開腹手術後の癒着の予防剤
【課題】手術後の腹腔内癒着を予防する薬剤を提供する。
【解決手段】細胞の増殖、移動、生存を促進する成長因子であり、好中球、マクロファージを炎症刺激部位に誘導し、炎症反応の一翼を担うことが知られているミッドカインの発現を抑えるオリゴヌクレオチドあるいはミッドカインの作用を抑える抗体。当該オリゴヌクレオチドは、ミッドカインの発現を強力に抑えるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ミッドカインｍＲＮＡにハイブリダイズすることにより、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害し、そして、ミッドカインの合成を阻害する。ミッドカインに結合する抗体である抗ミッドカイン抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。
【解決手段】細胞の増殖、移動、生存を促進する成長因子であり、好中球、マクロファージを炎症刺激部位に誘導し、炎症反応の一翼を担うことが知られているミッドカインの発現を抑えるオリゴヌクレオチドあるいはミッドカインの作用を抑える抗体。当該オリゴヌクレオチドは、ミッドカインの発現を強力に抑えるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ミッドカインｍＲＮＡにハイブリダイズすることにより、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害し、そして、ミッドカインの合成を阻害する。ミッドカインに結合する抗体である抗ミッドカイン抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、開腹手術後の癒着の予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
術後の開腹術後、癒着を生じる割合は報告により差があるが、メジャーな開腹術では９０％以上のケースに生じ、婦人科の開腹術では５５−１００％の患者に生じると報告されている。開腹術の術中操作の機械的刺激により腹腔内臓器に炎症を生じ、腹腔内臓器間に、または腹腔内臓器と腹壁間に癒着が生じ、このことが原因で消化管の通過障害、絞扼などが生じ、癒着性イレウスにいたるものもある。癒着性イレウスに至らないまでも慢性的な腹痛や、女性では不妊の原因となり得る。また、その後の開腹術を非常に因難なものとする原因となる。術後数十年経過してから癒着性イレウスを生じるケースもしばしば見られ、それに対する治療として再び開腹し癒着剥離術を要する場合も多い。しかしこの操作により更なる癒着を生じる結果となる。従来、開腹術後の癒着は大きな問題点であったが、避けられない副作用として見過ごされていた。近年、これを防止するために腹腔内に留置する吸収性の膜（セプラフィルム；科研製薬）が開発されたが、膜で隔てられた部位にしか癒着防止効果は無く、腹腔内全体に癒着防止効果を発揮することはできない。術後の腹腔内の癒着を予防する更なる技術が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本研究は、手術後の腹腔内癒着を予防する新規薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、遺伝的背景の異なるマウス間で、癒着の程度に差があるかを系統的に調べた。そして、意外にもミッドカイン遺伝子ノックアウトマウス（ミッドカイン（−／−）マウス）では腹腔内に作った創部に対して腹腔内癒着が野性型マウスに比較して有意に少なかった。さらに、ミッドカイン（−／−）マウスでは、癒着は抑制されたが、これらのマウスにミッドカインを与えると、プロセスは再開された。マクロファージおよび好中球の網への遊走は、ミッドカイン（−／−）マウスにおいて抑制された。これら事実から、本発明者は、ミッドカインが腹腔内癒着に決定的に関与しており、それを抑制するための分子標的となることを見出した。
【０００５】
ミッドカインは細胞の増殖、移動、生存を促進する成長因子であり（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．Ｗｉｌｅｙ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｍｏｌ，２０８６−２０８８，２００２、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２，３５９−３７１，２００２）、好中球、マクロファージを炎症刺激部位に誘導し、炎症反応の一翼を担うことが知られているが（Ｔａｋａｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，４５３−４５８，１９９７、Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５，４８９−４９５，２０００）、本知見により、ミッドカインが癒着にも関与することが明らかとなった。
【０００６】
すなわち、本発明は、ミッドカインの合成あるいは作用を阻害することによって癒着を予防するものである。
【０００７】
ミッドカイン遺伝子ノックアウトマウス（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，３，８１１−８２２，１９９８）と対照とする野生型マウスで、膜壁損傷後の癒着の形成度を比較すると、ノックアウトマウスでは著しく低下していた（図１）。ノックアウトマウスと野生型マウスの間では、ミッドカインの存在の有無のみが異なるので、ミッドカインの発現を抑えるか、作用を抑えれば、癒着の予防・治療が可能である。
【０００８】
本発明における「ミッドカイン遺伝子の発現の抑制」には、転写および翻訳の抑制の双方が含まれる。ミッドカイン遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドとしては、ミッドカイン遺伝子の転写産物と相補的なＲＮＡまたは該ＲＮＡをコードするＤＮＡを用いることができる。このような化合物の一つの態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
ミッドカインの発現を強力に抑えるアンチセンスオリゴヌクレオチドは既に開発されて
いる（Ｔａｋｅｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６１ ８４８６−８４９１，２００１、特願２００２−１４２７７８、特願２００２−４７１３５、２００２−４７１３６）ので、これらを用いれば良い。しかし、本発明はこの特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドに限定されるものではない。
【００１０】
本明細書における「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド構造のような天然に存在するオリゴマーの核酸部分、ならびに天然に存在する核酸に結合する能力のある人工アナログの両方を包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって、またはメチルホスホネート、ホスホロチオエート、もしくは他の結合により結合したアナログによって、結合したリボヌクレオチドモノマーに基づいていればよい。またそれらは、基本構造または他の修飾は変化しているが、天然に存在するＤＮＡ構造およびＲＮＡ構造に結合する能力を保持したままである、モノマー部分を有していてもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、出願人らに周知の方法、例えば、市販の機械およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）より入手できる試薬を用いる方法によって調製することができる。
【００１１】
ホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドは、血清でまたは細胞内部でヌクレアーゼの作用を特に受けやすく、そのため好適な態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性であることが明らかになっているホスホロチオエート結合あるいはメチロホスホネート結合したアナログなどである（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８；２６５９，１９９８）。出願人らが開発した方法も有効である（特願２００２−４７１３６）。
【００１２】
本発明の他の態様において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、発現構築を用いて標的細胞を感染させることによって生成されるＲＮＡ分子が、ミッドカインｍＲＮＡにハイブリダイズすることにより、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害し、そして、ミッドカインの合成を阻害するように選択される。
【００１３】
ｍＲＮＡ標的物を用いてこのオリゴヌクレオチドをハイブリッドすると、相応する遺伝子産物の発現を多重機構で阻害することができる。「翻訳停止」状態では、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が阻止される（Ｈａｅｕｐｔｌｅ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４．：１４２７，１９８６）。ホスホジエステルＤＮＡまたはホスホロチオエートＤＮＡオリゴヌクレオチドなどの場合では、標的となるＲＮＡ配列がそのＤＮＡオリゴマーにハイブリダイズするとすぐに、細胞内ＲＮａｓｅ Ｈがその標的ＲＮＡ配列を消化することができる（Ｗａｌｄｅｒ ＆ Ｗａｌｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：５０１１，１９８８）。「翻訳停止」状態におけるさらなる作用機構としては、ある種のオリゴヌクレオチドは、目的の遺伝子を含む二本鎖の標準的なゲノムＤＮＡとともに「トリップレクス」すなわち三重らせん構造を形成することが可能で、それによってＲＮＡポリメラーゼによる転写が妨げられることが明らかである（Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：１００１３，１９９３）。
【００１４】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドの他の一つの態様は、ミッドカイン遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡまたはこれをコードするＤＮＡである。ＲＮＡｉは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡ（以下ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約４０〜数百塩基対のｄｓＲＮＡが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、ｄｓＲＮＡを３’末端から約２１〜２３塩基対ずつ切り出し、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）を生じる。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体はｓｉＲＮＡと同じ配列を認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部で標的遺伝子のｍＲＮＡを切断する。また、この経路とは別にｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｓＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成される。このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となって、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅する経路も考えられている。ｓｉＲＮＡ法のオリゴヌクレオチド（ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｈａｒｐ Ｐ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，３，７３７−７４７）も本発明に適用可能である。
