電気化学尿素センサおよびその製造方法
試料中の尿素を検出するための電気化学センサは、酵素層および外側拡散層を含む複合膜を含む。外側拡散層は、酵素層と分析試料との間に配置され、酵素層と分析試料との直接の接触を防ぐ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年２月１１日出願の米国特許出願第１０／３６４，８４０号明細書の一部継続出願であり、その開示は本明細書で参照することにより援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、電気化学センサ、詳しくは、分析試料中の尿素を測定するセンサの分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
研究者および医師はしばしば生体試料中のさまざまな被分析物の濃度を測定する必要がある。これらの被分析物としては、溶解ガス（二酸化炭素）、イオン（例えば水素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リチウム、アンモニウム、およびマグネシウム）、および生物活性分子（例えば尿素）が挙げられる。多くの場合、生体試料は、外来診療中または手術を受けている間の患者から取られた体液（例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、および／または尿）である。適切な診断および治療はしばしば、これらの測定の精度およびそれらが得られる速度によって決まる。
【０００４】
電気化学センサシステムが、生体試料中の被分析物の濃度を測定するために使用されうる分析ツールである。電気化学センサは、少なくとも１つの半透過性膜によって分析試料から分離される、金属電極などの物理的変換器を含む。分析試料中の生体代謝産物（例えば、糖質、ペプチド、脂質、ヌクレオチド、または尿素など）を検出および／または測定する酵素センサは、半透過性膜を覆う酵素層を含む。酵素層は、目的とする被分析物と反応し、半透過性膜を通じて移動し、電極によって検出されうる化学副産物を生成する少なくとも１つの酵素を含有する。酵素センサの例が尿素センサであるが、これは、尿素を加水分解してアンモニウムイオンを形成するウレアーゼなどの酵素を含有しうる。
【０００５】
既存の尿素センサは、他のタイプのセンサ（例えば、イオンセンサ）と比べ一般に寿命が短い。これは、既存の尿素センサの酵素層が分析試料と直接接触しており、これにより膜の酵素および他の成分が試料および／または試料中の汚染物質へ浸出し、酵素層における酵素を分解または破壊することによる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要約
本発明は、酵素層が試料と直接接触しない尿素センサを提供し、これにより試料中の尿素濃度の複数の連続した測定が可能となる。また、本発明の尿素センサは小型化に適しており、センサカードの全体的な寿命を損なうことがなく、複数被分析物の連続長期分析用に使用される他の小型化電気化学センサを含むセンサカードへ組込まれうる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一般に、一態様において、本発明は、電極と、酵素層と、外側拡散層とを含む試料中の尿素を検出するためのセンサである。外側拡散層は尿素に対して透過性であり、酵素層と試料との間に配置されている。外側拡散層は、酵素層と試料との直接の接触を防ぐことによって、酵素の分解および／または損失を阻止し、それによって尿素センサの寿命を延長する。尿素センサは、例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、および／または尿試料の尿素濃度を測定するために使用されうる。
【０００８】
本発明の本態様の実施形態は以下の特徴を含みうる。電極は、銀／塩化銀電極などの金属電極でありうる。酵素層は、尿素のアンモニウムイオンへの加水分解を触媒するウレアーゼなどの酵素を含有しうる。酵素層は、例えば、ポリペプチド（例えば、グルタチオン）および不活性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）などの１つもしくはそれ以上の酵素安定剤をも含有しうる。特定の実施形態において、酵素層は、グルタチオンに架橋結合されたウレアーゼを含む。他の実施形態において、酵素層は、ウレアーゼおよびグルタチオンの少なくとも１つに架橋結合されたウシ血清アルブミンなどの１つもしくはそれ以上の不活性タンパク質を含む。外側拡散層は、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）イオノマー、ポリ−（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ塩化ビニル、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、水酸化ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、酢酸セルロース、およびそれらの混合物などのポリマーを含みうる。
【０００９】
一部の実施形態において、尿素センサは、電極と酵素層との間に配置されたイオン選択膜をさらに含む。例えば、イオン選択膜は、アンモニウム選択イオノフォアが配置されたポリマーマトリクスなどのアンモニウムイオン選択膜であってもよい。ポリマーマトリクスは、例えば、ポリ塩化ビニル、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、水酸化ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（メチルメタクリレート）、シリコーンゴム、およびそれらの混合物を含みうる。適切なアンモニウムイオン選択イオノフォアの例としては、ノナクチン、モナクチン、ジナクチン、トリナクチン、テトラナクチン、ナラシン、ヘキサオキサヘプタシクロトリトリアコンタン、ベンゾクラウンエーテル、環状デプシペプチド、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００１０】
別の態様において、本発明は、基板の中または上に配置された上記の１つもしくはそれ以上のセンサを含むセンサカードである。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は上記のセンサを形成するための方法を提供する。１つの方法では、この方法は、電極を用意するステップと、電極の少なくとも１つの表面に酵素層を塗布するステップと、酵素層上に外側拡散層を塗布するステップとを含む。別の方法では、この方法は、電極を用意するステップと、電極の少なくとも１つの表面にイオン選択膜を塗布するステップと、イオン選択膜に酵素層を塗布するステップと、酵素層上に外側拡散層を塗布するステップとを含む。
【００１２】
本発明の前記および他の目的、態様、特徴、および利点は、以下の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１３】
図面の簡単な説明
図面において、同じ参照文字は一般に異なる図面の全体を通じて同じ部分を指す。また、図面は必ずしも縮尺どおりではなく、一般に本発明の原理の説明に重点が置かれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
説明
本発明による電気化学センサは電気化学センサシステムに組込むことができる。図１を参照すると、本発明による一実施形態において、電気化学センサシステム１は、生体試料が電気化学センサシステム１へ導入される注入口２を有する。蠕動ポンプ４が、体液試料などの試料を注入口２を通じて電極カード６へ移動させる。電極カード６は、試料中の対象の被分析物を検出および測定する１つもしくはそれ以上の電極８を含有する。電気的インターフェース１０は電極カード６をマイクロプロセッサ１２に接続する。電極カード６からの信号がマイクロプロセッサ１２に移動し、信号の保存および表示を可能にする。マイクロプロセッサ１２からの信号が電極カード６に移動し、電極の分極電圧などの測定条件の制御を可能にする。本発明による一実施形態において、試料注入口２および電極カード６は使い捨てカートリッジ１３内に含まれており、これは電気化学センサシステム１の他の要素から使用後に取外され、交換されうる。
【００１５】
図２を参照すると、本発明による一実施形態において、電極カード６は、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）で作られた硬質の実質的に長方形のカードを含む。チャネル２０が電極カード６内に配置されており、それを通じて生体試料または基準溶液が流れうる。１つもしくはそれ以上の電極８をチャネル２０内に埋込むことができる。試料が電極カード６を通過すると、試料はチャネル２０を通じて電極８を越えて流れ、対象の被分析物の検出および／または測定を可能にする。
【００１６】
図２を参照すると、電極カード６へ組込まれうる電極８は、イオン選択電極（ＩＳＥ）１００、溶解ガスを分析するための電極（ガス電極）、および酵素ベースの検出システムを使用する電極（酵素電極）を含む。例えば、電極はナトリウム２６、カルシウム２８、カリウム３０、ｐＨ３２、リチウム３４、マグネシウム３６、アンモニウム３８、二酸化炭素４０、および尿素４２を検出しうる。
【００１７】
図３を参照すると、本発明による一実施形態において、ＩＳＥ１００は、金属要素１０５、内側溶液層１１０、およびポリマー膜１１５を含む。金属要素１０５は電極カード６のＰＶＣに埋込まれており、内側溶液層１１０は金属要素１０５の露出端を覆う。内側溶液層１１０は、例えば、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファーを含有しうる。ポリマー膜１１５は、電極カード６のチャネル２０を通過する分析試料（例えば、体液試料）から内側溶液層１１０を分離するイオン選択膜である。ポリマー膜１１５の組成は、特定のイオンに対するＩＳＥ１００の選択性を決定する。本発明による特定の実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨがポリマー膜１１５の成分である。
【００１８】
再び図２を参照すると、分析試料中のイオンの濃度を測定するには、ＩＳＥ１００は基準電極４４と並行して作動しなければならない。ＩＳＥ１００が検出するように意図されているイオンが分析試料中に存在する場合は、図３に示されている内側溶液層１１０における被分析物の濃度と分析試料中のその濃度との差に依存する電位が、ポリマー膜１１５に発生する。ＩＳＥ１００と基準電極４４との間の電位差は、分析試料中の測定イオンの濃度の対数の変化に直接比例している。
【００１９】
図４を参照すると、本発明による一実施形態において、ガス電極の１つのタイプである二酸化炭素（ＣＯ２）電極４０は、金属要素１２５、内側溶液層１３０、およびポリマー膜１３５を含む。ＣＯ２電極４０は、ＣＯ２電極４０の内側溶液層１３０が重炭酸バッファーであることを除いて、機能的にＩＳＥ１００とほぼ同じである。図２を参照すると、ＩＳＥ１００とは異なり、ＣＯ２電極４０はｐＨ電極３２と並行して作動しなければならない。
【００２０】
再び図４を参照すると、ＣＯ２はＣＯ２電極４０のポリマー膜１３５を通過すると、内側溶液層１３０の重炭酸バッファーに溶解し、バッファーｐＨを変化させ、これによりＣＯ２電極４０の電位が変化する。しかし、ｐＨ電極３２の内側溶液層は分析試料中のＣＯ２によって影響されず、そのためｐＨ電極の電位は一定のままである。ＣＯ２電極４０とｐＨ電極３２との間の電位差は、試料中のＣＯ２の濃度に比例する。本発明による一実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨがＣＯ２電極４０のポリマー膜１３５を構成していてもよい。
【００２１】
図５は本発明による別の実施形態の、分析試料中の生体代謝産物（例えば、糖質、ペプチド、脂質、ヌクレオチド、または尿素など）の存在および濃度を検出するための酵素電極１５０を示す。酵素電極１５０は、電極カード６に埋込まれた金属要素１５５、およびチャネル２０を通じて電極カード６に流れる金属要素１５５と分析試料との間に配置されている複合膜１６０を含む。複合膜１６０は、チャネル２０に隣接した外側拡散膜１６５、酵素層１７０、イオン選択ポリマー膜１７５、および金属要素１５５に隣接した内側溶液層１８０を含む。外側拡散膜１６５は、被分析物の酵素層１７０への拡散を制御し、酵素電極１５０の他の成分をチャネル２０における分析試料との直接の接触から保護する。酵素層１７０は、特定の被分析物と反応する少なくとも１つの酵素、または、いくつかの酵素、タンパク質、および安定剤の混合物を具備しうる。被分析物が外側拡散膜１６５を通じて拡散する場合には、これは酵素１７０における酵素と反応し、化学副産物を生じうるが、これはイオン選択ポリマー膜１７５を通じて移動しうる。尿素センサの場合、化学副産物は、例えば、アンモニウムイオンでありうる。分析試料中の対象の被分析物の濃度に比例する化学副産物の濃度に依存する電位が複合膜１６０に発生する。本発明による一実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨがイオン選択ポリマー膜１７５を構成していてもよい。
【００２２】
特定の実施形態において、本発明による尿素センサは、尿素のアンモニウムイオンへの加水分解を触媒する酵素を含み、次いでアンモニウムイオンがアンモニウムイオン選択電極によって検出される。適切な酵素の例がウレアーゼである。図５を参照すると、尿素センサの複合膜１６０は、外側拡散膜１６５、ウレアーゼを含有する酵素層１７０、アンモニウムイオン選択ポリマー膜１７５、および金属要素１５５に隣接した内側溶液層１８０を含む。
【００２３】
外側拡散膜１６５は、いくつかの機能を果たすように調製される。第一に、外側拡散膜１６５は、保護用の外側拡散膜１６５がなければ起こるであろう酵素層上を流れる較正溶液または試料の流れによって酵素層１７０が洗い流されてしまうことを防ぎ、酵素層１７０をイオン選択ポリマー膜１７５に固定する。第二に、外側拡散膜１６５は、試料から酵素層１７０への汚染物質の拡散を制限し、センサの寿命を有利に延長する。特定の実施形態において、外側拡散膜１６５は、尿素の酵素層１７０への拡散を制限するように調製され、これにより、試料中の尿素より少ないが、これに比例する量の尿素が酵素と反応することを可能にする。酵素層１７０に達する尿素の量の制限は、尿素センサの線形範囲を拡大するだけではなく、酵素層１７０のｐＨが増加するのを抑制し、これによりさらにセンサの上部線形範囲を拡大する。
【００２４】
