酸化型アルブミン低下剤
【課題】酸化型アルブミンの割合を低下させる薬剤等の提供。
【解決手段】イソロイシン、ロイシン、およびバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下剤,および血清アルブミン機能改善剤,あるいは生体内酸化還元状態改善剤。
【解決手段】イソロイシン、ロイシン、およびバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下剤,および血清アルブミン機能改善剤,あるいは生体内酸化還元状態改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内における酸化型アルブミンの割合を低下させる薬剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清アルブミンは生体内で最も多く存在する単純蛋白質であり、血漿膠質浸透圧の維持、種々の内因性・外因性物質の結合・輸送およびアミノ酸の供給源という３つの生理機能を有する。血清アルブミンが輸送する物質としては、トリプトファン、尿酸、グルタチオン、ＡＴＰ、ビリルビン、サイロキシンやテストステロンなどのホルモン、銅や亜鉛などの金属イオン、ビタミンＢ６やビタミンＣなどのビタミン、パルミチン酸やオレイン酸などの脂肪酸、抗生物質やアスピリンなどの薬剤などが幅広く知られている（渡邊明治編 臨床アルブミン学 （株）メディカルレビュー社）。
【０００３】
血清アルブミンは、Ｎ末端から３４番目に存在するシステイン残基のＳＨ基が遊離の状態の還元型アルブミンと血中のシステインやグルタチオンなどとジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合した状態の酸化型アルブミンとの混合物として存在している。正常ヒト血清では還元型が約７５％、酸化型が約２５％の割合で存在するが、肝硬変患者（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ａ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ２０：３５１，２００４）、慢性腎不全患者、糖尿病患者や麻酔・手術時の患者では酸化型アルブミンの割合が増加していると報告されている（恵良聖一 臨床検査 ４８：５０１−５１１，２００４）。
【０００４】
酸化型アルブミンの増加は、生体内の酸化還元状態に関係することや、物質の結合・輸送に影響するものと推測されてはいるが、その病態意義については明らかにされていない。また、血液透析によって慢性腎不全患者の酸化型アルブミンが低下して還元型アルブミンが増加するとの報告（Ｓｏｇａｍｉ，Ｍ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ２５：３９８，１９８５）はあるものの、酸化型アルブミンを低下させ還元型アルブミンを増加させるような薬剤や食品成分については全く知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、酸化型アルブミンの病態意義を明らかにして、増加した酸化型アルブミン量の割合を低下させる薬剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸に増加した酸化型アルブミン量を低下させる作用、酸化型／還元型アルブミン比を改善する作用、血清アルブミン機能を改善する作用および生体内酸化還元状態を改善する作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって本発明は、以下の項目を包含する。
【０００７】
（１）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下剤。
（２）イソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下剤。
（３）イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１〜３：０．５〜２．０であることを特徴とする、上記（２）に記載の酸化型アルブミン低下剤。
（４）イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１．５〜２．５：０．８〜１．５であることを特徴とする、上記（２）に記載の酸化型アルブミン低下剤。
（５）成人１日あたりの分岐鎖アミノ酸の投与量が全量で、１ｇ〜５０ｇである、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の酸化型アルブミン低下剤。
（６）成人１日あたりの分岐鎖アミノ酸の投与量が全量で、３ｇ〜３０ｇである、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の酸化型アルブミン低下剤。
（７）肝硬変、慢性腎不全、糖尿病、及び麻酔・手術時の患者から選ばれる少なくとも１種の患者用である、上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の酸化型アルブミン低下剤。
（８）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型／還元型アルブミン比改善剤。
（９）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する血清アルブミン機能改善剤。
（１０）血清アルブミン機能が、トリプトファン結合能、ビリルビン結合能、脂肪酸結合能から選ばれる少なくとも１種である、上記（９）に記載の血清アルブミン機能改善剤。
【０００８】
（１１）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する生体内酸化還元状態改善剤。
（１２）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する飲食品において、酸化型アルブミン低下作用を有する旨を表示することを特徴とする飲食品。
（１３）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する飲食品において、生体内酸化還元状態改善作用を有する旨を表示することを特徴とする飲食品。
（１４）有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、酸化型アルブミンの低下方法。
（１５）有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、酸化型／還元型アルブミン比の改善方法。
（１６）有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、血清アルブミン機能の改善方法。
（１７）有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、生体内酸化還元状態の改善方法。
（１８）酸化型アルブミン低下剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（１９）酸化型／還元型アルブミン比改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（２０）血清アルブミン機能改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（２１）生体内酸化還元状態改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【０００９】
（２２）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、酸化型アルブミンの低下に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
（２３）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、酸化型／還元型アルブミン比の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
（２４）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、血清アルブミン機能の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
（２５）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、生体内酸化還元状態の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