【００１５】
上記ＲＮＡｉは、当初、線虫において発見されたが（Ｆｉｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６−８１１，（１９９８））、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（Ｆｉｒｅ，Ａ．ＲＮＡ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１５，３５８−３６３（１９９９）、Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ２００１．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５，４８５−４９０（２００１）、Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．，Ｃａｕｄｙ，Ａ．Ａ．＆ Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２，１１０−１１１９（２００１）、Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ｌｉｓｔｅｎｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｏｕｎｄ ｏｆ ｓｉｌｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．８，７４６−７５０（２００１））。これら生物では、実際に外来よりｄｓＲＮＡを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックアウト個体を創生する方法としも利用されつつある。
【００１６】
ＲＮＡｉの登場当初はｄｓＲＮＡはある程度の長さ（４０塩基）以上でなければ効果がないと考えられていたが、米ロックフェラー大のＴｕｓｃｈｌらは２１塩基対前後の単鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞に導入すれば、哺乳動物細胞においてもＰＫＲによる抗ウイルス反応を起こさず、ＲＮＡｉの効果があることを報告し（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８（２００１））、ＲＮＡｉは分化したヒトなどの哺乳動物細胞に応用可能な技術として俄然注目を集めることになった。
【００１７】
ミッドカイン遺伝子の発現の抑制にＲＮＡｉを利用する場合においては、ｄｓＲＮＡとしてｓｉＲＮＡが使用されてもよい。「ｓｉＲＮＡ」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味し、Ｔｕｓｃｈｌら（前掲）により報告された全長２１〜２３塩基対に限定されるものではなく、毒性を示さない範囲の長さであれば特に限定はなく、例えば、１５〜４９塩基対と、好適には１５〜３５塩基対と、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。あるいは、発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的な二重鎖ＲＮＡ部分の長さが、例えば、１５〜４９塩基対、好適には１５〜３５塩基対、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。
【００１８】
本発明のＤＮＡとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドＲＮＡ（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ‘ｈａｉｒｐｉｎ’ ＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ））を作るようなコンストラクト（Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４０７：３１９，２０００、Ｗｅｓｌｅｙ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．２７：５８１，２００１、Ｐｉｃｃｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：Ｅ５５，２００１）を用いることもできる。
【００１９】
ＲＮＡｉに用いるＤＮＡは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上（例えば、９６，９７，９８，９９％以上）の配列の同一性を有する。塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ Ｓ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８〈１９９０〉；Ｋａｒｌｉｎ Ｓ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７〈１９９３〉）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〈１９９０〉）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００２０】
ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。また、マイクロＲＮＡまたはこれをコードするＤＮＡも、ミッドカイン遺伝子の発現の抑制に用いることが可能である。
【００２１】
また、ミッドカインの機能を抑制する化合物としては、ミッドカインに結合する抗体が挙げられる。
【００２２】
ミッドカインの作用を抑える抗ミッドカイン抗体は既に開発されているので、同様の手法で作成することができる（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，，１５９，３９２−４０２，１９９３）。また、ヒトミッドカインに対するモノクローナル抗体も作成されている（特開２００２−０８５０５８）。しかし、本発明の抗体はこれに限定されるものではない。抗ミッドカイン抗体についてより詳しく説明する。
【００２３】
本研究で使用される抗ミッドカイン抗体は、一般的には公知の手段を用いて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。モノクローナル抗体は、公知の方法に準じて作製することができる。例えばヒトミッドカインｃＤＮＡはクローニングされ、そのＤＮＡ配列とそれにコードされるアミノ酸配列が報告されている。モノクローナル抗体はミッドカイン（ミッドカイン）タンパク抗体全体に対しても、或いはその一部に対しても作製することができる。特に好ましいのは、可溶性型のヒトミッドカインタンパク抗原に対して作製された抗体である。また、本研究においては、抗原結合断片、例えば、Ｆ（ａｄ’）２やＦａｄ’断片を含む。
【００２４】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には、ケーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に準じて、以下のようにして作製できる。すなわち、ミッドカインタンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免役し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００２５】
例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるミッドカインタンパクは、ヒトミッドカインについては、特開平９−９５４５４に詑載のミッドカインアミノ酸配列を用いることによって得られる。
【００２６】
ミッドカインは、本発明で使用される抗体取得のための抗原として使用される限りそのアミノ酸残基数を問わない。ミッドカイン遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のミッドカインタンパクを公知の方法で精製し、この精製ミッドカインタンパクを感作抗原として用いればよい。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般には、齧歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
【００２７】
感作抗原を動物に免役するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳや生理食塩水等で適量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混含し、乳化後哺乳動物に１４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このようにして免役し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後、哺乳動物から免疫細胞を取り出し細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。
【００２８】
上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、公知の各々の細胞株、例えばＰ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３〉（Ｋｅａｒｎｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ，，１２３：１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８１：１−７，１９７８）、Ｎｓ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０，１９７８）、ＦＯ（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．＆ Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｄ．：Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５：１−２１，１９８０）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８：３１３−３２３，１９７８）、Ｒ２１０（Ｇａｌｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ，：Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１３１−１３３，１９７９）、等が好適である。
【００２９】
