説明

間葉系細胞を有効成分とする体内投与用脳神経疾患治療薬

ラット骨髄より骨髄細胞を採取し、ラット脳梗塞モデルへ静脈投与した結果、脳梗塞治療に有効であることが分かった。またヒトおよびマウス骨髄幹細胞も同様の効果を有することが分かった。骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞等の間葉系細胞は、脳神経疾患に対して静脈投与用の薬剤となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、間葉系細胞、特に骨髄細胞、臍帯血細胞、もしくは末梢血細胞、またはこれら細胞に由来する細胞を有効成分とする体内投与用脳神経疾患治療薬に関する。
【背景技術】
近年、再生医療が脚光を浴びている。再生医療においては、人体に備わっている自然の再生・治癒能力が及ばないような体の障害に対して、自己の細胞を人工的増殖により再生した器官等を障害部位に外科的に接合することによって、幅広い分野において障害部位の治癒を行なうことができるようになってきている。
稀突起膠細胞（オリゴデンドログリア：ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）（非特許文献１〜３参照）、またはシュワン細胞（非特許文献４、非特許文献２、非特許文献５参照）もしくはオルファクトリーエンシーシング細胞（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｅｎｓｈｅａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）（非特許文献６〜８参照）などの髄鞘形成細胞を移植すると、動物モデルにおいて再有髄化が誘発され、電気生理学機能を回復させることができる（非特許文献９および非特許文献５参照）。このような細胞を患者若しくは他人から調製して、細胞治療法に用いることも不可能ではないが、組織材料を脳または神経から採取しなければならないため問題が多い。
脳から得られる神経前駆細胞または幹細胞には、自己複製能力があり、さまざまな細胞系譜の神経細胞や膠細胞に分化することが知られている（非特許文献１０〜１３参照）。胎児組織から採取したヒト神経幹細胞を新生仔マウスの脳に移植すると、神経細胞と星状細胞に分化したり（非特許文献１４〜１６参照）、また再有髄化させることもできる（非特許文献１７参照）。脱髄化した齧歯類の脊髄に成人脳由来の神経前駆細胞を移植すると、再有髄化が行なわれて、インパルスの伝導を回復したことが報告されている（非特許文献１８参照）。
これらの研究は、上記細胞が、神経系疾患の修復術に利用できるかもしれないことを示唆しているため、大きな関心を引いている。（非特許文献１８、１４〜１６、１９参照）。
最近の研究によって、神経幹細胞が、インビボで造血細胞を発生させうることが明らかになり、神経前駆細胞は神経細胞系譜には限定されないことが示された（非特許文献２０参照）。さらに、骨髄間質細胞を新生仔マウスの側脳質に注入すると、ごくわずかではあるが星細胞のマーカーを発現する細胞へ分化したり（非特許文献２１参照）、または、適当な細胞培養条件下では、インビトロで神経細胞のマーカーを発現する細胞が極わずかに出現することが報告されているが、神経再生に有用かどうかは不明である（非特許文献２２参照）。
すでに本発明者らは、ヒト成人由来の神経系細胞（神経幹細胞、神経前駆細胞）を、脳より抽出・培養し、セルライン化し、その機能を検討し、当該神経系細胞には、自己複製機能と多分化機能が存在することを見出した（非特許文献１８参照）。すなわち、脳より得た神経細胞の前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を単一細胞展開（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）し、セルライン化したものをインビトロの系でクローン分析を行ったところ、自己複製能（すなわち、増殖能）と、多分化能［すなわち、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、膠星状細胞（アストログリア；ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）、稀突起膠細胞（オリゴデンドログリア；ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）への分化］が認められたことから、この細胞には神経幹細胞の性質があることが確認された。
また、自己の大脳より少量の神経組織を採取して、神経幹細胞を抽出・培養し、得られた神経幹細胞を、自己の脳や脊髄の損傷部位に移植することは、自家移植療法として、極めて応用性の高い治療法となるものと考えられる。しかしながら、大脳より神経幹細胞を含んだ組織を採取することは、採取にあたって神経脱落症状が発生しないとはいえ、容易なことではない。したがって、より安全で、かつ簡便な自家移植療法を確立することは、今日の複雑な各種疾患に対する治療法の確立という点から、極めて重要なことである。これに対し、本発明者らは、ドナー細胞の獲得のために、神経幹細胞の採取技術より容易である、骨髄細胞、臍帯血細胞、または胎児肝細胞より単核細胞分画等を採取する技術を開発した（特許文献１参照）。すなわち、骨髄細胞より調製した単核細胞分画が神経系細胞への分化能を有するものであることを示した。さらに、該単核細胞分画から分離した中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を含む細胞分画、間質細胞を含む細胞分画、およびＡＣ１３３陽性細胞を含む細胞分画が神経系細胞への分化能を有することを示した。
脳神経疾患に対しては、上記神経系細胞へ分化能を有する細胞を直接、脳患部へ投与する治療方法が考えられるが、非常に複雑かつ、危険性を伴う方法と言える。脳神経疾患に対する、簡便かつ、安全性の高い治療手段、治療薬の開発が望まれていた。
【特許文献１】ＷＯ０２／００８４９
【非特許文献１】Ａｒｃｈｅｒ ＤＲ，ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １２５：２６８−７７．
【非特許文献２】Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ ＷＦ，Ｃｒａｎｇ ＡＪ．１９８８．Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １０：１−１１．
【非特許文献３】Ｇｕｍｐｅｌ Ｍ，ｅｔ ａｌ．１９８７．Ａｎｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ４９５：７１−８５．
【非特許文献４】Ｂｌａｋｅｍｏｒｅ ＷＦ．１９７７．Ｎａｔｕｒｅ ２６６：６８−９．
【非特許文献５】Ｈｏｎｍｏｕ Ｏ，ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １６：３１９９−２０８．
【非特許文献６】Ｆｒａｎｋｌｉｎ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｇｌｉａ １７：２１７−２４．
【非特許文献７】Ｉｍａｉｚｕｍｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １８（１６）：６１７６−６１８５．
【非特許文献８】Ｋａｔｏ Ｔ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｇｌｉａ ３０：２０９−２１８．
【非特許文献９】Ｕｔｚｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：５３−７．
【非特許文献１０】Ｇａｇｅ ＦＨ，ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１１８７９−８３．
【非特許文献１１】Ｌｏｉｓ Ｃ，Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ Ａ．１９９３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：２０７４−７．
【非特許文献１２】Ｍｏｒｓｈｅａｄ ＣＭ，ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｎｅｕｒｏｎ １３：１０７１−８２．
【非特許文献１３】Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＢＡ，Ｗｅｉｓｓ Ｓ．１９９２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１７０７−１０．
【非特許文献１４】Ｃｈａｌｍｅｒｓ−Ｒｅｄｍａｎ ＲＭ，ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ７６：１１２１−８．
【非特許文献１５】Ｍｏｙｅｒ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ ２９：２０４０−１．
【非特許文献１６】Ｓｖｅｎｄｓｅｎ ＣＮ，ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １４８：１３５−４６．
【非特許文献１７】Ｆｌａｘ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：１０３３−９．
【非特許文献１８】Ａｋｉｙａｍａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．
【非特許文献１９】Ｙａｎｄａｖａ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：７０２９−３４．
【非特許文献２０】Ｂｊｏｒｎｓｏｎ ＣＲ，ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：５３４−７．
【非特許文献２１】Ｋｏｐｅｎ ＧＣ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：１０７１１−６．
【非特許文献２２】Ｗｏｏｄｂｕｒｙ Ｄ，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ６１：３６４−７０．
【発明の開示】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、脳神経疾患に対する、安全性の高い治療手段、治療薬の提供を目的とする。より詳しくは、間葉系細胞、特に、骨髄細胞、臍帯血細胞、もしくは末梢血細胞、またはこれら細胞由来の細胞を有効成分として含む、脳神経疾患治療のための体内投与、特に静脈投与用薬剤を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。まず本発明者らは、マウスの骨髄より骨髄細胞を採取して、単核細胞分画だけを分離し、これをドナー細胞としてラット脳梗塞モデルへ静脈投与し、脳神経疾患に対する治療効果を検討した。その結果、驚くべきことに骨髄細胞を局所投与すること以外に、静脈投与することによっても、脳神経疾患（脳梗塞、脊髄損傷、脱髄疾患）に対して治療効果を有することを見出した。
さらに、骨髄幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、間葉系幹細胞）も同様に上記モデル動物へ静脈投与し、脳神経疾患に対する治療効果を検討した結果、骨髄幹細胞の静脈投与が脳神経疾患治療に非常に有効であることを見出した。
さらに、自家骨髄細胞もしくは間葉系幹細胞の静脈投与もしくは局所投与も、脳神経疾患治療に有効であることを見出した。自家移植は、他家移植や異種移植と比較して、免疫抑制剤を使用せずにすみ、治療効果の面からも非常に有利である。
上記の如く、本発明者らは間葉系細胞（間葉系幹細胞）、特に骨髄細胞もしくは間葉系幹細胞の静脈投与による脳神経疾患治療効果を見出し、本発明を完成させた。本発明者らは、後述の実施例で示すように、本発明の間葉系細胞の静脈投与による脳神経疾患治療効果を、医学的あるいは生物学的な種々の実験によって詳細に解析を行い、上記知見を実証するに至った。
即ち、間葉系細胞（間葉系幹細胞）、特に骨髄細胞自体は、脳神経疾患治療のための静脈投与用薬剤となるものと考えられる。
また、上記治療効果は、骨髄細胞もしくは間葉系幹細胞による神経保護効果と神経再生効果の相乗効果であるものと考察される。従って、骨髄細胞もしくは間葉系幹細胞は、静脈投与用脳神経保護剤、または脳神経再生剤となるものと期待される。
本発明は間葉系細胞、特に骨髄細胞、臍帯血細胞、もしくは末梢血細胞、またはこれら細胞に由来する細胞を有効成分として含む、脳神経疾患治療のための体内投与、特に静脈投与用薬剤に関する。さらに本発明は、上記間葉系細胞を有効成分として含む脳神経保護効果あるいは脳神経再生効果を有する体内投与用薬剤、並びに、上記薬剤の用途に関し、より具体的には、
〔１〕 間葉系細胞を有効成分として含む、脳神経疾患治療のための体内投与用薬剤、
〔２〕 脳神経疾患が脳梗塞である、〔１〕に記載の薬剤、
〔３〕 間葉系細胞を有効成分として含む、脳神経保護効果を有する体内投与用薬剤（体内投与用脳神経保護剤）、
〔４〕 間葉系細胞を有効成分として含む、脳神経再生効果を有する体内投与用薬剤（体内投与用脳神経再生剤）、
〔５〕 体内投与が静脈内投与である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の薬剤、
〔６〕 間葉系細胞が、
（ａ）ＢＤＮＦ遺伝子、ＰＬＧＦ遺伝子、ＧＤＮＦ遺伝子、もしくはＩＬ−２遺伝子が導入された間葉系細胞、または
（ｂ）ｈＴＥＲＴ遺伝子が導入され不死化した間葉系細胞、
である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の薬剤、
〔７〕 間葉系細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の薬剤、
〔８〕 間葉系細胞が骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血細胞である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の薬剤、
〔９〕 患者へ治療上有効量の〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の薬剤を体内投与することを含む、脳神経疾患の治療方法、
〔１０〕 骨髄細胞が患者の自家細胞である、〔９〕に記載の治療方法、
〔１１〕 脳神経疾患が脳梗塞である、〔９〕または〔１０〕に記載の治療方法、
〔１２〕 体内投与が静脈内投与である、〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載の治療方法、
〔１３〕 間葉系細胞が骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血細胞である、〔９〕〜〔１２〕のいずれかに記載の治療方法、を提供するものである。
本発明は、間葉系細胞（例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、間葉系幹細胞、またはこれら細胞に由来する細胞）を有効成分として含む、脳神経疾患治療のための体内投与用薬剤を提供する。
本発明における「体内投与」とは、通常、頭部（脳）以外の部位への投与を意味する。例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等を挙げることができるが、最も好ましくは、静脈内投与である。
本発明における間葉系細胞とは、好ましくは骨髄細胞（骨髄細胞の単画球分画成分；ＭＣＦ（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｒａ ｃｅｌｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ））、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ））、またはこれら細胞に由来する細胞等を指す。また、本発明の間葉系細胞には、例えば、間葉系に関連する細胞、中胚葉幹細胞等が含まれる。尚、本発明において「間葉系細胞」として記述された細胞が、将来的に間葉系細胞以外の細胞として分類される場合であっても、本発明においては当該細胞を好適に利用することができる。
骨髄中には幹細胞として、造血幹細胞と「間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）」とがある。ここで「幹細胞」とは、一般に、生体を構成する細胞の生理的な増殖・分化などの過程において、自己増殖能と、特定の機能を持つ細胞に分化する能力とをあわせ有する未分化細胞のことである。造血幹細胞は、赤血球、白血球、あるいは血小板に分化する幹細胞である。間葉系幹細胞は、神経幹細胞を経て神経に分化する場合、神経幹細胞を経ないで直接的に神経に分化する場合、ストローマ細胞を経て神経に分化する場合（ただし効率は悪い）、内臓に分化する場合、血管系に分化する場合、又は骨、軟骨、脂肪、あるいは筋肉に分化する場合があることが知られている。
本発明では、主として間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を利用するが、造血幹細胞や、体内の他の幹細胞（前駆細胞）を利用できる可能性があることにも言及しておく。間葉系幹細胞は骨髄から採取された骨髄細胞から分離して得られる。なお、間葉系幹細胞を分離していない骨髄細胞も、有効性は若干劣るものの、間葉系幹細胞と同じように治療に用いることができる。
また、間葉系幹細胞のような細胞が、末梢血中から調製できる可能性も考えられる。実際、本発明者らは、末梢血のなかに混じっている細胞から培養してきた細胞を、神経幹細胞や神経系細胞（神経細胞、グリア細胞）のマーカーを出現する細胞へ誘導できることに成功した。その際、末梢血に由来する細胞から神経系細胞への誘導には、必ずしも、Ｇ−ＣＳＦあるいはＳＣＦを使用しなくともよい。即ち、本発明者らは既に、骨髄液または臍帯血から分離される単核細胞分画から調製した中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）、またはＥＳ細胞を、基礎的培養液で培養すると、該中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）または該ＥＳ細胞が神経幹細胞、神経細胞またはグリア細胞へ分化誘導することを見出した。従って、末梢血中の細胞を培養することにより、間葉系幹細胞と同等の機能を有する細胞を調製し、本発明に利用することも可能である。なお、上記「基礎的培養液」とは、細胞培養に使用される通常の培養液であれば特に制限はないが、好ましくは、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）またはＮＰＢＭ（Ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）である。上記基礎的培養液のその他の成分としては、特に制限はないが、好ましくは、Ｆ−１２、ＦＣＳ、Ｎｅｕｒａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）等が挙げられる。これらの培養液中の濃度としては、例えば、Ｆ−１２は５０％、ＦＣＳは１％である。また、培養液におけるＣＯ２濃度は好ましくは５％であるが、特に制限されない。
本発明において、中胚葉幹細胞とは、発生学的に中胚葉と分類される組織を構成している細胞を指し、血液細胞も含まれる。また、中胚葉幹細胞とは、自己と同じ能力を持った細胞をコピー（分裂、増殖）することができ、中胚葉の組織を構成している全ての細胞へ分化し得る能力を持った細胞を指す。中胚葉幹細胞は、例えば、ＳＨ２（＋），ＳＨ３（＋），ＳＨ４（＋），ＣＤ２９（＋），ＣＤ４４（＋），ＣＤ１４（−），ＣＤ３４（−），ＣＤ４５（−）の特徴を有する細胞であるが、これらマーカーに特に制限されない。また所謂、間葉系に関連する幹細胞も、本発明の中胚葉幹細胞に含まれる。
上記の間葉系に関連する細胞とは、間葉系幹細胞、間葉系細胞、間葉系細胞の前駆細胞、間葉系細胞から由来する細胞のことを意味する。
間葉系幹細胞とは、例えば、骨髄、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、血液、臍帯血、更には、種々の組織の初期培養物から得ることができる幹細胞のことである。また末梢血中の細胞を培養して得ることができる間葉系幹細胞と同等の機能を有する細胞も本発明の間葉系幹細胞に含まれる。
本発明において好ましい間葉系細胞としては、骨髄細胞、骨髄幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を好適に示すことができる。その他、本発明の細胞の好ましい例として、臍帯血細胞、末梢血細胞、胎児肝細胞等を挙げることができる。
本発明における骨髄細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、胎児肝細胞の好ましい態様としては、骨髄、臍帯血、末梢血、または胎児肝より分離して得た細胞の一分画であって、神経系細胞へ分化し得る細胞を含む細胞分画を挙げることができる。
他の一つの態様において、該細胞分画は、ＳＨ２（＋）、ＳＨ３（＋）、ＳＨ４（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ１４（−）、ＣＤ３４（−）、ＣＤ４５（−）の特徴を有する中胚葉幹細胞を含む細胞分画である。
本発明において、上記以外の細胞分画の例としては、Ｌｉｎ（−）、Ｓｃａ−１（＋）、ＣＤ１０（＋）、ＣＤ１１Ｄ（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ４５（＋）、ＣＤ７１（＋）、ＣＤ９０（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤＷ１２３（＋）、ＣＤ１２７（＋）、ＣＤ１６４（＋）、フィブロネクチン（＋）、ＡＬＰＨ（＋）、コラーゲナーゼ−１（＋）の特徴を有する間質細胞を含む細胞分画、あるいはＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を含む細胞分画を挙げることができる。
また、本発明においては、上記細胞分画に含まれる細胞は、神経系細胞へ分化し得る細胞であることが好ましい。
本発明における細胞分画には、骨髄細胞より分離して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化しうることを特徴とする細胞が含まれる。その他の態様として、例えば臍帯血細胞、末梢血細胞、または胎児肝細胞より分離して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化しうることを特徴とする細胞が含まれる。その他の態様として、末梢血中に放出させられた骨髄中の間葉系幹細胞であって、神経系細胞へ分化しうることを特徴とする細胞が含まれる。末梢血中へ間葉系幹細胞が放出される際には、例えば活性物質や薬剤を用いてもよいが、これら物質を用いない場合であってもよい。なお、骨髄より採取した間葉系幹細胞と、末梢血由来の間葉系幹細胞とでは、神経幹細胞や神経細胞のマーカーを出すという共通の性質を有するものの、一部異なった面、例えば、増殖率や、分化誘導率等について相違が見られる。本発明の間葉系幹細胞は、必ずしも、骨髄より採取した間葉系幹細胞に限定されず、末梢血由来の間葉系幹細胞であってもよい。即ち、本発明の間葉系幹細胞には、これらの両者が含まれる。（なお、本発明においては、末梢血由来の間葉系幹細胞についても、単に「間葉系幹細胞」と記載する場合あり）
本発明の細胞分画に含まれる細胞の神経系細胞への分化は、いわゆる血液系細胞の神経系細胞への形質転換により生じるのか、それとも骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞などの中に存在する神経細胞に分化できる未熟な細胞の分化によるものであるかは明確ではないが、神経系細胞へ分化する細胞は、主として、幹細胞、即ち、自己増殖能と多分化能を有する細胞であると考えられる。また、神経系細胞へ分化する細胞は、ある程度他の胚葉へ分化している幹細胞でありうる。
本発明の細胞分画に含まれる細胞は、栄養因子によって増殖することは要せず（栄養因子によって増殖することは可能である）、神経自己移植技術の開発という点では簡便で、かつ現実性の高いものであり、その医療産業上の有益性は多大なものであるといえる。本発明における骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞（細胞分画）は、一般的には、脊椎動物に由来する。好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ヒトなど）由来であるが、特に制限されない。
