸化還元酵素（デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ等）、トランスフェラーゼ、リガーゼ等を挙げることができる。
【００６０】
上記酵素反応系に含まれていることが好ましい双性イオン化合物（例えばベタイン）またはそれらの塩もしくは誘導体の濃度は、反応に用いられる酵素の種類や濃度、基質の濃度、添加されるベタインの構造によって異なるために特に限定されるものではなく、適宜検討のうえ、採用すればよい。
【００６１】
なお、本発明にかかる酵素活性を向上させる方法において用いられる「本発明にかかる組成物」は、既述の一般式（１）（または（１’））で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体そのものであってもよい。
【００６２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００６４】
＜実施例で用いたベタイン＞
本発明の実施例において用いたベタイン（化合物１〜８）について、化合物１としては、市販のグリシンベタイン（スペーサー長：Ｃ１）（型番023-10862、和光純薬製）を用いた。化合物２〜８は、以下のようにして合成したものを用いた。
【００６５】
〔１．前駆体の合成〕
既述の一般式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３がエチル基で、Ｒ６がメチレン基である分子内に１組の双性イオンを持つベタインの前駆体（２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−酢酸エチルエステル臭化物塩）を、図５に示すスキームに従って合成した。
【００６６】
まず、トリエチルアミン１００ｍｌを酢酸エチル１００ｍｌに溶解させた。この溶液に対してブロモ酢酸エチル（３７．５ｇ）をゆっくりと滴下した。滴下後、この溶液を室温で一晩攪拌した。その後、生成した沈殿を濾別した。得られた沈殿を真空乾燥して、前駆体１（２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−酢酸エチルエステル臭化物塩）を得た（収量５０．２ｇ、収率８６％）。
【００６７】
上記で得られた化合物の同定は、ＩＲ、および１Ｈ ＮＭＲによって行われた。表１にＩＲ解析の結果を、表２に１Ｈ ＮＭＲ解析の結果を示す。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【００７０】
ＩＲ、および１Ｈ ＮＭＲの結果、目的物である２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−酢酸エチルエステル臭化物塩（すなわち、図１における化合物４の前駆体）が合成されたことが確認できた。
【００７１】
図１における化合物２の前駆体を合成した結果を、表３（ＩＲ）および表４（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表３および４によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】
図１における化合物３の前駆体を合成した結果を、表５（ＩＲ）および表６（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表５および６によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
図１における化合物５の前駆体を合成した結果を、表７（ＩＲ）および表８（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表７および８によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００７８】
【表７】
【００７９】
【表８】
【００８０】
図１における化合物６の前駆体を合成した結果を、表９（ＩＲ）および表１０（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表９および１０によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００８１】
【表９】
【００８２】
【表１０】
【００８３】
図１における化合物７の前駆体を合成した結果を、表１１（ＩＲ）および表１２（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表１１および１２によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００８４】
【表１１】
【００８５】
【表１２】
【００８６】
図１における化合物８の前駆体を合成した結果を、表１３（ＩＲ）および表１４（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表１３および１４によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００８７】
【表１３】
【００８８】
【表１４】
【００８９】
〔２．ベタインの合成〕
得られた前駆体（２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−酢酸エチルエステル臭化物塩）１．０ｇを蒸留水１０ｍｌに溶解した。この溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：登録商標ＩＲ−４０２、ローム アンド ハース社製）を充填したカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、五酸化二リンの共存下、減圧乾燥し、ベタイン（２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−アセテート）を得た（収量０．５９ｇ、収率１００％）。
【００９０】
上記で得られた化合物の同定は、ＩＲおよび１Ｈ ＮＭＲによるエステルピークの消失確認と、Ｃ、Ｈ、Ｎ元素分析による塩の混入の有無を確認することで行った。表１５にＩＲ解析の結果を、表１６に１Ｈ ＮＭＲ解析の結果を、表１７に元素分析の結果を示す。
【００９１】
【表１５】
【００９２】
【表１６】
【００９３】
【表１７】
【００９４】
表１５〜１７の結果、目的物である２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−アセテート（すなわち、図１における化合物４）が得られたことが確認された。
【００９５】
図１における化合物２を合成した結果を、表１８（ＩＲ）、表１９（１Ｈ ＮＭＲ）、および表２０（元素分析）に示す。表１８〜２０によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００９６】
【表１８】
【００９７】
【表１９】
【００９８】
【表２０】
【００９９】
図１における化合物３を合成した結果を、表２１（ＩＲ）、表２２（1Ｈ ＮＭＲ）、および表２３（元素分析）に示す。表２１〜２３によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１００】
【表２１】
【０１０１】
【表２２】
【０１０２】
【表２３】
【０１０３】
図１における化合物５を合成した結果を、表２４（ＩＲ）、表２５（1Ｈ ＮＭＲ）、および表２６（元素分析）に示す。表２４〜２６によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１０４】
【表２４】
【０１０５】
【表２５】
【０１０６】
【表２６】
【０１０７】
図１における化合物６を合成した結果を、表２７（ＩＲ）、表２８（1Ｈ ＮＭＲ）、および表２９（元素分析）に示す。表２７〜２９によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１０８】
【表２７】
【０１０９】
【表２８】
【０１１０】
【表２９】
【０１１１】
図１における化合物７を合成した結果を、表３０（ＩＲ）、表３１（1Ｈ ＮＭＲ）、および表３２（元素分析）に示す。表３０〜３２によれば目的とする化合物が合成されたことが確認できた。
【０１１２】
【表３０】
【０１１３】
【表３１】
【０１１４】
【表３２】
【０１１５】
図１における化合物８を合成した結果を、表３３（ＩＲ）、表３４（1Ｈ ＮＭＲ）、および表３５（元素分析）に示す。表３３〜３５によれば目的とする化合物が合成されたことが確認できた。
【０１１６】
【表３３】
【０１１７】
【表３４】
【０１１８】
【表３５】
【０１１９】
〔実施例１〕
＜α−グルコシダーゼの加水分解速度に及ぼすベタイン添加の効果＞
得られた各種ベタイン（化合物１〜８）の添加による酵素活性向上効果を評価、検討するため、ベタイン存在下でのα−グルコシダーゼの加水分解速度を測定した。α−グルコシダーゼ（Saccharomyces由来）（型番076-02841、和光純薬製）の基質としては、紫外可視分光測定から加水分解をモニターできるα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド（型番325-34671、和光純薬製）を用いた。
【０１２０】
基質であるα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシドは３５０ｎｍに極大吸収波長を持つが、α−グルコシダーゼによってグルコースとｐ−ニトロフェノールに加水分解されると、ｐＨ７．０においてはｐ−ニトロフェノールは水酸基のプロトンが解離してｐ−ニトロフェノラートとなる。結果として、極大吸収波長は長波へシフトし、４００ｎｍ近傍の吸光度が上昇する。４０５ｎｍのｐ−ニトロフェノラートのモル吸光係数（ｐＨ７．０、３７℃）である７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を利用すれば、加水分解によって生成するｐ−ニトロフェノールの濃度を見積もることができ、反応速度を算出することができる。ここで４０５ｎｍを使用したのはマイクロプレートリーダーのフィルターの関係である。
【０１２１】
加水分解速度の測定は、酵素反応溶液（１００ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０），２ｍＭ α−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド，２．５×１０−５ｍｇ／ｍＬ α−グルコシダーゼ）を用いて、３７℃で行った。ベタインは、最終濃度５０ｍＭとなるように上記酵素反応溶液に添加した。
【０１２２】
α−グルコシダーゼの反応速度は反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解産物であるｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０、３７℃）７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて加水分解速度を算出した。