上記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は、基本的には、公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）等に準じて行うことができる。具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス等が使用され、さらに、融合効率を高めるため、ジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することができる。
【００３０】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補助液を併用することもできる。
【００３１】
細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を上記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば，平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を、通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的の融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して、上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００３２】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマスクリーニング及び単一クローニングが行われる。
【００３３】
また、本発明では、組み換え型抗体や改変抗体が使用できる。組み換え型抗体としては、例えば、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んでこれを宿主に導入し、遺伝子組み換え技術を用いて産生させた組み換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．＆ Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０）。改変抗体としては、例えばキメラ抗体、ヒト型化抗体が使用できる。キメラ抗体は、ヒト抗体以外の抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、産生させることにより得られる（ＥＰ １２５０２３，ＰＣＴ ＷＯ９６／０２５７６）。
【００３４】
本発明で使用される抗体は、ミッドカインに結合しミッドカインの活性を阻害するかぎり、抗体の断片や修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【００３５】
また、ミッドカインの活性を抑制する限り、抗体以外の化合物も、本発明における、開腹手術後の癒着を防止するために用いることができる。このような化合物は、被検化合物をミッドカインと接触させ、被検化合物の存在下におけるミッドカインの活性を測定し、被検化合物の非存在下と比較して、有意にミッドカインの活性を低下させるものを選択することにより、同定することができる。被検化合物としては、細胞抽出液、精製タンパク質、もしくはペプチド、人工的に合成された低分子化合物、などが挙げられるが、本発明は、これらに制限されない。被検化合物は、ミッドカイン受容体とミッドカインとの結合を阻害する化合物であってもよい。ミッドカインの種々の活性は公知である。例えば、好中球およびマクロファージの遊走については、文献（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２，３５９−３７１，２００２、Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５１，１３１２−１３１８ １９８８、Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５，４８９−４９５，２０００、Ｔａｋａｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，４５３−４５８，１９９７、Ｓａｔｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，３４６３−３４６９ ２００１）に開示されている。また、ミッドカインの活性を抑制する化合物の候補は、ミッドカインとの結合活性を指標に同定することができる。即ち、被検化合物をミッドカインと接触させ、被検化合物のミッドカインとの結合活性を測定し、有意な結合活性を示すものを選択することにより、ミッドカインの活性を抑制する化合物の候補を得ることができる。
【００３６】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物やミッドカインタンパク質の機能を抑制する化合物は、公知の製剤学的製造法によって、製剤化して投与することもできる。例えば、薬剤として一般的に用いられる適当な担体、または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油等）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム）、安定剤（例、糖、糖アルコール、アルブミン）、または保存剤（パラベン）、等と適宜組み合わせて、生体に効果的に投与するのに適した剤型にて生体に投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、野生型マウスとミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスでの作成創に対する大網の癒着面積の割合を［大網の癒着面積の割合（％）＝大網の癒着面積×１００／作成創の面積］で計算し、その平均値を示したグラフである。相関のない２群の有意差検定を行った。
【図２】図２はミッドカイン（−／−）マウスにおける腹腔内癒着の減少を示す写真（ａ−ｃ）および図（ｄ，ｅ）である。ａ、部分的肝切除後２週間で認められた腸の癒着。ＷＴ（ｎ＝１０）およびミッドカイン（−／−）（ｎ＝１０）マウスにおいて認められた代表的な例を示す。ｂ、ｃ、損傷した腹壁への網の癒着。矢印で示した領域は、手術によって剥離され、７日後に癒着を調べた。ＷＴ（ｂ）およびミッドカイン（−／−）マウス（ｃ）の代表的な例を示す。ｄ、ｅ、損傷した腹壁に対する網の癒着の減少の定量的推定。ｄ、ＷＴ（ｎ＝１０）およびミッドカイン（−／−）（ｎ＝１０）マウスにおける癒着領域を欠損領域に対する百分率として示す。ｅ、無処置のまま（ｎ＝１０）、またはミッドカイン（ｎ＝１０）もしくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｎ＝１０）を注入したＷＴおよびミッドカイン（−／−）マウスにおける癒着の発生率。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。統計学的有意性は、ｄではスチューデントｔ検定において、そしてｅではフィッシャーの直説法によって評価した。
【図３】図３は、網におけるミッドカインの局在を示す写真（ａ−ｃ）および図（ｄ）である。ａ、５日目での癒着領域の抗ミッドカイン染色。破線は癒着部位を示す。ＯＭ、網；ＰＷ、腹壁。バーは１００μｍである。ｂ、四角の領域を拡大した。ａｎｔｉ−ミッドカイン、抗ミッドカインによる染色；ａｎｔｉ−Ｍａｃ、抗単球−マクロファージマーカーによる染色。バー、１００μｍ。ｃ、抗マクロファージマーカーまたは抗ミッドカイン抗体による腹腔内マクロファージの染色。バー、５０μｍ。ｄ、網におけるミッドカインを同定するためのウェスタンブロット分析。レーン１、２、３および４は、０、３、５および７日目に採取した試料を示す。
【図４】図４は、ミッドカイン（−／−）マウスにおける炎症性白血球遊走の減少を示す写真（ａ）および図（ｂ−ｅ）である。ａ、創傷後異なる日の網からの切片の免疫組織化学染色。バー、５０μｍ。ｂ〜ｅ、網（ｂ、ｄ）および損傷した腹壁（ｃ、ｅ）に存在するマクロファージ数（ｂ、ｃ）、および好中球数（ｄ、ｅ）。黒い部分、ＷＴ；白い部分、ミッドカイン（−／−）。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。統計学的有意性はスチューデントｔ検定によって評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
［実施例１］ミッドカインの開腹手術後の癒着に与える影響
（１）ノックアウトマウスの調製
ミッドカイン（−／−）マウスは既に記述されている通りに作製した（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，３，８１１−８２２，１９９８）。ヘテロ接合体をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに９回戻し交配した。次に、それらを互いに交配させて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有するミッドカイン（−／−）マウスを得た。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは野生型対照として用いた。
（２）試験例１
１６週齢の野生型マウスとミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスにケタラールを１ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与し全身麻酔を施行後、清潔操作下に開腹し左側上腹部腹壁の腹腔内側に５×５ｍｍの腹膜欠損創を作成し、バイポーラで止血後ナイロン糸を用いて閉腹した。７日後に同様の処置によって開腹し、画像解析ソフトＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にて作成創に対する大網の癒着面積の割合（大綱の癒着面積×１００／作成創の面積）を測定した。
【００４０】
この値は野生型マウスでは３４．６％、ノックアウトマウスでは２．３３％であり、有意にノックアウトマウスで低かった（図１）。
（３）試験例２
４ヶ月齢の雌性マウスを用いた。マウスをペントバルビタールナトリウム（アボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ノースシカゴ、イリノイ州）（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔して、開腹した。１１番の手術用ナイフを用いて、左上腹部の内側に５×５ｍｍの擦過傷を作製した。両極性焼灼器によって止血した後、腹部を５−０ナイロン縫合糸によって閉じた。７日後、上記のようにペントバルビタールナトリウムの麻酔下で再度開腹して、網と注射部位の癒着領域をシオンイメージ画像分析ソフトウェアを用いて決定した（シオンコーポレーション（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、シティ、マサチューセッツ州）。ポンプ試験では、ヒトミッドカインの生理食塩液溶液（１ｍｇ／ｍｌ）またはヒト血清アルブミン（和光純薬、大阪、日本）の生理食塩液溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、浸透圧ポンプ（アルザコーポレーション（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、パロアルト、カリフォルニア州）を用いてミッドカイン（−／−）マウスに注入した。背部皮膚下に埋め込まれたポンプは、７日間にわたって全体で９０μｌを持続的に注入した。ヒトミッドカインは酵母において産生され、セルシグナルズインク（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｉｎｃ．）のＳａｋｕｍａ博士の好意により提供された。部分的肝切除の場合、マウスを用量４０ｍｇ／ｋｇ体重のペントバルビタールによって麻酔して、左右中葉および左側葉を外科的に切除した。癒着は２週間後に調べた。