外側拡散膜１６５は、一般に１つもしくはそれ以上のポリマーを含む。適切なポリマーとしては、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）イオノマー（例えば、デラフェア州ウィルミントンのイー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー（Ｅ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ＆Ｃｏ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）によってナフィオン（ＮＡＦＩＯＮ）の商標で販売されているペルフルオロスルホン酸イオノマー）、ポリ−（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニル誘導体（例えば、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、および水酸化ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート、酢酸セルロース、およびそれらの混合物およびコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。外側拡散膜１６５での使用に好ましいポリマーは、親水性ポリウレタン（例えば、マサチューセッツ州ウォバーンのテルメディックス社（Ｔｈｅｒｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から入手可能）である。一実施形態において、外側拡散膜１６５は２つもしくはそれ以上のポリマーの混合物またはコポリマーを含む。別の実施形態において、外側拡散膜１６５は、同一のまたは異なるポリマーおよび／または同一のまたは異なるコポリマーの２つもしくはそれ以上の別個の層を含む。
【００２５】
酵素層１７０は、例えば、ウレアーゼなど尿素のアンモニウムイオンに対する反応を触媒する酵素を含む。一実施形態において、酵素層１７０は、例えば、１種以上の不活性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンを含む血清タンパク質）、ポリペプチド（例えば、グルタチオン）などの酵素安定剤と溶媒を含む。特定の実施形態において、グルタチオンが１種以上の不活性タンパク質とともに使用され、酵素層１７０におけるウレアーゼを安定化する。また、ウレアーゼを、架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）を使用してグルタチオンおよび／または１種以上の不活性タンパク質に架橋結合させ、酵素および／または安定剤が酵素層１７０からの移動するのを防いでもよい。架橋により、酵素層１７０もその下のイオン選択ポリマー層１７５に固定される。酵素層１７０の製造中、酵素安定剤は、一般に、架橋剤の添加に先立って酵素含有溶液に添加され、安定剤が酵素と架橋結合することを確実にする。
【００２６】
アンモニウムイオン選択ポリマー層１７５は、ポリマーマトリクスに配置されたアンモニウム選択イオノフォアを含む。適切なイオノフォアとしては、ノナクチン、モナクチン、ジナクチン、トリナクチン、テトラナクチン、ナラシン、ヘキサオキサヘプタシクロトリトリアコンタン、ベンゾクラウンエーテル（例えば、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、７２、４６８３−４６８８頁を参照）環状デプシペプチド（例えば、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、７５、１５２−１５６頁を参照）、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーマトリクスは、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニル誘導体（例えば、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、および水酸化ポリ塩化ビニル）、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（メチルメタクリレート）、シリコーンゴム、およびそれらの混合物およびコポリマーを含みうる。また、アンモニウムイオン選択ポリマー層１７５は、本明細書に記載された可塑剤および脂溶性塩添加剤などの他の添加剤を含有しうる。
【００２７】
再び図３を参照すると、ＩＳＥのポリマー膜は、対象の被分析物のためにＩＳＥ１００の選択性を調節する。ポリマー膜１１５は、少なくとも４つの要素：ポリマー、可塑剤、イオノフォア、および脂溶性塩添加剤、を含む。
【００２８】
本発明による一実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨはポリマー膜１１５のポリマー成分である。ＰＶＣ−ＣＯＯＨは、塩素原子の一部がカルボキシル基（ＣＯＯＨ）によって置換されたポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）ポリマーである。本発明による実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨは、０．１〜５重量％のＣＯＯＨを含有し、本発明の特定の実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨは、１．８重量％のＣＯＯＨを含有しうる。ＰＶＣ−ＣＯＯＨは、分析試料中の脂溶性陰イオン性種（例えば、鎮痛剤および麻酔剤など）がポリマー膜１１５に浸透し、かつＩＳＥ１００に干渉するのを防ぐ。かかる脂溶性陰イオン性種には、例えば、チオペンタールナトリウム（チオペンタール）、フェニトイン、イブプロフェン、フェノプロフェン、サリチル酸塩、バルプロ酸塩、およびε−アミノカプロン酸塩などが含まれる。ＰＶＣ−ＣＯＯＨは、別のポリマー（例えば、ＨＭＷ−ＰＶＣまたはポリウレタンなど）と混合され、ポリマー膜のポリマー成分を形成してもよい。本発明の特定の実施形態においては、ＰＶＣ−ＣＯＯＨは別のポリマーと混合されておらず、ポリマー膜の唯一のポリマー成分である。
【００２９】
ＰＶＣ−ＣＯＯＨを含むポリマー膜１１５は、固体プラットフォームへの付着力の増強も示すが、これは電気化学センサの長い寿命および電位の安定性に重要である。また、ポリマー膜１１５にＰＶＣ−ＣＯＯＨを使用する電気化学センサは、以下の実施例６によって示されているように、比較的極性を有するポリマー膜１１５によって与えられる膜抵抗の大幅な低減により、より優れたセンサ測定の潜在的安定性および再現性を示す。ＰＶＣ−ＣＯＯＨセンサの精度および正確度は、以下の実施例７によって示されているように、高分子量ポリ塩化ビニル（ＨＭＷ−ＰＶＣ）に基づくセンサなどの周知のＩＳＥと同等である。
【００３０】
ポリマー膜１１５の可塑剤成分は、有効なイオン移動を得るために必要な膜内におけるイオン移動度を提供する。可塑剤はポリマー成分と適合しなければならず、イオノフォアの溶媒でなければならない。可塑剤は、ポリマー膜１１５の表面と接触する水性試料に大幅に移動することがないように、水中で十分に不溶性でもなければならない。可塑剤は電極の寿命を延長するために、実質的に非揮発性であることも望ましい。有用な可塑剤としては、セバシン酸ビス（２−エチルへキシル）（ＤＯＳ）およびｏ−ニトロフェニルオクチルエーテル（ＮＰＯＥ）が挙げられる。
【００３１】
ポリマー膜１１５において使用されるイオノフォアは、特定のイオンと選択的に結合する能力がある。イオノフォアのこの特徴により、ＩＳＥのイオン選択性が生じる。ナトリウムＩＳＥの適切なイオノフォアの例としては、メチルモネンジンエステル、カリックスアレーン誘導体、および他のナトリウム感受性化合物が挙げられる。単環式抗生物質（例えば、バリオマイシンなど）をカリウムＩＳＥ用のイオノフォアとして使用することができる。カルシウムＩＳＥ用のイオノフォアは、例えば、（−）−（Ｒ，Ｒ）−Ｎ，Ｎ’−（ビス（１１−エトキシカルボニル）ウンデシル）−Ｎ，Ｎ’−４，５−テトラメチル−３，６−ジオキサオクタンジアミド、ジエチルＮ，Ｎ’−［（４Ｒ，５Ｒ）−４，５−ジメチル−１，８−ジオキソ−３，６−ジオキサオクタメチレン］−ビス（１２−ドデカン酸メチルアミノ）（ＥＴＨ１００１）でありうる。ｐＨ電極および／または二酸化炭素電極用の適切なイオノフォアの例は、トリドデシルアミン（ＴＤＤＡ）である。
【００３２】
ポリマー膜１１５に使用される脂溶性塩添加剤は、膜抵抗を削減し、かつ陰イオン干渉を削減するために役立つ。有用な脂溶性塩添加剤としては、例えば、カリウムテトラキス（４−クロロフェニル）ホウ酸（ＫＴｐＣｌＰＢ）、およびカリウムテトラキス［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］ホウ酸（ＫＴＴＦＰＢ）が挙げられる。しかし、脂溶性塩添加剤は、ポリマー膜１１５の機能に必ずしも必須ではなく、一定の被分析物が分析対象となる場合には省略できる。
【００３３】
ポリマー膜１１５の脂溶性陰イオン薬剤不純物を拒絶する効率は、ポリマー膜１１５の組成のＰＶＣ−ＣＯＯＨ／可塑剤比を最適化し、かつイオノフォアおよび脂溶性塩添加剤のタイプおよび比を適切に選択することによって強化される。例えば、ナトリウムＩＳＥ用のポリマー膜１１５は、２５−３５重量％のＰＶＣ−ＣＯＯＨ、６０−７０重量％のＤＯＳ、２−８重量％のカリックスアレーン誘導体、および１−３重量％のＫＴＴＦＰＢを含有しうる。カリウムＩＳＥ用のポリマー膜１１５は、例えば、２５−３５重量％のＰＶＣ−ＣＯＯＨ、６０−７０重量％のＤＯＳ、１−５重量％のバリノマイシン、および０−１重量％のＫＴｐＣｌＰＢを含有しうる。カルシウムＩＳＥ用のポリマー膜１１５は、例えば、２５−３５重量％のＰＶＣ−ＣＯＯＨ、６０−７０重量％の１：１のＤＯＳ／ＮＰＯＥ、１−５重量％のＥＴＨ１００１、および０．２−２重量の％ＫＴｐＣｌＰＢを含有しうる。ｐＨまたはＣＯ２ＩＳＥ用のポリマー膜１１５は、例えば、２５−３５重量％のＰＶＣ−ＣＯＯＨ、６０−７０重量％のＤＯＳ、２−７重量％のＴＤＤＡ、および１−４重量％のＫＴｐＣｌＰＢを含有しうる。図６は、適切なポリマー膜１１５成分の特定の実施形態、およびそれらのそれぞれのさまざまな電気化学センサの重量比の例を示す。
【００３４】
さらに図３を参照すると、本発明によるポリマー膜１１５は、適切な量のポリマー、可塑剤、イオノフォア、および脂溶性塩添加剤を溶媒、一般的にはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはシクロヘキサノン、に溶解し、この溶液を電極カード６に埋込まれた金属要素１０５の露出表面に塗布することによって形成されうる。例えば、カリウムＩＳＥは、図６に記載された比に従ってＰＶＣ−ＣＯＯＨ（１．８重量％のＣＯＯＨ）、ＤＯＳ、バリノマイシン、およびＫＴｐＣｌＰＢを混合し、全質量を６３０〜６５０ｍｇにすることによって製造されうる。混合物は３〜３．５ｍＬ ＴＨＦ中に溶解され、この溶液の０．７５μＬが電極カード６に埋込まれた金属要素１０５（例えば、塩素化銀ワイヤ）の露出端に塗布される。溶媒が蒸発したら、同量の膜溶液を十分な乾燥時間をおいてさらに２回塗布する。最後の塗布の後溶媒が蒸発したら、ポリマー膜１１５が形成され、電極カード６に結合される。
【００３５】
再び図５を参照すると、一実施形態において、本発明による尿素センサは、まず内側溶液層１８０（例えば、ＭＥＳバッファー溶液）を電極カード６に埋込まれた金属要素１５５（例えば、銀／塩化銀または白金）の露出面に塗布することによって製造される。次に、ノナクチン、ポリ塩化ビニル、および１つもしくはそれ以上の可塑剤の溶液を内側溶液層１８０上に塗布し、イオン選択ポリマー層１７５を形成する。酵素層１７０は、ウレアーゼ、グルタチオン、ウシ血清アルブミン、およびグルタルアルデヒド溶液をイオン選択ポリマー層１７５の表面に塗布することによって形成される。最後に、親水性ポリウレタンの溶液を酵素層１７０上に塗布し、外側拡散層１６５を形成する。
【００３６】
本発明によるＩＳＥでは、試料中の被分析物の濃度の変化に起因する分析試料のミリボルト（ｍＶ）で測定される電位の変化が測定される。同様に、本発明によるガス電極では、試料中に溶解されたガスの分圧の変化に起因する分析試料の電位の変化が測定される。当業者であれば、電位値がネルンストの式による濃度または分圧値に関係があることを承知している。本発明による特定の実施形態においては、電極によって測定された電位値をネルンストの式を使用することによって被分析物の濃度または分圧値に変換するソフトウェアを電気化学センサシステムに含めることができる。
【００３７】
別の態様において、本発明は、脂溶性陰イオン性種（例えば、チオペンタールなど）の存在下で被分析物を検出および／または測定する際に、脂溶性陰イオン性種による干渉を受けることなく体液（例えば、血液）中の被分析物の存在を検出および／または濃度を測定するための方法である。本発明のこの方法は、センサのポリマー膜のポリマー成分としてＰＶＣ−ＣＯＯＨを含む体液中の対象被分析物を検出および／または測定するための電気化学センサを提供する。対象被分析物および脂溶性陰イオン性汚染物質を含有する体液試料が、センサのポリマー膜のポリマー成分としてＰＶＣ−ＣＯＯＨを含む電気化学センサと接触して配置される。次いで、体液試料中の対象被分析物が、脂溶性陰イオン性汚染物質による干渉が低減された中で電気化学センサによって測定および／または検出される。
【００３８】
以下の実施例は、本発明を説明するが、限定することは意図されていない。
【実施例】
【００３９】
実施例１
図７は、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するナトリウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のナトリウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、ＩＳＥによりナトリウムの濃度が１４２ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のナトリウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更したところ、ＩＳＥは１３７ｍＭのナトリウム濃度値に戻った。
【００４０】
図８は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのナトリウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のナトリウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、５つのＩＳＥのすべてでナトリウムの濃度が１３９ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のナトリウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更されたところ、５つの電極すべてが１３９ｍＭのナトリウム濃度値に戻った。ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥは、チオペンタールで汚染された試料の分析後に、ＨＭＷ−ＰＶＣベースのナトリウムＩＳＥに見られるドリフトを示すことはなかったが、このことは脂溶性陰イオン性汚染物質によって引き起こされるナトリウム測定障害の防止におけるＰＶＣ−ＣＯＯＨの有効性を示している。
【００４１】
実施例２