（２６）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下用組成物。
（２７）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型／還元型アルブミン比改善用組成物。
（２８）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する血清アルブミン機能改善用組成物。
（２９）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する生体内酸化還元状態改善用組成物。
【００１０】
本発明により提供される、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する薬剤及び飲食品は、酸化型アルブミンを低下させる効果、酸化型／還元型アルブミン比を改善する効果、血清アルブミン機能を改善する効果および生体内酸化還元状態を改善する効果があるため、酸化型アルブミンが増加することによって引き起こされる種々の疾患や弊害を改善できるため有用である。また、本発明の酸化型アルブミン低下剤は、アミノ酸を有効成分とすることから、安全性が高く、副作用がほとんどないため、医薬品及び飲食品として有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図１は、実施例１における酸化型アルブミン比の推移を示すグラフである。
図２は、実施例２における酸化型アルブミン比を示す図である。
図３は、実施例２におけるＬ−トリプトファン結合率を示す図である。
図４は、実施例３における各アルブミンの発生ラジカル強度を示すチャートである。
図５は、実施例３における、酸化型アルブミン比に対するラジカル強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明の実施の形態について説明する。
本発明における「酸化型アルブミン低下剤」とは、血清アルブミンの還元型：酸化型の存在比において、疾患やその他の要因により増加した酸化型アルブミンの割合を低下させる薬剤のことである。すなわち、正常時の生体内における酸化型アルブミンと還元型アルブミンとの存在割合は、ほぼ前者が２５％、後者が７５％であるところ、本発明の薬剤は酸化型アルブミンが増量した状態を正常の割合に、より具体的には２５％に、あるいは２５％に近づく方向に低下させる働きを有する。
【００１３】
本発明の酸化型アルブミン低下剤は、生体内における酸化型アルブミンの割合が増加している患者に有用である。具体的には、肝硬変、慢性腎不全、糖尿病、および麻酔・手術時の患者などに対して有用である。
【００１４】
また、本発明の酸化型アルブミン低下剤は、酸化型／還元型アルブミン比改善剤、血清アルブミン機能改善剤、および生体内酸化還元状態改善剤として使用されうる。
【００１５】
ここで、酸化型／還元型アルブミン比とは、生体内における血清アルブミンの酸化型と還元型の比率のことをさし、正常時、この値は約２．５：７．５であるとされている。肝疾患、糖尿病、甲状腺疾患、ネフローゼ症候群、腎不全、加齢などにより酸化型が増加するとこの比率は変動する。すなわち、酸化型／還元型アルブミン比改善とは、これらの比率を正常時の比率に改善する、またはそれに近づけることをいう。
【００１６】
血清アルブミン機能改善とは、血清アルブミンの有するトリプトファン結合能、ビリルビン結合能、脂肪酸結合能のうち少なくとも１つの機能を高めることである。
【００１７】
血清アルブミンのトリプトファン結合率は９０％以上であるのが正常とされており、これが著しく低下すると血液中に血清タンパク質非結合型で存在するトリプトファン濃度が上昇し、脳内でセロトニンへの変換速度が速まる。これに起因して易疲労感や脳症がもたらされる。
【００１８】
血清アルブミンのビリルビン結合率は通常９９％以上であるのが正常とされており、血中の非抱合型（間接）ビリルビンの肝臓への運搬を担っている。この数値が低下すると遊離型のビリルビン濃度が上昇し、脳内に移行し神経毒性を呈する。
【００１９】
また、血清アルブミンのパルミチン酸やオレイン酸などの脂肪酸結合率は通常９９％以上であるのが正常とされており、この数値が低下すると血中の遊離脂肪酸濃度が高まり、溶血などの毒性が現れる。
【００２０】
すなわち、血清アルブミン機能改善とは、これらの数値を正常時の値に改善すること、またはそれに近づけることをいう。
【００２１】
生体内酸化還元状態とは生体内の酸化反応と抗酸化反応（すなわち還元反応）のバランス状態のことである。種々の病態においてこのバランスが破綻し酸化傾向に傾いた結果、活性酸素やフリーラジカルなどの活性酸素種の発生を介する酸化ストレスが生じ、細胞や組織に障害を引き起こす。したがって生体内酸化還元状態改善とは、抗酸化防御機構を活性化させて過剰な酸化ストレスを消去し、正常な状態に戻すこと、又はそれに近づけることをいう。
【００２２】
本発明の有効成分（分岐鎖アミノ酸）である、イソロイシン、ロイシンおよびバリンはそれぞれＬ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体いずれも使用可能である。またイソロイシン、ロイシンおよびバリンはそれぞれ、遊離体のみならず、塩、水和物の形態でも使用することができる。
【００２３】
塩の形態には酸付加塩や塩基との塩等を挙げることもでき、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの医薬品又は飲食品として許容される塩を選択することが好ましい。イソロイシン、ロイシンおよびバリンにそれぞれ付加して医薬品又は飲食品として許容される塩を形成する酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸塩等の無機塩、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸又はモノメチル硫酸等の有機塩が挙げられる。イソロイシン、ロイシンおよびバリンの医薬品又は飲食品として許容される塩基との塩の例としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物あるいは炭酸化物や、アンモニア等の無機の塩基との塩、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機の塩基との塩が挙げられる。上記塩は水和物（含水塩）であってもよい。
【００２４】
また、水和物としては、例えば１〜６水和物などが挙げられる。これらの塩、水和物も本発明の権利に包含されるものである。
【００２５】
本発明の酸化型アルブミン低下剤は、イソロイシン、ロイシン、バリンのいずれか１種以上が分岐鎖アミノ酸として含有されていれば良いが、イソロイシン、ロイシン、バリン全てが含有されていることが好ましい。より好ましくは、イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１〜３：０．５〜２．０である。さらに好ましくは、イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１．５〜２．５：０．８〜１．５である。最も好ましい重量比は１：２：１．２である。本発明薬剤の投与方法は、経口投与、または点滴投与、注射投与（経静脈投与）等の非経口投与（摂取）でも良く、特に限定しないが、有効成分がアミノ酸であることから経口投与であることが好ましい。
【００２６】
本発明の酸化型アルブミン低下剤を経口投与する場合の投与量（摂取量）は、投与する患者の症状、年齢、投与方法によって異なるが、通常、１人あたり１日、イソロイシン１〜３０ｇ、ロイシン１〜３０ｇ、バリン１〜３０ｇである。一般の成人の場合、好ましくは１人あたり１日、イソロイシン２〜１０ｇ、ロイシン２〜１０ｇ、バリン２〜１０ｇ、より好ましくは、イソロイシン２．５〜３ｇ、ロイシン５〜６ｇ、バリン３〜４ｇである。イソロイシン、ロイシン、バリン全てが含有されている場合は、成人１日あたりの投与量が全量で、１ｇ〜５０ｇであることが好ましい。より好ましくは成人１日あたりの投与量が全量で、３〜３０ｇである。さらに好ましくは４〜２５ｇである。
【００２７】
一方、点滴投与、注射投与（経静脈投与）等、非経口投与（摂取）することも可能であり、その場合の投与量については、前記経口投与についての好ましい投与量（摂取量）範囲の１０〜２０分の１程度を投与することができる。
【００２８】
経口投与剤としては、顆粒剤、細粒剤、錠剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、液剤、懸濁剤など、また注射剤としては静脈直接注入用、点滴投与用などの医薬製剤一般の剤形を採用することができる。
【００２９】
