霊長類におけるフィロウイルス感染に対する予防ワクチンの開発
【課題】エボラウイルス等のフィロウイルスに対する免疫応答を誘発し、その感染により引き起こされる疾患を予防する方法を提供する。
【解決手段】ビリオン糖タンパク質をコードする特定の塩基配列、又は該塩基配列と少なくとも９５〜１００％の同一性を有する塩基配列であって、発現を指示する塩基配列を含む、発現ベクターを用いる。
【解決手段】ビリオン糖タンパク質をコードする特定の塩基配列、又は該塩基配列と少なくとも９５〜１００％の同一性を有する塩基配列であって、発現を指示する塩基配列を含む、発現ベクターを用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は包括的に、ウイルスワクチン、特にフィロウイルスワクチンに、ならびにフィロウイルスに対する免疫応答またはフィロウイルスの感染により引き起こされる疾患を誘発する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エボラウイルス、及び遺伝的に関連するマールブルグウイルスは、北米、欧州およびアフリカにおけるヒトおよび霊長類の高致死性出血熱の大発生に関連するフィロウイルスである（非特許文献１または２）。エボラウイルスは、４つのサブタイプ（例えばザイール、スーダン、レストンおよび象牙海岸エピソード（episode）に記載されたもの）からなるマイナス鎖（negative-stranded）ＲＮＡウイルスである（非特許文献３）。いくつかのサブタイプが定義されているが、しかしこれらのウイルスの遺伝子構成は類似しており、それぞれ７つの線状アレイ遺伝子（linearly arrayed genes）を含有する。ウイルスタンパク質の１つであるエンベロープ糖タンパク質は２つの代替的形態で存在し、その２つの形態とは、ウイルスゲノムによりコードされる未知の機能を有する５０〜７０キロダルトン（ｋＤａ）の分泌タンパク質と、ウイルス進入を媒介するＲＮＡエディティング（editing）により生成される１３０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である（非特許文献１または３）。その他の構造遺伝子産物としては、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質ＶＰ２４およびＶＰ４０、推定非構造タンパク質ＶＰ３０およびＶＰ３５、ならびにウイルスポリメラーゼが挙げられる（非特許文献１で検討されている）。そのＲＮＡ配列の自発突然変異は天然で起きるが、しかし他のＲＮＡウイルス内よりも、エボラサブタイプ内では低ヌクレオチド多型性であると思われ（非特許文献３）、これは免疫感作がこの疾患に対する防御に有用であり得ることを示唆する。しかしながら伝統的な能動的および受動的免疫感作アプローチを用いたエボラウイルスに対する防御的免疫応答を誘発する従来の試みは、霊長類では成功していない（非特許文献１、４または５）。したがって、フィロウイルスに対する免疫応答またはフィロウイルス感染により引き起こされる疾患を誘発するためのワクチンを提供することが望まれている。さらに上記のワクチンを製造し、用いる方法を提供することが望まれている。
【非特許文献１】Peters, C.J. et al. in : Fields Virology, eds. Fields, B.N. et al. 1161-1176, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996
【非特許文献２】Peters, C.J. et al. 1994 Semin Virol 5: 147-154
【非特許文献３】Sanchez, A. et al. 1996 PNAS USA 93: 3602-3607
【非特許文献４】Clegg, J.C.S. et al. 1997 New Generation Vaccines, eds. : Levine, M.M. et al. 749-765, New York, NY. Marcel Dekker, Inc.
【非特許文献５】Jahrling, P.B. et al. 1996 Arch Virol Suppl 11: 135-140
【発明の開示】
【０００３】
エボラウイルスにより引き起こされる出血熱の大発生は、このヒト病原体の顕著な特徴である高死亡率と関連付けられる。最高致死率は、今日までに同定された４つの株のうちの１つであるザイールサブタイプと関連付けられる（Feldmann, H. et al. 1994 Virology 199: 469-473 ;Sanchez, A. et al. 1996 PNAS USA 93: 3602-3607）。その急速な進行は、天然免疫を発現する機会をほとんど与えず、現在、有効な抗ウイルス療法は存在しない。したがって予防接種は、感染を予防し、伝染を制限するための有望な手段を提供する。本明細書に、霊長類におけるエボラウイルス感染に対する非常に有効なワクチン戦略を記載する。ＤＮＡ免疫感作、およびウイルスタンパク質をコードするアデノウイルスベクターによる追加免疫の組合せは、カニクイマカクザルにおいて細胞性および体液性免疫を生じた。致死用量のエボラ・ザイールウイルスの高病原性野生型１９７６マインガ（Mayi
nga）株を用いた攻撃誘発(challenge)は、対照において均一感染を引き起こし、それらのカニクイマカクザルは１週間未満で瀕死状態および死に至った。対照的に、予防接種された動物は全て、６ヶ月より長い間無症候性であり、最初の攻撃誘発後、検出可能なウイルスは認められなかった。これらの知見は、霊長類におけるエボラウイルス感染に対する予防ワクチンを開発することができることを実証している。
【０００４】
【表１】
【０００５】
【表２−１】
【表２−２】
【０００６】
［発明の詳細な説明］
薬学的に許容可能な賦形剤中で、対照配列に作動可能的に連結された、フィロウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子を含むフィロウイルスワクチンが提供される。一実施形態では、核酸分子は膜貫通形態のウイルス糖タンパク質（ＧＰ）をコードする。別の実施形態では、核酸分子は分泌形態のウイルス糖タンパク質（ＳＧＰ）をコードする。さ
らに別の実施形態では、核酸分子はウイルス核タンパク質（ＮＰ）をコードする。
【０００７】
本発明はさらに、ＧＰ、ＳＧＰおよびＮＰ以外のフィロウイルス構造タンパク質（例えば、フィロウイルスに対する免疫応答またはフィロウイルス感染により引き起こされる疾患を誘発するその他の構造遺伝子産物）をコードする核酸分子を含むワクチンを包含する。本発明のワクチンの核酸分子は、任意のエボラウイルス株（例えばザイール、スーダン、象牙海岸およびレストン株）の構造遺伝子産物をコードする。遺伝的に関連するマールブルグウイルス株の構造遺伝子産物をコードする核酸分子も用いられ得る。さらに本発明の核酸分子は修飾され得る。例えば本明細書中に記述された核酸分子は、修飾発現タンパク質が病原体または疾患に対する免疫応答を誘発する限り、突然変異化され得る。例えば核酸分子は、発現タンパク質が細胞に低毒性であるよう、突然変異化され得る。本発明は、核酸分子の組合せを含むワクチンも包含する。例えばザイール、スーダンおよび象牙海岸エボラ株のＧＰ、ＳＧＰおよびＮＰをコードする核酸分子が任意の組合せで、１つのワクチン組成物中に組合され得るが、これらに限定されない。
【０００８】
本発明は、フィロウイルス感染により引き起こされる疾患に対して被験体を免疫感作するための方法であって、免疫有効量のフィロウイルスワクチンを被験体に投与することを含む方法も提供する。薬学的組成物の調製を含めた、フィロウイルスワクチンの製造および使用方法も、本発明により提供される。
【０００９】
エボラウイルスの分泌およびビリオン糖タンパク質の生化学的分析
エボラ（ＥＢＯ）ウイルスは、フィロウイルス（Filoviridae）の成員であり、ヒトおよび／または非ヒト霊長類において重篤な、しばしば致命的な形態の出血熱疾患を引き起こす。フィロウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子は、マイナス鎖ＲＮＡゲノムの３’末端から（７つのうちの）４番目の遺伝子である。ある程度まで特性化されたＥＢＯウイルスは全て、構造ＧＰよりむしろ分泌非構造糖タンパク質（ＳＧＰ）の発現を生じる、同一の非従来型のＧＰ遺伝子構成を有する。ＳＧＰは単一フレーム（０フレーム）でコードされるが、一方、ＧＰは２つのフレーム（０および−１フレーム）でコードされる。ＧＰの発現は、単一の追加のアデノシンの挿入（一連の７つのアデノシンに付加される）を生じる転写エディティング事象を介して２つのフレームが連結される場合に起こる。
【００１０】
図４４を参照すると、ＥＢＯウイルスのザイール種に関しては、ＳＧＰ（３６４総残基）およびＧＰ（６７６総残基）のＮ末端２９５残基（シグナル配列を含む）は同一であるが、それらのＣ末端配列の長さおよび構成は独特である。タイプ１膜貫通タンパク質であるＧＰは、感染ビリオンの表面に見出され、感受性細胞へのウイルスの結合および進入において付着構造で機能する。全種のＥＢＯウイルスに関するＧＰ予測アミノ酸配列の比較は、Ｎ末端およびＣ末端領域における一般的保存を示し（各々、総配列の約３分の１）、高可変性中区分により分離される。このタンパク質は、高度にグリコシル化され、多量のＮ−およびＯ−連結グリカンを含有し、マールブルグ（ＭＢＧ）ウイルス（別の種類のフィロウイルス）に関しては、三量体を形成することが示されている。ＧＰの膜貫通アンカー配列（残基６５０〜６７２）に対する直Ｎ末端は、フィロウイルスにおいて高度に保存されるモチーフ（残基５８５〜６０９）である。この配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫抑制性であることが示されている腫瘍形成性レトロウイルスの糖タンパク質中の一モチーフと高度の相同性を有する。一部重複するこのモチーフは、他のウイルスの表面糖タンパク質に関して予測される構造と同様に、三量体のアセンブリーにおける分子間コイルドコイルの形成において機能すると考えられる七価基反復配列（５３残基；位置５４１〜５９３）である。この配列に対する直（immediately）Ｎ末端は、サブチリシン／ケキシン様転換酵素フリンに関する推定上の多塩基切断部位が直ぐ後に続く予測融合ペプチドである。フリンによる切断は、特異的阻害剤を使用して間接的に実証されており、配列ＲＲＴＲ↓の最後のアルギニン（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始からの位置５０１
）で起こると予測される。ＳＧＰの役割はほとんど定義されていないが、しかしＳＧＰは好中球と結合し、一方ＧＰは内皮細胞と結合することが近年の研究により示された。ＳＧＰとＧＰの異なる結合パターンは、同一のＮ末端アミノ酸配列（〜２８０残基）を有するにもかかわらず、これらの糖タンパク質は構造的に互いに全く異なることを示唆する。
【００１１】
図４５を参照すると、エボラウイルスのザイール種により発現される糖タンパク質は、切断、オリゴマー化およびその他の構造特性に関して分析され、それらの機能をより明確に定義した。２９５Ｎ末端残基を共有する５０〜７０ｋＤａの分泌糖タンパク質および１５０ｋＤａのビリオン／構造糖タンパク質（それぞれＳＧＰおよびＧＰ）は、シグナラーゼによりＮ末端近くで切断される。フリンにより媒介される傾向が高い多塩基部位（ＲＲＴＲＲ↓）（配列番号５１）で、ＧＰで起きる二次切断事象は、ジスルフィド結合により連結される２つの糖タンパク質（ＧＰ１およびＧＰ２）を生じる。このフリン切断部位は、全てのエボラウイルスのＧＰ中で同一位置に存在し（Ｒ［Ｒ／Ｋ］Ｘ［Ｒ／Ｋ］Ｒ↓）、しかしながら１つはマールブルグウイルスウイルスに関して（Ｒ［Ｒ／Ｋ］ＫＲ↓）異なる位置で予測される。架橋試験の結果に基づいて、エボラビリオンペプロマーはＧＰ１−ＧＰ２へテロダイマーの三量体から成り、そしてそれらの構造的な面はレトロウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のようなレンチウイルスを含む）、パラミクソウイルスおよびインフルエンザウイルスのものに類似することを研究者は確定することができた。ＳＧＰは、ほとんどもっぱらジスルフィド結合により連結されるホモダイマーの形態で、感染細胞から分泌されることも研究者は確定した。
【００１２】
図４６を参照すると、エボラウイルス病原性の主要ウイルス決定因子を特定した；ザイール型エボラウイルスのビリオン糖タンパク質（ＧＰ）の合成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのヒト内皮細胞における細胞傷害作用を誘導した。この作用は、ウイルスの７つの遺伝子産物のうちの１つであるこのＩ型膜貫通糖タンパク質のセリン−トレオニンに富むムチン様ドメインにマップされた。移植されたヒトまたはブタ血管へのＧＰの遺伝子移入は、４８時間以内に内皮細胞の大損失を引き起こし、血管透過性の重大な増大をもたらした。ＧＰのムチン様領域の欠失は、タンパク質の発現または機能に影響を及ぼさずに、これらの作用を消失させた。非ヒト霊長類においては疾患を引き起こすがヒトにおいては引き起こさないレストン株ウイルス由来のＧＰは、ヒト血管の血管系を崩壊させなかった。これに対比して、ザイール型ＧＰは非ヒト霊長類およびヒトの両方の血管において内皮細胞崩壊および細胞傷害を誘導し、ムチンドメインがこの作用のために必要とされた。これらの知見は、ＧＰのムチンドメインがエボラ病原性のウイルス決定因子であり、感染中の出血に関与すると思われることを示す。
【００１３】
核酸分子
本明細書中に示されているように、本発明の核酸分子は、クローニングにより得られるかまたは合成的に生産されるＲＮＡまたはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても既知であるコード鎖であり得るし、あるいはアンチセンス鎖としても言及される非コード鎖であり得る。
【００１４】
「単離」核酸分子（単数または複数）とは、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えばベクター中に含入される組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞中に保持される組換えＤＮＡ分子または溶液中の精製（部分的または実質的な）ＤＮＡ分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子としては、本発明のＤＮＡ分子のｉｎ
ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写体が挙げられる。本発明の単離核酸分子としてはさらに、合成的に生産されたこのような分子が挙げられる。
【００１５】
本発明の核酸分子としては、野生型フィロウイルス構造遺伝子産物をコードするオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子、ならびに上記のものとは実質的に異なる配列であるが、遺伝コードの縮重のために、依然として野生型フィロウイルス構造遺伝子産物のＯＲＦをコードする配列を含むＤＮＡ分子が挙げられる。もちろん遺伝コードは、当該技術分野で既知である。
【００１６】
本発明はさらに、本明細書中に記載された核酸分子の断片を対象とする。野生型フィロウイルス構造遺伝子産物をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列を有する核酸分子の断片とは、少なくとも約１５ｎｔ．長、さらに好ましくは少なくとも約２０ｎｔ．長、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ．長、さらに好ましくは少なくとも約４０ｎｔ．長の断片を意図する。もちろんより長い断片、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ｎｔ．長も、野生型フィロウイルス構造遺伝子産物をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列のほとんど（全てではないとしても）に対応する断片であり、本発明により意図される。例えば少なくとも２０ｎｔ．長の断片とは、野生型フィロウイルス構造遺伝子産物のＯＲＦのヌクレオチド配列からの２０またはそれ以上の連続塩基を含む断片を意図する。
【００１７】
本発明の好ましい核酸断片としては、フィロウイルス構造タンパク質のエピトープ保有部分をコードする核酸分子が挙げられる。特に本発明のこのような核酸断片としては、フィロウイルス構造タンパク質のエピトープ保有ドメインをコードする核酸分子が挙げられるが、この場合、ドメインはＧＰ／ＳＧＰ同一性ドメイン、ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカードメインおよび細胞内ドメインならびにそれらの任意の組合せ、例えば膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーション（truncation）を有するフィロウイルスの糖タンパク質；七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質である。別の例は、ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカードメインまたは細胞内ドメインを欠失するためのアミノ、内部またはカルボキシ欠失を有するフィロウイルスの糖タンパク質である。
【００１８】
別の態様において、本発明は、上記の本発明の核酸分子中のポリヌクレオチドの一部分と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で一晩インキュベートし、その後、０．１ｘＳＳＣ中約６５℃でフィルターを洗浄することを意味する。
【００１９】
ポリヌクレオチドの「一部分」とハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ．）、さらに好ましくは少なくとも約２０ｎｔ．、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ．、さらに好ましくは約３０〜７０ｎｔ．の参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意味する。
【００２０】
「少なくとも２０ｎｔ．長」のポリヌクレオチドの一部分とは、例えば参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列からの２０またはそれ以上の連続ヌクレオチドを意味する。もちろん、ポリＡ配列あるいはＴ（またはＵ）残基の相補的ストレッチのみとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリＡストレッチまたはその相補体（例えば特に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含有する任意の核酸分子とハイブリダイズするため、本発明の核酸の一部分とハイブリダイズするために用いられる本発明のポリヌクレオチドには含まれない。
【００２１】
本明細書中に示されるように、フィロウイルス構造遺伝子産物をコードする本発明の核酸分子としては、全長ポリペプチドのアミノ酸配列を単独でコードするもの、全長ポリペプチドおよび付加的配列に関するコード配列、例えばリーダーまたは分泌配列、例えばプレ−またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列をコードするもの、付加的非コード配列（例えばイントロンおよび非コード５’および３’配列が挙げられるが、これらに限定されない）とともに上記の付加的コード配列を伴うかまたは伴わない全長ポリペプチドのコード配列、例えば転写、ｍＲＮＡプロセシング、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル、例えばリボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性において機能する転写化非翻訳化配列；ならびに付加的アミノ酸をコードする付加的コード配列、例えば付加的官能基を提供するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明はさらに、フィロウイルス構造遺伝子産物の一部分、類似体または誘導体をコードする、本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」とは、生物体のゲノム上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替的形態のうちの１つを意味する（Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, 1985 New York）。非天然変異体は、当該技術分野で既知の突然変異誘発技法を用いて生産され得る。
【００２３】
このような変異体としては、１つまたは複数のヌクレオチドを包含し得る、ヌクレオチド置換、欠失または付加により生産されるものが挙げられる。変異体は、コード領域、非コード領域またはその両方で変更され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいのは、フィロウイルス構造遺伝子産物またはその一部分の特性および活性を変更しないサイレント置換、付加および欠失である。保存的置換もこの点において特に好ましい。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態としては、野生型フィロウイルス構造遺伝子産物またはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列あるいはそれと相補的なヌクレオチド配列と、少なくとも９５％同一の、さらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸分子が挙げられる。
【００２５】
フィロウイルス構造遺伝子産物をコードする参照ヌクレオチド配列と、例えば少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、エボラウイルス構造遺伝子産物をコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり、ポリヌクレオチド配列が５つまでの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失されるかまたは別のヌクレオチドで置換され得るか、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの数の５％までの数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置で、あるいは参照配列中のヌクレオチド間に独立して、あるいは参照配列内の１つまたは複数の連続基中に点在されるそれらの末端位置間のいずれで