本発明における細胞分画は、例えば、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、２０００回転で比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、好ましくは１．０７ｇ／ｍｌから１．０８ｇ／ｍｌの範囲（例えば、１．０７７ｇ／ｍｌ）である。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるが、これらに制限されない。また、脊椎動物から採取した臍帯血細胞を上記と同様に調製し、細胞分画として利用することもできる。
具体例を示せば、まず、脊椎動物より採取した骨髄液（５−１０μｌ）を溶液（ＩＬ−１５を２ｍｌ＋Ｆｉｃｏｌを３ｍｌ）に混合し、遠心（２０００回転で１５分間）し、単核細胞分画（約１ｍｌ）を抽出する。この単核細胞分画を細胞の洗浄のために培養溶液（ＮＰＢＭ ２ｍｌ）に混合して、再度、遠心（２０００回転で１５分間）する。次いで、上澄みを除去した後、沈降した細胞を回収する。本発明の細胞分画の採取源としては、大腿骨以外にも、胸骨や、骨盤を形成している腸骨から採取することもできる。これらの骨以外でも大きい骨であれば採取可能である。また、骨髄バンクに保存してある骨髄液や臍帯血から採取することも可能である。臍帯血細胞を利用する場合には、骨髄バンクに保存してある臍帯血から採取することも可能である。
本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞より単離・精製して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化しうる中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を含む細胞分画である。中胚葉幹細胞を含む細胞分画は、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記ＳＨ２等の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。
また、神経系細胞へ分化しうる中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を含む細胞分画は、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、９００ｇで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、細胞の由来する動物の種類（例えば、ヒト、ラット、マウス）により変動しうる。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるが、これらに制限されない。
具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した骨髄液（２５ｍｌ）または臍帯血を同量のＰＢＳ溶液に混合し、遠心（９００ｇで１０分間）し、沈降細胞をＰＢＳに混合して回収（細胞密度は４×１０７細胞／ｍｌ程度）することにより、血液成分を除去する。その後、そのうち５ｍｌをＰｅｒｃｏｌ液（１．０７３ｇ／ｍｌ）と混合し、遠心（９００ｇで３０分間）し、単核細胞分画を抽出する。細胞の洗浄のために、抽出した単核細胞分画を培養溶液（ＤＭＥＭ，１０％ ＦＢＳ，１％ ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に混合し、遠心（２０００回転で１５分間）する。次いで、遠心後の上澄みを除去し、沈降した細胞を回収し、培養する（３７℃、５％ ＣＯ２ ｉｎ ａｉｒ）。
本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞より分離して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化しうる間質細胞を含む細胞分画である。間質細胞は、例えば、Ｌｉｎ（−）、Ｓｃａ−１（＋）、ＣＤ１０（＋）、ＣＤ１１Ｄ（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ４５（＋）、ＣＤ７１（＋）、ＣＤ９０（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤＷ１２３（＋）、ＣＤ１２７（＋）、ＣＤ１６４（＋）、フィブロネクチン（＋）、ＡＬＰＨ（＋）、コラーゲナーゼ−１（＋）の特徴を有する細胞である。間質細胞を含む細胞分画は、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記Ｌｉｎ等の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。
また、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、８００ｇで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、好ましくは１．０７ｇ／ｍｌから１．０８ｇ／ｍｌの範囲（例えば、１．０７７ｇ／ｍｌ）である。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるがこれらに制限されない。
具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した骨髄液または臍帯血を同量の溶液（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ＋０．６％クエン酸ナトリウム＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）溶液に混合し、そのうちの５ｍｌをＦｉｃｏｌ＋Ｐａｑｕｅ液（１．０７７ｇ／ｍｌ）と混合し、遠心（８００ｇで２０分間）し、単核細胞分画を抽出する。この単核細胞分画を細胞の洗浄のために培養溶液（Ａｌｆａ ＭＥＭ，１２．５％ ＦＢＳ，１２．５％ ウマ血清，０．２％ ｉ−イノシトール，２０ｍＭ 葉酸，０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール，２ｍＭ Ｌ−グルタミン，１μＭ ヒドロコルチゾン，１％ ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に混合し、遠心（２０００回転、１５分間）する。次いで、遠心後の上澄みを除去した後、沈降した細胞を回収し、培養する（３７℃、５％ ＣＯ２ ｉｎ ａｉｒ）。
本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、または胎児肝細胞より分離して得た単核細胞分画であって、神経系細胞へ分化しうるＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を含む細胞分画である。この細胞分画は、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記ＡＣ１３３（＋）の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。
また、その他の態様として、脊椎動物から採取した胎児肝細胞を、２０００回転で比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる細胞分画を回収し、この細胞分画から、ＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるがこれらに制限されない。
具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した肝臓組織をＬ−１５溶液内で洗浄し、酵素処理（Ｌ−１５＋０．０１％ＤｎａｓｅＩ，０．２５％トリプシン，０．１％コラーゲナーゼを含む溶液中で、３７度で３０分間）し、ピペッティングにより単一細胞にする。この単一細胞となった胎児肝細胞から、実施例１（１）において大腿骨から単核細胞分画を調製したのと同様に、遠心分離を行なう。これにより得られた細胞を洗浄し、洗浄後の細胞からＡＣ１３３抗体を利用してＡＣ１３３（＋）細胞を回収する。これにより胎児肝細胞から神経系細胞へ分化しうる細胞を調製することができる。抗体を利用したＡＣ１３３（＋）細胞の回収は、マグネットビーズを利用して、または、セルソーター（ＦＡＣＳなど）を利用して行なうことができる。
これら中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）、間質細胞、あるいはＡＣ１３３陽性細胞を含む細胞分画は、脊髄脱髄領域への移植後に、効率よく再有髄化する。特に、上記中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を含む細胞分画は、脳梗塞モデルへの移植に用いても、良好に生着し、神経系細胞あるいはグリア細胞に分化することができる。
また、上記細胞分画に含まれる神経系細胞に分化し得る細胞として、例えば、上記細胞分画に含まれる神経幹細胞、中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）、および間質細胞、ＡＣ１３３陽性細胞が含まれるが、神経系細胞に分化し得る限り、これらに制限されない。
また、本発明における脳神経系疾患の治療ための体内投与用薬剤の有効成分としては、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞だけでなく、上記細胞分画も含まれる。本発明の間葉系細胞、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞はそのまま投与に用いることも可能であるが、投与による治療効率を向上させるために、種々の薬剤を添加した薬剤（組成物）として、または、治療効果を上昇させる機能を有する遺伝子を導入した細胞として投与することも考えられる。本発明の薬剤または遺伝子導入細胞の調製においては、例えば、
（１）細胞分画に含まれる細胞の増殖率を向上させるまたは神経系細胞への分化を促進する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、
（２）細胞分画に含まれる細胞の損傷神経組織内での生存率を向上させる物質の添加、あるいはこのような効果（例えば、ラジカルの抑制等）を有する遺伝子の導入、
（３）細胞分画に含まれる細胞が、損傷神経組織から受ける悪影響を阻止する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、
（４）ドナー細胞の寿命を延長させる物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子（例えば、ｈＴＥＲＴ遺伝子等）の導入、
（５）細胞周期を調節する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、
（６）免疫反応の抑制を目的とした物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、
（７）エネルギー代謝を活発にする物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、
（８）ドナー細胞のホスト組織内での遊走能を向上させる物質、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、
（９）血流を向上させる物質、あるいはこのような効果を有する遺伝子（例えばＶＥＧＦ，Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＰＧＦ等）の導入（血管新生誘導も含む）、
（１０）神経保護作用を有する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子（例えばＢＤＮＦ，ＧＤＮＦ，ＮＴ，ＮＧＦ，ＦＧＦ，ＥＧＦ，ＰＦＧ等）の導入、
（１１）アポトーシス抑制効果を有する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子の導入、
（１２）抗腫瘍効果を有する物質の添加、あるいはこのような効果を有する遺伝子（例えばＩＬ−２，ＩＦ−β等）の導入、
を行うことが考えられるが、これらに制限されるものではない。
本発明者らは、後述の実施例で示すように間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に神経栄養因子であるＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）遺伝子を導入した細胞が、ラット脳梗塞モデルにおいて治療効果があることを実証した。さらに本発明者らは、該ＢＤＮＦ遺伝子を導入したＭＳＣを、静脈内に移植した場合に、脳梗塞に対して治療効果を有することを確認した。同様に、ＰＬＧＦ（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）遺伝子をＭＳＣへ導入した細胞を静脈内移植した場合にも、脳梗塞に対して治療効果を有することを確認した。
また、ＢＤＮＦ遺伝子以外の遺伝子、例えば、ＧＤＮＦ（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ），ＣＮＴＦ（ｃｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ＮＴ３（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３）遺伝子をＭＳＣに導入した細胞についても、脳梗塞に対して治療効果を有することを見出した。さらに、間葉系幹細胞にＩＬ−２遺伝子を導入した細胞が、ラット脳腫瘍モデルで治療効果を有することを実証した。従って、本発明の間葉系細胞の好ましい態様としては、ＢＤＮＦ遺伝子、ＰＬＧＦ遺伝子、ＧＤＮＦ遺伝子、またはＩＬ−２遺伝子が導入された間葉系細胞である。即ち、外来のＢＤＮＦ遺伝子、ＰＬＧＦ遺伝子、ＧＤＮＦ遺伝子、またはＩＬ−２遺伝子を発現可能な状態で保有する間葉系細胞を、本発明の間葉系細胞として、好適に使用することができる。
また、上記以外の遺伝子、例えば、ＣＮＴＦ、ＮＴ３の各遺伝子が導入された間葉系幹細胞についても、本発明の間葉系細胞の具体例として、好適に示すことができる。（なお、本明細書において、○○遺伝子が導入された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、「ＭＳＣ−○○」と記載する場合あり）
また、脳梗塞は血管が閉塞する病状を呈することから、脳梗塞の治療の際には、本発明の間葉系細胞を、血管新生を司る因子（遺伝子）と組み合わせることで著明な治療効果が期待できる。本発明者らは、後述の実施例で示すように、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ遺伝子を、脳梗塞巣に直接注入することにより、著明な血管新生効果が発揮されることを見出した。即ち、血管新生に関与する遺伝子、例えば、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ遺伝子が導入されたＭＳＣは、特に、脳梗塞に対して治療効果を有することが期待される。
所望の遺伝子を発現可能な状態で導入させた間葉系細胞は、当業者においては、公知の技術を用いて、適宜作製することが可能である。
本発明において、骨髄液の採取は、例えば、採取源となる脊椎動物（ヒトを含む）を麻酔し（局所または全身麻酔）、骨に針を刺し、シリンジで吸引することにより行なうことができる。該骨としては、例えば大腿骨、胸骨、骨盤を形成している腸骨等が挙げられるが、これらに限定されない。また、出生時に臍帯に直接針を刺し、注射器で吸引して、臍帯血を採取保存しておくことは確立された技術となっている。一回の骨髄細胞の採取は被験者に局所麻酔を施した上で行い、その量は数ｍｌ程度が適切である。但しこの量は、下記のＢとＣの場合に適用されるが、Ａの場合には適用されない。
以下に骨髄採取の一例を示すが、必ずしもこれに制限されない。
（Ａ）骨髄細胞を生移植する場合
例えばヒトから採取する場合は、麻酔医による全身麻酔の安全性に関し十分な検討を行った上で、全身麻酔下にて患者（腸骨等）より骨髄液採取を行う。採取する目標細胞数は、単核球数で３ｘ１０９個以上とする。おおよそ、２００ｍｌから４００ｍｌの骨髄液で目標細胞数が得られると推定している。なお、骨髄採取上限量の算定は、患者の負担を考慮し、骨髄採取上限量は骨髄採取直前の血色素量（Ｈｂ値）および患者の体重により算出する。ただし、高齢者で以下に定められた必要骨髄液採取が困難な場合には、骨髄液採取の担当医師の判断により、最大限の採取を行うこととする。
骨髄採取直前のＨｂ値による採取上限量：
（１）１２．５ｇ／ｄｌ未満の場合、患者体重１ｋｇ当たり、１２ｍｌ／ｋｇ以下の採取
（２）１３．０ｇ／ｄｌ未満の場合、患者体重１ｋｇ当たり、１５ｍｌ／ｋｇ以下の採取
（３）１３．５ｇ／ｄｌ未満の場合、患者体重１ｋｇ当たり、１８ｍｌ／ｋｇ以下の採取
（４）１３．５ｇ／ｄｌ以上の場合、患者体重１ｋｇ当たり、２０ｍｌ／ｋｇ以下の採取
また、末梢血球減少（白血球数＜２，０００／ｍｌ，好中球数＜１，０００／ｍｌ，血色素量＜１１．０ｇ／ｄｌ，血小板数＜１０万／ｍｌ）を認める患者および出血傾向のある患者は、骨髄液採取は行なわない。
さらに、抗凝固剤、抗血小板剤を使用している患者からの骨髄採取に関しては、骨髄採取、全身麻酔前に、出血時間とＡＣＴを含む、緊急検査可能な止血凝固検査（ＦＤＰ、フィブリノーゲン、ＡＴＩＩＩ）を行い、慎重に検討する。
（１）抗血小板剤（パナルジン、バファリン、バイアスピリンなど）を使用している患者の場合
中止後７日間以上経過しないと血小板機能は回復しないため、急性期の骨髄採取は採取出血の原因となりうる。従って、慎重に骨髄採取を施行する。出血時間が１０分間を越える時には骨髄採取を施行しない。
（２）抗凝固剤（ワーファリンなど）を使用している患者の場合
ビタミンＫ（Ｋ１またはＫ２）の静注によりＡＣＴが正常化した上で、骨髄採取を行う。
骨髄細胞の静脈内投与は、例えば、骨髄細胞（３ｘ１０９個以上）を、同量の希釈液（抗生剤非添加ＲＰＭＩ １６４０）に混注し、静脈内注射する。全体量は、約４００〜２０００ｃｃ程度と予想される。可及的速やかに投与を行なうが、この間の凝固を防止するために、通常、ヘパリンを混注する。
一例を示せば、採取された骨髄細胞液２５０ｃｃ毎に、ヘパリン２５００単位と、同量の希釈液とを合わせ５００ｃｃとし、その場でフィルターを通過させ、静脈投与が可能な状態とし、その場で、すぐに患者へ静脈投与を開始する。この間も骨髄細胞液採取を続ける。この操作を２−６回行い、所定の骨髄細胞液の投与を行う。これにより投与されるヘパリンの量は、約５，０００から１５，０００単位であり、すでに脳梗塞急性期におけるエビデンスが得られている安全有効な量とほぼ同等となる。ただ、この間、骨髄採取が続けられることを考慮し、ＡＣＴの測定を行い、必要があれば、プロタミンで中和するなどの処置を講ずる。採取に必要な時間はほぼ２時間程度であろうと考えられる。静脈内へ投与される骨髄液（希釈液を含む）の量は、全体で、２０００ｃｃ程度である。従って、中心静脈圧などの右心負荷を十分にモニターしながら、３−４時間で静脈内投与を終了する。（注：静脈内に投与される骨髄液（希釈液を含む）は約２０００ｍｌ、採取骨髄液は約１０００ｍｌ、従って、実際に人体へ負荷する液量は１０００ｍｌ／３−４時間であり、通常の脳梗塞治療時におけるボリューム負荷を考慮すると、決して多い量ではない。）
患者は、必ずしも制限されるものではないが、以下の条件で選択されることが好ましい。
１、年齢：２０歳以上７０歳以下
２、発症後２４時間以内の患者
３、ＭＲＩ拡散強調画像法にて、天幕上の大脳皮質、穿通枝領域あるいはその両方に異常を認める患者
４、ＮＩＮＤＳＩＩＩの分類におけるアテローム血栓性脳梗塞、ラクナー梗塞、心原性脳塞栓症のいずれのカテゴリーでもかまわない
５、今回の発作で、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒａｎｋｉｎ Ｓｃａｌｅが、３以上となった患者
６、意識障害がＪａｐａｎ Ｃｏｍａ Ｓｃａｌｅにおいて、０から１００の患者
さらに以下の条件を満たす患者は除外されることが好ましい。
１、症状が改善してほぼ無症候あるいはＴＩＡと診断された患者
２、ＣＴまたはＭＲＩから頭蓋内出血など閉塞性脳血管障害以外が責任病巣と診断された患者
３、心原性塞栓で、すでにＣＴ上、出血性変化が出現している患者
４、意識障害が強く、Ｊａｐａｎ Ｃｏｍａ Ｓｃａｌｅにおいて、２００以上の昏睡患者
５、妊婦あるいは妊娠している可能性のある患者
６、重篤な腎疾患、肝疾患、消化器疾患を有する患者
７、悪性腫瘍を合併する患者
８、重症な虚血性心疾患等、全身の心血管系統に重篤な異常が疑われる患者
９、骨髄液採取の除外基準にあてはまる患者
１０、全身麻酔が危険と判断される患者
１１、小脳梗塞、脳幹梗塞
１２，急性期に血管内外科治療を行った患者
１３、その他、治療担当主治医が本治療の対象として不適当と判断した患者
（Ｂ）骨髄液などから間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を採取・培養・保存し、投与する場合
さらに本発明の静脈投与の他の態様として、骨髄液などから採取・培養・保存したＭＳＣを静脈内投与する方法を挙げることができる。骨髄細胞の採取・培養・保存については、以下に記載する条件に従うことが好ましい。
具体的には、
（１）局所麻酔で腸骨より約５ｍｌの骨髄液を採取する
（２）採取骨髄液より、例えば、特許出願明細書（ＷＯ ０２／００８４９）に記載の方法で、ＭＳＣを抽出・培養・増殖する
（３）保存液中で冷凍保存する
（４）必要時に解凍し、そのまま静脈内に投与する（２ｘ１０８個以上のＭＳＣ）
本発明においては骨髄液は、初期の骨髄採取量が３〜５ｍｌ程度と身体への負担が少ないため、ほぼ全ての患者から局所麻酔で安全かつ容易に採取することができる。
採取された骨髄幹細胞等の間葉系幹細胞は、増殖培養することができるため、これを用いる治療に必要な量まで予め増殖させておくことができる。本発明におけるＭＳＣは、好ましくはｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ＭＳＣである。さらに好ましくは２ｘ１０８個以上のｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ＭＳＣである。上記方法を用いて増殖させられた間葉系幹細胞もしくは本発明の治療薬は、必要に応じて、凍結などの所定の方法により長期間保存しておくことができる。保存・解凍方法を以下に示す。
まず細胞凍結作業は以下のように行なう。最初にプログラムフリーザ、凍結バックＦ−１００、液体窒素、チューブシーラー等の機材を準備する。また、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ、ＤＭＳＯ、デキストラン自己血清、Ｄ−ＭＥＭ等の試薬を調整し準備する。
次いで、培養液を除去後、Ｔ／Ｅを添加し、付着培養ＭＳＣ細胞を回収し、等量の細胞洗浄液（２％ 自己血清含Ｄ−ＭＥＭ）を加え、４００ｇで５分遠心分離を行なう。細胞洗浄液（２％ 自己血清含Ｄ−ＭＥＭ）で細胞ペレットを攪拌し、４００ｇで５分遠心分離を行なう。次いで、細胞保存液（５０％ 自己血清含Ｄ−ＭＥＭ）４１ｍｌに細胞を攪拌する。この際、１ｍｌシリンジを用いて０．５ｍｌ ２本の細胞溶液を分取し、細胞数をカウントする。攪拌した液体の細菌・ウイルス検査を実施し、細菌・ウイルスに汚染されていないことを確認する。次いで凍結保護液（ＤＭＳＯ（Ｃｒｙｏｓｅｒｖ）５ｍｌ、１０％ デキストラン４０ ５ｍｌ）１０ｍｌを添加する。これを凍結バックに５０ｍｌずつ充填し、各バックに検体番号を記載する。バックをプログラムフリーザにて凍結開始し、凍結したバックは液体窒素タンクへ移動して保存する。
細胞解凍洗浄作業は以下のように行なう。まず、温浴槽、クリーンベンチ、遠心分離機、分離バック、チューブシーラー等の機材を準備する。また、２０％ ヒト血清アルブミン（または自己血清）、生理食塩水、１０％ デキストラン４０等の試薬を調整し準備する。次いで、液体窒素タンクより細胞を保存した凍結バックを取り出し気相５分、室温２分に静置する。気相および室温に静置する理由は液体窒素気化による破裂を防止するためである。バックを滅菌済みビニール袋に入れ、バックのピンホール等による内容物流出を阻止する。このビニール袋を温浴槽に入れ解凍する。解凍後、細胞溶液を血液バック（閉鎖系）またはチューブ（開放系）に全液量を回収する。回収した細胞溶液に洗浄液（２０％ ヒト血清アルブミン２５ｍｌ、生理食塩水７５ｍｌ、１０％ デキストラン４０ １００ｍｌ）を等量添加する。室温で５分間静置して平衡状態にし、細胞内のＤＭＳＯを抜く。続いて４００ｇで５分遠心分離を行なう。上記細胞洗浄液で細胞ペレットを攪拌する。このようにして得られた細胞溶液は患者の体内に投与され、また一方で、１ｍｌシリンジを用いて０．５ｍｌ ２本細胞溶液を分取し、生存率検査および細菌検査を実施する。