【０１２３】
また、酵素活性の誤差を最小限とするため、ベタイン添加による効果は活性比で表した。当該「活性比」とは、〔発明を実施するための形態〕の＜１．本発明にかかる組成物＞で上述したように、本発明にかかる組成物存在下における酵素の反応速度に対する本発明にかかる組成物非存在下における酵素の反応速度の比を指す。
【０１２４】
結果を図２に示す。図２は、各種ベタインを最終濃度５０ｍＭとなるように酵素反応溶液に添加した場合の活性比を表すグラフである。化合物１〜８のいずれのベタインを添加した場合も、活性比は１を上回った。これは、ベタインを添加しなかった場合のα−グルコシダーゼ活性と比較して、ベタインを添加した場合のα−グルコシダーゼ活性が上昇したことを表している。特に、化合物６では活性比は８．７、化合物８では活性比は７．９と、ベタイン添加の効果が顕著であった。
【０１２５】
一方、後述する比較例１に示すように、酵素活性を向上することが報告されているエタノール（非特許文献４を参照）では活性比は１．０、グリセロール（非特許文献４を参照）では活性比は０．９、ポリエチレングリコール（非特許文献５を参照）では活性比は０．１と、これらの物質を添加することによる酵素活性向上効果はほとんど確認できなかった。
【０１２６】
〔比較例１〕
酵素活性を向上させるために一般的に用いられるエタノール、グリセロール、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平均分子量６，０００）をベタインの代わりに最終濃度５０ｍＭとなるように酵素反応溶液に添加した以外は、実施例１と同様の方法によりα−グルコシダーゼ活性を測定し、活性比を求めた。
【０１２７】
〔試験例１〕
＜ベタインの濃度の与える効果＞
添加するベタインの最適濃度を調べるために、ベタインの濃度を変化させたときの活性比を測定した。一例として、化合物１、化合物２、および化合物６の結果を図３に示す。
【０１２８】
図３には化合物１、化合物２、および化合物６の濃度変化による活性比の変化が示されている。
【０１２９】
化合物２を最終濃度５０ｍＭで添加した場合の活性比は３．３であったが、添加する化合物２の濃度が上昇すると加水分解速度は濃度依存的に上昇し、最終濃度１．０Ｍで添加した場合の活性比は９．５であった。
【０１３０】
また、化合物６は最終濃度５０ｍＭで添加すると顕著な効果を示したが、最終濃度０．５Ｍ以上の濃度では活性比が低下した。
【０１３１】
化合物６に関し、活性の低下は酵素（α−グルコシダーゼ）の沈殿によるものと推察されたため、基質非存在下で酵素溶液の濁度測定を行った。
【０１３２】
一方、化合物１は最終濃度５０ｍＭの添加で活性比の上昇が飽和挙動を示し、活性比２以上となるような酵素活性向上効果はもたらさないことが明らかとなった。これにより、化合物２〜８のベタインは、天然のベタインである化合物１と比較しても明らかな効果があることが確認された。
【０１３３】
また、図４は、高濃度の化合物６存在下におけるα−グルコシダーゼタンパク質の沈殿の有無を示すグラフである。α−グルコシダーゼタンパク質の沈殿の有無は、沈殿の生成によって生じた粒子の起こす光散乱を検出する方法（濁度測定）により評価した。
【０１３４】
具体的に説明すると、本発明にかかる組成物には５００ｎｍに吸収帯を持つ分子は含まれておらず、沈殿を生じない溶液では光はすべて透過するため、吸光度はゼロとなる。一方、沈殿が生じた場合は光の散乱が生じ、吸光度はゼロよりも大きな値を示す。したがって、沈殿生成による光の散乱に伴う５００ｎｍの吸光度変化を測定すれば、α−グルコシダーゼタンパク質の沈殿の有無を評価することができる。ただし、散乱強度は粒子の大きさ等にも依存するため、５００ｎｍの吸光度の強度と沈殿量とには相関はない。
【０１３５】
化合物６を最終濃度が０．５Ｍ以上添加すると活性比が低下したが、これは、図４に示すように酵素を沈殿させることが原因であることが判明した。化合物６に関しては、低濃度領域（１ｍＭ〜０．３Ｍ）において高い活性向上効果が確認されており、この結果は本発明を制限するものではない。
【０１３６】
試験例１の結果に従って、実施例１で用いた各種ベタインの使用濃度範囲と最大効果を表３６に示した。
【０１３７】
【表３６】
【０１３８】
化合物１、化合物２、および化合物３は、ベタインのカチオンとアニオンとの距離をスペーサーによって変化させたものであるが、スペーサー長が長くなれば酵素活性向上効果は高いことが明らかになった。
【０１３９】
化合物４、化合物５、および化合物６は、アルキル鎖長を長くすることによって、カチオンであるアンモニウム基の嵩高さを変えたものであるが、アンモニウム基が嵩高くなるほど酵素活性向上効果は高いことが明らかになった。また、ベタインの添加量が低濃度であっても酵素活性向上効果があらわれることが明らかになった。しかし、化合物５、化合物６に関しては高濃度での使用は酵素を沈殿させるため、使用に際しては濃度範囲の調節が必要となることが明らかになった。
【０１４０】
化合物７、化合物８は、アンモニウム基の嵩高さは同じであるが、アンモニウム基に導入される官能基を疎水性から親水性に変えたものである。アンモニウム基に導入される官能基が疎水性である化合物８の方が、親水性官能基が導入された化合物７よりもその酵素活性向上効果が高いことが明らかになった。
【０１４１】
〔試験例２〕
＜各種α−グルコシダーゼに与えるベタインの効果＞
種々のα−グルコシダーゼに与えるベタインの添加効果を比較した。α−グルコシダーゼとしては、市販の３種類のα−グルコシダーゼ（Saccharomyces由来（型番076-02841、和光純薬製）、Bacillus Stearothermophilus由来（型番G3651-250un、シグマアルドリッチ製）、またはBakers Yeast由来（型番G5003-100un、シグマアルドリッチ製）を用いて評価し、ベタインとしては化合物４、５、および６を用いた。化合物４は、最終濃度が７５０ｍＭになるように添加し、化合物５は、最終濃度が２００ｍＭになるように添加した。化合物６は、沈殿を生じないよう最終濃度が５０ｍＭになるように添加した。
【０１４２】
測定条件は実施例１に記載の条件に従って行い、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を測定した結果を図６〜１０に示す。図６は、Saccharomyces由来のα−グルコシダーゼを用い、ベタインとして化合物６を用いた結果を表す。図７は、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用い、ベタインとして化合物６を用いた結果を表す。図８は、Bakers Yeast由来のα−グルコシダーゼを用い、ベタインとして化合物６を用いた結果を表す。図９は、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用い、ベタインとして化合物４を用いた結果を表す。図１０は、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用い、ベタインとして化合物５を用いた結果を表す。
【０１４３】
図６〜８に示す結果から、由来の異なる３種類のα−グルコシダーゼのすべてにおいて、化合物６の添加によって化合物６非存在下と比較して反応速度の上昇が確認された。また、図９および１０に示す結果から、化合物４または５の添加によっても、これらの化合物非存在下と比較して反応速度の上昇が確認された。
【０１４４】
すなわち、これらの結果は、本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって酵素タンパク質の沈殿を生じない場合であれば、添加しない場合と比較して、酵素活性が少なくとも１倍より大きくなることを示している。
【０１４５】
〔試験例３〕
＜α−グルコシダーゼの基質選択性に与える効果＞
α−グルコシダーゼの基質選択性に与えるベタインの添加効果を比較した。α−グルコシダーゼとしては、市販のα−グルコシダーゼ（Bacillus Stearothermophilus由来（型番G351-250un）、シグマアルドリッチ製）を用いた。ベタインとしては化合物６を用いた。基質としては、α−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド（型番325-34671、和光純薬製）、β−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド（型番N0235、東京化成製）、α−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトピラノシド（型番N0492、東京化成製）、およびα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−マンノピラノシド（型番N503995、TRC製）を用いた。
【０１４６】
試験例３では、各基質に対するα−グルコシダーゼの反応速度は、反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解物であるｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０，３７℃）７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて算出した。
【０１４７】
試験例３では、加水分解速度の測定は、実施例１に記載の酵素反応溶液に、記載のα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシドの代わりに、上記の４種類の基質のいずれかを、最終濃度が２ｍＭになるように上記酵素反応溶液に添加した。また、化合物６を、最終濃度が５０ｍＭになるように上記酵素反応溶液に添加した。上述した以外は実施例１に記載の条件に従って行った。化合物６存在下、または非存在下において、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度から算出した反応速度を表３７に示す。
【０１４８】
【表３７】
【０１４９】
α−グルコシダーゼの基質であるα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシドに対するα−グルコシダーゼの反応速度は、化合物６を添加することによって２．５倍に上昇したが、α−グルコシダーゼの基質の類似化合物であるβ−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド、α−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトピラノシド、およびα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−マンノピラノシドに対するα−グルコシダーゼの反応速度は、化合物６を添加することで低下した。
【０１５０】