も起こり得る。
【００２６】
実際的問題として、任意の特定の核酸分子が参照ヌクレオチド配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、既知のコンピュータープログラム、例えばＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711）を用いて従来通りに確定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Smith and Waterman, 1981 Advances in Applied Mathematics 2: 482-489の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最良セグメントを見つけ出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて、特定の配列が、例えば本発明の参照配列と９５％同一であるか否かを確定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長に亘って算定され、参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許されるように設定される。
【００２７】
本発明の出願は、エボラ、マールブルグまたはラッサウイルスポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードする、本願の配列表中に示された核酸配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の核酸分子を対象とする。「エボラ、マールブルグまたはラッサウイルスポリペプチド活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにおいてエボラ、マールブルグまたはラッサウイルスポリペプチド活性を示すポリペプチドを意味する。例えば、ＧＰ、ＳＧＰまたはＮＰタンパク質活性は、適切な免疫学的アッセイにより、免疫学的特質における変化に関して測定され得る。
【００２８】
もちろん、遺伝コードの縮重のために、本願の配列表中に示された核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する多数の核酸分子が、「エボラ、マールブルグまたはラッサウイルスポリペプチド活性を有する」ポリペプチドをコードすると当業者は容易に理解するであろう。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体は全て同一ポリペプチドをコードするため、これは上記の比較アッセイを実施するまでもなく、当業者には明らかである。縮重変異体でないこのような核酸分子に関しては、合理的な数（a reasonable number）が、エボラ、マールブルグまたはラッサウイルスポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードすることが当該技術分野においてさらに理解されるであろう。これは、タンパク質機能に有意な影響を与えるとはあまり考えられないかまたは考えられないアミノ酸置換（例えばある脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸に置換すること）に、当業者は十分に気づくためである。
【００２９】
例えば、表現型性サイレントアミノ酸置換の作製方法に関する指針は、Bowie, J.U. et
al. 1990 Science 247: 1306-1310に記載されており、その記載では、タンパク質は意外にもアミノ酸置換に寛容であると著者等は示している。
【００３０】
ポリペプチドおよび断片
本発明はさらに、野生型フィロウィルス構造遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされるアミノ酸配列を有するフィロウイルスポリペプチド、あるいはその一部分を含むペプチドまたはポリペプチド（例えばＳＧＰ）を提供する。
【００３１】
フィロウイルスポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能の有意の作用を伴わずに変更され得ると当該技術分野では理解される。配列におけるこのような差異が意図される場合、活性を確定するタンパク質に重要な領域が存在するということを思い起こすべきである。
【００３２】
したがって本発明はさらに、実質的フィロウイルスポリペプチド活性を示し、あるいは
下記のタンパク質部分のようなフィロウイルスタンパク質の領域を含む、フィロウイルスポリペプチドの変異を包含する。このような突然変異体としては、欠失、挿入、逆位、反復および型置換が挙げられる。上記のように、アミノ酸変化が表現型性サイレントであるかどうかを考えるに関する指針は、Bowie, J.U. et al. 1990 Science 247: 1306-1310に見出され得る。
【００３３】
したがって、本発明のポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、このような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであり得るかまたはあり得ないもの、あるいは（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されたもの、例えばＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド、あるいはリーダーまたは分泌配列、あるいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列であり得る。このような断片、誘導体および類似体は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００３４】
上記のように、好ましくは性質の変化が僅かなものであり、例えばタンパク質のフォールディングまたは活性に有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である（表Ａ参照）。
【００３５】
【表３】
【００３６】
もちろん、当業者が作製するアミノ酸置換の数は、上記したものを含めた多数の因子に依存している。概して、任意の所定のフィロウイルスポリペプチドに関するアミノ酸置換の数は、５０、４０、３０、２０、１０、５または３より少ない。
【００３７】
機能に不可欠な本発明のフィロウイルスポリペプチド中のアミノ酸は、当該技術分野で
既知の方法により、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発により同定され得る（Cunningham & Wells 1989 Science 244: 1081-1085）。後者の手法は、分子中の全ての残基に単一アラニン突然変異を導入する。その結果生じた突然変異体分子は次に、生物学的活性、例えば免疫学的特質の変化に関して試験される。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、便宜上、単離形態で提供される。「単離ポリペプチド」とは、そのネイティブ環境から取り出されたポリペプチドを意味する。したがって組換え宿主細胞内に生産されるかおよび／または含有されるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたと考えられる。「単離ポリペプチド」とは、組換え宿主細胞またはネイティブ供給源から、部分的にまたは実質的に精製されたポリペプチドも意味する。例えば、組換えにより生産されたバージョンのフィロウイルスポリペプチドは、Smith and Johnson 1988 Gene 67: 31-40に記載された一段階法により実質的に精製され得る。
【００３９】
本発明のポリペプチドとしては、野生型フィロウイルス構造遺伝子産物またはその一部分のアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは本願の配列表に示された核酸配列によりコードされるポリペプチド；ならびに上記したものと少なくとも９５％同一、さらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドを含むポリペプチドが挙げられる。
【００４０】
フィロウイルスポリペプチドの参照アミノ酸配列と、少なくとも例えば９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、フィロウイルスポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸当たり、ポリヌクレオチド配列が５つまでのアミノ酸変更を含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の５％までが欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換され得るか、あるいは参照配列中の全アミノ酸残基のうちの５％までの数のアミノ酸が参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端位置で起こり得るし、あるいは参照配列中の残基の間に独立してまたは参照配列内の１つまたは複数の連続基中に点在される、それらの末端位置間のいずれの位置ででも起こり得る。
【００４１】
実際的問題として、任意の特定のポリペプチドが参照アミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、既知のコンピュータープログラム、例えばＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711）を用いて慣用的に確定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて、特定の配列が、例えば本発明の参照配列と９５％同一であるか否かを確定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長に亘って算定され、参照配列中のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許されるように設定される。
【００４２】
別の態様では、本発明は、少なくとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を有する、本明細書中に記載されたポリペプチドの一部分を提供する。本発明の好ましい一部分としては、フィロウイルス構造タンパク質のエピトープ保有部分を含むポリペプチドが挙げられる。特に、本発明の好ましい一部分としては、フィロウイルス構造タンパク質のエピトープ保有ドメインを含むポリペプチドが挙げられるが、この場合、ドメインはＧＰ／ＳＧＰ同一性ドメイン、ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカードメインおよび細胞内ドメインならびにそれらの任意の組合せである。
該組み合わせとは、例えば膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカル
ボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質である。別の例は、ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカードメインまたは細胞内ドメインを欠失するための、アミノ、内部またはカルボキシ欠失を有するフィロウイルスの糖タンパク質である。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、任意の慣用的手段により生産され得る（Houghten, R.A. 1985 PNAS USA 82: 5131-5135）。「同時多重ペプチド合成（ＳＭＰＳ）」法は、米国特許第４，６３１，２１１号（Houghten等（１９８６））に記載されている。
【００４４】
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技法によるフィロウイルスポリペプチドまたはその断片の産生にも関する。
【００４５】
本発明は、初回免疫組成物の投与により誘導された免疫応答が、追加免疫組成物の投与により追加免疫される、「初回免疫および追加免疫」免疫感作レジメンに関する。本発明は、種々の異なる種類の初回免疫組成物のうちのいずれかを用いて初回免疫した後に、複製欠陥アデノウイルスベクターを用いて有効な追加免疫を達成することができるという本発明者らの実験的実証に基づいている。本発明は、下記の実験が示すように、種々の異なる初回免疫組成物のうちのいずれかを用いて、抗原に対して初回免疫された免疫応答に、追加免疫を提供するための有効な手段であることが明らかにされた複製欠陥アデノウイルスを用いる。
【００４６】
ヒト血清型５由来の複製欠陥アデノウイルスは、Grahamと同僚等により生（live）ウイルスベクターとして開発された（Graham & Prevec 1995 Mol Biotechnol 3: 207-20; Bett et al. 1994 PNAS USA 91: 8802-6）。アデノウイルスは、約３６００ｂｐの線状二本鎖ＤＮＡゲノムを含有する非エンベロープ型ウイルスである。組換えウイルスは、ウイルス複製を可能にする許容細胞株中で、アデノウイルスゲノムプラスミドと、強力な真核生物プロモーターとともに当該遺伝子を含むシャトルベクターとの間の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えにより構築され得る。高ウイルス力価が許容細胞株から得られるが、その結果生じるウイルスは、広範囲の細胞型を感染し得るが、許容株以外のいかなる細胞中でも複製せず、したがって安全な抗原送達系である。組換えアデノウイルスは、多数の抗原、例えばダニ媒介性脳炎ウイルスＮＳ１タンパク質（Jacobs et al. 1992 J Virol 66: 2086-95）および麻疹ウイルス核タンパク質（Fooks et al. 1995 Virology 210: 456-65）に対する防御的免疫応答を誘発することが示されている。
【００４７】
驚くべきことに、下記の実験的研究は、本発明の実施形態の使用により、抗原を発現する組換え複製欠陥アデノウイルスが、ＤＮＡワクチンにより初回免疫された免疫応答を追加免疫することが可能になることを実証する。複製欠陥アデノウイルスは、筋肉内免疫感作後に免疫応答を誘導することが見出された。初回免疫／追加免疫予防接種レジメンでは、複製欠陥アデノウイルスは、異なる組換えウイルスまたは組換えにより産生された抗原により追加免疫され得る応答を、初回免疫し得るものとしても予見される。
【００４８】
プラスミドＤＮＡで免疫感作され、複製欠陥アデノウイルスで追加免疫された非ヒト霊長類は、攻撃誘発に対して防御された。組換え複製欠陥アデノウイルスおよびプラスミドＤＮＡはともに、ヒトにとって安全なワクチンである。有益なことに、用いられる予防接種レジメンにおいて、免疫応答（例えば、ヒトにおける）を誘導するのに適した一般的免疫感作レジメンを構成する初回免疫および追加免疫の両方のために、筋肉内免疫感作が用いられ得ることを本発明者が見出した。
【００４９】
本発明は、種々の態様および実施形態において、抗原または抗原をコードする核酸の前投与により初回免疫された抗原に対する免疫応答を追加免疫するために、抗原をコードする複製欠陥アデノウイルスベクターを用いる。
【００５０】
本発明の一般的態様は、抗原に対する免疫応答を追加免疫するための複製欠陥アデノウイルスベクターの使用を提供する。
【００５１】
本発明の一態様は、個体において抗原に対する免疫応答を追加免疫する方法であって、核酸からの発現により個体において抗原を産生し、それにより個体に以前に初回免疫された抗原に対する免疫応答を追加免疫するために、調節配列に作動可能的に連結された抗原をコードする核酸を含む複製欠陥アデノウイルスベクターを個体に提供することを含む方法を提供する。
【００５２】
抗原に対する免疫応答は、遺伝子免疫感作により、感染因子による感染により、または組換えにより産生された抗原により初回免疫され得る。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、個体における抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、抗原または抗原をコードする核酸を含む初回免疫組成物を個体に投与し、次に核酸からの発現により個体において抗原を生産するための、調節配列に作動可能的に連結された抗原をコードする核酸を含む複製欠陥アデノウイルスベクターを含む追加免疫組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００５４】
さらなる態様は、抗原に対する免疫応答を追加免疫するために哺乳類へ投与するための薬剤の製造における、開示されたような複製欠陥アデノウイルスベクターの使用を提供する。このような薬剤は一般に、抗原を含む初回免疫組成物を前投与した後に投与するための薬剤である。
【００５５】
初回免疫組成物は、任意のウイルスベクター、例えばアデノウイルスまたはアデノウイルス以外のもの、例えばワクシニアウイルスベクター（例えば修飾ウイルスアンカラ（Ankara）（ＭＶＡ）（Mayr et al. 1978 Zentralbl Bakteriol 167: 375-90; Sutter and Moss 1992 PNAS USA 89: 10847-51; Sutter et al. 1994 Vaccine 12: 1032-40）またはＮＹＶＡＣ（Tartaglia et al. 1992 Virology 118: 217-32）等の複製欠陥株）、鳥痘（avipox）ベクター（例えばＡＬＶＡＣとして既知の株（Kanapox、Paoletti et al. 1994 Dev Biol Stand 1994 82: 65-9）等の鶏痘（fowlpox）またはカナリア痘（canarypox））、あるいはヘルペスウイルスベクターを含み得る。
【００５６】
初回免疫組成物は、抗原をコードするＤＮＡを含み、このようなＤＮＡは好ましくは、哺乳類細胞中で複製することができない環状プラスミドの形態である。任意の選択可能マーカーは、臨床的に用いられる抗生物質に対して耐性を有するべきでないため、例えばカナマイシン耐性がアンピシリン耐性よりも好ましい。抗原発現は、哺乳類細胞中で活性であるプロモーター、例えばサイトメガロウイルス極初期（ＣＭＶＩＥ）プロモーターにより駆動されるべきである。
【００５７】
本発明の種々の態様の特定の実施形態では、初回免疫組成物の投与の後に、一次および二次追加免疫組成物による追加免疫が続き、一次および二次追加免疫組成物は、例えば以下に例示されるように、同一でもまたは互いに異なっていてもよい。さらなる追加免疫組成物が、本発明から逸脱することなく用いられ得る。一実施形態では、三重免疫感作レジメンは、ＤＮＡを用い、次に一次追加免疫組成物としてアデノウイルス（Ａｄ）を用い、次に二次追加免疫組成物としてＭＶＡを用い、その後任意に、さらなる（三次）追加免疫組成物を投与してもよく、あるいは同一または異なるベクターの一方または両方を追加免疫投与してもよい。別のオプションは、ＤＮＡ、次にＭＶＡ、次にＡｄ、任意にその後、同一または異なるベクターの他方または両方の追加免疫投与である。
【００５８】
それぞれの初回免疫組成物および追加免疫組成物中に含まれる抗原（しかしながら多数の追加免疫組成物が用いられる）は同一である必要はないが、エピトープを共有すべきである。抗原は標的病原体または細胞中の完全抗原またはその断片に対応し得る。ペプチドエピトープまたはエピトープの人工紐（string）が用いられて、抗原中の不必要なタンパク質配列、および単数または複数のベクター中のコード配列がより効率的に切断される。１つまたは複数の付加的エピトープ、例えばＴヘルパー細胞により認識されるエピトープ、特に異なるＨＬＡ型の個体中で認識されるエピトープが包含され得る。
【００５９】
複製欠陥アデノウイルスベクター内では、コード抗原の発現のための調節配列はプロモーターを含む。「プロモーター」とは、下流に（すなわち、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖上で３’方向に）作動可能的に連結されるＤＮＡの輸送が開始され得るヌクレオチドの配列を意味する。「作動可能的に連結される」とは、プロモーターから開始される転写のために適切に配置され、配向された同一核酸分子の一部として連結されることを意味する。プロモーターに作動可能的に連結されるＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下」にある。その他の調節配列（例えばターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびその他の配列）が、当業者の知識および技量により、適宜含まれ得る（例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。核酸構築物の調製、突然変異誘発、シーケンシング、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現ならびにタンパク質の分析における、核酸の操作のための多数の既知の技術およびプロトコールは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1994に詳細に記載されている。
【００６０】
本発明の態様および実施形態に用いるための適切なプロモーターとしては、イントロンＡを伴うかまたは伴わないサイトメガロウイルス極初期（ＣＭＶＩＥ）プロモーター、ならびに哺乳類細胞中で活性である任意のその他のプロモーターが挙げられる。
【００６１】
初回免疫組成物および追加免疫組成物のいずれかまたは両方が、アジュバントまたはサイトカイン、例えばα−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｇＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２またはそのコード核酸を含み得る。
【００６２】
追加免疫組成物の投与は一般に、初回免疫組成物の投与後、数週間目または数ヶ月目、好ましくは約２〜３週目または４週目、または８週目、または１６週目、または２０週目、または２４週目、または２８週目または３２週目に実施される。
【００６３】