さらに本発明では、このようにして予め採取・培養・保存しておいたｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ＭＳＣは、必要時にはただちに解凍して活性状態に戻し、そのまま可及的速やかに静脈内へ投与し治療のために使用することができる。この際、ヘパリンは使用しない。また、投与される患者側にも特に制限される事項はない。
（Ｃ）ｈＴＥＲＴで不死化した間葉系幹細胞を投与する場合
本発明者らは、多量に安定して細胞を増殖・分化させることができる誘導方法の開発に成功している（ＷＯ ０３／０３８０７５）。通常、神経再生医療において中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）は有用であるが、培養条件下での増殖はある程度制限される。しかし、本発明者らの研究により、インビトロにおいてストローマ細胞や間葉系幹細胞にテロメラーゼのような不死化遺伝子を組み込んだウイルスベクターを導入すると、細胞分裂を繰り返しても細胞の増殖が継続し、細胞の寿命が飛躍的に延びるにもかかわらず、細胞形状が正常細胞と同じであることが明らかとなった。そして、本発明者らは、不死化遺伝子を導入することにより不死化した中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を、適当な条件下で培養することにより効率的に神経幹細胞および神経系細胞へ分化誘導できることを見出した。
具体的には、不死化遺伝子であるｈＴＥＲＴ遺伝子を中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）へ導入することにより不死化した中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を、脂肪細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞等へ分化誘導させることに成功した。さらにｈＴＥＲＴ遺伝子導入により不死化した中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を培養条件下で高率に神経幹細胞を含む神経系細胞へ分化誘導し、またこれらの細胞（中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）そのもの、中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）より分化誘導した神経幹細胞、中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）より分化誘導した神経幹細胞を分化誘導した神経系細胞、中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）より分化誘導した神経系細胞）を移植することにより、脊髄脱髄部位が修復されることを明らかにした。
また、不死化遺伝子を導入した中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）自体、若しくは、本発明の上記方法によって分化誘導された神経幹細胞および神経系細胞は、神経再生に非常に有用であるものと期待される。
ガン遺伝子等を導入して細胞を不死化した場合、細胞そのものの形質転換が生じるのに対し、本発明において不死化遺伝子を導入することにより細胞を不死化した場合には、もとの細胞の性質を保持したままであり、さらに、不死化遺伝子の導入では、十分な増殖が得られた後、該遺伝子を取り去ることも可能である。
本発明においては、上記の不死化遺伝子が導入された間葉系細胞を、適宜静脈内投与に利用することも可能である。
（Ｃ）では得られる細胞が多量のため、静脈内投与する細胞数を多くすることができる。好ましくは１ｘ１０９個以上の細胞を投与することができる。投与細胞数が多くなるほど治療効果が高まるため、これは大きな利点である。
本発明の間葉系細胞を有効成分として含む脳神経疾患治療のための体内投与用薬剤は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、必要に応じて水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。また、注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなビークルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者の体内への投与は、好ましくは非経口投与であり、具体的には、静脈への１回の投与が基本であるが、複数回の投与でもよい。また、投与時間は短時間でも長時間持続投与でもよい。さらに具体的には、注射剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、動脈内注射、選択的動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、脳室内注射、脳内注射、髄液腔内注射などにより投与することができるが、好ましくは静脈内注射である。
静脈内注射の場合、通常の輸血の要領での移植が可能となり、患者を手術する必要がなく、さらに局所麻酔も必要ないため、患者及び医者双方の負担が軽い。また病棟での移植操作が可能である点で好適である。将来の救急医療の発展を考慮すれば、救急搬送中、もしくは発症現場の投与も考えられる。
また、本発明の細胞分画に含まれる細胞は、その遊走能の高さから、遺伝子の運び屋（ベクター）として利用することも考えられる。例えば、脳梗塞を始めとした脳腫瘍などの各種神経疾患に対する遺伝子治療用ベクターとしての利用が期待される。
本発明における脳神経疾患としては、例えば、脳梗塞、脳卒中、脳出血、クモ膜下出血、脳腫瘍等を挙げることができるが、好ましくは、脳梗塞である。原因は、ＮＩＮＤＳ ＩＩＩ（脳血管疾患分類第ＩＩＩ版における臨床病型分類）の分類における、アテローム血栓性脳梗塞、心原性脳塞栓症、ラクナー梗塞のいずれでもよい。その他にも、頭部外傷性の神経系疾患（頭部外傷、脳挫傷等）、虚血性脳神経損傷、外傷性脳神経損傷、脳神経変性疾患、代謝性神経疾患等が挙げられるが、脳神経の異常に起因する疾患であれば、特にこれらに制限されない。
また本発明の間葉系細胞は、静脈投与等の体内投与により、脳において脳神経の保護効果、および脳神経再生効果を有する。従って本発明は、間葉系細胞を有効成分として含む、脳神経保護効果を有する体内投与用薬剤を提供する。ここで、「脳神経保護効果」（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）とは、未治療の場合に損傷を受け死滅する脳神経細胞を救い生存させ続ける効果をいう。
また本発明は、間葉系細胞を有効成分として含む、脳神経再生効果を有する体内投与用薬剤を提供する。ここで「脳神経再生効果」とは、脳神経細胞を再生させ機能を回復させる効果もしくはこの効果によって得られる治療効果をいう。
さらに本発明は、患者へ治療上有効量の本発明の薬剤を体内投与（好ましくは、静脈内投与）することを含む、脳神経疾患の治療方法に関する。
上記治療方法に用いられる薬剤に含まれる骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞等の間葉系細胞は、移植による拒絶反応の危険性を防止するために、免疫抑制などの特殊な操作を行なわない限りは、患者本人の体内から採取されたもの、あるいはそれに由来するもの（患者由来の自家細胞）であることが好ましい（自家移植療法）。これは、免疫抑制剤を併用しなければならない困難性がない点で好ましい。免疫抑制を行えば他家移植療法も可能であるが、自家移植療法の方が圧倒的に良好な治療効果が期待できる。
自家移植療法が困難な場合には、他人または他の医療用動物由来の細胞を利用することも可能である。細胞は冷凍保存したものであってもよい。
なお前記自家細胞は、患者の体内から未分化の状態で採取されたもの、患者の体内から未分化の状態で採取された間葉系幹細胞に遺伝子操作を加えたもの、または患者の体内から未分化の状態で採取された間葉系幹細胞を分化誘導させたもののいずれであってもよい。
また、本発明の治療方法において、本発明の薬剤（間葉系細胞、例えば骨髄細胞等）の患者への投与は、例えば、上述の方法に従って、好適に実施することができる。また、医師においては、上記方法を適宜改変して、本発明の薬剤を患者へ投与することが可能である。
また、本発明の上記治療方法は必ずしもヒトのみに限定されない。通常、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル等）においても間葉系細胞を用いて、同様に本発明の方法を実施することが可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ラット脳梗塞モデル（中大脳動脈一時閉塞モデル）に対する、ＭＣＦの静脈内投与の治療効果を示す写真である。静脈内投与したＭＣＦ細胞が脳梗塞巣に集積した。
図２は、ＭＣＦの局所投与と静脈内投与の治療効果に及ぼす影響を検討した結果を示すグラフである。□が局所投与、■が静脈内投与であることを示す。
図３は、ラット脳梗塞モデル（中大脳動脈一時閉塞モデル：４５分間）に対して、自家ＭＣＦ（１ｘ１０７ｃｅｌｌ）を移植した治療効果を示す写真である。Ａ：脳梗塞後３時間、Ｂ：脳梗塞後６時間、Ｃ：脳梗塞後１２時間、Ｄ：脳梗塞後２４時間、Ｅ：脳梗塞後７２時間、Ｆ：非治療群。
図４は、上記図３の結果を定量化したグラフである。□が非移植群、■が移植群を示す。＊＜０．００１。
図５は、ラット脳梗塞モデルに対して自家ＭＣＦ（１ｘ１０７ｃｅｌｌ）を静脈内投与した結果を示す写真である。Ａ；脳梗塞巣に集積する移植ＭＣＦＧ細胞（青色）。Ｂ；Ａの□部の強拡大図（ＨＥ染色）。Ｃ；同部位をｘ−ｇａｌで処理し、ドナー細胞を青く視覚化したもの。移植ＭＣＦ細胞（青色）が多数集積している。ＬａｃＺ陽性細胞（Ｄ）がＮＳＥ陽性（Ｅ）となっている。Ｆ；ＤとＥのマージしたもの。ＬａｃＺ陽性細胞（Ｇ）がＧＦＡＰ陽性（Ｈ）となっている。Ｉ；ＧとＨのマージしたもの。
図６は、移植ＭＣＦ細胞が高率に脳内へ遊走していることを示す写真である。Ａ：脳梗塞後３時間、Ｂ：脳梗塞後１２時間、Ｃ：脳梗塞後７２時間、Ｄ：Ａの□部を染色したもの、Ｅ：Ｂの□部を染色したもの、Ｆ：Ｃの□部を染色したもの、Ｇ：Ａの□部を染色したもの、Ｈ：Ｂの□部を染色したもの、Ｉ：Ｃの□部を染色したもの。
図７は、移植治療効果を示すグラフである。Ａ：モーリスの水迷路試験で、脳高次機能（記憶、学習）を検討した結果を示す。Ｂ：トレッドミル運動負荷試験の結果を示すグラフである。▲は非治療群、□は治療群を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１であることを示す。
図８は、脳梗塞ラットをＭＲＩで検査した結果を示す写真である。上段は脳梗塞直後のもの、下段は脳梗塞１週間後のものである。スケールバー：５ｍｍ。
図９は、ＭＳＣを使用した治療効果を示す写真である。上段は脳梗塞直後治療直前のもの、下段は脳梗塞１週間後治療後のものを示す。スケールバー：５ｍｍ。
図１０は、脳梗塞後１２時間後に、ＭＳＣ（１ｘ１０４〜１ｘ１０７個）を静脈内投与した結果を示す写真およびグラフである。
図１１は、図１０での結果を、組織学的にも裏付けした結果を示す写真およびグラフである。非治療群（Ａ）に比較して治療群（Ｂ：１ｘ１０６個の移植）では、著明な治療効果が見られる。Ｃは組織学的結果を定量化したものである。
図１２は、ラット脳梗塞モデルに対してＭＳＣ（１ｘ１０６ｃｅｌｌ）を静脈内投与した結果を示す写真である。移植ドナー細胞は、脳梗塞局所に集積した（Ａ，Ｂ，Ｃ、Ｄ）。ＡとＣは蛍光撮影。ＣとＤは蛍光撮影に光学写真をマージさせたものである。非移植群では、ドナー細胞は見られなかった（Ｅ，Ｆ）。また、その一部は、神経細胞（Ｇ，Ｉ，Ｋ）やグリア細胞（Ｈ，Ｊ，Ｌ）に分化した。ＬａｃＺ陽性細胞（Ｇ）がＮＳＥ陽性（Ｉ）となっていた。Ｋ；ＧとＩのマージしたもの。ＬａｃＺ陽性細胞（Ｈ）がＧＦＡＰ陽性（Ｊ）となっていた。Ｌ；ＨとＪのマージしたもの。スケールバー：２５０μｍ（Ａ，Ｂ）、１０μｍ（Ｃ−Ｆ），５μｍ（Ｇ−Ｌ）。
図１３は、脳梗塞に対するＭＳＣ静脈内投与の治療効果を、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＭＲＳ）により検討した結果を示す写真およびグラフである。
図１４は、ＭＳＣの移植治療効果について、行動学的検査より検討した結果を示すグラフである。
図１５は、ラット中大脳動脈永久閉塞モデルを用いた、ＭＳＣの治療効果を検討した結果を示す写真である。
図１６は、重症脳梗塞（ラット中大脳動脈永久閉塞モデル）においても、脳梗塞巣に一致してＭＲＩ検査で異常信号が検出されることを示す写真である。
図１７は、上記の図１６の脳梗塞巣の異常信号（ＭＲＩでＨＩＡ）が無治療の場合、時間経過（１２時間後、３日後、７日後）とともに明瞭化することを示す写真である。
図１８は、ラット中大脳動脈永久閉塞モデルに対して間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（１ｘ１０６ｃｅｌｌ）を静脈内投与した結果を画像として示すＭＲＩ画像写真である。障害発生からＭＳＣの投与までの経過時間ごとに分けて結果を示した。上段から、未処理、３時間後に治療、６時間後に治療、１２時間後に治療、２４時間後に治療、及び７２時間後に治療の結果の画像である。それぞれ脳梗塞発生の１週間後におけるＭＲＩ検査（Ｔ２ＷＩ）によるものである。画像において、脳梗塞巣は白く描出される。
図１９は、重症脳梗塞（ラット中大脳動脈永久閉塞モデル）に対して間葉系細胞（１×１０６ｃｅｌｌ）を静脈内投与した結果、脳梗塞の範囲を測定し体積として定量化したグラフである。
図２０は、重症脳梗塞に対する超急性期のＭＳＣ静脈内投与による経時的な治療効果を示す写真である。
図２１は、重症脳梗塞に対する急性期のＭＳＣ静脈内投与による経時的な治療効果の例を示す写真である。
図２２は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（１×１０６ｃｅｌｌ）の静脈内投与による重症脳梗塞（ラット中大脳動脈永久閉塞モデル）における障害発生後の生存率を示すグラフである。障害発生から間葉系幹細胞の投与までの経過時間毎に分けて結果を示している。ｎはサンプル数である。
図２３は、重症脳梗塞に対してＭＳＣの移植治療を行なった臨床症状を示すグラフである。
図２４は、無処置群、若しくは、Ｇ−ＣＳＦやＳＣＦの因子を、事前に皮下に注射した群の、末梢血から得られた間葉系幹細胞のような付着培養細胞を示す写真である。
図２５左は、得られた付着培養細胞から神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）への分化誘導が可能であったことを示す写真である。また図２５右は、ＲＴ−ＰＣＲでＮｅｓｔｉｎの発現の確認も可能であったことを示す写真である。
図２６上段は、図２５に示す細胞が神経細胞（ＮＦ陽性細胞）やグリア細胞（ＧＦＡＰ陽性細胞）への分化誘導が可能であったことを示す写真である。また図２６下段はＲＴ−ＰＣＲで、それぞれＮＦやＧＦＡＰの発現の確認も可能であったことを示す写真である。
図２７は、ＭＳＣを培養してＢＤＮＦが産生された結果を示すグラフである。それぞれ１００，３００，１０００，および３０００ｐｕ／ｃｅｌｌのＭＯＩのＡｘＣＡｈＢＤＮＦ−Ｆ／ＲＧＤ（ＭＳＣ−ＢＤＮＦ）でトランスフェクトしたＭＳＣは、４８時間後に０．２３０±０．１１０，０．４３４±０．１２２，０．９３１±０．１０１，および１．８６０±０．４１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌｓの割合でＢＤＮＦを分泌した。トランスフェクトしていないＭＳＣもＢＤＮＦを産生した（０．０４０７±０．００５９ｎｇ／１０５ｃｅｌｌｓ／４８ｈｒ）。
図２８は、脳虚血誘導性神経欠損の評価を示すグラフである。
Ａ：脚プレースメントにおける不足を以下の尺度で評価した。０：高度の神経欠損、１６：神経欠損なし。ＭＣＡＯの１日後で脳内にＭＳＣを投与する前では、４つの虚血集団間で脚プレースメントスコアに統計学的な差は見られなかった。ＭＣＡＯの８日後では、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ処理ラットは、コントロールＤＭＥＭラット（Ｐ＝０．０００１）および線維芽細胞処理ラット（Ｐ＝０．００３）と比較して、有意に高い脚プレースメントスコアに達した。ＭＣＡＯの１５日後、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ処理ラットのスコアはＤＭＥＭ集団（Ｐ＝０．０２４）と比較したところ同じく上昇した。
Ｂ：ＭＣＡＯの前に、トレッドミル速度の平均を集団間で比較した。ＭＣＡＯの８日後、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ集団におけるラットは、コントロールＤＭＥＭ（Ｐ＝０．００１）および線維芽細胞処理（Ｐ＝０．０１７）集団の動物と比較して、有意に速い速度に達した。これらの差は、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ集団における速度は、コントロールＤＭＥＭ（Ｐ＝０．００２）および線維芽細胞集団（Ｐ＝０．０２３）と比較して有意に高いまま１５日目まで持続した。
図２９Ａは、ＤＭＥＭ、線維芽細胞、ＭＳＣ、あるいはＭＳＣ−ＢＤＮＦを投与したラットにおけるＭＣＡＯの２、７、１４日後に撮ったＴ２強調画像（Ｔ２Ｗ）を表す写真である。ＭＣＡＯの７日後、ＤＭＥＭ（Ｐ＝０．００２）、線維芽細胞（Ｐ＝０．０１５）あるいはＭＳＣ（Ｐ＝０．０２８）で処理したラットと比較して、ＭＳＣ−ＢＤＮＦで処理したラットでは、ＨＬＶ（％）に有意な減少が見られた。１４日後、ＤＭＥＭ処理したラット（Ｐ＝０．０１１）と比較して、ＭＳＣ−ＢＤＮＦで処理したラットのＨＬＶ（％）に有意な減少が観察された。
図２９Ｂは、ＤＭＥＭ、ＭＳＣあるいはＭＳＣ−ＢＤＮＦを投与したラットにおいてＭＣＡＯの２および７日後に得た代表的なＴ２Ｗ画像を表す写真である。７日目の他の集団と比較して、虚血損傷体積の減少がＭＳＣ−ＢＤＮＦ集団にて検出された。
図３０は、ＢＤＮＦ産生のインビボのレベルを示すグラフである。ＢＤＮＦレベルは、ＤＭＥＭ（Ｐ＝０．０００２）あるいはＭＳＣ（Ｐ＝０．０００６）を処理ラットと比較して、ＭＣＡＯの７日後にＭＳＣ−ＢＤＮＦ−移植ラットの虚血脳半球において有意に上昇した。ＢＤＮＦのレベルはまた、ＤＭＥＭ処理ラットと比較してＭＳＣ処理した虚血脳半球において有意に上昇した（Ｐ＝０．０１２４）。
図３１は、ＤＮＡ断片を有する細胞が、ＭＣＡＯ後の虚血半影および投与部位に存在することを示す図である。
Ａ：ＤＭＥＭ処理ラットと比べて、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ処理ラットではＴＵＮＥＬ陽性細胞が殆ど見られないことを示す写真である。ＦＩＴＣ＝緑（ＴＵＮＥＬ陽性）、ＰＩ＝赤（核）、倍率２００倍。
Ｂ：Ａを６３０倍した写真である。
図３１Ｃは、虚血境界域をＭＳＣ−ＢＤＮＦで処理した動物では、ＤＭＥＭを投与した動物と比較してＴＵＮＥＬ陽性細胞が有意に減少した（Ｐ＝０．０１３）ことを示すグラフである。
図３１Ｄは、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ処理ラットではＭＳＣ処理ラットと比較して、より少ない陽性細胞が検出されたことを示す写真である。多くのＤｓＲ陽性ＭＳＣが投与部位の＜２ｍｍ以内で検出された。ＦＩＴＣ（緑、ＴＵＮＥＬ陽性）、ＤｓＲ（赤、ＭＳＣ）。
図３２は、ラット脳における、外因性ＭＳＣおよび内因性脳細胞の形態学的な特徴を示す顕微鏡写真である。二重免疫蛍光染色を用いたところ、ＥＧＦＰ細胞は投与部位の近くに局在していた。レシピエントラットの脳において、レーザー走査性共焦点顕微鏡により、ＥＧＦＰ細胞（緑色）、神経性核抗原（ＮｅｕＮ；Ａ）および神経膠線維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ；Ｂ）が見出された。スケールバー＝２０μｍ。
図３３ａ〜ｅは、ラットＭＳＣにおける表面抗原の発現をフローサイトメトリーで分析した写真である。ＭＳＣは提示される抗原に特異的なモノクローナル抗体で標識された。死亡細胞は前面および側面散乱によって除去した。ｆ〜ｉは、ラットＭＳＣの典型的な間葉細胞への分化を示す写真である。初代ＭＳＣあるいはＭＳＣ−ＩＬ２の骨形成分化は、フォン−コッサ染色によって検出した。初代ＭＳＣ（ｈ）あるいはＭＳＣ−ＩＬ２（ｉ）の脂肪細胞形成分化は、オイルレッド０染色によって検出した。
図３４は、ＭＳＣの抗腫瘍効果および遊走能を示すグラフである。■はＮＲＫ細胞、□はＭＳＣ細胞を示す。（ａ） ９Ｌ細胞（５ｘ１０４／ウェル）をＭＳＣあるいはＮＲＫ細胞（５ｘ１０３／ウェル）と共培養した。（ｂ） ＭＳＣあるいはＮＲＫ細胞を１ｘ１０５ｃｅｌｌの濃度でトランスウェルインサートに蒔き、９Ｌ細胞を５ｘ１０３細胞／ウェルの濃度でウェルに置床した。４日後、９Ｌ細胞数を数えた。全データは、増殖阻害率（％）＝［１−（ＭＳＣあるいはＮＲＫ細胞と共培養した９Ｌ細胞数／単独で培養した９Ｌ細胞数）］ｘ１００で表示した。（ｃ） 遊走アッセイの結果を示す。８μｍ孔径で単離した１２５Ｉ−デオキシウリジン標識細胞（５ｘ１０４）を、トランスウェルの上部チャンバー内に置いた。９Ｌ細胞は下部チャンバー内に置いた。インキュベーション２４時間後、下部チャンバーにおける放射活性を測定した。細胞遊走アッセイの結果は、チャンバーにおける総細胞数に対する下部チャンバーにおける数の比として示した。
図３５は、神経膠腫をもつラットにおけるＭＳＣの分布および遊走を示す写真である。９Ｌ−ＤｓＲ細胞（４ｘ１０４）細胞を移植し、続いて腫瘍接種の３日後に、４ｘ１０５のＭＳＣ−ＥＧＦＰを腫瘍内投与あるいは反対側の脳半球へ投与した。腫瘍接種の１４日後にラットを安楽死させ、脳を切り出した。（ａ）および（ｂ）は、ＭＳＣ−ＥＧＦＰを腫瘍内投与した脳標本の顕微鏡像。（ｃ）および（ｄ）は、反対側の脳半球へＭＳＣ−ＥＧＦＰを投与した脳標本の顕微鏡像。（ａ）および（ｃ）はＨ−Ｅ染色、（ｂ）および（ｄ）は抗ＧＦＰモノクローナル抗体で免疫組織化学的に染色した。（ｅ）−（ｈ）は、ＭＳＣ−ＥＧＦＰを腫瘍内投与した脳の蛍光顕微鏡像。（ｅ）は、神経膠腫および正常実質の間の境界域。（ｆ）は腫瘍の内側、（ｇ）は末端ののマイクロサテライト。（ｈ）は反対側の脳半球にＭＳＣ−ＥＧＦＰを投与した腫瘍および正常実質の間の境界域の蛍光顕微鏡像。
図３６は、９Ｌ細胞を接種した生存ラットのＩＬ２遺伝子改変ＭＳＣの効果を示すグラフである。生存の解析は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ方法に基づく対数順位検定によって行なった。（ａ）は９Ｌ細胞を接種して、ＭＳＣを接種したあるいはしないラットの生存率。（ｂ）は腫瘍接種の３日後にＭＳＣを腫瘍内へ接種したあるいはしないラットの生存率。
図３７は、代表的なＭＲＩ（Ｇｄ−ＤＴＰＡで増強したＴ１強調冠状イメージ）の写真である。９Ｌ神経膠腫は、腫瘍接種の３日後にＭＳＣを接種あるいは接種しない処理をした。磁気共鳴映像法は、７日毎に全動物に対して行なった。腫瘍体積（ｍｍ３）は、映像の厚さに各映像領域（ｍｍ２）のＧｄ−ＤＴＰＡで増強された部分を掛けた合計として計算した。
図３８は、遺伝子改変ＭＳＣを投与した神経膠腫の組織学的解析結果を示す写真である。非改変ＭＳＣ（ａ，ｂ）あるいはＭＳＣ−ＩＬ２（ｃ，ｄ）の接種による神経膠腫の組織学的解析は、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色して行なった。非改変ＭＳＣ（ｅ）あるいはＭＳＣ−ＩＬ２（ｆ）の接種による神経膠腫におけるＣＤ４陽性リンパ球の浸潤は、モノクローナル抗体Ｗ３／２５によって検出した。非改変ＭＳＣ（ｇ）あるいはＭＳＣ−ＩＬ２（ｈ）の接種による神経膠腫におけるＣＤ８陽性リンパ球の浸潤はモノクローナル抗体ＯＸ−８によって検出した。
図３９は、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＮＴ３遺伝子をＭＳＣに導入し、培養した細胞のＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＮＴ３の産生について検討した結果を示すグラフである。縦軸はサイトカイン産生（ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／４８時間）、横軸は感染多重度（ｐｕ／ｃｅｌｌ）を示す。