図９は、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するカリウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のカリウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、ＩＳＥによりカリウムの濃度が３．２ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のカリウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、ＩＳＥは２．８ｍＭのカリウム濃度値に戻った。
【００４２】
図１０は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのカリウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のカリウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、５つのＩＳＥのすべてでカリウムの濃度が３．３ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のカリウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更されたところ、５つの電極すべてが３．３ｍＭのカリウム濃度値に戻った。ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカリウムＩＳＥは、チオペンタールで汚染された試料の分析後に、ＨＭＷ−ＰＶＣベースのカリウムＩＳＥに見られるドリフトと比べて、わずかしか電位のドリフトを示さなかったが、このことは脂溶性陰イオン性汚染物質によって引き起こされるカリウム測定障害の防止におけるＰＶＣ−ＣＯＯＨの有効性を示している。
【００４３】
実施例３
図１１は、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するカルシウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のカルシウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、ＩＳＥによりカルシウムの濃度が０．９３ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のカルシウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、ＩＳＥは０．８１ｍＭのカルシウム濃度値に戻った。
【００４４】
図１２は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのカルシウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のカルシウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、５つのＩＳＥのすべてでカルシウムの濃度が０．８７ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のカルシウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、５つの電極は０．８５、０．８５、０．８６、０．８６、および０．８５ｍＭのカルシウム濃度値に戻った。ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカルシウムＩＳＥは、チオペンタールで汚染された試料の分析後にＨＭＷ−ＰＶＣをベースとするカルシウムＩＳＥに見られるほどの大きな電位のドリフトを示すことはなかったが、このことは脂溶性陰イオン性汚染物質によって引き起こされるカルシウム測定障害の防止におけるＰＶＣ−ＣＯＯＨの有効性を示している。
【００４５】
実施例４
図１３は、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するｐＨ電極を含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知のｐＨのバッファー溶液を含有する分析試料が電極カードに導入され、電極ではｐＨが７．６３であることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じバッファー溶液＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、電極は７．６８のｐＨ値に戻った。
【００４６】
図１４は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのｐＨ電極含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応の１つのグラフ表示である。既知のｐＨのバッファー溶液を含有する分析試料が電極カードに導入され、５つの電極のすべてでｐＨが７．６６であることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じバッファー溶液＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、５つの電極は７．６８のｐＨ値に戻った。ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのｐＨ電極は、チオペンタールで汚染された試料の分析後にＨＭＷ−ＰＶＣをベースとするｐＨ電極に見られるほどの大きな電位のドリフトを示すことはなかったが、このことは脂溶性陰イオン性汚染物質によって引き起こされるｐＨ測定障害の防止におけるＰＶＣ−ＣＯＯＨの有効性を示している。
【００４７】
実施例５
図１５は、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するＣＯ２電極を含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。バッファー溶液を含有する分析試料が電極カードに導入された。溶液中のＣＯ２の分圧の２つの測定値を取り、結果を平均化し、６６ｍｍＨｇの値を得た。時間ｔで、分析試料が同じバッファー溶液＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、電極は１１５ｍｍＨｇのＣＯ２分圧値に戻った。
【００４８】
図１６は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する４つのＣＯ２電極を含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。バッファー溶液を含有する分析試料が電極カードに導入された。４つの電極の各々で溶液中のＣＯ２の分圧の２つの測定値を取り、各電極の結果を平均化し、６７．９、６８．０、６８．０、および６８．２ｍｍＨｇの値を得た。時間ｔで、分析試料が同じバッファー溶液＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、４つの電極は７０．４、６８．８、６８．８、および７３．４ｍｍＨｇのＣＯ２の分圧値に戻った。ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのＣＯ２電極は、ＨＭＷ−ＰＶＣベースのＣＯ２電極に見られるドリフトと比べてチオペンタールで汚染された試料の分析後にわずかしか電位のドリフトを示さなかったが、このことは脂溶性陰イオン性汚染物質によって引き起こされるＣＯ２測定障害の防止におけるＰＶＣ−ＣＯＯＨの有効性を示している。
【００４９】
実施例６
図１７は、当技術分野で周知のポリマー成分としてＨＭＷ−ＰＶＣを含むＩＳＥポリマー膜のバルク膜抵抗のグラフ表示である。図１７によると、ＨＭＷ−ＰＶＣ膜は約２．４×１０７オームのバルク抵抗を有する。比較すると、図１８は、本発明によるポリマー成分としてＰＶＣ−ＣＯＯＨを含むＩＳＥポリマー膜のバルク膜抵抗が、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するＩＳＥより１９倍以上低い約１．２５×１０６オームであることを示している。バルク膜抵抗性を低下させることによって、そのポリマー膜にＰＶＣ−ＣＯＯＨを使用して製造されたＩＳＥは、測定の電位の安定性および再現性の増強を示す。
【００５０】
実施例７
図１９は、全血液試料におけるナトリウム濃度の本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのナトリウムＩＳＥを含む電極カードによる測定値とＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有する既知のナトリウムＩＳＥによる測定値を比較するグラフ表示である。広範囲のナトリウムレベルを表す９９種類の全血試料のナトリウム濃度値を最初にＨＭＷ−ＰＶＣベースのナトリウムＩＳＥで測定し、次いでＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥで測定した。図１９によって示されているように、ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥから得られた値は、ＨＭＷ−ＰＶＣベースのナトリウムＩＳＥを使用して得られたものと十分に相関し（ｒ＝０．９９８３）、このことはＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥでは既知のナトリウム電極と同等の精度および正確度でナトリウムが測定されることを示している。
【００５１】
図２０は、ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカリウムＩＳＥを使用した同様の実験を示す。広範囲のカリウムレベルを表す１２７種類の全血試料のカリウム測定値を、最初にＨＭＷ−ＰＶＣベースのカリウムＩＳＥを使用して測定し、次いでＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカリウムＩＳＥで測定した。図２０によって示されているように、ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカリウムＩＳＥから得られた値は、ＨＭＷ−ＰＶＣベースの電極を使用して得られたものと十分に相関し（ｒ＝０．９９９５）、このことはＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカリウムＩＳＥでは既知のカリウム電極と同等の精度および正確度でカリウムが測定されることを示している。
【００５２】
実施例８
図２１は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥの経時的な安定性のグラフ表示である。１日目、既知の濃度のナトリウムを含有する分析試料を、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのナトリウムＩＳＥを含む電極カードに導入し、ナトリウムの濃度を測定した。次いで、分析試料を同じ濃度のナトリウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更し、ナトリウムの濃度を再び測定した。チオペンタール干渉による電極の電位のドリフトを表す、２つの測定値間の差（ΔＥＭＦ）を計算し、分析試料をセンサカードから除去した。この手順を２、４、６、９、１２、１４、および２０日目に繰返し、ΔＥＭＦ値を計算した。図２１が示すように、チオペンタールなどの脂溶性陰イオン性種が本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥに及ぼす影響は、電極の全寿命を通じてきわめて低いままである。
【００５３】
実施例９
尿素センサを以下の通り本発明に従って製造した。５０．９ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳカリウム塩、４６．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ非含有酸、２ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムを含有するＭＥＳバッファー溶液を調製し、この溶液０．０５μＬをＰＶＣ電極カードに埋込まれた銀／塩化銀ワイヤの端に塗布した。次に、ＰＶＣ１５０ｍｇ、セバシン酸ジオクチル１００μＬ、２−ニトロフェニルオクチルエーテル１００μＬ、ＴＨＦ中１％カリウムテトラキス（４−クロロフェニル）ホウ酸塩１１０μＬ、および８ｍＬ ＴＨＦ中ＴＨＦ中５％ノナクチン３００μＬを組合わせることによってイオン選択膜溶液を調製した。この溶液の２つの０．７５μＬアリコートをＭＥＳバッファー層上に連続的に塗布し、イオン選択膜を形成した。次に、５０ｍｇ／ｍＬウレアーゼ（バイオザイム（Ｂｉｏｚｙｍｅ）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（ＣＡ））、２０ｍｇ／ｍＬグルタチオン、１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、および０．１２％グルタルアルデヒドをｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸バッファー中に含有する酵素溶液を調製し、この溶液０．０７５μＬをイオン選択膜に塗布した。最後に、ＴＨＦ中に０．１２ｇ／ｍｌのポリウレタン（テルメディックス社（Ｔｈｅｒｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ウォバーン、マサチューセッツ州）を含有する外側膜溶液を調製し、この溶液０．５μＬを酵素層上に塗布し、外側膜を形成した。尿素センサを使い捨てカートリッジに組み込み、ＧＥＭプレミア（Ｐｒｅｍｉｅｒ）３０００分析器（インスツルメンテーション・ラボラトリー・カンパニー（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）、レキシントン、マサチューセツ州）で試験した。
【００５４】
使用中、本発明による尿素センサは、センサの全寿命を通じて所定のスケジュールに従って使い捨てカートリッジに封入された較正溶液を使用して自動的に較正される。較正は、尿素センサの尿素に対する感度（すなわち、尿素反応曲線の傾き）およびカリウムに対する尿素のセンサの選択係数を測定するために実行される。本発明による尿素センサの感度を測定するために、上記の尿素センサを２種類の較正溶液で較正した。１．０ｍｍｏｌ／Ｌの尿素および２．０ｍｍｏｌ／Ｌのカリウムを含んだ最初の較正溶液（Ｃａｌ Ｂ）をカートリッジの試料チャネルへ導入し、尿素センサの信号を記録した。次に、７．５ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および１５ｍｍｏｌ／Ｌカリウムを含んだＣａｌ Ｂを第２の較正溶液（Ｃａｌ Ｄ）で置換し、センサ反応を記録した。最後に、較正溶液をＣａｌ Ｂに切替え、センサ反応を再び記録した。センサは、較正および試料分析中を除き、つねにＣａｌ Ｂ溶液中に浸される。図２２に示されているように、尿素センサは、迅速、かつ安定的に尿素およびカリウム濃度の変化に反応したが、このことは本発明による尿素センサが分析試料の迅速な分析が可能であることを示す。
【００５５】
