酸化発色化合物の製造方法
【課題】生体成分測定のための酸化発色化合物の製造方法を提供する。
【解決手段】本発明は、化学式４（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である）で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法に係り、メチル化工程は、化学式１で示される化合物またはその塩を、メチル化する前に所定の含水率以下まで乾燥する乾燥工程を含み、ニトロソ化工程は、化学式２で示される化合物またはその塩を、ニトロソ化する前に所定の粒径以下まで微粉化する微粉化工程を含む。
【解決手段】本発明は、化学式４（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である）で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法に係り、メチル化工程は、化学式１で示される化合物またはその塩を、メチル化する前に所定の含水率以下まで乾燥する乾燥工程を含み、ニトロソ化工程は、化学式２で示される化合物またはその塩を、ニトロソ化する前に所定の粒径以下まで微粉化する微粉化工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化発色化合物の製造方法ならびに当該方法によって製造された化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一種として、酵素を用いた比色分析法が広く用いられている。これらの方法は、測定キット、自動分析機、ドライケミストリー試験具等に組み込まれ、日常的な臨床検査に数多く用いられている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００３】
このような測定法の一種として、被測定物質に特異的な酸化酵素を作用させて発生する過酸化水素をさらにペルオキシダーゼの作用で活性酸素とし、これで発色試薬を酸化して生成する色素を比色定量する方法がある。
【０００４】
ここで使用される酵素としては、例えばグルコースの測定ではグルコースオキシダーゼ、コレステロールの測定ではコレステロールオキシダーゼ、尿酸の測定にはウリカーゼ、ピルビン酸の測定にはピルベートオキシダーゼ等が用いられる。これらの酵素は検体中の基質のみを特異的に酸化するために、色々な成分を含む検体からそれぞれの測定対象物のみを限定して定量することができる。
【０００５】
また、発色試薬としては、活性酸素で酸化されることによって、その吸収波長特性や吸収強度等が変化する色素もしくは色素の前駆体（色原体）が用いられる。すなわち、活性酸素の量に応じて変化する色を測定することによって、被測定物質の量を定量することができる。これらの色素や色原体には、１分子だけで機能するものや、異なる２分子がカップリングして機能するものがある。
【０００６】
１分子で機能するものには、ロイコ型色素等が挙げられる。２分子で機能する代表的なものには、カプラーとトリンダー試薬を酸化的にカップリングさせたものが挙げられる（例えば、非特許文献１および２を参照）。
【０００７】
カプラーとしては、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミンまたはその誘導体などが用いられる。
【０００８】
トリンダー試薬としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体が用いられる。フェノール誘導体としては、フェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、３，５−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，６，４−トリクロロフェノール、２，６，４−トリブロモフェノール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイル酸、などが挙げられる。アニリン誘導体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン（ＥＳＥＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＳＤＡ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）などが挙げられる。
【０００９】
ここで、保存安定性に鑑みると、１分子で機能する色素より２分子で機能する色素の方が良い傾向にある。また、２分子で機能する色素のうち、カプラーとしては、前記のうち最も安定な４−アミノアンチピリン、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンが多く用いられ、トリンダー試薬としては安定でかつ発色強度や波長の点でより有利なアニリン誘導体が多く用いられている。
【００１０】
このような現状の下、前記の発色原理を用いた製品の価値を上げるためには、測定精度をさらに向上させる、あるいは経時的劣化を低減させる必要があり、また、より微量な成分の検出には、現存のものよりさらに感度のよい検出系が必要となり、それらの目的において、より高性能の発色試薬の開発が望まれている。
【００１１】
このように、従来のカプラーに変わる新規な発色化合物の開発が進められており、例えば、特許文献２には、酵素を阻害しないとされるアミノアンチピリン誘導体が開示されている。
【００１２】
ところで、このようなアミノアンチピリン誘導体のようなアミノ化合物を得るためには、ニトロソ化を行い、さらに還元を行なう方法が一般的に知られており、アミノアンチピリンの製造過程においては、ニトロソ化した後還元し、アミノ化をする手法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。なお、特許文献２においても、ニトロソ化、アミノ化を行い、所望の発色化合物を得ている。また、水溶性と経時安定性に優れたアミノアンチピリン誘導体を得るために、特許文献４と特許文献５が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００４−２２３１１５号公報
【特許文献２】特公平６−９９４０３号公報
【特許文献３】米国特許第１，８７７，１６６号明細書
【特許文献４】特開２００９−２４２２４５号公報
【特許文献５】特開２０１０−４３０１０号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６，２４，１９６９
【非特許文献２】Ｂａｒｈａｍ，Ｄ．ａｎｄ Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎａｌｙｓｔ（Ｌｏｎｄｏｎ），９７，１４２，１９７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記の通り、より高性能の発色試薬の開発が望まれている一方で、実際に工業化を念頭においた場合、特に、スケールアップする際に、高純度、高収率で、その高性能の発色試薬を簡便に製造する必要性が生じる。しかしながら、前記したような技術においては、製造スケールが、より大きくなると、その高性能の発色試薬を簡便に製造することができず、このような技術手段の開発が、現実問題として希求されている。
【００１６】
よって、本発明は、上記実情を鑑みてなされたものであり、従来に比して性能が向上した発色化合物を、高純度、高収率で、簡便に製造するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記実情に鑑み、鋭意研究を行った。その過程でまず、前記のような技術によっても、従来に比して性能が向上した発色化合物を、高純度、高収率で、簡便に製造することができない理由を、以下の通り詳細に探索した。
【００１８】
まず、所望の発色化合物を得るためには、メチル化、ニトロソ化、アミノ化を経る必要があるが、スケールアップする際に、高純度、高収率で所望の発色化合物を得ることができないのは、化学式１で示される化合物またはその塩を
硫酸ジメチルを用いてメチル化する際、化学式１で示される化合物またはその塩に含まれる水分が、硫酸ジメチルを加水分解して、反応に影響を及ぼし、短時間で、高純度、高収率でメチル体を得られないためではないかと予測した。
【００１９】
また、化学式２で示される化合物またはその塩を亜硝酸塩を用いてニトロソ化する際、反応が懸濁状態で進行するため、化学式２で示される化合物またはその塩の粒子径が反応に影響を及ぼし、微粉化の程度が粗いと、原料（化学式２で示される化合物またはその塩）残りが生じて、高純度、高収率でニトロソ体を得られないためではないかと予測した。
【００２０】
また、化学式２で示される化合物またはその塩を亜硝酸塩を用いてニトロソ化する際、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定で、水溶液中では容易に分解して不純物を生じるため、よりスケールが大きくなると、その影響が大きくなり、簡便に、高純度、高収率でニトロソ体を得られないためではないかと予測した。
【００２１】
さらには、化学式３で示される化合物またはその塩を、接触水素還元する際、還元した後に、反応溶液から不溶物を濾取する工程において、よりスケールが大きくなると、従来の反応溶媒によるロート上からのかけ洗いでは、不純物が残留し易く、高純度、高収率でアミノ体を得られないためではないかと予測した。
【００２２】
その予測の下、鋭意研究を行った結果、本発明の製造方法によると、驚くべきことに、非常に高い純度および収率で、簡便に目的物を得ることができたのである。
【００２３】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（８）で示される、高い性能を持つ新規酸化発色化合物の製造方法を提供する。
【００２４】
（１）下記化学式１：
【化１】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である）、
で示される化合物またはその塩と、硫酸ジメチルとを混合し、無溶媒下で加熱反応させるメチル化工程と；
前記メチル化工程の後、下記化学式２：
【化２】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化するニトロソ化工程と；
前記ニトロソ化工程の後、下記化学式３：
【化３】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される化合物またはその塩を単離する単離工程と；
前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩を、接触水素還元する還元工程と；
を含む、下記化学式４：
【化４】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法において、
前記メチル化工程は、化学式１で示される化合物またはその塩を、メチル化する前に所定の含水率以下まで乾燥する乾燥工程を含み、
前記ニトロソ化工程は、化学式２で示される化合物またはその塩を、ニトロソ化する前に所定の粒径以下まで微粉化する微粉化工程を含むことを特徴とする製造方法。
【００２５】
（２）前記乾燥工程における前記所定の含水率は１％である（１）に記載の製造方法。
（３）前記微粉化工程における前記所定の粒径は５００μｍである（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）前記還元工程は、化学式３で示される化合物またはその塩を、触媒としてパラジウム炭素を用いて還元した後に、反応溶液から不溶物を濾取し、濾取した不溶物をアルコールを用いて分散洗浄し、更に、該不溶物にアルカリ水溶液を加えて化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を溶解し、触媒を除去した後、酸析することによって化学式４で示される酸化発色化合物を精製する精製工程を含む（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）前記アルコールがエタノールであり、前記酸析に用いる酸が塩酸である（４）に記載の製造方法。
（６）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の製造方法で得られる、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の製造方法においては、従来の方法と比較して、下記(ア)〜(ウ)の点で優れている。
（ア）製造工程の効率化
本願発明の製造方法によると、従来法での製造工程と比較して、工程を効率化しうる。特に、メチル化工程では次の効果がある。硫酸ジメチルを用いてメチル化する際、化学式１で示される化合物またはその塩に含まれる水分を、メチル化する前に、充分除去することにより、硫酸ジメチルの加水分解を防止することにより、従来法と比較して、より低温で短時間で反応を終了することができるため、効率的に、高純度、高収率でメチル体を得ることができる。
（イ）ニトロソ化での純度向上
従来法での製造工程と比較して、ニトロソ化での単離生成物において純度を向上しうる。特に、反応の際に次の効果がある。化学式２で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する際、懸濁反応のため、化学式２で示される化合物またはその塩を充分に微粉化することにより、従来法と比較して、反応を完結することができるため、原料残りがなく、高純度でニトロソ体を得ることができる。
また、化学式２で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する際、亜硝酸塩を加える前に、冷却塩酸水溶液中に前記化学式２で示される化合物またはその塩を分散することにより、従来法と比較して、安定な条件で反応することができるため、スケールアップが容易となり、高純度でニトロソ体を得ることができる。
（ウ）アミノ化での純度向上
従来法での製造工程と比較して、アミノ化での生成物において純度を向上しうる。特に、還元後の生成物の処理の際に次の効果がある。化学式３で示される化合物またはその塩を、触媒としてパラジウム炭素を用いて還元した後に、反応溶液から不溶物を濾取する工程において、アルコールを用いて濾取した不溶物を分散洗浄し、更に、該不溶物にアルカリ水溶液を加えて化学式４で示される酸化発色化合物を溶解し、触媒を除去した後、酸析することにより、従来法と比較して、スケールアップする際、不純物の除去を完全に行なうことができるため、スケールアップが容易となり、高純度でアミノ体を得ることができる。
【００２７】
さらに、本願発明により製造される発色化合物は、その呈色性能において、下記（エ）〜（キ）の点でこれまでの試薬より優れている。特に担体に保持した試験具として使用する場合、その効果が最も顕著である。
【００２８】
（エ）測定時間の短縮
本願発明の製造方法により製造される発色化合物は、水溶性が有意に高いので、特に担体に保持して使用する場合には、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こる。
【００２９】
（オ）感度が高い
呈色反応によって生成した色素化合物は、検体への溶解性や親和性が有意に高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなる。それによって感度が高く安定した測定が可能となる。
【００３０】
（カ）精度が高い
本願発明の製造方法により製造される発色化合物は、溶解性が有意に高いので、従来の試薬より高濃度の試薬液が調製可能である。また、担体に担持して使用する場合塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。さらには、塗布液の濃度を高く設定し全体液量を少なくできることで、塗工均一性の高い、グラビア印刷法、ドット印刷法、インクジェット印刷等の精密印刷法が使用できる。塗工液量が少なくなれば、乾燥時間が短縮され乾燥むらを低減させる効果もある。つまり、十分な試薬を高い均一性で塗工できることにより、塗りむらなどに起因するばらつきを低減させることができ、高い精度の試験具を提供することができる。
【００３１】
（キ）経時安定性に優れる
本発明の製造方法により製造される発色化合物における親水性官能基は、担体への吸着性を高め、担体内での化合物の安定性を向上させる。つまり、経時劣化を低減させ、有効期間を延ばすことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例２における、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩および４−アミノアンチピリンの反射吸光度値の時間変化を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下に本発明をより具体的に説明する。本発明は下記化学式４：
【化５】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である）、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法に関する。
【００３４】
上記の通り、スケールアップの際、従来技術では所望の高純度の発色化合物を得ることができない。これは少量での合成と異なり、大量合成する場合は、懸濁反応の影響が大きいためと考えられる。すなわち、原料の純度、粒径、中間体の安定性、不純物の洗浄効率等が大きく起因するのではないかとの予測の下に鋭意研究を行った。
【００３５】
その結果、メチル化反応、ニトロソ化反応、還元反応の条件および精製法等に、様々な技術的工夫を行うことにより、スケールアップする際、従来法に比較して、より効率的に高純度の発色化合物を合成する方法を見出し、本発明を完成させたのである。
【００３６】
［メチル化工程］
メチル化を行う対象化合物は、下記化学式１：
【００３７】
【化６】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、で示される化合物またはその塩である。
【００３８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち１つのみが、スルホン酸基である場合、好ましい部位は、呈色性の観点で、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４である。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうちの２つがスルホン酸基である場合、好ましい部位は、呈色性の観点で、Ｒ２、Ｒ４である。
【００３９】
なお、スルホン酸基は、イオン性官能基であるが、これらの官能基は、遊離の状態であっても、または塩を形成していてもよい、すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、スルホン酸基の塩であってもよい。
【００４０】
この際、これらの酸基と塩を形成する対イオンは、無機イオンでもよいし、有機イオンでもよい。例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等の無機塩基由来の陽イオン；アンモニウムイオン；アルキルアミン類等の有機塩基由来の陽イオン；およびアミノ酸類等の両性化合物由来のイオンなどが挙げられる。なかでも、塩の形態である場合には、好ましくはナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩であり、より好ましくはナトリウム塩である。
【００４１】
なお、後述する化学式２〜化学式６における「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５」は、いずれも、上記化学式１において行った「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５」の定義と同様である。よって、下記ではその説明を割愛する。
【００４２】
なお、ここで、化学式１で示される化合物またはその塩を得る方法について下記に説明する。
【００４３】
すなわち、本発明の化学式１で示される化合物またはその塩の製造方法は、下記化学式５：
【化７】
で示される化合物［以下、「化合物５」とも称する］と、下記化学式６：
【化８】
で示される化合物［以下、「化合物６」とも称する］とを、反応させる工程［工程（Ａ）］を有することが好ましい。
【００４４】
化合物５と化合物６とを反応させる上記工程（Ａ）において、化合物５及び６の混合比は、特に制限されない。好ましくは、化合物５及び６をそれぞれ等モル混合する、あるいは化合物5を化合物６に対してやや多めに混合することが好ましい。後者の場合、化合物５は、化合物６を１モルに対して、０．８〜２モル、より好ましくは１〜１．２モル程度の割合で、混合することが好ましい。また、化合物５と化合物６との反応条件は、これらの反応が進行する条件であれば特に制限されないが、例えば、反応温度は、好ましくは２０〜２００℃、より好ましくは、８０〜１５０℃の温度であり、反応時間は、好ましくは０．５〜５時間、より好ましくは１〜１．５時間である。また、化合物５と化合物６との反応は、無溶媒下で行なってもよく、あるいは溶媒中で行なってもよい。後者の場合に使用できる溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール等の、アルコール類；ＴＨＦ、ジエチルエーテル、ジオキサン等の、エーテル類；ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒が挙げられる。これらのうち、ＴＨＦが好ましい。化合物５と化合物６との反応後は、反応混合物を適当な溶媒中に加えることによって生成物を固化させることによって、原料化合物と分離回収することができる。
【００４５】
次に、工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）を用いて、以下のメチル化工程によってメチル化することで、化学式２で示される化合物が得られる。
【００４６】
すなわち、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）と、硫酸ジメチルと、を混合し、無溶媒下で加熱反応させる工程を含む、下記化学式２で示される化合物またはその塩：
【００４７】
【化９】
で示される化合物またはその塩が得られる。
【００４８】
上記の製造方法のように、溶媒を用いずに（無溶媒で）合成できるメリットとしては、反応容量を少量化でき、反応容器容積あたりの仕込み可能量が大きいことがあげられる。すなわち、通常の反応より小型の反応装置でより多くの製造ができるので、大量合成に好都合である。また、塩基を用いずに合成することもできる。
【００４９】
硫酸ジメチルは、市販のものを使用しても合成して使用してもよく、特に制限されることはない。
【００５０】
上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式１）の含水率は、１％以下が好ましく、０．５％以下が特に好ましい。上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式１）の含水率が高いと、反応中、硫酸ジメチルの加水分解が生じ、反応効率低下の虞れがある。
【００５１】
上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）の乾燥方法としては、通常、加熱乾燥でよく、常圧、減圧、いずれの方法でもよく、減圧加熱乾燥がより好ましい。乾燥の度合を示す含水率は、例えば、カールフィッシャー水分測定器を用いて測定し、重量％で示される。
【００５２】
上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）に対する前記硫酸ジメチルの量は、１．０〜２．０倍モルであることが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．３倍モルが特に好ましい。上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）に対する硫酸ジメチルの添加量が、１．０倍モル未満だと、反応効率低下の虞れがあり、２．０倍モルを越えると副生成物の増大の虞れがある。
【００５３】
本発明に係る硫酸ジメチルの添加の方法としては、滴下ロート、ピペットなどを用いることができるが、外気中の水分による硫酸ジメチルの加水分解を防ぐために滴下ロートを用いて反応系を密閉して行なうのが好ましい。また、室温、１ａｔｍにおいて上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）と、硫酸ジメチルとを混合する際には、液体である硫酸ジメチルに完全に溶解させてもまたは溶解させなくてもよく、両者がどのような状態であろうが混合していればよい。
【００５４】
メチル化工程における加熱反応の温度（内温）としては、１４０〜２００℃が好ましく、１５０〜１９０℃が特に好ましく、１６０〜１８０℃がさらに好ましい。
【００５５】
上記加熱反応の温度が１４０℃未満だと、反応効率低下の虞れがあり、２００℃超だと、副生成物の増大の虞れがある。
【００５６】
メチル化工程における加熱反応の反応時間としては、０．５〜２０時間が好ましく、０．５〜１０時間が特に好ましい。
【００５７】
上記加熱反応の反応時間が０．５時間未満だと、反応効率低下の虞れがあり、２０時間超だと、副生成物の増大の虞れがある。
【００５８】
メチル化工程において、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）と、硫酸ジメチルとを混合し、無溶媒下で加熱反応させて得られた反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得る工程と、前記反応混合溶液に酸を加えて固体を単離する工程とを含むことが好ましい。
【００５９】
本発明に係る化学式２で示される化合物は、溶媒抽出による回収が困難であるため酸を添加することで強制的に沈殿するいわゆる“酸沈”により回収することが好ましい。これにより、最終目的物を高い純度で得られることができる。
これにより、化学式２で示される化合物またはその塩を高い純度で得られることができる。
【００６０】
メチル化工程に用いられるアルカリ水溶液のアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムが好ましく、水酸化ナトリウムが特に好ましい。
【００６１】
メチル化工程に用いられるアルカリ水溶液の濃度としては、１０〜３０ｗ／ｖ％（重量対体積％）が好ましく、１５〜２５ｗ／ｖ％が特に好ましく、２０〜２５ｗ／ｖ％がさらに好ましい。
【００６２】
また、上記反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて得られる反応混合溶液のｐＨは、７〜１４が好ましい。