図４０は、脳虚血により誘発される神経学的障害について評価した結果を示すグラフである。ＢＤＮＦに加え、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ３遺伝子をＭＳＣに導入した細胞を脳梗塞局所へ移植し脚プレースメント試験を行なった。縦軸は脚プレースメントスコア、横軸はそれぞれＭＣＡＯ前、ＭＣＡＯ１日後（注射前）、ＭＣＡＯ８日後、ＭＣＡＯ１５日後を示す。
図４１は、ＭＳＣ−ＢＤＮＦおよびＭＳＣ−ＧＤＮＦの局所移植治療後の梗塞体積（ＨＬＶ）を示すグラフである。縦軸は梗塞体積（％）、横軸はそれぞれＭＣＡＯ２日後、７日後、１４日後を示す。
図４２は、ＤＭＥＭ、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ、ＭＳＣ−ＧＤＮＦ、ＭＳＣ−ＣＮＴＦまたはＭＳＣ−ＮＴ３を局所投与したラットにおける、ＭＣＡＯの２日後および７日後に得た代表的なＴ２強調（Ｔ２Ｗ）画像写真である。
図４３は、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ静脈内投与群、ＭＳＣ静脈内投与群、および未処理群（対照）における、ＭＣＡＯの２４時間後、７２時間後、７日後のＭＲＩ画像写真である。
図４４は、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ静脈内投与群、ＭＳＣ静脈内投与群、および未処理群（対照）における、ＭＣＡＯ後の脳梗塞体積の変化を示すグラフである。縦軸は梗塞容積、横軸はそれぞれＭＣＡＯの６時間後、２４時間後、７２時間後、７日後を示す。
図４５は、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ静脈内投与群、ＭＳＣ静脈内投与群、および未処理群（対照）における、ＭＣＡＯ後のトレッドミル試験の結果を示すグラフである。縦軸は最大走行速度、横軸はそれぞれＭＣＡＯの２４時間後、７２時間後、７日後を示す。
図４６は、ＭＣＡＯの３時間後、２４時間後、３日後、７日後の未処理群（対照）、および、ＭＳＣ−ＰＬＧＦ静脈内投与群（ＭＣＡＯ３時間後）についてＭＲＩにより、脳梗塞巣を観察した結果を示す写真である。それぞれＤＷ２（ｂ＝１０００）画像およびＴ２ＷＩ画像を示す。
図４７は、ＭＣＡＯ後に出現した異常信号を示す体積をＭＲＩ検査で時間の経過とともに定量した結果を示すグラフである。上段はＤＷＩ画像による結果を示すグラフであり、下段はＴ２ＷＩ画像による結果を示すグラフである。
図４８は、ＭＣＡＯの７日後に、未処理群（対照）およびＭＳＣ−ＰＬＧＦ静脈内投与群の脳組織をＴＴＣ染色した結果を示す写真である。上段はＭＳＣ−ＰＬＧＦ投与群の写真であり、下段の写真は未処理群（対照）の写真である。
図４９は、正常なラットの血管系をＥｖａｎｓ ＢｌｕｅおよびＦＩＴＣデキストランで視覚化した結果を示す写真である。Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅによる結果を左側に、ＦＩＴＣデキストランによる結果を右側に示す。
図５０は、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ遺伝子をａｄｅｎｏｖｉｒｕｓベクターで局所注入処理をしたＭＣＡＯモデルラットと、遺伝子注入処理をしていないＭＣＡＯモデルラットの血管形成誘導についてＦＩＴＣで視覚的に比較した結果を示す写真である。遺伝子注入処理をしたＭＣＡＯモデルラット（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）の結果を左側に、遺伝子注入処理をしていないＭＣＡＯモデルラット（対照）の結果を右側に示す。
図５１は、ＦＩＴＣで同側／対側（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ／ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）を定量化した結果を示すグラフである。図中「Ａｎｇ」はＡｎｇｉｏｐｏｉｔｉｎ処理を示す。
図５２は、遺伝子注入処理をしたＭＣＡＯモデルラットと、遺伝子注入処理をしていないＭＣＡＯモデルラットの血管形成誘導についてＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅで視覚的に比較した結果を示す写真である。遺伝子注入処理をしたＭＣＡＯモデルラット（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）の結果を左側に、遺伝子注入処理をしていないＭＣＡＯモデルラット（対照）の結果を右側に示す。
図５３は、脳梗塞後慢性期にＭＳＣを局所投与した後、ＭＳＣ投与群および未処理群（対照）におけるトレッドミル試験の結果を示すグラフである。縦軸は最大走行速度、横軸はＭＳＣ投与後の日数を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
〔実施例１〕 中大脳動脈一時閉塞モデル
ラット中大脳動脈閉塞モデルを脳卒中モデルとして用いた。以前に記載された血管内腔閉塞法（Ｅ．Ｚ．Ｌｏｎｇａ，Ｐ．Ｒ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｒ．Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒａｎｉｅｃｔｏｍｙ ｉｎ ｒａｔｓ，Ｓｔｒｏｋｅ ２０（１９８９）８４−９１．）を用いて、４５分間、中大脳動脈一時閉塞（ＭＣＡＯ）を生じさせた。
体重２５０〜３００ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット成体（ｎ＝１１３）を、まず５％イソフルランで麻酔し、その後機械的に人工換気下で７０％Ｎ２Ｏおよび３０％Ｏ２混合ガス中の１．５％イソフルランにより麻酔を維持した。赤外線加熱ランプを用いて、直腸温を３７℃に保った。手術中は血液ｐＨ、ｐＯ２およびｐＣＯ２を測定するために、左大腿動脈にカニューレを挿入した。長さ２０．０〜２２．０ｍｍの３−０号縫合糸（Ｄｅｒｍａｌｏｎ：Ｓｈｅｒｗｏｏｄ Ｄａｖｉｓ ＆ Ｇｅｃｋ，ＵＫ）の先端を炎の近くで加熱して丸め、外頸動脈から内頸動脈の内腔へと押し進め、中大脳動脈（ＭＣＡ）の起始部を閉塞させた。ＭＣＡＯの４５分後に、縫合糸の先端を内頸動脈から外れるまで抜去して再灌流を行った。
全マウスの生理的指標（直腸温、血液ｐＨ、ＰＯ２、ＰＣＯ２、血圧）は、手術および移植処置中は正常範囲内に維持され、実験群の間に統計的な差はみられなかった。
〔実施例２〕 骨髄細胞の調製
骨髄細胞移植の１時間半前に、ＭＣＡＯラットの大腿骨から自家性の骨髄を採取した。
ラットはケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）で麻酔した。皮膚を１ｃｍ切開して大腿骨にエアドリルで小さな孔（２×３ｍｍ）を開け、２２ゲージ針を用いて骨髄１ｍｌを吸引した。試料はＦｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）３ｍｌを含むＬ−１５培地（２ｍｌ）中に希釈した。遠心処理（２，０００ｒｐｍ、１５分間）後に単核細胞画分を回収し、２ｍｌの無血清培地（神経前駆細胞維持培地：ＮＰＭＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）中に再懸濁した。２回目の遠心処理（２，０００ｒｐｍ、１５分間）後に細胞を１ｍｌのＮＰＭＭ中に懸濁した。
〔実施例３〕 実験群
実験は１１群により構成した（ｎ＝８８）。第１群（対照）のラットにはＭＣＡＯ後に何も投与しなかった（ｎ＝８）。第２〜６群のラットには、ＭＣＡＯからそれぞれ３、６、１２、２４、７２時間後に培地のみ（ドナー細胞は投与せず）を静脈内投与した（各群ｎ＝８）。第７〜１１群のラットには、ＭＣＡＯからそれぞれ３、６、１２、２４、７２時間後に自家骨髄細胞（１．０×１０７個）を静脈内投与した（各群ｎ＝８）。各群のラットのうち６匹を梗塞巣体積の算出に用い、残りを他の組織学的分析に用いた。
〔実施例４〕 ラット脳梗塞モデルへの自家骨髄細胞の静脈内投与
骨髄細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｒａ ｃｅｌｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＭＣＦ）はラット脳梗塞モデル（中大脳動脈一時閉塞モデル）へ移植する前にＬａｃＺ遺伝子を導入した。
骨髄細胞へのＬａｃＺ遺伝子の導入には、Ａｄｅｘ１ＣＡｌａｃＺアデノウイルスを用いた。構築手順の詳細は別の文献に記載されている（Ｉ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｋ．Ｉｊｉｍａ，Ｓ．Ｃｈｉｋｕｍａ，Ｉ．Ｓａｉｔｏ，Ｙ．Ｋａｎｅｇａｅ，Ｈ．Ｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｔ．Ｙｏｓｈｉｋｉ，Ｈ．Ｏｋａｍｏｔｏ，Ａ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ，Ｔ．Ｕｅｄｅ，Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｅｄｉａｔｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＴＬＡ４ＩｇＧ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（１９９８）１７３９−１７４５．Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．Ｗａｋｉｍｏｔｏ，Ｊ．Ａｂｅ，Ｙ．Ｋａｎｅｇａｅ，Ｉ．Ｓａｉｔｏ，Ｍ．Ａｏｙａｇｉ，Ｋ．Ｈｉｒａｋａｗａ，Ｈ．Ｈａｍａｄａ，Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｍｕｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４（１９９４）５７５７−５７６０．Ｍ．Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｉ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｉ．Ｓａｉｔｏ，Ａ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｕｅｄｅ，ＣＴＬＡ４ＩｇＧ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｕｐｕｓ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ ｉｎ ＭＲＬ／ｌｐｒ ｍｉｃｅ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６６（２０００）９９１−１００１．）。このアデノウイルスベクターは、ウイルス複製を防ぐためにＥ１Ａ、Ｅ１ＢおよびＥ３各領域が欠失したアデノウイルス血清型−５のゲノムを有しており、Ｅ１Ａ領域およびＥ１Ｂ領域の代わりに、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であるｌａｃＺ遺伝子を、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターから構成されるＣＡＧプロモーター（Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｖｅｃｔｏｒ，Ｇｅｎｅ １０８（１９９１）１９３−１９９．）とウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルとの間に含む。この組換えアデノウイルスを２９３細胞内で増殖させて単離した。ウイルス溶液は使用時まで−８０℃で保存した。１．０×１０７個の自家骨髄細胞を５０ ＭＯＩのＡｄｅｘ１ＣＡｌａｃＺとともに、１０％ウシ胎仔血清を含む３７℃のＤＭＥＭ中に１時間置き、アデノウイルスをインビトロで感染させた。
その後、骨髄細胞を採取したのと同じラットに、ＭＣＡＯを実施した。そして自家骨髄から調製したばかりの約１×１０７個の単核細胞を含む総容量１ｍｌの液体（ＮＰＭＭ）を左大腿静脈へ投与した。
移植２週間後に、インビボでのβ−ガラクトシダーゼ発現細胞を検出した。
まず、深麻酔したラットの脳を摘出し、０．５％グルタルアルデヒドを加えたリン酸緩衝液中に１時間置いて固定した。ビブラトームで脳切片（１００μｍ）を切り出し、この切片をＸ−Ｇａｌ現像液（３５ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６／３５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６．３Ｈ２Ｏ／２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むリン酸緩衝食塩液）中に、最終濃度１ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌとともに３７℃で一晩インキュベートした。青色の反応産物を細胞内に形成させ、β−ガラクトシダーゼ発現細胞を検出した。
各脳切片の断面を解剖顕微鏡で観察し、画像解析装置に記録した。続いて切片を、４％パラホルムアルデヒドを加えたリン酸緩衝液中に一晩置いて固定し、脱水した上でパラフィン中に包埋した。切片（５μｍ）を切り出し、光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ：Ａｘｉｏｓｋｏｐ ＦＳ）により青色反応産物（β−ガラクトシダーゼ反応産物）の存在を評価した。一部の切片にはヘマトキシリンおよびエオジンによる対比染色を行った。
その結果、Ｘ−ｇａｌはホスト脳組織中で青く発色するため、ドナーＭＣＦ細胞はホスト脳組織内で青い細胞として視覚化された（図１）。静脈内投与したＭＣＦ細胞が脳梗塞巣に集積した。
〔実施例５〕 ＭＣＦの局所投与および静脈内投与の治療効果に及ぼす影響
実験の結果、移植細胞数が増加するほど治療効果が高まった（図２）。また、静脈内投与では、局所投与と同程度の治療効果を得るためには約１００倍の細胞数を要したが、逆に、１００倍の細胞数を投与すれば、静脈内投与でも、局所投与と同程度の治療効果が期待できることが判明した。
〔実施例６〕 ラット脳梗塞モデルへの自家ＭＣＦ移植による治療効果
ラット脳梗塞モデル（中大脳動脈一時閉塞モデル：４５分間）に対して、自家ＭＣＦ（１ｘ１０７ｃｅｌｌ）を移植した。
梗塞巣の程度は、２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）染色を用いて評価した（Ｊ．Ｂ．Ｂｅｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｈ．Ｐｉｔｔｓ，Ｓ．Ｍ．Ｇｅｒｍａｎｏ，Ｍ．Ｃ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｒ．Ｌ．Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｍ．Ｂａｒｔｋｏｗｓｋｉ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅａｓ ａ ｓｔａｉｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ，Ｓｔｒｏｋｅ １７（１９８６）１３０４−１３０８．）。正常脳はこの方法で赤く染色される。
移植２週間後に、ラットをペントバルビタール・ナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で深麻酔した。脳を注意深く摘出し、ビブラトームを用いて切り出して１ｍｍ厚の冠状切片とした。新たな脳切片を、２％２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）を加えた３７℃の生理食塩水中に３０分間浸漬した。
その結果、ＭＣＡＯモデルラットの脳内の脳梗塞領域（皮質と大脳基底核の両方）では染色が弱く、脳梗塞巣は白く明瞭に描出された（図３）。
また、各脳切片における梗塞の断面積は解剖顕微鏡で評価し、画像解析ソフトウエアＮＩＨ ｉｍａｇｅを用いて計測した。すべての脳切片の梗塞面積を合計し、各々の脳の総梗塞体積を算出した。
梗塞巣の体積は統計学的に分析した。データは平均値±ＳＤとして表した。群間差は、個々の群の差を同定するためのＳｃｈｅｆｆｅ多重比較検定を用いるＡＮＯＶＡによって評価した。差はｐ＜０．０５の場合に統計的に有意であるとみなした。
結果、細胞を投与しなかった虚血巣（対照巣）の組織学的分析では、再現性および一貫性のある虚血巣が認められ、平均体積は２５８±５５ｍｍ３であった（ｎ＝６）（図３Ｆ）。梗塞巣モデルに用いた閉塞指標では、ＴＴＣにより同定された虚血は線条体（尾状核−被殻）、淡蒼球、中隔核で最も高度であり、皮質内の虚血は比較的軽度であった。
同じ梗塞巣指標を用いて、梗塞巣誘導から３、６、１２、２４および７２時間後に骨髄細胞を静脈内投与した。これらのすべての時点で、移植により梗塞巣体積が縮小したが、虚血誘導から早期に移植した方が優れた結果となった。自家骨髄細胞をＭＣＡＯの３時間後に静脈内投与した場合には、梗塞巣はほとんど検出されなかった（図３Ａ）；ＴＴＣ染色の変化はほとんど検出されなかったが、標的梗塞巣部に若干の炎症反応が観察された。ＭＣＡＯの６時間後に細胞を投与した場合は、大脳基底核における梗塞巣内部のＴＴＣ染色の低下が明らかとなった（４０±２８ｍｍ３、ｎ＝６）（図３Ｂ）。ＭＣＡＯから１２時間後（８０±２５ｍｍ３、ｎ＝６、図３Ｃ）、２４時間後（１４０±１８ｍｍ３、ｎ＝６、図３Ｄ）および７２時間後（１８０±２２ｍｍ３、ｎ＝６、図１Ｅ）に細胞を投与した場合、梗塞巣は徐々に増加した。
この治療効果は、移植時間が早いほど著明であったが、脳梗塞後７２時間を経過した時点で治療した場合でも、ある程度の治療効果が見られたことは特記すべきことである。
治療効果は、神経保護効果と神経再生効果の相乗効果と考察される。脳梗塞後、早期に移植した場合ほど、神経保護効果が強く、また、比較的遅く治療した場合には、相対的に神経保護効果が弱くなるが、そのかわり、神経再生効果が強くなる。
さらに、得られた結果を定量化し、図４のヒストグラムに、対照（細胞非移植群）、ならびに３、６、１２、２４および７２時間後に細胞を投与した梗塞モデル動物（細胞移植群）における梗塞体積をまとめて示した。
〔実施例７〕 ラット脳梗塞モデルへの自家ＭＣＦ静脈内投与による効果
ラット脳梗塞モデルに対して、ＭＣＡＯ誘導後に、ＬａｃＺを導入した自家ＭＣＦ（１ｘ１０７ｃｅｌｌ）を静脈内投与した。該骨髄細胞を、インビボで同定した。
インビボの移植細胞の表現型分析はレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて行った（ｎ＝５）。ラットをペントバルビタール・ナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で深麻酔し、心臓を最初にＰＢＳ、次に０．１４Ｍソーレンセンリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に４％パラホルムアルデヒドを含む固定液により灌流した。脳を摘出し、４％パラホルムアルデヒドを含む４℃のリン酸緩衝液中に２４時間置いて固定した上で、３０％スクロースを含む０．１Ｍ ＰＢＳ溶液中に一晩置いて脱水した。続いて組織をＯ．Ｃ．Ｔ．ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．）中に浸漬して、液体窒素中で凍結させ、クリオスタットで１０μ厚の冠状切片を切り出した。シランをコーティングしたスライド上で切片を乾燥させた。
ドナー骨髄由来細胞の種類を特定するために、β−ガラクトシダーゼ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４で標識したウサギ・ポリクローナル抗β−ガラクトシダーゼ抗体（ＩｇＧ）、ＣＨＥＭＩＣＯＮ）、ニューロン（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したマウス・モノクローナル抗ニューロン特異的エノラーゼ抗体（ＩｇＧ）［ＮＳＥ］、ＤＡＫＯ）およびアストロサイト（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したマウス・モノクローナル抗グリア線維酸性タンパク質抗体（ＩｇＧ）［ＧＦＡＰ］、ＳＩＧＭＡ）に対する抗体を用いる二重標識試験を行った。一次抗体は、ＺｅｎｏｎマウスまたはウサギＩｇＧ標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を製造者の指示に従って用いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４で標識した。シランをコーティングしたスライド上で乾燥させた組織切片をＰＢＳで洗い（５分間、３回）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＰＢＳにより室温で３０分間処理して、ブロッキング溶液（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ、ＤＡＫＯ）とともに室温で１０分間インキュベートした。これをさらに２種類の一次抗体と室温で６０分間反応させ、ＰＢＳで洗った（５分間、３回）。免疫染色後に、蛍光用封入培地（ＤＡＫＯ）を用いてスライドをカバーグラスで覆った。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（緑色）の励起にはアルゴンレーザーによって生じた４８８ｎｍのレーザー光を用い、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（赤色）の励起にはＨｅＮｅレーザーによる５４３ｎｍのレーザー光を用いた。Ｚｅｉｓｓ社のレーザー走査共焦点顕微鏡を用い、Ｚｅｉｓｓ社製のソフトウエアを用いて共焦点画像を入手した。
また、移植ＭＣＦＧ細胞をＸ−ｇａｌで処理し、ドナー細胞を青く視覚化した。
結果、移植ドナー細胞は、脳梗塞の内部および周囲に集積した。図５Ａは、蓄積したＬａｃＺ陽性細胞を含む、梗塞部の冠状切片を示す。光学顕微鏡検査により、虚血病巣の内部および周囲に多数の細胞が存在し（図５Ｂ）、その多くはＬａｃＺ陽性ドナー細胞であることが示された（図５Ｃ）。免疫組織化学分析からは、ＬａｃＺ陽性ドナー細胞の一部は、ニューロンのマーカーであるＮＳＥ（図５Ｅ）またはアストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ（図５Ｈ）を発現することが示された。ＬａｃＺ、ＮＳＥおよびＧＦＡＰのそれぞれを合成した画像を図５ＦおよびＩに示した。対照群には明らかな蛍光シグナルは認められなかった。以上の結果は、移植骨髄細胞の少なくとも一部が、梗塞巣部位で神経細胞（図５Ｅ，Ｆ）およびグリア細胞（図５Ｈ，Ｉ）の系に分化しうる可能性を示唆した。
〔実施例８〕 移植ＭＣＦ細胞の脳内への遊走
移植ＭＣＦ細胞が高率に脳内へ遊走した（図６）。また、この遊走は、脳梗塞後の移植時期で異なった。例えば、ＭＣＡＯの３時間後に細胞を静脈内投与し梗塞巣体積が縮小した場合（図６Ａ）、保護を受けた梗塞巣の血管組織および実質脳組織の双方でＬａｃＺ陽性細胞が観察され、治療しなければ脳梗塞に陥って非可逆的に損傷されてしまう部位へ移植細胞が遊走し、著明な神経保護効果を発揮し、本来であれば死滅してしまう神経系細胞を救ったことが示された（図６ＤおよびＧ）。ＭＣＡＯの１２時間後に自家骨髄細胞を投与した場合（図６Ｂ）、病態生理学的な特徴の点で複雑であった。虚血負荷によって高度の損傷を受けたと思われる領域には比較的多数の青色ドナー細胞が観察されたが、梗塞巣の非損傷領域に存在するドナー細胞の数はこれよりも少なかった（図６ＥおよびＨ）。上記（図６Ａ、Ｄ、Ｇ）で見られた神経保護効果とともに、神経再生効果も見られた。これに対し、ＭＣＡＯの７２時間後に自家骨髄細胞を投与した場合、虚血損傷の程度がはるかに大きく（図６Ｃ）、梗塞巣内に認められた移植細胞の数も少なかった（図６Ｆ、Ｉ）。上記（図６Ａ、Ｄ、Ｇ）で見られた神経保護効果は比較的少なく、むしろ神経再生効果が強く見られた。しかし、この群でも、骨髄細胞の移植により、ＴＴＣによるアッセイでは脳虚血巣が抑制されたことに注目すべきである。
〔実施例９〕 行動学的検査によるＭＣＦ移植治療効果確認
ＭＣＦ移植治療効果について、学習および記憶行動を評価するため、モーリスの水迷路試験、ならびに運動機能を評価するためのトレッドミル負荷試験という、２種類の行動学的検査を行なった。