本発明の分岐鎖アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれが単独で、若しくは任意の２つの組み合わせで製剤化されてもよく、又は全てを含有する単一製剤としてもよい。別々に製剤化して投与する場合、それらの投与経路、投与剤形は同一であっても異なっていてもよく、また各々を投与するタイミングも、同時であっても別々であってもよい。併用する薬剤の種類や効果によって適宜決定する。
【００３０】
本発明において、「重量比」とは製剤中のそれぞれの成分の重量比を示す。例えばイソロイシン、ロイシン及びバリンの各分岐鎖アミノ酸が１つの製剤中に含まれる場合には個々の含有量の比であり、各分岐鎖アミノ酸のそれぞれが単独で又は任意の２つの組み合わせで複数製剤中に含まれる場合には、各製剤に含まれる各分岐鎖アミノ酸の重量の比である。なお、本明細書中において各アミノ酸の重量は、遊離アミノ酸としてのものである。
【００３１】
本発明の酸化型アルブミン低下剤は常法により製剤化することができる。製剤上の必要に応じて、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、でんぷん、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、ゼラチン等の担体や、溶剤、溶解補助剤、等張化剤等の通常の添加剤を適宜配合することができる。
【００３２】
本発明の酸化型アルブミン低下剤は、特に医薬品又は飲食品（健康食品、栄養補助食品等を含む）として使用することができる。有効成分がアミノ酸であるため、安全性に優れており、飲食品の形態でも簡便に使用することができる。またこのような飲食品を保健機能食品として提供することも可能であり、この保健機能食品には、酸化型アルブミン低下作用を有する旨、または生体内酸化還元状態改善作用を有する旨の表示を付した飲食品、特に特定保健用食品なども含まれる。医薬品として使用する場合には、その形態は特に限定されるものではなく、上記製剤をそのまま使用しても良い。また飲食品の場合にも、その形態は特に限定されるものではなく、酸化型アルブミン低下剤の分岐鎖アミノ酸のみ、あるいは製剤の効果を発揮させるのに必要な量のみ、飲食品に含有させても良い。
【００３３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に例示するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
［実施例１］
非代償性肝硬変患者に対する分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）投与による酸化型アルブミン低下作用の検討
低アルブミン血症（血清アルブミン値３．５ｇ／ｄＬ以下）を呈する非肝硬変患者の血清アルブミンについて、酸化型アルブミン比に及ぼすＢＣＡＡの投与効果を８週間に渡り検討した。対象はＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）を成因とし、食事摂取量が十分で過去４週間以内にアミノ酸製剤を投与していない肝硬変患者（７例）とした。この際、アルブミン製剤や凍結血漿製剤を継続的に投与している患者、肝細胞癌を認める患者、血清中総ビリルビン値が３．０ｍｇ／ｄＬ以上の患者、肝性脳症を認める患者等は対象から除外した。
ＢＣＡＡの投与は、イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が、１：２：１．２（イソロイシン：０．９５２ｇ、ロイシン：１．９０４ｇ、バリン：１．１４４ｇ）であるリーバクト顆粒（登録商標、味の素株式会社）を１回１包（４．７４ｇ）、１日３回食後に経口投与し、２ヶ月間継続した。投与開始時、２週後、８週後にそれぞれ採血し、血清アルブミンの酸化型アルブミン比（ＨＳＡ（ｏｘ）％）を測定した。
ＨＳＡ（ｏｘ）％の測定は以下のように行った。全血約４ｍＬを採血後、直ちに遠心分離をして血清を得た。これを０．４５μｍのフィルターにて濾過した後ドライアイスで凍結し、測定まで−８０℃のディープフリーザーで保存した。サンプルはＨＰＬＣ分析により分離し、還元型アルブミン由来ピークと酸化型アルブミンＩ型（可逆的）ピーク及び酸化型アルブミンＩＩ型（不可逆的）ピークのそれぞれのエリア面積を算出した。ＨＳＡ（ｏｘ）％＝（酸化型アルブミンＩ型＋酸化型アルブミンＩＩ型）／（還元型アルブミン＋酸化型アルブミンＩ型＋酸化型アルブミンＩＩ型）×１００とした。
その結果、図１に示すようにＨＳＡ（ｏｘ）％の推移は、３９．７±１１．１、３６．２±８．１、３３．１±９．０とリーバクト投与により経時的に低下し、８週後で有意であった。この際、血清アルブミン値（ｇ／ｄＬ）の推移は３．３±０．２、３．４±０．２、３．４±０．３であり、有意な変化は認められなかった（図示せず）。
（＊測定に関する参考文献：教育医学、第４３巻、第４号、４２１〜４３１頁（１９９８））
【００３５】
［実施例２］
Ｌ−トリプトファン結合力における酸化型アルブミン機能異常解析
酸化型アルブミン比の上昇がアルブミン機能へ与える影響について検討する目的で、肝硬変モデルラットの血漿を用いてアルブミンのＬ−トリプトファン結合率について解析した。
通常、血中の遊離型Ｌ−トリプトファンは９０％以上がアルブミンに結合しているが、アルブミン非結合型Ｌ−トリプトファンは脳内でセロトニンに変換される。肝硬変患者ではしばしば肝性脳症を認められることから、アルブミンのＬ−トリプトファン結合率の変化に注目した。
肝硬変モデルラットは雄性ＳＤ系ラットに四塩化炭素を週２回継続的に１８週投与して作製した２５週齢のもの（ｎ＝２）を、コントロールとして１０週齢の正常な同系ラット（ｎ＝２）を用いた。
エーテル麻酔下、下大静脈より採血し、抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いて遠心分離により血漿を得た。血漿を３７℃で２０分間プレインキュベーションし、血漿１ｍＬ当たりＬ−トリプトファン溶液（１０ｍＭ）を１０μＬ添加してよく混合した（Ａ）。Ａ液を限外濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、分子量３０，０００カット）に４５０μＬ分注後、３，０００ｇで５分間３７℃にて遠心し、濾液５０μＬ（Ｂ）と未濾過液５０μＬ（Ｃ）をそれぞれ得た。Ａ及びＢにそれぞれ等量の８％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ溶液を添加し混合した後、室温にて３，０００ｇで５分間遠心して除蛋白上清を回収した。これに０．１２５％（ｖ／ｖ）ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）溶液を４倍量添加して混合し、検量線作製した濃度範囲に入るように０．１％ＨＦＢＡにて追加希釈した後、ＬＣ／ＭＳ法により各サンプル中のＬ−トリプトファン濃度を定量した。血漿アルブミンに対するＬ−トリプトファン結合率は、［１−（Ｔｒｐ濃度（Ｂ）／Ｔｒｐ濃度（Ａ））］×１００（％）で示した。回収率は、［Ｔｒｐ濃度（Ｂ）×５０μＬ＋Ｔｒｐ濃度（Ｃ）×４００μＬ］／［Ｔｒｐ濃度（Ａ）×４５０μＬ］×１００（％）として算出した。
また、この際用いたＡ液の酸化型アルブミン比（ＲＳＡ（ｏｘ）％）を測定し図２に示した。肝硬変モデルラットではＲＳＡ（ｏｘ）％が５２．２であり、正常ラットの２９．６に比べ有意に高値であった。
それぞれの血漿中のアルブミンに対するＬ−トリプトファン結合率は、正常ラットでは８３％と高く、肝硬変ラットでは４８％にまで低下していた（図３）。これにより、酸化型アルブミン比の増加によりアルブミンのＬ−トリプトファン結合率が低下し、血液中に血漿蛋白質非結合型で存在するトリプトファン濃度が上昇する可能性が示された。
【００３６】
［実施例３］
酸化型アルブミンの抗酸化力評価実験
アルブミンの機能の一つである生体内酸化還元状態の改善作用が、酸化型アルブミン比の上昇により影響を受けるか検討する目的で、アルブミンの抗酸化力を測定した。評価には正常ヒト血漿より精製したアルブミン（ＨＳＡ）から以下に示す３種類のＨＳＡ（ｏｘ）％を有すサンプルを調製して用いた。
１．還元型アルブミン：精製ＨＳＡ。ＨＳＡ（ｏｘ）％＝２１．５
２．酸化型アルブミン：ＨＳＡ（ｒｅｄ）の３４番目のシステイン残基に人為的にシステインをジスルフィド結合させて作製。ＨＳＡ（ｏｘ）％＝９２．０
３．保存後アルブミン：血漿を３７℃で１８時間インキュベーションし酸化型アルブミン比を上昇させた後に精製し作製。ＨＳＡ（ｏｘ）％＝４５．６
アルブミンの抗酸化力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでフェントン反応によりヒドロキシラジカルを発生させ、各種アルブミン共存下での発生ラジカル強度をＥＳＲ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｉｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）測定機を用いて定量した。