次に、尿素センサの分析性能を、３週間にわたって試験された６２個の全血液試料の尿素濃度を分析することによって評価した。血液試料は、試験の第４日、第９日、第１４日、および第２２日に試験された。各々試験のために、ヘパリン化全血液試料を健康な個人から採取し、濃縮尿素溶液でスパイクし、５〜７０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲の尿素濃度の試料を得た。次いで、各々の試料の尿素濃度値を上記のように本発明による尿素センサを使用して測定した。比較のために、各々のアリコートを分析後に遠心分離して血漿を単離し、血漿尿素濃度を従来の臨床化学分析器（モナーク（ＭＯＮＡＲＣＨ）、インスツルメンテーション・ラボラトリー・カンパニー（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、マサチューセツ州（ＭＡ））を使用して測定した。モナーク（Ｍｏｎａｒｃｈ）分析器では、ウレアーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、およびＮＡＤＨの二酵素反応と組合せた分光測光法が使用され、試料中の尿素濃度を検出する。モナーク分析器は３５ｍｍｏｌ／Ｌまでの尿素しか測定できないので、血漿試料は分析前に食塩水で希釈した。実験の結果は図２３に要約されている。
【００５６】
図２３が示すように、本発明の尿素センサから得られた尿素濃度値はモナーク分析器を使用して得られたものと十分に相関し（ｒ＝０．９９５）、これは本発明の尿素センサにより従来の化学分析器と同等の精度および正確度で尿素が測定されることを示す。本発明による尿素センサは、モナーク分析器よりも高価でなく、使用しやすいという追加の利点を有する。また、実験が示すように、尿素センサは少なくとも３週間の有効寿命を有する。
【００５７】
実施例１０
本発明による尿素センサのアンモニウムイオン選択膜は少なくとも部分的にカリウムイオンに対して透過性であるが、これは誤った尿素濃度値をもたらしうる。カリウム干渉の尿素濃度値を補正する１つの方法は、試料中のカリウム濃度を（例えば、本明細書に記載されたカリウムＩＳＥを使用して）独立して測定し、カリウム濃度と尿素センサのカリウムに対する尿素の選択係数に基づく補正係数を決定し、次いで補正係数を測定された尿素濃度値から引き、試料の実際の尿素濃度値を得るステップを含む。
【００５８】
本発明による尿素センサを使用する際にカリウム干渉が補正できるかを判定するために、２つの尿素センサを実施例９に記載された方法に従って製造し、カリウムＩＳＥも含む使い捨てカートリッジへ組込んだ。各々の尿素センサの選択係数は、２つの較正溶液、すなわちＣａｌ Ａ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ尿素、７．５ｍｍｏｌ／Ｌカリウム）およびＣａｌ Ｂ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ尿素、２．０ｍｍｏｌ／Ｌカリウム）で較正することによって測定された。５つの全血液試料を異なる量のカリウムでスパイクし、８〜２４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲のカリウム濃度の試料を得た。非スパイク試料は、４．２ｍｍｏｌ／Ｌのカリウム濃度および５．０ｍｍｏｌ／Ｌの尿素濃度を有した。各々の試料をカートリッジへ導入し、カリウムおよび尿素濃度値を記録した。尿素濃度値を選択係数およびカリウム濃度に基づき補正した。実験の結果は、以下の表１に要約されている。
【００５９】
【表１】
【００６０】
表１が示すように、カリウム干渉は本発明による尿素センサのために有効に除去できる。
【００６１】
本明細書に記載されているものの変型、変更、および他の実施は、請求された発明の精神および範囲を逸脱することなく当業者には考え及ぶであろう。したがって、本発明は、前記例示的説明によってではなく、冒頭の特許請求の範囲の精神および範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】電極カードおよび試料注入口を有するセンサカートリッジ、蠕動ポンプ、およびマイクロプロセッサを含む、本発明による電気化学センサシステムの実施形態の構成要素を示す概略図である。
【図２】本発明による電極カードの実施形態を示す正面図である。
【図３】本発明によるイオン選択電極（ＩＳＥ）の実施形態を示す断面図である。
【図４】本発明による二酸化電極（ＣＯ２）の実施形態を示す断面図である。
【図５】本発明による酵素電極の実施形態を示す断面図である。
【図６】４種類のＩＳＥのポリマー膜成分およびそのそれぞれの重量％の例を含む表である。
【図７】高分子量ポリ塩化ビニル（ＨＭＷ−ＰＶＣ）を含有するポリマー膜を有するナトリウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールナトリウム（チオペンタール）で汚染された試料を含有するナトリウムの分析前後に取られた測定値を示すグラフ表示である。
【図８】本発明によるカルボキシル化ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ−ＣＯＯＨ）含有するポリマー膜を有する５つのナトリウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図９】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するカリウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１０】本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのカリウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１１】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するカルシウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１２】本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのカルシウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１３】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するｐＨ電極を含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１４】本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのｐＨ電極を含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応の１つと、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１５】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するＣＯ２電極を含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１６】本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する４つのＣＯ２電極を含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染された試料の分析前後に取られた測定値とともを示すグラフ表示である。
【図１７】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するＩＳＥのバルク膜抵抗を示すグラフ表示である。
【図１８】ＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有するＩＳＥのバルク膜抵抗を示すグラフ表示である。
【図１９】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するナトリウムＩＳＥによって測定された全血液試料中のナトリウム濃度値と本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのナトリウムＩＳＥを含む電極カードによって測定されたものとの比較を示すグラフ表示である。
【図２０】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するカリウムＩＳＥによって測定された全血液試料中のカリウム濃度値と本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのカリウムＩＳＥを含む電極カードによって測定されたものとの比較を示すグラフ表示である。
【図２１】本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有するナトリウムＩＳＥの経時的な電位のマイナスドリフトを示すグラフ表示である。
【図２２】２種類の較正溶液に対する本発明による尿素センサの反応を示すグラフ表示である。
【図２３】市販の臨床化学分析器によって測定された血漿試料中の尿素濃度値と本発明による尿素センサを含む電極カードによって測定された対応する全血液試料中の尿素濃度値との比較を示すグラフ表示である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年２月１１日出願の米国特許出願第１０／３６４，８４０号明細書の一部継続出願であり、その開示は本明細書で参照することにより援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、電気化学センサ、詳しくは、分析試料中の尿素を測定するセンサの分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
研究者および医師はしばしば生体試料中のさまざまな被分析物の濃度を測定する必要がある。これらの被分析物としては、溶解ガス（二酸化炭素）、イオン（例えば水素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リチウム、アンモニウム、およびマグネシウム）、および生物活性分子（例えば尿素）が挙げられる。多くの場合、生体試料は、外来診療中または手術を受けている間の患者から取られた体液（例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、および／または尿）である。適切な診断および治療はしばしば、これらの測定の精度およびそれらが得られる速度によって決まる。
【０００４】
電気化学センサシステムが、生体試料中の被分析物の濃度を測定するために使用されうる分析ツールである。電気化学センサは、少なくとも１つの半透過性膜によって分析試料から分離される、金属電極などの物理的変換器を含む。分析試料中の生体代謝産物（例えば、糖質、ペプチド、脂質、ヌクレオチド、または尿素など）を検出および／または測定する酵素センサは、半透過性膜を覆う酵素層を含む。酵素層は、目的とする被分析物と反応し、半透過性膜を通じて移動し、電極によって検出されうる化学副産物を生成する少なくとも１つの酵素を含有する。酵素センサの例が尿素センサであるが、これは、尿素を加水分解してアンモニウムイオンを形成するウレアーゼなどの酵素を含有しうる。
【０００５】
既存の尿素センサは、他のタイプのセンサ（例えば、イオンセンサ）と比べ一般に寿命が短い。これは、既存の尿素センサの酵素層が分析試料と直接接触しており、これにより膜の酵素および他の成分が試料および／または試料中の汚染物質へ浸出し、酵素層における酵素を分解または破壊することによる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要約
本発明は、酵素層が試料と直接接触しない尿素センサを提供し、これにより試料中の尿素濃度の複数の連続した測定が可能となる。また、本発明の尿素センサは小型化に適しており、センサカードの全体的な寿命を損なうことがなく、複数被分析物の連続長期分析用に使用される他の小型化電気化学センサを含むセンサカードへ組込まれうる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一般に、一態様において、本発明は、電極と、酵素層と、外側拡散層とを含む試料中の尿素を検出するためのセンサである。外側拡散層は尿素に対して透過性であり、酵素層と試料との間に配置されている。外側拡散層は、酵素層と試料との直接の接触を防ぐことによって、酵素の分解および／または損失を阻止し、それによって尿素センサの寿命を延長する。尿素センサは、例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、および／または尿試料の尿素濃度を測定するために使用されうる。
【０００８】
本発明の本態様の実施形態は以下の特徴を含みうる。電極は、銀／塩化銀電極などの金属電極でありうる。酵素層は、尿素のアンモニウムイオンへの加水分解を触媒するウレアーゼなどの酵素を含有しうる。酵素層は、例えば、ポリペプチド（例えば、グルタチオン）および不活性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）などの１つもしくはそれ以上の酵素安定剤をも含有しうる。特定の実施形態において、酵素層は、グルタチオンに架橋結合されたウレアーゼを含む。他の実施形態において、酵素層は、ウレアーゼおよびグルタチオンの少なくとも１つに架橋結合されたウシ血清アルブミンなどの１つもしくはそれ以上の不活性タンパク質を含む。外側拡散層は、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）イオノマー、ポリ−（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ塩化ビニル、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、水酸化ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、酢酸セルロース、およびそれらの混合物などのポリマーを含みうる。
【０００９】
一部の実施形態において、尿素センサは、電極と酵素層との間に配置されたイオン選択膜をさらに含む。例えば、イオン選択膜は、アンモニウム選択イオノフォアが配置されたポリマーマトリクスなどのアンモニウムイオン選択膜であってもよい。ポリマーマトリクスは、例えば、ポリ塩化ビニル、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、水酸化ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（メチルメタクリレート）、シリコーンゴム、およびそれらの混合物を含みうる。適切なアンモニウムイオン選択イオノフォアの例としては、ノナクチン、モナクチン、ジナクチン、トリナクチン、テトラナクチン、ナラシン、ヘキサオキサヘプタシクロトリトリアコンタン、ベンゾクラウンエーテル、環状デプシペプチド、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００１０】