モーリスの方法（Ｒ．Ｇ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｓｐａｔｉａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｄｅｐｅｎｄ ｕｐｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｃｕｅｓ，Ｌｅａｒｎ Ｍｏｔｉｖ．１２（１９８１）２３９−２６０．）を改変した水迷路試験で、脳高次機能（記憶、学習）を検討した（ｎ＝１０）。梗塞誘導から１２時間後に静脈内への自家骨髄投与またはシャム投与を行った。
本装置は直径１．３ｍの白色のスチール製タンク内に、白色テンペラ絵の具で不透明化し、２４℃に保った水を、深さ３０ｃｍとなるように満たしたものから構成される。その空間の壁には視覚的手がかりが含まれ、これは実験の間を通じて同じ位置に保たれた。訓練試行時にはすべて、タンクの四分円のうち１つに、直径８ｃｍのセラミック製円形プラットフォームを水面下２．５ｃｍの深さに置いた。訓練第１日には、各ラットを隠されたプラットフォームの上に６０秒間乗せておくことにより、単一の馴化試行を行った。ラットがプラットフォームから落ちたり飛び降りたりした場合には、水から取り上げてプラットフォームの上に戻した。四分円の探索と泳速を、天井に装着しコンピュータ追跡画像解析システムと接続したビデオカメラによって観測した。
また、トレッドミル運動負荷試験を行った。梗塞誘導から１２時間後に静脈内への自家骨髄投与またはシャム投与を行った。
ラットを週２日の頻度で１日２０分間、勾配０°としたモーター駆動式トレッドミルの上を２０ｍ／分の速度で走らせて訓練した。ラットの背面に通電グリッドが位置するように移動ベルトの上に乗せ、ベルトの動きと反対の向きに走るようにさせた。すなわち、足へのショック（強度１．０ｍＡ）を避けるために、ラットは前方に進まなければならない。弱い電気ショックを避けることを学習したラットのみを、この試験に含めた（ｎ＝１０）。モーター駆動式トレッドミル上をラットが走行しうる最大速度を記録した。
モーリス水迷路試験およびトレッドミル負荷試験で記録した行動スコアは統計学的に分析した。データは平均値±ＳＤとして表した。群間差は、個々の群の差を同定するためのＳｃｈｅｆｆｅ多重比較検定を用いるＡＮＯＶＡによって評価した。差はｐ＜０．０５の場合に統計的に有意であるとみなした。
実験の結果、どちらの試験でも行動の改善が観察された（それぞれｎ＝１０）（図７ＡおよびＢ）。通常時の観察では非移植群、移植群ともに運動障害は明らかでなかったが、トレッドミル試験では、処置したラットのモーター駆動式トレッドミル上での最大走行速度が非処置ラットよりも高いことが示された（図７Ｂ）。脳梗塞によって低下した運動機能が移植により著明に改善することが判明した。重度の運動障害は泳ぐ速度に影響する可能性があるが、本発明における軽度の運動機能不全はモーリス水迷路試験の成績の低さにはつながりにくいと考えられる。
〔実施例１０〕 ＭＲＩによる治療効果の経時的な確認
治療効果を生きたまま経時的に検討するために、ＭＲＩを用いた。この方法は、実際の臨床の現場での検査・治療で使用されているものであり、これにより得られるデータは、そのまま臨床に応用できるため、非常に価値が高い。
まず、ラットをケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）で麻酔した。各ラットを動物保持器／ＭＲＩプローブ装置に設置し、磁石内部に入れた。ラット頭部は画像化コイル内部に固定した。ＭＲＩ測定にはすべて、７テスラ、内径１８−ｃｍの超伝導磁石（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍａｇｎｅｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＢｉｏｓｐｅｃ Ｉ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続したものを用いた。０．５−ｍｍ厚の冠状切片から、視野３ｃｍ、ＴＲ＝３０００ｍｓ、ＴＥ＝３０ｍｓを用いてＴ２強調像を入手し、１２８×１２８の画像マトリックスを再構成した。
上記の脳梗塞ラットをＭＲＩで検査したところ、脳梗塞後約３時間後から、異常信号が検出された。すなわち、脳虚血領域はＭＲＩ（Ｔ２ＷＩ）でＨｉｇｈ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ａｒｅａ（ＨＩＡ）として検出された（図８上段）。この異常信号は、非治療群では、そのまま存続し（図８下段）、最終的には脳梗塞巣となった。
〔実施例１１〕 間葉系幹細胞使用による治療効果
脳梗塞の治療において、骨髄細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｒａ ｃｅｌｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＭＣＦ）の静脈内投与はかなりの治療効果を発揮したが、ＭＣＦの約０．１％程度に存在する間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）も治療に使用し、その治療効果を確認した。ＭＳＣは容易に抽出・培養・増殖・保存が可能である。
上記（図８）の脳梗塞ラットに、ＭＳＣ（１ｘ１０７個）を投与した。脳梗塞後１２時間で静脈内投与したところ、脳梗塞後にＭＲＩ検査で一旦出現した異常信号（ＨＩＡ）は（図９上段）、治療後１週間後の再検査で消失した（図９下段）。
このように、現在の医療レベルでは治療不可能な脳梗塞が、ＭＳＣの静脈内投与により、治療されたことが実証された。
〔実施例１２〕 ＭＳＣ移植細胞数と治療効果の関係
脳梗塞後１２時間後に、ＭＳＣ（１ｘ１０４〜１ｘ１０７個）を静脈内投与した。
虚血巣体積の縮小効果に対するＭＳＣおよびＭＳＣ−ｈＴＥＲＴ移植の有効性を明らかにするために、種々の濃度（１ｘ１０４〜１ｘ１０７個）の細胞を梗塞誘導から１２時間後に静脈内投与し、全実験動物の脳画像（Ｔ２強調像）をＭＣＡＯの１２時間後、および種々の濃度のＭＳＣ−ｈＴＥＲＴの静脈内投与から１週間後に再び入手した。梗塞巣サイズの初期推計値は、インビボでのＭＲＩを用いて得た。
図１０の写真の左列（Ａ１−Ｅ１）に、損傷１２時間後にラット５匹から得た単一の脳画像を示す。これらの冠状前脳切片は尾状核−被殻複合体のレベルで入手した。虚血損傷部位は高輝度領域として描出される。対側の脳組織は正常信号を呈しているため、対比が可能である。
梗塞巣体積（ｍｍ３）は、大脳全体から収集した連続画像の高輝度領域を分析することによって評価した。梗塞巣の体積推計値は実験動物の間で一定していた（２１４±２３ｍｍ３、ｎ＝２５）。
溶媒（培地）のみを投与した場合には、ＭＲＩによる評価で梗塞サイズに変化はなかった（図１０Ａ２）。梗塞巣体積は、静脈内投与するＭＳＣ−ｈＴＥＲＴの数の増加伴って縮小した。１０４個のＭＳＣ−ｈＴＥＲＴを投与した場合、梗塞巣体積がわずかに縮小し、治療効果はわずかであった（図１０Ｂ２）（１７６±２１ｍｍ３、ｎ＝５）。梗塞巣体積の縮小は、１０５個（１３８±３６ｍｍ３、ｎ＝５）、１０６個（５６±１８ｍｍ３、ｎ＝５）の投与によって増大し治療効果は明らかとなり（図１０Ｃ２、Ｄ２）、１０７個の細胞を投与した場合、梗塞巣体積が最大に縮小しほぼ完全な治療効果が期待できた（図１０Ｅ２）（２３±３１ｍｍ３、ｎ＝５）。治療前に見られた異常信号（ＨＩＡ）（図１０Ａ１，Ｂ１，Ｃ１，Ｄ１，Ｅ１）は、治療しなければそのまま存続したが（図１０Ａ２）、治療すると部分的若しくは、ほぼ完全に消失した（図１０Ｂ２，Ｃ２，Ｄ２，Ｅ２）。
別の試験において、初期のＭＳＣ（ｐｒｉｍａｒｙ ＭＳＣ）も静脈内に移植された。移植された１０６個の初期ＭＳＣによって、同じ細胞数で試験した場合のＭＳＣ−ｈＴＥＲＴのように、梗塞巣体積は等しく減少を示した（図１０Ｆ）（６１±１８ｍｍ３，ｎ＝５，ｖｓ５６±１８ｍｍ３，ｎ＝５，ｐ＝０．６９）。１０６個の皮膚線維芽細胞を用いて、追加のシャム対照実験を実施した（図１０Ｆ）。１０６個の皮膚線維芽細胞を移植したところ、梗塞巣体積の減少は見られなかった（２４０±２７ｍｍ３，ｎ＝５，ｐ＝０．９５）。
脳梗塞に対するＭＳＣ静脈内投与の治療効果は、移植細胞数に相関していた。すなわち、移植細胞数が多いほど、治療効果が高いことが判明した。
さらに組織学的にも裏付けを行なった（図１１）。
ＭＲＩ分析による病変体積の評価を終えて、細胞の投与を行う前後に、ラットに灌流処置をし、２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色して、梗塞体積に関する第２の独立した測定値を得た。正常脳組織は通常ＴＴＣによって染色されるが、梗塞病変は染色を示さないか、染色の低下を示した。細胞移植を行わずにＭＣＡＯの１週間後に行ったＴＴＣ染色の結果を図１１Ａに示す。病変側の染色は主として線条体に認められた。病変体積は、ＴＴＣ染色が低下した前脳内の領域を測定することによって算出した。ＭＲＩ分析の場合と同じく、移植細胞の数が多いほど梗塞サイズの縮小がみられた。１０７個のＭＳＣ−ｈＴＥＲＴの静脈内投与により、ＴＴＣ染色による評価で病変体積が大幅に縮小した（図１１Ｂ、Ｃ）。
〔実施例１３〕 移植ドナー細胞の集積
上記ラット脳梗塞モデルに対して、ＬａｃＺまたはＧＦＰを導入したＭＳＣ（１ｘ１０６ｃｅｌｌ）をＭＣＡＯの１２時間後に静脈内投与した。
培養細胞をリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）ですすぎ洗いし、０．１４Ｍソーレンセンリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中に４％パラホルムアルデヒドを含む４℃の固定液で１５分間かけて固定した。固定した細胞を、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５％正常ヤギ血清を含むブロッキング溶液中で１５分間インキュベートし、続いて一次抗体とインキュベートした。用いた一次抗体は、抗ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；１：１０００ウサギポリクローナル抗ＮＳＥ、Ｎｉｔｉｒｅｉ）抗体、抗グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；１：２００ウサギポリクローナル抗ＧＦＡＰ、Ｎｉｔｉｒｅｉ）抗体および抗ネスチン（ネスチン；１：５０００モノクローナルマウス抗ネスチン、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）抗体である。一次抗体の画像化には、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を有するヤギ抗マウスＩｇＧ抗体およびヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、またはアルカリホスファターゼ反応（Ｚｙｍｅｄ）を製造者の指示に従って用いた。免疫染色後に、顕微鏡用スライドに対して細胞が下側になるように、封入培地（Ｄａｋｏ）を用いてカバーガラスをかけた。Ｚｅｉｓｓ社製の免疫蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ ＦＳ）を用いて写真を撮影した。
ＦＩＴＣ蛍光色素（緑色）の励起にはアルゴンレーザーにより生じた４８８ｎｍのレーザー光を用い、ローダミン蛍光色素（赤色）にはＨｅＮｅレーザーによる５４３ｎｍのレーザー光を用いた。Ｚｅｉｓｓ社のレーザー走査共焦点顕微鏡を用い、Ｚｅｉｓｓ社製のソフトウエアを用いて共焦点画像を入手した。
図１０および１１に示すように、移植治療により梗塞巣体積は大きく縮小したが、ＧＦＰを発現するＭＳＣ−ｈＴＥＲＴは主として、線条体（非移植ラットで梗塞が最も同定された領域）に認められた。
梗塞巣側の線条体におけるＧＦＰ蛍光および透過光像を低倍率および高倍率で示した合成共焦点画像をそれぞれ図１２ＡおよびＢに示した。ＧＦＰ陽性細胞と思われる因子が多く存在することが注目される。ＧＦＰ発現細胞は主として線条体に集まっていたが、罹患半球の全域にわたって若干数が認められた。梗塞を誘導していない対側線条体から得た画像ではＧＦＰ発現は観察されなかった。これらのデータは、全身投与によって細胞が梗塞巣部位に到達したことを示唆する。
ＬａｃＺ導入ＭＳＣ−ｈＴＥＲＴを移植したラットの梗塞巣領域における未熟ニューロン（ＮｅｕＮ）およびアストロサイト（ＧＦＡＰ）を同定するために、免疫組織化学検査を行った。
結果、少数のＮｅｕＮ陽性細胞およびＧＦＡＰ陽性細胞がＬａｃＺによって同時染色された（図１２Ｇ−Ｌ）。
結果、移植ドナー細胞は、脳梗塞局所に集積した（図１２Ａ，Ｂ，Ｃ、Ｄ）。ＭＳＣはホスト脳組織内で蛍光顕微鏡下において緑に発色する。非移植群では、ドナー細胞は見られなかった（図１２Ｅ，Ｆ）。また、その一部は、神経細胞（図１２Ｇ，Ｉ，Ｋ）やグリア細胞（図１２Ｈ，Ｊ，Ｌ）に分化した。
〔実施例１４〕 物質代謝の検討によるＭＳＣ静脈内投与治療効果確認
脳梗塞に対するＭＳＣ静脈内投与の治療効果について、物質代謝の面から検討した。
詳しくは、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＭＲＳ）を用いて、細胞移植の前後の脳内でのＮＡＡおよび乳酸レベルを調べた。ＭＲＳにおけるＮＡＡシグナルは健常ニ ューロンの存在と相関し、乳酸の増加は神経細胞死と相関することが示されている（Ｂａｒｋｅｒ，Ｐ．Ｂ．，Ｇｉｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｈ．，ｖａｎ Ｚｉｊｌ，Ｐ．Ｃ．，Ｓｏｈｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｈａｎｌｅｙ，Ｄ．Ｆ．，Ａｇｉｌｄｅｒｅ，Ａ．Ｍ．，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｒｙａｎ，Ｒ．Ｎ．，Ａｃｕｔｅ ｓｔｒｏｋｅ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｏｎ ＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，１９２（３）（１９９４）７２３−３２．）。脳梗塞巣のある半球と脳梗塞巣のない半球におけるＮＡＡおよび乳酸のレベルについて、ＭＣＡＯ誘導から１２時間後にＭＲＳ分析を行った。
ＭＲＳは、ＴＲ＝１５００ｍｓｅｃ、ＴＥ＝２０ｍｓｅｃ、平均＝１０２４、ボクセルサイズ２．５×２．５×２．５ｍｍ３を用いて行った。脳の正確な位置決定は、ラット頭部をｆｌａｔ ｓｋｕｌｌ ｐｏｓｉｔｉｏｎに保持した上で、画像用切片の中心を嗅脳溝の後方５ｍｍに置くことによって行った。
その結果、脳梗塞に対するＭＳＣ静脈内投与の治療効果は、物質代謝の面からも証明された。正常の半球は最も高いレベルのＮＡＡを示し、乳酸シグナルは認められなかった（図１３Ａ、Ｄ）。その反対に、脳梗塞巣側ではＮＡＡレベルが低く、乳酸シグナルが高度であった（図１３Ａ、Ｅ）。細胞移植を行わない場合、梗塞誘導から１週間後のＮＡＡシグナルは低値であり、乳酸シグナルは高値であった（図１３Ｂ，Ｆ）。しかし、１０７個のＭＳＣ−ｈＴＥＲＴの静脈内投与後に、ＮＡＡシグナルが存在し、乳酸シグナルが低かったことから、移植処置によって脳組織が保護されたことが示唆された（ｎ＝５）（図１３Ｃ，Ｇ）。
〔実施例１５〕 行動学的検査によるＭＳＣ移植治療効果確認
梗塞誘導ラットおよび移植ラットの行動能力を評価するために、モーリス水迷路試験およびトレッドミル負荷試験という２種類の試験を行なった。行動試験は梗塞誘導を単独または細胞移植と併用して行ってから１週間後に開始した。
モーリス水迷路試験は１日おきに行った。対照ラットは数秒以内にプラットフォームの上に乗ることを学習した（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｒ．Ｇ．Ｍ．，Ｓｐａｔｉａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｄｅｐｅｎｄ ｕｐｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｃｕｅｓ．，Ｌｅａｒｎ Ｍｏｔｉｖ，１２（１９８１）２３９−２６０．）。ＭＣＡＯを行ったラットはこの試験を遂行するのに約１４０秒を要した。移植を行わなかったラットは段階的な改善を示し、試験第２６日には約４０秒でプラットフォームの上に乗った。ＭＣＡＯを誘導し、ＭＳＣ−ｈＴＥＲＴの静脈内注射を行ったラットでもプラットフォームの上に乗るまでの時間は徐々に短くなり、第２６日までには数秒でプラットフォームに乗れるようになった。その結果、移植により、著明な改善が見られた（図１４Ａ）。
トレッドミル負荷試験で、対照ラット（梗塞巣無し）のトレッドミル最大速度は約６０ｍ／分に達した。ＭＣＡＯを単独または移植と併用して１週間後のトレッドミル試験での最大速度は約３５ｍ／分であった（図１４Ｂ）。非処理ラットでは、梗塞誘導１１日後からトレッドミル速度の上昇がみられるようになり、最長２５日にわたって徐々に改善した（４６．３＋６．１、ｎ＝１０）。細胞移植群では、速度の改善の程度がさらに大きく、損傷２５日後には対照値と近くなった（６２．０＋７．２、ｎ＝１０）。脳梗塞によって低下した運動機能が移植により著明に改善することが判明した
〔実施例１６〕 重症脳梗塞へのＭＳＣの治療効果
ラット重症脳梗塞（中大脳動脈永久閉塞モデル）を用いて、ＭＳＣによる再生医療によって、どの程度障害を受けた組織を回復させることができるのか、その治療効果を検討した。上記実施例１５までに使用した中大脳動脈一過性閉塞モデルと異なり、中大脳動脈を永久に閉塞させたモデルを使用した。閉塞時間以外は上記実施例１５までに使用したモデルと同様の条件である。
ラット重症脳梗塞では、前述のラット脳梗塞モデル（中大脳動脈一時閉塞モデル：４５分間）と比較して、広範囲の脳梗塞領域が見られた（図１５、ＴＴＣ染色で白く抜ける部分）。
また、重症脳梗塞においても、脳梗塞巣に一致してＭＲＩ検査で異常信号が検出された（図１６）。さらに脳梗塞巣の異常信号（ＭＲＩでＨＩＡ）が無治療の場合、時間経過（１２時間後、３日後、７日後）とともに明瞭化した（図１７）。
ラット重症脳梗塞（ラット中大脳動脈永久閉塞モデル）に対して、ＭＳＣ（１ｘ１０６ｃｅｌｌ）を静脈内投与した。脳梗塞１週間後にＭＲＩ検査（Ｔ２ＷＩ）を行い治療効果を検討した。脳梗塞巣は白く描出される。移植時期は、脳梗塞後３時間、６時間、１２時間、２４時間、７２時間とした。結果、非治療群（最上段）では明確に認められた脳梗塞巣は、脳梗塞後３時間でＭＳＣを静脈内投与した群では、ほとんど見られなかった（図１８）。つまり重症脳梗塞においても、ＭＳＣの静脈内投与が著明な治療効果を示した。この治療効果は、移植時間が早いほど著明であったが、脳梗塞後２４時間以上を経過した時点で治療した場合でも、ある程度の治療効果が見られることは特記すべきことである。
治療効果は、神経保護効果と神経再生効果の相乗効果と考察される。脳梗塞後、早期に移植した場合ほど、神経保護効果や抗浮腫作用が強く、また、比較的遅く治療した場合には、相対的に神経保護効果が弱くなるが、そのかわり、神経再生効果が強くなる。
さらに、重症脳梗塞（ラット中大脳動脈永久閉塞モデル）に対してＭＳＣ（１×１０６ｃｅｌｌ）を静脈内投与した結果を脳梗塞領域の体積として測定し、定量化しグラフとした（図１９）。障害発生からＭＳＣ投与までの経過時間ごとに分けて結果を示した。このグラフから分かるように、未処理の場合では約５００ｍｍ３に及んでいた障害部位が、３時間後に治療の場合では２００ｍｍ３にしか及んでおらず、著明な効果が得られた。１２時間後までに治療の場合、未処理の場合と比較して、明らかに障害部位の体積が小さくなった。また、治療が早ければ早いほど、障害部位の体積が小さくなっており、予後が良好であることが分かる。
〔実施例１７〕 重症脳梗塞への超急性期のＭＳＣ静脈内投与効果
重症脳梗塞に対する超急性期のＭＳＣ静脈内投与による経時的な治療効果を検討した。
重症脳梗塞に対して、脳梗塞後３時間でＭＳＣ（１ｘ１０６ｃｅｌｌ）を静脈内投与した場合、ＭＲＩ検査で一旦出現した異常信号（ＨＩＡ）は、治療後数日でほぼ消失し、その効果が持続した（図２０）。ＭＳＣによる治療効果が、投与後、比較的早期に発揮され、その効果が継続することより、脳梗塞急性期におけるＭＳＣ静脈内投与の主な治療効果は神経保護効果と抗浮腫作用が強いと思われる。
〔実施例１８〕 重症脳梗塞への急性期のＭＳＣ静脈内投与効果
重症脳梗塞に対する急性期のＭＳＣ静脈内投与による経時的な治療効果を検討した。重症脳梗塞に対して、脳梗塞後６時間でＭＳＣ（１ｘ１０６ｃｅｌｌ）を静脈内投与した場合、治療直前にＭＲＩ検査で出現した異常信号（ＨＩＡ）は、治療後（移植治療後１８時間、１週間後、２週間後、４週間後）次第に消失した（図２１）。非治療群では、これらの治療効果は認められなかった（データなし）。
〔実施例１９〕 重症脳梗塞へのＭＳＣの静脈内投与による生存率
重症脳梗塞（ラット中大脳動脈永久閉塞モデル）に対してＭＳＣ（１×１０６ｃｅｌｌ）を静脈内投与し、障害発生後の生存率の変化を検討し、グラフとした。
このグラフから、ＭＳＣの静脈内投与による治療は、重症脳梗塞（ラット中大脳動脈永久閉塞モデル）における生存率を著明に向上させたことがわかる（図２２）。同脳梗塞モデルラットは、無治療の場合９０％が死亡したが、ＭＳＣ（１ｘ１０６ｃｅｌｌ）を脳梗塞後３時間で静脈内投与した場合、約８０％が生存した。治療開始時期が速いほど生存率が高まることが判明した。また治療後の生存率も、画期的な数値である。
〔実施例２０〕 重症脳梗塞へのＭＳＣ移植治療による臨床症状への効果
重症脳梗塞に対してＭＳＣの移植治療を行ない、臨床症状について検討した。
ＭＳＣの移植治療は、重症脳梗塞に対しても臨床症状において著明に改善した（図２３）。トレッドミル運動負荷試験では、脳梗塞によって低下した運動機能が移植により著明に改善した。
〔実施例２１〕 末梢血より得た付着培養細胞の神経幹細胞あるいは神経系細胞への分化誘導
末梢血から間葉系幹細胞のような付着培養細胞が得られた。これらの細胞は、ｇ−ＣＳＦやＳＣＦの因子を事前に皮下に注射することで、多数得られることが判明した（図２４）。
また、得られた付着培養細胞は、神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）へ分化誘導が可能であった。ＲＴ−ＰＣＲでＮｅｓｔｉｎの発現の確認も可能であった（図２５）。
さらに、得られた付着培養細胞は、神経細胞（ＮＦ陽性細胞）やグリア細胞（ＧＦＡＰ陽性細胞）への分化誘導が可能であった。また、ＲＴ−ＰＣＲで、それぞれ、ＮＦやＧＦＡＰの発現の確認も可能であった（図２６）。
下記の実施例２２〜３１は、脳梗塞発症後、比較的長時間が経過した状態において、脳実質内への遺伝子組み換え幹細胞移植が及ぼす治療効果を検討したものである。
〔実施例２２〕 細胞の調製
健康な成人ボランティアからのヒト骨髄（ＢＭ）は、インフォームド・コンセントを得た後で、後腸骨稜から吸引して得た。本試験は、札幌医科大学の院内審査委員会の承認を得た。ＢＭ単核球を１５０ｃｍ２のプラスチック製組織培養フラスコに播種して、一晩インキュベートした。浮遊細胞を洗浄後、接着細胞を１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、ロックビル、メリーランド州）を含むダルベッコ改変基本培地（ＤＭＥＭ）において５％ＣＯ２を含む湿潤大気中で３７℃で培養した。
コンフルエンスに達した後、細胞を回収し、レトロウイルスベクターＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴによる遺伝子トランスフェクションに用いた［Ｋａｗａｎｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ（ｈＴＥＲＴ）−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ １０１，５３２−５４０．］。４０集団倍加時間（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ：ＰＤ）以内のＭＳＣを本研究に用いた。
ＭＳＣの形態学的特徴は、Ｋｏｂｕｎｅら［Ｋｏｂｕｎｅ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ ａｒｅａ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３１，７１５−７２２．］が以前に記述した特徴と同じであった。成人正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ａｄ）は、タカラバイオインク（日本）から得て、上記のように１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにおいて培養した。
〔実施例２３〕 アデノウイルスベクター