【００４１】
その結果、部分的肝切除を行った際に、本発明者らは、腸の癒着がミッドカイン（−／−）マウスでは野生型（ＷＴ）マウスほど重度ではないことを発見した（図２ａ）。癒着は全てのＷＴマウスにおいて起こったが、ミッドカイン（−／−）マウスの約５０％は癒着を示さなかった。詳しい分析を行うため、本発明者らは網の癒着アッセイを開発した。ミッドカイン（−／−）またはＷＴマウスの腹壁に創傷を作製した。ＷＴマウスでは（図２ｂ）、損傷の７日後、網は腹壁に癒着したが、ミッドカイン（−／−）マウス（図２ｃ）では癒着は全くまたはほとんど起こらなかった。癒着した網の領域の平均値（図２ｄ）および癒着の発生率（図２ｅ）は、ミッドカイン（−／−）マウスではＷＴマウスより有意に低かった。ミッドカインを浸透圧ポンプによってミッドカイン（−／−）マウスに皮下投与すると、癒着は有意に元に戻った。ウシ血清アルブミンを投与しても作用を示さなかった（図２ｅ）。この知見は、ミッドカインの喪失が、ミッドカイン（−／−）マウスにおける癒着の減少に実際に関与していることを確認した。これらの全ての結果から、本発明者らは、ミッドカインが腹腔内癒着に根本的に関与しているという結論に達する。
［実施例２］癒着領域におけるミッドカインの発現
ミッドカインの発現は、既に記述されているように（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，，１５９，３９２−４０２，１９９３）、抽出物１．７ｍｇに由来するヘパリン結合タンパク質のウェスタンブロット分析によって決定した。抗マウスミッドカイン（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，，１５９，３９２−４０２，１９９３）は記述通りに産生した。アフィニティ精製ウサギ抗マウスミッドカインを第一抗体として、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）を二次抗体として用いる免疫組織化学分析（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，３，８１１−８２２，１９９８）によって、ミッドカイン発現部位が明らかとなった。染色は、ジアミノベンジジン四塩酸（アマシャムファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、東京、日本）によって可視化した。フルオレセインイソチオシアネート標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ州）も同様に第二抗体として用いた。マクロファージマーカーまたは好中球マーカーの染色は、同じように行った；切片はラット抗マウス単球−マクロファージマーカーＦ４／８０（セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ）、オックスフォード、イギリス）またはラット抗マウス好中球マーカー７／４（セロテック）に対するモノクローナル抗体によって染色した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ）と共にインキュベートした。倍率４００倍での視野における細胞数を計数した。全体で１２視野を調べて、平均値を得た。それぞれの遺伝子型［ＷＴまたはミッドカイン（−／−）］のマウス４匹をそれぞれの時点で調べて、平均値をＳＤと共に示す。マウスの腹腔内マクロファージは、既に記述されているとおりに単離した（Ｘｉｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，３６３７−３６４４，１９９４）。
【００４２】
ミッドカインは、胚の時期に主に発現され、成体組織では限定された部位に存在するに過ぎず、その発現はしばしば様々な損傷後に増加するが（Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５，４８９−４９５，２０００、Ｓａｔｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，３４６３−３４６９ ２００１、Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１０，６０７−６１６ １９９０、Ｍｉｔｓｉａｄｉｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１，３７−５１ １９９５、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８５，２５−３０ １９９５）、癒着の過程において、ミッドカインは網において主に発現された。免疫組織化学染色の例を図２ａに示す。ミッドカインは、マクロファージ様細胞および血管に主に存在した。ミッドカインがマクロファージによって発現されることは、抗ミッドカイン抗体および抗マクロファージマーカーとの同時染色によって確認されたのみならず（図３ｂ）、単離された腹腔マクロファージにおけるミッドカイン発現を調べること（図３ｃ）によっても確認された。ウェスタンブロット分析から、網からのミッドカインが単量体および二量体の双方で構成され、分子量は３０ｋＤａであることが判明した（図３ｄ）。
【００４３】
本発明者らは、癒着領域周辺の網におけるマクロファージの数が損傷後３日目および５日目でピークに達したことを認め、癒着の際にこれらの部位へ細胞が動員されることを示している（図４ａ）。一つのマクロファージ源は網における乳状斑である（Ｍａｎｄａｃｈｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｒｐｈｏｌ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．（Ｂｕｃｕｒ）３１，１３７−１４２ １９８５）。遊走はＷＴマウスではミッドカイン（−／−）マウスより顕著であった。定量的評価によってこれらの知見を確認した（図４ｂ）。網への好中球の遊走に関して、本発明者らは、同じ結論に達した（図４ｄ）。損傷した腹壁への白血球の遊走は、ＷＴおよびミッドカイン（−／−）マウスのあいだでごくわずかな差を認めた（図４ｃおよびｅ）。
【産業上の利用の可能性】
【００４４】
ミッドカインは、好中球およびマクロファージの遊走を直接、そしてまたケモカインの誘導によって間接的に促進する（Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５，４８９−４９５，２０００、Ｔａｋａｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，４５３−４５８，１９９７、Ｓａｔｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，３４６３−３４６９ ２００１）。ミッドカイン（−／−）マウスにおいて、虚血性損傷時の新生内膜形成（Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５，４８９−４９５，２０００）および腎炎（Ｓａｔｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，３４６３−３４６９ ２００１）は、野生型マウスと比較して、炎症性白血球動員の同時減少と共に有意に抑制される。本発明者らは、以下の一連の事象が癒着の場合に起こると考えている。損傷した腹壁は、網を活性化する因子を分泌して、白血球の浸潤を誘発する。炎症性白血球の網への動員は、血管に存在し、マクロファージによっても分泌されるミッドカインによって促進される。マクロファージ内のミッドカインも同様にその活性化に関与しうる。マクロファージが動員された後、それらによって分泌されたミッドカインは、白血球の動員をさらに加速するであろう。動員された白血球は、網の癒着活性を促進する因子を分泌する可能性がある。ミッドカインが同様に網を直接刺激する可能性は完全に排除することができない。本発明者らは、臓器間癒着において、腹腔内マクロファージが重大な役割を有すること、そしてミッドカインがマクロファージの遊走および／または活性化を促進することによってこの癒着において重要であると考える。この点において、網の乳状斑は、重要な腹腔内マクロファージ源であると考えられることを指摘すべきである。
【００４５】
腹腔内癒着の形成における重要な要因としてミッドカインが同定されたことは、プロセスの背後のメカニズムおよびその予防法に対して新たな洞察を与える。特に、ミッドカインの活性化またはその生合成を阻害する治療戦略は、予防において有用となるであろう。最近、腹腔内癒着を防止するために、腹腔に残って吸収される膜が導入されている（Ｂｅｃｋ，Ｄ．Ｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｓｕｐｐｌ．５７７，４９−５５ １９９７）。しかし、技法は、膜によって隔てられた臓器のみに適用され、腹腔内癒着を予防する他の有効な手段が緊急に必要である。そのような癒着を防止するために様々な実験が行われている（Ｖｒｉｊｌａｎｄ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２３５，１９３−１９９ ２００２、Ｇｉｍｂｅｌ．Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１３６，３１１−３１７ ２００１、Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１１０，２０７−２１０ ２００３、Ｎａｇｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１８０，５５８−５６３ １９９９）。ミッドカインは妊娠中期胚において主に発現され、成体組織におけるその発現は限定されている（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１０，６０７−６１６ １９９０、Ｍｉｔｓｉａｄｉｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１，３７−５１ １９９５）。その発現様式のために、ミッドカインは副作用がほとんどないという点において適した標的である。抗ミッドカイン抗体およびミッドカインアンチセンスオリゴＤＮＡは既に開発されており、腫瘍細胞のミッドカイン依存的増殖を阻害するために有効であることが判明している（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，，１５９，３９２−４０２，１９９３、Ｔａｋｅｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６１ ８４８６−８４９１，２００１）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、開腹手術後の癒着の予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