別の態様において、本発明は、基板の中または上に配置された上記の１つもしくはそれ以上のセンサを含むセンサカードである。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は上記のセンサを形成するための方法を提供する。１つの方法では、この方法は、電極を用意するステップと、電極の少なくとも１つの表面に酵素層を塗布するステップと、酵素層上に外側拡散層を塗布するステップとを含む。別の方法では、この方法は、電極を用意するステップと、電極の少なくとも１つの表面にイオン選択膜を塗布するステップと、イオン選択膜に酵素層を塗布するステップと、酵素層上に外側拡散層を塗布するステップとを含む。
【００１２】
本発明の前記および他の目的、態様、特徴、および利点は、以下の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１３】
図面の簡単な説明
図面において、同じ参照文字は一般に異なる図面の全体を通じて同じ部分を指す。また、図面は必ずしも縮尺どおりではなく、一般に本発明の原理の説明に重点が置かれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
説明
本発明による電気化学センサは電気化学センサシステムに組込むことができる。図１を参照すると、本発明による一実施形態において、電気化学センサシステム１は、生体試料が電気化学センサシステム１へ導入される注入口２を有する。蠕動ポンプ４が、体液試料などの試料を注入口２を通じて電極カード６へ移動させる。電極カード６は、試料中の対象の被分析物を検出および測定する１つもしくはそれ以上の電極８を含有する。電気的インターフェース１０は電極カード６をマイクロプロセッサ１２に接続する。電極カード６からの信号がマイクロプロセッサ１２に移動し、信号の保存および表示を可能にする。マイクロプロセッサ１２からの信号が電極カード６に移動し、電極の分極電圧などの測定条件の制御を可能にする。本発明による一実施形態において、試料注入口２および電極カード６は使い捨てカートリッジ１３内に含まれており、これは電気化学センサシステム１の他の要素から使用後に取外され、交換されうる。
【００１５】
図２を参照すると、本発明による一実施形態において、電極カード６は、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）で作られた硬質の実質的に長方形のカードを含む。チャネル２０が電極カード６内に配置されており、それを通じて生体試料または基準溶液が流れうる。１つもしくはそれ以上の電極８をチャネル２０内に埋込むことができる。試料が電極カード６を通過すると、試料はチャネル２０を通じて電極８を越えて流れ、対象の被分析物の検出および／または測定を可能にする。
【００１６】
図２を参照すると、電極カード６へ組込まれうる電極８は、イオン選択電極（ＩＳＥ）１００、溶解ガスを分析するための電極（ガス電極）、および酵素ベースの検出システムを使用する電極（酵素電極）を含む。例えば、電極はナトリウム２６、カルシウム２８、カリウム３０、ｐＨ３２、リチウム３４、マグネシウム３６、アンモニウム３８、二酸化炭素４０、および尿素４２を検出しうる。
【００１７】
図３を参照すると、本発明による一実施形態において、ＩＳＥ１００は、金属要素１０５、内側溶液層１１０、およびポリマー膜１１５を含む。金属要素１０５は電極カード６のＰＶＣに埋込まれており、内側溶液層１１０は金属要素１０５の露出端を覆う。内側溶液層１１０は、例えば、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファーを含有しうる。ポリマー膜１１５は、電極カード６のチャネル２０を通過する分析試料（例えば、体液試料）から内側溶液層１１０を分離するイオン選択膜である。ポリマー膜１１５の組成は、特定のイオンに対するＩＳＥ１００の選択性を決定する。本発明による特定の実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨがポリマー膜１１５の成分である。
【００１８】
再び図２を参照すると、分析試料中のイオンの濃度を測定するには、ＩＳＥ１００は基準電極４４と並行して作動しなければならない。ＩＳＥ１００が検出するように意図されているイオンが分析試料中に存在する場合は、図３に示されている内側溶液層１１０における被分析物の濃度と分析試料中のその濃度との差に依存する電位が、ポリマー膜１１５に発生する。ＩＳＥ１００と基準電極４４との間の電位差は、分析試料中の測定イオンの濃度の対数の変化に直接比例している。
【００１９】
図４を参照すると、本発明による一実施形態において、ガス電極の１つのタイプである二酸化炭素（ＣＯ２）電極４０は、金属要素１２５、内側溶液層１３０、およびポリマー膜１３５を含む。ＣＯ２電極４０は、ＣＯ２電極４０の内側溶液層１３０が重炭酸バッファーであることを除いて、機能的にＩＳＥ１００とほぼ同じである。図２を参照すると、ＩＳＥ１００とは異なり、ＣＯ２電極４０はｐＨ電極３２と並行して作動しなければならない。
【００２０】
再び図４を参照すると、ＣＯ２はＣＯ２電極４０のポリマー膜１３５を通過すると、内側溶液層１３０の重炭酸バッファーに溶解し、バッファーｐＨを変化させ、これによりＣＯ２電極４０の電位が変化する。しかし、ｐＨ電極３２の内側溶液層は分析試料中のＣＯ２によって影響されず、そのためｐＨ電極の電位は一定のままである。ＣＯ２電極４０とｐＨ電極３２との間の電位差は、試料中のＣＯ２の濃度に比例する。本発明による一実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨがＣＯ２電極４０のポリマー膜１３５を構成していてもよい。
【００２１】
図５は本発明による別の実施形態の、分析試料中の生体代謝産物（例えば、糖質、ペプチド、脂質、ヌクレオチド、または尿素など）の存在および濃度を検出するための酵素電極１５０を示す。酵素電極１５０は、電極カード６に埋込まれた金属要素１５５、およびチャネル２０を通じて電極カード６に流れる金属要素１５５と分析試料との間に配置されている複合膜１６０を含む。複合膜１６０は、チャネル２０に隣接した外側拡散膜１６５、酵素層１７０、イオン選択ポリマー膜１７５、および金属要素１５５に隣接した内側溶液層１８０を含む。外側拡散膜１６５は、被分析物の酵素層１７０への拡散を制御し、酵素電極１５０の他の成分をチャネル２０における分析試料との直接の接触から保護する。酵素層１７０は、特定の被分析物と反応する少なくとも１つの酵素、または、いくつかの酵素、タンパク質、および安定剤の混合物を具備しうる。被分析物が外側拡散膜１６５を通じて拡散する場合には、これは酵素１７０における酵素と反応し、化学副産物を生じうるが、これはイオン選択ポリマー膜１７５を通じて移動しうる。尿素センサの場合、化学副産物は、例えば、アンモニウムイオンでありうる。分析試料中の対象の被分析物の濃度に比例する化学副産物の濃度に依存する電位が複合膜１６０に発生する。本発明による一実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨがイオン選択ポリマー膜１７５を構成していてもよい。
【００２２】
特定の実施形態において、本発明による尿素センサは、尿素のアンモニウムイオンへの加水分解を触媒する酵素を含み、次いでアンモニウムイオンがアンモニウムイオン選択電極によって検出される。適切な酵素の例がウレアーゼである。図５を参照すると、尿素センサの複合膜１６０は、外側拡散膜１６５、ウレアーゼを含有する酵素層１７０、アンモニウムイオン選択ポリマー膜１７５、および金属要素１５５に隣接した内側溶液層１８０を含む。
【００２３】
外側拡散膜１６５は、いくつかの機能を果たすように調製される。第一に、外側拡散膜１６５は、保護用の外側拡散膜１６５がなければ起こるであろう酵素層上を流れる較正溶液または試料の流れによって酵素層１７０が洗い流されてしまうことを防ぎ、酵素層１７０をイオン選択ポリマー膜１７５に固定する。第二に、外側拡散膜１６５は、試料から酵素層１７０への汚染物質の拡散を制限し、センサの寿命を有利に延長する。特定の実施形態において、外側拡散膜１６５は、尿素の酵素層１７０への拡散を制限するように調製され、これにより、試料中の尿素より少ないが、これに比例する量の尿素が酵素と反応することを可能にする。酵素層１７０に達する尿素の量の制限は、尿素センサの線形範囲を拡大するだけではなく、酵素層１７０のｐＨが増加するのを抑制し、これによりさらにセンサの上部線形範囲を拡大する。
【００２４】
外側拡散膜１６５は、一般に１つもしくはそれ以上のポリマーを含む。適切なポリマーとしては、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）イオノマー（例えば、デラフェア州ウィルミントンのイー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー（Ｅ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ＆Ｃｏ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）によってナフィオン（ＮＡＦＩＯＮ）の商標で販売されているペルフルオロスルホン酸イオノマー）、ポリ−（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニル誘導体（例えば、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、および水酸化ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート、酢酸セルロース、およびそれらの混合物およびコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。外側拡散膜１６５での使用に好ましいポリマーは、親水性ポリウレタン（例えば、マサチューセッツ州ウォバーンのテルメディックス社（Ｔｈｅｒｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から入手可能）である。一実施形態において、外側拡散膜１６５は２つもしくはそれ以上のポリマーの混合物またはコポリマーを含む。別の実施形態において、外側拡散膜１６５は、同一のまたは異なるポリマーおよび／または同一のまたは異なるコポリマーの２つもしくはそれ以上の別個の層を含む。
【００２５】
酵素層１７０は、例えば、ウレアーゼなど尿素のアンモニウムイオンに対する反応を触媒する酵素を含む。一実施形態において、酵素層１７０は、例えば、１種以上の不活性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンを含む血清タンパク質）、ポリペプチド（例えば、グルタチオン）などの酵素安定剤と溶媒を含む。特定の実施形態において、グルタチオンが１種以上の不活性タンパク質とともに使用され、酵素層１７０におけるウレアーゼを安定化する。また、ウレアーゼを、架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）を使用してグルタチオンおよび／または１種以上の不活性タンパク質に架橋結合させ、酵素および／または安定剤が酵素層１７０からの移動するのを防いでもよい。架橋により、酵素層１７０もその下のイオン選択ポリマー層１７５に固定される。酵素層１７０の製造中、酵素安定剤は、一般に、架橋剤の添加に先立って酵素含有溶液に添加され、安定剤が酵素と架橋結合することを確実にする。
【００２６】
アンモニウムイオン選択ポリマー層１７５は、ポリマーマトリクスに配置されたアンモニウム選択イオノフォアを含む。適切なイオノフォアとしては、ノナクチン、モナクチン、ジナクチン、トリナクチン、テトラナクチン、ナラシン、ヘキサオキサヘプタシクロトリトリアコンタン、ベンゾクラウンエーテル（例えば、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、７２、４６８３−４６８８頁を参照）環状デプシペプチド（例えば、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、７５、１５２−１５６頁を参照）、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーマトリクスは、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニル誘導体（例えば、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、および水酸化ポリ塩化ビニル）、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（メチルメタクリレート）、シリコーンゴム、およびそれらの混合物およびコポリマーを含みうる。また、アンモニウムイオン選択ポリマー層１７５は、本明細書に記載された可塑剤および脂溶性塩添加剤などの他の添加剤を含有しうる。
【００２７】
再び図３を参照すると、ＩＳＥのポリマー膜は、対象の被分析物のためにＩＳＥ１００の選択性を調節する。ポリマー膜１１５は、少なくとも４つの要素：ポリマー、可塑剤、イオノフォア、および脂溶性塩添加剤、を含む。
【００２８】
本発明による一実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨはポリマー膜１１５のポリマー成分である。ＰＶＣ−ＣＯＯＨは、塩素原子の一部がカルボキシル基（ＣＯＯＨ）によって置換されたポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）ポリマーである。本発明による実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨは、０．１〜５重量％のＣＯＯＨを含有し、本発明の特定の実施形態において、ＰＶＣ−ＣＯＯＨは、１．８重量％のＣＯＯＨを含有しうる。ＰＶＣ−ＣＯＯＨは、分析試料中の脂溶性陰イオン性種（例えば、鎮痛剤および麻酔剤など）がポリマー膜１１５に浸透し、かつＩＳＥ１００に干渉するのを防ぐ。かかる脂溶性陰イオン性種には、例えば、チオペンタールナトリウム（チオペンタール）、フェニトイン、イブプロフェン、フェノプロフェン、サリチル酸塩、バルプロ酸塩、およびε−アミノカプロン酸塩などが含まれる。ＰＶＣ−ＣＯＯＨは、別のポリマー（例えば、ＨＭＷ−ＰＶＣまたはポリウレタンなど）と混合され、ポリマー膜のポリマー成分を形成してもよい。本発明の特定の実施形態においては、ＰＶＣ−ＣＯＯＨは別のポリマーと混合されておらず、ポリマー膜の唯一のポリマー成分である。
【００２９】
ＰＶＣ−ＣＯＯＨを含むポリマー膜１１５は、固体プラットフォームへの付着力の増強も示すが、これは電気化学センサの長い寿命および電位の安定性に重要である。また、ポリマー膜１１５にＰＶＣ−ＣＯＯＨを使用する電気化学センサは、以下の実施例６によって示されているように、比較的極性を有するポリマー膜１１５によって与えられる膜抵抗の大幅な低減により、より優れたセンサ測定の潜在的安定性および再現性を示す。ＰＶＣ−ＣＯＯＨセンサの精度および正確度は、以下の実施例７によって示されているように、高分子量ポリ塩化ビニル（ＨＭＷ−ＰＶＣ）に基づくセンサなどの周知のＩＳＥと同等である。