すなわち、この結果は、本発明にかかる組成物を構成するベタインは、α−グルコシダーゼの基質に対する反応速度のみを上昇させることを示している。つまり、本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって酵素タンパク質の基質選択性（基質特異性）を向上させることができることを示している。
【０１５１】
〔試験例４〕
＜β−グルコシダーゼに与えるベタインの効果＞
α−グルコシダーゼと異なる糖加水分解酵素であるβ−グルコシダーゼに与えるベタインの添加効果を比較した。β−グルコシダーゼとしては、市販のβ−グルコシダーゼ（Almond由来（型番306-50981）、和光純薬製）を用いた。ベタインとしては化合物４、５および６を用いた。基質としてはβ−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド（型番N0235、東京化成製）を用いた。
【０１５２】
β−グルコシダーゼの反応速度は、反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解物であるｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０，３７℃）７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて加水分解速度を算出した。
【０１５３】
試験例４では、測定条件は、酵素反応溶液II（１００ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０），２ｍＭ β−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド，１．３×１０−３ｍｇ／ｍＬ β−グルコシダーゼ）を用いて、３７℃で行った。化合物４〜６のいずれかを、最終濃度５０ｍＭとなるように上記酵素反応溶液IIに添加し、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を測定した。結果を図１１に示す。
【０１５４】
図１１は、化合物４〜６のいずれかを用い、Almond由来のβ−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。図１１に示す結果から、α−グルコシダーゼとは異なる基質を認識して加水分解するβ−グルコシダーゼを用いた場合であっても、本発明にかかる組成物を構成するベタインの添加によって、ベタイン非存在下の場合と比較して反応速度が上昇することが確認された。また、化合物４〜６のいずれのベタインを用いても、反応速度の上昇効果が認められた。
【０１５５】
すなわち、この結果は、本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって、α−グルコシダーゼとは異なる糖加水分解酵素についても、その活性を向上させることができることを示している。
【０１５６】
〔試験例５〕
＜アルカリホスファターゼに与えるベタインの効果＞
糖加水分解酵素以外の加水分解酵素に与えるベタインの添加効果を調べるために、リン酸エスエル加水分解酵素であるアルカリホスファターゼを用いて実験を行った。アルカリホスファターゼとしては、市販のアルカリホスファターゼ（Calf intestine由来（型番308-51041）、和光純薬製）を用いた。ベタインとしては化合物４、５および６を用いた。基質としては、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（型番N22002-5G、アルドリッチ製）を用いた。
【０１５７】
アルカリホスファターゼの反応速度は、反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解物であるｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０， ３７℃）７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて加水分解速度を算出した。
【０１５８】
試験例５では、測定条件は、酵素反応溶液III（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．５），２ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート，１．０×１０−３ｍｇ／ｍＬ アルカリホスファターゼ）を用いて、３７℃で行った。化合物４〜６のいずれかを、最終濃度５０ｍＭとなるように上記酵素反応溶液IIIに添加し、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を測定した。結果を図１２に示す。
【０１５９】
図１２は、化合物４〜６のいずれかを用い、Calf intestine由来のアルカリホスファターゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。図１２に示す結果から、リン酸エステルを加水分解するアルカリホスファターゼを用いた場合であっても、ベタインの添加によって、ベタイン非存在下と比較して反応速度が上昇することが確認された。また、化合物４〜６のいずれのベタインを用いても、反応速度の上昇効果が認められた。
【０１６０】
すなわち、この結果は、本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって、糖加水分解酵素以外の加水分解酵素の活性についても、その活性を向上させることができることを示している。
【０１６１】
〔試験例６〕
＜乳酸脱水素酵素に与えるベタインの効果＞
糖加水分解酵素、リン酸エスエル加水分解酵素等の加水分解酵素以外の酵素に与えるベタインの添加効果を調べるため、酸化還元酵素の１つである乳酸脱水素酵素を用いて実験を行った。乳酸脱水素酵素としては、市販の乳酸脱水素酵素（Chicken heart由来（型番305-51431）、和光純薬製）を用いた。ベタインとしては化合物４、５および６を用いた。基質としては、ピルビン酸（型番162-05553、和光純薬製）を用い、補酵素としてＮＡＤＨ（型番305-50451、和光純薬製）を用いた。
【０１６２】
乳酸脱水素酵素による基質の酸化還元反応速度は、反応時間（分）に対する３４０ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、補酵素であるＮＡＤＨのモル吸光係数（ｐＨ７．５，３７℃）２９７０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて算出した。
【０１６３】
基質であるピルビン酸が酸化還元される際に、補酵素であるＮＡＤＨも等モル消費され、減少する。その結果、ＮＡＤＨ極大吸収波長である３４０ｎｍの吸光度が低下する。このため、ＮＡＤＨのモル吸光係数（ｐＨ７．５，３７℃）２９７０Ｍ−１ｃｍ−１を利用すれば、酸化還元によって消費されたＮＡＤＨの濃度を見積もることができ、反応速度を算出することができる。
【０１６４】
試験例６では、測定条件は、酵素反応溶液IV（８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ衝溶液（ｐＨ７．５），２ｍＭ ピルビン酸，１．５ｍＭ ＮＡＤＨ，１０ｍＭ ＫＣｌ，５．０×１０−５ｍｇ／ｍＬ 乳酸脱水素酵素）を用いて、３７℃で行った。化合物４〜６のいずれかを、最終濃度５０ｍＭとなるように上記酵素反応溶液IVに添加し、反応時間（分）に対して、基質であるピルビン酸の消費と共に減少したＮＡＤＨの濃度を測定した。結果を図１３に示す。
【０１６５】
図１３は、化合物４〜６のいずれかを用い、Chicken heart由来の乳酸脱水素酵素を用いた場合の、反応時間（分）に対して、基質であるピルビン酸の消費と共に減少したＮＡＤＨの濃度を表すグラフである。図１３に示す結果から、酸化還元酵素である乳酸脱水素酵素を用いた場合であっても、ベタインの添加によって、ベタイン非存在下と比較して反応速度が上昇することが確認された。また、化合物４〜６のいずれのベタインを用いても、反応速度の上昇効果が認められた。
【０１６６】
すなわち、この結果は、本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって加水分解酵素以外の酵素の活性についても、その活性を向上させることができることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
上述したように、本発明にかかる組成物を添加するだけで、様々な酵素の酵素活性を向上させることができるという効果を享受できる。
【０１６８】
酵素反応は、生化学、分子生物学等の学術分野のみならず、生産工程において酵素を利用する全ての産業（医薬品産業、食品産業等）において利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性を向上させるための組成物およびその利用に関する。具体的には、例えばα−グルコシダーゼといった加水分解酵素等の各種酵素活性を向上させることができる化合物を含む組成物およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、酵素反応は、反応プロセスの過程で反応速度が頭打ちになる。酵素活性を向上させることができれば、例えば酵素反応の反応速度が向上し、酵素反応産物の生産効率が向上する等の工業的メリットが生じるため重要な課題である。
【０００３】
酵素活性を向上させる方法としては、一般的に酵素タンパク質を構成するアミノ酸を変異させて酵素タンパク質の構造を変化させる方法（部位特異的変異法）、アルコールまたは高分子（例えば、ポリエチレングリコール等）等を酵素反応溶液に添加する方法が知られている。
【０００４】
例えば、非特許文献１から３には、上記部位特異的変異法により酵素活性を向上させる方法が開示されている。
【０００５】
また、非特許文献４には、アルコールを酵素反応溶液に添加することにより酵素活性を向上させる方法が開示されている。さらに、非特許文献５には、ポリエチレングリコールを酵素反応溶液に添加することにより酵素活性を向上させる方法が開示されている。
【０００６】
また、非特許文献６には、高ＮａＣｌ濃度条件下では酵素活性が阻害されるが、グリシンベタインを添加することにより、高ＮａＣｌ濃度条件下での酵素活性の阻害が軽減され、酵素の安定性が向上することが記載されている。
【０００７】
また、非特許文献７には、グリシン添加により酵素の至適ｐＨが上昇すること、および酵素活性が向上することが記載されている。一方、グリシンの代わりにメチルグリシンエステルまたはエチルグリシンエステルを添加したとしても酵素活性向上効果が見られないことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】M. Hashida, B. F. Henrik, Trends Glycosci. Glycotech., 12, 389 (2000).