【００６３】
メチル化工程に用いられるアルカリ水溶液中のアルカリの量としては、使用する硫酸ジメチルに対して２〜５倍モルが好ましく、２．５〜４倍モルが特に好ましく、３倍モルがさらに好ましい。
【００６４】
メチル化工程に用いられる酸としては、有機酸または無機酸のいずれでもよく、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、ピクリン酸、濃硫酸、濃硝酸などが用いられるが、塩酸、硫酸、硝酸がより好ましく、塩酸がさらに好ましい。
【００６５】
メチル化工程において、上記反応物に添加する酸の濃度としては、なるべく水分量を減らすべく濃度が高いものが好ましい。
【００６６】
上記反応物混合溶液に添加する酸の濃度は、５〜１００ｗ／ｖ％（重量／体積％）が好ましく、１５〜１００ｗ／ｖ％がより好ましく、３０〜１００ｗ／ｖ％が特に好ましい。例えば、添加する酸として塩酸を用いる場合は、１５〜３６ｗ／ｖ％が好ましく、３０〜３６ｗ／ｖ％が特に好ましい。
【００６７】
上記反応物混合溶液に添加する酸の量は、１〜１０倍モルが好ましく、１〜５倍モルがより好ましく、１．５〜３倍モルが特に好ましい。
【００６８】
上記反応物に添加する塩酸の量としては、出発物質の使用量に対して、１〜５倍モルが好ましく、１．５〜３倍モルが特に好ましく、１．８〜２．２倍モルがさらに好ましい。
【００６９】
また、メチル化工程において酸を加え沈殿を生成させる工程で用いる攪拌装置としては、磁気スターラー、メカニカルスターラーなどを用いることができる。
【００７０】
メチル化工程において、前記単離工程で得られた固体を水から再結晶する工程をさらに含むことが好ましい。すなわち、本発明の製造方法は、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物と、硫酸ジメチルを混合し、無溶媒下で加熱反応させて得られた反応混合物を得る工程と、アルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得た後、さらに前記反応混合溶液に酸を加えて固体（上記化学式2に示される化合物を含むもの）を単離する工程と、単離された前記固体を水から再結晶する工程とを含むことが好ましい。
【００７１】
メチル化工程における再結晶で用いる水の量としては、固体１００ｇ当り、５００ｍｌ〜３０００ｍｌが好ましく、１０００ｍｌ〜２０００ｍｌが特に好ましく、１０００ｍｌ〜１５００ｍｌがさらに好ましい。なお、当該単離された固体は、０．５〜２４時間、室温条件下で減圧乾燥したものが使用される。
【００７２】
上記再結晶工程で固体を水に溶解させる際に、加熱を行なってよい。加熱器具としては、水浴、油浴、マントルヒーター、ホットプレートなどが用いられる。加熱する際の加熱器具の温度設定は、５０〜１５０℃が好ましく、７０〜１３０℃が特に好ましく、９０〜１１０℃がさらに好ましい。
【００７３】
また上記再結晶のための放置時間は、３０分〜３日が好ましく、１時間〜１日が特に好ましく、１０時間〜１５時間がさらに好ましい。さらに、上記再結晶のための放置時の温度は、０〜４０℃が好ましく、０〜２５℃が特に好ましく、０〜１５℃がさらに好ましい。
【００７４】
メチル化工程において使用される水は、特に制限されるものではなく、水道水、イオン交換水、純水、超純水、または工業用水などの水洗水を使用することができ、純水が特に好ましい。
【００７５】
上記により得られた、前記化学式２で示される化合物またはその塩の純度の測定方法は、後述する。
【００７６】
［ニトロソ化工程］
（微粉化）
前記化学式２で示される化合物またはその塩は、微粉化した後、ニトロソ化するのが好ましい。微粉化後の粒径は、５００μｍ以下が好ましく、３００μｍ以下が特に好ましく、２００μｍ以下がさらに好ましい。微粉化の方法は、特に制限はないが、乳鉢、ミル等用いることができる。なお、微粉化後の粒径が、５００μｍ超だと、上記メチル化工程で得られた反応生成物（化学式２）が反応せず、原料残りの虞れがある。
【００７７】
（亜硝酸塩）
前記化学式２で示される化合物またはその塩は、亜硝酸塩を用いてニトロソ化される。ニトロソ化工程に用いる亜硝酸塩は、特に制限はないが、亜硝酸のカチオン塩が用いられると好ましい。
【００７８】
カチオン塩としても、特に制限はなく、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが好適に挙げられる。具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、入手のし易さの観点で、ナトリウム塩が特に好ましい。
【００７９】
ニトロソ化工程に用いる亜硝酸塩の量は、化学式２で示される化合物またはその塩（本明細書中、単に「出発物質」とも称する。）の量に対して、反応効率および副生成物の観点で、１．０〜２．０倍モルが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【００８０】
（酸）
前記ニトロソ化工程におけるニトロソ化反応は、反応性の観点で、酸の存在下において行うとよい。
【００８１】
ニトロソ化工程に用いられる酸は、特に制限はないが、反応性の観点で、塩酸、硫酸、硝酸、濃塩酸、濃硫酸、濃硝酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、ピクリン酸が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、取り扱いの観点で、塩酸が特に好ましい。
【００８２】
ニトロソ化工程に用いられうる酸の量にも、特に制限はないが、出発物質の量に対して、反応効率および副生成物の生成の観点で、０．５〜２．０倍モルが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【００８３】
また、添加する酸は、副生成物の生成を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは１〜１０℃、さらに好ましくは１〜５℃にしておくとよい。なお、添加する酸を、後述する溶媒で希釈した場合も同様の温度に制御しておくとよい。
【００８４】
（溶媒）
ニトロソ化工程において、出発物質と上記亜硝酸塩、酸を混合する場合、それぞれを予め溶媒に含有させておいてもよい。
【００８５】
つまり、溶媒に、それぞれの原末（出発物質と亜硝酸塩）または原液（酸）を加えていく方法や、出発物質を溶媒に含有させた溶液（本明細書中、「出発物質の溶液」とも称する）に、亜硝酸塩、酸を溶媒に含有させた溶液（それぞれ、「亜硝酸塩の溶液」、「酸の溶液」とも称する。）を添加する方法を用いてもよい。
【００８６】
好ましくは、反応効率の観点で、出発物質の溶液に、亜硝酸塩の溶液および酸の溶液を添加する方法である。つまり、酸の溶液と、亜硝酸塩の溶液とを、化学式2で示される化合物またはその塩の溶液に滴下して添加する。
【００８７】
この際、添加する亜硝酸塩と酸の溶液は、副生成物の生成を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは１〜１０℃、さらに好ましくは１〜５℃にしておくとよい。また、添加する亜硝酸塩の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは３〜５ｍｏｌ／ｌにしておくとよい。
【００８８】
また、添加する酸の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは３〜５ｍｏｌ／ｌにしておくとよい。
【００８９】
また、出発物質の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは０．１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは０．５〜２ｍｏｌ／ｌである。
【００９０】
また、予め出発物質の溶液を、副生成物を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは０〜５℃、さらに好ましくは０〜３℃にしておくとよい。
【００９１】
前記溶媒は、特に制限はないが、水、有機溶媒またはこれら混合物（混合溶媒）が用いられうる。なお、本明細書中、溶媒として「水」を主成分（好ましくは、全部）とした溶液の名称を「水溶液」とも称する。なお、本明細書中、「水を主成分とする」とは、全溶液中に水の占める割合が、１０〜１００ｖ／ｖ％であることを意味する。
【００９２】
有機溶媒としては、特に制限はないが、アルコール、エーテル類、ケトン類、エステル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられる。
【００９３】
アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノールなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【００９４】
エーテル類としては、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジフェニルエーテル、ベンジルエーテル及びｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【００９５】
ケトン類としては、アセトン、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）及びシクロヘキサノンなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【００９６】
これらのうち、反応性の観点で、水単独または水とアルコールとの混合物が好ましく、水単独が特に好ましい。
【００９７】
水および有機溶媒の混合溶媒を用いる際は、例えば、好ましくは水／有機溶媒（容量比）＝０／１００〜１００／０、より好ましくは水／有機溶媒（容量比）＝１０／９０〜１００／０程度がよい。この際、有機溶媒の含有量が、混合溶媒中、５０容量％を超えると、亜硝酸塩の析出の虞れもある。
【００９８】
また、上記の通り、出発物質と、亜硝酸塩と酸とを混合させる方法にも特に制限はないが、反応性の観点で、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液とを、攪拌下で、出発物質の溶液に添加する方法が好ましい。添加する条件は、副生成物を抑える観点で、亜硝酸塩の溶液と酸の溶液を、ほぼ同じ速度で、同時に添加することが好ましい。
【００９９】
ここで、「同時に添加する」とは、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液とを添加しているある時点が、一瞬でも互いに重複すればよいが、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液との添加を開始する時点と、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液との添加を終了する時点とが、実質的に同じであると好ましい。
【０１００】
さらには、添加する条件は、さらに副生成物を抑える観点で、酸またはその水溶液を亜硝酸塩の水溶液より先に化学式２で示される化合物またはその塩の水溶液に滴下して添加することが好ましい。
【０１０１】
酸またはその水溶液と亜硝酸塩の水溶液の添加中、および添加後の溶液の温度は、０〜１０℃が好ましい。
【０１０２】
０℃以下では反応が進みにくく、１０℃以上では生成物の安定性に難がある。
【０１０３】
なお、この際の、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液の添加の方法にも特に制限はないが、ピペット、シリンジ、滴下ロートなどを用いて行なわれることが好ましい。また、これらの添加に要する時間は、グラムスケールの反応では、生成物の安定性の観点で、１〜３０分が好ましく、３〜７分が特に好ましく、４〜６分がさらに好ましい。
【０１０４】
また、添加は、磁気攪拌子等で、攪拌しながら行うことが、好ましい。
【０１０５】
さらに、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液と、を添加した後、そのまま静置しておいてもよいが、反応が添加後、時間とともに進行するため、好ましくは、上述の磁気攪拌子等で、好ましくは１〜６０分程度、より好ましくは３０分程度、激しく攪拌するとよい。この際、「激しく攪拌する」の攪拌速度にも特に制限はないが、好ましくは３００〜１２００ｒｐｍ、より好ましくは６００〜１０００ｒｐｍである。
【０１０６】
（反応時間）
ニトロソ化工程における反応時間にも特に制限はないが、あまりに反応時間が短すぎると、反応が不十分で出発物質の残留が生じる虞れがある。一方で、あまりに反応時間が長過ぎると、生成したニトロソ体の分解が起こる虞れがある。
【０１０７】
反応時間は、亜硝酸塩の溶液と酸の溶液を添加する時間を含めて、グラムスケールの反応では、１〜６０分が好ましく、５〜４５分がより好ましく、１０〜３０分がさらに好ましい。
【０１０８】
（反応温度）
ニトロソ化工程において設定される反応温度としては、副生成物の生成を抑える観点で、０〜１５℃が好ましく、１〜１０℃がより好ましく、１〜５℃がさらに好ましい。かような温度条件にするためには、従来公知の知見を適宜参照して制御することができ、例えば、水浴や氷浴等を用いればよい。
【０１０９】
上記ニトロソ化工程を経ることにより、
下記化学式３：
【０１１０】
【化１０】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、で示される化合物またはその塩を得ることができる。
【０１１１】
［単離工程］
本発明においては、上記ニトロソ化工程の後、化学式３で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程を経る。つまり、本発明においては、ニトロソ化工程終了後、そのままワンポットで、一気に、後述の還元工程を行わず、単離工程を必須の工程として有する点に特徴の一つを有する。
【０１１２】
上記の通り、従来、所望の発色化合物を、高純度かつ高収率で得ることができないのは、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定ではないかとの予測の下に鋭意研究を行った。そして、その予測は正しく、中間体であるニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）は不安定であり、それが、収率減少や目的物の純度低下の一因となっていることを見出したのである。
【０１１３】
つまりは、中間体であるニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）を適切な精製を行わなければ、結局は、最終生成物たる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の収率減少や純度低下という結果に直結するのである。
【０１１４】
一方で、ニトロソ化工程終了後、ワンポット（一気に）で、後述の還元工程に移行する条件の下で、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の製造を試みると、中間体であるニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）の単離をすることが非常に困難なのである。つまりは、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）中に存在する副生成物の分離除去を行うことが困難なのである。
【０１１５】
その観点からして、上記ニトロソ化工程においては、中間体であるニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）の単離を容易に行わせしめるべく、最適なニトロソ化反応条件を詳細に検討する点も、非常に有用であると言えるのである。具体的には、本発明の製造方法におけるニトロソ化工程によれば、化学式３で示される化合物またはその塩のみが、沈殿分離するため、容易に単離精製することができる。また、上記にて、亜硝酸塩、酸を、それぞれ化学式２で示させる化合物またはその塩に対して、ほぼ等量で添加するのも、副生成物の生成をより抑え、ひいては化学式３で示される化合物またはその塩を容易に単離精製させるために他ならない。
【０１１６】
上記の通り、ニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）を固体として単離することによって、不純物が除去され、次の還元工程が効率的に進行するため、最終的に得られるアミノ体（化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩）の純度が高くなり、また還元工程における収率も向上するのである。
【０１１７】
以下、単離工程における、ニトロソ体を単離する方法について詳説する。
【０１１８】
ニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）を単離する具体的方法としては、特に制限はないが、ニトロソ化工程終了後に得られた反応混合物を、濾過したり、遠心分離したりすることなどによって行なわれるとよい。なお、かようにして得られたものを、「ニトロソ化物固体」とも称する。
【０１１９】
この際の濾過方法や条件としては、特に制限ないが、ろ紙を用いた吸引ろ過によって行うことができる。
【０１２０】
なお、得られたニトロソ化物固体は、溶媒で洗浄することにより、さらに純度が高くなる。
【０１２１】
この洗浄に用いられうる溶媒は、特に制限はないが、有機溶媒、またはこれらの混合物が用いられる。これらのうち、ニトロソ体の安定性の観点で、有機溶媒は、アルコールが好ましい。アルコールとしても特に制限はなく、上記にて列挙した具体例が同様に妥当であるが、ニトロソ体の安定性・純度の観点で、メタノールが特に好ましい。
【０１２２】
この際、洗浄に用いるアルコールは、ニトロソ体の安定性の観点から、好ましくは−２０℃〜１０℃程度、より好ましくは０〜５℃程度に冷却しておくと良い。
【０１２３】
このように得られたニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）の固体は、減圧乾燥などによって乾燥することによって、さらに、保存安定性が向上する。この際の減圧乾燥方法や条件としても、特に制限ないが、真空ライン（好ましくは０〜１０ｍｍＨｇ、より好ましくは１〜２ｍｍＨｇ）に接続して行うことができる。
【０１２４】
かようにして、化学式３で示される化合物またはその塩を単離することができる。
【０１２５】
［還元工程］
本発明における還元工程では、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩を、接触水素還元法を用いて還元する。
【０１２６】
かような還元工程を経ることにより、
下記化学式４：
【０１２７】
【化１１】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、で示される酸化発色化合物またはその塩を製造することができる。
【０１２８】
（水素）
接触水素還元工程において、前記単離工程により得られた化学式3で示される化合物またはその塩に、水素を接触させる。水素はボンベや発生装置から供給する。水素を効率的に反応混合物と接触させるために、一定圧の水素を供給しながら激しく攪拌を行う、あるいは攪拌下水素を連続的に吹き込むなどの方法がとられる。
【０１２９】
（触媒）
接触水素還元工程において、触媒を必須成分として用いる。触媒としては、パラジウム炭素、白金炭素、パラジウム硫酸バリウム、パラジウム炭酸バリウム、パラジウム炭酸ストロンチウム、ラネーＮｉ、銅-クロム酸化物、ラネーコバルトなどを用いることができるが、パラジウム炭素が特に好ましい。
【０１３０】
接触水素還元工程において、触媒の量は、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩に対して重量％で１〜２０％が好ましく、３〜１５％がより好ましい。
【０１３１】
パラジウム炭素を用いる場合、パラジウムの含有量は、全重量に対して２〜２０％が好ましく、７．５〜１０％が特に好ましい。
また、パラジウム炭素は乾燥状態で発火の危険性があるため、安全のため適量の水分を含んだものを用いる。過剰な水分は触媒活性の低下をまねく。水分の含有量は、全重量に対して１０〜９０％が好ましく、５０〜６０％が特に好ましい。
【０１３２】
（酸）
還元工程における還元反応は、酸の存在下において行うとよい。化学式３で示される化合物（ニトロソ体）は酸の存在で安定化するため、酸の使用は特に好ましい。
【０１３３】
還元工程に用いられる酸は、特に制限はなく、どのような種の酸でも用いうるが、反応性の観点で、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、取り扱いやすさの観点で、塩酸が好ましい。
【０１３４】
還元工程に用いられうる酸の量にも、特に制限はないが、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩の量に対して、副生成物を抑える観点で、１〜３０倍モルが好ましく、１〜５倍モルが特に好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【０１３５】
（溶媒）
化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の製造のために、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩と、触媒を用い、上記の通り、還元反応は、酸の存在下で行うとよいが、必要に応じ反応溶媒を用いるとよい。反応溶媒としては、特に制限はなく、上記ニトロソ化工程で説明した具体例が、同様に妥当である。
【０１３６】
還元工程に用いられる化学式３で示される化合物またはその塩は、反応溶媒に懸濁した状態（スラリー）で反応に供されるのが好ましい。これは、反応溶媒に溶解した状態では、反応が複雑化し副生成物が多くなるためである。
【０１３７】
これに適した溶媒としては、反応速度の観点からも、アルコール類が好ましい。
【０１３８】
アルコール類としては、直鎖、分岐鎖、いずれの価数のものも用いうるが、炭素数が１〜６のものが好ましい。実際には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ヘプタノール、ｎ−ヘキサノールなどが用いられる。
【０１３９】
アルコール類としてはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノールが好ましく、２−プロパノールがさらに好ましい。
【０１４０】
アルコール類は他の有機溶媒や水と混合して用いてもよいが、アルコール類単独が好ましい。
【０１４１】
還元工程における溶媒の量は、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩１ｇに対して、反応性の観点で、５〜１００ｍＬが好ましく、７．５〜５０ｍＬがより好ましく、１０〜２０ｍＬがさらに好ましい。
【０１４２】
また、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩と、触媒、酸、溶媒とを攪拌させる方法にも特に制限はないが、反応性の観点で、磁気攪拌子あるいはメカニカルスターラー等により攪拌する方法が好ましい。
【０１４３】
より具体的には、単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩を反応容器に入れ、予め酸を含有させた溶媒を添加することが好ましい。
【０１４４】
触媒は安全性の観点から、単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩を酸含有溶媒に分散させた後、反応容器内を窒素で置換してから投入することが好ましい。
【０１４５】
（反応温度）
還元工程において設定される反応温度としては、常温〜３００℃が好ましく、常温が特に好ましい。かような温度条件にするためには、従来公知の知見を適宜参照して制御することができ、例えば、水浴、氷浴、油浴、恒温槽などを用いればよい。
【０１４６】
（圧力）
還元工程における接触水素還元反応では、系内（水素雰囲気下）の圧力が１〜１００ａｔｍの範囲で行われることが好ましく、特に常圧下（１ａｔｍ）で行われることが好ましい。
【０１４７】
（反応容器）
還元工程に用いられる反応容器の素材としても、特に制限はなく、前記ニトロソ化工程で説明した具体例が同様に妥当である。気体状の水素と効率よく接触させるため、効率の高い攪拌装置を用いうる反応容器が好ましい。攪拌装置は、機械式攪拌装置、磁気攪拌装置などが用いられる。また、反応容器は、気体状の水素を供給するための導入管や導入口を、持つものあるいは装着できるものがふさわしい。なお、加圧下で反応を行う場合は、耐圧性容器を用いる必要がある。
【０１４８】
かような還元工程を経ることにより、前記化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を製造することができる。
【０１４９】
［精製工程］
ａ．触媒含有反応物分取工程
上記還元工程終了後、触媒を含む目的反応物（不溶物）を分取することが好ましい。触媒含有反応物は、濾過によって分取できる。濾過は、常圧、減圧いずれでもよく、濾材としては通常の濾紙を用いてもよい。
【０１５０】
ｂ．触媒含有反応物洗浄工程
分取した上記触媒含有反応物を、不純物を除去するために、アルコールにて分散洗浄することが好ましい。
【０１５１】
アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノールなどが好適に用いられうるが、エタノールがより好ましい。
【０１５２】
分散洗浄としては、磁気攪拌子等の通常の攪拌装置を使用することができる。
【０１５３】
上記の分散洗浄を行なうことにより、高純度の化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を得るために、下記に示す、酸析工程の回数を削減することができ、酸析１回でも純度９９％以上の化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１５４】
ｂ．触媒除去工程
上記触媒含有反応物洗浄工程終了後、触媒を除去することが好ましい。触媒を除去するために、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に目的物を溶解し、溶け残った触媒は、濾過によって除去される。濾過は、常圧、減圧いずれでもよく、濾材としては通常の濾紙を用いてもよいが、メンブランフィルターやセライトを使用することによってさらに触媒の残留量を減少させることができる。