【００３０】
ポリマー膜１１５の可塑剤成分は、有効なイオン移動を得るために必要な膜内におけるイオン移動度を提供する。可塑剤はポリマー成分と適合しなければならず、イオノフォアの溶媒でなければならない。可塑剤は、ポリマー膜１１５の表面と接触する水性試料に大幅に移動することがないように、水中で十分に不溶性でもなければならない。可塑剤は電極の寿命を延長するために、実質的に非揮発性であることも望ましい。有用な可塑剤としては、セバシン酸ビス（２−エチルへキシル）（ＤＯＳ）およびｏ−ニトロフェニルオクチルエーテル（ＮＰＯＥ）が挙げられる。
【００３１】
ポリマー膜１１５において使用されるイオノフォアは、特定のイオンと選択的に結合する能力がある。イオノフォアのこの特徴により、ＩＳＥのイオン選択性が生じる。ナトリウムＩＳＥの適切なイオノフォアの例としては、メチルモネンジンエステル、カリックスアレーン誘導体、および他のナトリウム感受性化合物が挙げられる。単環式抗生物質（例えば、バリオマイシンなど）をカリウムＩＳＥ用のイオノフォアとして使用することができる。カルシウムＩＳＥ用のイオノフォアは、例えば、（−）−（Ｒ，Ｒ）−Ｎ，Ｎ’−（ビス（１１−エトキシカルボニル）ウンデシル）−Ｎ，Ｎ’−４，５−テトラメチル−３，６−ジオキサオクタンジアミド、ジエチルＮ，Ｎ’−［（４Ｒ，５Ｒ）−４，５−ジメチル−１，８−ジオキソ−３，６−ジオキサオクタメチレン］−ビス（１２−ドデカン酸メチルアミノ）（ＥＴＨ１００１）でありうる。ｐＨ電極および／または二酸化炭素電極用の適切なイオノフォアの例は、トリドデシルアミン（ＴＤＤＡ）である。
【００３２】
ポリマー膜１１５に使用される脂溶性塩添加剤は、膜抵抗を削減し、かつ陰イオン干渉を削減するために役立つ。有用な脂溶性塩添加剤としては、例えば、カリウムテトラキス（４−クロロフェニル）ホウ酸（ＫＴｐＣｌＰＢ）、およびカリウムテトラキス［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］ホウ酸（ＫＴＴＦＰＢ）が挙げられる。しかし、脂溶性塩添加剤は、ポリマー膜１１５の機能に必ずしも必須ではなく、一定の被分析物が分析対象となる場合には省略できる。
【００３３】
ポリマー膜１１５の脂溶性陰イオン薬剤不純物を拒絶する効率は、ポリマー膜１１５の組成のＰＶＣ−ＣＯＯＨ／可塑剤比を最適化し、かつイオノフォアおよび脂溶性塩添加剤のタイプおよび比を適切に選択することによって強化される。例えば、ナトリウムＩＳＥ用のポリマー膜１１５は、２５−３５重量％のＰＶＣ−ＣＯＯＨ、６０−７０重量％のＤＯＳ、２−８重量％のカリックスアレーン誘導体、および１−３重量％のＫＴＴＦＰＢを含有しうる。カリウムＩＳＥ用のポリマー膜１１５は、例えば、２５−３５重量％のＰＶＣ−ＣＯＯＨ、６０−７０重量％のＤＯＳ、１−５重量％のバリノマイシン、および０−１重量％のＫＴｐＣｌＰＢを含有しうる。カルシウムＩＳＥ用のポリマー膜１１５は、例えば、２５−３５重量％のＰＶＣ−ＣＯＯＨ、６０−７０重量％の１：１のＤＯＳ／ＮＰＯＥ、１−５重量％のＥＴＨ１００１、および０．２−２重量の％ＫＴｐＣｌＰＢを含有しうる。ｐＨまたはＣＯ２ＩＳＥ用のポリマー膜１１５は、例えば、２５−３５重量％のＰＶＣ−ＣＯＯＨ、６０−７０重量％のＤＯＳ、２−７重量％のＴＤＤＡ、および１−４重量％のＫＴｐＣｌＰＢを含有しうる。図６は、適切なポリマー膜１１５成分の特定の実施形態、およびそれらのそれぞれのさまざまな電気化学センサの重量比の例を示す。
【００３４】
さらに図３を参照すると、本発明によるポリマー膜１１５は、適切な量のポリマー、可塑剤、イオノフォア、および脂溶性塩添加剤を溶媒、一般的にはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはシクロヘキサノン、に溶解し、この溶液を電極カード６に埋込まれた金属要素１０５の露出表面に塗布することによって形成されうる。例えば、カリウムＩＳＥは、図６に記載された比に従ってＰＶＣ−ＣＯＯＨ（１．８重量％のＣＯＯＨ）、ＤＯＳ、バリノマイシン、およびＫＴｐＣｌＰＢを混合し、全質量を６３０〜６５０ｍｇにすることによって製造されうる。混合物は３〜３．５ｍＬ ＴＨＦ中に溶解され、この溶液の０．７５μＬが電極カード６に埋込まれた金属要素１０５（例えば、塩素化銀ワイヤ）の露出端に塗布される。溶媒が蒸発したら、同量の膜溶液を十分な乾燥時間をおいてさらに２回塗布する。最後の塗布の後溶媒が蒸発したら、ポリマー膜１１５が形成され、電極カード６に結合される。
【００３５】
再び図５を参照すると、一実施形態において、本発明による尿素センサは、まず内側溶液層１８０（例えば、ＭＥＳバッファー溶液）を電極カード６に埋込まれた金属要素１５５（例えば、銀／塩化銀または白金）の露出面に塗布することによって製造される。次に、ノナクチン、ポリ塩化ビニル、および１つもしくはそれ以上の可塑剤の溶液を内側溶液層１８０上に塗布し、イオン選択ポリマー層１７５を形成する。酵素層１７０は、ウレアーゼ、グルタチオン、ウシ血清アルブミン、およびグルタルアルデヒド溶液をイオン選択ポリマー層１７５の表面に塗布することによって形成される。最後に、親水性ポリウレタンの溶液を酵素層１７０上に塗布し、外側拡散層１６５を形成する。
【００３６】
本発明によるＩＳＥでは、試料中の被分析物の濃度の変化に起因する分析試料のミリボルト（ｍＶ）で測定される電位の変化が測定される。同様に、本発明によるガス電極では、試料中に溶解されたガスの分圧の変化に起因する分析試料の電位の変化が測定される。当業者であれば、電位値がネルンストの式による濃度または分圧値に関係があることを承知している。本発明による特定の実施形態においては、電極によって測定された電位値をネルンストの式を使用することによって被分析物の濃度または分圧値に変換するソフトウェアを電気化学センサシステムに含めることができる。
【００３７】
別の態様において、本発明は、脂溶性陰イオン性種（例えば、チオペンタールなど）の存在下で被分析物を検出および／または測定する際に、脂溶性陰イオン性種による干渉を受けることなく体液（例えば、血液）中の被分析物の存在を検出および／または濃度を測定するための方法である。本発明のこの方法は、センサのポリマー膜のポリマー成分としてＰＶＣ−ＣＯＯＨを含む体液中の対象被分析物を検出および／または測定するための電気化学センサを提供する。対象被分析物および脂溶性陰イオン性汚染物質を含有する体液試料が、センサのポリマー膜のポリマー成分としてＰＶＣ−ＣＯＯＨを含む電気化学センサと接触して配置される。次いで、体液試料中の対象被分析物が、脂溶性陰イオン性汚染物質による干渉が低減された中で電気化学センサによって測定および／または検出される。
【００３８】
以下の実施例は、本発明を説明するが、限定することは意図されていない。
【実施例】
【００３９】
実施例１
図７は、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するナトリウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のナトリウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、ＩＳＥによりナトリウムの濃度が１４２ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のナトリウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更したところ、ＩＳＥは１３７ｍＭのナトリウム濃度値に戻った。
【００４０】
図８は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのナトリウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のナトリウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、５つのＩＳＥのすべてでナトリウムの濃度が１３９ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のナトリウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更されたところ、５つの電極すべてが１３９ｍＭのナトリウム濃度値に戻った。ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥは、チオペンタールで汚染された試料の分析後に、ＨＭＷ−ＰＶＣベースのナトリウムＩＳＥに見られるドリフトを示すことはなかったが、このことは脂溶性陰イオン性汚染物質によって引き起こされるナトリウム測定障害の防止におけるＰＶＣ−ＣＯＯＨの有効性を示している。
【００４１】
実施例２
図９は、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するカリウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のカリウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、ＩＳＥによりカリウムの濃度が３．２ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のカリウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、ＩＳＥは２．８ｍＭのカリウム濃度値に戻った。
【００４２】
図１０は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのカリウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のカリウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、５つのＩＳＥのすべてでカリウムの濃度が３．３ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のカリウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更されたところ、５つの電極すべてが３．３ｍＭのカリウム濃度値に戻った。ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカリウムＩＳＥは、チオペンタールで汚染された試料の分析後に、ＨＭＷ−ＰＶＣベースのカリウムＩＳＥに見られるドリフトと比べて、わずかしか電位のドリフトを示さなかったが、このことは脂溶性陰イオン性汚染物質によって引き起こされるカリウム測定障害の防止におけるＰＶＣ−ＣＯＯＨの有効性を示している。
【００４３】
実施例３
図１１は、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するカルシウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のカルシウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、ＩＳＥによりカルシウムの濃度が０．９３ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のカルシウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、ＩＳＥは０．８１ｍＭのカルシウム濃度値に戻った。
【００４４】
図１２は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのカルシウムＩＳＥを含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知の濃度のカルシウムを含有する分析試料が電極カードに導入され、５つのＩＳＥのすべてでカルシウムの濃度が０．８７ｍＭであることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じ濃度のカルシウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、５つの電極は０．８５、０．８５、０．８６、０．８６、および０．８５ｍＭのカルシウム濃度値に戻った。ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカルシウムＩＳＥは、チオペンタールで汚染された試料の分析後にＨＭＷ−ＰＶＣをベースとするカルシウムＩＳＥに見られるほどの大きな電位のドリフトを示すことはなかったが、このことは脂溶性陰イオン性汚染物質によって引き起こされるカルシウム測定障害の防止におけるＰＶＣ−ＣＯＯＨの有効性を示している。
【００４５】
実施例４
図１３は、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するｐＨ電極を含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。既知のｐＨのバッファー溶液を含有する分析試料が電極カードに導入され、電極ではｐＨが７．６３であることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じバッファー溶液＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、電極は７．６８のｐＨ値に戻った。
【００４６】
図１４は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのｐＨ電極含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応の１つのグラフ表示である。既知のｐＨのバッファー溶液を含有する分析試料が電極カードに導入され、５つの電極のすべてでｐＨが７．６６であることが測定された。時間ｔで、分析試料が同じバッファー溶液＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、５つの電極は７．６８のｐＨ値に戻った。ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのｐＨ電極は、チオペンタールで汚染された試料の分析後にＨＭＷ−ＰＶＣをベースとするｐＨ電極に見られるほどの大きな電位のドリフトを示すことはなかったが、このことは脂溶性陰イオン性汚染物質によって引き起こされるｐＨ測定障害の防止におけるＰＶＣ−ＣＯＯＨの有効性を示している。
【００４７】
実施例５
図１５は、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するＣＯ２電極を含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。バッファー溶液を含有する分析試料が電極カードに導入された。溶液中のＣＯ２の分圧の２つの測定値を取り、結果を平均化し、６６ｍｍＨｇの値を得た。時間ｔで、分析試料が同じバッファー溶液＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、電極は１１５ｍｍＨｇのＣＯ２分圧値に戻った。
【００４８】