術後の開腹術後、癒着を生じる割合は報告により差があるが、メジャーな開腹術では９０％以上のケースに生じ、婦人科の開腹術では５５−１００％の患者に生じると報告されている。開腹術の術中操作の機械的刺激により腹腔内臓器に炎症を生じ、腹腔内臓器間に、または腹腔内臓器と腹壁間に癒着が生じ、このことが原因で消化管の通過障害、絞扼などが生じ、癒着性イレウスにいたるものもある。癒着性イレウスに至らないまでも慢性的な腹痛や、女性では不妊の原因となり得る。また、その後の開腹術を非常に因難なものとする原因となる。術後数十年経過してから癒着性イレウスを生じるケースもしばしば見られ、それに対する治療として再び開腹し癒着剥離術を要する場合も多い。しかしこの操作により更なる癒着を生じる結果となる。従来、開腹術後の癒着は大きな問題点であったが、避けられない副作用として見過ごされていた。近年、これを防止するために腹腔内に留置する吸収性の膜（セプラフィルム；科研製薬）が開発されたが、膜で隔てられた部位にしか癒着防止効果は無く、腹腔内全体に癒着防止効果を発揮することはできない。術後の腹腔内の癒着を予防する更なる技術が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本研究は、手術後の腹腔内癒着を予防する新規薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、遺伝的背景の異なるマウス間で、癒着の程度に差があるかを系統的に調べた。そして、意外にもミッドカイン遺伝子ノックアウトマウス（ミッドカイン（−／−）マウス）では腹腔内に作った創部に対して腹腔内癒着が野性型マウスに比較して有意に少なかった。さらに、ミッドカイン（−／−）マウスでは、癒着は抑制されたが、これらのマウスにミッドカインを与えると、プロセスは再開された。マクロファージおよび好中球の網への遊走は、ミッドカイン（−／−）マウスにおいて抑制された。これら事実から、本発明者は、ミッドカインが腹腔内癒着に決定的に関与しており、それを抑制するための分子標的となることを見出した。
【０００５】
ミッドカインは細胞の増殖、移動、生存を促進する成長因子であり（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．Ｗｉｌｅｙ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｍｏｌ，２０８６−２０８８，２００２、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２，３５９−３７１，２００２）、好中球、マクロファージを炎症刺激部位に誘導し、炎症反応の一翼を担うことが知られているが（Ｔａｋａｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，４５３−４５８，１９９７、Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５，４８９−４９５，２０００）、本知見により、ミッドカインが癒着にも関与することが明らかとなった。
【０００６】
すなわち、本発明は、ミッドカインの合成あるいは作用を阻害することによって癒着を予防するものである。
【０００７】
ミッドカイン遺伝子ノックアウトマウス（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，３，８１１−８２２，１９９８）と対照とする野生型マウスで、膜壁損傷後の癒着の形成度を比較すると、ノックアウトマウスでは著しく低下していた（図１）。ノックアウトマウスと野生型マウスの間では、ミッドカインの存在の有無のみが異なるので、ミッドカインの発現を抑えるか、作用を抑えれば、癒着の予防・治療が可能である。
【０００８】
本発明における「ミッドカイン遺伝子の発現の抑制」には、転写および翻訳の抑制の双方が含まれる。ミッドカイン遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドとしては、ミッドカイン遺伝子の転写産物と相補的なＲＮＡまたは該ＲＮＡをコードするＤＮＡを用いることができる。このような化合物の一つの態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
ミッドカインの発現を強力に抑えるアンチセンスオリゴヌクレオチドは既に開発されて
いる（Ｔａｋｅｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６１ ８４８６−８４９１，２００１、特願２００２−１４２７７８、特願２００２−４７１３５、２００２−４７１３６）ので、これらを用いれば良い。しかし、本発明はこの特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドに限定されるものではない。
【００１０】
本明細書における「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド構造のような天然に存在するオリゴマーの核酸部分、ならびに天然に存在する核酸に結合する能力のある人工アナログの両方を包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって、またはメチルホスホネート、ホスホロチオエート、もしくは他の結合により結合したアナログによって、結合したリボヌクレオチドモノマーに基づいていればよい。またそれらは、基本構造または他の修飾は変化しているが、天然に存在するＤＮＡ構造およびＲＮＡ構造に結合する能力を保持したままである、モノマー部分を有していてもよい。このようなオリゴヌクレオチドは、出願人らに周知の方法、例えば、市販の機械およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）より入手できる試薬を用いる方法によって調製することができる。
【００１１】
ホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドは、血清でまたは細胞内部でヌクレアーゼの作用を特に受けやすく、そのため好適な態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性であることが明らかになっているホスホロチオエート結合あるいはメチロホスホネート結合したアナログなどである（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８；２６５９，１９９８）。出願人らが開発した方法も有効である（特願２００２−４７１３６）。
【００１２】
本発明の他の態様において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、発現構築を用いて標的細胞を感染させることによって生成されるＲＮＡ分子が、ミッドカインｍＲＮＡにハイブリダイズすることにより、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害し、そして、ミッドカインの合成を阻害するように選択される。
【００１３】
ｍＲＮＡ標的物を用いてこのオリゴヌクレオチドをハイブリッドすると、相応する遺伝子産物の発現を多重機構で阻害することができる。「翻訳停止」状態では、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が阻止される（Ｈａｅｕｐｔｌｅ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４．：１４２７，１９８６）。ホスホジエステルＤＮＡまたはホスホロチオエートＤＮＡオリゴヌクレオチドなどの場合では、標的となるＲＮＡ配列がそのＤＮＡオリゴマーにハイブリダイズするとすぐに、細胞内ＲＮａｓｅ Ｈがその標的ＲＮＡ配列を消化することができる（Ｗａｌｄｅｒ ＆ Ｗａｌｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：５０１１，１９８８）。「翻訳停止」状態におけるさらなる作用機構としては、ある種のオリゴヌクレオチドは、目的の遺伝子を含む二本鎖の標準的なゲノムＤＮＡとともに「トリップレクス」すなわち三重らせん構造を形成することが可能で、それによってＲＮＡポリメラーゼによる転写が妨げられることが明らかである（Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：１００１３，１９９３）。
【００１４】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドの他の一つの態様は、ミッドカイン遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡまたはこれをコードするＤＮＡである。ＲＮＡｉは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡ（以下ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約４０〜数百塩基対のｄｓＲＮＡが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、ｄｓＲＮＡを３’末端から約２１〜２３塩基対ずつ切り出し、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）を生じる。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体はｓｉＲＮＡと同じ配列を認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部で標的遺伝子のｍＲＮＡを切断する。また、この経路とは別にｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｓＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成される。このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となって、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅する経路も考えられている。ｓｉＲＮＡ法のオリゴヌクレオチド（ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｈａｒｐ Ｐ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，３，７３７−７４７）も本発明に適用可能である。
【００１５】
上記ＲＮＡｉは、当初、線虫において発見されたが（Ｆｉｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６−８１１，（１９９８））、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（Ｆｉｒｅ，Ａ．ＲＮＡ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１５，３５８−３６３（１９９９）、Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ２００１．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５，４８５−４９０（２００１）、Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．，Ｃａｕｄｙ，Ａ．Ａ．＆ Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２，１１０−１１１９（２００１）、Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ｌｉｓｔｅｎｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｏｕｎｄ ｏｆ ｓｉｌｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．８，７４６−７５０（２００１））。これら生物では、実際に外来よりｄｓＲＮＡを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックアウト個体を創生する方法としも利用されつつある。
