【課題】目的蛋白質を精製するための、オリゴペプチド（タグ）、及び金属イオンアフィニティークロマトグラフィー用ポリマー基材の提供。
【解決手段】少なくとも１つの金属イオンに配位する環状リガンド基を有する官能基により官能化されたポリマー基材であって、前記環状リガンド基がＮ、Ｏ、及びＳからなる群から独立に選択される少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を備える、ポリマー基材。特定のアミノ酸配列を備えたヒスチジン含有オリゴペプチド。該オリゴペプチドに目的のタンパク質分子のアミノ末端又はカルボキシ末端が融合したタンパク質を備えた融合タンパク質。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの金属イオンに配位する環状リガンド基を有する官能基により官能化されたポリマー基材であって、前記環状リガンド基がＮ、Ｏ、及びＳからなる群から独立に選択される少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を備える、ポリマー基材。
【請求項２】
前記環状リガンド基中の少なくとも１つの金属イオン配位ドナー原子が環原子である、請求項１に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項３】
前記ポリマーが実質的に水に不溶性である、請求項１又は２に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項４】
前記ポリマーが、多糖及びその誘導体、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、ポリビニルアルコール及びその誘導体、ポリアクリルアミド、表面修飾されたシリカ、並びに表面修飾された金属酸化物からなる群から選択される、請求項１乃至３の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項５】
前記ポリマーが、アガロース及びその誘導体、デキストラン及びその誘導体、並びにセルロース及びその誘導体からなる群から選択される、先行する請求項の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項６】
前記金属イオンに配位する環状リガンド基が、少なくとも６つの環原子を有する環中に少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を備えた複素環基である、先行する請求項の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項７】
前記金属イオンに配位する環状リガンド基が、少なくとも６個の環原子を有するトリアザシクロアルカン由来の基である、先行する請求項の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項８】
先行する請求項の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材であって、
前記官能基が一般式（Ｉ）を有する、官能化ポリマー基材。
【化１】

ここで、
ｎは０又は１乃至３の整数であり、
各トリアザシクロアルカン環中の各ａ、ｂ、ｃは、相互に独立し且つ他の何れのトリアザシクロアルカン環とも独立して、１乃至３の整数であり、
各トリアザシクロアルカン環中の各−ＣＨ_２−基の一方又は両方の水素原子は、相互に独立し且つ他の何れのトリアザシクロアルカン環とも独立して、任意に且つ独立に置換基で置換することができ、
各トリアザシクロアルカン環中の各−ＮＨ−基の水素原子は、相互に独立して且つ他の何れのトリアザシクロアルカン環とも独立して、任意に置換基で置換することができ、
ｎが０の場合には、ＲはＨ又は置換基であり、
ｎが１の場合には、Ｒは任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備えた二官能性基であり、
ｎが２又は３の場合には、Ｒは任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備えた（ｎ＋１）−官能基であり、
Ｘは、リンカー／スペーサー基である。
【請求項９】
環の−ＣＨ_２基中の水素原子を任意に置換する前記置換基が、任意に置換された低級アルキル基および任意に置換されたアリール基からなる群から選択され、前記低級アルキル基又はアリール基上に任意に導入される前記置換基が任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備える、請求項８に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項１０】
環の−ＮＨ基中の水素原子を任意に置換する前記置換基が、任意に置換された低級アルキル基および任意に置換されたアリール基からなる群から選択され、前記低級アルキル基又はアリール基上に任意に導入される前記置換基が任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備える、請求項８又は９に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項１１】
請求項８乃至１０の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材であって、
前記ポリマー基材がアガロースであり、
ｎが０、１、２又は３であり、
各トリアザシクロアルカン環中のａ、ｂ、及びｃが２であり、
ｎが０の場合には、ＲがＨであり、
ｎが１の場合には、Ｒは、
−〔ＣＨ_２〕_ｍ（ｍは、２、３、又は４である）、
【化２】