試験管内で２５μＭ ＦｅＳＯ４、５ｍＭ ＤＭＰＯ（スピントラップ剤）、１００μＭ ＤＥＴＡＰＡＣ（鉄イオンキレート剤）を混合し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で各種アルブミンを添加した。１０秒後に０．５ｍＭ Ｈ２Ｏ２を添加しよく混合した後、４５秒後より１分間発生するヒドロキシラジカルの強度をＥＳＲ（ＪＥＳ−ＦＲ８０Ｓ、ＪＥＯＬ社）で測定した。測定条件は以下の通り。
Ｐｏｗｅｒ：１ｍＷ，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｗｉｄｔｈ：０．１ｍＴ，Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：１００Ｈｚ，Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｉｅｌｄ：３３５．５ｍＴ，Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｇａｉｎ：７９，Ｓｗｅｅｐ Ｗｉｄｔｈ：１０ｍＴ，Ｔｉｍｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ：０．０３ｓｅｃ，Ｓｗｅｅｐ ｔｉｍｅ：１ｍｉｎ．
その結果、図４に示すように発生ラジカル強度は添加したアルブミンの種類により異なり、酸化型アルブミン比と相関したラジカル強度が得られた（図５）。これにより、酸化型アルブミンは還元型アルブミンに比べてヒドロキシラジカルの消去力が弱いことが示され、酸化型アルブミン比の上昇はアルブミン由来の抗酸化力の低下をもたらすことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明により提供される、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する薬剤及び飲食品は、酸化型アルブミンを低下させる効果、酸化型／還元型アルブミン比を改善する効果、血清アルブミン機能を改善する効果および生体内酸化還元状態を改善する効果があるため、酸化型アルブミンが増加することによって引き起こされる種々の疾患や弊害を改善できるため有用である。また、本発明の酸化型アルブミン低下剤は、アミノ酸を有効成分とすることから、安全性が高く、副作用がほとんどないため、医薬品及び飲食品として有利である。
本出願は、日本で出願された特願２００５−２２６９６７（出願日：２００５年８月４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内における酸化型アルブミンの割合を低下させる薬剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清アルブミンは生体内で最も多く存在する単純蛋白質であり、血漿膠質浸透圧の維持、種々の内因性・外因性物質の結合・輸送およびアミノ酸の供給源という３つの生理機能を有する。血清アルブミンが輸送する物質としては、トリプトファン、尿酸、グルタチオン、ＡＴＰ、ビリルビン、サイロキシンやテストステロンなどのホルモン、銅や亜鉛などの金属イオン、ビタミンＢ６やビタミンＣなどのビタミン、パルミチン酸やオレイン酸などの脂肪酸、抗生物質やアスピリンなどの薬剤などが幅広く知られている（渡邊明治編 臨床アルブミン学 （株）メディカルレビュー社）。
【０００３】
血清アルブミンは、Ｎ末端から３４番目に存在するシステイン残基のＳＨ基が遊離の状態の還元型アルブミンと血中のシステインやグルタチオンなどとジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合した状態の酸化型アルブミンとの混合物として存在している。正常ヒト血清では還元型が約７５％、酸化型が約２５％の割合で存在するが、肝硬変患者（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ａ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ２０：３５１，２００４）、慢性腎不全患者、糖尿病患者や麻酔・手術時の患者では酸化型アルブミンの割合が増加していると報告されている（恵良聖一 臨床検査 ４８：５０１−５１１，２００４）。
【０００４】
酸化型アルブミンの増加は、生体内の酸化還元状態に関係することや、物質の結合・輸送に影響するものと推測されてはいるが、その病態意義については明らかにされていない。また、血液透析によって慢性腎不全患者の酸化型アルブミンが低下して還元型アルブミンが増加するとの報告（Ｓｏｇａｍｉ，Ｍ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ２５：３９８，１９８５）はあるものの、酸化型アルブミンを低下させ還元型アルブミンを増加させるような薬剤や食品成分については全く知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、酸化型アルブミンの病態意義を明らかにして、増加した酸化型アルブミン量の割合を低下させる薬剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸に増加した酸化型アルブミン量を低下させる作用、酸化型／還元型アルブミン比を改善する作用、血清アルブミン機能を改善する作用および生体内酸化還元状態を改善する作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって本発明は、以下の項目を包含する。
【０００７】
（１）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下剤。
（２）イソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下剤。
（３）イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１〜３：０．５〜２．０であることを特徴とする、上記（２）に記載の酸化型アルブミン低下剤。
（４）イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１．５〜２．５：０．８〜１．５であることを特徴とする、上記（２）に記載の酸化型アルブミン低下剤。
（５）成人１日あたりの分岐鎖アミノ酸の投与量が全量で、１ｇ〜５０ｇである、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の酸化型アルブミン低下剤。
（６）成人１日あたりの分岐鎖アミノ酸の投与量が全量で、３ｇ〜３０ｇである、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の酸化型アルブミン低下剤。
（７）肝硬変、慢性腎不全、糖尿病、及び麻酔・手術時の患者から選ばれる少なくとも１種の患者用である、上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の酸化型アルブミン低下剤。
（８）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型／還元型アルブミン比改善剤。
（９）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する血清アルブミン機能改善剤。
（１０）血清アルブミン機能が、トリプトファン結合能、ビリルビン結合能、脂肪酸結合能から選ばれる少なくとも１種である、上記（９）に記載の血清アルブミン機能改善剤。
【０００８】
（１１）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する生体内酸化還元状態改善剤。
（１２）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する飲食品において、酸化型アルブミン低下作用を有する旨を表示することを特徴とする飲食品。
（１３）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する飲食品において、生体内酸化還元状態改善作用を有する旨を表示することを特徴とする飲食品。
（１４）有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、酸化型アルブミンの低下方法。
（１５）有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、酸化型／還元型アルブミン比の改善方法。