【００１６】
ＲＮＡｉの登場当初はｄｓＲＮＡはある程度の長さ（４０塩基）以上でなければ効果がないと考えられていたが、米ロックフェラー大のＴｕｓｃｈｌらは２１塩基対前後の単鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞に導入すれば、哺乳動物細胞においてもＰＫＲによる抗ウイルス反応を起こさず、ＲＮＡｉの効果があることを報告し（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８（２００１））、ＲＮＡｉは分化したヒトなどの哺乳動物細胞に応用可能な技術として俄然注目を集めることになった。
【００１７】
ミッドカイン遺伝子の発現の抑制にＲＮＡｉを利用する場合においては、ｄｓＲＮＡとしてｓｉＲＮＡが使用されてもよい。「ｓｉＲＮＡ」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味し、Ｔｕｓｃｈｌら（前掲）により報告された全長２１〜２３塩基対に限定されるものではなく、毒性を示さない範囲の長さであれば特に限定はなく、例えば、１５〜４９塩基対と、好適には１５〜３５塩基対と、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。あるいは、発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的な二重鎖ＲＮＡ部分の長さが、例えば、１５〜４９塩基対、好適には１５〜３５塩基対、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。
【００１８】
本発明のＤＮＡとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドＲＮＡ（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ‘ｈａｉｒｐｉｎ’ ＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ））を作るようなコンストラクト（Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４０７：３１９，２０００、Ｗｅｓｌｅｙ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．２７：５８１，２００１、Ｐｉｃｃｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：Ｅ５５，２００１）を用いることもできる。
【００１９】
ＲＮＡｉに用いるＤＮＡは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上（例えば、９６，９７，９８，９９％以上）の配列の同一性を有する。塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ Ｓ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８〈１９９０〉；Ｋａｒｌｉｎ Ｓ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７〈１９９３〉）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〈１９９０〉）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００２０】
ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。また、マイクロＲＮＡまたはこれをコードするＤＮＡも、ミッドカイン遺伝子の発現の抑制に用いることが可能である。
【００２１】
また、ミッドカインの機能を抑制する化合物としては、ミッドカインに結合する抗体が挙げられる。
【００２２】
ミッドカインの作用を抑える抗ミッドカイン抗体は既に開発されているので、同様の手法で作成することができる（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，，１５９，３９２−４０２，１９９３）。また、ヒトミッドカインに対するモノクローナル抗体も作成されている（特開２００２−０８５０５８）。しかし、本発明の抗体はこれに限定されるものではない。抗ミッドカイン抗体についてより詳しく説明する。
【００２３】
本研究で使用される抗ミッドカイン抗体は、一般的には公知の手段を用いて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。モノクローナル抗体は、公知の方法に準じて作製することができる。例えばヒトミッドカインｃＤＮＡはクローニングされ、そのＤＮＡ配列とそれにコードされるアミノ酸配列が報告されている。モノクローナル抗体はミッドカイン（ミッドカイン）タンパク抗体全体に対しても、或いはその一部に対しても作製することができる。特に好ましいのは、可溶性型のヒトミッドカインタンパク抗原に対して作製された抗体である。また、本研究においては、抗原結合断片、例えば、Ｆ（ａｄ’）２やＦａｄ’断片を含む。
【００２４】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には、ケーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に準じて、以下のようにして作製できる。すなわち、ミッドカインタンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免役し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００２５】
例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるミッドカインタンパクは、ヒトミッドカインについては、特開平９−９５４５４に詑載のミッドカインアミノ酸配列を用いることによって得られる。
【００２６】
ミッドカインは、本発明で使用される抗体取得のための抗原として使用される限りそのアミノ酸残基数を問わない。ミッドカイン遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のミッドカインタンパクを公知の方法で精製し、この精製ミッドカインタンパクを感作抗原として用いればよい。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般には、齧歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
【００２７】
感作抗原を動物に免役するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳや生理食塩水等で適量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混含し、乳化後哺乳動物に１４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このようにして免役し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後、哺乳動物から免疫細胞を取り出し細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。
【００２８】
上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、公知の各々の細胞株、例えばＰ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３〉（Ｋｅａｒｎｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ，，１２３：１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８１：１−７，１９７８）、Ｎｓ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０，１９７８）、ＦＯ（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．＆ Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｄ．：Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５：１−２１，１９８０）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８：３１３−３２３，１９７８）、Ｒ２１０（Ｇａｌｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ，：Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１３１−１３３，１９７９）、等が好適である。
【００２９】
上記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は、基本的には、公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）等に準じて行うことができる。具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス等が使用され、さらに、融合効率を高めるため、ジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することができる。
【００３０】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補助液を併用することもできる。
【００３１】
細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を上記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば，平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を、通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的の融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して、上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００３２】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマスクリーニング及び単一クローニングが行われる。
【００３３】
また、本発明では、組み換え型抗体や改変抗体が使用できる。組み換え型抗体としては、例えば、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んでこれを宿主に導入し、遺伝子組み換え技術を用いて産生させた組み換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．＆ Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０）。改変抗体としては、例えばキメラ抗体、ヒト型化抗体が使用できる。キメラ抗体は、ヒト抗体以外の抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、産生させることにより得られる（ＥＰ １２５０２３，ＰＣＴ ＷＯ９６／０２５７６）。