図１６は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する４つのＣＯ２電極を含む電極カードから記録されたクロノポテンシオメトリー反応のグラフ表示である。バッファー溶液を含有する分析試料が電極カードに導入された。４つの電極の各々で溶液中のＣＯ２の分圧の２つの測定値を取り、各電極の結果を平均化し、６７．９、６８．０、６８．０、および６８．２ｍｍＨｇの値を得た。時間ｔで、分析試料が同じバッファー溶液＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更され、４つの電極は７０．４、６８．８、６８．８、および７３．４ｍｍＨｇのＣＯ２の分圧値に戻った。ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのＣＯ２電極は、ＨＭＷ−ＰＶＣベースのＣＯ２電極に見られるドリフトと比べてチオペンタールで汚染された試料の分析後にわずかしか電位のドリフトを示さなかったが、このことは脂溶性陰イオン性汚染物質によって引き起こされるＣＯ２測定障害の防止におけるＰＶＣ−ＣＯＯＨの有効性を示している。
【００４９】
実施例６
図１７は、当技術分野で周知のポリマー成分としてＨＭＷ−ＰＶＣを含むＩＳＥポリマー膜のバルク膜抵抗のグラフ表示である。図１７によると、ＨＭＷ−ＰＶＣ膜は約２．４×１０７オームのバルク抵抗を有する。比較すると、図１８は、本発明によるポリマー成分としてＰＶＣ−ＣＯＯＨを含むＩＳＥポリマー膜のバルク膜抵抗が、ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するＩＳＥより１９倍以上低い約１．２５×１０６オームであることを示している。バルク膜抵抗性を低下させることによって、そのポリマー膜にＰＶＣ−ＣＯＯＨを使用して製造されたＩＳＥは、測定の電位の安定性および再現性の増強を示す。
【００５０】
実施例７
図１９は、全血液試料におけるナトリウム濃度の本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのナトリウムＩＳＥを含む電極カードによる測定値とＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有する既知のナトリウムＩＳＥによる測定値を比較するグラフ表示である。広範囲のナトリウムレベルを表す９９種類の全血試料のナトリウム濃度値を最初にＨＭＷ−ＰＶＣベースのナトリウムＩＳＥで測定し、次いでＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥで測定した。図１９によって示されているように、ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥから得られた値は、ＨＭＷ−ＰＶＣベースのナトリウムＩＳＥを使用して得られたものと十分に相関し（ｒ＝０．９９８３）、このことはＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥでは既知のナトリウム電極と同等の精度および正確度でナトリウムが測定されることを示している。
【００５１】
図２０は、ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカリウムＩＳＥを使用した同様の実験を示す。広範囲のカリウムレベルを表す１２７種類の全血試料のカリウム測定値を、最初にＨＭＷ−ＰＶＣベースのカリウムＩＳＥを使用して測定し、次いでＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカリウムＩＳＥで測定した。図２０によって示されているように、ＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカリウムＩＳＥから得られた値は、ＨＭＷ−ＰＶＣベースの電極を使用して得られたものと十分に相関し（ｒ＝０．９９９５）、このことはＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのカリウムＩＳＥでは既知のカリウム電極と同等の精度および正確度でカリウムが測定されることを示している。
【００５２】
実施例８
図２１は、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥの経時的な安定性のグラフ表示である。１日目、既知の濃度のナトリウムを含有する分析試料を、本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのナトリウムＩＳＥを含む電極カードに導入し、ナトリウムの濃度を測定した。次いで、分析試料を同じ濃度のナトリウム＋１０ｍｇ／ｄＬのチオペンタールを含有する溶液に変更し、ナトリウムの濃度を再び測定した。チオペンタール干渉による電極の電位のドリフトを表す、２つの測定値間の差（ΔＥＭＦ）を計算し、分析試料をセンサカードから除去した。この手順を２、４、６、９、１２、１４、および２０日目に繰返し、ΔＥＭＦ値を計算した。図２１が示すように、チオペンタールなどの脂溶性陰イオン性種が本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨベースのナトリウムＩＳＥに及ぼす影響は、電極の全寿命を通じてきわめて低いままである。
【００５３】
実施例９
尿素センサを以下の通り本発明に従って製造した。５０．９ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳカリウム塩、４６．６ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ非含有酸、２ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウムを含有するＭＥＳバッファー溶液を調製し、この溶液０．０５μＬをＰＶＣ電極カードに埋込まれた銀／塩化銀ワイヤの端に塗布した。次に、ＰＶＣ１５０ｍｇ、セバシン酸ジオクチル１００μＬ、２−ニトロフェニルオクチルエーテル１００μＬ、ＴＨＦ中１％カリウムテトラキス（４−クロロフェニル）ホウ酸塩１１０μＬ、および８ｍＬ ＴＨＦ中ＴＨＦ中５％ノナクチン３００μＬを組合わせることによってイオン選択膜溶液を調製した。この溶液の２つの０．７５μＬアリコートをＭＥＳバッファー層上に連続的に塗布し、イオン選択膜を形成した。次に、５０ｍｇ／ｍＬウレアーゼ（バイオザイム（Ｂｉｏｚｙｍｅ）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（ＣＡ））、２０ｍｇ／ｍＬグルタチオン、１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、および０．１２％グルタルアルデヒドをｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸バッファー中に含有する酵素溶液を調製し、この溶液０．０７５μＬをイオン選択膜に塗布した。最後に、ＴＨＦ中に０．１２ｇ／ｍｌのポリウレタン（テルメディックス社（Ｔｈｅｒｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ウォバーン、マサチューセッツ州）を含有する外側膜溶液を調製し、この溶液０．５μＬを酵素層上に塗布し、外側膜を形成した。尿素センサを使い捨てカートリッジに組み込み、ＧＥＭプレミア（Ｐｒｅｍｉｅｒ）３０００分析器（インスツルメンテーション・ラボラトリー・カンパニー（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）、レキシントン、マサチューセツ州）で試験した。
【００５４】
使用中、本発明による尿素センサは、センサの全寿命を通じて所定のスケジュールに従って使い捨てカートリッジに封入された較正溶液を使用して自動的に較正される。較正は、尿素センサの尿素に対する感度（すなわち、尿素反応曲線の傾き）およびカリウムに対する尿素のセンサの選択係数を測定するために実行される。本発明による尿素センサの感度を測定するために、上記の尿素センサを２種類の較正溶液で較正した。１．０ｍｍｏｌ／Ｌの尿素および２．０ｍｍｏｌ／Ｌのカリウムを含んだ最初の較正溶液（Ｃａｌ Ｂ）をカートリッジの試料チャネルへ導入し、尿素センサの信号を記録した。次に、７．５ｍｍｏｌ／Ｌ尿素および１５ｍｍｏｌ／Ｌカリウムを含んだＣａｌ Ｂを第２の較正溶液（Ｃａｌ Ｄ）で置換し、センサ反応を記録した。最後に、較正溶液をＣａｌ Ｂに切替え、センサ反応を再び記録した。センサは、較正および試料分析中を除き、つねにＣａｌ Ｂ溶液中に浸される。図２２に示されているように、尿素センサは、迅速、かつ安定的に尿素およびカリウム濃度の変化に反応したが、このことは本発明による尿素センサが分析試料の迅速な分析が可能であることを示す。
【００５５】
次に、尿素センサの分析性能を、３週間にわたって試験された６２個の全血液試料の尿素濃度を分析することによって評価した。血液試料は、試験の第４日、第９日、第１４日、および第２２日に試験された。各々試験のために、ヘパリン化全血液試料を健康な個人から採取し、濃縮尿素溶液でスパイクし、５〜７０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲の尿素濃度の試料を得た。次いで、各々の試料の尿素濃度値を上記のように本発明による尿素センサを使用して測定した。比較のために、各々のアリコートを分析後に遠心分離して血漿を単離し、血漿尿素濃度を従来の臨床化学分析器（モナーク（ＭＯＮＡＲＣＨ）、インスツルメンテーション・ラボラトリー・カンパニー（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、マサチューセツ州（ＭＡ））を使用して測定した。モナーク（Ｍｏｎａｒｃｈ）分析器では、ウレアーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、およびＮＡＤＨの二酵素反応と組合せた分光測光法が使用され、試料中の尿素濃度を検出する。モナーク分析器は３５ｍｍｏｌ／Ｌまでの尿素しか測定できないので、血漿試料は分析前に食塩水で希釈した。実験の結果は図２３に要約されている。
【００５６】
図２３が示すように、本発明の尿素センサから得られた尿素濃度値はモナーク分析器を使用して得られたものと十分に相関し（ｒ＝０．９９５）、これは本発明の尿素センサにより従来の化学分析器と同等の精度および正確度で尿素が測定されることを示す。本発明による尿素センサは、モナーク分析器よりも高価でなく、使用しやすいという追加の利点を有する。また、実験が示すように、尿素センサは少なくとも３週間の有効寿命を有する。
【００５７】
実施例１０
本発明による尿素センサのアンモニウムイオン選択膜は少なくとも部分的にカリウムイオンに対して透過性であるが、これは誤った尿素濃度値をもたらしうる。カリウム干渉の尿素濃度値を補正する１つの方法は、試料中のカリウム濃度を（例えば、本明細書に記載されたカリウムＩＳＥを使用して）独立して測定し、カリウム濃度と尿素センサのカリウムに対する尿素の選択係数に基づく補正係数を決定し、次いで補正係数を測定された尿素濃度値から引き、試料の実際の尿素濃度値を得るステップを含む。
【００５８】
本発明による尿素センサを使用する際にカリウム干渉が補正できるかを判定するために、２つの尿素センサを実施例９に記載された方法に従って製造し、カリウムＩＳＥも含む使い捨てカートリッジへ組込んだ。各々の尿素センサの選択係数は、２つの較正溶液、すなわちＣａｌ Ａ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ尿素、７．５ｍｍｏｌ／Ｌカリウム）およびＣａｌ Ｂ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ尿素、２．０ｍｍｏｌ／Ｌカリウム）で較正することによって測定された。５つの全血液試料を異なる量のカリウムでスパイクし、８〜２４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲のカリウム濃度の試料を得た。非スパイク試料は、４．２ｍｍｏｌ／Ｌのカリウム濃度および５．０ｍｍｏｌ／Ｌの尿素濃度を有した。各々の試料をカートリッジへ導入し、カリウムおよび尿素濃度値を記録した。尿素濃度値を選択係数およびカリウム濃度に基づき補正した。実験の結果は、以下の表１に要約されている。
【００５９】
【表１】
【００６０】
表１が示すように、カリウム干渉は本発明による尿素センサのために有効に除去できる。
【００６１】
本明細書に記載されているものの変型、変更、および他の実施は、請求された発明の精神および範囲を逸脱することなく当業者には考え及ぶであろう。したがって、本発明は、前記例示的説明によってではなく、冒頭の特許請求の範囲の精神および範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】電極カードおよび試料注入口を有するセンサカートリッジ、蠕動ポンプ、およびマイクロプロセッサを含む、本発明による電気化学センサシステムの実施形態の構成要素を示す概略図である。
【図２】本発明による電極カードの実施形態を示す正面図である。
【図３】本発明によるイオン選択電極（ＩＳＥ）の実施形態を示す断面図である。
【図４】本発明による二酸化電極（ＣＯ２）の実施形態を示す断面図である。
【図５】本発明による酵素電極の実施形態を示す断面図である。
【図６】４種類のＩＳＥのポリマー膜成分およびそのそれぞれの重量％の例を含む表である。
【図７】高分子量ポリ塩化ビニル（ＨＭＷ−ＰＶＣ）を含有するポリマー膜を有するナトリウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールナトリウム（チオペンタール）で汚染された試料を含有するナトリウムの分析前後に取られた測定値を示すグラフ表示である。
【図８】本発明によるカルボキシル化ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ−ＣＯＯＨ）含有するポリマー膜を有する５つのナトリウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図９】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するカリウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１０】本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのカリウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１１】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するカルシウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１２】本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのカルシウムＩＳＥを含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１３】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するｐＨ電極を含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１４】本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのｐＨ電極を含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応の１つと、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１５】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するＣＯ２電極を含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染されたカルシウム含有試料の分析前後の測定値を示すグラフ表示である。