（１６）有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、血清アルブミン機能の改善方法。
（１７）有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、生体内酸化還元状態の改善方法。
（１８）酸化型アルブミン低下剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（１９）酸化型／還元型アルブミン比改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（２０）血清アルブミン機能改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（２１）生体内酸化還元状態改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【０００９】
（２２）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、酸化型アルブミンの低下に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
（２３）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、酸化型／還元型アルブミン比の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
（２４）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、血清アルブミン機能の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
（２５）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、生体内酸化還元状態の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
（２６）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下用組成物。
（２７）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型／還元型アルブミン比改善用組成物。
（２８）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する血清アルブミン機能改善用組成物。
（２９）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する生体内酸化還元状態改善用組成物。
【００１０】
本発明により提供される、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する薬剤及び飲食品は、酸化型アルブミンを低下させる効果、酸化型／還元型アルブミン比を改善する効果、血清アルブミン機能を改善する効果および生体内酸化還元状態を改善する効果があるため、酸化型アルブミンが増加することによって引き起こされる種々の疾患や弊害を改善できるため有用である。また、本発明の酸化型アルブミン低下剤は、アミノ酸を有効成分とすることから、安全性が高く、副作用がほとんどないため、医薬品及び飲食品として有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図１は、実施例１における酸化型アルブミン比の推移を示すグラフである。
図２は、実施例２における酸化型アルブミン比を示す図である。
図３は、実施例２におけるＬ−トリプトファン結合率を示す図である。
図４は、実施例３における各アルブミンの発生ラジカル強度を示すチャートである。
図５は、実施例３における、酸化型アルブミン比に対するラジカル強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明の実施の形態について説明する。
本発明における「酸化型アルブミン低下剤」とは、血清アルブミンの還元型：酸化型の存在比において、疾患やその他の要因により増加した酸化型アルブミンの割合を低下させる薬剤のことである。すなわち、正常時の生体内における酸化型アルブミンと還元型アルブミンとの存在割合は、ほぼ前者が２５％、後者が７５％であるところ、本発明の薬剤は酸化型アルブミンが増量した状態を正常の割合に、より具体的には２５％に、あるいは２５％に近づく方向に低下させる働きを有する。
【００１３】
本発明の酸化型アルブミン低下剤は、生体内における酸化型アルブミンの割合が増加している患者に有用である。具体的には、肝硬変、慢性腎不全、糖尿病、および麻酔・手術時の患者などに対して有用である。
【００１４】
また、本発明の酸化型アルブミン低下剤は、酸化型／還元型アルブミン比改善剤、血清アルブミン機能改善剤、および生体内酸化還元状態改善剤として使用されうる。
【００１５】
ここで、酸化型／還元型アルブミン比とは、生体内における血清アルブミンの酸化型と還元型の比率のことをさし、正常時、この値は約２．５：７．５であるとされている。肝疾患、糖尿病、甲状腺疾患、ネフローゼ症候群、腎不全、加齢などにより酸化型が増加するとこの比率は変動する。すなわち、酸化型／還元型アルブミン比改善とは、これらの比率を正常時の比率に改善する、またはそれに近づけることをいう。
【００１６】
血清アルブミン機能改善とは、血清アルブミンの有するトリプトファン結合能、ビリルビン結合能、脂肪酸結合能のうち少なくとも１つの機能を高めることである。
【００１７】
血清アルブミンのトリプトファン結合率は９０％以上であるのが正常とされており、これが著しく低下すると血液中に血清タンパク質非結合型で存在するトリプトファン濃度が上昇し、脳内でセロトニンへの変換速度が速まる。これに起因して易疲労感や脳症がもたらされる。
【００１８】
血清アルブミンのビリルビン結合率は通常９９％以上であるのが正常とされており、血中の非抱合型（間接）ビリルビンの肝臓への運搬を担っている。この数値が低下すると遊離型のビリルビン濃度が上昇し、脳内に移行し神経毒性を呈する。
【００１９】
また、血清アルブミンのパルミチン酸やオレイン酸などの脂肪酸結合率は通常９９％以上であるのが正常とされており、この数値が低下すると血中の遊離脂肪酸濃度が高まり、溶血などの毒性が現れる。
【００２０】
すなわち、血清アルブミン機能改善とは、これらの数値を正常時の値に改善すること、またはそれに近づけることをいう。
【００２１】
生体内酸化還元状態とは生体内の酸化反応と抗酸化反応（すなわち還元反応）のバランス状態のことである。種々の病態においてこのバランスが破綻し酸化傾向に傾いた結果、活性酸素やフリーラジカルなどの活性酸素種の発生を介する酸化ストレスが生じ、細胞や組織に障害を引き起こす。したがって生体内酸化還元状態改善とは、抗酸化防御機構を活性化させて過剰な酸化ストレスを消去し、正常な状態に戻すこと、又はそれに近づけることをいう。
【００２２】
本発明の有効成分（分岐鎖アミノ酸）である、イソロイシン、ロイシンおよびバリンはそれぞれＬ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体いずれも使用可能である。またイソロイシン、ロイシンおよびバリンはそれぞれ、遊離体のみならず、塩、水和物の形態でも使用することができる。
【００２３】
塩の形態には酸付加塩や塩基との塩等を挙げることもでき、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの医薬品又は飲食品として許容される塩を選択することが好ましい。イソロイシン、ロイシンおよびバリンにそれぞれ付加して医薬品又は飲食品として許容される塩を形成する酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸塩等の無機塩、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸又はモノメチル硫酸等の有機塩が挙げられる。イソロイシン、ロイシンおよびバリンの医薬品又は飲食品として許容される塩基との塩の例としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物あるいは炭酸化物や、アンモニア等の無機の塩基との塩、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機の塩基との塩が挙げられる。上記塩は水和物（含水塩）であってもよい。
【００２４】
また、水和物としては、例えば１〜６水和物などが挙げられる。これらの塩、水和物も本発明の権利に包含されるものである。
【００２５】