【００３４】
本発明で使用される抗体は、ミッドカインに結合しミッドカインの活性を阻害するかぎり、抗体の断片や修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【００３５】
また、ミッドカインの活性を抑制する限り、抗体以外の化合物も、本発明における、開腹手術後の癒着を防止するために用いることができる。このような化合物は、被検化合物をミッドカインと接触させ、被検化合物の存在下におけるミッドカインの活性を測定し、被検化合物の非存在下と比較して、有意にミッドカインの活性を低下させるものを選択することにより、同定することができる。被検化合物としては、細胞抽出液、精製タンパク質、もしくはペプチド、人工的に合成された低分子化合物、などが挙げられるが、本発明は、これらに制限されない。被検化合物は、ミッドカイン受容体とミッドカインとの結合を阻害する化合物であってもよい。ミッドカインの種々の活性は公知である。例えば、好中球およびマクロファージの遊走については、文献（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２，３５９−３７１，２００２、Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５１，１３１２−１３１８ １９８８、Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５，４８９−４９５，２０００、Ｔａｋａｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，４５３−４５８，１９９７、Ｓａｔｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，３４６３−３４６９ ２００１）に開示されている。また、ミッドカインの活性を抑制する化合物の候補は、ミッドカインとの結合活性を指標に同定することができる。即ち、被検化合物をミッドカインと接触させ、被検化合物のミッドカインとの結合活性を測定し、有意な結合活性を示すものを選択することにより、ミッドカインの活性を抑制する化合物の候補を得ることができる。
【００３６】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物やミッドカインタンパク質の機能を抑制する化合物は、公知の製剤学的製造法によって、製剤化して投与することもできる。例えば、薬剤として一般的に用いられる適当な担体、または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油等）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム）、安定剤（例、糖、糖アルコール、アルブミン）、または保存剤（パラベン）、等と適宜組み合わせて、生体に効果的に投与するのに適した剤型にて生体に投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、野生型マウスとミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスでの作成創に対する大網の癒着面積の割合を［大網の癒着面積の割合（％）＝大網の癒着面積×１００／作成創の面積］で計算し、その平均値を示したグラフである。相関のない２群の有意差検定を行った。
【図２】図２はミッドカイン（−／−）マウスにおける腹腔内癒着の減少を示す写真（ａ−ｃ）および図（ｄ，ｅ）である。ａ、部分的肝切除後２週間で認められた腸の癒着。ＷＴ（ｎ＝１０）およびミッドカイン（−／−）（ｎ＝１０）マウスにおいて認められた代表的な例を示す。ｂ、ｃ、損傷した腹壁への網の癒着。矢印で示した領域は、手術によって剥離され、７日後に癒着を調べた。ＷＴ（ｂ）およびミッドカイン（−／−）マウス（ｃ）の代表的な例を示す。ｄ、ｅ、損傷した腹壁に対する網の癒着の減少の定量的推定。ｄ、ＷＴ（ｎ＝１０）およびミッドカイン（−／−）（ｎ＝１０）マウスにおける癒着領域を欠損領域に対する百分率として示す。ｅ、無処置のまま（ｎ＝１０）、またはミッドカイン（ｎ＝１０）もしくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｎ＝１０）を注入したＷＴおよびミッドカイン（−／−）マウスにおける癒着の発生率。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。統計学的有意性は、ｄではスチューデントｔ検定において、そしてｅではフィッシャーの直説法によって評価した。
【図３】図３は、網におけるミッドカインの局在を示す写真（ａ−ｃ）および図（ｄ）である。ａ、５日目での癒着領域の抗ミッドカイン染色。破線は癒着部位を示す。ＯＭ、網；ＰＷ、腹壁。バーは１００μｍである。ｂ、四角の領域を拡大した。ａｎｔｉ−ミッドカイン、抗ミッドカインによる染色；ａｎｔｉ−Ｍａｃ、抗単球−マクロファージマーカーによる染色。バー、１００μｍ。ｃ、抗マクロファージマーカーまたは抗ミッドカイン抗体による腹腔内マクロファージの染色。バー、５０μｍ。ｄ、網におけるミッドカインを同定するためのウェスタンブロット分析。レーン１、２、３および４は、０、３、５および７日目に採取した試料を示す。
【図４】図４は、ミッドカイン（−／−）マウスにおける炎症性白血球遊走の減少を示す写真（ａ）および図（ｂ−ｅ）である。ａ、創傷後異なる日の網からの切片の免疫組織化学染色。バー、５０μｍ。ｂ〜ｅ、網（ｂ、ｄ）および損傷した腹壁（ｃ、ｅ）に存在するマクロファージ数（ｂ、ｃ）、および好中球数（ｄ、ｅ）。黒い部分、ＷＴ；白い部分、ミッドカイン（−／−）。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。統計学的有意性はスチューデントｔ検定によって評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
［実施例１］ミッドカインの開腹手術後の癒着に与える影響
（１）ノックアウトマウスの調製
ミッドカイン（−／−）マウスは既に記述されている通りに作製した（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，３，８１１−８２２，１９９８）。ヘテロ接合体をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに９回戻し交配した。次に、それらを互いに交配させて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有するミッドカイン（−／−）マウスを得た。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは野生型対照として用いた。
（２）試験例１
１６週齢の野生型マウスとミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスにケタラールを１ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与し全身麻酔を施行後、清潔操作下に開腹し左側上腹部腹壁の腹腔内側に５×５ｍｍの腹膜欠損創を作成し、バイポーラで止血後ナイロン糸を用いて閉腹した。７日後に同様の処置によって開腹し、画像解析ソフトＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にて作成創に対する大網の癒着面積の割合（大綱の癒着面積×１００／作成創の面積）を測定した。
【００４０】
この値は野生型マウスでは３４．６％、ノックアウトマウスでは２．３３％であり、有意にノックアウトマウスで低かった（図１）。
（３）試験例２
４ヶ月齢の雌性マウスを用いた。マウスをペントバルビタールナトリウム（アボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ノースシカゴ、イリノイ州）（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔して、開腹した。１１番の手術用ナイフを用いて、左上腹部の内側に５×５ｍｍの擦過傷を作製した。両極性焼灼器によって止血した後、腹部を５−０ナイロン縫合糸によって閉じた。７日後、上記のようにペントバルビタールナトリウムの麻酔下で再度開腹して、網と注射部位の癒着領域をシオンイメージ画像分析ソフトウェアを用いて決定した（シオンコーポレーション（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、シティ、マサチューセッツ州）。ポンプ試験では、ヒトミッドカインの生理食塩液溶液（１ｍｇ／ｍｌ）またはヒト血清アルブミン（和光純薬、大阪、日本）の生理食塩液溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、浸透圧ポンプ（アルザコーポレーション（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、パロアルト、カリフォルニア州）を用いてミッドカイン（−／−）マウスに注入した。背部皮膚下に埋め込まれたポンプは、７日間にわたって全体で９０μｌを持続的に注入した。ヒトミッドカインは酵母において産生され、セルシグナルズインク（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｉｎｃ．）のＳａｋｕｍａ博士の好意により提供された。部分的肝切除の場合、マウスを用量４０ｍｇ／ｋｇ体重のペントバルビタールによって麻酔して、左右中葉および左側葉を外科的に切除した。癒着は２週間後に調べた。
【００４１】
その結果、部分的肝切除を行った際に、本発明者らは、腸の癒着がミッドカイン（−／−）マウスでは野生型（ＷＴ）マウスほど重度ではないことを発見した（図２ａ）。癒着は全てのＷＴマウスにおいて起こったが、ミッドカイン（−／−）マウスの約５０％は癒着を示さなかった。詳しい分析を行うため、本発明者らは網の癒着アッセイを開発した。ミッドカイン（−／−）またはＷＴマウスの腹壁に創傷を作製した。ＷＴマウスでは（図２ｂ）、損傷の７日後、網は腹壁に癒着したが、ミッドカイン（−／−）マウス（図２ｃ）では癒着は全くまたはほとんど起こらなかった。癒着した網の領域の平均値（図２ｄ）および癒着の発生率（図２ｅ）は、ミッドカイン（−／−）マウスではＷＴマウスより有意に低かった。ミッドカインを浸透圧ポンプによってミッドカイン（−／−）マウスに皮下投与すると、癒着は有意に元に戻った。ウシ血清アルブミンを投与しても作用を示さなかった（図２ｅ）。この知見は、ミッドカインの喪失が、ミッドカイン（−／−）マウスにおける癒着の減少に実際に関与していることを確認した。これらの全ての結果から、本発明者らは、ミッドカインが腹腔内癒着に根本的に関与しているという結論に達する。
［実施例２］癒着領域におけるミッドカインの発現