好ましくは、初回免疫組成物、追加免疫組成物、または初回免疫および追加免疫組成物
の両方の投与は、筋肉内免疫感作である。
【００６４】
アデノウイルスワクチンまたはプラスミドＤＮＡの筋肉内投与は、ウイルスまたはプラスミドＤＮＡの懸濁液を注射するための針を用いて実施され得る。代替的に、冷蔵を必要とせずに個別調製用量を製造することができるウイルスまたはプラスミドＤＮＡ懸濁液（例えばＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）を使用）、あるいはワクチンを含有する凍結乾燥粉末（例えばPowderjectの技法および製品による）を投与するための無針注射用具（device）を使用してもよい。これは、アフリカの地方において必要とされるワクチンにとっては大きな利点となろう。
【００６５】
アデノウイルスは、ヒト免疫感作における優れた安全性記録を有するウイルスである。組換えウイルスは簡単に生成され、それらは大量に再現的に製造され得る。したがって組換え複製欠陥アデノウイルスの筋肉内投与は、免疫応答により制御され得る疾患に対するヒトの予防的または治療的予防接種に非常に適している。
【００６６】
個体は、抗原の送達および抗原に対する免疫応答の発生が、有益であるかまたは治療的に有益な作用を有するような疾患または障害を有し得る。
【００６７】
おそらく、投与は、感染または症状の発生前に、病原体または疾患に対する免疫応答を発生させるという予防的目標を有する。
【００６８】
本発明に従って治療または予防され得る疾患および障害としては、免疫応答が予防的または治療的役割を果たし得るものが挙げられる。
【００６９】
本発明に従って投与される構成成分は、薬学的組成物中に処方され得る。これらの組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に既知のその他の物質を含み得る。このような物質は無毒性であるべきであり、そして活性成分の効力を妨げるべきでない。担体またはその他の物質の厳密な性質は、投与経路（例えば静脈内、皮膚または皮下、粘膜内（例えば腸）、鼻内、筋肉内または腹腔内経路）によって変わり得る。
【００７０】
上述のように、投与は好ましくは皮内、皮下または筋肉内である。
【００７１】
液体薬学的組成物は一般に、液体担体、例えば水、鉱油（petroleum）、動物または植物油、鉱物油（mineral oil）または合成油を含む。生理食塩水、デキストロースまたはその他の糖類溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが含まれ得る。
【００７２】
静脈内注射、皮膚注射または皮下注射、あるいは疾患部位への注射のために、活性成分は、発熱物質無含有であって、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶液の形態である。当業者は、例えば等張性ビヒクル（例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸化リンガー注射液）を用いて適切な溶液を調製し得る。防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／またはその他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。
【００７３】
徐放性処方物が用いられ得る。
【００７４】
複製欠陥アデノウイルス粒子の産生、およびこのような粒子を組成物中へ任意に処方した後、粒子は個体（特にヒトまたはその他の霊長類）に投与され得る。
【００７５】
投与は、別の哺乳類、例えば齧歯類、例えばマウス、ラットもしくはハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、ロバ、イヌまたはネコに対しても実施され得る。
【００７６】
投与は、好ましくは「予防的有効量」または「治療的有効量」（但し、場合によっては、予防は治療であると考えられ得る）で実施され、これは、個体に対する利益を示すのに十分である。実際に投与される量、ならびに投与される速度および時間経過は、治療されるものの性質および重症度によって異なる。治療の処方、例えば投薬量に関する決定等は、一般医およびその他の医師の、あるいは獣医学的状況では獣医の責任の範囲内であり、典型的には治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、ならびに医師に既知のその他の因子を考慮する。上記の技法およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980に見出され得る。
【００７７】
好ましい一レジメンでは、ＤＮＡが１０μｇ〜５０ｍｇ／注射の用量で、その後、アデノウイルス（好ましくは筋肉内に）が５×１０7〜１×１０12粒子／注射の用量で投与される。
【００７８】
組成物は、所望により、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るキット、パックまたはディスペンサー中にあり得る。例えばキットは、金属またはプラスチック箔、例えばブリスターパックを含み得る。キット、パックまたはディスペンサーは、投与のための使用説明書が添付され得る。
【００７９】
組成物は、治療される症状によって、単独でまたは他の治療と組合せて、同時にまたは順番に投与され得る。
【００８０】
非ヒト哺乳類への送達は、治療目的である必要はないが、実験的に、例えば当該抗原に対する免疫応答、例えば疾患に対する防御のメカニズムの研究に用いるためであり得る。
【００８１】
本発明のさらなる態様および実施形態は、上記の開示および以下の実験的例示（例として包含されるが、それらに限定されない）を、添付の図面を参照して考慮すれば、当業者には明らかである。
【００８２】
霊長類におけるエボラウイルス感染に対する予防ワクチンの開発
遺伝子免疫感作は、体液性および細胞性免疫活性化経路の両方に影響を及ぼし、ヒト病原体による感染に対して防御することが示されている（Tang, D.C. et al. 1992 Nature 356: 152-154; Ulmer, J.B. et al. 1993 Science 259: 1745-1749; Wang, B. et al. 1993 PNAS USA 90: 4156-4160;Sedegah, M. et al. 1994 PNAS USA 91: 9866-9870）。プラスミドワクチンの有効性は、宿主細胞タンパク質合成および免疫原の内因性提示に起因し、おそらくはプラスミドＤＮＡ自体の免疫刺激作用によるものと考えられる（Kreig, A.M. et al. 1995 Nature 374: 546-549; Sato, Y. et al. 1996 Science 273: 352-354）。ＤＮＡワクチンは、エボラウイルス抗原に対する特異的免疫応答を誘発し、齧歯類において致死的感染するエボラウイルスによる攻撃誘発（Connolly, B.M. et al. 1999 J Infect Dis 179: S203-S217; Bray, M. et al. 1998 J Infect Dis 178: 651-661）に対してモルモット（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 7-42）およびマウス（Vanderzanden, L. et al. 1998 Virology 246: 134-144）を防御することが示されている。細胞媒介性および体液性免疫応答の両方が誘発されたが、抗体力価は、エボラウイルスのザイールサブタイプからのタンパク質をコードするプラスミドで免疫感作された動物における防御の程度と関連付けられた。
【００８３】
広範に有効なワクチンは、ヒト感染において単離される多エボラサブタイプ（ザイール
、スーダンおよび象牙海岸）に対する免疫を提供する必要があるが、多価ワクチンは、単一サブタイプワクチンに関して実証された特異的免疫応答を弱め得る。この問題に対処するために、オリジナルのエボラ・ザイールＤＮＡワクチン単独の効力を、エボラウイルスのスーダンおよび象牙海岸サブタイプからのＤＮＡと組合せて使用した場合の効力とを比較して分析した。従来の研究（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 7-42）の場合と同様に、ザイールサブタイプビリオン糖タンパク質ＧＰ（Ｚ）をコードする単一プラスミドによる免疫感作は、モルモットにおいて実質的なウイルス特異的抗体応答を発生し、防御免疫を付与した（表１）。エボラ核タンパク質ＮＰを発現するプラスミドの封入は、エボラＧＰ（Ｚ）に対する抗体力価に影響を及ぼさず、その防御効力を低減することもなかった。ＮＰ、ならびにエボラ糖タンパク質の３つのサブタイプ（ザイール、象牙海岸およびスーダンＧＰ（Ｚ、ＩＣ、Ｓ）＋ＮＰ）を含むワクチン構成成分のさらなる拡大は、単一プラスミドワクチンに匹敵する前攻撃誘発免疫応答を生じた。さらに、エボラザイール型ウイルスによる感染からの完全防御が、多価ワクチンを投与されたモルモットにおいて達成された（表Ｉ、被験体１３〜１６）。既往抗体はウイルス攻撃誘発によっては誘導されなかったが、これはワクチンそれ自体が、ウイルスを効率的に除去するのに十分な免疫応答を提供したことを示す。これらの知見により、齧歯類モデルにおける多価プラスミド免疫感作は、糖タンパク質（ＧＰ）特異的抗体産生およびその防御的効力を実質的に低減しないことが示された。
【００８４】
【表４】
【００８５】
エボラウイルス感染の齧歯類モデルにおける防御は抗体力価と関連付けられ、効率的な体液性応答はヒト疾患に置ける臨床結果に影響を及ぼし得るため（Baize, S. et al. 1999 Nat Med 5: 423-426; Maruyama, T. et al. 1999 J Virol 73: 6024-6030）、霊長類において試験されたワクチンに対する強力な体液性応答を誘発することが重要であると本発明者らは考えたが、細胞媒介性免疫は同等に誘導され、防御に寄与すると思われる（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42）。近年、ＤＮＡ初回免疫とその後のウイルスベクターの投与というレジメンは、ＤＮＡ単独を用いたワクチンと比較して、免疫応答を増強することが実証された（Sedegah, M. et al. 1998 PNAS USA 95: 7648-7653; Hanke, T. et
al. 1998 Vaccine 16: 439-445; Robinson, H.L. et al. 1999 Nat Med 5: 526-534; Schneider, J. et al. 1998 Nat Med 4: 397-402）。組換え複製欠陥アデノウイルスは高力価になり、抗原提示細胞に感染し、強力な免疫応答を誘導し得る（Davis, A.R. et al. 1985 PNAS USA 82: 7560-7564; Natuk, R.J. et al. 1992 PNAS USA 89: 7777-7781; Xiang, Z.Q. et al. 1996 Virology 219: 220-227）。アデノウイルスはマウスにおける追加免疫作用を示した（Xiang, Z.Q. et al. 1999 J Immunol 162: 6716-6723）が、ＤＮＡおよびアデノウイルスの組合せは、感染性攻撃誘発モデルにおける効力に関して試験されておらず、霊長類におけるこの手法の成功は未だ報告されていない。したがって、本発明者らは、高レベルＧＰ発現を指示する組換えアデノウイルスベクターＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ）を開発し、修飾初期免疫−追加免疫戦略が、裸ＤＮＡ単独を用いて得られたエボラウイルスに対する抗体応答を増大するか否かを試験するために、このベクターを用いた。マウスにＤＮＡおよびアデノウイルスベクターを、単独でまたは組合せて注射し、細胞媒介性応答および体液性免疫応答を評価した。ＤＮＡ免疫感作単独の場合と比較して、ＤＮＡおよびその後のアデノウイルス追加免疫を注射したマウスにおいて、抗体力価が１０倍〜１００倍増加することが見出された（図４７）。同様に細胞傷害性Ｔ細胞応答の増大がこの組合せを用いて観察された。ＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ）単独による免疫感作は、ＤＮＡ初回免疫、アデノウイルス追加免疫感作した場合と、抗体力価が有意に異ならなかった。これらのデータは、マウスにおけるエボラＧＰ ＤＮＡワクチンの免疫原性が組換えアデノウイルスによる追加免疫によって改良されたこと、及びこの戦略が非ヒト霊長類における免疫応答を増大するための有用なアプローチを提示し得ることを示唆する。
【００８６】
齧歯類モデルはワクチン戦略の開発において有用であったが、一方、ヒトから直接単離されたエボラウイルスは先ず、マウスまたはモルモットにおいて致死性感染するために、齧歯類における逐次的な多継代により適合されなければならない（Connolly, B.M. et al. 1999 J Infect Dis 179: S203-S217; Bray, M. et al. 1998 J Infect Dis 178: 651-661）。エボラ感染の霊長類モデルは、ヒト疾患および免疫防御に関してより強力な予測値を有すると考えられる。したがって、二方式性ＤＮＡ／ＡＤＶワクチンならびにモルモットにおける防御と相関した多プラスミド戦略を用いて、非ヒト霊長類における試験を本発明者らは実施した。カニクイマカクザル（Macaca fascicularis）に、４週間間隔で裸ＤＮＡベクターを３回注射し（図４８Ａ）、数ヶ月の安静（免疫応答を追加免疫することができると示されることが知られている（Letvin, N.L. et al. 1997 PNAS USA 94: 9378-9383））後、ザイール糖タンパク質のみを発現する組換えアデノウイルスで追加免疫した（図４８Ａ）。対照動物には空ベクター（プラスミドＤＮＡおよびＡＤＶ−ΔＥ１組換えアデノウイルス）を投与し、予防接種動物にはＮＰおよびエボラＧＰの３つのサブタイプを含有する多構成成分ＤＮＡワクチン（ｐＧＰ／ＮＰ）とその後のＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ）を投与した。予測した通り、抗エボラ血清抗体は対照動物では検出されなかったが、エボラワクチン投与動物では、抗原特異的抗体応答が、１２週目、すなわち３回目のＤＮＡ注射の１ヵ月後に検出された（図４８Ｂ）。組換えアデノウイルスにより追加免疫した後、抗体力価は、ＤＮＡ単独で観察されたレベルの１０〜２０倍に増大した。最終免疫感作の３ヵ月後に、抗体レベルは依然として高かったが、但し、一動物（被験体８）に関しては、わずかに力価が下がった（５×１０4から１．３×１０4）。
【００８７】
次にエボラ抗原に対する霊長類細胞性応答を、ｉｎ ｖｉｔｒｏリンパ球増殖アッセイを用いて検査した。対照サルでは、3Ｈ−チミジン取り込みにより測定された抗原特異的リンパ球増殖は、適正化非刺激細胞と等価であり、各動物に関して約１．０の増殖指数を生じた（４８Ｃ）。これに対比して、多価ワクチンで免疫を受けた動物からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、９〜２０倍の刺激増大を示したが、このことは、細胞レベルでのエボラ抗原に対する活発な免疫応答を実証する。ＣＤ４−陽性リンパ球の枯渇は、ワクチン接種サルからのＰＢＭＣの抗原刺激性増殖性応答を、対照動物で観察されたレベルにまで低減させた（図４８Ｄ）。しかしながらＣＤ８−陽性リンパ球の枯渇は、エボラ抗原特異的リンパ球増殖に影響を及ぼさなかった。したがって、高抗体力価に必要とされるＴ細胞助力（help）を提供するリンパ球のＣＤ４−陽性サブセットは、ワクチン誘導性細胞免疫応答に寄与している。
【００８８】
この予防接種レジメンの防御効力を確定するために、エボラウイルスのザイールサブタイプからの致死用量の野生型マインガ株を用いてサルを攻撃誘発した。対照サルでは、血液化学知見から肝臓酵素の増大が示された（図４９Ａ、図４９Ｂ）が、このような増大はエボラウイルス感染に特徴的である（Fisher-Hoch, S.P. et al. 1985 J Infect Dis 152: 887-894）。このような増大はワクチン接種被験体においては観察されなかった。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇は、対照動物の全てにおけるウイルス血症の劇的増大と関連した（図４９Ｃ）。これに対比して、予防接種サルにおいては、ウイルス負荷の実質的増大は観察されなかった。疾患進行の動態は、対照動物の間では同様で、疾患発生率はこの群においては１００％であった。５日目〜６日目に３匹は死亡し、最後のサルは、瀕死状態で、７日目に安楽死させられた。これに対比して、ＤＮＡ−アデノウイルスワクチンの組み合わせで免疫を受けたサル４匹のうち４匹が、エボラウイルスによる致死性攻撃誘発を生き残り、４匹の被験体中３匹において滅菌免疫が達成された。残りの動物は、ウイルス抗原のわずかな一過性増大を示した。しかしながら長期間の後、予防接種動物はすべて、感染の徴候または症状を示さず、ウイルス抗原のＥＬＩＳＡ検出（図４９Ａ）および培養ウイルスの終点滴定分析により測定した場合、感染後６ヶ月以上、検出可能なウイルス血症は認められなかった。１０日目に一過性の低レベルのウイルス血症を示したワクチンレシピエント（被験体８）は、１７日までに検出不可能レベルになった。
【００８９】
エボラウイルスの天然レザバー（reservoir）は未知であるので、将来的大発生を防止するための従来の公衆衛生対策の可能性は制限され、したがってヒトにおけるワクチンおよび治療薬の開発の緊急性が増大する。霊長類は、エボラウイルス感染の致死作用に対して免疫感作され、そして滅菌免疫が異種初回免疫−追加免疫戦略を用いて達成され得ることを本発明の知見は実証する。多様な地理的単離物からのエボラウイルス構造タンパク質を発現する多構成成分遺伝子ワクチンは、強力な抗原特異的免疫応答を発生し、ヒト感染における最高死亡数に関連するこのウイルスのサブタイプであるエボラ・ザイールの致死用量を用いた攻撃誘発後に免疫感作霊長類を生存させた。この試験の結果は、Ｔ細胞媒介性および体液性免疫が、齧歯類における従来の試験と同様に、非ヒト霊長類におけるウイルスクリアランス（clearance）に寄与することを示唆する（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42; Wilson, J. et al. 2000 Science 287: 1664-1666）。２つの免疫パラメーターである抗体力価（１：７５，０００対＜１：１００、Ｐ＝０．００１）および細胞性増殖応答（約１２倍対１．４倍、Ｐ＝０．００１４）は、免疫防御との非常に有意な相関関係を示した。ヒトにおけるエボラウイルス感染からの免疫防御との相関関係を調べる試験は、ウイルスの攻撃性ならびに必然的に高レベルの生物安全性束縛（biosafety containment）により妨げられる。ここに提示された霊長類免疫のモデルを用いて、エボラウイルス感染からの免疫防御のメカニズムを明らかにし、免疫ベースの抗ウイルス療法を進展させ、そしてこの病原体に対する、さらには出血熱のその他の感染性原因に対するヒトワクチンを開発することが、目下考えられている。
【００９０】
エボラ、マールブルグおよびラッサ構築物の説明
ＶＲＣ６０００
ＶＲＣ６０００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ））。ザイールサブタイプのエボラ糖タンパク質を発現する主鎖ｐＶＲ１０１２（＃４５０）。配向は、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩである。
ＶＲＣ６００１
ＶＲＣ６００１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＧＰ（Ｚ））。その他の説明なし。これは６０００と同一であるが、ｐＶＲ１０１２主鎖へのＳｆｉ制限部位の付加を伴う。
ＶＲＣ６００２
ＶＲＣ６００２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＭＵＣ）。ＧＰ（Ｚ）のムチン様ドメインが欠失された。主鎖ｐＶＲ１０１２ＧＰ（Ｚ）中の５３０ｂｐがＥａｒＩ（２８４４）からＢｆａＩ（３３７４）まで欠失された。この突然変異体は、エボラ受容体と結合し得る。
ＶＲＣ６００３
ＶＲＣ６００３（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＭＵＣデルタＦＵＲ）。ＧＰ（Ｚ）のムチン様ドメインおよびフリン切断部位が欠失された。主鎖ｐＶＲ１０１２ＧＰ（Ｚ）中の５９３ｂｐがＥａｒＩ（２８４４）からＥａｒＩ（３４３７）まで欠失された。本タンパク質は、ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＭＵＣと同様の特性を有する。
ＶＲＣ６００４
ＶＲＣ６００４（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２）。ＧＰ（Ｚ）中のＧＰ２領域の大多数が欠失された。主鎖ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）からの４３０ｂｐがＢｃｌＩ（３４１４）からＢｓｐＥＩ（３８４４）まで欠失された。ＴＭ（膜貫通）領域が保持された。
ＶＲＣ６００５
ＶＲＣ６００５（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＣ末端Ａ）。これは、ＧＰ２のＣ末端欠失である。２６７ｂｐがｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）主鎖のＭｓｃＩ（３６２３）からＢｓｐＭＩ（３８９０）まで欠失された。
ＶＲＣ６００６
ＶＲＣ６００６（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＣ末端Ｂ）。これは、ＧＰ２のＣ末端のより小さな欠失である。主鎖ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）の１１０ｂｐがＢｓｔＸＩ（３７８０）からＢｓｐＭＩ（３８９０）まで欠失された。
ＶＲＣ６００７
ＶＲＣ６００７（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＦＵＳ）。ＧＰ（Ｚ）のＧＰ２中の融合ペプチドが、ＰＣＲを用いて、この突然変異で欠失された。主鎖ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）からの４７ｂｐが、３５０８から３５５５まで欠失された。