【０１５５】
ｃ．酸析工程
上記触媒除去工程終了後、さらに不純物を除去するために、目的物を含有する炭酸水素ナトリウム水溶液に酸またはその水溶液を添加して酸析することが好ましい。
【０１５６】
酸としては、特に制限はなく、どのような種の酸でも用いうるが、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、取り扱いやすさの観点で、塩酸が好ましい。
【０１５７】
酸析工程の回数については、特に制限はなく、回数が多いほど、高純度の化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができるが、実用上、上記の分散洗浄後、１回の酸析工程を経ることにより、純度９９％以上の化学式4で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１５８】
ｄ．再溶解工程
上記酸析工程終了後、水溶性とするために、炭酸水素ナトリウム水溶液に再
溶解して、ナトリウム塩にもどすことが好ましい。
【０１５９】
ｅ．抽出工程
上記再溶解工程を経た後、得られた混合物から、さらに残留する無機塩を除くため、抽出工程を経ることが好ましい。かような抽出工程を経ることにより、より高純度かつ高収率で、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１６０】
抽出工程は、上記再溶解工程を経て得られた混合物を固体状態とし、溶媒で抽出する方法が用いられうる。抽出工程における抽出方法は、混合物を粉末状態として溶媒を加えて攪拌する他、一般に用いられる抽出装置を使用して行なってもよい。
【０１６１】
再溶解工程を経て得られた混合物を固体状態にする方法にも特に制限はないが、例えば、減圧乾燥方法等により蒸発乾固する方法が挙げられる。
【０１６２】
この際の減圧乾燥方法や条件としても、特に制限ないが、真空ライン（好ましくは０〜３０ｍｍＨｇ、より好ましくは１〜２ｍｍＨｇ）に接続して行うことができる。
【０１６３】
抽出工程における溶媒としては、最終目的物（化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩）を溶解できるものであれば特に制限されないが、アルコールが好ましく、より具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノールなどが好適に使用できる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、抽出効率の観点で、エタノールが特に好ましい。
【０１６４】
また、本発明の製造方法により得られる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、両性でありうるため、本来、単離をすること自体も困難である。しかしながら、上記の通り、メチル化物の単離、再結晶（不純物除去）、ニトロソ化物の単離（不純物除去）、残留触媒の除去、エタノールによる無機塩（ＮａＨＣＯ３）の分離などの工夫を行うため、容易に単離を行うことができる。
【０１６５】
本発明の製造方法によると、純度は、少なくとも９５％以上、実際には９９％以上に向上する。また、工程の大幅な短縮化もできる。この点においても、本発明は非常に優れていると言える。なお、目的物の純度等は以下の方法で調べることができる。
【０１６６】
（１）ＴＬＣ
・ＴＬＣプレート：シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ １．１３７２８．０００１、濃縮ゾーン付ＨＰＴＬＣ）
・展開溶媒：クロロホルム／メタノール／アンモニア水（５９：３１：１０）
・試料溶解液：水／メタノール混合液（１：６）
・検出：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１６７】
標品と同時に展開を行い、目視で反応進行度合いの確認に用いられる。
【０１６８】
（２）ＨＰＬＣ
・カラム： ＹＭＣ社製 分析カラムＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ ２５０Ｘ４．６ｍｍＩ．Ｄ．（ＨＳ１２Ｓ０５−２５４６ＷＴ）
・ガードカラム：ＹＭＣ社製 ガードカートリッジカラムＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８２３ Ｘ４．０ｍｍＩ．Ｄ．
・溶離液：アセトニトリル／２３ｍＭリン酸バッファー (ｐＨ７．５)＝１／９
・試料濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ
・試料溶解液：溶離液
・流速： ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
・カラムオーブン温度：４０℃
・検出：ＵＶ（測定波長：２５４ｎｍ)
【０１６９】
全ピーク面積の和のうち目的物のピーク面積の％を計算し、純度とした。
【０１７０】
本発明の製造方法により製造された酸化発色化合物またはその塩、つまり、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の特に好ましい用途・使用について説明する。
【０１７１】
［試薬組成物］
化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一つである、酵素を用いた比色分析法に好適に使用される。特に２分子で機能する酸化型発色試薬のうちのカプラーとして用いられうる。すなわち、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、例えば、前記背景技術の項で記載したトリンダー試薬と共に用いられ、被測定物質の酵素的酸化で生じる過酸化酸素をさらにペルオキシダーゼで酸化して生成した活性酸素によって、２分子が酸化縮合することによって呈色する。
【０１７２】
すなわち、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、を含む試薬組成物が提供される。
【０１７３】
つまり、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、カプラーとして使用することが特に好ましく、それ以外については従来公知の知見が適宜参照され、特に限定されるものではない。
【０１７４】
トリンダー試薬としては、特に制限はなく、従来公知の化合物がいずれも好ましく用いられうる。ただ、中でもＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンが好ましく、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンが、発色強度や波長といった観点で、特に好ましい。
【０１７５】
「測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼ」としては、例えば、測定対象物がグルコースである場合、該オキシダーゼはグルコースオキシダーゼであり、測定対象物がコレステロールである場合、該オキシダーゼはコレステロールオキシダーゼであり、測定対象物が尿酸である場合、該オキシダーゼはウリカーゼであり、測定対象物がピルビン酸である場合、該オキシダーゼはピルベートオキシダーゼである。これらは測定対象物の基質のみを特異的に酸化するために、色々な成分を含む検体からそれぞれの測定対象物のみを限定して定量することができる。
【０１７６】
前記試薬組成物において、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩とトリンダー試薬とのモル比は、１：１〜２：１であることが好ましく、１．３：１がより好ましい。化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩とトリンダー試薬とのモル比が１：１未満である場合、また、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩とトリンダー試薬とのモル比が２：１を超える場合、発色不良を生じることがある。
【０１７７】
当該試薬組成物中の、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量は、カプラー１５ｍｍｏｌに対して、４３３ｋ〜２６００ｋＵであることが好ましく、８６６ｋ〜２６００ｋＵであることがより好ましい。測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量が、カプラー１５ｍｍｏｌに対して４３３ｋＵ未満である場合、発色不良を生じることがある。なお、前記測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量は、４ＡＡ−ＴＯＯＳ法により測定したユニット数を採用するものとする。
【０１７８】
当該試薬組成物中のペルオキシダーゼの含有量は、カプラー１５ｍｍｏｌに対して１６６．５ｋ〜１６６６ｋＵであることが好ましく、３３３ｋ〜９９９ｋＵであることがより好ましい。ペルオキシダーゼの含有量が、カプラー１５ｍｍｏｌに対して１６６．５ｋＵ未満である場合、発色不良を生じることがある。なお、前記ペルオキシダーゼの含有量は、ピロガロール法により測定したユニット数を採用するものとする。
【０１７９】
当該試薬組成物は、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、を含む。すなわち、「化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼ」以外の他の成分を、試薬組成物としての機能を害さない程度含んでいてもよい。該成分としては、例えば、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、保護剤等が挙げられる。
【０１８０】
なお、これら他の成分の含有量は、試薬組成物としての機能を害さなければ特に制限されないが、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとの総質量に対して、好ましくは１０〜３０質量％、より好ましくは１３〜２０質量％含まれてもよい。
【０１８１】
化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一種である、酵素を用いた比色分析法に好適に使用されるカプラーとして用いられうる。すなわち、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、前記トリンダー試薬と共に用いられ、測定対象物の酵素的酸化で生じる過酸化酸素を、さらにペルオキシダーゼ酸化して生成した活性酸素によって、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を含むカプラーと、トリンダー試薬と、が酸化縮合することによって呈色する。そのため化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、上記の通り、その化合物自体に特徴を有するものであるが、カプラーとして使用することが特に好ましい。
【０１８２】
上述の通り、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は水溶性が高いため、それを含む試薬組成物や、該試薬組成物を担体に保持して試験具として使用する場合には、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こる点、非常に優れたものである。また、当該試薬組成物を用いた呈色反応（比色分析法）において、それによって生じた色素化合物についても、検体への溶解性や親和性が高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなり、感度が高く安定した測定が可能となる。さらには、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、溶解性が高いので、従来の試薬より高濃度の試薬組成物液（試薬液）が調製可能である。すると、該試薬組成物を担体に担持して、試験具として使用する場合、塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。
【０１８３】
また、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ない為に、化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらに、前記試薬組成物に含まれる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の親水性官能基は、担体への吸着性を高め、試験具として使用した場合でも、担体内での化合物の安定性を向上させる。このような試薬組成物を提供することにより、ひいては、経時劣化を低減させ有効期間が延びた試験具を提供することが可能となる。
【０１８４】
上記の通り、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、トリンダー試薬と、を組み合わせて、試薬組成物となる。
【０１８５】
化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、前記トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、組み合わせて、液体、粉末、錠剤、もしくは担体に保持した状態で分析用組成物として用いられうる。
【０１８６】
これら分析用組成物には、上記に加えて、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、保護剤等の成分を含んでいてもよい。
【０１８７】
なお、これら成分の含有量は、試薬組成物としての機能を害さなければ特に制限されないが、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとの総重量に対して、好ましくは１０〜３０質量％、より好ましくは１３〜２０質量％含まれてもよい。
【０１８８】
また、液体に保持して用いる場合には、検体と混合して反応させた後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で透過吸光度を測定してもよい。また、前記試薬組成物は、担体に保持した状態で用いてもよい。
【０１８９】
このように、前記試薬組成物は、種々の物に保持して用いることができるが、担体に保持した状態で試験具として用いることが好ましい。
【０１９０】
［試験具］
ドライケミストリーで用いられる試験用具のように、担体に保持した状態で用いる場合には、これらの試薬組成物を含む層の他、これの機能を害さない範囲において、計量層、展開層、濾過層、保持層等を含んでいてもよい。このように担体に保持して用いる場合には、検体を付与した後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で反射吸光度を測定してもよい。測定値は予め作製した検量線を用いて測定対象物の量に換算することができる。
【０１９１】
前記担体の素材としては、紙、布帛、高分子膜等の多孔質物質を用いることができるが、特に、発色性能といった点で、高分子膜が好ましい。
【０１９２】
上記高分子膜とは、高分子よりなる水不溶性の多孔質体である。高分子としては、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、セルロース、セルロースアセテート、硝酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、芳香族ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコールが挙げられる。これらの高分子は一般的に知られている製膜方法を用いて膜を形成することができる。これらの高分子膜の中でもポリスルホンまたはポリエーテルスルホンが、発色性能といった点で、特に好ましい。
【０１９３】
前記試薬組成物を担体に保持する方法にも特に制限はないが、担体に適当な溶剤に溶解させた試薬組成物溶液を担体にコーティングする他、試薬組成物を含むマトリックス前駆体を成型して試験層を形成させる等の公知の方法が用いられうる。
【０１９４】
コーティングは、工業用に使用される一般的なコート法を用いることができるが、担体が多孔質の場合には、しばしば塗工直後の液移動や不均一な乾燥に起因するコートむらが問題となる。担体と塗工液の物性や、塗工乾燥の方法、機器、条件がこれらを支配する重要因子となりうる。このため、精密印刷法が有効な場合もある。
【０１９５】
塗工後の液移動や不均一な乾燥を低減する為には、少量の液を正確に計量して塗工するような精密印刷技術が適するが、この方法では高い試薬濃度の塗工液を作製できることが必須となる。
【０１９６】
例えば、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーは、測定に用いる種々の試薬の中でも最も溶解性が低く、これが高い濃度の塗工液を作製するときの問題点となっていた。しかしながら、本発明の化合物は溶解性が高く、濃度の高い塗工液を作製するに好都合である。
【０１９７】
試薬を担体に保持させた試験具では、検体付与後、検体の液体成分によってまず試薬が溶解し、混合して反応が起こり、色素化合物が生成し、通常試験具の検体付与面の反対側にある読み取り面に移動し、その色調変化を測定する、というステップを経て定量が行なわれる。このため、試薬の溶解性が高いことは、検体による均一な溶解、均一化、迅速な反応に有利であるだけではなく、生成する色素も溶解性に優れるために読み取り面への移動がスムースかつ均一性が高いというメリットもある。これらの特徴は、測定時間の短縮化、測定精度の向上、測定値ばらつきの低減に寄与する。したがって、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は高い溶解性を有するため、測定時間の短縮化、測定精度の向上、測定値ばらつきの低減に寄与できることが期待される。
【０１９８】
４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーは、ある担体に保持させた試験具として使用した場合、濃度変化が測定値に影響するという問題点がある。バルク担体にコートする際むらが生じた場合には、それを切り抜いて用いる各試験具間に感度差が生じる、あるいは保存中に劣化分解して量が変化した場合測定値に影響が出るということを示唆している。原因は、酵素反応や呈色反応の阻害ではなく、化合物の濃度が高いほど他の試薬類の溶解や移動、また生成色素の流動性に何らかの障害を与えるのではないかと考えられている。これに対して、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は４−アミノアンチピリンと比較して濃度の測定値への影響が少なく、これらの問題を改善できる。
【０１９９】
本発明の製造方法により得られる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、トリンダー試薬と組み合わせて酸化発色させた場合には、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーを用いた場合と比較して吸光度が大きくなり、測定感度が向上することができる。例えば、本発明の４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン、４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン等は、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）やＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）と組み合わせて発色させた場合、その検量線の傾きは改善され、測定感度が向上されうる。
【０２００】
上述の通り、本発明の製造方法により得られる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は水溶性が高いため、それを含む試薬組成物を担体に保持してなる試験具を使用する場合、当該試薬組成物は、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こるため、当該試験具は、非常に優れたものとして使用されうる。
【０２０１】
また、前記試験具を用いた場合、試薬組成物の呈色反応において生じた色素化合物についても、検体への溶解性や親和性が高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなる。
【０２０２】
本願発明の製造方法により製造された化合物は、溶解性が高いので、従来の試薬より高濃度の試薬組成物液（試薬液）が調製可能である。すなわち、当該試薬組成物を担体に担持して試験具として使用する場合、塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。
【０２０３】
また、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ない為に、化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらに、当該試薬組成物に含まれる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の親水性官能基は、担体への吸着性を高める。すなわち、前記試験具は、担体内での化合物の安定性が向上されている。
【０２０４】
このように前記試薬組成物を含む試験具は、従来に比べ、経時劣化を低減させ有効期間が有意に延びたものといえる。
【実施例】
【０２０５】
次に実施例によって本発明を説明する。本発明の化合物は以下の実施例の製法で合成される。
【０２０６】
＜実施例１＞
１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
１２０℃で１２時間減圧乾燥した１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを２０７４ｇ（含水率：０．５％、カールフィッシャー水分測定器で測定）、２０Ｌ四口フラスコに入れ、１２５７ｇの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した。硫酸ジメチルの滴下後、四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた。次いで、温度コントローラーのセンサー部分をオイルバスに浸し、内温が１６０〜１８０℃になるように加熱を開始した。１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、３〜１０時間加熱した。反応後、四口フラスコを放冷後、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１７４ｇ＋純水：５Ｌ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上で攪拌しながら反応混合物の固形物を溶解した。さらに、溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２０７】
次いで、上記反応混合物の固形物をアルカリ水溶液で溶解した反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。四口フラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過し濾別した。氷冷下、得られた濾液に１．２４Ｌの濃塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水２Ｌにて洗浄した。得られた粗生成物を、スリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた２０Ｌ四口フラスコに入れ、純水７．２Ｌを加えて、９０〜１００℃に加熱溶解した。一晩攪拌しながら室温まで放冷し、目的物の結晶を析出させ、吸引濾過を行なった。上記の再結晶操作をもう一度繰り返し、４０℃の熱風乾燥機で一晩乾燥を行ない、目的物１５３２ｇを得た（収率：７０％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２０８】
【表１】
【０２０９】
＜実施例２＞
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程、単離工程」
４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例１で合成した１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを乳鉢で細かくすりつぶし、６０〜８０メッシュの篩いにかけて（約２００μｍ以下）、１５００．０ｇ（５．５９０ｍｏｌ）を２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコに秤量した。四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計を取り付けた。氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水５．５Ｌを加え、攪拌分散した。攪拌下、冷却した４Ｎ塩酸１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で加えた。その後、攪拌下、冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で、約１時間かけて滴下ロートから滴下した。滴下後、３０分間、０〜１０℃で激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約９Ｌをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。 その後、目的物（４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１１７１ｇを得た（収率：６９％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２１０】
（２）「還元工程、抽出精製工程」