【非特許文献２】T. A. Kunkel, J. D. Roberts, R. A. Zakour, Methods in Enzymology, 154, 367 (1987).
【非特許文献３】松沢洋著、タンパク質工学の基礎（応用生命科学シリーズ）東京化学同人
【非特許文献４】S. N. Timasheff, Adv. Protein Chem., 51, 355 (1998).
【非特許文献５】K. Hayashi, M. Nakazwa, Y. Ishizaki, N. Hiraoka, A. Obayashi, Nucleic Acids Res., 14, 7817 (1986).
【非特許文献６】A. Pollard and R. G. Wyn Jones, Planta, 144, 291 (1979).
【非特許文献７】V. Vathipadiekal, A. Verma, M. Rao, Biol. Chem., 388, 61 (2007).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記従来の酵素タンパク質を構成するアミノ酸を変異させて酵素タンパク質の構造を変化させる方法では、たとえ酵素タンパク質の立体構造が決定されていたとしても、どのように立体構造を改変すれば酵素活性が向上するかについて予測することは難しいため、酵素活性を効果的に改良することは困難であることは当業者に広く知られている。また、かかる方法は、目的の酵素タンパク質毎にアミノ酸変異を検討する必要があり、非常に手間がかかるという問題を有する。
【００１０】
また、酵素反応溶液にアルコールまたは高分子（例えば、ポリエチレングリコール等）等を酵素反応溶液に添加する方法では、これらの物質の添加により酵素タンパク質の安定性が向上する結果として、酵素活性が向上すると考えられている。かかる方法は、アミノ酸を変異させる方法と比べて簡便且つ汎用性があるが、酵素活性を向上させる効果は低いという問題を有する。従って、さらに酵素活性向上効果に優れた物質が求められている。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便、且つ効果的に酵素活性を向上させる組成物、および当該組成物の利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、特定の構造を有するベタインを酵素反応溶液に添加することにより、酵素活性が顕著に向上することを本発明者らが発見し、本発明を完成させるに至った。ベタインのような比較的低分子の物質を添加して酵素活性を顕著に向上させるという報告はこれまでに無く、またベタインに酵素活性を向上させる効果があるということも一切知られていない。特定の構造を有するベタインに酵素活性を顕著に向上させる効果があるということは、本発明者らが初めて見出し、ここに開示するものである。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１３】
本発明にかかる組成物は、酵素活性を向上させるために用いられる組成物であって、
当該組成物が、以下の一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴としている：
【００１４】
【化１】
【００１５】
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ｒ６はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ａ１は長周期型周期表における５Ｂ族元素、かつ
Ｚ１は−ＣＯＯ、−ＳＯ３、−ＮＯ３、または−ＨＰＯ４を表し、かつ
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ６が炭素数１以上の基である。
【００１６】
また、本発明にかかる組成物は、酵素活性を向上させるために用いられる組成物であって、
当該組成物が、以下の一般式（１’）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴としている：
【００１７】
【化２】
【００１８】
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ｒ６はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ６が炭素数１以上の基である。
【００１９】
また、本発明にかかる組成物は、上記Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、末端に極性官能基を含まない基であることが好ましい。
【００２０】
また、本発明にかかる組成物は、上記酵素は、加水分解酵素であることが好ましい。
【００２１】
本発明にかかる酵素反応キットは、本発明にかかる組成物と対象酵素とを含むことを特徴としている。
【００２２】
本発明にかかる方法は、酵素活性を向上させる方法であって、本発明にかかる組成物を酵素反応系に加える工程を含むことを特徴としている。
【００２３】
なお、上記非特許文献６は、高ＮａＣｌ濃度条件下における酵素の安定性の向上に、グリシンベタインが寄与することを示すに過ぎない。また、非特許文献７はそもそもグリシンに関する文献であり、グリシンベタインをはじめとするベタインに酵素活性を向上させる効果があることを示す文献ではない。また非特許文献７にはグリシンの代わりにメチルグリシンエステルまたはエチルグリシンエステルを添加した場合に酵素活性向上効果が見られないことが記載されているため、当業者であれば、グリシンに類似した物質であっても、僅かな構造の変化により酵素活性向上効果が失われるということを理解する。よって、本発明にかかる組成物は、非特許文献６や非特許文献７の記載に基づいて容易に想到し得るものではない。
【発明の効果】
【００２４】
上記本発明にかかる組成物は、従来用いられるポリエチレングリコール等の添加剤と比較して、非常に優れた酵素活性向上効果を奏するものである。よって、本発明にかかる組成物を用いることによって、簡便、且つ効果的に酵素活性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】各種ベタイン（化合物１〜８）の構造を示す図である。
【図２】各種ベタインの添加によるα−グルコシダーゼの活性比を表すグラフである。
【図３】各種ベタインについて、添加濃度とα−グルコシダーゼ活性に及ぼす効果を表すグラフである。
【図４】高濃度の化合物６存在下におけるα−グルコシダーゼタンパク質の沈殿の有無を示すグラフである。
【図５】分子内に１組の双性イオンを持つベタインの製造スキームを示す図である。
【図６】化合物６を用い、Saccharomyces由来のα−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図７】化合物６を用い、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図８】化合物６を用い、Bakers Yeast由来のα−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図９】化合物４を用い、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図１０】化合物５を用い、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図１１】化合物４〜６のいずれかを用い、Almond由来のβ−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図１２】化合物４〜６のいずれかを用い、Calf intestine由来のアルカリホスファターゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。
【図１３】化合物４〜６のいずれかを用い、Chicken heart由来の乳酸脱水素酵素を用いた場合の、反応時間（分）に対して、基質であるピルビン酸の消費と共に減少したＮＡＤＨの濃度を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りである。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００２７】
＜１．本発明にかかる組成物＞
本発明にかかる組成物は、酵素活性を向上させるために用いられる組成物に関する。ここで「酵素活性を向上させる」対象となる「酵素」としては、特に限定されるものではなく、例えば、加水分解酵素（例えば、グルコシダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、フォスファターゼ等）、核酸合成酵素（例えば、ポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酸化還元酵素（デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ等）、トランスフェラーゼ、リガーゼ等を挙げることができる。後述する実施例では、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および乳酸脱水素酵素について、本発明にかかる組成物の効果（酵素活性を向上させる効果）を示した。実施例の結果から、本発明にかかる組成物による効果は、特定の酵素に対するものに限定されないことが分かる。
【００２８】
また、「酵素活性を向上させる」とは、例えば、本発明にかかる組成物存在下における酵素の反応速度に対する本発明にかかる組成物非存在下における酵素の反応速度の比（以下、「活性比」と称する）が、１より大きくなることを意味する。なお、上記「活性比」は、下記の式（１）を用いて求めることができる。
【００２９】
活性比
＝（組成物存在下の酵素の反応速度）／（組成物非存在下の酵素の反応速度）・・・（１）
なお、上記「酵素の反応速度」とは、基質大過剰の条件下における反応初期速度を示す。
【００３０】
例えば、加水分解酵素であるα−グルコシダーゼの反応速度は、紫外可視分光測定から加水分解をモニターできるα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシドを基質として用い、反応時間（分）に対する３９０ｎｍの波長における吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解産物であるｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０、３７℃）である７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて加水分解速度を算出することができる。
【００３１】
本発明にかかる組成物は、既述の一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含む組成物である。一般式（１）で表される化合物は、その構造から双性イオン化合物であることがわかる。特に記述の一般式（１’）で表される化合物は、ベタインに属することがわかる。なお、一般に「グリシンベタイン＝トリメチルグリシン」のことを単に「ベタイン」と称する場合があるが、本発明の説明においては「グリシンベタイン＝トリメチルグリシン」を「ベタイン」の下位概念であるとして、それぞれを区別する。
【００３２】