ＶＲＣ６００８
ＶＲＣ６００８（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＴＭ）。この突然変異体においては、ＧＰ（Ｚ）のＴＭ領域がトランケートされた。停止コドン（ＴＧＡ）がＢｓｐＭＩ部位（３８８９）の下流に付加された。このタンパク質は分泌され、三量体を形成しない。
ＶＲＣ６０５２
ＶＲＣ６０５２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタｓＧＰ）。ＳＧＰ／ＧＰ相同領域の大多数が欠失された。主鎖ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）からの６８７ｂｐが、ＨｉｎｃＩＩ（２０８３）からＨｉｎｃＩＩ（２２７０）まで欠失された。
ＶＲＣ６１０１
ＶＲＣ６１０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（Ｒ）（ｄＴＭ））。本ベクターは、その膜貫通および細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（レストンサブタイプ）を発現する。ＰＣＲを用いて、停止コドンがＧＰ（Ｒ）のａ．ａ．６５０の下流に生成され、その後にＸｂａＩ部位が続いた。このタンパク質は分泌されることができ、ＧＰ
（Ｒ）（ｄＴＭ）と称される。
ＶＲＣ６１１０
ＶＲＣ６１１０（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｒ）（ｄＴＭ））。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（レストンサブタイプ）を発現するアデノウイルスシャトルベクター。ＰＣＲを用いることで、停止コドンがＧＰ（レストン）のａ．ａ．６５１の下流に生成され、その後にＸｂａＩ部位が続いた。結果として得られる組換えアデノウイルスは、ＧＰ（Ｒ）（ｄＴＭ）と呼ばれる６５１ａ．ａ．分泌糖タンパク質を発現する。
ＶＲＣ６２００
ＶＲＣ６２００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｓ））。スーダンサブタイプのエボラ糖タンパク質を発現する主鎖ｐＶＲ１０１２（＃４５０）。配向は、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩである。
ＶＲＣ６２０１
ＶＲＣ６２０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（Ｓ））。１０１２主鎖へのＳｆｉ部位の付加を伴う以外は６２００と同一であり、その他の説明はない。
ＶＲＣ６２０２
ＶＲＣ６２０２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｓ）デルタＴＭ）。この突然変異体においては、ＧＰ（Ｓ）のＴＭ領域がトランケートされた。停止コドン（ＴＧＡ）がＢｓｐＭＩ部位（ｘｘｘ）の下流に付加された。このタンパク質は分泌され、三量体を形成しない。
ＶＲＣ６３００
ＶＲＣ６３００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（ＩＣ））。象牙海岸サブタイプのエボラ糖タンパク質を発現する主鎖ｐＶＲ１０１２（＃４５０）。配向は、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩである。
ＶＲＣ６３０１
ＶＲＣ６３０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＧＰ（ＩＣ））。１０１２主鎖へのＳｆｉ部位の付加を伴う以外は６３００と同一であるが、その他の説明はない。
ＶＲＣ６３０２
ＶＲＣ６３０２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（ＩＣ）デルタＴＭ）。この突然変異体においては、ＧＰ（ＩＣ）のＴＭ領域がトランケートされた。停止コドン（ＴＧＡ）がＢｓｐＭＩ部位の下流に付加された。このタンパク質は分泌され、三量体を形成しない。
ＶＲＣ６３０３
ＶＲＣ６３０３（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（ＩＣ）（ｄＴＭ））。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（象牙海岸サブタイプ）を発現するｐＶＲ２０００ベースのベクター。ＰＣＲを用いることで、停止コドンがＧＰ（Ｒ）のａ．ａ．６５０の下流に生成され、その後にＢｇｌＩＩ部位が続いた。本ベクターは、６５０ａ．ａ．分泌糖タンパク質（ａ．ａ．１〜ａ．ａ．６５０）を発現する。
ＶＲＣ６３１０
ＶＲＣ６３１０（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（ＩＣ）（ｄＴＭ））。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（サブタイプ象牙海岸）を発現するアデノウイルスシャトルベクター。ＰＣＲを用いることで、停止コドンがＧＰ（ＩＣ）のａ．ａ．６５１の下流に生成された。結果として得られる組換えアデノウイルスは、ＧＰ（ＩＣ）（ｄＴＭ）と呼ばれる６５１ａ．ａ．分泌糖タンパク質を発現する。
ＶＲＣ６３５１
ＶＲＣ６３５１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ｓＧＰ（ＩＣ））。その他の説明なし。
ＶＲＣ６４００
ＶＲＣ６４００（ｐＶＲ１０１２−ＮＰ）。象牙海岸サブタイプのエボラ核タンパク質を発現する主鎖ｐＶＲ１０１２（＃４５０）。
ＶＲＣ６４０１
ＶＲＣ６４０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＮＰ）。１０１２主鎖へのＳｆｉ部位の付加を伴う以外は６４００と同一であり、その他の説明はない。
ＶＲＣ６５００
ＶＲＣ６５００（ｐＶＲ１０１２−ＶＰ３５）。主鎖はｐＶＲ１０１２（＃４５０）である。挿入物は、ｐＧＥＭ ３Ｚｆ（＋）ＶＰ３５（＃１２１３）からクローン化されたエボラからのＶＰ３５である。
ＶＲＣ６６００
ＶＲＣ６６００（ｐＡＤ／ＣＭＶ−ＧＰ（ｄＴＭ）（Ｚ−ＣＩＴＥ−Ｓ））。その他の説明なし。
ＶＲＣ６６０１
ＶＲＣ６６０１（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｓ））。その他の説明なし。
ＶＲＣ６６０２
ＶＲＣ６６０２（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｓ）（ｄＴＭ））。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（スーダンサブタイプ）を発現するアデノウイルスシャトルベクター。停止コドンがＧＰ（Ｓ）のａ．ａ．６５０の下流に融合された。結果として得られる組換えアデノウイルスは、ＧＰ（Ｓ）（ｄＴＭ）と呼ばれる６５４ａ．ａ．分泌糖タンパク質を発現する。
ＶＲＣ６６０３
ＶＲＣ６６０３（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｚ））。その他の説明なし。
ＶＲＣ６６０４
ＶＲＣ６６０４（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｚ）（ｄＴＭ））。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（サブタイプザイール）を発現するアデノウイルスシャトルベクター。停止コドンがＧＰ（Ｚ）のａ．ａ．６５１の下流に融合された。結果として得られる組換えアデノウイルスは、ＧＰ（Ｚ）（ｄＴＭ）と呼ばれる６５５ａ．ａ．分泌糖タンパク質を発現する。
ＶＲＣ６７０１
ＶＲＣ６７０１（ｐＶＲ１０１２−マールブルグ）。マールブルグ糖タンパク質（ＧＰ）オープンリーディングフレーム、Ｍｕｓｏｋｅ株。マールブルグをＶＲＣ６７００（Ｘｂａ／ＰｖｕＩＩ）からの主鎖＃４５０（Ｂａｍ（ｂｌｕｎｔ）／ＸｂａＩ）中にクローン化した。
ＶＲＣ６７０２
ＶＲＣ６７０２（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓマールブルグＧＰ（ｄＴＭ））。本ベクターは、その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにマールブルグウイルス糖タンパク質を発現する。ＰＣＲを用いることで、停止コドンがＧＰ（マールブルグ）のａ．ａ．６５０の下流に生成され、その後にＢｇｌＩＩ部位が続いた。このタンパク質は分泌され、ＧＰ（マールブルグ）（ｄＴＭ）と呼ばれる。
ＶＲＣ６７１０
ＶＲＣ６７１０（ｐＡｄＡｐｔマールブルグＧＰ（ｄＴＭ））。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにマールブルグウイルス糖タンパク質を発現するアデノウイルスシャトルベクター（ｐＶＲＣ１２９０）。ＰＣＲを用いることで、ターミネーターコドンがａ．ａ．６５０の下流に生成され、その後にＢｇｌＩＩ部位が続いた。結果として得られる組換えアデノウイルスは６５０ａ．ａ．分泌タンパク質（ａ．ａ．１〜ａ．ａ．６５０）を発現する。
ＶＲＣ６８００
ＶＲＣ６８００（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓラッサＧＰ）。その他の説明なし。
ＶＲＣ６８０１
ＶＲＣ６８０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓラッサＧＰ（ｄＴＭ））。その他の説明なし。
ＶＲＣ６８１０
ＶＲＣ６８１０（ｐＡｄＡｐｔラッサＧＰ）。その他の説明なし。
ＶＲＣ６８１１
ＶＲＣ６８１１（ｐＡｄＡｐｔラッサＧＰ（ｄＴＭ））。その他の説明なし。
【実施例１】
【００９１】
ベクター構築。
エボラ・ザイール糖タンパク質（ＧＰ）、分泌ＧＰ（ＳＧＰ）および核タンパク質（ＮＰ）を発現するＤＮＡベクターの構築は、Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42に記載されている。ＧＰスーダンおよび象牙海岸発現ベクターを同様に構築した。要するに、以下のプライマー：５’ＡＴＣ ＴＴＣ ＡＧＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＣＣＡ ＴＧＧ Ａ３’（スーダンＧＰ遺伝子；ＮｃｏＩ＞ＡＴＧ；配列番号４４）、５’ＧＡＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＴＧ ＣＡＧ３’（スーダンＧＰ遺伝子；Ｃ末端ＧＰ停止；配列番号４５）、５’ＣＴＡ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＡ３’（象牙海岸ＧＰ遺伝子；ＮｃｏＩ＞ＡＴＧ；配列番号４６）、５’ＡＡＡ ＧＴＡ ＴＧＡ ＴＧＣ ＴＡＴ ＡＴＴ ＡＧＴ ＴＣＡ３’（象牙海岸ＧＰ遺伝子；Ｃ末端ＧＰ停止；配列番号４７）を用いて、感染細胞ＲＮＡの、ＲＮＡの逆転写後のポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）産物から、ＧＰオープンリーディングフレームを生成し、ＴＡクローンＰＣＲ２．１スーダンおよびＰＣＲ２．１象牙海岸を得た。ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、スーダン糖タンパク質をプラスミドＰＣ２．１から消化し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）処理して、ｐ１０１２のＸｂａＩ部位にクローン化した（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42）。ＥｃｏＲＩを用いて、象牙海岸ＧＰをプラスミドＰＣ２．１から消化し、クレノウ処理して、ｐ１０１２のＸｂａＩ部位にクローン化した（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42）。
【００９２】
ＡＤＶ−ＧＰを作製するために、ＧＰ（Ｚ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＧＥＭ−３Ｚｆ（−）−ＧＰから消化して、クレノウ処理し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ／Ｋｌｅ／ＣＩＰ処理ｐＲｃ／ＣＭＶプラスミド中に挿入した。その結果生じたプラスミド（ＰＲＣ／ＣＭＶ−ＧＰ（Ｚ））をＮｒｕＩ／ＤｒａＩＩＩで消化し、クレノウ処理した。ＣＭＶエンハンサー、ＧＰ（Ｚ）ＤＮＡおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含有するＮｒｕＩ／ＤｒａＩＩＩ／Ｋｌｅ断片を、アデノウイルスシャトルプラスミドｐＡｄＢｇＩＩＩのＢｇｌＩＩ部位に挿入した（Ohno, T. et al. 1994 Science 265: 781-784）。第一世代ｄｌ３０９ベースＡｄ５ベクターであるアデノウイルスは、Ｅ１に欠失を含み、ベクターを複製欠陥体およびＥ３における部分欠失／置換体にさせたが、これは、それぞれ１４．７ｋＤ、１４．５ｋＤおよび１０．４ｋＤの相対分子量を有するＥ３タンパク質に関するコード配列を崩壊する。ザイールＧＰを発現する組換えアデノウイルスＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ）を、以前に報告された方法（Aoki, K. et al. 1999 Mol Med 5: 224-231）にしたがって作製した。投与されるアデノウイルスの用量、１０10プラーク形成単位（ＰＦＵ）／動物（約３×１０9ＰＦＵ／ｋｇ）は、ヒト遺伝子療法試験において安全に用いられる範囲内である。
【００９３】
動物試験および安全性。
Covance (Princeton, NJ)から入手した３歳、体重２〜３ｋｇの８匹のカニクイマカクザル（cynomolgus macaques）（Macaca fascicularis）を、免疫感作および攻撃誘発実験のために用いた。血液検体を得るため、そしてワクチンを投与するために、ケタマインでサルを麻酔した。「実験室動物の管理および使用のための指針（Guide for the Care and
Use of Laboratory Animals (DHEW No. NIH 86-23）」に従って、動物を１匹ずつ収容し、定期的エンリッチメントを施した。エボラウイルス攻撃誘発直前から実験終了まで、動物を最大閉じ込め実験室（ＢＳＬ−４）中に保持し、給餌し、毎日検査した。瀕死状態と思われた一動物を安楽死させ、その後、病理検査のために剖検した。さらに、単一無症候性予防接種動物を、病理学的およびウイルス学的分析のために安楽死させた。
【００９４】
マウス免疫感作。
エボラザイールＧＰまたはＮＰを発現するＤＮＡおよびアデノウイルスベクターを、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびプロモーターの制御下で、遺伝子発現を用いて、前記と同様に構築した（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42; Ohno, T. et al. 1994 Science 265: 781-784）。０、１４および２８日目に、１００μｇのＤＮＡ（ｐＧＰまたはｐ１０１２プラスミド対照）または１０8ＰＦＵのアデノウイルス（ＡＤＶ−ＧＰまたはＡＤＶ−ΔＥ１対照ウイルス）を用いて、マウスを筋肉内免疫感作し、２８日目に血液を採取した。４２日目に、ＤＮＡまたはアデノウイルスを用いてマウスに筋肉内追加免疫を施して、力価を５６日目に再び測定した。精製ビリオン由来のエボラウイルス抗原の調製物を被覆し、膜関連タンパク質（ＧＰ、ＶＰ４０およびＶＰ２４）を濃化した９６ウエルプレートを用いて、ＥＬＩＳＡ ＩｇＧ力価を確定した（Ksiazek, T.G. et al. 1992 J Clin Microbiol 30: 947-950）。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体およびＡＢＴＳ／ペルオキシド（基質／指示薬）を用いて、特異的抗原結合を検出した。
【００９５】
マカク（Macaque）ザル免疫感作。
ＤＮＡ免疫感作のために、ＧＰ（ザイール）［ＧＰ（Ｚ）］、ＧＰ（象牙海岸）［ｐＧＰ（ＩＣ）］、ＧＰ（スーダン）［ｐＧＰ（Ｓ）］、ならびに混合物［ｐＧＰ／ＮＰ］として投与されるＮＰ（ザイール）［ＧＰ（Ｚ）］を発現するそれぞれのＤＮＡ（１ｍｇ）を、あるいは空［ｐＧＰ（Ｚ）］対照プラスミド４ｍｇを、動物の三角筋に両側投与した（２ｍｇ／一側）。０および４週目の免疫感作はＩＭ注射により、８週目はＢｉｏｊｅｃｔｏｒにより行った。アデノウイルス追加免疫のために、動物に１０10ＰＦＵのＡＤＶ−ＧＰ（ザイールサブタイプ）またはＡＤＶ−ΔＥ１（空ベクター）を、２用量に分けて三角筋に両側投与した。３２週目に、ハンクス緩衝化塩溶液１ｍｌ中の約６ＰＦＵのエボラウイルス（ザイール１９７６年単離物；マインガ株）を全動物に腹腔内注射した（Kiley,
M.P. et al. 1980 J Gen Virol 49: 333-341）。ウイルスを患者血液から直接単離し、ベロ細胞中での１回継代後に用いた。
【００９６】
対照（プラスミド：ＡＤＶ−ΔＥ１）および免疫感作（ｐＧＰ／ＮＰ：ＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ））サルに関して、上記と同様にＥＬＩＳＡ ＩｇＧ力価を確定した。各被験体に関する希釈の相互終点は、１２週目および２４週目であった。記載どおりに（Ksiazek, T.G. et al. 1992 J Clin Microbiol 30: 947-950）、ＥＬＩＳＡにより血清抗体レベルを測定した。
【００９７】
４、８および２０週目、並びに２４週目の免疫感作の１〜３日前に、対照（プラスミド：ＡＤＶ−ΔＥ１）または免疫感作（ｐＧＰ／ＮＰ：ＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ））動物から血液を採取した。血液をパーコール勾配上で分離して、富リンパ球集団を得た。記載どおりに（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42）エボラ分泌糖タンパク質（ＳＧＰ）または空プラスミドでトランスフェクトされた細胞からの上清を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで５日間、リンパ球を刺激し、3Ｈ−チミジン取り込みにより増殖を測定した。増殖指数は、ＳＧＰを投与したウエル中の増殖を、対照上清を投与したウエル中の増殖で割ることによって算定された。
【００９８】
マカクザルにおけるウイルス検出。
サル血漿の連続希釈液からＶＰ４０タンパク質を捕捉することにより、記載どおりに（Ksiazek, T.G. et al. 1992 J Clin Microbiol 30: 947-950）、循環エボラウイルス抗原の存在を検出した。抗ＶＰ４０ｍＡｂを被覆した９６ウエルプレートを用いて、抗原を捕捉し、検出はウサギ抗エボラウイルス血清を用いた。
【実施例２】
【００９９】
エボラＧＰ（ザイール）およびＮＰ（ザイール）のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：
ＧＰ（ザイール）、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ８７６６６；ＮＰ（ザイール）、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００２５４９から入手し、一方、ＧＰ（スーダン／Ｇｕｌｕ）は、ＣＤＣから入手した。次に、哺乳類の好ましいコドンを用いて、アミノ酸配列をＤＮＡ配列に逆翻訳した。２５ｂｐ重複を有する連続７５ｂｐオリゴ体を調製して、全遺伝子を網羅した。次にＰＣＲを用いて、好ましいコドンを含有する無傷哺乳類遺伝子中にオリゴ体をアセンブルした。設計において、ＧＰ（ザイール）（ａ．ａ．６４８〜６７６）およびＧＰ（スーダン／Ｇｕｌｕ）（ａ．ａ．６４８〜６７６）の予測膜貫通ドメインの前に、この領域がこれらの合成的作製遺伝子から排除されるよう、停止コドンを導入した。欠失も、両構築物中の４ａ．ａ．細胞質領域の損失をもたらした。エボラＧＰ（ザイール）配列の最終シーケンシングは、実験室ＧＰ配列からの１０の多岐アミノ酸を明示した。これを本発明者らの動物試験に用い、部位特異的突然変異誘発により、これらを補正した。ＸｂａＩ／ＳａｌＩにより、ｐ１０１２ｘ／ｓ中にこれらの挿入物をクローン化した。
【０１００】
ＣＭＶ／Ｒ−ＧＰ（Ｓ／Ｇ）（ΔＴＭ）／ｈの構築
エボラＧＰ（スーダン／Ｇｕｌｕ）遺伝子から欠失されたコドン修飾膜貫通ドメインを、ＳａｌＩ／ＫｐｎＩを用いてｐ１０１２（ｘ／ｓ）−ＧＰ（Ｓ／Ｇ）（ΔＴＭ）／ｈから切り出し、ＳａｌＩ／ＫｐｎＩ消化ＣＭＶ／Ｒ／ＭＣＳプラスミド中に挿入した。
【０１０１】
ＣＭＶ／Ｒ ＧＰ（Ｚ）（ΔＴＭ）／ｈの構築
エボラＧＰ（ザイール）遺伝子から欠失されたコドン修飾膜貫通ドメインを、ｐ１０１２ｘ／ｓ−ＧＰ（Ｚ）（ｄＴＭ）／ｈ ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ部位から切り出し、ＣＭＶ／ＲプラスミドのＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ部位にクローン化した。
【０１０２】
ＣＭＶ／ＲエボラＮＰの構築
ザイールサブタイプのエボラ核タンパク質を発現するＶＲＣ６４００（ｐＶＲ１０１２−ＮＰ）からのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ断片を切り出し、ＣＭＶ／ＲプラスミドのＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ部位にクローン化した。
【実施例３】
【０１０３】
改良型非ウイルス哺乳類発現ベクター
本発明は、現在使用されているベクターよりも高レベルのタンパク質発現を発生させる改良型哺乳類発現ベクターを提供する。
【０１０４】
最初に、各々異なるエンハンサーを含有する３つの新規のベクターを開発し、試験した。ＲＳＶエンハンサー、マウスユビキチンエンハンサー（ｍＵＢＢ）およびＣＭＶエンハンサー（Xu et al. 1998 Nat Med 4: 37-42）を各々、ＨＴＬＶ−１Ｒ領域と組合せて（Takebe et al. 1988 Mol Cell Biol 8: 466-472）、別個のベクターを作製した。これら３つのベクターを、ＣＭＶ翻訳エンハンサーおよびイントロンと組合せたＣＭＶエンハンサーを含有する主鎖（ＣＭＶｉｎｔ）（これは現時点で最も有効なベクターである）と比較した場合、ＣＭＶ／Ｒを含有するベクターを用いた発現は、ＣＭＶ／ｉｎｔと比較して５〜１０倍増大されることをｉｎ ｖｉｔｒｏデータは示し、そして免疫学的試験は、ＣＭＶｉｎｔと比較して有意に高いＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答の誘導を示した。この新規のベクターを用いた場合、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方の応答が顕著に高くなった。他の２つのベクターはいずれも、同程度の結果を生じなかった。