本発明の酸化型アルブミン低下剤は、イソロイシン、ロイシン、バリンのいずれか１種以上が分岐鎖アミノ酸として含有されていれば良いが、イソロイシン、ロイシン、バリン全てが含有されていることが好ましい。より好ましくは、イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１〜３：０．５〜２．０である。さらに好ましくは、イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１．５〜２．５：０．８〜１．５である。最も好ましい重量比は１：２：１．２である。本発明薬剤の投与方法は、経口投与、または点滴投与、注射投与（経静脈投与）等の非経口投与（摂取）でも良く、特に限定しないが、有効成分がアミノ酸であることから経口投与であることが好ましい。
【００２６】
本発明の酸化型アルブミン低下剤を経口投与する場合の投与量（摂取量）は、投与する患者の症状、年齢、投与方法によって異なるが、通常、１人あたり１日、イソロイシン１〜３０ｇ、ロイシン１〜３０ｇ、バリン１〜３０ｇである。一般の成人の場合、好ましくは１人あたり１日、イソロイシン２〜１０ｇ、ロイシン２〜１０ｇ、バリン２〜１０ｇ、より好ましくは、イソロイシン２．５〜３ｇ、ロイシン５〜６ｇ、バリン３〜４ｇである。イソロイシン、ロイシン、バリン全てが含有されている場合は、成人１日あたりの投与量が全量で、１ｇ〜５０ｇであることが好ましい。より好ましくは成人１日あたりの投与量が全量で、３〜３０ｇである。さらに好ましくは４〜２５ｇである。
【００２７】
一方、点滴投与、注射投与（経静脈投与）等、非経口投与（摂取）することも可能であり、その場合の投与量については、前記経口投与についての好ましい投与量（摂取量）範囲の１０〜２０分の１程度を投与することができる。
【００２８】
経口投与剤としては、顆粒剤、細粒剤、錠剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、液剤、懸濁剤など、また注射剤としては静脈直接注入用、点滴投与用などの医薬製剤一般の剤形を採用することができる。
【００２９】
本発明の分岐鎖アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれが単独で、若しくは任意の２つの組み合わせで製剤化されてもよく、又は全てを含有する単一製剤としてもよい。別々に製剤化して投与する場合、それらの投与経路、投与剤形は同一であっても異なっていてもよく、また各々を投与するタイミングも、同時であっても別々であってもよい。併用する薬剤の種類や効果によって適宜決定する。
【００３０】
本発明において、「重量比」とは製剤中のそれぞれの成分の重量比を示す。例えばイソロイシン、ロイシン及びバリンの各分岐鎖アミノ酸が１つの製剤中に含まれる場合には個々の含有量の比であり、各分岐鎖アミノ酸のそれぞれが単独で又は任意の２つの組み合わせで複数製剤中に含まれる場合には、各製剤に含まれる各分岐鎖アミノ酸の重量の比である。なお、本明細書中において各アミノ酸の重量は、遊離アミノ酸としてのものである。
【００３１】
本発明の酸化型アルブミン低下剤は常法により製剤化することができる。製剤上の必要に応じて、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、でんぷん、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、ゼラチン等の担体や、溶剤、溶解補助剤、等張化剤等の通常の添加剤を適宜配合することができる。
【００３２】
本発明の酸化型アルブミン低下剤は、特に医薬品又は飲食品（健康食品、栄養補助食品等を含む）として使用することができる。有効成分がアミノ酸であるため、安全性に優れており、飲食品の形態でも簡便に使用することができる。またこのような飲食品を保健機能食品として提供することも可能であり、この保健機能食品には、酸化型アルブミン低下作用を有する旨、または生体内酸化還元状態改善作用を有する旨の表示を付した飲食品、特に特定保健用食品なども含まれる。医薬品として使用する場合には、その形態は特に限定されるものではなく、上記製剤をそのまま使用しても良い。また飲食品の場合にも、その形態は特に限定されるものではなく、酸化型アルブミン低下剤の分岐鎖アミノ酸のみ、あるいは製剤の効果を発揮させるのに必要な量のみ、飲食品に含有させても良い。
【００３３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に例示するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
［実施例１］
非代償性肝硬変患者に対する分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）投与による酸化型アルブミン低下作用の検討
低アルブミン血症（血清アルブミン値３．５ｇ／ｄＬ以下）を呈する非肝硬変患者の血清アルブミンについて、酸化型アルブミン比に及ぼすＢＣＡＡの投与効果を８週間に渡り検討した。対象はＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）を成因とし、食事摂取量が十分で過去４週間以内にアミノ酸製剤を投与していない肝硬変患者（７例）とした。この際、アルブミン製剤や凍結血漿製剤を継続的に投与している患者、肝細胞癌を認める患者、血清中総ビリルビン値が３．０ｍｇ／ｄＬ以上の患者、肝性脳症を認める患者等は対象から除外した。
ＢＣＡＡの投与は、イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が、１：２：１．２（イソロイシン：０．９５２ｇ、ロイシン：１．９０４ｇ、バリン：１．１４４ｇ）であるリーバクト顆粒（登録商標、味の素株式会社）を１回１包（４．７４ｇ）、１日３回食後に経口投与し、２ヶ月間継続した。投与開始時、２週後、８週後にそれぞれ採血し、血清アルブミンの酸化型アルブミン比（ＨＳＡ（ｏｘ）％）を測定した。
ＨＳＡ（ｏｘ）％の測定は以下のように行った。全血約４ｍＬを採血後、直ちに遠心分離をして血清を得た。これを０．４５μｍのフィルターにて濾過した後ドライアイスで凍結し、測定まで−８０℃のディープフリーザーで保存した。サンプルはＨＰＬＣ分析により分離し、還元型アルブミン由来ピークと酸化型アルブミンＩ型（可逆的）ピーク及び酸化型アルブミンＩＩ型（不可逆的）ピークのそれぞれのエリア面積を算出した。ＨＳＡ（ｏｘ）％＝（酸化型アルブミンＩ型＋酸化型アルブミンＩＩ型）／（還元型アルブミン＋酸化型アルブミンＩ型＋酸化型アルブミンＩＩ型）×１００とした。
その結果、図１に示すようにＨＳＡ（ｏｘ）％の推移は、３９．７±１１．１、３６．２±８．１、３３．１±９．０とリーバクト投与により経時的に低下し、８週後で有意であった。この際、血清アルブミン値（ｇ／ｄＬ）の推移は３．３±０．２、３．４±０．２、３．４±０．３であり、有意な変化は認められなかった（図示せず）。
（＊測定に関する参考文献：教育医学、第４３巻、第４号、４２１〜４３１頁（１９９８））
【００３５】
［実施例２］
Ｌ−トリプトファン結合力における酸化型アルブミン機能異常解析
酸化型アルブミン比の上昇がアルブミン機能へ与える影響について検討する目的で、肝硬変モデルラットの血漿を用いてアルブミンのＬ−トリプトファン結合率について解析した。
通常、血中の遊離型Ｌ−トリプトファンは９０％以上がアルブミンに結合しているが、アルブミン非結合型Ｌ−トリプトファンは脳内でセロトニンに変換される。肝硬変患者ではしばしば肝性脳症を認められることから、アルブミンのＬ−トリプトファン結合率の変化に注目した。
肝硬変モデルラットは雄性ＳＤ系ラットに四塩化炭素を週２回継続的に１８週投与して作製した２５週齢のもの（ｎ＝２）を、コントロールとして１０週齢の正常な同系ラット（ｎ＝２）を用いた。
エーテル麻酔下、下大静脈より採血し、抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いて遠心分離により血漿を得た。血漿を３７℃で２０分間プレインキュベーションし、血漿１ｍＬ当たりＬ−トリプトファン溶液（１０ｍＭ）を１０μＬ添加してよく混合した（Ａ）。Ａ液を限外濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、分子量３０，０００カット）に４５０μＬ分注後、３，０００ｇで５分間３７℃にて遠心し、濾液５０μＬ（Ｂ）と未濾過液５０μＬ（Ｃ）をそれぞれ得た。Ａ及びＢにそれぞれ等量の８％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ溶液を添加し混合した後、室温にて３，０００ｇで５分間遠心して除蛋白上清を回収した。これに０．１２５％（ｖ／ｖ）ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）溶液を４倍量添加して混合し、検量線作製した濃度範囲に入るように０．１％ＨＦＢＡにて追加希釈した後、ＬＣ／ＭＳ法により各サンプル中のＬ−トリプトファン濃度を定量した。血漿アルブミンに対するＬ−トリプトファン結合率は、［１−（Ｔｒｐ濃度（Ｂ）／Ｔｒｐ濃度（Ａ））］×１００（％）で示した。回収率は、［Ｔｒｐ濃度（Ｂ）×５０μＬ＋Ｔｒｐ濃度（Ｃ）×４００μＬ］／［Ｔｒｐ濃度（Ａ）×４５０μＬ］×１００（％）として算出した。