酵素反応系が水溶液系の場合、本発明にかかる組成物を構成する双性イオン化合物は、酵素反応溶液中で優先的に水和を起こす。その結果、基質、酵素、補酵素類は溶解体積が減少する、いわゆる排除体積効果が生じ、この排除体積効果によって基質、酵素、補酵素類の分子間での会合が促進し、酵素活性が向上するものと考えられる。また後述する実施例に示したように、本発明にかかる組成物を構成するベタインによれば、酵素の基質特異性を高めることができる。このように酵素の基質特異性を向上させることが、酵素活性の向上につながる一つの要因であると考えられる。
【００３３】
一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択される基である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て同一であっても、異なっていてもよい。また上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。ただし、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の末端には、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸基、リン酸基、アミド基、エポキシ基をはじめとする極性官能基が含まれないことが好ましい。
【００３４】
炭化水素のような疎水性官能基は、水分子と水素結合をするための正に帯電した水素や、非共有電子対を有していない。このような疎水性官能基の周囲に存在する水は、氷殻と呼ばれるネットワーク性の強い水分子のクラスターを形成する（クラスター化する）ことが知られている。
【００３５】
酵素反応系が水溶液系の場合、本発明にかかる組成物を構成する双性イオン化合物は、酵素反応溶液中で優先的に水和を起こす。双性イオン化合物の分子内に疎水性官能基が含まれる場合、双性イオン化合物と水和した水分子が双性イオン化合物の周囲でクラスター化する。このクラスター化した水分子は、溶質が溶解することができる水分子、いわゆるバルク水（自由水）とは異なり、溶質である酵素や基質が溶解することができない。この結果、上述したような「排除体積効果」が生じるものと考えられる。
【００３６】
一方、双性イオン化合物の分子内に水酸基のような極性官能基が含まれる場合、疎水性官能基の周囲に存在する水分子同士の結びつきが変化し、双性イオン化合物の周囲でクラスター化する水分子の数が減少する。この結果、双性イオン化合物の分子内に極性官能基が含まれない場合と比較して、「排除体積効果」が低減されるものと考えられる。従って、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の末端には、極性官能基が含まれないことが好ましい。
【００３７】
また一般式（１）において、Ｒ６はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基である。そして上記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。
【００３８】
また一般式（１）においてＡ１は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）をはじめとする長周期型周期表における５Ｂ族元素を表す。
【００３９】
また一般式（１）において、Ｚ１は−ＣＯＯ、−ＳＯ３、−ＮＯ３、または−ＨＰＯ４を表す。
【００４０】
さらに一般式（１）において下記の（I）または（II）の１つ以上が満たされる。
（I）Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ６が炭素数１以上の基である。
【００４１】
なお、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６の炭素数は、一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体（以下「化合物等」という）が酵素−基質反応を行う反応溶液中に溶解する程度の条件であれば、炭素数の上限は特に限定されるものではない。
【００４２】
本発明にかかる組成物は、上記一般式（１）で表される化合物からなる群から選択される１つ以上の化合物が含まれていればよい。また本発明にかかる組成物には上記一般式（１）で表される化合物の塩、またはそれらの誘導体であってもよい。また２つ以上の化合物等が組成物に含まれる場合の配合比率は特に限定されるものではなく、酵素−基質反応に適した配合比率を適宜検討のうえ、採用すればよい。
【００４３】
なお本発明にかかる組成物に含まれる一般式（１）で表される化合物は、分子内に少なくとも１組以上のカチオンとアニオンとの双性イオンを有する双性イオン化合物（例えばベタイン）であって、（ａ）カチオンとアニオンと間のスペーサー長が少なくともＣ１以上である、および／または（ｂ）アンモニウム基の置換基がＣ２以上である双性イオン化合物（例えばベタイン）であるとも表現できる。
【００４４】
また本発明にかかる組成物は、既述の一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を主成分として含む（５０質量％以上、好ましくは７０質量％以上、最も好ましくは９０質量％以上）ものであればよいが、上記の他、酵素−基質反応の際に好適に使用されている緩衝剤、塩類、補酵素、界面活性剤、タンパク質等が含まれていてもよい。また本発明にかかる組成物は、既述の一般式（１）（または（１’））で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体そのものであってもよい。
【００４５】
上記、緩衝剤としては特に限定されるものではないが、トリス（ＴＲ１Ｓ）、トリジン（ＴＲｌＣ１ＮＥ）、ビスートリシン（ＢｌＳ-ＴＲ１Ｃ１ＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（Ｐ１ＰＥＳ）、キャプス（ＣＡＰＳ）、リン酸、酢酸、ホウ酸、炭酸等が挙げられる。
【００４６】
また上記塩としては特に限定されるものではないが、例えば塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、酢酸リチウム、塩化鉄、硫酸鉄、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、塩化カルシウム等が挙げられる。
【００４７】
また上記補酵素としては特に限定されるものではないが、例えば、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、トパキノン（ＴＰＱ）、リシンチロシルキノン（ＬＴＱ）等のキノン補酵素、チアミン二リン酸（ＴＰＰ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ビオチン、葉酸などのビタミン補酵素、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰＧ）等が挙げられる。
【００４８】
また上記界面活性剤としては特に限定されるものではないが、例えば、ＴＷＥＥＮ、ＴｒｉｔｏｎＸ、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられる。
【００４９】
また上記タンパク質としては特に限定されるものではないが、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、シャペロンタンパク質などが挙げられる。
【００５０】
さらに本発明にかかる組成物には、酵素活性を向上させることが公知である、ＰＥＧ、エタノール、グリセロール、アミノ酸等が、補助成分として含まれていてもよい。
【００５１】
また本発明にかかる組成物の状態は、特に限定されるものではなく、液体であっても、固体の状態であってもよい。
【００５２】
＜２．酵素反応キット＞
上記本発明にかかる組成物を用いて酵素反応キットを構成することができる。本発明にかかる酵素反応キットは、本発明にかかる組成物と対象酵素とを含んでいればよく、これらは別々の容器に充填されていてもよいし、同じ容器に充填されていてもよい。上記酵素反応キットは、本発明にかかる組成物を含んでいるため、上記対象酵素の酵素活性を向上させることができる。
【００５３】
なお、上記「対象酵素」とは、酵素活性を向上させる対象となる酵素を指す。上記「対象酵素」としては、特に限定されるものではなく、例えば、加水分解酵素（例えば、グルコシダーゼ等）、核酸合成酵素（例えば、ポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）等を挙げることができる。
【００５４】
本発明にかかる酵素反応キットには、さらに、既述の緩衝剤、塩類、補酵素、界面活性剤、タンパク質等が含まれていてもよい。
【００５５】
また上記酵素反応キットを構成する成分を格納するための１つ以上の容器（例えば、バイアル、管、アンプル、ビンなど）が含まれていてもよい。
【００５６】
なお、本発明に係る酵素反応キットを構成する「本発明にかかる組成物」は、既述の一般式（１）（または（１’））で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体そのものであってもよい。
【００５７】
＜３．酵素活性を向上させる方法＞
本発明にかかる酵素活性を向上させる方法は、本発明にかかる組成物を酵素反応系に加える工程を含む。なお、上記「酵素反応系」とは、酵素活性を向上させる対象となる酵素（以下、「対象酵素」という）を少なくとも含む系を意味する。なお酵素反応系には、上記対象酵素以外に、例えば、既述の緩衝剤、塩類、補酵素、界面活性剤、タンパク質等の酵素反応に必要なものがさらに含まれていてもよい。上記「酵素反応系」の一例として溶液系である酵素反応溶液を挙げることができるが、本発明はこれに限定されない。なお、上記酵素反応系には、上記対象酵素の基質がさらに含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。上記酵素反応系に対象酵素の基質が含まれていない場合は、上記酵素反応系に対象酵素の基質を加える工程が、本発明にかかる酵素活性を向上させる方法に含まれていてもよい。
【００５８】
例えば、α−グルコシダーゼによる加水分解反応において、α−グルコシダーゼの活性を向上させる場合には、α−グルコシダーゼおよびα−グルコシダーゼの基質を含む酵素反応系に、本発明にかかる組成物を加えればよい。酵素反応の反応条件は、用いられる酵素に応じて適宜設定すればよい。
【００５９】
上記「対象酵素」としては、特に限定されるものではなく、例えば、加水分解酵素（例えば、グルコシダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、フォスファターゼ等）、核酸合成酵素（例えば、ポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酸化還元酵素（デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ等）、トランスフェラーゼ、リガーゼ等を挙げることができる。
【００６０】
上記酵素反応系に含まれていることが好ましい双性イオン化合物（例えばベタイン）またはそれらの塩もしくは誘導体の濃度は、反応に用いられる酵素の種類や濃度、基質の濃度、添加されるベタインの構造によって異なるために特に限定されるものではなく、適宜検討のうえ、採用すればよい。
【００６１】
なお、本発明にかかる酵素活性を向上させる方法において用いられる「本発明にかかる組成物」は、既述の一般式（１）（または（１’））で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体そのものであってもよい。