【０１０５】
本発現ベクターは、それが特異的エンハンサー／プロモーターと組合せて特異的翻訳エンハンサーを用いることにより、ＤＮＡワクチンに関する高レベルの発現および免疫原性強化を付与するという点で独特である。ヒトにおけるこれらのワクチンの効力が充分でなく、遺伝子的改良により、この技術をヒトに使用可能にするための重要なプラットホームとして役立ち得るため、これは特に重要である。発現ベクターカセットは、他の遺伝子ベ
ースのワクチンにも同様に、または真核生物発現ベクターからの組換えタンパク質の生産のためにも用いられ得る。本発明は、広範な種々の疾患（例えばＨＩＶおよびその他のウイルス疾患および癌）のための遺伝子ワクチンの製造および遺伝子療法に有用である。
【０１０６】
図５０ 修飾ＣＭＶ発現ベクター、ＣＭＶ／Ｒの発現増強
リン酸カルシウムを用いて、０．５ｕｇの対応するプラスミドを有する６ウエル組織培養皿中で、
（Ａ）ベクター単独（レーン１）、ＣＭＶｉｎｔ−ｇｐ−１４５（ｄＣＦＩ）（レーン２）、ＣＭＶ／Ｒ−ｇｐ１４５（ｄＣＦＩ）（レーン３）、または
（Ｂ）ｍＵＢＢ−ｇｐ１４５（ｄＣＦＩ）（レーン４）、ｍＵＢＢ／Ｒ−ｇｐ１４５（ｄＣＦＩ）（レーン５）
を用いて、マウス線維芽細胞３Ｔ３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を収穫し、溶解緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、ミニ完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche））中で溶解した。各試料の総タンパク質１０μｇを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて４〜１５％勾配ゲル上で分離し、その後、タンパク質を移して、ウエスタンブロット分析した。ヒトＨＩＶ−ＩｇＧ（１：５０００）を一次抗体として用いて、ＨＲＰ−接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００）を二次抗体として用いた。ＥＣＬウエスタンブロット現像系を用いて、膜を現像した。矢印は、ＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１４５（ΔＣＦＩ）ポリタンパク質に関する特異的帯域を示す。
【０１０７】
図５１ マウスにおける修飾ＣＭＶ発現ベクター、ＣＭＶ／Ｒの免疫原性増強
各群のマウス５匹を、０、２および６週目に、５０μｇの指定プラスミドＤＮＡで免疫感作した。最後の注射後１０日目に、各マウスから脾臓細胞を収穫し、対照ペプチドのプール（１５ｍｅｒ）またはＨＩＶ Ｅｎｖペプチドのプール（１５ｍｅｒ）を用いて６時間刺激した。ＰＥ−抗マウスＣＤ３、ＰｅｒＣＰ−抗マウスＣＤ４、ＡＰＣ−抗マウスＣＤ８、ＦＩＴＣ−抗マウスＩＦＮ−γおよびＦＩＴＣ−抗マウスＴＮＦ−αを含有する抗体のカクテルを用いて、刺激脾臓細胞を染色した。フローサイトメトリーにより試料を分析した。ＣＤ３／ＣＤ４／ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−αおよびＣＤ３／ＣＤ８／ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α陽性細胞数を、ＦｌｏＪｏソフトウエア（Treestar）を用いて測定した。
【０１０８】
ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、Ｒ領域（ＨＴＶＬ−１）、ＣＭＶ ＩＥスプライシング受容体配列
【０１０９】
【表５】
【０１１０】
１〜７４１：ＣＭＶエンハンサー／プロモーター
７４２〜９７２：ＨＴＬＶ−１ Ｒ領域
９７３〜１０９５：ＣＭＶ／ＩＥスプライシング受容体
【０１１１】
本発明を明確にし、理解させるために、多少詳細に説明してきたが、本発明の真の範囲を逸脱しない限り、形態および詳細における種々の変更が成され得ると当業者は理解するであろう。図面、表および添付物、ならびに上記で言及した特許、出願および出版物は全て、参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ＶＲＣ６０００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２】ＶＲＣ６００１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＧＰ（Ｚ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３】ＶＲＣ６００２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＭＵＣ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４】ＶＲＣ６００３（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＭＵＣデルタＦＵＲ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図５】ＶＲＣ６００４（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図６】ＶＲＣ６００５（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＣ末端Ａ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図７】ＶＲＣ６００６（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＣ末端Ｂ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図８】ＶＲＣ６００７（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＦＵＳ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図９】ＶＲＣ６００８（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＴＭ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１０】ＶＲＣ６０５２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＳＧＰ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１１】ＶＲＣ６１０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（Ｒ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１２】ＶＲＣ６１１０（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｒ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１３】ＶＲＣ６２００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｓ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１４】ＶＲＣ６２０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（Ｓ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１５】ＶＲＣ６２０２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｓ）デルタＴＭ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１６】ＶＲＣ６３００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（ＩＣ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１７】ＶＲＣ６３０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＧＰ（ＩＣ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１８】ＶＲＣ６３０２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（ＩＣ）デルタＴＭ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１９】ＶＲＣ６３０３（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（ＩＣ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２０】ＶＲＣ６３１０（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（ＩＣ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２１】ＶＲＣ６３５１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＳＧＰ（ＩＣ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２２】ＶＲＣ６４００（ｐＶＲ１０１２−ＮＰ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２３】ＶＲＣ６４０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＮＰ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２４】ＶＲＣ６５００（ｐＶＲ１０１２−ＶＰ３５）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２５】ＶＲＣ６６００（ｐＡＤ／ＣＭＶ−ＧＰ（ｄＴＭ）（Ｚ−ＣＩＴＥ−Ｓ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２６】ＶＲＣ６６０１（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｓ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２７】ＶＲＣ６６０２（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｓ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２８】ＶＲＣ６６０３（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｚ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２９】ＶＲＣ６６０４（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｚ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３０】ＶＲＣ６７０１（ｐＶＲ１０１２−マールブルグ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３１】ＶＲＣ６７０２（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓマールブルグＧＰ（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３２】ＶＲＣ６７１０（ｐＡｄＡｐｔマールブルグＧＰ（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３３】ＶＲＣ６８００（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓラッサＧＰ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３４】ＶＲＣ６８０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓラッサＧＰ（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３５】ＶＲＣ６８１０（ｐＡｄＡｐｔラッサＧＰ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３６】ＶＲＣ６８１１（ｐＡｄＡｐｔラッサＧＰ（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３７】ＣＭＶ／ＲエボラＧＰ（Ｚ）デルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３８】ｐＶＲ１０１２エボラＧＰ（Ｚ，Ｐ８７６６６）デルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３９】ＣＭＶ／ＲエボラＧＰ（Ｓ／Ｇｕｌｕ）デルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４０】ＣＭＶ／ＲエボラＧＰ（Ｓ，Ｑ６６７９８）デルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４１】ＶＲＣ６８０２、ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓラッサデルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４２】ＶＲＣ６７０３、ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓマールブルグデルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４３】ＣＭＶ／ＲエボラＮＰ構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４４】重要な構造的特徴を示すエボラウイルス（１９７６年に単離されたザイール種）の、分泌糖タンパク質（ＳＧＰ）分子および糖タンパク質（ＧＰ）分子の概略図である。ＳＧＰおよびＧＰの白色Ｎ末端領域は同一（共有）配列に対応するが、一方、黒色Ｃ末端は、ＧＰまたはＳＧＰ分子に独特の配列を同定する。ＳＧＰおよびＧＰの両方に関する共通シグナラーゼ切断部位、ならびにＧＰ０（ＧＰの非切断形態）（↓）に関するフリン切断部位は、Ｎ末端シーケンシングにより確定された。システイン残基（Ｓ）、予測Ｎ連結グリコシル化部位（Ｙ形突出部）、予測融合ペプチド、七価基反復配列および膜貫通アンカー配列も示されている。エボラウイルスでは、これらの構造の位置は保存され、それらの配列は非常に類似しており、あるいはＮ連結グリコシル化部位の場合には、ＧＰの中央領域で少なくとも濃縮される。シグナラーゼ切断部位は配列番号４８であり、フリン切断部位は配列番号４９であり、融合ペプチドは配列番号５０である。
【図４５】構造ＧＰの概略図である。非確定ジスルフィド結合（クエスチョンマークで示されている）により連結されたＧＰ１−ＧＰ２へテロ二量体の予測配向が示される。示されている分子内ジスルフィド結合は、レトロウイルスの糖タンパク質構造との類似性に基づいた従来の予測から得られる。アミノ酸配列のその他の特徴に関しては、図４４を参照されたい。
【図４６】エボラウイルスの糖タンパク質による細胞変性作用の誘導および細胞変性の分子決定因子のマッピングを示す。
【図４７】異なるＤＮＡ／アデノウイルス初期免疫−追加免疫の組合せにより生成されるエボラ特異的抗体応答を示す。データは、マウスの各群に関する相互終点希釈の平均および標準偏差を表すエラーバーグラフである。
【図４８】カニクイマカクザルのＤＮＡ−アデノウイルス免疫感作を示す。 Ａ）ＤＮＡおよび／またはアデノウイルス注射、ならびにエボラウイルスのザイールサブタイプの野生型マインガ（Mayinga）株を用いた攻撃誘発に関する免疫感作スケジュール。 Ｂ）血清中のエボラ特異的抗体のＥＬＩＳＡ力価。血清を、１２週目（中白棒）および２４週での免疫感作の２日前（中黒棒）に採取した。 Ｃ）免疫感作後のエボラ分泌糖タンパク質（ＳＧＰ）に対するリンパ増殖性応答。バーは、各被験体に関する４つの血液試料全ての平均増殖倍数度（fold-proliferation）を示す。誘導のベースラインレベルが実験間で変化したため、標準偏差は示されていない。しかしながら、８匹の動物全てからのＰＢＭＣを各時点に関して同一実験内でアッセイし、図に示される平均は任意の単一時点に関して得られた結果の代表である。 Ｄ）リンパ球サブセットの枯渇後のバルクＰＢＭＣ中のエボラＳＧＰに対するリンパ増殖性応答。２４週目のＰＢＭＣを、指示抗体で被覆されたＤｙｎａｌ磁気ビーズで処理して、ＣＤ４+またはＣＤ８+細胞サブセットを枯渇させた。枯渇後に残存する細胞を、細胞数入力のために正規化し、実施例に記載したように刺激した。結果を、２つの対照（被験体２および３）サルおよび２つの予防接種（被験体６および７）サルに関して示す。
【図４９】ＤＮＡ−アデノウイルス免疫感作後のエボラウイルスによる致死的攻撃誘発に対するカニクイマカクザルの防御を示す。 Ａ、Ｂ）エボラウイルスによる攻撃誘発後のサルにおける肝臓酵素レベル。ピッコロ（Piccolo）（登録商標）分析器（Abaxis, Inc., Sunnyvale, CA）用の一般化学１２試薬ディスクを用いた標準推奨手法により、非ヒト霊長類血清中の肝臓酵素（アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ））レベルを測定した。４つの免疫感作（中黒記号）および４つの対照（中白記号）サルに関する結果を示す。 Ｃ）エボラウイルス感染後のサルにおける血漿ウイルス血症。十字印は対照動物における死亡時を表す（５日目（被験体１）および６日目（被験体２および４））。一の対照動物（被験体３）は、７日目に瀕死状態になったので、安楽死させられた。感染に対して耐性であった一の予防接種動物（被験体５）を、組織の組織学的実験のために１０日目に安楽死させた。１７日まで、検出可能なウイルス血症を有した動物はなく、観察期間中（６ヶ月）、無ウイルス血症であった。データは、各サルに関する血清の相互終点希釈である。４つの免疫感作（中黒記号）サルおよび４つの対照（中白記号）サルに関する結果を示す。
【図５０】修飾ＣＭＶ発現ベクター、ＣＭＶ／Ｒの発現増強を示す。
【図５１】マウスにおける修飾ＣＭＶ発現ベクター、ＣＭＶ／Ｒの免疫原性増強を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は包括的に、ウイルスワクチン、特にフィロウイルスワクチンに、ならびにフィロウイルスに対する免疫応答またはフィロウイルスの感染により引き起こされる疾患を誘発する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エボラウイルス、及び遺伝的に関連するマールブルグウイルスは、北米、欧州およびアフリカにおけるヒトおよび霊長類の高致死性出血熱の大発生に関連するフィロウイルスである（非特許文献１または２）。エボラウイルスは、４つのサブタイプ（例えばザイール、スーダン、レストンおよび象牙海岸エピソード（episode）に記載されたもの）からなるマイナス鎖（negative-stranded）ＲＮＡウイルスである（非特許文献３）。いくつかのサブタイプが定義されているが、しかしこれらのウイルスの遺伝子構成は類似しており、それぞれ７つの線状アレイ遺伝子（linearly arrayed genes）を含有する。ウイルスタンパク質の１つであるエンベロープ糖タンパク質は２つの代替的形態で存在し、その２つの形態とは、ウイルスゲノムによりコードされる未知の機能を有する５０〜７０キロダルトン（ｋＤａ）の分泌タンパク質と、ウイルス進入を媒介するＲＮＡエディティング（editing）により生成される１３０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である（非特許文献１または３）。その他の構造遺伝子産物としては、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質ＶＰ２４およびＶＰ４０、推定非構造タンパク質ＶＰ３０およびＶＰ３５、ならびにウイルスポリメラーゼが挙げられる（非特許文献１で検討されている）。そのＲＮＡ配列の自発突然変異は天然で起きるが、しかし他のＲＮＡウイルス内よりも、エボラサブタイプ内では低ヌクレオチド多型性であると思われ（非特許文献３）、これは免疫感作がこの疾患に対する防御に有用であり得ることを示唆する。しかしながら伝統的な能動的および受動的免疫感作アプローチを用いたエボラウイルスに対する防御的免疫応答を誘発する従来の試みは、霊長類では成功していない（非特許文献１、４または５）。したがって、フィロウイルスに対する免疫応答またはフィロウイルス感染により引き起こされる疾患を誘発するためのワクチンを提供することが望まれている。さらに上記のワクチンを製造し、用いる方法を提供することが望まれている。
【非特許文献１】Peters, C.J. et al. in : Fields Virology, eds. Fields, B.N. et al. 1161-1176, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996
【非特許文献２】Peters, C.J. et al. 1994 Semin Virol 5: 147-154
【非特許文献３】Sanchez, A. et al. 1996 PNAS USA 93: 3602-3607
【非特許文献４】Clegg, J.C.S. et al. 1997 New Generation Vaccines, eds. : Levine, M.M. et al. 749-765, New York, NY. Marcel Dekker, Inc.