ＣＡプロモーター（ニワトリβ−アクチンプロモーターと共にＣＭＶ−ＩＥエンハンサー）の制御下で、ＲＧＤ変異繊維の遺伝子と共にＡｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光蛋白質（強化ＧＦＰ：ＥＧＦＰ）のヒト化変種を有するアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＥＧＦＰ−Ｆ／ＲＧＤ）を、既に記述されているように構築した［Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｋ．ａｎｄ Ｈａｍａｄａ，Ｈ．（２００２）．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ｖｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３，６１３−６２６．、Ｄｅｈａｒｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＲＧＤ ｆｉｂｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０，７５−８５．］。
ＥＧＦＰ遺伝子断片をｐＥＧＦＰベクター（ＢＤバイオサイエンシズクロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州）から単離して、ｐＣＡｃｃベクター（ｐＣＡＥＧＦＰ）［Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｐｒｅ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ＶＥＧＦ ｉｎｄｕｃｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｍａｔｕｒｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｂｂｉｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｏｄｅｌ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ｉｎ ｐｒｅｓｓ］に挿入した。作製されたコスミドベクターｐＷＥＡｘＣＡＥＧＦＰ−Ｆ／ＲＧＤを、Ａｄ５ｄｌｘ−Ｆ／ＲＧＤからのＣｌａＩおよびＥｃｏＴ２２１−消化ＤＮＡ−ＴＰＣと共に、ヒト胎児腎２９３細胞に同時トランスフェクトした。単離されたプラークから得たアデノウイルスＥＧＦＰ発現ベクター、ＡｘＣＡＥＧＦＰ−Ｆ／ＲＧＤを、これらの細胞において増殖させて、塩化セシウム超遠心によって精製した［Ｋａｎｅｇａｅ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３，３８１６−３８２１．］。
ＣＡプロモーターの制御下で、ＲＧＤ変異繊維に関する遺伝子と共にヒト化Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲ）を有するアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＤｓＲ−Ｆ／ＲＧＤ）も、上記のように構築した。
ヒトＢＤＮＦ ｃＤＮＡは、初代培養ＭＳＣから抽出した総ＲＮＡを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いてクローニングした。このようにして得られたＢＤＮＦ ｃＤＮＡの相同性は、配列決定し、それをＧｅｎＢａｎｋ配列ＸＭ＿００６０２７と比較して確認した。ヒトＢＤＮＦプライマー配列はフォワード５′−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＡ−３′（配列番号：１）、およびリバース５′−ＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＧＴＡ−３′（配列番号：２）であった。
ＢＤＮＦ ｃＤＮＡを、ｐＣＡｃｃベクターのＥｃｏＲＩ部位とＢｇｌＩＩ部位の間に挿入して得られたプラスミドを、ｐＣＡｈＢＤＮＦと命名した。プラスミドｐＣＡｈＢＤＮＦをＣｌａＩにで消化し、ＢＤＮＦ ｃＤＮＡ発現ユニットを含む断片を、アガロースゲル電気泳動によって単離した。アデノウイルスＢＤＮＦ発現ベクターｐＷＥＡｘＣＡｈＢＤＮＦ−Ｆ／ＲＧＤは、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン、東京、日本）を用いて調製した。
上記ウイルスベクターを使用する前に、ウイルス濃度および力価を評価し、ウイルス保存液をレプリコンコンピテントウイルスの混入の可能性に関して調べた。ウイルス濃度（粒子単位（ｐｕ）／ｍｌ）を決定するために、ウイルス溶液を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中でインキュベートして、Ａ２６０を測定した［Ｎｙｂｅｒｇ−Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ．，Ｓｈａｂｒａｍ，Ｐ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｇｉｒｏｕｘ，Ｄ．ａｎｄ Ａｇｕｉｌａｒ−Ｃｏｒｄｏｖａ，Ｅ．（１９９７）．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｔｉｔｅｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ３，８０８−８１１．］。ＡｘＣＡｈＢＤＮＦ−Ｆ／ＲＧＤ、ＡｘＣＡＥＧＦＰ−Ｆ／ＲＧＤ、およびＡｘＣＡＤｓＲ−Ｆ／ＲＧＤのウイルス力価はそれぞれ、４．３５×１０１１、５．３８×１０１１および１．０３×１０１２ｐｕ／ｍｌであった。
〔実施例２４〕 アデノウイルス感染
アデノウイルス媒介による遺伝子トランスフェクションは、これまでに記述されているように実施した［Ｔｓｕｄａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＭＰ２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｆｉｂｅｒ−ｍｕｔａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ７，３５４−３６５．］。
簡単に説明すると、細胞を１５ｃｍプレートあたり２×１０６個の密度で播種した。ＭＳＣを、感染性のウイルス粒子を含むＤＭＥＭ浮遊液７．５ｍｌで３７℃６０分間曝露した。ＡｘＣＡｈＢＤＮＦ−Ｆ／ＲＧＤ、ＡｘＣＡＥＧＦＰ−Ｆ／ＲＧＤ、およびＡｘＣＡＤｓＲ−Ｆ／ＲＧＤをそれぞれ、ＭＯＩ １×１０３、４×１０３、および４×１０３ｐｕ／細胞で細胞に感染させた。次に培地を除去し、細胞をＤＭＥＭで１回洗浄してから、通常の培地で再度２４時間培養し、その後脳内移植を行った。
〔実施例２５〕 インビトロでの免疫反応性ヒトＢＤＮＦの検出と定量的分析
ＡｘＣＡｈＢＤＮＦ−Ｆ／ＲＧＤ（ＭＳＣ−ＢＤＮＦ）を、ＭＯＩ １００、３００、１０００および３０００ｐｕ／細胞でトランスフェクトしたＭＳＣはそれぞれ、０．２３０±０．１１０、０．４３４±０．１２２、０．９３１±０．１０１、および１．８６０±０．４１０ｎｇ／１０５個／４８時間の速度でＢＤＮＦを分泌した。トランスフェクトしていないＭＳＣも０．０４０７±０．００５９ｎｇ／１０５個／４８時間の速度でＢＤＮＦ蛋白質を産生した。ＭＯＩ １０００ｐｕ／細胞でトランスフェクトしたＭＳＣ−ＢＤＮＦからのＢＤＮＦ産生レベルは、非感染ＭＳＣの場合より２３倍大きかった（図２７）。
〔実施例２６〕 一過性のＭＣＡＯ動物モデルと脳内移植
本研究における動物の使用は、札幌医科大学の動物飼育使用に関する委員会の承認を得たものであり、技法は全て施設内ガイドラインに従って実施した。
ラットを３．５％ハロタンで麻酔し、顔用マスクを用いて７０％Ｎ２Ｏおよび３０％Ｏ２中で１．０％〜２．０％ハロタンによって無意識を維持した。術後は動物を熱ランプの下に置いて体温を３７℃に維持した。雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（各２５０〜３００ｇ）の局所的脳虚血は、血管内中心脳動脈閉鎖［Ｔａｍｕｒａ，Ａ．，Ｇｏｔｏｈ，Ｏ．ａｎｄ Ｓａｎｏ，Ｋ．（１９８６）．［Ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ：Ｉ．Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｏｄｅｌ］．Ｎｏ Ｔｏ Ｓｈｉｎｋｅｉ ３８，７４７−７５１．］によって誘導した。右総頚動脈の動脈切開部の中にシリコンコーティングしたチップを備えた５−０単フィラメントナイロン縫合糸を通して、内頚動脈の中を頚動脈分岐から約１８ｍｍ遠位の点まで徐々に挿入した。一過性の閉鎖を実施して９０分後、ナイロン糸を引き抜き脳の血流を回復させた。
ドナーＭＳＣの脳内移植は、Ｇｏｔｏら［Ｇｏｔｏ，Ｓ．，Ｙａｍａｄａ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｏｋａｍｕｒａ，Ａ．ａｎｄ Ｕｓｈｉｏ，Ｙ．（１９９７）．ＧＡＢＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｉａｔｏｎｉｇｒａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｆｅｔａｌ ｓｔｒｉａｔａｌ ｐｒｉｍｏｒｄｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎｅｄ ｓｔｒｉａｔｕｍ．Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １４７，５０３−５０９．］によって記述される方法に従って実施した。
下記の行動学試験によって虚血性脳損傷の誘導を確認後、動物を移植のためにランダム化した。動物はケタミン（２．７〜３ｍｇ／１００ｇ）およびキシラジン（０．３６〜０．４ｍｇ／１００ｇ）の腹腔内（ＩＰ）注射によって麻酔して、ナリシゲ定位固定フレーム（モデルＳＲ−６Ｎ、ナリシゲ社、日本）の中に入れた。２６ゲージハミルトンシリンジを用いて、ＭＳＣ ５×１０５個の血清不含ＤＭＥＭ浮遊液５μｌを頭蓋表面の４ｍｍ下で前頂レベルに対して３ｍ外側の右後外側線条体に２．５分かけて注射した［Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．，Ｐｅｎｎｉｓｉ，Ｍ．ａｎｄ Ｔｏｐｐｌｅ，Ａ．（１９８５）．Ｂｒｅｇｍａ，ｌａｍｂｄａ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｕｒａｌ ｍｉｄｐｏｉｎｔ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ｗｉｔｈ ｒａｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｅｘ，ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３，１３９−１４３．］。この位置はほぼ虚血境界域であった。ヒトＭＳＣ移植体の拒絶を防止するために、ラットにシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ毎日）を腹腔内投与した。
〔実施例２７〕 ＭＳＣ−ＢＤＮＦの治療効果（実験１）
実験１は、ＭＣＡＯの１４日後にＭＳＣ−ＢＤＮＦの治療的有効性を試験するために行った。実験群には以下が含まれた。
１群（対照）：ＤＭＥＭをＭＣＡＯの２４時間後に虚血境界域に注射したラット（ｎ＝７）、
２群：線維芽細胞をＭＣＡＯの２４時間後に虚血境界域に移植したラット（ＮＨＤＦ−Ａｄ）（ｎ＝６）、
３群：ＭＳＣをＭＣＡＯの２４時間後に虚血境界域に移植したラット（ｎ＝７）、および
４群：ＭＳＣ−ＢＤＮＦをＭＣＡＯの２４時間後に虚血境界域に移植したラット（ｎ＝７）。
ＬＰＴはＭＣＡＯの１、８、および１５日後に行い、トレッドミル試験はＭＣＡＯの８および１５日後に行った。ＭＲＩは２、７、および１４日後に行った。
（１）脚プレースメント（ｐｌａｃｅｍｅｎｔ）試験（ＬＰＴ）（図２８Ａ）
ＬＰＴには、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎと共同研究者［Ｏｈｌｓｓｏｎ，Ａ．Ｌ．ａｎｄ Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｂ．Ｂ．（１９９５）．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｓｔｒｏｋｅ ２６，６４４−６４９．］によって記述される小試験８個が含まれ、これらを虚血２４時間後に行った。
簡単に説明すると、ラットの四肢をカウンター上面の上部と端部とを用いて評価した。各小試験に関して、動物が脚を載せることができなければスコア０、部分的および／または遅れて（２秒より遅れて）脚を載せた場合には１、そして動物が直ちにそして正しく脚を載せた場合には２を与えた。
結果、ＭＣＡＯ前の神経学的スコアは全ての動物において類似であった。ＭＣＡＯ１日後で、脳内ＭＳＣ注射前の四つの虚血群における脚プレースメントスコアに統計学的な差は認められなかった。ＭＣＡＯの８日後、ＭＳＣ−ＢＤＮＦを投与したラットは、対照のＤＭＥＭラット（３．７１±０．４９、Ｐ＝０．０００１）および線維芽細胞を投与したラット（５．００±１．１０、Ｐ＝０．００３）と比較して、有意に高い脚プレースメントスコア（８．４３±１．５２）に達した。ＭＣＡＯの１５日後、ＭＳＣ−ＢＤＮＦを投与したラットのスコアは、９．１４±２．６１であり、これはＤＭＥＭ群において認められたスコアより有意に高かった（５．００±１．７３、Ｐ＝０．０２４）。一方、ＭＣＳを投与したラットは、８日目および１５日目においても、ＤＭＥＭまたは線維芽細胞を投与した対照ラットより高いスコアに達しなかった。
（２）トレッドミル試験（図２８Ｂ）
トレッドミル試験では、ラットを加速するトレッドミル（モデルＭＫ−６８０、室町機械、日本）に載せた［Ｍｏｋｒｙ，Ｊ．（１９９５）．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｔｅｓｔｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｓ ４４，１４３−１５０．］。ラットに、最大速度が７０ｍ／ｓで、１０秒間に１０ｍ／ｓずつ徐々に速度が増加するベルト上を走らせ、中央位置を維持する運動を行わせた。ラットが走ることができなくなった場合は試行を正式に終了した。各動物が走ることができる最大速度を測定した。ラットはＭＣＡＯの８日および１５日後に試験した。
その結果、ＭＣＡＯ前のトレッドミルの平均速度は各群で同等であった。ＭＣＡＯの８日後、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ群のラットは、対照ＤＭＥＭ（９．５７±５．６ｍ／ｓ；Ｐ＝０．００１）および線維芽細胞処理（１１．８±６．２ｍ／ｓ；Ｐ＝０．０１７）群の動物と比較して有意に速い速度に達した（２３．４±２．６ｍ／ｓ）。これらの差は１５日目でも維持され、、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ、対照ＤＭＥＭ、および対照線維芽細胞群の速度はそれぞれ、３６．６±９．５、１２．１±９．４（Ｐ＝０．００２）、および１５．８±１１．３（Ｐ＝０．０２３）であった。ＭＳＣ処理ラットは、８日または１５日での回復の増強を示さなかった。
（３）ＭＲＩによるＭＳＣ−ＢＤＮＦ処理後の梗塞体積の減少（図２９Ａおよび２９Ｂ）
ＭＲＩは、ＭＣＡＯ２、７、および１４日後に全ての動物について実施した。動物をＭＲＩの前に麻酔した。ＭＲＩ装置は、ＵＮＩＴＹＩＮＯＶＡコンソール（オックスフォードインスツルメンツ、イギリス、およびバリアンインク、パロアルト、カリフォルニア州）にインターフェイスで接続した７Ｔ、口径１８ｃｍの超伝導磁石で構成された。造影中は、動物を同じ位置に固定した。マルチスライスＴ２強調スピンエコーＭＲ画像（ＴＲ ３０００ｍｓｅｃ、ＴＥ ４０ｍｓｅｃ、撮像領域４０×３０ｍｍ、スライスの厚さ２ｍｍ、ギャップなし）を得た。
虚血領域の配置は、造影ソフトウェア（シオンイメージ、バージョンβ４．０．２、シオン社）を用いてＴ２強調画像から脳半球病変体積（％ＨＬＶ）を計算して評価した。各切片の虚血組織に印をして、切片の厚さ（２ｍｍ／切片）を考慮に入れて梗塞体積を計算した。梗塞体積の過大評価を防止するために、Ｎｅｕｍａｎｎ−Ｈａｅｆｅｌｉｎら［Ｎｅｕｍａｎｎ−Ｈａｅｆｅｌｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｓｅｒｉａｌ ＭＲＩ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｒａｔｓ：ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ，ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｄａｍａｇｅ，ａｎｄ ｅｄｅｍａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｔｒｏｋｅ ３１，１９６５−１９７２；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １９７２−１９６３．］に記述されるように、補正梗塞体積またはＣＩＶを以下のように計算した。
ＣＩＶ＝（ＬＴ−（ＲＴ−ＲＩ））×ｄ
式中ＬＴは、左半球の面積（ｍｍ２で表す）であり、ＲＴは右半球の面積（ｍｍ２で表す）、ＲＩは梗塞面積（ｍｍ２で表す）、およびｄは切片の厚さ（２ｍｍ）である。相対梗塞体積（％ＨＬＶ）は右脳半球体積の百分率として表記した。
その結果、Ｔ２強調画像での過剰強度領域を中心のＭＲ画像６個に合計して、病変体積を反対側の半球体積の百分率（％ＨＬＶ）として表記した。全ての群において、％ＨＬＶは、２日目から１４日目まで減少した。ＭＣＡＯの２日後、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ（３５．０±４．８％）、ＤＭＥＭ（３８．７±４．９％）、線維芽細胞（３７．９±３．８％）、およびＭＳＣ（３７．８±２．８％）群の％ＨＬＶに有意差は認められなかったが、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ群では％ＨＬＶはこれらの他の群と比較していくぶん減少した。
一方、ＭＣＡＯの７日後、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ群のラットの％ＨＬＶ（２５．４±２．８％）は、対照群のＤＭＥＭ（３２．８±４．９％；Ｐ＝０．００２）、対照線維芽細胞処置（３１．６±２．２％；Ｐ＝０．０１５）、および対照ＭＳＣ処置（３０．８±４．３％；Ｐ＝０．０２８）群のラットと比較して有意に減少した。１４日後、％ＨＬＶはＭＳＣ−ＢＤＮＦ群（２３．７±３．２％）群のラットではＤＭＥＭ対照（２９．６±３．６％；Ｐ＝０．０１１）と比較して有意に減少した。ＭＳＣ処理ラットは、７日（３０．８±４．３％）または１４日（２６．２±２．９％）のいずれにおいても、対照ＤＭＥＭおよび線維芽細胞群と比較して％ＨＬＶの如何なる有意な回復も示さなかった。
〔実施例２８〕 インビボＢＤＮＦ産生レベル（実験２；図３０）
実験２では、増殖因子を以下の動物群において測定した。
１群（対照）：正常ラット（ｎ＝３）、
２群（対照）：ＤＭＥＭを注射したラット（ｎ＝３）、
３群：ＭＳＣを注射したラット（ｎ＝３）、および
４群：ＭＣＡＯの２４時間後に虚血境界域にＭＳＣ−ＢＤＮＦを注射したラット。
ＭＣＡＯの７日後にラットを屠殺して、局所脳組織におけるＢＤＮＦの濃度を測定した。
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、本発明者らは、ＭＣＡＯの７日後の局所脳組織におけるＢＤＮＦレベルを調べた。
ＭＳＣをインビトロで様々なＭＯＩ（ｐｕ／細胞）でトランスフェクトした４８時間後、培養上清を分析用に採取した。さらに、ＭＣＡＯの７日後、ラットをケタミン（４．４〜８ｍｇ／１００ｇ）およびキシラジン（１．３ｍｇ／１００ｇ）の腹腔内投与によって麻酔して、脳を摘出し、虚血半球の前頂の−１．０〜１．０ｍｍまでの冠状断面（２００ｍｇ）を氷中で解剖して使用するまで−８０℃で保存した。その後、各組織試料を等重量のホモジネート緩衝液（１ｍｌ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、１％ＮＰ４０、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、０．５ｍＭバナジン酸ナトリウム）に浮遊させて、ダウンスホモジナイザーによってホモジナイズした。ホモジネートを４℃で１０分間遠心して（１０，０００ｇ）、上清（５μｇ／μｌ）を分析のために回収した。市販のＢＤＮＦ ＥＬＩＳＡキット（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて、各試料（１試料あたり３個ずつ）のＢＤＮＦの濃度を定量した。
その結果、ＢＤＮＦレベルは、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ移植ラット（４５．２±１４．８ｐｇ／ｍｇ蛋白質）の虚血半球では、ＤＭＥＭ（１２．５±１．９ｐｇ／ｍｇ蛋白質；Ｐ＝０．０００２）、またはＭＳＣ（１９．３±５．５ｐｇ／ｍｇ蛋白質；Ｐ＝０．０００６）を注射したラットと比較して有意に増加した。ＢＤＮＦレベルはまた、ＭＳＣ処理ラットの虚血半球では、ＤＭＥＭ処理ラット（Ｐ＝０．０１２４）と比較して有意に増加した。
〔実施例２９〕 ＭＳＣ−ＢＤＮＦ処置動物における核ＤＮＡ断片化（実験３Ａ、Ｂ；図３１）
実験３Ａは、虚血７日後に脳細胞のＤＮＡ断片化の程度を評価するために行った。実験群は、上記実験２に記述した群と同じものを使用した。ラットをＭＣＡＯの７日後に屠殺して、脳組織をＴＵＮＥＬ染色によって評価した。
ＭＣＡＯの７日後、ラットを麻酔して、まずリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で頭蓋内還流後に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳ溶液によって頭蓋内を還流した。脳を摘出して、４％ＰＦＡのＰＢＳ溶液に２日間浸漬し、低温層にて−２０℃で３０μｍ凍結切片（冠状座標前頂−１．０〜１．０ｍｍ）を切り出した。虚血境界域における細胞のＤＮＡ断片化は、インサイチューアポトーシス検出キット（タカラバイオメディカルズ、滋賀、日本）によって、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）法を用いて検出した［Ｇａｖｒｉｅｌｉ，Ｙ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｙ．ａｎｄ Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎ，Ｓ．Ａ．（１９９２）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｓｉｔｕ ｖｉａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１９，４９３−５０１．］。つまりプロテアーゼ消化後、切片をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよびフルオレセインイソチオシアネート標識ｄＵＴＰ（緑色）を含む混合物中でインキュベートした。切片を、赤色に染色するＰＩ（ヨウ化プロピジウム）で対比染色した。ＡｘＣＡＤｓＲ−Ｆ／ＲＧＤをトランスフェクトしたＭＳＣは、これらの切片では赤色に染色された。陽性の赤色細胞の総数を、内部境界域の３つの１×１ｍｍ２領域において計数した［Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ａｂｅ，Ｋ．ａｎｄ Ｉｔｏｙａｍａ，Ｙ．（１９９８）．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｄａｍａｇｅ ｂｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １８，８８７−８９５．］。
ビブラトームを用いて調製した１００ミクロンの切片を、３％ＢＳＡおよび０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで希釈した一次抗体と共に、４℃で一晩インキュベートした。本研究において用いた一次抗体は以下の通りであった：抗ニューロン核抗原（ＮｅｕＮ：ｍＡｂ３７７；ケミコン社、テメキュラ、カリフォルニア州）および抗グリア原線維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ：Ｇ３８９３シグマ社）抗体。ＰＢＳ中ですすいだ後、切片を蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：Ａ−１１０３２、モレキュラープローブス社）と共に室温で１時間インキュベートした。