並びにそれらの置換された誘導体からなる群から選択され、
ｎが２の場合には、Ｒは、
【化３】

及びそれらの置換された誘導体からなる群から選択され、
ｎが３の場合には、Ｒは、
【化４】

及びそれらの置換された誘導体からなる群から選択され、
Ｘは、アガロースとエピクロロヒドリンとの反応、及び該反応によって生じた生成物とＸに結合した状態になるトリアザシクロアルカン環の環−ＮＨ−基との反応によって誘導可能な基である、
官能化ポリマー基材。
【請求項１２】
前記官能基中の少なくとも１つの前記環状リガンド基に配位した金属イオンをさらに備えた、先行する請求項の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項１３】
前記配位した金属イオンが２価又は３価の金属イオンである、請求項１２に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項１４】
前記金属イオンが、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^2＋、Ｃｕ^2＋、Ｚｎ^2＋、Ｎｉ^2＋、Ｍｎ^2＋、Ｃｏ^2＋、Ｆｅ^3＋、及びＣｒ^3＋からなる群から選択される、請求項１３に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項１５】
第一の官能基と第二の官能基を有する二官能性試薬の前記第一の官能基と第一の反応を行うことができる反応性官能基を有するポリマー基材を選択する工程であって、
前記第一の反応によって前記ポリマー基材と前記二官能性試薬との間に共有結合が形成され、
前記共有結合された試薬の前記第二の官能基が、続いて、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から独立に選択される少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を備えた金属イオンに配位する環状リガンド基を有する種の中に存在する反応性官能基と第二の反応を行うことができ、
前記第二の反応によって前記種と前記共有結合された試薬との間に共有結合が生じる、工程と
前記ポリマー基材を前記二官能性試薬と反応させる工程と、
生じた前記共有結合された試薬を前記種と反応させる工程と、
を備えた、請求項１に記載の官能化ポリマー基材を調製する方法。
【請求項１６】
前記環状リガンド基中の少なくとも１つの金属イオン配位ドナー原子が環原子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリマーが実質的に水に不溶性である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーが、多糖及びその誘導体、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、ポリビニルアルコール及びその誘導体、ポリアクリルアミド、表面修飾されたシリカ、並びに表面修飾された金属酸化物からなる群から選択される、請求項１５乃至１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーが、アガロースとその誘導体、デキストランとその誘導体、及びセルロースとその誘導体からなる群から選択される、請求項１５乃至１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記金属イオンに配位する環状リガンド基が、少なくとも６つの環原子を有する環中に少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を備えた複素環基である、請求項１５乃至１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記金属イオンに配位する環状リガンド基が、少なくとも６つの環原子を有するトリアザシクロアルカン由来の基である、請求項１５乃至２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記金属イオンに配位する環状リガンド基を含む前記種が、一般式（ＩＩ）を有する種である、請求項１５乃至２１の何れか１項に記載の方法：
【化５】