【００６２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００６４】
＜実施例で用いたベタイン＞
本発明の実施例において用いたベタイン（化合物１〜８）について、化合物１としては、市販のグリシンベタイン（スペーサー長：Ｃ１）（型番023-10862、和光純薬製）を用いた。化合物２〜８は、以下のようにして合成したものを用いた。
【００６５】
〔１．前駆体の合成〕
既述の一般式（１）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３がエチル基で、Ｒ６がメチレン基である分子内に１組の双性イオンを持つベタインの前駆体（２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−酢酸エチルエステル臭化物塩）を、図５に示すスキームに従って合成した。
【００６６】
まず、トリエチルアミン１００ｍｌを酢酸エチル１００ｍｌに溶解させた。この溶液に対してブロモ酢酸エチル（３７．５ｇ）をゆっくりと滴下した。滴下後、この溶液を室温で一晩攪拌した。その後、生成した沈殿を濾別した。得られた沈殿を真空乾燥して、前駆体１（２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−酢酸エチルエステル臭化物塩）を得た（収量５０．２ｇ、収率８６％）。
【００６７】
上記で得られた化合物の同定は、ＩＲ、および１Ｈ ＮＭＲによって行われた。表１にＩＲ解析の結果を、表２に１Ｈ ＮＭＲ解析の結果を示す。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【００７０】
ＩＲ、および１Ｈ ＮＭＲの結果、目的物である２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−酢酸エチルエステル臭化物塩（すなわち、図１における化合物４の前駆体）が合成されたことが確認できた。
【００７１】
図１における化合物２の前駆体を合成した結果を、表３（ＩＲ）および表４（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表３および４によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】
図１における化合物３の前駆体を合成した結果を、表５（ＩＲ）および表６（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表５および６によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００７５】
【表５】
【００７６】
【表６】
【００７７】
図１における化合物５の前駆体を合成した結果を、表７（ＩＲ）および表８（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表７および８によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００７８】
【表７】
【００７９】
【表８】
【００８０】
図１における化合物６の前駆体を合成した結果を、表９（ＩＲ）および表１０（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表９および１０によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００８１】
【表９】
【００８２】
【表１０】
【００８３】
図１における化合物７の前駆体を合成した結果を、表１１（ＩＲ）および表１２（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表１１および１２によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００８４】
【表１１】
【００８５】
【表１２】
【００８６】
図１における化合物８の前駆体を合成した結果を、表１３（ＩＲ）および表１４（１Ｈ ＮＭＲ）に示す。表１３および１４によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００８７】
【表１３】
【００８８】
【表１４】
【００８９】
〔２．ベタインの合成〕
得られた前駆体（２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−酢酸エチルエステル臭化物塩）１．０ｇを蒸留水１０ｍｌに溶解した。この溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：登録商標ＩＲ−４０２、ローム アンド ハース社製）を充填したカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、五酸化二リンの共存下、減圧乾燥し、ベタイン（２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−アセテート）を得た（収量０．５９ｇ、収率１００％）。
【００９０】
上記で得られた化合物の同定は、ＩＲおよび１Ｈ ＮＭＲによるエステルピークの消失確認と、Ｃ、Ｈ、Ｎ元素分析による塩の混入の有無を確認することで行った。表１５にＩＲ解析の結果を、表１６に１Ｈ ＮＭＲ解析の結果を、表１７に元素分析の結果を示す。
【００９１】
【表１５】
【００９２】
【表１６】
【００９３】
【表１７】
【００９４】
表１５〜１７の結果、目的物である２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム）−アセテート（すなわち、図１における化合物４）が得られたことが確認された。
【００９５】
図１における化合物２を合成した結果を、表１８（ＩＲ）、表１９（１Ｈ ＮＭＲ）、および表２０（元素分析）に示す。表１８〜２０によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【００９６】
【表１８】
【００９７】
【表１９】
【００９８】
【表２０】
【００９９】
図１における化合物３を合成した結果を、表２１（ＩＲ）、表２２（1Ｈ ＮＭＲ）、および表２３（元素分析）に示す。表２１〜２３によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１００】
【表２１】
【０１０１】
【表２２】
【０１０２】
【表２３】
【０１０３】
図１における化合物５を合成した結果を、表２４（ＩＲ）、表２５（1Ｈ ＮＭＲ）、および表２６（元素分析）に示す。表２４〜２６によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１０４】
【表２４】
【０１０５】
【表２５】
【０１０６】
【表２６】
【０１０７】
図１における化合物６を合成した結果を、表２７（ＩＲ）、表２８（1Ｈ ＮＭＲ）、および表２９（元素分析）に示す。表２７〜２９によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１０８】
【表２７】
【０１０９】
【表２８】
【０１１０】
【表２９】
【０１１１】
図１における化合物７を合成した結果を、表３０（ＩＲ）、表３１（1Ｈ ＮＭＲ）、および表３２（元素分析）に示す。表３０〜３２によれば目的とする化合物が合成されたことが確認できた。
【０１１２】
【表３０】
【０１１３】
【表３１】
【０１１４】
【表３２】
【０１１５】
図１における化合物８を合成した結果を、表３３（ＩＲ）、表３４（1Ｈ ＮＭＲ）、および表３５（元素分析）に示す。表３３〜３５によれば目的とする化合物が合成されたことが確認できた。
【０１１６】
【表３３】
【０１１７】
【表３４】
【０１１８】
【表３５】
【０１１９】
〔実施例１〕
＜α−グルコシダーゼの加水分解速度に及ぼすベタイン添加の効果＞
得られた各種ベタイン（化合物１〜８）の添加による酵素活性向上効果を評価、検討するため、ベタイン存在下でのα−グルコシダーゼの加水分解速度を測定した。α−グルコシダーゼ（Saccharomyces由来）（型番076-02841、和光純薬製）の基質としては、紫外可視分光測定から加水分解をモニターできるα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド（型番325-34671、和光純薬製）を用いた。
【０１２０】
基質であるα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシドは３５０ｎｍに極大吸収波長を持つが、α−グルコシダーゼによってグルコースとｐ−ニトロフェノールに加水分解されると、ｐＨ７．０においてはｐ−ニトロフェノールは水酸基のプロトンが解離してｐ−ニトロフェノラートとなる。結果として、極大吸収波長は長波へシフトし、４００ｎｍ近傍の吸光度が上昇する。４０５ｎｍのｐ−ニトロフェノラートのモル吸光係数（ｐＨ７．０、３７℃）である７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を利用すれば、加水分解によって生成するｐ−ニトロフェノールの濃度を見積もることができ、反応速度を算出することができる。ここで４０５ｎｍを使用したのはマイクロプレートリーダーのフィルターの関係である。
【０１２１】
加水分解速度の測定は、酵素反応溶液（１００ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０），２ｍＭ α−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド，２．５×１０−５ｍｇ／ｍＬ α−グルコシダーゼ）を用いて、３７℃で行った。ベタインは、最終濃度５０ｍＭとなるように上記酵素反応溶液に添加した。
【０１２２】
α−グルコシダーゼの反応速度は反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解産物であるｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０、３７℃）７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて加水分解速度を算出した。
【０１２３】
また、酵素活性の誤差を最小限とするため、ベタイン添加による効果は活性比で表した。当該「活性比」とは、〔発明を実施するための形態〕の＜１．本発明にかかる組成物＞で上述したように、本発明にかかる組成物存在下における酵素の反応速度に対する本発明にかかる組成物非存在下における酵素の反応速度の比を指す。
【０１２４】
結果を図２に示す。図２は、各種ベタインを最終濃度５０ｍＭとなるように酵素反応溶液に添加した場合の活性比を表すグラフである。化合物１〜８のいずれのベタインを添加した場合も、活性比は１を上回った。これは、ベタインを添加しなかった場合のα−グルコシダーゼ活性と比較して、ベタインを添加した場合のα−グルコシダーゼ活性が上昇したことを表している。特に、化合物６では活性比は８．７、化合物８では活性比は７．９と、ベタイン添加の効果が顕著であった。
【０１２５】
一方、後述する比較例１に示すように、酵素活性を向上することが報告されているエタノール（非特許文献４を参照）では活性比は１．０、グリセロール（非特許文献４を参照）では活性比は０．９、ポリエチレングリコール（非特許文献５を参照）では活性比は０．１と、これらの物質を添加することによる酵素活性向上効果はほとんど確認できなかった。
【０１２６】
〔比較例１〕