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコにスリーワンモーター、パーフェクトシーラー、撹拌棒、撹拌羽、温度計、玉入冷却器、ガス導入管（先端内径：φ4mm）を取り付けた。窒素ガスをガス導入管から四つ口フラスコ中を約30分間窒素置換した。上記（１）で得られた４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１１００ｇ，２−プロパノール１６．５Ｌ（濃塩酸３５０ｍＬ含有）を四つ口フラスコに入れ、内部を窒素置換して、１０％パラジウム/活性炭（ｗｅｔ）２２０ｇを加えた。水素ガスをガス導入管から２−プロパノール溶液中に攪拌しながら通気した。室温下、８０時間、攪拌しながら水素ガスを通気した。反応後、フラスコ内容物を吸引濾過して、２−プロパノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。
濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，エタノール１０Ｌを加えて分散洗浄した。洗浄後、内容物を吸引濾過して、エタノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液８．３Ｌを加えて攪拌して目的物を溶解抽出した。セライト−５４５をロート上に積層して容器内容物をロートに注いで吸引濾過を行なった。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３Ｌでロート上から洗浄した。目的物を溶解抽出した濾液に濃塩酸を加えてｐＨ＝１以下とした。氷冷下攪拌して目的物の結晶を析出させた。析出した結晶を吸引濾過して、希塩酸１Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５．９Ｌを加えて攪拌して目的物を再溶解した。１０Ｌロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で乾固するまで減圧濃縮を行なった。真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥した。生成物にエタノール７０Ｌを加え、目的物を攪拌抽出した。炭酸水素ナトリウム残渣を濾別して濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥して目的物６００ｇを得た（収率：５０％）。純度９９％（ＨＰＬＣ）。
【０２１１】
【表２】
【０２１２】
＜比較例１＞
１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
未乾燥の１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを２０７４ｇ（含水率：４．６％）、２０Ｌ四口フラスコに入れ、１２５７ｇの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した。硫酸ジメチルの滴下後、四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた。次いで、温度コントローラーのセンサー部分をオイルバスに浸し、内温が１６０〜１８０℃になるように加熱を開始した。１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、３０時間加熱した。反応後、四口フラスコを放冷後、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１７４ｇ＋純水：５Ｌ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上で攪拌しながら反応混合物の固形物を溶解した。さらに、溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２１３】
次いで、上記反応混合物の固形物をアルカリ水溶液で溶解した反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。四口フラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過し濾別した。氷冷下、得られた濾液に１．２４Ｌの濃塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水２Ｌにて洗浄した。得られた粗生成物を、スリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた２０Ｌ四口フラスコに入れ、純水７．２Ｌを加えて、９０〜１００℃に加熱溶解した。一晩攪拌しながら室温まで放冷し、目的物の結晶を析出させ、吸引濾過を行なった。上記の再結晶操作を純度９５％以上（ＨＰＬＣ）になるまで繰り返し、４０℃の熱風乾燥機で一晩乾燥を行ない、目的物２４０ｇを得た（収率：１１％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２１４】
【表３】
【０２１５】
＜比較例２＞
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程、単離工程」
４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例１で合成した１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを乳鉢ですりつぶし（粒径：約５００μｍ以上）、篩いにかけず、１５００．０ｇ（５．５９０ｍｏｌ）を２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコに秤量した。四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計を取り付けた。氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水５．５Ｌを加え、攪拌分散した。攪拌下、冷却した４Ｎ塩酸１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で加えた。その後、攪拌下、冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で、約１時間かけて滴下ロートから滴下した。滴下後、３０分間、０〜１０℃で激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約９Ｌをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。 その後、目的物（４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン９３３ｇを得た（収率：５５％。純度８１％（ＨＰＬＣ）。
【０２１６】
（２）「還元工程、抽出精製工程」
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコにスリーワンモーター、パーフェクトシーラー、撹拌棒、撹拌羽、温度計、玉入冷却器、ガス導入管（先端内径：φ4mm）を取り付けた。窒素ガスをガス導入管から四つ口フラスコ中を約30分間窒素置換した。実施例２の（１）で得られた４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１１００ｇ，２−プロパノール１６．５Ｌ（濃塩酸３５０ｍＬ含有）を四つ口フラスコに入れ、内部を窒素置換して、１０％パラジウム/活性炭（ｗｅｔ）２２０ｇを加えた。水素ガスをガス導入管から２−プロパノール溶液中に攪拌しながら通気した。室温下、８０時間、攪拌しながら水素ガスを通気した。反応後、フラスコ内容物を吸引濾過して、２−プロパノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液８．３Ｌを加えて攪拌して目的物を溶解抽出した。セライト−５４５をロート上に積層して容器内容物をロートに注いで吸引濾過を行なった。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３Ｌでロート上から洗浄した。目的物を溶解した濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で乾固するまで減圧濃縮を行なった。真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥した。生成物にエタノール７０Ｌを加え、目的物を攪拌抽出した。炭酸水素ナトリウム残渣を濾別して濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥して目的物６６０ｇを得た（収率：５５％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２１７】
【表４】
【０２１８】
＜実施例３＞
１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
１２０℃で１２時間減圧乾燥した１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを２０７４ｇ（含水率：０．５％）、２０Ｌ四口フラスコに入れ、１２５７ｇの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した。硫酸ジメチルの滴下後、四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた。次いで、温度コントローラーのセンサー部分をオイルバスに浸し、内温が１６０〜１８０℃になるように加熱を開始した。１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、３〜１０時間加熱した。反応後、四口フラスコを放冷後、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１７４ｇ＋純水：５Ｌ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上で攪拌しながら反応混合物の固形物を溶解した。さらに、溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２１９】
次いで、上記反応混合物の固形物をアルカリ水溶液で溶解した反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。四口フラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過し濾別した。氷冷下、得られた濾液に１．２４Ｌの濃塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水２Ｌにて洗浄した。得られた粗生成物を、スリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた２０Ｌ四口フラスコに入れ、純水７．２Ｌを加えて、９０〜１００℃に加熱溶解した。一晩攪拌しながら室温まで放冷し、目的物の結晶を析出させ、吸引濾過を行なった。上記の再結晶操作をもう一度繰り返し、４０℃の熱風乾燥機で一晩乾燥を行ない、目的物１６４１ｇを得た（収率：７５％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２２０】
【表５】
【０２２１】
＜実施例４＞
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程、単離工程」
４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例３で合成した１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを乳鉢で細かくすりつぶし、６０〜８０メッシュの篩いにかけて（約２００μｍ以下）、１５００．０ｇ（５．５９０ｍｏｌ）を２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコに秤量した。四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計を取り付けた。氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水５．５Ｌを加え、攪拌分散した。攪拌下、冷却した４Ｎ塩酸１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で加えた。その後、攪拌下、冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で、約１時間かけて滴下ロートから滴下した。滴下後、３０分間、０〜１０℃で激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約９Ｌをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。 その後、目的物（４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１２２１ｇを得た（収率：７２％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２２２】
（２）「還元工程、抽出精製工程」
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコにスリーワンモーター、パーフェクトシーラー、撹拌棒、撹拌羽、温度計、玉入冷却器、ガス導入管（先端内径：φ4mm）を取り付けた。窒素ガスをガス導入管から四つ口フラスコ中を約30分間窒素置換した。上記（１）で得られた４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１１００ｇ，２−プロパノール１６．５Ｌ（濃塩酸３５０ｍＬ含有）を四つ口フラスコに入れ、内部を窒素置換して、１０％パラジウム/活性炭（ｗｅｔ）２２０ｇを加えた。水素ガスをガス導入管から２−プロパノール溶液中に攪拌しながら通気した。室温下、８０時間、攪拌しながら水素ガスを通気した。反応後、フラスコ内容物を吸引濾過して、２−プロパノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。
濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，エタノール１０Ｌを加えて分散洗浄した。洗浄後、内容物を吸引濾過して、エタノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液８．３Ｌを加えて攪拌して目的物を溶解抽出した。セライト−５４５をロート上に積層して容器内容物をロートに注いで吸引濾過を行なった。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３Ｌでロート上から洗浄した。目的物を溶解抽出した濾液に濃塩酸を加えてＰＨ＝１以下とした。氷冷下攪拌して目的物の結晶を析出させた。析出した結晶を吸引濾過して、希塩酸１Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５．９Ｌを加えて攪拌して目的物を再溶解した。１０Ｌロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で乾固するまで減圧濃縮を行なった。真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥した。生成物にエタノール７０Ｌを加え、目的物を攪拌抽出した。炭酸水素ナトリウム残渣を濾別して濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥して目的物７０８ｇを得た（収率：５９％）。純度９９％（ＨＰＬＣ）。
【０２２３】
【表６】
【０２２４】
＜比較例３＞
１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
未乾燥の１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを２０７４ｇ（含水率：４．６％）、２０Ｌ四口フラスコに入れ、１２５７ｇの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した。硫酸ジメチルの滴下後、四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた。次いで、温度コントローラーのセンサー部分をオイルバスに浸し、内温が１６０〜１８０℃になるように加熱を開始した。１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、３０時間加熱した。反応後、四口フラスコを放冷後、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１７４ｇ＋純水：５Ｌ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上で攪拌しながら反応混合物の固形物を溶解した。さらに、溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２２５】
次いで、上記反応混合物の固形物をアルカリ水溶液で溶解した反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。四口フラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過し濾別した。氷冷下、得られた濾液に１．２４Ｌの濃塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水２Ｌにて洗浄した。得られた粗生成物を、スリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた２０Ｌ四口フラスコに入れ、純水７．２Ｌを加えて、９０〜１００℃に加熱溶解した。一晩攪拌しながら室温まで放冷し、目的物の結晶を析出させ、吸引濾過を行なった。上記の再結晶操作を純度９５％以上（ＨＰＬＣ）になるまで繰り返し、４０℃の熱風乾燥機で一晩乾燥を行ない、目的物２１８ｇを得た（収率：１０％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２２６】
【表７】
【０２２７】
＜比較例４＞
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程、単離工程」
４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例３で合成した１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを乳鉢ですりつぶし（粒径：約５００μｍ以上）、篩いにかけず、１５００．０ｇ（５．５９０ｍｏｌ）を２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコに秤量した。四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計を取り付けた。氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水５．５Ｌを加え、攪拌分散した。攪拌下、冷却した４Ｎ塩酸１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で加えた。その後、攪拌下、冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で、約１時間かけて滴下ロートから滴下した。滴下後、３０分間、０〜１０℃で激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約９Ｌをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。 その後、目的物（４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン８４８ｇを得た（収率：５０％。純度７５％（ＨＰＬＣ）。
【０２２８】
（２）「還元工程、抽出精製工程」
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコにスリーワンモーター、パーフェクトシーラー、撹拌棒、撹拌羽、温度計、玉入冷却器、ガス導入管（先端内径：φ4mm）を取り付けた。窒素ガスをガス導入管から四つ口フラスコ中を約30分間窒素置換した。実施例４の（１）で得られた４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１１００ｇ，２−プロパノール１６．５Ｌ（濃塩酸３５０ｍＬ含有）を四つ口フラスコに入れ、内部を窒素置換して、１０％パラジウム/活性炭（ｗｅｔ）２２０ｇを加えた。水素ガスをガス導入管から２−プロパノール溶液中に攪拌しながら通気した。室温下、８０時間、攪拌しながら水素ガスを通気した。反応後、フラスコ内容物を吸引濾過して、２−プロパノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液８．３Ｌを加えて攪拌して目的物を溶解抽出した。セライト−５４５をロート上に積層して容器内容物をロートに注いで吸引濾過を行なった。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３Ｌでロート上から洗浄した。目的物を溶解した濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で乾固するまで減圧濃縮を行なった。真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥した。生成物にエタノール７０Ｌを加え、目的物を攪拌抽出した。炭酸水素ナトリウム残渣を濾別して濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥して目的物７８０ｇを得た（収率：６５％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２２９】
【表８】
【０２３０】
比較例に比べ、本発明の製造方法に係る実施例では、以下の効果が認めら れた。
（１）メチル化
本発明の製造方法に係る実施例では、比較例に比べ、より短時間で反応が進行し、そのため不純物の生成も少なく、精製工程が簡略化できるため、スケールアップが容易になり、収率向上につながった。
（２）ニトロソ化
本発明の製造方法に係る実施例では、比較例に比べ、未反応の原料残りも なく、反応時間の許容範囲が広く、反応工程が簡略化できるため、スケール アップが容易になり、純度、収率向上につながった。
（３）アミノ化
本発明の製造方法に係る実施例では、比較例に比べ、スケールアップした 際でも、高純度の目的物が再現よく得ることが可能となった。
【０２３１】
＜実施例５＞
試験片による性能評価
０．１３Ｍコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）１００ｍＬ中に、実施例２で合成した４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン ０．４６ｇ 、 Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン ０．９５ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ３．０ｇ、グルコースオキシダーゼ １５０Ｋ ｕｎｉｔ、ペルオキシダーゼ ２５０Ｋ ｕｎｉｔを溶解して塗工液を作成した。ポリエーテルスルホン膜（テルモ株式会社製、膜厚１３０μｍ）に塗工液を塗布し、３５℃で１８時間乾燥を行なった。膜を１ｃｍ角の正方形に打ち抜き、試験片を得た。試験片を反射分光光度計検出部に固定した後、１μＬの検体を試験膜上部より滴下し、１０秒後の反射吸光度を測定した。ヘマトクリット値４０、種々のグルコース濃度の血液で測定した値から検量線を作成し、定量感度を観察した。（図１）反射吸光度値はそれぞれの試験片に対して最高となる時間の値を用いた。図１中、ｘ軸に反射吸光度、ｙ軸に血糖値をとっているため、傾きがなだらかなほど感度が高いことを意味する。
図２から示されるように、本発明の製造方法により合成した中間体を用いて合成された４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを用いた試験片の検量線の傾きは、従来から広く使用されている４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）を用いた場合より改善され、測定感度を有意に向上させることが示される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化発色化合物の製造方法ならびに当該方法によって製造された化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一種として、酵素を用いた比色分析法が広く用いられている。これらの方法は、測定キット、自動分析機、ドライケミストリー試験具等に組み込まれ、日常的な臨床検査に数多く用いられている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００３】
このような測定法の一種として、被測定物質に特異的な酸化酵素を作用させて発生する過酸化水素をさらにペルオキシダーゼの作用で活性酸素とし、これで発色試薬を酸化して生成する色素を比色定量する方法がある。
【０００４】
ここで使用される酵素としては、例えばグルコースの測定ではグルコースオキシダーゼ、コレステロールの測定ではコレステロールオキシダーゼ、尿酸の測定にはウリカーゼ、ピルビン酸の測定にはピルベートオキシダーゼ等が用いられる。これらの酵素は検体中の基質のみを特異的に酸化するために、色々な成分を含む検体からそれぞれの測定対象物のみを限定して定量することができる。
【０００５】
また、発色試薬としては、活性酸素で酸化されることによって、その吸収波長特性や吸収強度等が変化する色素もしくは色素の前駆体（色原体）が用いられる。すなわち、活性酸素の量に応じて変化する色を測定することによって、被測定物質の量を定量することができる。これらの色素や色原体には、１分子だけで機能するものや、異なる２分子がカップリングして機能するものがある。
【０００６】
１分子で機能するものには、ロイコ型色素等が挙げられる。２分子で機能する代表的なものには、カプラーとトリンダー試薬を酸化的にカップリングさせたものが挙げられる（例えば、非特許文献１および２を参照）。
【０００７】
カプラーとしては、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミンまたはその誘導体などが用いられる。
【０００８】