また、この際用いたＡ液の酸化型アルブミン比（ＲＳＡ（ｏｘ）％）を測定し図２に示した。肝硬変モデルラットではＲＳＡ（ｏｘ）％が５２．２であり、正常ラットの２９．６に比べ有意に高値であった。
それぞれの血漿中のアルブミンに対するＬ−トリプトファン結合率は、正常ラットでは８３％と高く、肝硬変ラットでは４８％にまで低下していた（図３）。これにより、酸化型アルブミン比の増加によりアルブミンのＬ−トリプトファン結合率が低下し、血液中に血漿蛋白質非結合型で存在するトリプトファン濃度が上昇する可能性が示された。
【００３６】
［実施例３］
酸化型アルブミンの抗酸化力評価実験
アルブミンの機能の一つである生体内酸化還元状態の改善作用が、酸化型アルブミン比の上昇により影響を受けるか検討する目的で、アルブミンの抗酸化力を測定した。評価には正常ヒト血漿より精製したアルブミン（ＨＳＡ）から以下に示す３種類のＨＳＡ（ｏｘ）％を有すサンプルを調製して用いた。
１．還元型アルブミン：精製ＨＳＡ。ＨＳＡ（ｏｘ）％＝２１．５
２．酸化型アルブミン：ＨＳＡ（ｒｅｄ）の３４番目のシステイン残基に人為的にシステインをジスルフィド結合させて作製。ＨＳＡ（ｏｘ）％＝９２．０
３．保存後アルブミン：血漿を３７℃で１８時間インキュベーションし酸化型アルブミン比を上昇させた後に精製し作製。ＨＳＡ（ｏｘ）％＝４５．６
アルブミンの抗酸化力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでフェントン反応によりヒドロキシラジカルを発生させ、各種アルブミン共存下での発生ラジカル強度をＥＳＲ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｉｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）測定機を用いて定量した。
試験管内で２５μＭ ＦｅＳＯ４、５ｍＭ ＤＭＰＯ（スピントラップ剤）、１００μＭ ＤＥＴＡＰＡＣ（鉄イオンキレート剤）を混合し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で各種アルブミンを添加した。１０秒後に０．５ｍＭ Ｈ２Ｏ２を添加しよく混合した後、４５秒後より１分間発生するヒドロキシラジカルの強度をＥＳＲ（ＪＥＳ−ＦＲ８０Ｓ、ＪＥＯＬ社）で測定した。測定条件は以下の通り。
Ｐｏｗｅｒ：１ｍＷ，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｗｉｄｔｈ：０．１ｍＴ，Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：１００Ｈｚ，Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｉｅｌｄ：３３５．５ｍＴ，Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｇａｉｎ：７９，Ｓｗｅｅｐ Ｗｉｄｔｈ：１０ｍＴ，Ｔｉｍｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ：０．０３ｓｅｃ，Ｓｗｅｅｐ ｔｉｍｅ：１ｍｉｎ．
その結果、図４に示すように発生ラジカル強度は添加したアルブミンの種類により異なり、酸化型アルブミン比と相関したラジカル強度が得られた（図５）。これにより、酸化型アルブミンは還元型アルブミンに比べてヒドロキシラジカルの消去力が弱いことが示され、酸化型アルブミン比の上昇はアルブミン由来の抗酸化力の低下をもたらすことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明により提供される、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する薬剤及び飲食品は、酸化型アルブミンを低下させる効果、酸化型／還元型アルブミン比を改善する効果、血清アルブミン機能を改善する効果および生体内酸化還元状態を改善する効果があるため、酸化型アルブミンが増加することによって引き起こされる種々の疾患や弊害を改善できるため有用である。また、本発明の酸化型アルブミン低下剤は、アミノ酸を有効成分とすることから、安全性が高く、副作用がほとんどないため、医薬品及び飲食品として有利である。
本出願は、日本で出願された特願２００５−２２６９６７（出願日：２００５年８月４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下剤。
【請求項２】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下剤。
【請求項３】
イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１〜３：０．５〜２．０であることを特徴とする、請求項２に記載の酸化型アルブミン低下剤。
【請求項４】
イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１．５〜２．５：０．８〜１．５であることを特徴とする、請求項２に記載の酸化型アルブミン低下剤。
【請求項５】
成人１日あたりの分岐鎖アミノ酸の投与量が全量で、１ｇ〜５０ｇである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酸化型アルブミン低下剤。
【請求項６】
成人１日あたりの分岐鎖アミノ酸の投与量が全量で、３ｇ〜３０ｇである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酸化型アルブミン低下剤。
【請求項７】
肝硬変、慢性腎不全、糖尿病、及び麻酔・手術時の患者から選ばれる少なくとも１種の患者用である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の酸化型アルブミン低下剤。
【請求項８】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型／還元型アルブミン比改善剤。
【請求項９】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する血清アルブミン機能改善剤。
【請求項１０】
血清アルブミン機能が、トリプトファン結合能、ビリルビン結合能、脂肪酸結合能から選ばれる少なくとも１種である、請求項９に記載の血清アルブミン機能改善剤。
【請求項１１】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する生体内酸化還元状態改善剤。
【請求項１２】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する飲食品において、酸化型アルブミン低下作用を有する旨を表示することを特徴とする飲食品。
【請求項１３】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する飲食品において、生体内酸化還元状態改善作用を有する旨を表示することを特徴とする飲食品。
【請求項１４】
有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、酸化型アルブミンの低下方法。
【請求項１５】
有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、酸化型／還元型アルブミン比の改善方法。
【請求項１６】
有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、血清アルブミン機能の改善方法。
【請求項１７】
有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、生体内酸化還元状態の改善方法。
【請求項１８】
酸化型アルブミン低下剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項１９】
酸化型／還元型アルブミン比改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項２０】
血清アルブミン機能改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項２１】