【図１６】本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する４つのＣＯ２電極を含む電極カードのクロノポテンシオメトリー反応と、１０ｍｇ／ｄＬチオペンタールで汚染された試料の分析前後に取られた測定値とともを示すグラフ表示である。
【図１７】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するＩＳＥのバルク膜抵抗を示すグラフ表示である。
【図１８】ＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有するＩＳＥのバルク膜抵抗を示すグラフ表示である。
【図１９】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するナトリウムＩＳＥによって測定された全血液試料中のナトリウム濃度値と本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのナトリウムＩＳＥを含む電極カードによって測定されたものとの比較を示すグラフ表示である。
【図２０】ＨＭＷ−ＰＶＣを含有するポリマー膜を有するカリウムＩＳＥによって測定された全血液試料中のカリウム濃度値と本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有する５つのカリウムＩＳＥを含む電極カードによって測定されたものとの比較を示すグラフ表示である。
【図２１】本発明によるＰＶＣ−ＣＯＯＨを含有するポリマー膜を有するナトリウムＩＳＥの経時的な電位のマイナスドリフトを示すグラフ表示である。
【図２２】２種類の較正溶液に対する本発明による尿素センサの反応を示すグラフ表示である。
【図２３】市販の臨床化学分析器によって測定された血漿試料中の尿素濃度値と本発明による尿素センサを含む電極カードによって測定された対応する全血液試料中の尿素濃度値との比較を示すグラフ表示である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の尿素を検出するためのセンサであって、
電極と、
酵素層と、
前記試料と前記酵素層との間に配置された外側拡散層と、
を含み、
前記外側拡散層が尿素に透過性であるセンサ。
【請求項２】
前記電極が、金属電極を含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記電極が、銀／塩化銀電極を含む請求項２に記載のセンサ。
【請求項４】
前記酵素層が、尿素のアンモニウムイオンへの加水分解を触媒する請求項１に記載のセンサ。
【請求項５】
前記酵素層が、ウレアーゼを含む請求項４に記載のセンサ。
【請求項６】
前記酵素層が、１つもしくはそれ以上の酵素安定剤をさらに含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項７】
前記酵素安定剤が、ポリペプチドおよび不活性タンパク質からなる群から選択される請求項６に記載のセンサ。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、グルタチオンを含む請求項７に記載のセンサ。
【請求項９】
前記不活性タンパク質が、ウシ血清アルブミンを含む請求項７に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記酵素層が、グルタチオンに架橋結合されたウレアーゼを含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項１１】
ウレアーゼおよびグルタチオンの少なくとも１つに架橋結合された１つもしくはそれ以上の不活性タンパク質をさらに含む請求項１０に記載のセンサ。
【請求項１２】
前記不活性タンパク質が、ウシ血清アルブミンを含む請求項１１に記載のセンサ。
【請求項１３】
前記外側拡散層が、ポリマーを含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項１４】
前記ポリマーが、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）イオノマー、ポリ−（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ塩化ビニル、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、水酸化ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、酢酸セルロース、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１３に記載のセンサ。
【請求項１５】
前記ポリマーが、ポリウレタンを含む請求項１４に記載のセンサ。
【請求項１６】
前記電極と前記酵素層との間に配置されたイオン選択膜をさらに含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項１７】
前記イオン選択膜が、アンモニウムイオン選択膜を含む請求項１６に記載のセンサ。
【請求項１８】
前記イオン選択膜が、
ポリマーマトリクスと、
その中に配置されたアンモニウム選択イオノフォアと、
を含む請求項１７に記載のセンサ。
【請求項１９】
前記ポリマーマトリクスが、ポリ塩化ビニル、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、水酸化ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（メチルメタクリレート）、シリコーンゴム、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１８に記載のセンサ。
【請求項２０】
前記ポリマーマトリクスが、ポリ塩化ビニルを含む請求項１９に記載のセンサ。
【請求項２１】
前記イオノフォアが、ノナクチン、モナクチン、ジナクチン、トリナクチン、テトラナクチン、ナラシン、ヘキサオキサヘプタシクロトリテトラコンタン、ベンゾクラウンエーテル、環状デプシペプチド、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１８に記載のセンサ。
【請求項２２】
前記イオノフォアが、ノナクチンを含む請求項２１に記載のセンサ。
【請求項２３】
前記試料が、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、および尿からなる群から選択される請求項１に記載のセンサ。
【請求項２４】
前記試料が、血液である請求項２３に記載のセンサ。
【請求項２５】
基板と、
前記基板の上または中に配置された請求項１に記載の１つもしくはそれ以上のセンサと、
を含むセンサカード。
【請求項２６】
請求項１に記載のセンサを形成する方法であって、前記方法が、
電極を用意するステップと、
前記電極の少なくとも１つの表面に酵素層を塗布するステップと、
前記酵素層上に外側拡散層を塗布するステップと、
を含み、
前記センサが試料中の尿素を検出または測定する方法。
【請求項２７】
請求項１５に記載のセンサを形成する方法であって、前記方法が、
電極を用意するステップと、
前記電極の少なくとも１つの表面にイオン選択膜を塗布するステップと、
前記イオン選択膜に酵素層を塗布するステップと、
前記酵素層上に外側拡散層を塗布するステップと、
を含み、
前記センサが試料中の尿素を検出または測定する方法。
【請求項１】
試料中の尿素を検出するためのセンサであって、
電極と、
酵素層と、
前記試料と前記酵素層との間に配置された外側拡散層と、
を含み、
前記外側拡散層が尿素に透過性であるセンサ。
【請求項２】
前記電極が、金属電極を含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記電極が、銀／塩化銀電極を含む請求項２に記載のセンサ。
【請求項４】
前記酵素層が、尿素のアンモニウムイオンへの加水分解を触媒する請求項１に記載のセンサ。
【請求項５】
前記酵素層が、ウレアーゼを含む請求項４に記載のセンサ。
【請求項６】
前記酵素層が、１つもしくはそれ以上の酵素安定剤をさらに含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項７】
前記酵素安定剤が、ポリペプチドおよび不活性タンパク質からなる群から選択される請求項６に記載のセンサ。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、グルタチオンを含む請求項７に記載のセンサ。
【請求項９】
前記不活性タンパク質が、ウシ血清アルブミンを含む請求項７に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記酵素層が、グルタチオンに架橋結合されたウレアーゼを含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項１１】
ウレアーゼおよびグルタチオンの少なくとも１つに架橋結合された１つもしくはそれ以上の不活性タンパク質をさらに含む請求項１０に記載のセンサ。
【請求項１２】
前記不活性タンパク質が、ウシ血清アルブミンを含む請求項１１に記載のセンサ。
【請求項１３】
前記外側拡散層が、ポリマーを含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項１４】
前記ポリマーが、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）イオノマー、ポリ−（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ塩化ビニル、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、水酸化ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、酢酸セルロース、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１３に記載のセンサ。
【請求項１５】
前記ポリマーが、ポリウレタンを含む請求項１４に記載のセンサ。
【請求項１６】
前記電極と前記酵素層との間に配置されたイオン選択膜をさらに含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項１７】
前記イオン選択膜が、アンモニウムイオン選択膜を含む請求項１６に記載のセンサ。
【請求項１８】
前記イオン選択膜が、
ポリマーマトリクスと、
その中に配置されたアンモニウム選択イオノフォアと、
を含む請求項１７に記載のセンサ。
【請求項１９】
前記ポリマーマトリクスが、ポリ塩化ビニル、カルボキシル化ポリ塩化ビニル、水酸化ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（メチルメタクリレート）、シリコーンゴム、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１８に記載のセンサ。
【請求項２０】
前記ポリマーマトリクスが、ポリ塩化ビニルを含む請求項１９に記載のセンサ。
【請求項２１】
前記イオノフォアが、ノナクチン、モナクチン、ジナクチン、トリナクチン、テトラナクチン、ナラシン、ヘキサオキサヘプタシクロトリテトラコンタン、ベンゾクラウンエーテル、環状デプシペプチド、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１８に記載のセンサ。
【請求項２２】
前記イオノフォアが、ノナクチンを含む請求項２１に記載のセンサ。
【請求項２３】
前記試料が、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、および尿からなる群から選択される請求項１に記載のセンサ。
【請求項２４】
前記試料が、血液である請求項２３に記載のセンサ。
【請求項２５】
基板と、
前記基板の上または中に配置された請求項１に記載の１つもしくはそれ以上のセンサと、
を含むセンサカード。
【請求項２６】
請求項１に記載のセンサを形成する方法であって、前記方法が、
電極を用意するステップと、
前記電極の少なくとも１つの表面に酵素層を塗布するステップと、
前記酵素層上に外側拡散層を塗布するステップと、
を含み、
前記センサが試料中の尿素を検出または測定する方法。
【請求項２７】
請求項１５に記載のセンサを形成する方法であって、前記方法が、
電極を用意するステップと、
前記電極の少なくとも１つの表面にイオン選択膜を塗布するステップと、
前記イオン選択膜に酵素層を塗布するステップと、
前記酵素層上に外側拡散層を塗布するステップと、
を含み、
前記センサが試料中の尿素を検出または測定する方法。
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２００８−５０２９２１（Ｐ２００８−５０２９２１Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７６８８（Ｐ２００７−５２７６８８）
【出願日】平成１７年６月８日（２００５．６．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２０１２０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２３９３８
【国際公開日】平成１７年１２月２９日（２００５．１２．２９）
【出願人】（５０６３９１８６４）インストゥルメンテーション ラボラトリー カンパニー (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月８日（２００５．６．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２０１２０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２３９３８
【国際公開日】平成１７年１２月２９日（２００５．１２．２９）
【出願人】（５０６３９１８６４）インストゥルメンテーション ラボラトリー カンパニー (7)
【Ｆターム（参考）】
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