トリンダー試薬としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体が用いられる。フェノール誘導体としては、フェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、３，５−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，６，４−トリクロロフェノール、２，６，４−トリブロモフェノール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイル酸、などが挙げられる。アニリン誘導体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン（ＥＳＥＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＳＤＡ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）などが挙げられる。
【０００９】
ここで、保存安定性に鑑みると、１分子で機能する色素より２分子で機能する色素の方が良い傾向にある。また、２分子で機能する色素のうち、カプラーとしては、前記のうち最も安定な４−アミノアンチピリン、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンが多く用いられ、トリンダー試薬としては安定でかつ発色強度や波長の点でより有利なアニリン誘導体が多く用いられている。
【００１０】
このような現状の下、前記の発色原理を用いた製品の価値を上げるためには、測定精度をさらに向上させる、あるいは経時的劣化を低減させる必要があり、また、より微量な成分の検出には、現存のものよりさらに感度のよい検出系が必要となり、それらの目的において、より高性能の発色試薬の開発が望まれている。
【００１１】
このように、従来のカプラーに変わる新規な発色化合物の開発が進められており、例えば、特許文献２には、酵素を阻害しないとされるアミノアンチピリン誘導体が開示されている。
【００１２】
ところで、このようなアミノアンチピリン誘導体のようなアミノ化合物を得るためには、ニトロソ化を行い、さらに還元を行なう方法が一般的に知られており、アミノアンチピリンの製造過程においては、ニトロソ化した後還元し、アミノ化をする手法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。なお、特許文献２においても、ニトロソ化、アミノ化を行い、所望の発色化合物を得ている。また、水溶性と経時安定性に優れたアミノアンチピリン誘導体を得るために、特許文献４と特許文献５が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００４−２２３１１５号公報
【特許文献２】特公平６−９９４０３号公報
【特許文献３】米国特許第１，８７７，１６６号明細書
【特許文献４】特開２００９−２４２２４５号公報
【特許文献５】特開２０１０−４３０１０号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６，２４，１９６９
【非特許文献２】Ｂａｒｈａｍ，Ｄ．ａｎｄ Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎａｌｙｓｔ（Ｌｏｎｄｏｎ），９７，１４２，１９７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記の通り、より高性能の発色試薬の開発が望まれている一方で、実際に工業化を念頭においた場合、特に、スケールアップする際に、高純度、高収率で、その高性能の発色試薬を簡便に製造する必要性が生じる。しかしながら、前記したような技術においては、製造スケールが、より大きくなると、その高性能の発色試薬を簡便に製造することができず、このような技術手段の開発が、現実問題として希求されている。
【００１６】
よって、本発明は、上記実情を鑑みてなされたものであり、従来に比して性能が向上した発色化合物を、高純度、高収率で、簡便に製造するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記実情に鑑み、鋭意研究を行った。その過程でまず、前記のような技術によっても、従来に比して性能が向上した発色化合物を、高純度、高収率で、簡便に製造することができない理由を、以下の通り詳細に探索した。
【００１８】
まず、所望の発色化合物を得るためには、メチル化、ニトロソ化、アミノ化を経る必要があるが、スケールアップする際に、高純度、高収率で所望の発色化合物を得ることができないのは、化学式１で示される化合物またはその塩を
硫酸ジメチルを用いてメチル化する際、化学式１で示される化合物またはその塩に含まれる水分が、硫酸ジメチルを加水分解して、反応に影響を及ぼし、短時間で、高純度、高収率でメチル体を得られないためではないかと予測した。
【００１９】
また、化学式２で示される化合物またはその塩を亜硝酸塩を用いてニトロソ化する際、反応が懸濁状態で進行するため、化学式２で示される化合物またはその塩の粒子径が反応に影響を及ぼし、微粉化の程度が粗いと、原料（化学式２で示される化合物またはその塩）残りが生じて、高純度、高収率でニトロソ体を得られないためではないかと予測した。
【００２０】
また、化学式２で示される化合物またはその塩を亜硝酸塩を用いてニトロソ化する際、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定で、水溶液中では容易に分解して不純物を生じるため、よりスケールが大きくなると、その影響が大きくなり、簡便に、高純度、高収率でニトロソ体を得られないためではないかと予測した。
【００２１】
さらには、化学式３で示される化合物またはその塩を、接触水素還元する際、還元した後に、反応溶液から不溶物を濾取する工程において、よりスケールが大きくなると、従来の反応溶媒によるロート上からのかけ洗いでは、不純物が残留し易く、高純度、高収率でアミノ体を得られないためではないかと予測した。
【００２２】
その予測の下、鋭意研究を行った結果、本発明の製造方法によると、驚くべきことに、非常に高い純度および収率で、簡便に目的物を得ることができたのである。
【００２３】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（８）で示される、高い性能を持つ新規酸化発色化合物の製造方法を提供する。
【００２４】
（１）下記化学式１：
【化１】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である）、
で示される化合物またはその塩と、硫酸ジメチルとを混合し、無溶媒下で加熱反応させるメチル化工程と；
前記メチル化工程の後、下記化学式２：
【化２】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化するニトロソ化工程と；
前記ニトロソ化工程の後、下記化学式３：
【化３】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される化合物またはその塩を単離する単離工程と；
前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩を、接触水素還元する還元工程と；
を含む、下記化学式４：
【化４】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法において、
前記メチル化工程は、化学式１で示される化合物またはその塩を、メチル化する前に所定の含水率以下まで乾燥する乾燥工程を含み、
前記ニトロソ化工程は、化学式２で示される化合物またはその塩を、ニトロソ化する前に所定の粒径以下まで微粉化する微粉化工程を含むことを特徴とする製造方法。
【００２５】
（２）前記乾燥工程における前記所定の含水率は１％である（１）に記載の製造方法。
（３）前記微粉化工程における前記所定の粒径は５００μｍである（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）前記還元工程は、化学式３で示される化合物またはその塩を、触媒としてパラジウム炭素を用いて還元した後に、反応溶液から不溶物を濾取し、濾取した不溶物をアルコールを用いて分散洗浄し、更に、該不溶物にアルカリ水溶液を加えて化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を溶解し、触媒を除去した後、酸析することによって化学式４で示される酸化発色化合物を精製する精製工程を含む（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）前記アルコールがエタノールであり、前記酸析に用いる酸が塩酸である（４）に記載の製造方法。
（６）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の製造方法で得られる、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の製造方法においては、従来の方法と比較して、下記(ア)〜(ウ)の点で優れている。
（ア）製造工程の効率化
本願発明の製造方法によると、従来法での製造工程と比較して、工程を効率化しうる。特に、メチル化工程では次の効果がある。硫酸ジメチルを用いてメチル化する際、化学式１で示される化合物またはその塩に含まれる水分を、メチル化する前に、充分除去することにより、硫酸ジメチルの加水分解を防止することにより、従来法と比較して、より低温で短時間で反応を終了することができるため、効率的に、高純度、高収率でメチル体を得ることができる。
（イ）ニトロソ化での純度向上
従来法での製造工程と比較して、ニトロソ化での単離生成物において純度を向上しうる。特に、反応の際に次の効果がある。化学式２で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する際、懸濁反応のため、化学式２で示される化合物またはその塩を充分に微粉化することにより、従来法と比較して、反応を完結することができるため、原料残りがなく、高純度でニトロソ体を得ることができる。
また、化学式２で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する際、亜硝酸塩を加える前に、冷却塩酸水溶液中に前記化学式２で示される化合物またはその塩を分散することにより、従来法と比較して、安定な条件で反応することができるため、スケールアップが容易となり、高純度でニトロソ体を得ることができる。
（ウ）アミノ化での純度向上
従来法での製造工程と比較して、アミノ化での生成物において純度を向上しうる。特に、還元後の生成物の処理の際に次の効果がある。化学式３で示される化合物またはその塩を、触媒としてパラジウム炭素を用いて還元した後に、反応溶液から不溶物を濾取する工程において、アルコールを用いて濾取した不溶物を分散洗浄し、更に、該不溶物にアルカリ水溶液を加えて化学式４で示される酸化発色化合物を溶解し、触媒を除去した後、酸析することにより、従来法と比較して、スケールアップする際、不純物の除去を完全に行なうことができるため、スケールアップが容易となり、高純度でアミノ体を得ることができる。
【００２７】
さらに、本願発明により製造される発色化合物は、その呈色性能において、下記（エ）〜（キ）の点でこれまでの試薬より優れている。特に担体に保持した試験具として使用する場合、その効果が最も顕著である。
【００２８】
（エ）測定時間の短縮
本願発明の製造方法により製造される発色化合物は、水溶性が有意に高いので、特に担体に保持して使用する場合には、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こる。
【００２９】
（オ）感度が高い
呈色反応によって生成した色素化合物は、検体への溶解性や親和性が有意に高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなる。それによって感度が高く安定した測定が可能となる。
【００３０】
（カ）精度が高い
本願発明の製造方法により製造される発色化合物は、溶解性が有意に高いので、従来の試薬より高濃度の試薬液が調製可能である。また、担体に担持して使用する場合塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。さらには、塗布液の濃度を高く設定し全体液量を少なくできることで、塗工均一性の高い、グラビア印刷法、ドット印刷法、インクジェット印刷等の精密印刷法が使用できる。塗工液量が少なくなれば、乾燥時間が短縮され乾燥むらを低減させる効果もある。つまり、十分な試薬を高い均一性で塗工できることにより、塗りむらなどに起因するばらつきを低減させることができ、高い精度の試験具を提供することができる。
【００３１】
（キ）経時安定性に優れる
本発明の製造方法により製造される発色化合物における親水性官能基は、担体への吸着性を高め、担体内での化合物の安定性を向上させる。つまり、経時劣化を低減させ、有効期間を延ばすことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例２における、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩および４−アミノアンチピリンの反射吸光度値の時間変化を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下に本発明をより具体的に説明する。本発明は下記化学式４：
【化５】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である）、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法に関する。
【００３４】
上記の通り、スケールアップの際、従来技術では所望の高純度の発色化合物を得ることができない。これは少量での合成と異なり、大量合成する場合は、懸濁反応の影響が大きいためと考えられる。すなわち、原料の純度、粒径、中間体の安定性、不純物の洗浄効率等が大きく起因するのではないかとの予測の下に鋭意研究を行った。
【００３５】
その結果、メチル化反応、ニトロソ化反応、還元反応の条件および精製法等に、様々な技術的工夫を行うことにより、スケールアップする際、従来法に比較して、より効率的に高純度の発色化合物を合成する方法を見出し、本発明を完成させたのである。
【００３６】
［メチル化工程］
メチル化を行う対象化合物は、下記化学式１：
【００３７】
【化６】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、で示される化合物またはその塩である。
【００３８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち１つのみが、スルホン酸基である場合、好ましい部位は、呈色性の観点で、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４である。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうちの２つがスルホン酸基である場合、好ましい部位は、呈色性の観点で、Ｒ２、Ｒ４である。
【００３９】
なお、スルホン酸基は、イオン性官能基であるが、これらの官能基は、遊離の状態であっても、または塩を形成していてもよい、すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、スルホン酸基の塩であってもよい。
【００４０】
この際、これらの酸基と塩を形成する対イオンは、無機イオンでもよいし、有機イオンでもよい。例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等の無機塩基由来の陽イオン；アンモニウムイオン；アルキルアミン類等の有機塩基由来の陽イオン；およびアミノ酸類等の両性化合物由来のイオンなどが挙げられる。なかでも、塩の形態である場合には、好ましくはナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩であり、より好ましくはナトリウム塩である。
【００４１】
なお、後述する化学式２〜化学式６における「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５」は、いずれも、上記化学式１において行った「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５」の定義と同様である。よって、下記ではその説明を割愛する。
【００４２】
なお、ここで、化学式１で示される化合物またはその塩を得る方法について下記に説明する。
【００４３】
すなわち、本発明の化学式１で示される化合物またはその塩の製造方法は、下記化学式５：
【化７】
で示される化合物［以下、「化合物５」とも称する］と、下記化学式６：
【化８】
で示される化合物［以下、「化合物６」とも称する］とを、反応させる工程［工程（Ａ）］を有することが好ましい。
【００４４】
化合物５と化合物６とを反応させる上記工程（Ａ）において、化合物５及び６の混合比は、特に制限されない。好ましくは、化合物５及び６をそれぞれ等モル混合する、あるいは化合物5を化合物６に対してやや多めに混合することが好ましい。後者の場合、化合物５は、化合物６を１モルに対して、０．８〜２モル、より好ましくは１〜１．２モル程度の割合で、混合することが好ましい。また、化合物５と化合物６との反応条件は、これらの反応が進行する条件であれば特に制限されないが、例えば、反応温度は、好ましくは２０〜２００℃、より好ましくは、８０〜１５０℃の温度であり、反応時間は、好ましくは０．５〜５時間、より好ましくは１〜１．５時間である。また、化合物５と化合物６との反応は、無溶媒下で行なってもよく、あるいは溶媒中で行なってもよい。後者の場合に使用できる溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール等の、アルコール類；ＴＨＦ、ジエチルエーテル、ジオキサン等の、エーテル類；ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒が挙げられる。これらのうち、ＴＨＦが好ましい。化合物５と化合物６との反応後は、反応混合物を適当な溶媒中に加えることによって生成物を固化させることによって、原料化合物と分離回収することができる。
【００４５】
次に、工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）を用いて、以下のメチル化工程によってメチル化することで、化学式２で示される化合物が得られる。
【００４６】
すなわち、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）と、硫酸ジメチルと、を混合し、無溶媒下で加熱反応させる工程を含む、下記化学式２で示される化合物またはその塩：
【００４７】
【化９】
で示される化合物またはその塩が得られる。
【００４８】
上記の製造方法のように、溶媒を用いずに（無溶媒で）合成できるメリットとしては、反応容量を少量化でき、反応容器容積あたりの仕込み可能量が大きいことがあげられる。すなわち、通常の反応より小型の反応装置でより多くの製造ができるので、大量合成に好都合である。また、塩基を用いずに合成することもできる。
【００４９】
硫酸ジメチルは、市販のものを使用しても合成して使用してもよく、特に制限されることはない。
【００５０】
上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式１）の含水率は、１％以下が好ましく、０．５％以下が特に好ましい。上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式１）の含水率が高いと、反応中、硫酸ジメチルの加水分解が生じ、反応効率低下の虞れがある。
【００５１】
上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）の乾燥方法としては、通常、加熱乾燥でよく、常圧、減圧、いずれの方法でもよく、減圧加熱乾燥がより好ましい。乾燥の度合を示す含水率は、例えば、カールフィッシャー水分測定器を用いて測定し、重量％で示される。
【００５２】
上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）に対する前記硫酸ジメチルの量は、１．０〜２．０倍モルであることが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．３倍モルが特に好ましい。上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）に対する硫酸ジメチルの添加量が、１．０倍モル未満だと、反応効率低下の虞れがあり、２．０倍モルを越えると副生成物の増大の虞れがある。
【００５３】
本発明に係る硫酸ジメチルの添加の方法としては、滴下ロート、ピペットなどを用いることができるが、外気中の水分による硫酸ジメチルの加水分解を防ぐために滴下ロートを用いて反応系を密閉して行なうのが好ましい。また、室温、１ａｔｍにおいて上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）と、硫酸ジメチルとを混合する際には、液体である硫酸ジメチルに完全に溶解させてもまたは溶解させなくてもよく、両者がどのような状態であろうが混合していればよい。
【００５４】
メチル化工程における加熱反応の温度（内温）としては、１４０〜２００℃が好ましく、１５０〜１９０℃が特に好ましく、１６０〜１８０℃がさらに好ましい。
【００５５】
上記加熱反応の温度が１４０℃未満だと、反応効率低下の虞れがあり、２００℃超だと、副生成物の増大の虞れがある。
【００５６】
メチル化工程における加熱反応の反応時間としては、０．５〜２０時間が好ましく、０．５〜１０時間が特に好ましい。
【００５７】
上記加熱反応の反応時間が０．５時間未満だと、反応効率低下の虞れがあり、２０時間超だと、副生成物の増大の虞れがある。
【００５８】
メチル化工程において、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物（化学式1）と、硫酸ジメチルとを混合し、無溶媒下で加熱反応させて得られた反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得る工程と、前記反応混合溶液に酸を加えて固体を単離する工程とを含むことが好ましい。
【００５９】
本発明に係る化学式２で示される化合物は、溶媒抽出による回収が困難であるため酸を添加することで強制的に沈殿するいわゆる“酸沈”により回収することが好ましい。これにより、最終目的物を高い純度で得られることができる。
これにより、化学式２で示される化合物またはその塩を高い純度で得られることができる。
【００６０】
メチル化工程に用いられるアルカリ水溶液のアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムが好ましく、水酸化ナトリウムが特に好ましい。
【００６１】
メチル化工程に用いられるアルカリ水溶液の濃度としては、１０〜３０ｗ／ｖ％（重量対体積％）が好ましく、１５〜２５ｗ／ｖ％が特に好ましく、２０〜２５ｗ／ｖ％がさらに好ましい。
【００６２】
また、上記反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて得られる反応混合溶液のｐＨは、７〜１４が好ましい。
【００６３】
メチル化工程に用いられるアルカリ水溶液中のアルカリの量としては、使用する硫酸ジメチルに対して２〜５倍モルが好ましく、２．５〜４倍モルが特に好ましく、３倍モルがさらに好ましい。
【００６４】
メチル化工程に用いられる酸としては、有機酸または無機酸のいずれでもよく、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、ピクリン酸、濃硫酸、濃硝酸などが用いられるが、塩酸、硫酸、硝酸がより好ましく、塩酸がさらに好ましい。
【００６５】
メチル化工程において、上記反応物に添加する酸の濃度としては、なるべく水分量を減らすべく濃度が高いものが好ましい。
【００６６】
上記反応物混合溶液に添加する酸の濃度は、５〜１００ｗ／ｖ％（重量／体積％）が好ましく、１５〜１００ｗ／ｖ％がより好ましく、３０〜１００ｗ／ｖ％が特に好ましい。例えば、添加する酸として塩酸を用いる場合は、１５〜３６ｗ／ｖ％が好ましく、３０〜３６ｗ／ｖ％が特に好ましい。
【００６７】
上記反応物混合溶液に添加する酸の量は、１〜１０倍モルが好ましく、１〜５倍モルがより好ましく、１．５〜３倍モルが特に好ましい。
【００６８】
上記反応物に添加する塩酸の量としては、出発物質の使用量に対して、１〜５倍モルが好ましく、１．５〜３倍モルが特に好ましく、１．８〜２．２倍モルがさらに好ましい。
【００６９】
また、メチル化工程において酸を加え沈殿を生成させる工程で用いる攪拌装置としては、磁気スターラー、メカニカルスターラーなどを用いることができる。
【００７０】
メチル化工程において、前記単離工程で得られた固体を水から再結晶する工程をさらに含むことが好ましい。すなわち、本発明の製造方法は、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物と、硫酸ジメチルを混合し、無溶媒下で加熱反応させて得られた反応混合物を得る工程と、アルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得た後、さらに前記反応混合溶液に酸を加えて固体（上記化学式2に示される化合物を含むもの）を単離する工程と、単離された前記固体を水から再結晶する工程とを含むことが好ましい。
【００７１】
メチル化工程における再結晶で用いる水の量としては、固体１００ｇ当り、５００ｍｌ〜３０００ｍｌが好ましく、１０００ｍｌ〜２０００ｍｌが特に好ましく、１０００ｍｌ〜１５００ｍｌがさらに好ましい。なお、当該単離された固体は、０．５〜２４時間、室温条件下で減圧乾燥したものが使用される。
【００７２】
上記再結晶工程で固体を水に溶解させる際に、加熱を行なってよい。加熱器具としては、水浴、油浴、マントルヒーター、ホットプレートなどが用いられる。加熱する際の加熱器具の温度設定は、５０〜１５０℃が好ましく、７０〜１３０℃が特に好ましく、９０〜１１０℃がさらに好ましい。
【００７３】
また上記再結晶のための放置時間は、３０分〜３日が好ましく、１時間〜１日が特に好ましく、１０時間〜１５時間がさらに好ましい。さらに、上記再結晶のための放置時の温度は、０〜４０℃が好ましく、０〜２５℃が特に好ましく、０〜１５℃がさらに好ましい。
【００７４】
メチル化工程において使用される水は、特に制限されるものではなく、水道水、イオン交換水、純水、超純水、または工業用水などの水洗水を使用することができ、純水が特に好ましい。
【００７５】
上記により得られた、前記化学式２で示される化合物またはその塩の純度の測定方法は、後述する。
【００７６】
［ニトロソ化工程］
（微粉化）