ここで、
ｎ、ａ、ｂ、ｃ、及びＲは、請求項８に記載のとおりであり、
各トリアザシクロアルカン環中の各−ＣＨ_２−基の一方又は両方の水素原子は、相互に独立して且つ他の何れのトリアザシクロアルカン環とも独立して、任意にかつ独立に置換基で置換することができ、任意に導入される該置換基は任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備え、
各トリアザシクロアルカン環中の各−ＮＨ−基の水素原子は、Ｈ^＊を除き、相互に独立して且つ他の何れのトリアザシクロアルカン環とも独立して、任意に置換基で置換することができ、任意に導入される該置換基は任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備える。
【請求項２３】
環−ＣＨ_２−基中の水素原子を置換する前記任意に導入される置換基が、任意に置換された低級アルキル基及び任意に置換されたアリール基からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
環−ＮＨ−基中の水素原子を置換する前記任意に導入される置換基が、任意に置換された低級アルキル基及び任意に置換されたアリール基からなる群から選択される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリマー基材がアガロースであり、
ｎ、ａ、ｂ、ｃ及びＲが、請求項１１に記載のとおりであり、
前記二官能性試薬がエピクロロヒドリンである、請求項２２乃至２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリマー基材を前記二官能性試薬と反応させる際に、反応混合物に還元剤を加える、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記還元剤が水素化ホウ素ナトリウムである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１５乃至２７の何れか１項に記載の方法により取得可能な官能化ポリマー基材。
【請求項２９】
請求項１乃至１１の何れか１項又は請求項２８に記載された官能化ポリマー基材に、前記環状基のうち少なくとも１つに配位された金属イオンをさらに備えた官能化ポリマー基材を調製する方法であって、請求項１乃至１１の何れか１項又は請求項２８に記載の官能化ポリマー基材を前記金属イオンの無機又は有機塩の水溶液に接触させることを備えた、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法によって取得可能な金属イオン含有官能化ポリマー基材。
【請求項３１】
下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えたヒスチジン含有オリゴペプチド：
ＨＨＨＮＳＷＤＨＤＩＮＲ（配列番号１）
ＨＴＮＩＨＱＤＱＨＮＨＦＨＲ（配列番号２）
ＨＡＭＬＤＲＡＨＤＨＧＴＲ（配列番号３）
ＳＬＨＥＨＨＳＧＤＮＬＲ（配列番号４）
ＴＨＹＮＡＶＨＳＨＮＴＬＱ（配列番号５）
ＤＩＨＨＷＴＤＨＬＱＳＳＴＨ（配列番号６）
ＬＹＮＨＹＳＨＴＡＨＶＮＨＬ（配列番号７）。
【請求項３２】
前記アミノ酸配列がアミノ酸配列Ｍｅｔ−Ｘａａを含むＮ末端伸長部を有し、前記Ｘａａがプロリン残基以外のアミノ酸残基である、請求項３１に記載のヒスチジン含有オリゴペプチド。
【請求項３３】
前記アミノ酸配列が、多くとも１０アミノ酸残基のアミノ酸配列を備えたＮ末端伸長部を有する、請求項３１に記載のヒスチジン含有オリゴペプチド。
【請求項３４】
請求項３１乃至３３の何れか１項に記載された少なくとも１つのオリゴペプチドに目的のタンパク質分子のアミノ末端又はカルボキシ末端が融合したタンパク質を備えた融合タンパク質であるポリペプチド。
【請求項３５】
前記オリゴペプチドのアミノ酸配列の前記アミノ末端及びカルボキシ末端が、目的のタンパク分子にそれぞれ融合する、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
酵素及び化学的切断部位からなる群から選択される切断部位に前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が隣接して存在する、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記２つの対象タンパク質分子が同一タンパク質の分子である、請求項３５又は３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記２つの対象タンパク質分子が異なる分子である、請求項３５又は３６に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記ポリペプチドを発現させる条件下で、適切な増殖培地中において、請求項３４乃至３８の何れか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物を備える宿主細胞を培養すること、及び前記培地から当該ポリペプチドを回収することにより取得可能なポリペプチド。
【請求項４０】
前記宿主細胞がＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの菌株である、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
請求項３４乃至３８の何れか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物。
【請求項４２】
ベクターである、請求項４１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項４３】
請求項４１又は４２に記載のポリヌクレオチド構築物を含む宿主細胞。
【請求項４４】
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの菌株である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
請求項３４乃至４０の何れか１項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドを発現させる条件下で、適切な増殖培地中において、請求項４３又は４４に記載されている宿主細胞を培養することと、前記培地から前記ポリペプチドを回収することを備えた方法。
【請求項４６】
目的のタンパク質を精製する方法であって、
請求項３４乃至４０の何れか１項に記載のポリペプチドを含有し、他のタンパク質とともに前記目的のタンパク質を有するタンパク質試料を、前記ポリペプチドが前記金属イオン含有官能化ポリマー基材を結合して該基材と複合体を形成する条件下で、請求項１２乃至１４の何れか１項又は請求項３０に記載の金属イオン含有官能化ポリマー基材と接触させる工程と、
前記複合体を緩衝溶液で洗浄して、前記他のタンパク質を除去する工程と、
前記結合したポリペプチドを前記洗浄された複合体から溶出する工程と、
を備えた方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドから前記オリゴペプチドが切断される工程をさらに備えた、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
酵素的手段により前記ポリペプチドから前記オリゴペプチドが切断される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリペプチドから前記オリゴペプチドを切断するために、ジペプチジルアミノペプチダーゼ等のアミノペプチダーゼを使用する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４７乃至４９の何れか１項に記載の方法により取得可能な精製タンパク質。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【図５６】

【図５７】

【公開番号】特開２００９−１４２２７９（Ｐ２００９−１４２２７９Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−３２１４６７（Ｐ２００８−３２１４６７）
【出願日】平成２０年１２月１７日（２００８．１２．１７）
【分割の表示】特願２００３−５４４０８４（Ｐ２００３−５４４０８４）の分割
【原出願日】平成１４年１１月１２日（２００２．１１．１２）
【出願人】（３９１０３２０７１）ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ (148)
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＶＯ　ＮＯＲＤＩＳＫ　ＡＫＴＩＥ　ＳＥＬＳＸＡＢ
【出願人】（５９４２０２５２３）モナシュ　ユニバーシティ (10)
【Ｆターム（参考）】