酵素活性を向上させるために一般的に用いられるエタノール、グリセロール、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平均分子量６，０００）をベタインの代わりに最終濃度５０ｍＭとなるように酵素反応溶液に添加した以外は、実施例１と同様の方法によりα−グルコシダーゼ活性を測定し、活性比を求めた。
【０１２７】
〔試験例１〕
＜ベタインの濃度の与える効果＞
添加するベタインの最適濃度を調べるために、ベタインの濃度を変化させたときの活性比を測定した。一例として、化合物１、化合物２、および化合物６の結果を図３に示す。
【０１２８】
図３には化合物１、化合物２、および化合物６の濃度変化による活性比の変化が示されている。
【０１２９】
化合物２を最終濃度５０ｍＭで添加した場合の活性比は３．３であったが、添加する化合物２の濃度が上昇すると加水分解速度は濃度依存的に上昇し、最終濃度１．０Ｍで添加した場合の活性比は９．５であった。
【０１３０】
また、化合物６は最終濃度５０ｍＭで添加すると顕著な効果を示したが、最終濃度０．５Ｍ以上の濃度では活性比が低下した。
【０１３１】
化合物６に関し、活性の低下は酵素（α−グルコシダーゼ）の沈殿によるものと推察されたため、基質非存在下で酵素溶液の濁度測定を行った。
【０１３２】
一方、化合物１は最終濃度５０ｍＭの添加で活性比の上昇が飽和挙動を示し、活性比２以上となるような酵素活性向上効果はもたらさないことが明らかとなった。これにより、化合物２〜８のベタインは、天然のベタインである化合物１と比較しても明らかな効果があることが確認された。
【０１３３】
また、図４は、高濃度の化合物６存在下におけるα−グルコシダーゼタンパク質の沈殿の有無を示すグラフである。α−グルコシダーゼタンパク質の沈殿の有無は、沈殿の生成によって生じた粒子の起こす光散乱を検出する方法（濁度測定）により評価した。
【０１３４】
具体的に説明すると、本発明にかかる組成物には５００ｎｍに吸収帯を持つ分子は含まれておらず、沈殿を生じない溶液では光はすべて透過するため、吸光度はゼロとなる。一方、沈殿が生じた場合は光の散乱が生じ、吸光度はゼロよりも大きな値を示す。したがって、沈殿生成による光の散乱に伴う５００ｎｍの吸光度変化を測定すれば、α−グルコシダーゼタンパク質の沈殿の有無を評価することができる。ただし、散乱強度は粒子の大きさ等にも依存するため、５００ｎｍの吸光度の強度と沈殿量とには相関はない。
【０１３５】
化合物６を最終濃度が０．５Ｍ以上添加すると活性比が低下したが、これは、図４に示すように酵素を沈殿させることが原因であることが判明した。化合物６に関しては、低濃度領域（１ｍＭ〜０．３Ｍ）において高い活性向上効果が確認されており、この結果は本発明を制限するものではない。
【０１３６】
試験例１の結果に従って、実施例１で用いた各種ベタインの使用濃度範囲と最大効果を表３６に示した。
【０１３７】
【表３６】
【０１３８】
化合物１、化合物２、および化合物３は、ベタインのカチオンとアニオンとの距離をスペーサーによって変化させたものであるが、スペーサー長が長くなれば酵素活性向上効果は高いことが明らかになった。
【０１３９】
化合物４、化合物５、および化合物６は、アルキル鎖長を長くすることによって、カチオンであるアンモニウム基の嵩高さを変えたものであるが、アンモニウム基が嵩高くなるほど酵素活性向上効果は高いことが明らかになった。また、ベタインの添加量が低濃度であっても酵素活性向上効果があらわれることが明らかになった。しかし、化合物５、化合物６に関しては高濃度での使用は酵素を沈殿させるため、使用に際しては濃度範囲の調節が必要となることが明らかになった。
【０１４０】
化合物７、化合物８は、アンモニウム基の嵩高さは同じであるが、アンモニウム基に導入される官能基を疎水性から親水性に変えたものである。アンモニウム基に導入される官能基が疎水性である化合物８の方が、親水性官能基が導入された化合物７よりもその酵素活性向上効果が高いことが明らかになった。
【０１４１】
〔試験例２〕
＜各種α−グルコシダーゼに与えるベタインの効果＞
種々のα−グルコシダーゼに与えるベタインの添加効果を比較した。α−グルコシダーゼとしては、市販の３種類のα−グルコシダーゼ（Saccharomyces由来（型番076-02841、和光純薬製）、Bacillus Stearothermophilus由来（型番G3651-250un、シグマアルドリッチ製）、またはBakers Yeast由来（型番G5003-100un、シグマアルドリッチ製）を用いて評価し、ベタインとしては化合物４、５、および６を用いた。化合物４は、最終濃度が７５０ｍＭになるように添加し、化合物５は、最終濃度が２００ｍＭになるように添加した。化合物６は、沈殿を生じないよう最終濃度が５０ｍＭになるように添加した。
【０１４２】
測定条件は実施例１に記載の条件に従って行い、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を測定した結果を図６〜１０に示す。図６は、Saccharomyces由来のα−グルコシダーゼを用い、ベタインとして化合物６を用いた結果を表す。図７は、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用い、ベタインとして化合物６を用いた結果を表す。図８は、Bakers Yeast由来のα−グルコシダーゼを用い、ベタインとして化合物６を用いた結果を表す。図９は、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用い、ベタインとして化合物４を用いた結果を表す。図１０は、Bacillus Stearothermophilus由来のα−グルコシダーゼを用い、ベタインとして化合物５を用いた結果を表す。
【０１４３】
図６〜８に示す結果から、由来の異なる３種類のα−グルコシダーゼのすべてにおいて、化合物６の添加によって化合物６非存在下と比較して反応速度の上昇が確認された。また、図９および１０に示す結果から、化合物４または５の添加によっても、これらの化合物非存在下と比較して反応速度の上昇が確認された。
【０１４４】
すなわち、これらの結果は、本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって酵素タンパク質の沈殿を生じない場合であれば、添加しない場合と比較して、酵素活性が少なくとも１倍より大きくなることを示している。
【０１４５】
〔試験例３〕
＜α−グルコシダーゼの基質選択性に与える効果＞
α−グルコシダーゼの基質選択性に与えるベタインの添加効果を比較した。α−グルコシダーゼとしては、市販のα−グルコシダーゼ（Bacillus Stearothermophilus由来（型番G351-250un）、シグマアルドリッチ製）を用いた。ベタインとしては化合物６を用いた。基質としては、α−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド（型番325-34671、和光純薬製）、β−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド（型番N0235、東京化成製）、α−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトピラノシド（型番N0492、東京化成製）、およびα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−マンノピラノシド（型番N503995、TRC製）を用いた。
【０１４６】
試験例３では、各基質に対するα−グルコシダーゼの反応速度は、反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解物であるｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０，３７℃）７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて算出した。
【０１４７】
試験例３では、加水分解速度の測定は、実施例１に記載の酵素反応溶液に、記載のα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシドの代わりに、上記の４種類の基質のいずれかを、最終濃度が２ｍＭになるように上記酵素反応溶液に添加した。また、化合物６を、最終濃度が５０ｍＭになるように上記酵素反応溶液に添加した。上述した以外は実施例１に記載の条件に従って行った。化合物６存在下、または非存在下において、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度から算出した反応速度を表３７に示す。
【０１４８】
【表３７】
【０１４９】
α−グルコシダーゼの基質であるα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシドに対するα−グルコシダーゼの反応速度は、化合物６を添加することによって２．５倍に上昇したが、α−グルコシダーゼの基質の類似化合物であるβ−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド、α−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトピラノシド、およびα−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−マンノピラノシドに対するα−グルコシダーゼの反応速度は、化合物６を添加することで低下した。
【０１５０】
すなわち、この結果は、本発明にかかる組成物を構成するベタインは、α−グルコシダーゼの基質に対する反応速度のみを上昇させることを示している。つまり、本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって酵素タンパク質の基質選択性（基質特異性）を向上させることができることを示している。
【０１５１】
〔試験例４〕
＜β−グルコシダーゼに与えるベタインの効果＞
α−グルコシダーゼと異なる糖加水分解酵素であるβ−グルコシダーゼに与えるベタインの添加効果を比較した。β−グルコシダーゼとしては、市販のβ−グルコシダーゼ（Almond由来（型番306-50981）、和光純薬製）を用いた。ベタインとしては化合物４、５および６を用いた。基質としてはβ−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド（型番N0235、東京化成製）を用いた。
【０１５２】
β−グルコシダーゼの反応速度は、反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解物であるｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０，３７℃）７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて加水分解速度を算出した。
【０１５３】
試験例４では、測定条件は、酵素反応溶液II（１００ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０），２ｍＭ β−ｐ−ニトロフェニル−Ｄ−グルコピラノシド，１．３×１０−３ｍｇ／ｍＬ β−グルコシダーゼ）を用いて、３７℃で行った。化合物４〜６のいずれかを、最終濃度５０ｍＭとなるように上記酵素反応溶液IIに添加し、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を測定した。結果を図１１に示す。
【０１５４】