前記化学式２で示される化合物またはその塩は、微粉化した後、ニトロソ化するのが好ましい。微粉化後の粒径は、５００μｍ以下が好ましく、３００μｍ以下が特に好ましく、２００μｍ以下がさらに好ましい。微粉化の方法は、特に制限はないが、乳鉢、ミル等用いることができる。なお、微粉化後の粒径が、５００μｍ超だと、上記メチル化工程で得られた反応生成物（化学式２）が反応せず、原料残りの虞れがある。
【００７７】
（亜硝酸塩）
前記化学式２で示される化合物またはその塩は、亜硝酸塩を用いてニトロソ化される。ニトロソ化工程に用いる亜硝酸塩は、特に制限はないが、亜硝酸のカチオン塩が用いられると好ましい。
【００７８】
カチオン塩としても、特に制限はなく、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが好適に挙げられる。具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、入手のし易さの観点で、ナトリウム塩が特に好ましい。
【００７９】
ニトロソ化工程に用いる亜硝酸塩の量は、化学式２で示される化合物またはその塩（本明細書中、単に「出発物質」とも称する。）の量に対して、反応効率および副生成物の観点で、１．０〜２．０倍モルが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【００８０】
（酸）
前記ニトロソ化工程におけるニトロソ化反応は、反応性の観点で、酸の存在下において行うとよい。
【００８１】
ニトロソ化工程に用いられる酸は、特に制限はないが、反応性の観点で、塩酸、硫酸、硝酸、濃塩酸、濃硫酸、濃硝酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、ピクリン酸が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、取り扱いの観点で、塩酸が特に好ましい。
【００８２】
ニトロソ化工程に用いられうる酸の量にも、特に制限はないが、出発物質の量に対して、反応効率および副生成物の生成の観点で、０．５〜２．０倍モルが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【００８３】
また、添加する酸は、副生成物の生成を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは１〜１０℃、さらに好ましくは１〜５℃にしておくとよい。なお、添加する酸を、後述する溶媒で希釈した場合も同様の温度に制御しておくとよい。
【００８４】
（溶媒）
ニトロソ化工程において、出発物質と上記亜硝酸塩、酸を混合する場合、それぞれを予め溶媒に含有させておいてもよい。
【００８５】
つまり、溶媒に、それぞれの原末（出発物質と亜硝酸塩）または原液（酸）を加えていく方法や、出発物質を溶媒に含有させた溶液（本明細書中、「出発物質の溶液」とも称する）に、亜硝酸塩、酸を溶媒に含有させた溶液（それぞれ、「亜硝酸塩の溶液」、「酸の溶液」とも称する。）を添加する方法を用いてもよい。
【００８６】
好ましくは、反応効率の観点で、出発物質の溶液に、亜硝酸塩の溶液および酸の溶液を添加する方法である。つまり、酸の溶液と、亜硝酸塩の溶液とを、化学式2で示される化合物またはその塩の溶液に滴下して添加する。
【００８７】
この際、添加する亜硝酸塩と酸の溶液は、副生成物の生成を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは１〜１０℃、さらに好ましくは１〜５℃にしておくとよい。また、添加する亜硝酸塩の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは３〜５ｍｏｌ／ｌにしておくとよい。
【００８８】
また、添加する酸の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは３〜５ｍｏｌ／ｌにしておくとよい。
【００８９】
また、出発物質の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは０．１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは０．５〜２ｍｏｌ／ｌである。
【００９０】
また、予め出発物質の溶液を、副生成物を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは０〜５℃、さらに好ましくは０〜３℃にしておくとよい。
【００９１】
前記溶媒は、特に制限はないが、水、有機溶媒またはこれら混合物（混合溶媒）が用いられうる。なお、本明細書中、溶媒として「水」を主成分（好ましくは、全部）とした溶液の名称を「水溶液」とも称する。なお、本明細書中、「水を主成分とする」とは、全溶液中に水の占める割合が、１０〜１００ｖ／ｖ％であることを意味する。
【００９２】
有機溶媒としては、特に制限はないが、アルコール、エーテル類、ケトン類、エステル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられる。
【００９３】
アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノールなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【００９４】
エーテル類としては、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジフェニルエーテル、ベンジルエーテル及びｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【００９５】
ケトン類としては、アセトン、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）及びシクロヘキサノンなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【００９６】
これらのうち、反応性の観点で、水単独または水とアルコールとの混合物が好ましく、水単独が特に好ましい。
【００９７】
水および有機溶媒の混合溶媒を用いる際は、例えば、好ましくは水／有機溶媒（容量比）＝０／１００〜１００／０、より好ましくは水／有機溶媒（容量比）＝１０／９０〜１００／０程度がよい。この際、有機溶媒の含有量が、混合溶媒中、５０容量％を超えると、亜硝酸塩の析出の虞れもある。
【００９８】
また、上記の通り、出発物質と、亜硝酸塩と酸とを混合させる方法にも特に制限はないが、反応性の観点で、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液とを、攪拌下で、出発物質の溶液に添加する方法が好ましい。添加する条件は、副生成物を抑える観点で、亜硝酸塩の溶液と酸の溶液を、ほぼ同じ速度で、同時に添加することが好ましい。
【００９９】
ここで、「同時に添加する」とは、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液とを添加しているある時点が、一瞬でも互いに重複すればよいが、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液との添加を開始する時点と、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液との添加を終了する時点とが、実質的に同じであると好ましい。
【０１００】
さらには、添加する条件は、さらに副生成物を抑える観点で、酸またはその水溶液を亜硝酸塩の水溶液より先に化学式２で示される化合物またはその塩の水溶液に滴下して添加することが好ましい。
【０１０１】
酸またはその水溶液と亜硝酸塩の水溶液の添加中、および添加後の溶液の温度は、０〜１０℃が好ましい。
【０１０２】
０℃以下では反応が進みにくく、１０℃以上では生成物の安定性に難がある。
【０１０３】
なお、この際の、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液の添加の方法にも特に制限はないが、ピペット、シリンジ、滴下ロートなどを用いて行なわれることが好ましい。また、これらの添加に要する時間は、グラムスケールの反応では、生成物の安定性の観点で、１〜３０分が好ましく、３〜７分が特に好ましく、４〜６分がさらに好ましい。
【０１０４】
また、添加は、磁気攪拌子等で、攪拌しながら行うことが、好ましい。
【０１０５】
さらに、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液と、を添加した後、そのまま静置しておいてもよいが、反応が添加後、時間とともに進行するため、好ましくは、上述の磁気攪拌子等で、好ましくは１〜６０分程度、より好ましくは３０分程度、激しく攪拌するとよい。この際、「激しく攪拌する」の攪拌速度にも特に制限はないが、好ましくは３００〜１２００ｒｐｍ、より好ましくは６００〜１０００ｒｐｍである。
【０１０６】
（反応時間）
ニトロソ化工程における反応時間にも特に制限はないが、あまりに反応時間が短すぎると、反応が不十分で出発物質の残留が生じる虞れがある。一方で、あまりに反応時間が長過ぎると、生成したニトロソ体の分解が起こる虞れがある。
【０１０７】
反応時間は、亜硝酸塩の溶液と酸の溶液を添加する時間を含めて、グラムスケールの反応では、１〜６０分が好ましく、５〜４５分がより好ましく、１０〜３０分がさらに好ましい。
【０１０８】
（反応温度）
ニトロソ化工程において設定される反応温度としては、副生成物の生成を抑える観点で、０〜１５℃が好ましく、１〜１０℃がより好ましく、１〜５℃がさらに好ましい。かような温度条件にするためには、従来公知の知見を適宜参照して制御することができ、例えば、水浴や氷浴等を用いればよい。
【０１０９】
上記ニトロソ化工程を経ることにより、
下記化学式３：
【０１１０】
【化１０】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、で示される化合物またはその塩を得ることができる。
【０１１１】
［単離工程］
本発明においては、上記ニトロソ化工程の後、化学式３で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程を経る。つまり、本発明においては、ニトロソ化工程終了後、そのままワンポットで、一気に、後述の還元工程を行わず、単離工程を必須の工程として有する点に特徴の一つを有する。
【０１１２】
上記の通り、従来、所望の発色化合物を、高純度かつ高収率で得ることができないのは、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定ではないかとの予測の下に鋭意研究を行った。そして、その予測は正しく、中間体であるニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）は不安定であり、それが、収率減少や目的物の純度低下の一因となっていることを見出したのである。
【０１１３】
つまりは、中間体であるニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）を適切な精製を行わなければ、結局は、最終生成物たる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の収率減少や純度低下という結果に直結するのである。
【０１１４】
一方で、ニトロソ化工程終了後、ワンポット（一気に）で、後述の還元工程に移行する条件の下で、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の製造を試みると、中間体であるニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）の単離をすることが非常に困難なのである。つまりは、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）中に存在する副生成物の分離除去を行うことが困難なのである。
【０１１５】
その観点からして、上記ニトロソ化工程においては、中間体であるニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）の単離を容易に行わせしめるべく、最適なニトロソ化反応条件を詳細に検討する点も、非常に有用であると言えるのである。具体的には、本発明の製造方法におけるニトロソ化工程によれば、化学式３で示される化合物またはその塩のみが、沈殿分離するため、容易に単離精製することができる。また、上記にて、亜硝酸塩、酸を、それぞれ化学式２で示させる化合物またはその塩に対して、ほぼ等量で添加するのも、副生成物の生成をより抑え、ひいては化学式３で示される化合物またはその塩を容易に単離精製させるために他ならない。
【０１１６】
上記の通り、ニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）を固体として単離することによって、不純物が除去され、次の還元工程が効率的に進行するため、最終的に得られるアミノ体（化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩）の純度が高くなり、また還元工程における収率も向上するのである。
【０１１７】
以下、単離工程における、ニトロソ体を単離する方法について詳説する。
【０１１８】
ニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）を単離する具体的方法としては、特に制限はないが、ニトロソ化工程終了後に得られた反応混合物を、濾過したり、遠心分離したりすることなどによって行なわれるとよい。なお、かようにして得られたものを、「ニトロソ化物固体」とも称する。
【０１１９】
この際の濾過方法や条件としては、特に制限ないが、ろ紙を用いた吸引ろ過によって行うことができる。
【０１２０】
なお、得られたニトロソ化物固体は、溶媒で洗浄することにより、さらに純度が高くなる。
【０１２１】
この洗浄に用いられうる溶媒は、特に制限はないが、有機溶媒、またはこれらの混合物が用いられる。これらのうち、ニトロソ体の安定性の観点で、有機溶媒は、アルコールが好ましい。アルコールとしても特に制限はなく、上記にて列挙した具体例が同様に妥当であるが、ニトロソ体の安定性・純度の観点で、メタノールが特に好ましい。
【０１２２】
この際、洗浄に用いるアルコールは、ニトロソ体の安定性の観点から、好ましくは−２０℃〜１０℃程度、より好ましくは０〜５℃程度に冷却しておくと良い。
【０１２３】
このように得られたニトロソ体（化学式３で示される化合物またはその塩）の固体は、減圧乾燥などによって乾燥することによって、さらに、保存安定性が向上する。この際の減圧乾燥方法や条件としても、特に制限ないが、真空ライン（好ましくは０〜１０ｍｍＨｇ、より好ましくは１〜２ｍｍＨｇ）に接続して行うことができる。
【０１２４】
かようにして、化学式３で示される化合物またはその塩を単離することができる。
【０１２５】
［還元工程］
本発明における還元工程では、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩を、接触水素還元法を用いて還元する。
【０１２６】
かような還元工程を経ることにより、
下記化学式４：
【０１２７】
【化１１】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、で示される酸化発色化合物またはその塩を製造することができる。
【０１２８】
（水素）
接触水素還元工程において、前記単離工程により得られた化学式3で示される化合物またはその塩に、水素を接触させる。水素はボンベや発生装置から供給する。水素を効率的に反応混合物と接触させるために、一定圧の水素を供給しながら激しく攪拌を行う、あるいは攪拌下水素を連続的に吹き込むなどの方法がとられる。
【０１２９】
（触媒）
接触水素還元工程において、触媒を必須成分として用いる。触媒としては、パラジウム炭素、白金炭素、パラジウム硫酸バリウム、パラジウム炭酸バリウム、パラジウム炭酸ストロンチウム、ラネーＮｉ、銅-クロム酸化物、ラネーコバルトなどを用いることができるが、パラジウム炭素が特に好ましい。
【０１３０】
接触水素還元工程において、触媒の量は、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩に対して重量％で１〜２０％が好ましく、３〜１５％がより好ましい。
【０１３１】
パラジウム炭素を用いる場合、パラジウムの含有量は、全重量に対して２〜２０％が好ましく、７．５〜１０％が特に好ましい。
また、パラジウム炭素は乾燥状態で発火の危険性があるため、安全のため適量の水分を含んだものを用いる。過剰な水分は触媒活性の低下をまねく。水分の含有量は、全重量に対して１０〜９０％が好ましく、５０〜６０％が特に好ましい。
【０１３２】
（酸）
還元工程における還元反応は、酸の存在下において行うとよい。化学式３で示される化合物（ニトロソ体）は酸の存在で安定化するため、酸の使用は特に好ましい。
【０１３３】
還元工程に用いられる酸は、特に制限はなく、どのような種の酸でも用いうるが、反応性の観点で、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、取り扱いやすさの観点で、塩酸が好ましい。
【０１３４】
還元工程に用いられうる酸の量にも、特に制限はないが、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩の量に対して、副生成物を抑える観点で、１〜３０倍モルが好ましく、１〜５倍モルが特に好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【０１３５】
（溶媒）
化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の製造のために、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩と、触媒を用い、上記の通り、還元反応は、酸の存在下で行うとよいが、必要に応じ反応溶媒を用いるとよい。反応溶媒としては、特に制限はなく、上記ニトロソ化工程で説明した具体例が、同様に妥当である。
【０１３６】
還元工程に用いられる化学式３で示される化合物またはその塩は、反応溶媒に懸濁した状態（スラリー）で反応に供されるのが好ましい。これは、反応溶媒に溶解した状態では、反応が複雑化し副生成物が多くなるためである。
【０１３７】
これに適した溶媒としては、反応速度の観点からも、アルコール類が好ましい。
【０１３８】
アルコール類としては、直鎖、分岐鎖、いずれの価数のものも用いうるが、炭素数が１〜６のものが好ましい。実際には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ヘプタノール、ｎ−ヘキサノールなどが用いられる。
【０１３９】
アルコール類としてはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノールが好ましく、２−プロパノールがさらに好ましい。
【０１４０】
アルコール類は他の有機溶媒や水と混合して用いてもよいが、アルコール類単独が好ましい。
【０１４１】
還元工程における溶媒の量は、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩１ｇに対して、反応性の観点で、５〜１００ｍＬが好ましく、７．５〜５０ｍＬがより好ましく、１０〜２０ｍＬがさらに好ましい。
【０１４２】
また、前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩と、触媒、酸、溶媒とを攪拌させる方法にも特に制限はないが、反応性の観点で、磁気攪拌子あるいはメカニカルスターラー等により攪拌する方法が好ましい。
【０１４３】
より具体的には、単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩を反応容器に入れ、予め酸を含有させた溶媒を添加することが好ましい。
【０１４４】
触媒は安全性の観点から、単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩を酸含有溶媒に分散させた後、反応容器内を窒素で置換してから投入することが好ましい。
【０１４５】
（反応温度）
還元工程において設定される反応温度としては、常温〜３００℃が好ましく、常温が特に好ましい。かような温度条件にするためには、従来公知の知見を適宜参照して制御することができ、例えば、水浴、氷浴、油浴、恒温槽などを用いればよい。
【０１４６】
（圧力）
還元工程における接触水素還元反応では、系内（水素雰囲気下）の圧力が１〜１００ａｔｍの範囲で行われることが好ましく、特に常圧下（１ａｔｍ）で行われることが好ましい。
【０１４７】
（反応容器）
還元工程に用いられる反応容器の素材としても、特に制限はなく、前記ニトロソ化工程で説明した具体例が同様に妥当である。気体状の水素と効率よく接触させるため、効率の高い攪拌装置を用いうる反応容器が好ましい。攪拌装置は、機械式攪拌装置、磁気攪拌装置などが用いられる。また、反応容器は、気体状の水素を供給するための導入管や導入口を、持つものあるいは装着できるものがふさわしい。なお、加圧下で反応を行う場合は、耐圧性容器を用いる必要がある。
【０１４８】
かような還元工程を経ることにより、前記化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を製造することができる。
【０１４９】
［精製工程］
ａ．触媒含有反応物分取工程
上記還元工程終了後、触媒を含む目的反応物（不溶物）を分取することが好ましい。触媒含有反応物は、濾過によって分取できる。濾過は、常圧、減圧いずれでもよく、濾材としては通常の濾紙を用いてもよい。
【０１５０】
ｂ．触媒含有反応物洗浄工程
分取した上記触媒含有反応物を、不純物を除去するために、アルコールにて分散洗浄することが好ましい。
【０１５１】
アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノールなどが好適に用いられうるが、エタノールがより好ましい。
【０１５２】
分散洗浄としては、磁気攪拌子等の通常の攪拌装置を使用することができる。
【０１５３】
上記の分散洗浄を行なうことにより、高純度の化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を得るために、下記に示す、酸析工程の回数を削減することができ、酸析１回でも純度９９％以上の化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１５４】
ｂ．触媒除去工程
上記触媒含有反応物洗浄工程終了後、触媒を除去することが好ましい。触媒を除去するために、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に目的物を溶解し、溶け残った触媒は、濾過によって除去される。濾過は、常圧、減圧いずれでもよく、濾材としては通常の濾紙を用いてもよいが、メンブランフィルターやセライトを使用することによってさらに触媒の残留量を減少させることができる。
【０１５５】
ｃ．酸析工程
上記触媒除去工程終了後、さらに不純物を除去するために、目的物を含有する炭酸水素ナトリウム水溶液に酸またはその水溶液を添加して酸析することが好ましい。
【０１５６】
酸としては、特に制限はなく、どのような種の酸でも用いうるが、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、取り扱いやすさの観点で、塩酸が好ましい。
【０１５７】
酸析工程の回数については、特に制限はなく、回数が多いほど、高純度の化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができるが、実用上、上記の分散洗浄後、１回の酸析工程を経ることにより、純度９９％以上の化学式4で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１５８】
ｄ．再溶解工程
上記酸析工程終了後、水溶性とするために、炭酸水素ナトリウム水溶液に再
溶解して、ナトリウム塩にもどすことが好ましい。
【０１５９】
ｅ．抽出工程
上記再溶解工程を経た後、得られた混合物から、さらに残留する無機塩を除くため、抽出工程を経ることが好ましい。かような抽出工程を経ることにより、より高純度かつ高収率で、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１６０】
抽出工程は、上記再溶解工程を経て得られた混合物を固体状態とし、溶媒で抽出する方法が用いられうる。抽出工程における抽出方法は、混合物を粉末状態として溶媒を加えて攪拌する他、一般に用いられる抽出装置を使用して行なってもよい。
【０１６１】
再溶解工程を経て得られた混合物を固体状態にする方法にも特に制限はないが、例えば、減圧乾燥方法等により蒸発乾固する方法が挙げられる。
【０１６２】
この際の減圧乾燥方法や条件としても、特に制限ないが、真空ライン（好ましくは０〜３０ｍｍＨｇ、より好ましくは１〜２ｍｍＨｇ）に接続して行うことができる。
【０１６３】
抽出工程における溶媒としては、最終目的物（化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩）を溶解できるものであれば特に制限されないが、アルコールが好ましく、より具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノールなどが好適に使用できる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、抽出効率の観点で、エタノールが特に好ましい。
【０１６４】
また、本発明の製造方法により得られる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、両性でありうるため、本来、単離をすること自体も困難である。しかしながら、上記の通り、メチル化物の単離、再結晶（不純物除去）、ニトロソ化物の単離（不純物除去）、残留触媒の除去、エタノールによる無機塩（ＮａＨＣＯ３）の分離などの工夫を行うため、容易に単離を行うことができる。
【０１６５】
本発明の製造方法によると、純度は、少なくとも９５％以上、実際には９９％以上に向上する。また、工程の大幅な短縮化もできる。この点においても、本発明は非常に優れていると言える。なお、目的物の純度等は以下の方法で調べることができる。
【０１６６】
（１）ＴＬＣ
・ＴＬＣプレート：シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ １．１３７２８．０００１、濃縮ゾーン付ＨＰＴＬＣ）
・展開溶媒：クロロホルム／メタノール／アンモニア水（５９：３１：１０）
・試料溶解液：水／メタノール混合液（１：６）