【非特許文献５】Jahrling, P.B. et al. 1996 Arch Virol Suppl 11: 135-140
【発明の開示】
【０００３】
エボラウイルスにより引き起こされる出血熱の大発生は、このヒト病原体の顕著な特徴である高死亡率と関連付けられる。最高致死率は、今日までに同定された４つの株のうちの１つであるザイールサブタイプと関連付けられる（Feldmann, H. et al. 1994 Virology 199: 469-473 ;Sanchez, A. et al. 1996 PNAS USA 93: 3602-3607）。その急速な進行は、天然免疫を発現する機会をほとんど与えず、現在、有効な抗ウイルス療法は存在しない。したがって予防接種は、感染を予防し、伝染を制限するための有望な手段を提供する。本明細書に、霊長類におけるエボラウイルス感染に対する非常に有効なワクチン戦略を記載する。ＤＮＡ免疫感作、およびウイルスタンパク質をコードするアデノウイルスベクターによる追加免疫の組合せは、カニクイマカクザルにおいて細胞性および体液性免疫を生じた。致死用量のエボラ・ザイールウイルスの高病原性野生型１９７６マインガ（Mayi
nga）株を用いた攻撃誘発(challenge)は、対照において均一感染を引き起こし、それらのカニクイマカクザルは１週間未満で瀕死状態および死に至った。対照的に、予防接種された動物は全て、６ヶ月より長い間無症候性であり、最初の攻撃誘発後、検出可能なウイルスは認められなかった。これらの知見は、霊長類におけるエボラウイルス感染に対する予防ワクチンを開発することができることを実証している。
【０００４】
【表１】
【０００５】
【表２−１】
【表２−２】
【０００６】
［発明の詳細な説明］
薬学的に許容可能な賦形剤中で、対照配列に作動可能的に連結された、フィロウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子を含むフィロウイルスワクチンが提供される。一実施形態では、核酸分子は膜貫通形態のウイルス糖タンパク質（ＧＰ）をコードする。別の実施形態では、核酸分子は分泌形態のウイルス糖タンパク質（ＳＧＰ）をコードする。さ
らに別の実施形態では、核酸分子はウイルス核タンパク質（ＮＰ）をコードする。
【０００７】
本発明はさらに、ＧＰ、ＳＧＰおよびＮＰ以外のフィロウイルス構造タンパク質（例えば、フィロウイルスに対する免疫応答またはフィロウイルス感染により引き起こされる疾患を誘発するその他の構造遺伝子産物）をコードする核酸分子を含むワクチンを包含する。本発明のワクチンの核酸分子は、任意のエボラウイルス株（例えばザイール、スーダン、象牙海岸およびレストン株）の構造遺伝子産物をコードする。遺伝的に関連するマールブルグウイルス株の構造遺伝子産物をコードする核酸分子も用いられ得る。さらに本発明の核酸分子は修飾され得る。例えば本明細書中に記述された核酸分子は、修飾発現タンパク質が病原体または疾患に対する免疫応答を誘発する限り、突然変異化され得る。例えば核酸分子は、発現タンパク質が細胞に低毒性であるよう、突然変異化され得る。本発明は、核酸分子の組合せを含むワクチンも包含する。例えばザイール、スーダンおよび象牙海岸エボラ株のＧＰ、ＳＧＰおよびＮＰをコードする核酸分子が任意の組合せで、１つのワクチン組成物中に組合され得るが、これらに限定されない。
【０００８】
本発明は、フィロウイルス感染により引き起こされる疾患に対して被験体を免疫感作するための方法であって、免疫有効量のフィロウイルスワクチンを被験体に投与することを含む方法も提供する。薬学的組成物の調製を含めた、フィロウイルスワクチンの製造および使用方法も、本発明により提供される。
【０００９】
エボラウイルスの分泌およびビリオン糖タンパク質の生化学的分析
エボラ（ＥＢＯ）ウイルスは、フィロウイルス（Filoviridae）の成員であり、ヒトおよび／または非ヒト霊長類において重篤な、しばしば致命的な形態の出血熱疾患を引き起こす。フィロウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子は、マイナス鎖ＲＮＡゲノムの３’末端から（７つのうちの）４番目の遺伝子である。ある程度まで特性化されたＥＢＯウイルスは全て、構造ＧＰよりむしろ分泌非構造糖タンパク質（ＳＧＰ）の発現を生じる、同一の非従来型のＧＰ遺伝子構成を有する。ＳＧＰは単一フレーム（０フレーム）でコードされるが、一方、ＧＰは２つのフレーム（０および−１フレーム）でコードされる。ＧＰの発現は、単一の追加のアデノシンの挿入（一連の７つのアデノシンに付加される）を生じる転写エディティング事象を介して２つのフレームが連結される場合に起こる。
【００１０】
図４４を参照すると、ＥＢＯウイルスのザイール種に関しては、ＳＧＰ（３６４総残基）およびＧＰ（６７６総残基）のＮ末端２９５残基（シグナル配列を含む）は同一であるが、それらのＣ末端配列の長さおよび構成は独特である。タイプ１膜貫通タンパク質であるＧＰは、感染ビリオンの表面に見出され、感受性細胞へのウイルスの結合および進入において付着構造で機能する。全種のＥＢＯウイルスに関するＧＰ予測アミノ酸配列の比較は、Ｎ末端およびＣ末端領域における一般的保存を示し（各々、総配列の約３分の１）、高可変性中区分により分離される。このタンパク質は、高度にグリコシル化され、多量のＮ−およびＯ−連結グリカンを含有し、マールブルグ（ＭＢＧ）ウイルス（別の種類のフィロウイルス）に関しては、三量体を形成することが示されている。ＧＰの膜貫通アンカー配列（残基６５０〜６７２）に対する直Ｎ末端は、フィロウイルスにおいて高度に保存されるモチーフ（残基５８５〜６０９）である。この配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫抑制性であることが示されている腫瘍形成性レトロウイルスの糖タンパク質中の一モチーフと高度の相同性を有する。一部重複するこのモチーフは、他のウイルスの表面糖タンパク質に関して予測される構造と同様に、三量体のアセンブリーにおける分子間コイルドコイルの形成において機能すると考えられる七価基反復配列（５３残基；位置５４１〜５９３）である。この配列に対する直（immediately）Ｎ末端は、サブチリシン／ケキシン様転換酵素フリンに関する推定上の多塩基切断部位が直ぐ後に続く予測融合ペプチドである。フリンによる切断は、特異的阻害剤を使用して間接的に実証されており、配列ＲＲＴＲ↓の最後のアルギニン（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始からの位置５０１
）で起こると予測される。ＳＧＰの役割はほとんど定義されていないが、しかしＳＧＰは好中球と結合し、一方ＧＰは内皮細胞と結合することが近年の研究により示された。ＳＧＰとＧＰの異なる結合パターンは、同一のＮ末端アミノ酸配列（〜２８０残基）を有するにもかかわらず、これらの糖タンパク質は構造的に互いに全く異なることを示唆する。
【００１１】
図４５を参照すると、エボラウイルスのザイール種により発現される糖タンパク質は、切断、オリゴマー化およびその他の構造特性に関して分析され、それらの機能をより明確に定義した。２９５Ｎ末端残基を共有する５０〜７０ｋＤａの分泌糖タンパク質および１５０ｋＤａのビリオン／構造糖タンパク質（それぞれＳＧＰおよびＧＰ）は、シグナラーゼによりＮ末端近くで切断される。フリンにより媒介される傾向が高い多塩基部位（ＲＲＴＲＲ↓）（配列番号５１）で、ＧＰで起きる二次切断事象は、ジスルフィド結合により連結される２つの糖タンパク質（ＧＰ１およびＧＰ２）を生じる。このフリン切断部位は、全てのエボラウイルスのＧＰ中で同一位置に存在し（Ｒ［Ｒ／Ｋ］Ｘ［Ｒ／Ｋ］Ｒ↓）、しかしながら１つはマールブルグウイルスウイルスに関して（Ｒ［Ｒ／Ｋ］ＫＲ↓）異なる位置で予測される。架橋試験の結果に基づいて、エボラビリオンペプロマーはＧＰ１−ＧＰ２へテロダイマーの三量体から成り、そしてそれらの構造的な面はレトロウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のようなレンチウイルスを含む）、パラミクソウイルスおよびインフルエンザウイルスのものに類似することを研究者は確定することができた。ＳＧＰは、ほとんどもっぱらジスルフィド結合により連結されるホモダイマーの形態で、感染細胞から分泌されることも研究者は確定した。
【００１２】
図４６を参照すると、エボラウイルス病原性の主要ウイルス決定因子を特定した；ザイール型エボラウイルスのビリオン糖タンパク質（ＧＰ）の合成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのヒト内皮細胞における細胞傷害作用を誘導した。この作用は、ウイルスの７つの遺伝子産物のうちの１つであるこのＩ型膜貫通糖タンパク質のセリン−トレオニンに富むムチン様ドメインにマップされた。移植されたヒトまたはブタ血管へのＧＰの遺伝子移入は、４８時間以内に内皮細胞の大損失を引き起こし、血管透過性の重大な増大をもたらした。ＧＰのムチン様領域の欠失は、タンパク質の発現または機能に影響を及ぼさずに、これらの作用を消失させた。非ヒト霊長類においては疾患を引き起こすがヒトにおいては引き起こさないレストン株ウイルス由来のＧＰは、ヒト血管の血管系を崩壊させなかった。これに対比して、ザイール型ＧＰは非ヒト霊長類およびヒトの両方の血管において内皮細胞崩壊および細胞傷害を誘導し、ムチンドメインがこの作用のために必要とされた。これらの知見は、ＧＰのムチンドメインがエボラ病原性のウイルス決定因子であり、感染中の出血に関与すると思われることを示す。
【００１３】
核酸分子
本明細書中に示されているように、本発明の核酸分子は、クローニングにより得られるかまたは合成的に生産されるＲＮＡまたはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても既知であるコード鎖であり得るし、あるいはアンチセンス鎖としても言及される非コード鎖であり得る。
【００１４】
「単離」核酸分子（単数または複数）とは、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えばベクター中に含入される組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞中に保持される組換えＤＮＡ分子または溶液中の精製（部分的または実質的な）ＤＮＡ分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子としては、本発明のＤＮＡ分子のｉｎ
ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写体が挙げられる。本発明の単離核酸分子としてはさらに、合成的に生産されたこのような分子が挙げられる。
【００１５】
本発明の核酸分子としては、野生型フィロウイルス構造遺伝子産物をコードするオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子、ならびに上記のものとは実質的に異なる配列であるが、遺伝コードの縮重のために、依然として野生型フィロウイルス構造遺伝子産物のＯＲＦをコードする配列を含むＤＮＡ分子が挙げられる。もちろん遺伝コードは、当該技術分野で既知である。
【００１６】
本発明はさらに、本明細書中に記載された核酸分子の断片を対象とする。野生型フィロウイルス構造遺伝子産物をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列を有する核酸分子の断片とは、少なくとも約１５ｎｔ．長、さらに好ましくは少なくとも約２０ｎｔ．長、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ．長、さらに好ましくは少なくとも約４０ｎｔ．長の断片を意図する。もちろんより長い断片、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ｎｔ．長も、野生型フィロウイルス構造遺伝子産物をコードするＯＲＦのヌクレオチド配列のほとんど（全てではないとしても）に対応する断片であり、本発明により意図される。例えば少なくとも２０ｎｔ．長の断片とは、野生型フィロウイルス構造遺伝子産物のＯＲＦのヌクレオチド配列からの２０またはそれ以上の連続塩基を含む断片を意図する。
【００１７】
本発明の好ましい核酸断片としては、フィロウイルス構造タンパク質のエピトープ保有部分をコードする核酸分子が挙げられる。特に本発明のこのような核酸断片としては、フィロウイルス構造タンパク質のエピトープ保有ドメインをコードする核酸分子が挙げられるが、この場合、ドメインはＧＰ／ＳＧＰ同一性ドメイン、ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカードメインおよび細胞内ドメインならびにそれらの任意の組合せ、例えば膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーション（truncation）を有するフィロウイルスの糖タンパク質；七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質である。別の例は、ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカードメインまたは細胞内ドメインを欠失するためのアミノ、内部またはカルボキシ欠失を有するフィロウイルスの糖タンパク質である。
【００１８】
別の態様において、本発明は、上記の本発明の核酸分子中のポリヌクレオチドの一部分と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で一晩インキュベートし、その後、０．１ｘＳＳＣ中約６５℃でフィルターを洗浄することを意味する。
【００１９】
ポリヌクレオチドの「一部分」とハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ．）、さらに好ましくは少なくとも約２０ｎｔ．、さらに好ましくは少なくとも約３０ｎｔ．、さらに好ましくは約３０〜７０ｎｔ．の参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意味する。
【００２０】
「少なくとも２０ｎｔ．長」のポリヌクレオチドの一部分とは、例えば参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列からの２０またはそれ以上の連続ヌクレオチドを意味する。もちろん、ポリＡ配列あるいはＴ（またはＵ）残基の相補的ストレッチのみとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリＡストレッチまたはその相補体（例えば特に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含有する任意の核酸分子とハイブリダイズするため、本発明の核酸の一部分とハイブリダイズするために用いられる本発明のポリヌクレオチドには含まれない。
【００２１】
本明細書中に示されるように、フィロウイルス構造遺伝子産物をコードする本発明の核酸分子としては、全長ポリペプチドのアミノ酸配列を単独でコードするもの、全長ポリペプチドおよび付加的配列に関するコード配列、例えばリーダーまたは分泌配列、例えばプレ−またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列をコードするもの、付加的非コード配列（例えばイントロンおよび非コード５’および３’配列が挙げられるが、これらに限定されない）とともに上記の付加的コード配列を伴うかまたは伴わない全長ポリペプチドのコード配列、例えば転写、ｍＲＮＡプロセシング、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル、例えばリボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性において機能する転写化非翻訳化配列；ならびに付加的アミノ酸をコードする付加的コード配列、例えば付加的官能基を提供するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明はさらに、フィロウイルス構造遺伝子産物の一部分、類似体または誘導体をコードする、本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」とは、生物体のゲノム上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替的形態のうちの１つを意味する（Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, 1985 New York）。非天然変異体は、当該技術分野で既知の突然変異誘発技法を用いて生産され得る。
【００２３】
このような変異体としては、１つまたは複数のヌクレオチドを包含し得る、ヌクレオチド置換、欠失または付加により生産されるものが挙げられる。変異体は、コード領域、非コード領域またはその両方で変更され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいのは、フィロウイルス構造遺伝子産物またはその一部分の特性および活性を変更しないサイレント置換、付加および欠失である。保存的置換もこの点において特に好ましい。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態としては、野生型フィロウイルス構造遺伝子産物またはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列あるいはそれと相補的なヌクレオチド配列と、少なくとも９５％同一の、さらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸分子が挙げられる。
【００２５】
フィロウイルス構造遺伝子産物をコードする参照ヌクレオチド配列と、例えば少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、エボラウイルス構造遺伝子産物をコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり、ポリヌクレオチド配列が５つまでの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失されるかまたは別のヌクレオチドで置換され得るか、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの数の５％までの数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置で、あるいは参照配列中のヌクレオチド間に独立して、あるいは参照配列内の１つまたは複数の連続基中に点在されるそれらの末端位置間のいずれで
も起こり得る。
【００２６】
実際的問題として、任意の特定の核酸分子が参照ヌクレオチド配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、既知のコンピュータープログラム、例えばＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711）を用いて従来通りに確定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Smith and Waterman, 1981 Advances in Applied Mathematics 2: 482-489の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最良セグメントを見つけ出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて、特定の配列が、例えば本発明の参照配列と９５％同一であるか否かを確定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長に亘って算定され、参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許されるように設定される。
【００２７】
本発明の出願は、エボラ、マールブルグまたはラッサウイルスポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードする、本願の配列表中に示された核酸配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の核酸分子を対象とする。「エボラ、マールブルグまたはラッサウイルスポリペプチド活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにおいてエボラ、マールブルグまたはラッサウイルスポリペプチド活性を示すポリペプチドを意味する。例えば、ＧＰ、ＳＧＰまたはＮＰタンパク質活性は、適切な免疫学的アッセイにより、免疫学的特質における変化に関して測定され得る。
【００２８】
もちろん、遺伝コードの縮重のために、本願の配列表中に示された核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する多数の核酸分子が、「エボラ、マールブルグまたはラッサウイルスポリペプチド活性を有する」ポリペプチドをコードすると当業者は容易に理解するであろう。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体は全て同一ポリペプチドをコードするため、これは上記の比較アッセイを実施するまでもなく、当業者には明らかである。縮重変異体でないこのような核酸分子に関しては、合理的な数（a reasonable number）が、エボラ、マールブルグまたはラッサウイルスポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードすることが当該技術分野においてさらに理解されるであろう。これは、タンパク質機能に有意な影響を与えるとはあまり考えられないかまたは考えられないアミノ酸置換（例えばある脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸に置換すること）に、当業者は十分に気づくためである。