生体内酸化還元状態改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項２２】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、酸化型アルブミンの低下に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
【請求項２３】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、酸化型／還元型アルブミン比の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
【請求項２４】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、血清アルブミン機能の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
【請求項２５】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、生体内酸化還元状態の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
【請求項２６】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下用組成物。
【請求項２７】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型／還元型アルブミン比改善用組成物。
【請求項２８】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する血清アルブミン機能改善用組成物。
【請求項２９】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する生体内酸化還元状態改善用組成物。
【請求項１】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下剤。
【請求項２】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下剤。
【請求項３】
イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１〜３：０．５〜２．０であることを特徴とする、請求項２に記載の酸化型アルブミン低下剤。
【請求項４】
イソロイシン、ロイシン、バリンの重量比が１：１．５〜２．５：０．８〜１．５であることを特徴とする、請求項２に記載の酸化型アルブミン低下剤。
【請求項５】
成人１日あたりの分岐鎖アミノ酸の投与量が全量で、１ｇ〜５０ｇである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酸化型アルブミン低下剤。
【請求項６】
成人１日あたりの分岐鎖アミノ酸の投与量が全量で、３ｇ〜３０ｇである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酸化型アルブミン低下剤。
【請求項７】
肝硬変、慢性腎不全、糖尿病、及び麻酔・手術時の患者から選ばれる少なくとも１種の患者用である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の酸化型アルブミン低下剤。
【請求項８】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型／還元型アルブミン比改善剤。
【請求項９】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する血清アルブミン機能改善剤。
【請求項１０】
血清アルブミン機能が、トリプトファン結合能、ビリルビン結合能、脂肪酸結合能から選ばれる少なくとも１種である、請求項９に記載の血清アルブミン機能改善剤。
【請求項１１】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する生体内酸化還元状態改善剤。
【請求項１２】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する飲食品において、酸化型アルブミン低下作用を有する旨を表示することを特徴とする飲食品。
【請求項１３】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する飲食品において、生体内酸化還元状態改善作用を有する旨を表示することを特徴とする飲食品。
【請求項１４】
有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、酸化型アルブミンの低下方法。
【請求項１５】
有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、酸化型／還元型アルブミン比の改善方法。
【請求項１６】
有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、血清アルブミン機能の改善方法。
【請求項１７】
有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、生体内酸化還元状態の改善方法。
【請求項１８】
酸化型アルブミン低下剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項１９】
酸化型／還元型アルブミン比改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項２０】
血清アルブミン機能改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項２１】
生体内酸化還元状態改善剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
【請求項２２】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、酸化型アルブミンの低下に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
【請求項２３】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、酸化型／還元型アルブミン比の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
【請求項２４】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、血清アルブミン機能の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
【請求項２５】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬、ならびに当該医薬を、生体内酸化還元状態の改善に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。
【請求項２６】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型アルブミン低下用組成物。
【請求項２７】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する酸化型／還元型アルブミン比改善用組成物。
【請求項２８】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する血清アルブミン機能改善用組成物。
【請求項２９】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を含有する生体内酸化還元状態改善用組成物。
【公開番号】特開２０１３−４７２３３（Ｐ２０１３−４７２３３Ａ）
【公開日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２１３２３７（Ｐ２０１２−２１３２３７）
【出願日】平成２４年９月２６日（２０１２．９．２６）
【分割の表示】特願２００７−５２９６２９（Ｐ２００７−５２９６２９）の分割
【原出願日】平成１８年８月４日（２００６．８．４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年９月２６日（２０１２．９．２６）
【分割の表示】特願２００７−５２９６２９（Ｐ２００７−５２９６２９）の分割
【原出願日】平成１８年８月４日（２００６．８．４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
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