・検出：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１６７】
標品と同時に展開を行い、目視で反応進行度合いの確認に用いられる。
【０１６８】
（２）ＨＰＬＣ
・カラム： ＹＭＣ社製 分析カラムＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ ２５０Ｘ４．６ｍｍＩ．Ｄ．（ＨＳ１２Ｓ０５−２５４６ＷＴ）
・ガードカラム：ＹＭＣ社製 ガードカートリッジカラムＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８２３ Ｘ４．０ｍｍＩ．Ｄ．
・溶離液：アセトニトリル／２３ｍＭリン酸バッファー (ｐＨ７．５)＝１／９
・試料濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ
・試料溶解液：溶離液
・流速： ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
・カラムオーブン温度：４０℃
・検出：ＵＶ（測定波長：２５４ｎｍ)
【０１６９】
全ピーク面積の和のうち目的物のピーク面積の％を計算し、純度とした。
【０１７０】
本発明の製造方法により製造された酸化発色化合物またはその塩、つまり、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の特に好ましい用途・使用について説明する。
【０１７１】
［試薬組成物］
化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一つである、酵素を用いた比色分析法に好適に使用される。特に２分子で機能する酸化型発色試薬のうちのカプラーとして用いられうる。すなわち、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、例えば、前記背景技術の項で記載したトリンダー試薬と共に用いられ、被測定物質の酵素的酸化で生じる過酸化酸素をさらにペルオキシダーゼで酸化して生成した活性酸素によって、２分子が酸化縮合することによって呈色する。
【０１７２】
すなわち、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、を含む試薬組成物が提供される。
【０１７３】
つまり、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、カプラーとして使用することが特に好ましく、それ以外については従来公知の知見が適宜参照され、特に限定されるものではない。
【０１７４】
トリンダー試薬としては、特に制限はなく、従来公知の化合物がいずれも好ましく用いられうる。ただ、中でもＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンが好ましく、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンが、発色強度や波長といった観点で、特に好ましい。
【０１７５】
「測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼ」としては、例えば、測定対象物がグルコースである場合、該オキシダーゼはグルコースオキシダーゼであり、測定対象物がコレステロールである場合、該オキシダーゼはコレステロールオキシダーゼであり、測定対象物が尿酸である場合、該オキシダーゼはウリカーゼであり、測定対象物がピルビン酸である場合、該オキシダーゼはピルベートオキシダーゼである。これらは測定対象物の基質のみを特異的に酸化するために、色々な成分を含む検体からそれぞれの測定対象物のみを限定して定量することができる。
【０１７６】
前記試薬組成物において、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩とトリンダー試薬とのモル比は、１：１〜２：１であることが好ましく、１．３：１がより好ましい。化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩とトリンダー試薬とのモル比が１：１未満である場合、また、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩とトリンダー試薬とのモル比が２：１を超える場合、発色不良を生じることがある。
【０１７７】
当該試薬組成物中の、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量は、カプラー１５ｍｍｏｌに対して、４３３ｋ〜２６００ｋＵであることが好ましく、８６６ｋ〜２６００ｋＵであることがより好ましい。測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量が、カプラー１５ｍｍｏｌに対して４３３ｋＵ未満である場合、発色不良を生じることがある。なお、前記測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量は、４ＡＡ−ＴＯＯＳ法により測定したユニット数を採用するものとする。
【０１７８】
当該試薬組成物中のペルオキシダーゼの含有量は、カプラー１５ｍｍｏｌに対して１６６．５ｋ〜１６６６ｋＵであることが好ましく、３３３ｋ〜９９９ｋＵであることがより好ましい。ペルオキシダーゼの含有量が、カプラー１５ｍｍｏｌに対して１６６．５ｋＵ未満である場合、発色不良を生じることがある。なお、前記ペルオキシダーゼの含有量は、ピロガロール法により測定したユニット数を採用するものとする。
【０１７９】
当該試薬組成物は、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、を含む。すなわち、「化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼ」以外の他の成分を、試薬組成物としての機能を害さない程度含んでいてもよい。該成分としては、例えば、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、保護剤等が挙げられる。
【０１８０】
なお、これら他の成分の含有量は、試薬組成物としての機能を害さなければ特に制限されないが、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとの総質量に対して、好ましくは１０〜３０質量％、より好ましくは１３〜２０質量％含まれてもよい。
【０１８１】
化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一種である、酵素を用いた比色分析法に好適に使用されるカプラーとして用いられうる。すなわち、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、前記トリンダー試薬と共に用いられ、測定対象物の酵素的酸化で生じる過酸化酸素を、さらにペルオキシダーゼ酸化して生成した活性酸素によって、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を含むカプラーと、トリンダー試薬と、が酸化縮合することによって呈色する。そのため化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、上記の通り、その化合物自体に特徴を有するものであるが、カプラーとして使用することが特に好ましい。
【０１８２】
上述の通り、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は水溶性が高いため、それを含む試薬組成物や、該試薬組成物を担体に保持して試験具として使用する場合には、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こる点、非常に優れたものである。また、当該試薬組成物を用いた呈色反応（比色分析法）において、それによって生じた色素化合物についても、検体への溶解性や親和性が高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなり、感度が高く安定した測定が可能となる。さらには、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、溶解性が高いので、従来の試薬より高濃度の試薬組成物液（試薬液）が調製可能である。すると、該試薬組成物を担体に担持して、試験具として使用する場合、塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。
【０１８３】
また、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ない為に、化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらに、前記試薬組成物に含まれる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の親水性官能基は、担体への吸着性を高め、試験具として使用した場合でも、担体内での化合物の安定性を向上させる。このような試薬組成物を提供することにより、ひいては、経時劣化を低減させ有効期間が延びた試験具を提供することが可能となる。
【０１８４】
上記の通り、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、トリンダー試薬と、を組み合わせて、試薬組成物となる。
【０１８５】
化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、前記トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、組み合わせて、液体、粉末、錠剤、もしくは担体に保持した状態で分析用組成物として用いられうる。
【０１８６】
これら分析用組成物には、上記に加えて、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、保護剤等の成分を含んでいてもよい。
【０１８７】
なお、これら成分の含有量は、試薬組成物としての機能を害さなければ特に制限されないが、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとの総重量に対して、好ましくは１０〜３０質量％、より好ましくは１３〜２０質量％含まれてもよい。
【０１８８】
また、液体に保持して用いる場合には、検体と混合して反応させた後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で透過吸光度を測定してもよい。また、前記試薬組成物は、担体に保持した状態で用いてもよい。
【０１８９】
このように、前記試薬組成物は、種々の物に保持して用いることができるが、担体に保持した状態で試験具として用いることが好ましい。
【０１９０】
［試験具］
ドライケミストリーで用いられる試験用具のように、担体に保持した状態で用いる場合には、これらの試薬組成物を含む層の他、これの機能を害さない範囲において、計量層、展開層、濾過層、保持層等を含んでいてもよい。このように担体に保持して用いる場合には、検体を付与した後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で反射吸光度を測定してもよい。測定値は予め作製した検量線を用いて測定対象物の量に換算することができる。
【０１９１】
前記担体の素材としては、紙、布帛、高分子膜等の多孔質物質を用いることができるが、特に、発色性能といった点で、高分子膜が好ましい。
【０１９２】
上記高分子膜とは、高分子よりなる水不溶性の多孔質体である。高分子としては、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、セルロース、セルロースアセテート、硝酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、芳香族ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコールが挙げられる。これらの高分子は一般的に知られている製膜方法を用いて膜を形成することができる。これらの高分子膜の中でもポリスルホンまたはポリエーテルスルホンが、発色性能といった点で、特に好ましい。
【０１９３】
前記試薬組成物を担体に保持する方法にも特に制限はないが、担体に適当な溶剤に溶解させた試薬組成物溶液を担体にコーティングする他、試薬組成物を含むマトリックス前駆体を成型して試験層を形成させる等の公知の方法が用いられうる。
【０１９４】
コーティングは、工業用に使用される一般的なコート法を用いることができるが、担体が多孔質の場合には、しばしば塗工直後の液移動や不均一な乾燥に起因するコートむらが問題となる。担体と塗工液の物性や、塗工乾燥の方法、機器、条件がこれらを支配する重要因子となりうる。このため、精密印刷法が有効な場合もある。
【０１９５】
塗工後の液移動や不均一な乾燥を低減する為には、少量の液を正確に計量して塗工するような精密印刷技術が適するが、この方法では高い試薬濃度の塗工液を作製できることが必須となる。
【０１９６】
例えば、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーは、測定に用いる種々の試薬の中でも最も溶解性が低く、これが高い濃度の塗工液を作製するときの問題点となっていた。しかしながら、本発明の化合物は溶解性が高く、濃度の高い塗工液を作製するに好都合である。
【０１９７】
試薬を担体に保持させた試験具では、検体付与後、検体の液体成分によってまず試薬が溶解し、混合して反応が起こり、色素化合物が生成し、通常試験具の検体付与面の反対側にある読み取り面に移動し、その色調変化を測定する、というステップを経て定量が行なわれる。このため、試薬の溶解性が高いことは、検体による均一な溶解、均一化、迅速な反応に有利であるだけではなく、生成する色素も溶解性に優れるために読み取り面への移動がスムースかつ均一性が高いというメリットもある。これらの特徴は、測定時間の短縮化、測定精度の向上、測定値ばらつきの低減に寄与する。したがって、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は高い溶解性を有するため、測定時間の短縮化、測定精度の向上、測定値ばらつきの低減に寄与できることが期待される。
【０１９８】
４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーは、ある担体に保持させた試験具として使用した場合、濃度変化が測定値に影響するという問題点がある。バルク担体にコートする際むらが生じた場合には、それを切り抜いて用いる各試験具間に感度差が生じる、あるいは保存中に劣化分解して量が変化した場合測定値に影響が出るということを示唆している。原因は、酵素反応や呈色反応の阻害ではなく、化合物の濃度が高いほど他の試薬類の溶解や移動、また生成色素の流動性に何らかの障害を与えるのではないかと考えられている。これに対して、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は４−アミノアンチピリンと比較して濃度の測定値への影響が少なく、これらの問題を改善できる。
【０１９９】
本発明の製造方法により得られる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、トリンダー試薬と組み合わせて酸化発色させた場合には、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーを用いた場合と比較して吸光度が大きくなり、測定感度が向上することができる。例えば、本発明の４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン、４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン等は、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）やＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）と組み合わせて発色させた場合、その検量線の傾きは改善され、測定感度が向上されうる。
【０２００】
上述の通り、本発明の製造方法により得られる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は水溶性が高いため、それを含む試薬組成物を担体に保持してなる試験具を使用する場合、当該試薬組成物は、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こるため、当該試験具は、非常に優れたものとして使用されうる。
【０２０１】
また、前記試験具を用いた場合、試薬組成物の呈色反応において生じた色素化合物についても、検体への溶解性や親和性が高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなる。
【０２０２】
本願発明の製造方法により製造された化合物は、溶解性が高いので、従来の試薬より高濃度の試薬組成物液（試薬液）が調製可能である。すなわち、当該試薬組成物を担体に担持して試験具として使用する場合、塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。
【０２０３】
また、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ない為に、化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらに、当該試薬組成物に含まれる化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩の親水性官能基は、担体への吸着性を高める。すなわち、前記試験具は、担体内での化合物の安定性が向上されている。
【０２０４】
このように前記試薬組成物を含む試験具は、従来に比べ、経時劣化を低減させ有効期間が有意に延びたものといえる。
【実施例】
【０２０５】
次に実施例によって本発明を説明する。本発明の化合物は以下の実施例の製法で合成される。
【０２０６】
＜実施例１＞
１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
１２０℃で１２時間減圧乾燥した１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを２０７４ｇ（含水率：０．５％、カールフィッシャー水分測定器で測定）、２０Ｌ四口フラスコに入れ、１２５７ｇの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した。硫酸ジメチルの滴下後、四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた。次いで、温度コントローラーのセンサー部分をオイルバスに浸し、内温が１６０〜１８０℃になるように加熱を開始した。１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、３〜１０時間加熱した。反応後、四口フラスコを放冷後、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１７４ｇ＋純水：５Ｌ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上で攪拌しながら反応混合物の固形物を溶解した。さらに、溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２０７】
次いで、上記反応混合物の固形物をアルカリ水溶液で溶解した反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。四口フラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過し濾別した。氷冷下、得られた濾液に１．２４Ｌの濃塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水２Ｌにて洗浄した。得られた粗生成物を、スリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた２０Ｌ四口フラスコに入れ、純水７．２Ｌを加えて、９０〜１００℃に加熱溶解した。一晩攪拌しながら室温まで放冷し、目的物の結晶を析出させ、吸引濾過を行なった。上記の再結晶操作をもう一度繰り返し、４０℃の熱風乾燥機で一晩乾燥を行ない、目的物１５３２ｇを得た（収率：７０％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２０８】
【表１】
【０２０９】
＜実施例２＞
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程、単離工程」
４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例１で合成した１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを乳鉢で細かくすりつぶし、６０〜８０メッシュの篩いにかけて（約２００μｍ以下）、１５００．０ｇ（５．５９０ｍｏｌ）を２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコに秤量した。四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計を取り付けた。氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水５．５Ｌを加え、攪拌分散した。攪拌下、冷却した４Ｎ塩酸１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で加えた。その後、攪拌下、冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で、約１時間かけて滴下ロートから滴下した。滴下後、３０分間、０〜１０℃で激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約９Ｌをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。 その後、目的物（４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１１７１ｇを得た（収率：６９％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２１０】
（２）「還元工程、抽出精製工程」
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコにスリーワンモーター、パーフェクトシーラー、撹拌棒、撹拌羽、温度計、玉入冷却器、ガス導入管（先端内径：φ4mm）を取り付けた。窒素ガスをガス導入管から四つ口フラスコ中を約30分間窒素置換した。上記（１）で得られた４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１１００ｇ，２−プロパノール１６．５Ｌ（濃塩酸３５０ｍＬ含有）を四つ口フラスコに入れ、内部を窒素置換して、１０％パラジウム/活性炭（ｗｅｔ）２２０ｇを加えた。水素ガスをガス導入管から２−プロパノール溶液中に攪拌しながら通気した。室温下、８０時間、攪拌しながら水素ガスを通気した。反応後、フラスコ内容物を吸引濾過して、２−プロパノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。
濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，エタノール１０Ｌを加えて分散洗浄した。洗浄後、内容物を吸引濾過して、エタノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液８．３Ｌを加えて攪拌して目的物を溶解抽出した。セライト−５４５をロート上に積層して容器内容物をロートに注いで吸引濾過を行なった。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３Ｌでロート上から洗浄した。目的物を溶解抽出した濾液に濃塩酸を加えてｐＨ＝１以下とした。氷冷下攪拌して目的物の結晶を析出させた。析出した結晶を吸引濾過して、希塩酸１Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５．９Ｌを加えて攪拌して目的物を再溶解した。１０Ｌロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で乾固するまで減圧濃縮を行なった。真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥した。生成物にエタノール７０Ｌを加え、目的物を攪拌抽出した。炭酸水素ナトリウム残渣を濾別して濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥して目的物６００ｇを得た（収率：５０％）。純度９９％（ＨＰＬＣ）。
【０２１１】
【表２】
【０２１２】
＜比較例１＞
１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
未乾燥の１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを２０７４ｇ（含水率：４．６％）、２０Ｌ四口フラスコに入れ、１２５７ｇの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した。硫酸ジメチルの滴下後、四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた。次いで、温度コントローラーのセンサー部分をオイルバスに浸し、内温が１６０〜１８０℃になるように加熱を開始した。１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、３０時間加熱した。反応後、四口フラスコを放冷後、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１７４ｇ＋純水：５Ｌ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上で攪拌しながら反応混合物の固形物を溶解した。さらに、溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２１３】