【００２９】
例えば、表現型性サイレントアミノ酸置換の作製方法に関する指針は、Bowie, J.U. et
al. 1990 Science 247: 1306-1310に記載されており、その記載では、タンパク質は意外にもアミノ酸置換に寛容であると著者等は示している。
【００３０】
ポリペプチドおよび断片
本発明はさらに、野生型フィロウィルス構造遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされるアミノ酸配列を有するフィロウイルスポリペプチド、あるいはその一部分を含むペプチドまたはポリペプチド（例えばＳＧＰ）を提供する。
【００３１】
フィロウイルスポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能の有意の作用を伴わずに変更され得ると当該技術分野では理解される。配列におけるこのような差異が意図される場合、活性を確定するタンパク質に重要な領域が存在するということを思い起こすべきである。
【００３２】
したがって本発明はさらに、実質的フィロウイルスポリペプチド活性を示し、あるいは
下記のタンパク質部分のようなフィロウイルスタンパク質の領域を含む、フィロウイルスポリペプチドの変異を包含する。このような突然変異体としては、欠失、挿入、逆位、反復および型置換が挙げられる。上記のように、アミノ酸変化が表現型性サイレントであるかどうかを考えるに関する指針は、Bowie, J.U. et al. 1990 Science 247: 1306-1310に見出され得る。
【００３３】
したがって、本発明のポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、このような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであり得るかまたはあり得ないもの、あるいは（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されたもの、例えばＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド、あるいはリーダーまたは分泌配列、あるいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列であり得る。このような断片、誘導体および類似体は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００３４】
上記のように、好ましくは性質の変化が僅かなものであり、例えばタンパク質のフォールディングまたは活性に有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である（表Ａ参照）。
【００３５】
【表３】
【００３６】
もちろん、当業者が作製するアミノ酸置換の数は、上記したものを含めた多数の因子に依存している。概して、任意の所定のフィロウイルスポリペプチドに関するアミノ酸置換の数は、５０、４０、３０、２０、１０、５または３より少ない。
【００３７】
機能に不可欠な本発明のフィロウイルスポリペプチド中のアミノ酸は、当該技術分野で
既知の方法により、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発により同定され得る（Cunningham & Wells 1989 Science 244: 1081-1085）。後者の手法は、分子中の全ての残基に単一アラニン突然変異を導入する。その結果生じた突然変異体分子は次に、生物学的活性、例えば免疫学的特質の変化に関して試験される。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、便宜上、単離形態で提供される。「単離ポリペプチド」とは、そのネイティブ環境から取り出されたポリペプチドを意味する。したがって組換え宿主細胞内に生産されるかおよび／または含有されるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたと考えられる。「単離ポリペプチド」とは、組換え宿主細胞またはネイティブ供給源から、部分的にまたは実質的に精製されたポリペプチドも意味する。例えば、組換えにより生産されたバージョンのフィロウイルスポリペプチドは、Smith and Johnson 1988 Gene 67: 31-40に記載された一段階法により実質的に精製され得る。
【００３９】
本発明のポリペプチドとしては、野生型フィロウイルス構造遺伝子産物またはその一部分のアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは本願の配列表に示された核酸配列によりコードされるポリペプチド；ならびに上記したものと少なくとも９５％同一、さらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドを含むポリペプチドが挙げられる。
【００４０】
フィロウイルスポリペプチドの参照アミノ酸配列と、少なくとも例えば９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、フィロウイルスポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸当たり、ポリヌクレオチド配列が５つまでのアミノ酸変更を含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の５％までが欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換され得るか、あるいは参照配列中の全アミノ酸残基のうちの５％までの数のアミノ酸が参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端位置で起こり得るし、あるいは参照配列中の残基の間に独立してまたは参照配列内の１つまたは複数の連続基中に点在される、それらの末端位置間のいずれの位置ででも起こり得る。
【００４１】
実際的問題として、任意の特定のポリペプチドが参照アミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、既知のコンピュータープログラム、例えばＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711）を用いて慣用的に確定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて、特定の配列が、例えば本発明の参照配列と９５％同一であるか否かを確定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長に亘って算定され、参照配列中のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許されるように設定される。
【００４２】
別の態様では、本発明は、少なくとも３０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を有する、本明細書中に記載されたポリペプチドの一部分を提供する。本発明の好ましい一部分としては、フィロウイルス構造タンパク質のエピトープ保有部分を含むポリペプチドが挙げられる。特に、本発明の好ましい一部分としては、フィロウイルス構造タンパク質のエピトープ保有ドメインを含むポリペプチドが挙げられるが、この場合、ドメインはＧＰ／ＳＧＰ同一性ドメイン、ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカードメインおよび細胞内ドメインならびにそれらの任意の組合せである。
該組み合わせとは、例えば膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカル
ボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質；ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカーおよび細胞内ドメインを欠失するためのカルボキシ末端のトランケーションを有するフィロウイルスの糖タンパク質である。別の例は、ムチン様ドメイン、フリン切断部位、融合ペプチドドメイン、七価基反復ドメイン、膜貫通アンカードメインまたは細胞内ドメインを欠失するための、アミノ、内部またはカルボキシ欠失を有するフィロウイルスの糖タンパク質である。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、任意の慣用的手段により生産され得る（Houghten, R.A. 1985 PNAS USA 82: 5131-5135）。「同時多重ペプチド合成（ＳＭＰＳ）」法は、米国特許第４，６３１，２１１号（Houghten等（１９８６））に記載されている。
【００４４】
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技法によるフィロウイルスポリペプチドまたはその断片の産生にも関する。
【００４５】
本発明は、初回免疫組成物の投与により誘導された免疫応答が、追加免疫組成物の投与により追加免疫される、「初回免疫および追加免疫」免疫感作レジメンに関する。本発明は、種々の異なる種類の初回免疫組成物のうちのいずれかを用いて初回免疫した後に、複製欠陥アデノウイルスベクターを用いて有効な追加免疫を達成することができるという本発明者らの実験的実証に基づいている。本発明は、下記の実験が示すように、種々の異なる初回免疫組成物のうちのいずれかを用いて、抗原に対して初回免疫された免疫応答に、追加免疫を提供するための有効な手段であることが明らかにされた複製欠陥アデノウイルスを用いる。
【００４６】
ヒト血清型５由来の複製欠陥アデノウイルスは、Grahamと同僚等により生（live）ウイルスベクターとして開発された（Graham & Prevec 1995 Mol Biotechnol 3: 207-20; Bett et al. 1994 PNAS USA 91: 8802-6）。アデノウイルスは、約３６００ｂｐの線状二本鎖ＤＮＡゲノムを含有する非エンベロープ型ウイルスである。組換えウイルスは、ウイルス複製を可能にする許容細胞株中で、アデノウイルスゲノムプラスミドと、強力な真核生物プロモーターとともに当該遺伝子を含むシャトルベクターとの間の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えにより構築され得る。高ウイルス力価が許容細胞株から得られるが、その結果生じるウイルスは、広範囲の細胞型を感染し得るが、許容株以外のいかなる細胞中でも複製せず、したがって安全な抗原送達系である。組換えアデノウイルスは、多数の抗原、例えばダニ媒介性脳炎ウイルスＮＳ１タンパク質（Jacobs et al. 1992 J Virol 66: 2086-95）および麻疹ウイルス核タンパク質（Fooks et al. 1995 Virology 210: 456-65）に対する防御的免疫応答を誘発することが示されている。
【００４７】
驚くべきことに、下記の実験的研究は、本発明の実施形態の使用により、抗原を発現する組換え複製欠陥アデノウイルスが、ＤＮＡワクチンにより初回免疫された免疫応答を追加免疫することが可能になることを実証する。複製欠陥アデノウイルスは、筋肉内免疫感作後に免疫応答を誘導することが見出された。初回免疫／追加免疫予防接種レジメンでは、複製欠陥アデノウイルスは、異なる組換えウイルスまたは組換えにより産生された抗原により追加免疫され得る応答を、初回免疫し得るものとしても予見される。
【００４８】
プラスミドＤＮＡで免疫感作され、複製欠陥アデノウイルスで追加免疫された非ヒト霊長類は、攻撃誘発に対して防御された。組換え複製欠陥アデノウイルスおよびプラスミドＤＮＡはともに、ヒトにとって安全なワクチンである。有益なことに、用いられる予防接種レジメンにおいて、免疫応答（例えば、ヒトにおける）を誘導するのに適した一般的免疫感作レジメンを構成する初回免疫および追加免疫の両方のために、筋肉内免疫感作が用いられ得ることを本発明者が見出した。
【００４９】
本発明は、種々の態様および実施形態において、抗原または抗原をコードする核酸の前投与により初回免疫された抗原に対する免疫応答を追加免疫するために、抗原をコードする複製欠陥アデノウイルスベクターを用いる。
【００５０】
本発明の一般的態様は、抗原に対する免疫応答を追加免疫するための複製欠陥アデノウイルスベクターの使用を提供する。
【００５１】
本発明の一態様は、個体において抗原に対する免疫応答を追加免疫する方法であって、核酸からの発現により個体において抗原を産生し、それにより個体に以前に初回免疫された抗原に対する免疫応答を追加免疫するために、調節配列に作動可能的に連結された抗原をコードする核酸を含む複製欠陥アデノウイルスベクターを個体に提供することを含む方法を提供する。
【００５２】
抗原に対する免疫応答は、遺伝子免疫感作により、感染因子による感染により、または組換えにより産生された抗原により初回免疫され得る。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、個体における抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、抗原または抗原をコードする核酸を含む初回免疫組成物を個体に投与し、次に核酸からの発現により個体において抗原を生産するための、調節配列に作動可能的に連結された抗原をコードする核酸を含む複製欠陥アデノウイルスベクターを含む追加免疫組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００５４】
さらなる態様は、抗原に対する免疫応答を追加免疫するために哺乳類へ投与するための薬剤の製造における、開示されたような複製欠陥アデノウイルスベクターの使用を提供する。このような薬剤は一般に、抗原を含む初回免疫組成物を前投与した後に投与するための薬剤である。
【００５５】
初回免疫組成物は、任意のウイルスベクター、例えばアデノウイルスまたはアデノウイルス以外のもの、例えばワクシニアウイルスベクター（例えば修飾ウイルスアンカラ（Ankara）（ＭＶＡ）（Mayr et al. 1978 Zentralbl Bakteriol 167: 375-90; Sutter and Moss 1992 PNAS USA 89: 10847-51; Sutter et al. 1994 Vaccine 12: 1032-40）またはＮＹＶＡＣ（Tartaglia et al. 1992 Virology 118: 217-32）等の複製欠陥株）、鳥痘（avipox）ベクター（例えばＡＬＶＡＣとして既知の株（Kanapox、Paoletti et al. 1994 Dev Biol Stand 1994 82: 65-9）等の鶏痘（fowlpox）またはカナリア痘（canarypox））、あるいはヘルペスウイルスベクターを含み得る。
【００５６】
初回免疫組成物は、抗原をコードするＤＮＡを含み、このようなＤＮＡは好ましくは、哺乳類細胞中で複製することができない環状プラスミドの形態である。任意の選択可能マーカーは、臨床的に用いられる抗生物質に対して耐性を有するべきでないため、例えばカナマイシン耐性がアンピシリン耐性よりも好ましい。抗原発現は、哺乳類細胞中で活性であるプロモーター、例えばサイトメガロウイルス極初期（ＣＭＶＩＥ）プロモーターにより駆動されるべきである。
【００５７】
本発明の種々の態様の特定の実施形態では、初回免疫組成物の投与の後に、一次および二次追加免疫組成物による追加免疫が続き、一次および二次追加免疫組成物は、例えば以下に例示されるように、同一でもまたは互いに異なっていてもよい。さらなる追加免疫組成物が、本発明から逸脱することなく用いられ得る。一実施形態では、三重免疫感作レジメンは、ＤＮＡを用い、次に一次追加免疫組成物としてアデノウイルス（Ａｄ）を用い、次に二次追加免疫組成物としてＭＶＡを用い、その後任意に、さらなる（三次）追加免疫組成物を投与してもよく、あるいは同一または異なるベクターの一方または両方を追加免疫投与してもよい。別のオプションは、ＤＮＡ、次にＭＶＡ、次にＡｄ、任意にその後、同一または異なるベクターの他方または両方の追加免疫投与である。
【００５８】
それぞれの初回免疫組成物および追加免疫組成物中に含まれる抗原（しかしながら多数の追加免疫組成物が用いられる）は同一である必要はないが、エピトープを共有すべきである。抗原は標的病原体または細胞中の完全抗原またはその断片に対応し得る。ペプチドエピトープまたはエピトープの人工紐（string）が用いられて、抗原中の不必要なタンパク質配列、および単数または複数のベクター中のコード配列がより効率的に切断される。１つまたは複数の付加的エピトープ、例えばＴヘルパー細胞により認識されるエピトープ、特に異なるＨＬＡ型の個体中で認識されるエピトープが包含され得る。
【００５９】
複製欠陥アデノウイルスベクター内では、コード抗原の発現のための調節配列はプロモーターを含む。「プロモーター」とは、下流に（すなわち、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖上で３’方向に）作動可能的に連結されるＤＮＡの輸送が開始され得るヌクレオチドの配列を意味する。「作動可能的に連結される」とは、プロモーターから開始される転写のために適切に配置され、配向された同一核酸分子の一部として連結されることを意味する。プロモーターに作動可能的に連結されるＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下」にある。その他の調節配列（例えばターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびその他の配列）が、当業者の知識および技量により、適宜含まれ得る（例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。核酸構築物の調製、突然変異誘発、シーケンシング、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現ならびにタンパク質の分析における、核酸の操作のための多数の既知の技術およびプロトコールは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1994に詳細に記載されている。
【００６０】
本発明の態様および実施形態に用いるための適切なプロモーターとしては、イントロンＡを伴うかまたは伴わないサイトメガロウイルス極初期（ＣＭＶＩＥ）プロモーター、ならびに哺乳類細胞中で活性である任意のその他のプロモーターが挙げられる。
【００６１】
初回免疫組成物および追加免疫組成物のいずれかまたは両方が、アジュバントまたはサイトカイン、例えばα−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｇＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２またはそのコード核酸を含み得る。
【００６２】
追加免疫組成物の投与は一般に、初回免疫組成物の投与後、数週間目または数ヶ月目、好ましくは約２〜３週目または４週目、または８週目、または１６週目、または２０週目、または２４週目、または２８週目または３２週目に実施される。
【００６３】
好ましくは、初回免疫組成物、追加免疫組成物、または初回免疫および追加免疫組成物
の両方の投与は、筋肉内免疫感作である。
【００６４】
アデノウイルスワクチンまたはプラスミドＤＮＡの筋肉内投与は、ウイルスまたはプラスミドＤＮＡの懸濁液を注射するための針を用いて実施され得る。代替的に、冷蔵を必要とせずに個別調製用量を製造することができるウイルスまたはプラスミドＤＮＡ懸濁液（例えばＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）を使用）、あるいはワクチンを含有する凍結乾燥粉末（例えばPowderjectの技法および製品による）を投与するための無針注射用具（device）を使用してもよい。これは、アフリカの地方において必要とされるワクチンにとっては大きな利点となろう。
【００６５】
アデノウイルスは、ヒト免疫感作における優れた安全性記録を有するウイルスである。組換えウイルスは簡単に生成され、それらは大量に再現的に製造され得る。したがって組換え複製欠陥アデノウイルスの筋肉内投与は、免疫応答により制御され得る疾患に対するヒトの予防的または治療的予防接種に非常に適している。
【００６６】
個体は、抗原の送達および抗原に対する免疫応答の発生が、有益であるかまたは治療的に有益な作用を有するような疾患または障害を有し得る。
【００６７】
おそらく、投与は、感染または症状の発生前に、病原体または疾患に対する免疫応答を発生させるという予防的目標を有する。
【００６８】
本発明に従って治療または予防され得る疾患および障害としては、免疫応答が予防的または治療的役割を果たし得るものが挙げられる。
【００６９】
本発明に従って投与される構成成分は、薬学的組成物中に処方され得る。これらの組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に既知のその他の物質を含み得る。このような物質は無毒性であるべきであり、そして活性成分の効力を妨げるべきでない。担体またはその他の物質の厳密な性質は、投与経路（例えば静脈内、皮膚または皮下、粘膜内（例えば腸）、鼻内、筋肉内または腹腔内経路）によって変わり得る。
【００７０】