ミッドカインの発現は、既に記述されているように（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，，１５９，３９２−４０２，１９９３）、抽出物１．７ｍｇに由来するヘパリン結合タンパク質のウェスタンブロット分析によって決定した。抗マウスミッドカイン（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，，１５９，３９２−４０２，１９９３）は記述通りに産生した。アフィニティ精製ウサギ抗マウスミッドカインを第一抗体として、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）を二次抗体として用いる免疫組織化学分析（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，３，８１１−８２２，１９９８）によって、ミッドカイン発現部位が明らかとなった。染色は、ジアミノベンジジン四塩酸（アマシャムファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、東京、日本）によって可視化した。フルオレセインイソチオシアネート標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ州）も同様に第二抗体として用いた。マクロファージマーカーまたは好中球マーカーの染色は、同じように行った；切片はラット抗マウス単球−マクロファージマーカーＦ４／８０（セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ）、オックスフォード、イギリス）またはラット抗マウス好中球マーカー７／４（セロテック）に対するモノクローナル抗体によって染色した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ）と共にインキュベートした。倍率４００倍での視野における細胞数を計数した。全体で１２視野を調べて、平均値を得た。それぞれの遺伝子型［ＷＴまたはミッドカイン（−／−）］のマウス４匹をそれぞれの時点で調べて、平均値をＳＤと共に示す。マウスの腹腔内マクロファージは、既に記述されているとおりに単離した（Ｘｉｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，３６３７−３６４４，１９９４）。
【００４２】
ミッドカインは、胚の時期に主に発現され、成体組織では限定された部位に存在するに過ぎず、その発現はしばしば様々な損傷後に増加するが（Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５，４８９−４９５，２０００、Ｓａｔｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，３４６３−３４６９ ２００１、Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１０，６０７−６１６ １９９０、Ｍｉｔｓｉａｄｉｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１，３７−５１ １９９５、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８５，２５−３０ １９９５）、癒着の過程において、ミッドカインは網において主に発現された。免疫組織化学染色の例を図２ａに示す。ミッドカインは、マクロファージ様細胞および血管に主に存在した。ミッドカインがマクロファージによって発現されることは、抗ミッドカイン抗体および抗マクロファージマーカーとの同時染色によって確認されたのみならず（図３ｂ）、単離された腹腔マクロファージにおけるミッドカイン発現を調べること（図３ｃ）によっても確認された。ウェスタンブロット分析から、網からのミッドカインが単量体および二量体の双方で構成され、分子量は３０ｋＤａであることが判明した（図３ｄ）。
【００４３】
本発明者らは、癒着領域周辺の網におけるマクロファージの数が損傷後３日目および５日目でピークに達したことを認め、癒着の際にこれらの部位へ細胞が動員されることを示している（図４ａ）。一つのマクロファージ源は網における乳状斑である（Ｍａｎｄａｃｈｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｒｐｈｏｌ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．（Ｂｕｃｕｒ）３１，１３７−１４２ １９８５）。遊走はＷＴマウスではミッドカイン（−／−）マウスより顕著であった。定量的評価によってこれらの知見を確認した（図４ｂ）。網への好中球の遊走に関して、本発明者らは、同じ結論に達した（図４ｄ）。損傷した腹壁への白血球の遊走は、ＷＴおよびミッドカイン（−／−）マウスのあいだでごくわずかな差を認めた（図４ｃおよびｅ）。
【産業上の利用の可能性】
【００４４】
ミッドカインは、好中球およびマクロファージの遊走を直接、そしてまたケモカインの誘導によって間接的に促進する（Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５，４８９−４９５，２０００、Ｔａｋａｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，４５３−４５８，１９９７、Ｓａｔｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，３４６３−３４６９ ２００１）。ミッドカイン（−／−）マウスにおいて、虚血性損傷時の新生内膜形成（Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５，４８９−４９５，２０００）および腎炎（Ｓａｔｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，３４６３−３４６９ ２００１）は、野生型マウスと比較して、炎症性白血球動員の同時減少と共に有意に抑制される。本発明者らは、以下の一連の事象が癒着の場合に起こると考えている。損傷した腹壁は、網を活性化する因子を分泌して、白血球の浸潤を誘発する。炎症性白血球の網への動員は、血管に存在し、マクロファージによっても分泌されるミッドカインによって促進される。マクロファージ内のミッドカインも同様にその活性化に関与しうる。マクロファージが動員された後、それらによって分泌されたミッドカインは、白血球の動員をさらに加速するであろう。動員された白血球は、網の癒着活性を促進する因子を分泌する可能性がある。ミッドカインが同様に網を直接刺激する可能性は完全に排除することができない。本発明者らは、臓器間癒着において、腹腔内マクロファージが重大な役割を有すること、そしてミッドカインがマクロファージの遊走および／または活性化を促進することによってこの癒着において重要であると考える。この点において、網の乳状斑は、重要な腹腔内マクロファージ源であると考えられることを指摘すべきである。
【００４５】
腹腔内癒着の形成における重要な要因としてミッドカインが同定されたことは、プロセスの背後のメカニズムおよびその予防法に対して新たな洞察を与える。特に、ミッドカインの活性化またはその生合成を阻害する治療戦略は、予防において有用となるであろう。最近、腹腔内癒着を防止するために、腹腔に残って吸収される膜が導入されている（Ｂｅｃｋ，Ｄ．Ｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｓｕｐｐｌ．５７７，４９−５５ １９９７）。しかし、技法は、膜によって隔てられた臓器のみに適用され、腹腔内癒着を予防する他の有効な手段が緊急に必要である。そのような癒着を防止するために様々な実験が行われている（Ｖｒｉｊｌａｎｄ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２３５，１９３−１９９ ２００２、Ｇｉｍｂｅｌ．Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１３６，３１１−３１７ ２００１、Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１１０，２０７−２１０ ２００３、Ｎａｇｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１８０，５５８−５６３ １９９９）。ミッドカインは妊娠中期胚において主に発現され、成体組織におけるその発現は限定されている（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１０，６０７−６１６ １９９０、Ｍｉｔｓｉａｄｉｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１，３７−５１ １９９５）。その発現様式のために、ミッドカインは副作用がほとんどないという点において適した標的である。抗ミッドカイン抗体およびミッドカインアンチセンスオリゴＤＮＡは既に開発されており、腫瘍細胞のミッドカイン依存的増殖を阻害するために有効であることが判明している（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，，１５９，３９２−４０２，１９９３、Ｔａｋｅｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６１ ８４８６−８４９１，２００１）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分とする、開腹手術後の癒着を防止するための薬剤。
【請求項２】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物がオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
ミッドカインタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分とする、開腹手術後の癒着を防止するための薬剤。
【請求項４】
ミッドカインタンパク質の機能を抑制する化合物がミッドカインに結合する抗体である、請求項３に記載の薬剤。
【請求項１】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分とする、開腹手術後の癒着を防止するための薬剤。
【請求項２】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物がオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
ミッドカインタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分とする、開腹手術後の癒着を防止するための薬剤。
【請求項４】
ミッドカインタンパク質の機能を抑制する化合物がミッドカインに結合する抗体である、請求項３に記載の薬剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−６３６１２（Ｐ２０１１−６３６１２Ａ）
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５９６８４（Ｐ２０１０−２５９６８４）
【出願日】平成２２年１１月２２日（２０１０．１１．２２）
【分割の表示】特願２００５−５０３１４８（Ｐ２００５−５０３１４８）の分割
【原出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【出願人】（３０８０３３６２９）セルミド リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月２２日（２０１０．１１．２２）
【分割の表示】特願２００５−５０３１４８（Ｐ２００５−５０３１４８）の分割
【原出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【出願人】（３０８０３３６２９）セルミド リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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