結果、ＭＳＣ−ＢＤＮＦを注射した動物では、ＭＣＡＯの７日後に、ＤＭＥＭ注射群と比較して虚血境界域でのＴＵＮＥＬ陽性細胞（緑色）の数が有意に少なかった（それぞれ、２７５±７３対５５．０±４１．０；Ｐ＝０．０１３）。一方、これらの細胞は、ＭＳＣを注射した動物ではＤＭＥＭを注射した動物より有意に多かった（１７３．０±６４．９対５５．０±４１．０；Ｐ＝０．２０）（図３１Ａ、Ｂ、およびＣ）。
実験３Ｂでは、７日目でのＤＮＡ断片化を、対照動物（１群；ｎ＝３）と共にＭＳＣ−ＤｓＲ（２群；ｎ＝３）またはＭＳＣ−ＢＤＮＦ−ＤｓＲ（３群；ｎ＝３）を移植した動物において調べた。
注射部位の２ｍｍ未満内に多くのＤｓＲ陽性ＭＣＳが検出された。移植したＭＳＣのＴＵＮＥＬ陽性細胞は、注射部位において、ＭＳＣ群と比較してＭＳＣ−ＢＥＮＦを処置した動物では減少した（図３１Ｄ）。その上、ＭＳＣ近傍のＴＵＮＥＬ陽性細胞は、注射部位においてＭＳＣ群と比較してＭＳＣ−ＢＤＮＦ処理動物では減少した。
〔実施例３０〕 ＭＳＣ表現型（実験４；図３２）
実験４は、７日目の細胞形態を調べるために実施した。実験群には、ＤＭＥＭ（１群；ｎ＝３）を注射した対照ラット、ＭＳＣ−ＥＧＦＰを移植したラット（２群；ｎ＝３）、およびＭＳＣ−ＢＤＮＦ−ＥＧＦＰを移植したラット（３群；ｎ＝３）が含まれた。ラットをＭＣＡＯの７日後に屠殺して、脳組織を形態学的に評価した。
虚血領域におけるＭＳＣがニューロンの表現型を呈するか否かを調べるために、ＭＣＡＯの７日後に形態学的に調べた。移植したＭＳＣのいくつかは、ニューロンマーカーＮｅｕＮおよび星状細胞マーカーＧＦＡＰに対して免疫陽性であった。繊維様突起を示す細胞もあったが、丸い形状を示す細胞も認められた。移植したＭＳＣ−ＢＤＮＦは、ＭＳＣと類似の特徴を示した。
〔実施例３１〕 データ分析
上記実施例２２〜３１までに示すデータは、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表記した。脚のプレースメントおよびトレッドミル試験によるデータは、一元配置ＡＮＯＶＡを用いた後に、ゲームス・ハウウェル後ｈｏｃ試験を用いて分析した。ＨＬＶデータは、一元配置ＡＮＯＶＡの後にテュキーのＨＳＤ後ｈｏｃ試験を用いて行った。各群のＥＬＩＳＡデータをスチューデントのｔ検定を用いて比較した。各群のＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を、一元配置ＡＮＯＶＡの後にＳｃｈｅｆｆｅの後ｈｏｃ検定を用いて比較した。Ｐ値が＜０．０５であれば有意とした。
下記の実施例３２〜４４は、脳腫瘍に対する遺伝子組み換え幹細胞移植が及ぼす治療効果を検討したものである。
〔実施例３２〕 細胞株の確立
９Ｌラット神経膠腫細胞株（Ｆｉｓｈｅｒ ３４４系ラットと同系）および正常ラット腎（ＮＲＫ）細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、インビトロジェン−ライフテクノロジーズインク、グランドアイランド、ニューヨーク州、アメリカ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇストレプトマイシン、および５０単位／ｍｌペニシリンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ−アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）において維持した。９Ｌ細胞を生物学的に標識するために、ＣＭＶプロモーターの制御下でヒト化Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄ２）をコードするｐＤｓＲ２−Ｎ１プラスミドを、ＢＤバイオサイエンシズクロンテック社（パロアルト、カリフォルニア州、アメリカ）から購入した。ＤＮＡ １μｇ：ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ（ジーンセラピーシステムズインク、サンジエゴ、カリフォルニア州、アメリカ）試薬２．５μｌの比で調製したＤＮＡ複合体を用いて、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲによって、５０〜６０％コンフルエンスの細胞にｐＤｓＲ２−Ｎ１をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社、フランクリンレークス、ニュージャージー州、アメリカ）でＤｓＲｅｄ２−陽性細胞を単離して、トランスフェクションの７２時間後に選別を繰り返してさらに精製した。単離されたＤｓＲｅｄ２陽性９Ｌ細胞を１０％ＦＢＳおよび１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（インビトロジェン−ライフテクノロジーズ）を添加したＤＭＥＭにおいて１４日間選択して、安定な細胞株（９Ｌ−ＤｓＲ）を確立した。
〔実施例３３〕 ＭＳＣ調製
ＭＳＣは、既に記述されているとおりに骨髄から調製した（Ｔｓｕｄａ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＭＰ２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｆｉｂｅｒ−ｍｕｔａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３；７：３５４−３６５．）。
簡単に説明すると、Ｆｉｓｃｈｅｒ ３４４系ラット（９週齢、雄性）を頚部脱臼によって屠殺し、軟組織から大腿骨および脛骨を切り離し、骨鉗子で骨端を除去した。大腿骨および脛骨の中央骨幹骨髄組織を、通常の培地（１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシン−Ｂ、および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したＤＭＥＭ）の中に洗い流した。大きさが次第に小さくなる針（それぞれ１８、２０、２２ゲージ）を通して骨髄をシリンジの中に連続的に引き入れて単細胞浮遊液を得た。初代培養ＭＳＣを通常の培地に密度５×１０７個／１０ｃｍ培養皿で播種した。非接着細胞を除去するために、初回培養後４日目に培地を新しい通常培地に交換した。ＭＳＣは、消費された培地を４日間隔で新鮮な培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
〔実施例３４〕 アデノウイルスベクターとインビボ遺伝子形質導入
ヒトＩＬ−２をコードする改変繊維を有するアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡｈＩＬ２−Ｆ／ＲＧＤ）は、既に記述されている（Ｄｅｈａｒｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＲＧＤ ｆｉｂｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００３；１０：７５−８５．）。ＣＡプロモーター（ニワトリβ−アクチンプロモーターと共にＣＭＶ−ＩＥエンハンサー）の制御下で、ＲＧＤ−変異繊維と共にＡｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光蛋白質（強化ＧＦＰ：ＥＧＦＰ）のヒト化変種を有するアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＥＧＦＰ−Ｆ／ＲＧＤ）は、既に記述されているとおりに構築した（Ｄｅｈａｒｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＲＧＤ ｆｉｂｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００３；１０：７５−８５．、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ，Ｓａｔｏ Ｋ，Ｈａｍａｄａ Ｈ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ｖｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００２；１３：６１３−６２６．）。
ＥＧＦＰ遺伝子断片を、ｐＥＧＦＰベクター（ＢＤバイオサイエンシズ・クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州、アメリカ）から単離して、ｐＣＡｃｃベクター（Ｙａｍａｕｃｈｉ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ＶＥＧＦ ｉｎｄｕｃｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｍａｔｕｒｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｂｂｉｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｏｄｅｌ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００３；５：９９４−１００４．）（ｐＣＡＥＧＦＰ）に挿入した。ＥＧＦＰ遺伝子を含む発現カセットは、ＣｌａＩによる制限酵素消化によって単離して、コスミドベクターｐＬのＣｌａＩ部位に挿入した。このように生成されたコスミドベクターｐＬＥＧＦＰを、Ａｄ５ｄｌｘ−Ｆ／ＲＧＤからのＣｌａＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉ消化ＤＮＡ−ＴＰＣと共に、ヒト胎児腎２９３細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクトした２９３細胞から発生したプラークを単離して、ウイルスゲノムの制限酵素消化によって評価した。単離されたプラークから得たＲＧＤ繊維を有するアデノウイルスＥＧＦＰ発現ベクター、ＡｘＣＡＥＧＦＰ−Ｆ／ＲＧＤを、２９３細胞において増殖させた。アデノウイルスベクターは全て、２９３細胞において増殖させて、塩化セシウム超遠心法によって精製した。精製後、ウイルスを１０％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に対して透析して、−８０℃で保存した。ウイルス力価は、Ａ２６０ｎｍでの分光光度測定によって粒子単位（ｐｕ）に関して決定した（Ｄｅｈａｒｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＲＧＤ ｆｉｂｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００３；１０：７５−８５．）。
初代培養ＭＳＣのエクスビボアデノウイルス遺伝子形質導入は、既に記述されている（Ｔｓｕｄａ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＭＰ２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｆｉｂｅｒ−ｍｕｔａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３；７：３５４−３６５．）。
簡単に説明すると、アデノウイルス感染の１日前にＭＳＣ ５×１０５個を１０ｃｍ培養皿に播種した。細胞を、ＡｘＣＡＥＧＦＰ−Ｆ／ｗｔまたはＡｘＣＡｈＩＬ２−Ｆ／ＲＧＤのいずれか１０００ｐｕ／細胞を含む保存ウイルス溶液５ｍｌと共に、３７℃で５％ＣＯ２において１時間インキュベートすることによって感染させた。感染後、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）によって２回洗浄し、通常の培地１０ｍｌを加えた。
〔実施例３５〕 初代培養ラットＭＳＣの特性について
本発明者らは、フローサイトメトリーによってラット初代培養ＭＳＣ上の表面抗原を分析した。
初代培養ＭＳＣの表現型分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社）によって行った。簡単に説明すると、細胞を０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで２回洗浄した。細胞を抗ラットＣＤ７３（ＳＨ３）、ＣＤ４５、またはＣＤ１１ｂ／ｃ（ファーミンゲン社、サンジエゴ、カリフォルニア州、アメリカ）モノクローナル抗体によって標識後、二次抗体としてフルオレセインイソチオシアネートを結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（イムノテック社、マルセイユ、フランス）によって標識した。アイソタイプをマッチさせた対照として、マウスＩｇＧ１（イムノテック社）またはマウスＩｇＧ２ａ標識細胞を分析した。
その結果、培養したラットＭＳＣは、ＣＤ７３抗原陽性であった（図３３ｂ）。この抗原は、ヒトＭＳＣ上での典型的な間葉表面抗原の一つであると報告されている（Ｋｏｂｕｎｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ ａｒｅａ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２００３；３１：７１５−７２２．）。
造血細胞（ＣＤ４５またはＣＤ１１／ｂ）のコンタミネーションは、本発明者らのＭＳＣ培養では検出されなかった（図３３ｃ、ｅ）。
〔実施例３６〕 ＭＳＣのインビトロにおける間葉系への分化能
同様に本発明者らは、ラットＭＳＣの典型的な間葉系列への分化についても調べた。
ラット初代培養ＭＳＣまたは遺伝子改変ＭＳＣの典型的な間葉系列へのインビトロ分化能の評価は、これまでに記述されているように（Ｔｓｕｄａ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＭＰ２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｆｉｂｅｒ−ｍｕｔａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３；７：３５４−３６５．、Ｋｏｂｕｎｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ ａｒｅａ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２００３；３１：７１５−７２２．）実施した。
簡単に説明すると、ＭＳＣは、８０μｇ／ｍｌビタミンＣホスフェート（和光純薬、大阪、日本）、１０ｍＭ β−グリセロホスフェートナトリウム（カルビオケム社、サンジエゴ、カリフォルニア州、アメリカ）および１０−７Ｍデキサメタゾン（シグマ−アルドリッチ社）を添加した骨形成性分化培地、または０．５μＭヒドロコルチゾン、５００μＭイソブチルメチルキサンチン、および６０μＭインドメタシンを添加した脂肪形成性分化培地によって処理した。分化培地は、２１日目まで３日毎に交換した。
骨形成性の分化を確認するために、細胞を１０％ホルマリンによって１０分間固定後、５％硝酸銀（シグマ−アルドリッチ社）で１５分染色して、無機質の沈着（フォン・コッサ染色）を検出した。
脂肪細胞形成性の分化を検出するために、１０％ホルマリンによって１５分間固定し、細胞培養物における脂肪小滴の形成を、新しく調製したオイルレッドＯ溶液（オイルレッドＯの０．５％イソプロパノール保存溶液３に対し、蒸留水２の混合物）によって染色した。
結果、本発明者らの培養ラットＭＳＣは、骨細胞系列（図３３ｆ）および脂肪細胞系列（図３３ｈ）に分化できた。初代培養ＭＳＣの、骨形成性および脂肪細胞形成性分化能は、アデノウイルスベクターによるＩＬ−２遺伝子改変によって影響を受けなかった（図３３ｇおよび図３３ｉ）。
〔実施例３７〕 インビトロで９Ｌ細胞の増殖に及ぼすＭＳＣの影響
インビボで脳腫瘍へのＭＳＣの投与が、腫瘍の増殖に対して何らかの影響を及ぼすか否かは明確にされていない。しかしＭＳＣは、線維芽細胞増殖因子（ＧＦＧ）のようなサイトカインおよび腫瘍の増殖を支持しうる他の腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）を産生できることが知られている（Ｔｉｌｌｅ ＪＣ，Ｐｅｐｐｅｒ ＭＳ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００２；２８０：１７９−１９１．）。従って本発明者らは、まずインビトロで９Ｌ神経膠腫細胞の増殖に及ぼすＭＳＣの共培養の影響について評価した。
本発明者らは、Ｄｓ−Ｒｅｄ２（ヒト化Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ赤色蛍光蛋白質）−標識９Ｌ細胞（９Ｌ−ＤｓＲ）（５×１０４個／ウェル）を、６ウェルプレートにおいて単独、またはＭＳＣ（５×１０３個／ウェル）または正常ラット腎（ＮＲＫ）細胞（５×１０３個／ウェル）と共に７２時間培養した。その後に、細胞をトリプシン処理して計数した。９Ｌ−ＤｓＲ細胞数は、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）を用いて決定した。
その結果、図３４ａに示すように、９Ｌ細胞の増殖は、ＭＳＣ（２４．５±１．９％阻害）との共培養ではＮＲＫ細胞（１７．４±１．９％阻害、ｐ＜０．０１）との共培養より有意に大きい程度に阻害された。
ＭＳＣから放出される可溶性因子が９Ｌ細胞の増殖に及ぼす影響を評価するために、本発明者らは、２チャンバー培養系を利用した。
ＭＳＣまたはＮＲＫ細胞をトランスウェルインサート（孔径０．４μｍ、コスター、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、アメリカ）に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにおいて、１×１０５個／トランスウェルの密度で播種した。９Ｌ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにおいて５×１０３個／ウェルの密度でウェルに播種した。共培養物を７２時間インキュベートして、細胞を直接計数して共培養系における増殖を直接決定した。データは全て、以下のように計算される％阻害として表記する。
％増殖阻害＝［１−（ＭＳＣまたはＮＲＫ細胞と共培養した９Ｌ−ＤｓＲ細胞数／単独で培養した９Ｌ−ＤｓＲ細胞数）］×１００。
その結果、図３４ｂに示すように、９Ｌ細胞の有意な増殖抑制は、異なるチャンバーで培養したＭＳＣによって影響を受けたが、ＮＲＫ細胞による影響は受けなかった（それぞれ９．８±３．１％および１．８±１．２％、Ｐ＜０．０１）。
これらの結果は、インビトロでは可溶性因子によって媒介される９Ｌ神経膠腫細胞に対して、ＭＳＣ自身はダイレクトな抗腫瘍効果を有することを示している。
〔実施例３８〕 インビトロでのＭＳＣの遊走能
本発明者らは、インビトロでの神経膠腫細胞に対するＭＳＣの遊走特性を評価した。
細胞遊走アッセイは、２つのチャンバーを有する培養皿、トランスウェル（コスター）を用いて行った。細胞を１２５Ｉ−デオキシウリジン（１２５Ｕ−ＩＵＤＲ、アマシャムバイオサイエンシズ社、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州、アメリカ）によって代謝的に標識した。
簡単に説明すると、細胞１×１０５個／ｍｌを０．１μＣｉ／ｍｌ１２５Ｉ−ＩＵＤＲを含む培地において２４時間培養した。次に、細胞をＤＭＥＭで３回洗浄して、同じ培地に再度浮遊させた。１２５Ｉ−ＩＵＤＲ標識細胞（５×１０４個）を孔径８μｍの上部チャンバーに入れ、９Ｌ細胞を下部チャンバーに入れた。トランスウェルを３７℃、５％ＣＯ２において２４時間放置した後、下部チャンバー中の細胞を１Ｎ ＮａＯＨによって溶解した。細胞溶解物における放射活性をガンマカウンターによって評価した。細胞遊走アッセイの結果は、百分率（総細胞数分の下部チャンバーの細胞数（％））として表記した。
その結果、ＭＳＣまたはＮＲＫ細胞はいずれも自発的に遊走しないが、いずれの細胞も、下部チャンバーに９Ｌ細胞を加えることによって、自発的に遊走するように刺激を受けた（図３４ｃ）。遊走活性は、９Ｌ細胞数を増加させるにつれて用量依存的に増加した。ＭＳＣはＮＲＫ細胞より有意に大きい遊走能を有することが判明した（ｐ＜０．０１）。
〔実施例３９〕 移植ＭＳＣの遊走と腫瘍向性
ＭＳＣのインビトロにおける遊走能は既に確立されたことから、本発明者らは、移植したＭＳＣが、インビボで正常な脳実質の中を頭蓋内神経膠腫に向かって遊走するか否かを調べた。
ＭＳＣの頭蓋内分布について評価するために、９Ｌ−ＤｓＲ神経膠腫細胞４×１０４個を右基底神経膠腫に頭蓋内に接種し、その腫瘍の接種３日後にＥＧＦＰ（強化緑色蛍光蛋白質）−標識ＭＳＣ（ＭＳＣ−ＥＧＦＰ）４×１０５個を神経膠腫内または反対側脳半球のいずれかに直接注射した。腫瘍接種の１４日後、深部麻酔下でラット脳をＰＢＳで潅流後に４％パラホルムアルデヒドによって潅流した。摘出した脳を４％パラホルムアルデヒドによって一晩後固定後、３０％ショ糖を含むＰＢＳにおいて４８時間平衡にした。固定した脳をＯＴＣ化合物（マイルスインク、エルクハート、インジアナ州、アメリカ）に抱埋して、液体窒素において瞬間凍結し、−７０℃で保存した。組織を厚さ２０μｍの凍結切片にして、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ−Ｅ）によって染色、または抗ＧＦＰモノクローナル抗体（ＢＤサイエンシズクロンテック社）によって免疫組織化学的に染色した。第一の抗体によって染色した切片をベクターラボラトリーズ（バーリンガム、カリフォルニア州、アメリカ）のベクタステインキットを用いて可視化した。造影は、ツァイス−パスカル顕微鏡（カール・ツァイスインク、ソーンウッド、ニューヨーク州、アメリカ）によって行った。
その結果、図３５ａおよび３５ｃに示すように、９Ｌ細胞を接種した全てのラットにおいて、ヘマトキシリンによって強く染色される大きい神経膠腫塊を認め、これは右半球を占有して、正中線の左半球方向へのシフトを引き起こした。遺伝子標識ＭＳＣは、ほとんどが腫瘍と正常な実質との境界部に認められたが、腫瘍内注射後では比較的均一に腫瘍床にも浸潤した（図３５ｂ）。ＭＳＣは、遠位の脳実質または反対側脳半球には遊走しなかった。
共焦点レーザー顕微鏡により、ＥＧＦＰ−陽性ＭＳＣの蓄積が判明したが、そのほとんどが、ＤｓＲｅｄ陽性腫瘍の端部でその紡錘状の形状を保持していた（図３５ｅ）。ＭＳＣは、主な腫瘍から広がった神経膠腫細胞と一致して存在した（図３５ｇ）。一方、反対側脳半球に接種したＭＳＣは、脳梁に沿って最初の注射部位から神経膠腫細胞へと遊走した（図３５ｄ）。これらのＭＳＣのほとんどが、脳梁およびそれに隣接する腫瘍の端部に留まっていた（図３５ｈ）。さらに、腫瘍へのＭＳＣの浸潤を認めた。頭蓋内移植後のこれらのＭＳＣの優れた遊走能および神経膠腫向性が確認されたことから、次の段階では、実験的神経膠腫を治療するための治療的遺伝子改変細胞を調製した。
〔実施例４０〕 遺伝子改変ＭＳＣによるヒトＩＬ−２産生
９Ｌ神経膠腫細胞に対するＩＬ−２の抗腫瘍効果は、ラットモデルにおいて十分に確立されていることから（Ｒｈｉｎｅｓ ＬＤ ｅｔ ａｌ．Ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ２００３；５２：８７２−８７９；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ８７９−８８０．、Ｉｗａｄａｔｅ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：８７６９−８７７４．）、治療用遺伝子としてヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）を選択した。
ヒトＩＬ−２形質導入ＭＳＣ（ＭＳＣ−ＩＬ２）は、既に記述されているように改変アデノウイルスベクターによる感染によって調製した（Ｔｓｕｄａ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＭＰ２ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｆｉｂｅｒ−ｍｕｔａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３；７：３５４−３６５．）。ラット初代培養ＭＳＣは、アデノウイルス受容体、コクサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の発現レベルが低いために、野生型アデノウイルス感染に対して比較的抵抗性であることから、この繊維変異体ベクターを用いた。