次いで、上記反応混合物の固形物をアルカリ水溶液で溶解した反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。四口フラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過し濾別した。氷冷下、得られた濾液に１．２４Ｌの濃塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水２Ｌにて洗浄した。得られた粗生成物を、スリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた２０Ｌ四口フラスコに入れ、純水７．２Ｌを加えて、９０〜１００℃に加熱溶解した。一晩攪拌しながら室温まで放冷し、目的物の結晶を析出させ、吸引濾過を行なった。上記の再結晶操作を純度９５％以上（ＨＰＬＣ）になるまで繰り返し、４０℃の熱風乾燥機で一晩乾燥を行ない、目的物２４０ｇを得た（収率：１１％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２１４】
【表３】
【０２１５】
＜比較例２＞
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程、単離工程」
４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例１で合成した１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを乳鉢ですりつぶし（粒径：約５００μｍ以上）、篩いにかけず、１５００．０ｇ（５．５９０ｍｏｌ）を２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコに秤量した。四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計を取り付けた。氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水５．５Ｌを加え、攪拌分散した。攪拌下、冷却した４Ｎ塩酸１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で加えた。その後、攪拌下、冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で、約１時間かけて滴下ロートから滴下した。滴下後、３０分間、０〜１０℃で激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約９Ｌをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。 その後、目的物（４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン９３３ｇを得た（収率：５５％。純度８１％（ＨＰＬＣ）。
【０２１６】
（２）「還元工程、抽出精製工程」
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコにスリーワンモーター、パーフェクトシーラー、撹拌棒、撹拌羽、温度計、玉入冷却器、ガス導入管（先端内径：φ4mm）を取り付けた。窒素ガスをガス導入管から四つ口フラスコ中を約30分間窒素置換した。実施例２の（１）で得られた４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１１００ｇ，２−プロパノール１６．５Ｌ（濃塩酸３５０ｍＬ含有）を四つ口フラスコに入れ、内部を窒素置換して、１０％パラジウム/活性炭（ｗｅｔ）２２０ｇを加えた。水素ガスをガス導入管から２−プロパノール溶液中に攪拌しながら通気した。室温下、８０時間、攪拌しながら水素ガスを通気した。反応後、フラスコ内容物を吸引濾過して、２−プロパノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液８．３Ｌを加えて攪拌して目的物を溶解抽出した。セライト−５４５をロート上に積層して容器内容物をロートに注いで吸引濾過を行なった。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３Ｌでロート上から洗浄した。目的物を溶解した濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で乾固するまで減圧濃縮を行なった。真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥した。生成物にエタノール７０Ｌを加え、目的物を攪拌抽出した。炭酸水素ナトリウム残渣を濾別して濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥して目的物６６０ｇを得た（収率：５５％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２１７】
【表４】
【０２１８】
＜実施例３＞
１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
１２０℃で１２時間減圧乾燥した１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを２０７４ｇ（含水率：０．５％）、２０Ｌ四口フラスコに入れ、１２５７ｇの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した。硫酸ジメチルの滴下後、四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた。次いで、温度コントローラーのセンサー部分をオイルバスに浸し、内温が１６０〜１８０℃になるように加熱を開始した。１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、３〜１０時間加熱した。反応後、四口フラスコを放冷後、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１７４ｇ＋純水：５Ｌ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上で攪拌しながら反応混合物の固形物を溶解した。さらに、溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２１９】
次いで、上記反応混合物の固形物をアルカリ水溶液で溶解した反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。四口フラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過し濾別した。氷冷下、得られた濾液に１．２４Ｌの濃塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水２Ｌにて洗浄した。得られた粗生成物を、スリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた２０Ｌ四口フラスコに入れ、純水７．２Ｌを加えて、９０〜１００℃に加熱溶解した。一晩攪拌しながら室温まで放冷し、目的物の結晶を析出させ、吸引濾過を行なった。上記の再結晶操作をもう一度繰り返し、４０℃の熱風乾燥機で一晩乾燥を行ない、目的物１６４１ｇを得た（収率：７５％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２２０】
【表５】
【０２２１】
＜実施例４＞
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程、単離工程」
４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例３で合成した１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを乳鉢で細かくすりつぶし、６０〜８０メッシュの篩いにかけて（約２００μｍ以下）、１５００．０ｇ（５．５９０ｍｏｌ）を２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコに秤量した。四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計を取り付けた。氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水５．５Ｌを加え、攪拌分散した。攪拌下、冷却した４Ｎ塩酸１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で加えた。その後、攪拌下、冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で、約１時間かけて滴下ロートから滴下した。滴下後、３０分間、０〜１０℃で激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約９Ｌをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。 その後、目的物（４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１２２１ｇを得た（収率：７２％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２２２】
（２）「還元工程、抽出精製工程」
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコにスリーワンモーター、パーフェクトシーラー、撹拌棒、撹拌羽、温度計、玉入冷却器、ガス導入管（先端内径：φ4mm）を取り付けた。窒素ガスをガス導入管から四つ口フラスコ中を約30分間窒素置換した。上記（１）で得られた４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１１００ｇ，２−プロパノール１６．５Ｌ（濃塩酸３５０ｍＬ含有）を四つ口フラスコに入れ、内部を窒素置換して、１０％パラジウム/活性炭（ｗｅｔ）２２０ｇを加えた。水素ガスをガス導入管から２−プロパノール溶液中に攪拌しながら通気した。室温下、８０時間、攪拌しながら水素ガスを通気した。反応後、フラスコ内容物を吸引濾過して、２−プロパノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。
濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，エタノール１０Ｌを加えて分散洗浄した。洗浄後、内容物を吸引濾過して、エタノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液８．３Ｌを加えて攪拌して目的物を溶解抽出した。セライト−５４５をロート上に積層して容器内容物をロートに注いで吸引濾過を行なった。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３Ｌでロート上から洗浄した。目的物を溶解抽出した濾液に濃塩酸を加えてＰＨ＝１以下とした。氷冷下攪拌して目的物の結晶を析出させた。析出した結晶を吸引濾過して、希塩酸１Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５．９Ｌを加えて攪拌して目的物を再溶解した。１０Ｌロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で乾固するまで減圧濃縮を行なった。真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥した。生成物にエタノール７０Ｌを加え、目的物を攪拌抽出した。炭酸水素ナトリウム残渣を濾別して濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥して目的物７０８ｇを得た（収率：５９％）。純度９９％（ＨＰＬＣ）。
【０２２３】
【表６】
【０２２４】
＜比較例３＞
１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
未乾燥の１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを２０７４ｇ（含水率：４．６％）、２０Ｌ四口フラスコに入れ、１２５７ｇの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した。硫酸ジメチルの滴下後、四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた。次いで、温度コントローラーのセンサー部分をオイルバスに浸し、内温が１６０〜１８０℃になるように加熱を開始した。１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、３０時間加熱した。反応後、四口フラスコを放冷後、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１７４ｇ＋純水：５Ｌ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上で攪拌しながら反応混合物の固形物を溶解した。さらに、溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２２５】
次いで、上記反応混合物の固形物をアルカリ水溶液で溶解した反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。四口フラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過し濾別した。氷冷下、得られた濾液に１．２４Ｌの濃塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水２Ｌにて洗浄した。得られた粗生成物を、スリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計、ジムロート冷却器を取り付けた２０Ｌ四口フラスコに入れ、純水７．２Ｌを加えて、９０〜１００℃に加熱溶解した。一晩攪拌しながら室温まで放冷し、目的物の結晶を析出させ、吸引濾過を行なった。上記の再結晶操作を純度９５％以上（ＨＰＬＣ）になるまで繰り返し、４０℃の熱風乾燥機で一晩乾燥を行ない、目的物２１８ｇを得た（収率：１０％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２２６】
【表７】
【０２２７】
＜比較例４＞
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程、単離工程」
４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例３で合成した１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを乳鉢ですりつぶし（粒径：約５００μｍ以上）、篩いにかけず、１５００．０ｇ（５．５９０ｍｏｌ）を２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコに秤量した。四口フラスコ上部にスリーワンモーター、撹拌棒、撹拌羽、温度計を取り付けた。氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水５．５Ｌを加え、攪拌分散した。攪拌下、冷却した４Ｎ塩酸１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で加えた。その後、攪拌下、冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液１．５３６Ｌ（６．１４４ｍｏｌ）を内温１０℃以下で、約１時間かけて滴下ロートから滴下した。滴下後、３０分間、０〜１０℃で激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約９Ｌをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。 その後、目的物（４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン８４８ｇを得た（収率：５０％。純度７５％（ＨＰＬＣ）。
【０２２８】
（２）「還元工程、抽出精製工程」
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２０Ｌ四つ口セパラブルフラスコにスリーワンモーター、パーフェクトシーラー、撹拌棒、撹拌羽、温度計、玉入冷却器、ガス導入管（先端内径：φ4mm）を取り付けた。窒素ガスをガス導入管から四つ口フラスコ中を約30分間窒素置換した。実施例４の（１）で得られた４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン１１００ｇ，２−プロパノール１６．５Ｌ（濃塩酸３５０ｍＬ含有）を四つ口フラスコに入れ、内部を窒素置換して、１０％パラジウム/活性炭（ｗｅｔ）２２０ｇを加えた。水素ガスをガス導入管から２−プロパノール溶液中に攪拌しながら通気した。室温下、８０時間、攪拌しながら水素ガスを通気した。反応後、フラスコ内容物を吸引濾過して、２−プロパノール２．５Ｌでロート上から洗浄した。濾液を十分に切って、濾過物（目的物＋触媒）を２０Ｌ容器に移し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液８．３Ｌを加えて攪拌して目的物を溶解抽出した。セライト−５４５をロート上に積層して容器内容物をロートに注いで吸引濾過を行なった。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３Ｌでロート上から洗浄した。目的物を溶解した濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で乾固するまで減圧濃縮を行なった。真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥した。生成物にエタノール７０Ｌを加え、目的物を攪拌抽出した。炭酸水素ナトリウム残渣を濾別して濾液を１０Ｌロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して４０℃にて減圧乾燥して目的物７８０ｇを得た（収率：６５％）。純度９５％（ＨＰＬＣ）。
【０２２９】
【表８】
【０２３０】
比較例に比べ、本発明の製造方法に係る実施例では、以下の効果が認めら れた。
（１）メチル化
本発明の製造方法に係る実施例では、比較例に比べ、より短時間で反応が進行し、そのため不純物の生成も少なく、精製工程が簡略化できるため、スケールアップが容易になり、収率向上につながった。
（２）ニトロソ化
本発明の製造方法に係る実施例では、比較例に比べ、未反応の原料残りも なく、反応時間の許容範囲が広く、反応工程が簡略化できるため、スケール アップが容易になり、純度、収率向上につながった。
（３）アミノ化
本発明の製造方法に係る実施例では、比較例に比べ、スケールアップした 際でも、高純度の目的物が再現よく得ることが可能となった。
【０２３１】
＜実施例５＞
試験片による性能評価
０．１３Ｍコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）１００ｍＬ中に、実施例２で合成した４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン ０．４６ｇ 、 Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン ０．９５ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ３．０ｇ、グルコースオキシダーゼ １５０Ｋ ｕｎｉｔ、ペルオキシダーゼ ２５０Ｋ ｕｎｉｔを溶解して塗工液を作成した。ポリエーテルスルホン膜（テルモ株式会社製、膜厚１３０μｍ）に塗工液を塗布し、３５℃で１８時間乾燥を行なった。膜を１ｃｍ角の正方形に打ち抜き、試験片を得た。試験片を反射分光光度計検出部に固定した後、１μＬの検体を試験膜上部より滴下し、１０秒後の反射吸光度を測定した。ヘマトクリット値４０、種々のグルコース濃度の血液で測定した値から検量線を作成し、定量感度を観察した。（図１）反射吸光度値はそれぞれの試験片に対して最高となる時間の値を用いた。図１中、ｘ軸に反射吸光度、ｙ軸に血糖値をとっているため、傾きがなだらかなほど感度が高いことを意味する。
図２から示されるように、本発明の製造方法により合成した中間体を用いて合成された４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを用いた試験片の検量線の傾きは、従来から広く使用されている４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）を用いた場合より改善され、測定感度を有意に向上させることが示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１：
【化１】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である）
で示される化合物またはその塩と、硫酸ジメチルとを混合し、無溶媒下で加熱反応させるメチル化工程と；
前記メチル化工程の後、下記化学式２：
【化２】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化するニトロソ化工程と；
前記ニトロソ化工程の後、下記化学式３：
【化３】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される化合物またはその塩を単離する単離工程と；
前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩を、接触水素還元する還元工程と；
を含む、下記化学式４：
【化４】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法において、
前記メチル化工程は、化学式１で示される化合物またはその塩を、メチル化する前に所定の含水率以下まで乾燥する乾燥工程を含み、
前記ニトロソ化工程は、化学式２で示される化合物またはその塩を、ニトロソ化する前に所定の粒径以下まで微粉化する微粉化工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記乾燥工程における前記所定の含水率は１％である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記微粉化工程における前記所定の粒径は５００μｍである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記還元工程は、化学式３で示される化合物またはその塩を、触媒としてパラジウム炭素を用いて還元した後に、反応溶液から不溶物を濾取し、濾取した不溶物をアルコールを用いて分散洗浄し、更に、該不溶物にアルカリ水溶液を加えて化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を溶解し、触媒を除去した後、酸析することによって化学式４で示される酸化発色化合物を精製する精製工程を含む請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記アルコールがエタノールであり、前記酸析に用いる酸が塩酸である請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法で得られる、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩。
【請求項１】
下記化学式１：
【化１】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である）
で示される化合物またはその塩と、硫酸ジメチルとを混合し、無溶媒下で加熱反応させるメチル化工程と；
前記メチル化工程の後、下記化学式２：
【化２】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化するニトロソ化工程と；
前記ニトロソ化工程の後、下記化学式３：
【化３】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される化合物またはその塩を単離する単離工程と；
前記単離工程により得られた化学式３で示される化合物またはその塩を、接触水素還元する還元工程と；
を含む、下記化学式４：
【化４】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である）、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法において、
前記メチル化工程は、化学式１で示される化合物またはその塩を、メチル化する前に所定の含水率以下まで乾燥する乾燥工程を含み、
前記ニトロソ化工程は、化学式２で示される化合物またはその塩を、ニトロソ化する前に所定の粒径以下まで微粉化する微粉化工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記乾燥工程における前記所定の含水率は１％である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記微粉化工程における前記所定の粒径は５００μｍである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記還元工程は、化学式３で示される化合物またはその塩を、触媒としてパラジウム炭素を用いて還元した後に、反応溶液から不溶物を濾取し、濾取した不溶物をアルコールを用いて分散洗浄し、更に、該不溶物にアルカリ水溶液を加えて化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩を溶解し、触媒を除去した後、酸析することによって化学式４で示される酸化発色化合物を精製する精製工程を含む請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記アルコールがエタノールであり、前記酸析に用いる酸が塩酸である請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法で得られる、化学式４で示される酸化発色化合物またはその塩。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２１４４１９（Ｐ２０１２−２１４４１９Ａ）
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８１２００（Ｐ２０１１−８１２００）
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
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