図１１は、化合物４〜６のいずれかを用い、Almond由来のβ−グルコシダーゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。図１１に示す結果から、α−グルコシダーゼとは異なる基質を認識して加水分解するβ−グルコシダーゼを用いた場合であっても、本発明にかかる組成物を構成するベタインの添加によって、ベタイン非存在下の場合と比較して反応速度が上昇することが確認された。また、化合物４〜６のいずれのベタインを用いても、反応速度の上昇効果が認められた。
【０１５５】
すなわち、この結果は、本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって、α−グルコシダーゼとは異なる糖加水分解酵素についても、その活性を向上させることができることを示している。
【０１５６】
〔試験例５〕
＜アルカリホスファターゼに与えるベタインの効果＞
糖加水分解酵素以外の加水分解酵素に与えるベタインの添加効果を調べるために、リン酸エスエル加水分解酵素であるアルカリホスファターゼを用いて実験を行った。アルカリホスファターゼとしては、市販のアルカリホスファターゼ（Calf intestine由来（型番308-51041）、和光純薬製）を用いた。ベタインとしては化合物４、５および６を用いた。基質としては、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（型番N22002-5G、アルドリッチ製）を用いた。
【０１５７】
アルカリホスファターゼの反応速度は、反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解物であるｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０， ３７℃）７６６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて加水分解速度を算出した。
【０１５８】
試験例５では、測定条件は、酵素反応溶液III（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．５），２ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート，１．０×１０−３ｍｇ／ｍＬ アルカリホスファターゼ）を用いて、３７℃で行った。化合物４〜６のいずれかを、最終濃度５０ｍＭとなるように上記酵素反応溶液IIIに添加し、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を測定した。結果を図１２に示す。
【０１５９】
図１２は、化合物４〜６のいずれかを用い、Calf intestine由来のアルカリホスファターゼを用いた場合の、反応時間（分）に対して産生されたｐ−ニトロフェノールの濃度を表すグラフである。図１２に示す結果から、リン酸エステルを加水分解するアルカリホスファターゼを用いた場合であっても、ベタインの添加によって、ベタイン非存在下と比較して反応速度が上昇することが確認された。また、化合物４〜６のいずれのベタインを用いても、反応速度の上昇効果が認められた。
【０１６０】
すなわち、この結果は、本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって、糖加水分解酵素以外の加水分解酵素の活性についても、その活性を向上させることができることを示している。
【０１６１】
〔試験例６〕
＜乳酸脱水素酵素に与えるベタインの効果＞
糖加水分解酵素、リン酸エスエル加水分解酵素等の加水分解酵素以外の酵素に与えるベタインの添加効果を調べるため、酸化還元酵素の１つである乳酸脱水素酵素を用いて実験を行った。乳酸脱水素酵素としては、市販の乳酸脱水素酵素（Chicken heart由来（型番305-51431）、和光純薬製）を用いた。ベタインとしては化合物４、５および６を用いた。基質としては、ピルビン酸（型番162-05553、和光純薬製）を用い、補酵素としてＮＡＤＨ（型番305-50451、和光純薬製）を用いた。
【０１６２】
乳酸脱水素酵素による基質の酸化還元反応速度は、反応時間（分）に対する３４０ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、補酵素であるＮＡＤＨのモル吸光係数（ｐＨ７．５，３７℃）２９７０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて算出した。
【０１６３】
基質であるピルビン酸が酸化還元される際に、補酵素であるＮＡＤＨも等モル消費され、減少する。その結果、ＮＡＤＨ極大吸収波長である３４０ｎｍの吸光度が低下する。このため、ＮＡＤＨのモル吸光係数（ｐＨ７．５，３７℃）２９７０Ｍ−１ｃｍ−１を利用すれば、酸化還元によって消費されたＮＡＤＨの濃度を見積もることができ、反応速度を算出することができる。
【０１６４】
試験例６では、測定条件は、酵素反応溶液IV（８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ衝溶液（ｐＨ７．５），２ｍＭ ピルビン酸，１．５ｍＭ ＮＡＤＨ，１０ｍＭ ＫＣｌ，５．０×１０−５ｍｇ／ｍＬ 乳酸脱水素酵素）を用いて、３７℃で行った。化合物４〜６のいずれかを、最終濃度５０ｍＭとなるように上記酵素反応溶液IVに添加し、反応時間（分）に対して、基質であるピルビン酸の消費と共に減少したＮＡＤＨの濃度を測定した。結果を図１３に示す。
【０１６５】
図１３は、化合物４〜６のいずれかを用い、Chicken heart由来の乳酸脱水素酵素を用いた場合の、反応時間（分）に対して、基質であるピルビン酸の消費と共に減少したＮＡＤＨの濃度を表すグラフである。図１３に示す結果から、酸化還元酵素である乳酸脱水素酵素を用いた場合であっても、ベタインの添加によって、ベタイン非存在下と比較して反応速度が上昇することが確認された。また、化合物４〜６のいずれのベタインを用いても、反応速度の上昇効果が認められた。
【０１６６】
すなわち、この結果は、本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって加水分解酵素以外の酵素の活性についても、その活性を向上させることができることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
上述したように、本発明にかかる組成物を添加するだけで、様々な酵素の酵素活性を向上させることができるという効果を享受できる。
【０１６８】
酵素反応は、生化学、分子生物学等の学術分野のみならず、生産工程において酵素を利用する全ての産業（医薬品産業、食品産業等）において利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素活性を向上させるために用いられる組成物であって、
当該組成物が、以下の一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴とする組成物：
【化１】
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ｒ６はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ａ１は長周期型周期表における５Ｂ族元素、かつ
Ｚ１は−ＣＯＯ、−ＳＯ３、−ＮＯ３、または−ＨＰＯ４を表し、かつ
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ６が炭素数１以上の基である。
【請求項２】
酵素活性を向上させるために用いられる組成物であって、
当該組成物が、以下の一般式（１’）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴とする組成物：
【化２】
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ｒ６はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ６が炭素数１以上の基である。
【請求項３】
上記Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、末端に極性官能基を含まない基であることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
上記酵素は、加水分解酵素であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物と対象酵素とを含むことを特徴とする酵素反応キット。
【請求項６】
酵素活性を向上させる方法であって、
請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物を、酵素反応系に加える工程を含むことを特徴とする当該方法。
【請求項１】
酵素活性を向上させるために用いられる組成物であって、
当該組成物が、以下の一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴とする組成物：
【化１】
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ｒ６はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ａ１は長周期型周期表における５Ｂ族元素、かつ
Ｚ１は−ＣＯＯ、−ＳＯ３、−ＮＯ３、または−ＨＰＯ４を表し、かつ
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ６が炭素数１以上の基である。
【請求項２】
酵素活性を向上させるために用いられる組成物であって、
当該組成物が、以下の一般式（１’）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴とする組成物：
【化２】
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
Ｒ６はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ６が炭素数１以上の基である。
【請求項３】
上記Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、末端に極性官能基を含まない基であることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
上記酵素は、加水分解酵素であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物と対象酵素とを含むことを特徴とする酵素反応キット。
【請求項６】
酵素活性を向上させる方法であって、
請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物を、酵素反応系に加える工程を含むことを特徴とする当該方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１０−２２０６０７（Ｐ２０１０−２２０６０７Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９８６（Ｐ２０１０−１９８６）
【出願日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（３９７０２２９１１）学校法人甲南学園 (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（３９７０２２９１１）学校法人甲南学園 (18)
【Ｆターム（参考）】
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