ヒトＩＬ−２遺伝子を形質導入したＭＳＣからのヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生を測定するために、ＭＳＣをアデノウイルス感染の１２時間前に、２４ウェルプレートにおいて１０４個／ウェルの密度で１試料あたり３ウェルずつ播種した。次に、細胞をＡｘＣＡｈＩＬ２−Ｆ／ＲＧＤに感染させて、７２時間インキュベートした。培養上清におけるヒトＩＬ−２濃度を、ＥＬＩＳＡ（ＩＬ−２イムノアッセイキット；Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州、アメリカ）によって測定した。
その結果、本発明者らのこれまでの知見と一致して、ＡｘＣＡｈＩＬ２−Ｆ／ＲＧＤの比較的低濃度を感染させたＭＳＣの上清において、高レベルのｈＩＬ−２を検出した（３００および１０００粒子単位／細胞でそれぞれ、８．６±０．５および２４．０±１．７ｎｇ／ｍｌ／１０４細胞／７２時間）。この高レベルｈＩＬ−２産生は、アデノウイルス濃度を増加させると用量依存的にさらに増加した。
〔実施例４１〕 ＩＬ−２遺伝子形質導入ＭＳＣを移植した神経膠腫担癌ラットの延命
ＭＳＣ−ＩＬ２がインビボで治療利益を提供できるか否かについて、本発明者らは検討した。
雄性Ｆｉｓｈｅｒ ３４４系ラット（７〜８週齢、２００〜２４０ｇ）を日本ＳＬＣインク（浜松、日本）から購入した。動物を麻酔して定位装置に入れた（ナリシゲ科学機器研究所、東京、日本）。適当な位置に穿頭した（前頂の１ｍｍ後方で正中線の３ｍｍ右）。２６−ゲージ針を硬膜から４ｍｍ腹側に挿入して、ここに９Ｌ腫瘍細胞のＰＢＳ浮遊液５μｌを１０μｌマイクロシリンジ（ハミルトン社、リノ、ネバダ州、アメリカ）を用いて接種した。そして９Ｌ細胞４×１０４個をＭＳＣまたはＩＬ−２形質導入（ＡｘＣＡｈＩＬ２−Ｆ／ＲＧＤ １０００ｐｕ／細胞を感染させた）ＭＳＣ（ＭＳＣ−ＩＬ２）４×１０５個のＰＢＳ浮遊液５μｌと混合してから、上記のように細胞浮遊液を頭蓋内に注射した（図３５ａ）。９Ｌ細胞を非改変ＭＳＣまたはＥＧＦＰ遺伝子改変ＭＳＣ（ＭＳＣ−ＥＧＦＰ）のいずれかと共に注射した結果も同様に評価した。
その結果、９Ｌ神経膠腫細胞およびＭＳＣ−ＩＬ２を共に注射したラットの生存（２６．３±２．２日、Ｐ＝０．０００３対９Ｌ単独、Ｐ＝０．０００８対ＭＳＣ、Ｐ＝０．０００７対ＭＳＣ−ＥＧＦＰ）は、９Ｌ単独、または９Ｌ細胞を非改変ＭＳＣもしくはＭＳＣ−ＥＧＦＰと共に注射した対照と比較して有意に長かった（１７．１±１．１、２２．０±０．８、２１．３±１．５日）。９Ｌ細胞を非改変ＭＳＣ（２２．０±０．８日、Ｐ＝０．０００３）またはＭＳＣ−ＥＧＦＰ（２１．３±１．５日、Ｐ＝０．０００３）と共に注射したラット群はいずれも、対照と比較して有意な延命を示したが、ＭＳＣとＭＳＣ−ＥＧＦＰ群の生存に差を認めなかった（Ｐ＝０．５８８１）。
ＭＳＣのＩＬ−２遺伝子改変は、ＭＳＣおよび９Ｌ神経膠腫細胞を共に注射したラットの生存にさらなる治療利益を付与したが、遺伝子改変そのものは生存に対して影響を及ぼさなかった。
ＭＳＣ−ＩＬ２の治療利益はまた、神経膠腫担癌ラットの治療モデルにおいても確認された。本発明者らは、９Ｌ神経膠腫細胞４×１０４個を移植した。その後、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＩＬ２ ４×１０５個のＰＢＳ浮遊液５μｌを腫瘍接種後３日目に腫瘍内移植した（図３６ｂ）。
ＭＳＣ−ＩＬ２の腫瘍内接種は、対照（１７．１±１．１日）と比較して９Ｌ神経膠腫担癌ラットの生存を有意に延長した（２７．７±１．１日、Ｐ＝０．０００２対９Ｌ単独）。ＭＳＣ−ＥＧＦＰを注射した神経膠腫担癌ラットの平均生存日数（２３．２±０．８日）は、ＭＳＣ−ＩＬ２を注射したラット（Ｐ＝０．００２４）より有意に短かったが、それでも前者は無処置対照より長く生存した（Ｐ＝０．０００６）。
〔実施例４２〕 ＭＲＩによって評価したインビボ腫瘍増殖に及ぼす遺伝子改変ＭＳＣの影響
ＭＳＣ−ＩＬ２またはＭＳＣの注射後に認められた延命が、腫瘍の増殖阻害に関連しているか否かを評価した。本発明者らは、頭蓋内の腫瘍体積を推定するために、全ての動物について７日毎に磁気共鳴造影（ＭＲＩ）を行った。
動物をケタミン（２．７〜３ｍｇ／１００ｇ）およびキシラジン（０．３６〜０．４ｍｇ／１００ｇ）の腹腔内注射によって麻酔した。次に、動物にＧｄ−ＤＴＰＡ（０．８〜１．０ｍｇ／ｋｇ、マグネビスト、シェーリング日本、東京、日本）０．２ｍｌを注射して、ＵＮＩＴＹＩＮＯＶＡコンソール（オックスフォードインスツルメンツＫＫ、東京、日本）にインターフェースで接続した７Ｔ、口径１８ｃｍの超伝導磁石によって、冠状Ｔ１強調スピンエコー画像（ＴＲ ５００ｍｓｅｃ、ＴＥ １０ｍｓｅｃ、撮像領域５０×５０ｍｍ、スライスの厚さ１．５ｍｍ、ギャップなし）を得た。腫瘍体積（ｍｍ３）は、それぞれのＭＲ−画像領域のＧｄ−ＤＴＰＡ強化部分に撮像の厚さをかけた和として計算した。ＭＲＩ上での推定される腫瘍体積は、造影試験の直後に得た実際の腫瘍重量と比例相関を有する（Ｎａｍｂａ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｂｅａｒｉｎｇ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｙ ｓｅｒｉａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９６；７：１８４７−１８５２．）。
結果、９Ｌ神経膠腫は、脳の冠状断面におけるＴ１強調造影によって強化領域として明確に認識された（図３７）。表１および図３７に示すように、９Ｌ神経膠腫の進行性の増殖は、無処置ラットの脳において認められ、腫瘍接種後１４日で致死体積に達した。表１は、ＭＲＩにより計測した９Ｌ神経膠腫体積（ｍｍ３）である。

上記表１中の、記号ｂは腫瘍接種後の日数を指し、記号ｃは未試験であることを表す。記号†はｐ＜０．０１ｖｓ．９Ｌ単独、記号‡はｐ＜０．０１ｖｓ．ＭＳＣを表す。
対照的にＭＳＣ−ＩＬ２またはＭＳＣで処理した動物の脳の腫瘍体積は、有意に小さかった（腫瘍接種後１４日での無処置対照と比較してＰ＜０．０１）。１４日目では、非改変ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＩＬ２で処理した群の腫瘍体積に有意差を認めなかった。しかし、ＩＬ−２遺伝子改変による治療効果は、腫瘍接種後２１日にＭＲＩで明らかに認識された。この時、非改変ＭＳＣで処理した動物における神経膠腫は、ほぼ致死体積に達していたが、ＭＳＣ−ＩＬ２で治療した場合は腫瘍は小さいままであった。これらの認められた腫瘍体積の変化は、異なる治療群における生存期間と一致した。
〔実施例４３〕 ＭＳＣ−ＩＬ２の移植は神経膠腫へのリンパ球浸潤を誘導する
本発明者らは、ＭＳＣ−ＩＬ２の９Ｌ神経膠腫への移植がインビボで免疫学的反応を誘発できるか否かを評価した。
ＭＳＣ−ＩＬ２の処理後に神経膠腫へのＣＤ４またはＣＤ８陽性細胞浸潤を検出するために、９Ｌ−ＤｓＲ細胞４×１０４個を移植し、ＭＳＣ−ＥＧＦＰまたはＭＳＣ−ＩＬ２ ４×１０５個を腫瘍接種の３日後に腫瘍内に注射した。腫瘍接種の７日後にラットを屠殺して、摘出した脳をパラフィンに抱埋した。厚さ６μｍの脳標本を抗ラットＣＤ４（クローンＷ３／２５、セロテックインク、オックスフォード、イギリス）、または抗ラットＣＤ８（クローンＯＸ−８、セロテックインク）モノクローナル抗体によって免疫組織化学的に染色して、ベクタステインＡＢＣキット（ベクターラボラトリーズ）によって可視化した。
ＭＳＣ処理９Ｌ神経膠腫のＨＥ染色の組織学分析を行ったところ、ＩＬ２遺伝子改変ＭＳＣで処理した９Ｌ神経膠腫において大量の単核球浸潤を認めた（図３８ｃ、ｄ）。対照的に、非改変ＭＳＣを移植した神経膠腫では、炎症性細胞の浸潤は最小であった（図３８ａ、ｂ）。非改変ＭＳＣを移植した腫瘍の標本には、ＣＤ４およびＣＤ８細胞の浸潤をほとんど認めなかった（図３８ｅ、ｇ）。これとは明らかに対照的に、ＩＬ−２遺伝子改変ＭＳＣを接種した腫瘍では、ＣＤ４−およびＣＤ８−陽性リンパ球の浸潤が検出された（図３８ｆ、ｈ）。
〔実施例４４〕 統計分析
上記実施例３２〜４３までに記載した細胞増殖アッセイおよび遊走アッセイに関する統計分析は、スチューデントのｔ検定によって行った。７日および１４日での腫瘍体積評価に関するＳｃｈｅｆｆｅ検定、および２１日目にスチューデントｔ検定を行った。スチューデントｔ検定およびＳｃｈｅｆｆｅ検定において、Ｐ値が０．０５未満であれば有意であると見なした。生存に関する統計分析は、対数順位検定によって行った。
〔実施例４５〕ＢＤＮＦ以外のサイトカイン遺伝子導入ＭＳＣ
（１）サイトカイン産生能力
ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）遺伝子以外の遺伝子、例えば、ＧＤＮＦ（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ＣＮＴＦ（ｃｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ＮＴ３（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３）遺伝子をＭＳＣに導入し、培養した細胞のＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＮＴ３の産生について検討した。
その結果を図３９に示す。ＡｘＣＡｈＢＤＮＦ−Ｆ／ＲＧＤ（ＭＳＣ−ＢＤＮＦ）をＭＯＩ １００、３００、１０００または３０００ｐｕ／ｃｅｌｌにてトランスフェクトしたＭＳＣは、ＢＤＮＦをそれぞれ０．２３０±０．１１０、０．４３４±０．１２２、０．９３１±０．１０１および１．８６０±０．４１ｎｇ／１０５個ｃｅｌｌ／４８時間の速度で分泌した。非トランスフェクトＭＳＣもＢＤＮＦを産生した（０．０４０７±０．００５９ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／４８時間）。
ＧＤＮＦに関しては、ＡｘＣＡｈＧＤＮＦ−Ｆ／ＲＧＤ（ＭＳＣ−ＧＤＮＦ）をＭＯＩ ３００、１０００または３０００ｐｕ／ｃｅｌｌにてトランスフェクトしたＭＳＣは、ＧＤＮＦをそれぞれ１．０５±０．２０、２．２６±０．４１および４．１５±０．５４ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／４８時間の速度で分泌した。非トランスフェクトＭＳＣもＧＤＮＦタンパク質を産生した（０．０４４±０．０３４ｎｇ／１０５個ｃｅｌｌ／４８時間）。
ＣＮＴＦに関しては、ＡｘＣＡｈＣＮＴ−Ｆ／ＲＧＤ（ＭＳＣ−ＣＮＴＦ）をＭＯＩ ３００、１０００または３００ｐｕ／ｃｅｌｌにてトランスフェクトしたＭＳＣは、ＣＮＴＦを０．１３６±０．０２８、０．８５４±０．１４５、３．５８±０．４３ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／４８時間の速度で分泌した。非トランスフェクトＭＳＣもＣＮＴＦタンパク質を産生した（０．０５２０±０．０１５０ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／４８時間）。
また、ＮＴ３に関しては、ＡｘＣＡｈＮＴ３−Ｆ／ＲＧＤ（ＭＳＣ−ＮＴ３）をＭＯＩ ３００、１０００または３０００ｐｕ／ｃｅｌｌにてトランスフェクトしたＭＳＣは、ＮＴ３をそれぞれ２．６７±０．０９、４．２４±０．１６および６．８８±０．０７ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／４８時間の速度で分泌した。非トランスフェクトＭＳＣもＮＴ３タンパク質を産生した（０．１２±０．００１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／４８時間）。
（２）脳虚血により誘発される神経学的障害評価
ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ３遺伝子をＭＳＣに導入した細胞を、上記実施例と同様の方法にて、脳梗塞局所へ移植し、脚プレースメント試験を行った。脚プレースメント試験は上記実施例２７（１）の記載と同様にして実施した。脚プレースメントに関する障害は以下の尺度を用いて評価した。０：重度の神経学的障害、１６：神経学的障害なし。脚プレースメント試験は、ＭＣＡＯの１、８、および１５日後に行なった。
その結果を図４０に示す。ＭＣＡＯの１日後（ただしＭＳＣ脳内注射の前）では、脚プレースメントスコアに関して４つの虚血群の間に統計学的な差はみられなかった。ＭＣＡＯの８日後には、ＭＳＣ−ＢＤＮＦおよびＭＳＣ−ＧＤＮＦを投与したラットでは、脚プレースメントスコアがＤＭＥＭラットと比較して有意に高かった（いずれもＰ＜０．０５）。ＭＣＡＯの１５日後には、ＭＳＣ−ＢＤＮＦおよびＭＳＣ−ＧＤＮＦを投与したラットのスコアは、ＤＭＥＭ群で認められた値よりも有意に高かった（いずれもＰ＜０．０５）。
これに対して、ＭＳＣ−ＣＮＴＦおよびＭＳＣ−ＮＴ３を投与したラットでは、第８日および第１５日のいずれの時点でも、ＤＭＥＭを投与した対照ラットを上回るスコアは得られなかった。
（３）ＭＲＩによるＭＳＣ−ＢＤＮＦおよびＭＳＣ−ＧＤＮＦ処理後の梗塞体積の減少
ＭＲＩは、ＭＣＡＯの２、７、および１４日後に全ての動物について実施した。実施手順および評価は上記実施例２７（３）と同様の方法にて行った。
その結果、ＭＣＡＯの７日後に、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ群およびＭＳＣ−ＧＤＮＦ群のラットでは、対照ＤＭＥＭ群のラットと比較してＨＬＶの有意な低下がみられた（いずれもＰ＜０．０５）。１４日後の時点でも同様に、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ群およびＭＳＣ−ＧＤＮＦ群のラットでは、ＤＭＥＭ対照と比較してＨＬＶの有意な低下がみられた。ＭＳＣ−ＣＮＴＦまたはＭＳＣ−ＮＴ３を投与したラットでは、対照ＤＭＥＭ群およびＭＳＣ−ＥＧＦＰ群と比較して、７日後および１４日後のいずれの時点でもＨＬＶの有意な回復は認められなかった（いずれもＰ＜０．０５）。結果を図４１に示す。
また、ＤＭＥＭ、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ、ＭＳＣ−ＧＤＮＦ、ＭＳＣ−ＣＮＴＦまたはＭＳＣ−ＮＴ３を投与したラットにおける、ＭＣＡＯの２日後および７日後に得た代表的なＴ２強調（Ｔ２Ｗ）画像を図４２に示す。ＭＳＣ−ＢＤＮＦ群およびＭＳＣ−ＧＤＮＦ群では、第７日の時点で、他の群と比較して虚血損傷体積の減少が検出された。
〔実施例４６〕ＭＳＣ−ＢＤＮＦ細胞の静脈内投与
ＭＳＣにＢＤＮＦ遺伝子を導入した細胞（１０７個）は上記実施例に従って調製した。上記実施例１６に記載のラット重症脳梗塞（中大脳動脈永久閉塞モデル）において脳梗塞作成後、上記細胞を１２時間後に左大静脈内に投与した。
治療効果を生きたまま経時的に検討するために、ＭＲＩを用いた。ＭＣＡＯの２４時間後、７２時間後、７日後の未処理群（対照）、ＭＳＣ投与群、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ投与群の脳梗塞巣が観察された（図４３）。
また、ＭＣＡＯの６時間後、２４時間後、７２時間後、７日後の未処理群（対照）、ＭＳＣ投与群、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ投与群の脳梗塞体積を計算し検討した（図４４）
さらに、ＭＣＡＯの２４時間後、７２時間後、７日後の未処理群（対照）、ＭＳＣ投与群、ＭＳＣ−ＢＤＮＦ投与群のトレッドミル試験を行い、運動回復について検討した（図４５）。
いずれの結果も、ＭＳＣ単独よりも、ＢＤＮＦ遺伝子を導入したＭＳＣの方が、治療効果が高いことが分った。
〔実施例４７〕ＭＳＣ−ＰＬＧＦ細胞の静脈内投与
ＢＤＮＦ遺伝子の代わりにＰＬＧＦ（ＰＬＧＦ：Ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）をＭＳＣに導入した。ＭＳＣ−ＰＬＧＦ細胞（１０７個）を、上記実施例１６に記載のラット重症脳梗塞（中大脳動脈永久閉塞モデル）において脳梗塞作成後、３時間後に左大静脈内に投与した。
ＭＣＡＯの３時間後、２４時間後、３日後、７日後の未処理群（対照）およびＭＳＣ−ＰＬＧＦ投与群についてＭＲＩにより、脳梗塞巣を観察した（図４６）。ＤＷ２（ｂ＝１０００）画像およびＴ２ＷＩ画像で比較した。
また、ＭＣＡＯ後に出現した異常信号を示す体積をＭＲＩ検査で時間の経過とともに定量した。結果、ＤＷＩ画像の場合はＭＣＡＯの２４時間後、Ｔ２ＷＩ画像の場合はＭＣＡＯの３日後から減少し始めた（図４７）。
さらに、ＭＣＡＯの７日後に、未処理群（対照）およびＭＳＣ−ＰＬＧＦ投与群の脳組織をＴＴＣ染色し脳梗塞体積を比較した（図４８）。
いずれの結果もＰＬＧＦ遺伝子を導入したＭＳＣの方が治療効果が高いことが分かった。
〔実施例４８〕脳梗塞モデルへのＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ遺伝子注入による血管新生効果
ラット脳梗塞モデル（中大脳動脈一時閉塞モデル：４５分間）の脳梗塞巣に対して、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ遺伝子を直接注入した。
Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ遺伝子の導入には、ベクターとしてアデノウイルスを使用した。
毛細血管を、ＦＩＴＣデキストランやＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅで視覚化し、血管新生について評価した。
正常なラットの血管系をＥｖａｎｓ ＢｌｕｅおよびＦＩＴＣデキストランで視覚化したものを図４９に示す。
遺伝子注入処理をしたＭＣＡＯモデルラットと、遺伝子注入処理をしていないＭＣＡＯモデルラットの血管形成誘導についてＦＩＴＣで視覚的に比較した（図５０）。またＦＩＴＣで同側／対側（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ／ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）を定量化した（図５１）。
さらに、遺伝子注入処理をしたＭＣＡＯモデルラットと、遺伝子注入処理をしていないＭＣＡＯモデルラットの血管形成誘導についてＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅで視覚的に比較した（図５２）。
結果として、著明な血管新生が認められた。脳梗塞は血管が閉塞する病気であるため、血管新生と組み合わせることで著明な治療効果が期待できる。
〔実施例４９〕脳梗塞後慢性期におけるＭＳＣの局所投与
上記実施例１６に記載のラット重症脳梗塞（中大脳動脈永久閉塞モデル）を用いて、脳梗塞後慢性期にＭＳＣを局所投与し、その治療効果を検討した。詳細には、ＭＣＡＯ後、２週間後に１ｘ１０４個のＭＳＣを脳梗塞局所に移植した。ＭＳＣ投与の１日後、１４日後、２８日後、４２日後にトレッドミル試験を行い、運動機能の回復についてＭＳＣ未処理群（対照）と比較した。その結果、運動機能の改善が見られた。結果を図５３に示す。
急性期に移植した場合と比較して、治療効果はかなり落ちたが、それでも、治療効果が認められた。急性期に治療できた方が効果は高いため、できるだけ急性期の治療を試みるのが望ましいが、実際の臨床では、既に脳梗塞になってしまった患者のニーズも高いため、慢性期の患者の治療にも有効であると考えられる。
従って、本発明の薬剤は、急性期の脳神経疾患患者へ使用することが好ましいが、必ずしも急性期に限定されず、例えば、慢性期の患者であっても、本発明の薬剤は有効である。
産業上の利用の可能性
本発明者らは間葉系細胞（間葉系幹細胞）、特に骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞を利用して、以下のような極めて大きな特徴を有する再生医療を行なうことができるという所見を得た。すなわち、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞を利用した再生治療では、従来は治療が事実上不可能であった神経系の損傷に対して、患者由来の骨髄細胞を体内に注射・点滴などで体内投与（例えば、静脈内投与）するだけで、その損傷部位を再生させることができ、障害を治癒させることができるということである。特に、脳梗塞については厳密な有効性の検証がなされた。更には、脳梗塞、脳出血、及び脊椎損傷などによる、神経系の損傷、心筋梗塞、クモ膜下出血を含む脳卒中、中枢性及び末梢性の脱髄疾患、中枢性及び末梢性の変性疾患、脳腫瘍、痴呆を含む高次機能障害、精神疾患、てんかん、頭部外傷や脳挫傷や脊髄損傷を含む外傷性の神経系疾患、炎症性疾患、及びヤコブ病を含む脳細胞損傷性の感染性疾患等、あらゆる神経系疾患に対してもこの治療は有効であると考えられる。そのような治療は、所定の専門的な治療施設においても、さらには一般的な治療現場（一般病院、救急搬送中、もしくは発症現場）においても行なうことができる。従来治療ができなかった障害を治癒させることができる点、及びそれが静脈内投与などの簡単な処置のよって可能である点を考えてみても、これがいかに画期的な治療法であるのかということがわかる。しかも、神経系の損傷は患者に重大な障害をもたらすものであるため、障害の治癒により患者が得られる恩恵は極めて大きく、ひいては社会的な意義も大きい。
本発明によって得られた再生医療の医学的な作用機序は、移植された骨髄細胞や間葉系幹細胞が患部（生体内損傷部位）まで遊走した上でそこに定着し、適切な物質を分泌したり、もともと備わっている自然治癒を促進したり、または、適切な細胞に分化して、その患部の機能を回復することによるものであると考えられる。このため、神経系の損傷を伴う、あらゆる種類の疾患や事故に効果が得られるものと考えられる。
【配列表】


【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】



【図３０】




【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系細胞を有効成分として含む、脳神経疾患治療のための体内投与用薬剤。
【請求項２】
脳神経疾患が脳梗塞である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
間葉系細胞を有効成分として含む、脳神経保護効果を有する体内投与用薬剤。
【請求項４】
間葉系細胞を有効成分として含む、脳神経再生効果を有する体内投与用薬剤。
【請求項５】
体内投与が静脈内投与である、請求項１〜４のいずれかに記載の薬剤。
【請求項６】
間葉系細胞が、
（ａ）ＢＤＮＦ遺伝子、ＰＬＧＦ遺伝子、ＧＤＮＦ遺伝子、もしくはＩＬ−２遺伝子が導入された間葉系細胞、または
（ｂ）ｈＴＥＲＴ遺伝子が導入され不死化した間葉系細胞、
である、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
間葉系細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
間葉系細胞が骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項９】
患者へ治療上有効量の請求項１〜８のいずれかに記載の薬剤を体内投与することを含む、脳神経疾患の治療方法。
【請求項１０】
骨髄細胞が患者の自家細胞である、請求項９に記載の治療方法。
【請求項１１】
脳神経疾患が脳梗塞である、請求項９または１０に記載の治療方法。
【請求項１２】
体内投与が静脈内投与である、請求項９〜１１のいずれかに記載の治療方法。
【請求項１３】
間葉系細胞が骨髄細胞、臍帯血細胞、または末梢血細胞である、請求項９〜１２のいずれかに記載の治療方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００７１７６
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【発行日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１１８１１（Ｐ２００５−５１１８１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９３８６
【国際出願日】平成１６年６月２５日（２００４．６．２５）
【出願人】（５０２４５５３９３）株式会社レノメディクス研究所 (5)
【出願人】（３９９１０６１９２）三井住友海上火災保険株式会社 (19)
【出願人】（０００００２９９０）あすか製薬株式会社 (39)
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】

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