上述のように、投与は好ましくは皮内、皮下または筋肉内である。
【００７１】
液体薬学的組成物は一般に、液体担体、例えば水、鉱油（petroleum）、動物または植物油、鉱物油（mineral oil）または合成油を含む。生理食塩水、デキストロースまたはその他の糖類溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが含まれ得る。
【００７２】
静脈内注射、皮膚注射または皮下注射、あるいは疾患部位への注射のために、活性成分は、発熱物質無含有であって、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶液の形態である。当業者は、例えば等張性ビヒクル（例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸化リンガー注射液）を用いて適切な溶液を調製し得る。防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／またはその他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。
【００７３】
徐放性処方物が用いられ得る。
【００７４】
複製欠陥アデノウイルス粒子の産生、およびこのような粒子を組成物中へ任意に処方した後、粒子は個体（特にヒトまたはその他の霊長類）に投与され得る。
【００７５】
投与は、別の哺乳類、例えば齧歯類、例えばマウス、ラットもしくはハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、ロバ、イヌまたはネコに対しても実施され得る。
【００７６】
投与は、好ましくは「予防的有効量」または「治療的有効量」（但し、場合によっては、予防は治療であると考えられ得る）で実施され、これは、個体に対する利益を示すのに十分である。実際に投与される量、ならびに投与される速度および時間経過は、治療されるものの性質および重症度によって異なる。治療の処方、例えば投薬量に関する決定等は、一般医およびその他の医師の、あるいは獣医学的状況では獣医の責任の範囲内であり、典型的には治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、ならびに医師に既知のその他の因子を考慮する。上記の技法およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed., 1980に見出され得る。
【００７７】
好ましい一レジメンでは、ＤＮＡが１０μｇ〜５０ｍｇ／注射の用量で、その後、アデノウイルス（好ましくは筋肉内に）が５×１０7〜１×１０12粒子／注射の用量で投与される。
【００７８】
組成物は、所望により、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るキット、パックまたはディスペンサー中にあり得る。例えばキットは、金属またはプラスチック箔、例えばブリスターパックを含み得る。キット、パックまたはディスペンサーは、投与のための使用説明書が添付され得る。
【００７９】
組成物は、治療される症状によって、単独でまたは他の治療と組合せて、同時にまたは順番に投与され得る。
【００８０】
非ヒト哺乳類への送達は、治療目的である必要はないが、実験的に、例えば当該抗原に対する免疫応答、例えば疾患に対する防御のメカニズムの研究に用いるためであり得る。
【００８１】
本発明のさらなる態様および実施形態は、上記の開示および以下の実験的例示（例として包含されるが、それらに限定されない）を、添付の図面を参照して考慮すれば、当業者には明らかである。
【００８２】
霊長類におけるエボラウイルス感染に対する予防ワクチンの開発
遺伝子免疫感作は、体液性および細胞性免疫活性化経路の両方に影響を及ぼし、ヒト病原体による感染に対して防御することが示されている（Tang, D.C. et al. 1992 Nature 356: 152-154; Ulmer, J.B. et al. 1993 Science 259: 1745-1749; Wang, B. et al. 1993 PNAS USA 90: 4156-4160;Sedegah, M. et al. 1994 PNAS USA 91: 9866-9870）。プラスミドワクチンの有効性は、宿主細胞タンパク質合成および免疫原の内因性提示に起因し、おそらくはプラスミドＤＮＡ自体の免疫刺激作用によるものと考えられる（Kreig, A.M. et al. 1995 Nature 374: 546-549; Sato, Y. et al. 1996 Science 273: 352-354）。ＤＮＡワクチンは、エボラウイルス抗原に対する特異的免疫応答を誘発し、齧歯類において致死的感染するエボラウイルスによる攻撃誘発（Connolly, B.M. et al. 1999 J Infect Dis 179: S203-S217; Bray, M. et al. 1998 J Infect Dis 178: 651-661）に対してモルモット（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 7-42）およびマウス（Vanderzanden, L. et al. 1998 Virology 246: 134-144）を防御することが示されている。細胞媒介性および体液性免疫応答の両方が誘発されたが、抗体力価は、エボラウイルスのザイールサブタイプからのタンパク質をコードするプラスミドで免疫感作された動物における防御の程度と関連付けられた。
【００８３】
広範に有効なワクチンは、ヒト感染において単離される多エボラサブタイプ（ザイール
、スーダンおよび象牙海岸）に対する免疫を提供する必要があるが、多価ワクチンは、単一サブタイプワクチンに関して実証された特異的免疫応答を弱め得る。この問題に対処するために、オリジナルのエボラ・ザイールＤＮＡワクチン単独の効力を、エボラウイルスのスーダンおよび象牙海岸サブタイプからのＤＮＡと組合せて使用した場合の効力とを比較して分析した。従来の研究（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 7-42）の場合と同様に、ザイールサブタイプビリオン糖タンパク質ＧＰ（Ｚ）をコードする単一プラスミドによる免疫感作は、モルモットにおいて実質的なウイルス特異的抗体応答を発生し、防御免疫を付与した（表１）。エボラ核タンパク質ＮＰを発現するプラスミドの封入は、エボラＧＰ（Ｚ）に対する抗体力価に影響を及ぼさず、その防御効力を低減することもなかった。ＮＰ、ならびにエボラ糖タンパク質の３つのサブタイプ（ザイール、象牙海岸およびスーダンＧＰ（Ｚ、ＩＣ、Ｓ）＋ＮＰ）を含むワクチン構成成分のさらなる拡大は、単一プラスミドワクチンに匹敵する前攻撃誘発免疫応答を生じた。さらに、エボラザイール型ウイルスによる感染からの完全防御が、多価ワクチンを投与されたモルモットにおいて達成された（表Ｉ、被験体１３〜１６）。既往抗体はウイルス攻撃誘発によっては誘導されなかったが、これはワクチンそれ自体が、ウイルスを効率的に除去するのに十分な免疫応答を提供したことを示す。これらの知見により、齧歯類モデルにおける多価プラスミド免疫感作は、糖タンパク質（ＧＰ）特異的抗体産生およびその防御的効力を実質的に低減しないことが示された。
【００８４】
【表４】
【００８５】
エボラウイルス感染の齧歯類モデルにおける防御は抗体力価と関連付けられ、効率的な体液性応答はヒト疾患に置ける臨床結果に影響を及ぼし得るため（Baize, S. et al. 1999 Nat Med 5: 423-426; Maruyama, T. et al. 1999 J Virol 73: 6024-6030）、霊長類において試験されたワクチンに対する強力な体液性応答を誘発することが重要であると本発明者らは考えたが、細胞媒介性免疫は同等に誘導され、防御に寄与すると思われる（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42）。近年、ＤＮＡ初回免疫とその後のウイルスベクターの投与というレジメンは、ＤＮＡ単独を用いたワクチンと比較して、免疫応答を増強することが実証された（Sedegah, M. et al. 1998 PNAS USA 95: 7648-7653; Hanke, T. et
al. 1998 Vaccine 16: 439-445; Robinson, H.L. et al. 1999 Nat Med 5: 526-534; Schneider, J. et al. 1998 Nat Med 4: 397-402）。組換え複製欠陥アデノウイルスは高力価になり、抗原提示細胞に感染し、強力な免疫応答を誘導し得る（Davis, A.R. et al. 1985 PNAS USA 82: 7560-7564; Natuk, R.J. et al. 1992 PNAS USA 89: 7777-7781; Xiang, Z.Q. et al. 1996 Virology 219: 220-227）。アデノウイルスはマウスにおける追加免疫作用を示した（Xiang, Z.Q. et al. 1999 J Immunol 162: 6716-6723）が、ＤＮＡおよびアデノウイルスの組合せは、感染性攻撃誘発モデルにおける効力に関して試験されておらず、霊長類におけるこの手法の成功は未だ報告されていない。したがって、本発明者らは、高レベルＧＰ発現を指示する組換えアデノウイルスベクターＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ）を開発し、修飾初期免疫−追加免疫戦略が、裸ＤＮＡ単独を用いて得られたエボラウイルスに対する抗体応答を増大するか否かを試験するために、このベクターを用いた。マウスにＤＮＡおよびアデノウイルスベクターを、単独でまたは組合せて注射し、細胞媒介性応答および体液性免疫応答を評価した。ＤＮＡ免疫感作単独の場合と比較して、ＤＮＡおよびその後のアデノウイルス追加免疫を注射したマウスにおいて、抗体力価が１０倍〜１００倍増加することが見出された（図４７）。同様に細胞傷害性Ｔ細胞応答の増大がこの組合せを用いて観察された。ＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ）単独による免疫感作は、ＤＮＡ初回免疫、アデノウイルス追加免疫感作した場合と、抗体力価が有意に異ならなかった。これらのデータは、マウスにおけるエボラＧＰ ＤＮＡワクチンの免疫原性が組換えアデノウイルスによる追加免疫によって改良されたこと、及びこの戦略が非ヒト霊長類における免疫応答を増大するための有用なアプローチを提示し得ることを示唆する。
【００８６】
齧歯類モデルはワクチン戦略の開発において有用であったが、一方、ヒトから直接単離されたエボラウイルスは先ず、マウスまたはモルモットにおいて致死性感染するために、齧歯類における逐次的な多継代により適合されなければならない（Connolly, B.M. et al. 1999 J Infect Dis 179: S203-S217; Bray, M. et al. 1998 J Infect Dis 178: 651-661）。エボラ感染の霊長類モデルは、ヒト疾患および免疫防御に関してより強力な予測値を有すると考えられる。したがって、二方式性ＤＮＡ／ＡＤＶワクチンならびにモルモットにおける防御と相関した多プラスミド戦略を用いて、非ヒト霊長類における試験を本発明者らは実施した。カニクイマカクザル（Macaca fascicularis）に、４週間間隔で裸ＤＮＡベクターを３回注射し（図４８Ａ）、数ヶ月の安静（免疫応答を追加免疫することができると示されることが知られている（Letvin, N.L. et al. 1997 PNAS USA 94: 9378-9383））後、ザイール糖タンパク質のみを発現する組換えアデノウイルスで追加免疫した（図４８Ａ）。対照動物には空ベクター（プラスミドＤＮＡおよびＡＤＶ−ΔＥ１組換えアデノウイルス）を投与し、予防接種動物にはＮＰおよびエボラＧＰの３つのサブタイプを含有する多構成成分ＤＮＡワクチン（ｐＧＰ／ＮＰ）とその後のＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ）を投与した。予測した通り、抗エボラ血清抗体は対照動物では検出されなかったが、エボラワクチン投与動物では、抗原特異的抗体応答が、１２週目、すなわち３回目のＤＮＡ注射の１ヵ月後に検出された（図４８Ｂ）。組換えアデノウイルスにより追加免疫した後、抗体力価は、ＤＮＡ単独で観察されたレベルの１０〜２０倍に増大した。最終免疫感作の３ヵ月後に、抗体レベルは依然として高かったが、但し、一動物（被験体８）に関しては、わずかに力価が下がった（５×１０4から１．３×１０4）。
【００８７】
次にエボラ抗原に対する霊長類細胞性応答を、ｉｎ ｖｉｔｒｏリンパ球増殖アッセイを用いて検査した。対照サルでは、3Ｈ−チミジン取り込みにより測定された抗原特異的リンパ球増殖は、適正化非刺激細胞と等価であり、各動物に関して約１．０の増殖指数を生じた（４８Ｃ）。これに対比して、多価ワクチンで免疫を受けた動物からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、９〜２０倍の刺激増大を示したが、このことは、細胞レベルでのエボラ抗原に対する活発な免疫応答を実証する。ＣＤ４−陽性リンパ球の枯渇は、ワクチン接種サルからのＰＢＭＣの抗原刺激性増殖性応答を、対照動物で観察されたレベルにまで低減させた（図４８Ｄ）。しかしながらＣＤ８−陽性リンパ球の枯渇は、エボラ抗原特異的リンパ球増殖に影響を及ぼさなかった。したがって、高抗体力価に必要とされるＴ細胞助力（help）を提供するリンパ球のＣＤ４−陽性サブセットは、ワクチン誘導性細胞免疫応答に寄与している。
【００８８】
この予防接種レジメンの防御効力を確定するために、エボラウイルスのザイールサブタイプからの致死用量の野生型マインガ株を用いてサルを攻撃誘発した。対照サルでは、血液化学知見から肝臓酵素の増大が示された（図４９Ａ、図４９Ｂ）が、このような増大はエボラウイルス感染に特徴的である（Fisher-Hoch, S.P. et al. 1985 J Infect Dis 152: 887-894）。このような増大はワクチン接種被験体においては観察されなかった。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇は、対照動物の全てにおけるウイルス血症の劇的増大と関連した（図４９Ｃ）。これに対比して、予防接種サルにおいては、ウイルス負荷の実質的増大は観察されなかった。疾患進行の動態は、対照動物の間では同様で、疾患発生率はこの群においては１００％であった。５日目〜６日目に３匹は死亡し、最後のサルは、瀕死状態で、７日目に安楽死させられた。これに対比して、ＤＮＡ−アデノウイルスワクチンの組み合わせで免疫を受けたサル４匹のうち４匹が、エボラウイルスによる致死性攻撃誘発を生き残り、４匹の被験体中３匹において滅菌免疫が達成された。残りの動物は、ウイルス抗原のわずかな一過性増大を示した。しかしながら長期間の後、予防接種動物はすべて、感染の徴候または症状を示さず、ウイルス抗原のＥＬＩＳＡ検出（図４９Ａ）および培養ウイルスの終点滴定分析により測定した場合、感染後６ヶ月以上、検出可能なウイルス血症は認められなかった。１０日目に一過性の低レベルのウイルス血症を示したワクチンレシピエント（被験体８）は、１７日までに検出不可能レベルになった。
【００８９】
エボラウイルスの天然レザバー（reservoir）は未知であるので、将来的大発生を防止するための従来の公衆衛生対策の可能性は制限され、したがってヒトにおけるワクチンおよび治療薬の開発の緊急性が増大する。霊長類は、エボラウイルス感染の致死作用に対して免疫感作され、そして滅菌免疫が異種初回免疫−追加免疫戦略を用いて達成され得ることを本発明の知見は実証する。多様な地理的単離物からのエボラウイルス構造タンパク質を発現する多構成成分遺伝子ワクチンは、強力な抗原特異的免疫応答を発生し、ヒト感染における最高死亡数に関連するこのウイルスのサブタイプであるエボラ・ザイールの致死用量を用いた攻撃誘発後に免疫感作霊長類を生存させた。この試験の結果は、Ｔ細胞媒介性および体液性免疫が、齧歯類における従来の試験と同様に、非ヒト霊長類におけるウイルスクリアランス（clearance）に寄与することを示唆する（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42; Wilson, J. et al. 2000 Science 287: 1664-1666）。２つの免疫パラメーターである抗体力価（１：７５，０００対＜１：１００、Ｐ＝０．００１）および細胞性増殖応答（約１２倍対１．４倍、Ｐ＝０．００１４）は、免疫防御との非常に有意な相関関係を示した。ヒトにおけるエボラウイルス感染からの免疫防御との相関関係を調べる試験は、ウイルスの攻撃性ならびに必然的に高レベルの生物安全性束縛（biosafety containment）により妨げられる。ここに提示された霊長類免疫のモデルを用いて、エボラウイルス感染からの免疫防御のメカニズムを明らかにし、免疫ベースの抗ウイルス療法を進展させ、そしてこの病原体に対する、さらには出血熱のその他の感染性原因に対するヒトワクチンを開発することが、目下考えられている。
【００９０】
エボラ、マールブルグおよびラッサ構築物の説明
ＶＲＣ６０００
ＶＲＣ６０００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ））。ザイールサブタイプのエボラ糖タンパク質を発現する主鎖ｐＶＲ１０１２（＃４５０）。配向は、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩである。
ＶＲＣ６００１
ＶＲＣ６００１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＧＰ（Ｚ））。その他の説明なし。これは６０００と同一であるが、ｐＶＲ１０１２主鎖へのＳｆｉ制限部位の付加を伴う。
ＶＲＣ６００２
ＶＲＣ６００２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＭＵＣ）。ＧＰ（Ｚ）のムチン様ドメインが欠失された。主鎖ｐＶＲ１０１２ＧＰ（Ｚ）中の５３０ｂｐがＥａｒＩ（２８４４）からＢｆａＩ（３３７４）まで欠失された。この突然変異体は、エボラ受容体と結合し得る。
ＶＲＣ６００３
ＶＲＣ６００３（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＭＵＣデルタＦＵＲ）。ＧＰ（Ｚ）のムチン様ドメインおよびフリン切断部位が欠失された。主鎖ｐＶＲ１０１２ＧＰ（Ｚ）中の５９３ｂｐがＥａｒＩ（２８４４）からＥａｒＩ（３４３７）まで欠失された。本タンパク質は、ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＭＵＣと同様の特性を有する。
ＶＲＣ６００４
ＶＲＣ６００４（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２）。ＧＰ（Ｚ）中のＧＰ２領域の大多数が欠失された。主鎖ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）からの４３０ｂｐがＢｃｌＩ（３４１４）からＢｓｐＥＩ（３８４４）まで欠失された。ＴＭ（膜貫通）領域が保持された。
ＶＲＣ６００５
ＶＲＣ６００５（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＣ末端Ａ）。これは、ＧＰ２のＣ末端欠失である。２６７ｂｐがｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）主鎖のＭｓｃＩ（３６２３）からＢｓｐＭＩ（３８９０）まで欠失された。
ＶＲＣ６００６
ＶＲＣ６００６（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＣ末端Ｂ）。これは、ＧＰ２のＣ末端のより小さな欠失である。主鎖ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）の１１０ｂｐがＢｓｔＸＩ（３７８０）からＢｓｐＭＩ（３８９０）まで欠失された。
ＶＲＣ６００７
ＶＲＣ６００７（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＦＵＳ）。ＧＰ（Ｚ）のＧＰ２中の融合ペプチドが、ＰＣＲを用いて、この突然変異で欠失された。主鎖ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）からの４７ｂｐが、３５０８から３５５５まで欠失された。
ＶＲＣ６００８
ＶＲＣ６００８（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＴＭ）。この突然変異体においては、ＧＰ（Ｚ）のＴＭ領域がトランケートされた。停止コドン（ＴＧＡ）がＢｓｐＭＩ部位（３８８９）の下流に付加された。このタンパク質は分泌され、三量体を形成しない。
ＶＲＣ６０５２
ＶＲＣ６０５２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタｓＧＰ）。ＳＧＰ／ＧＰ相同領域の大多数が欠失された。主鎖ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）からの６８７ｂｐが、ＨｉｎｃＩＩ（２０８３）からＨｉｎｃＩＩ（２２７０）まで欠失された。
ＶＲＣ６１０１
ＶＲＣ６１０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（Ｒ）（ｄＴＭ））。本ベクターは、その膜貫通および細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（レストンサブタイプ）を発現する。ＰＣＲを用いて、停止コドンがＧＰ（Ｒ）のａ．ａ．６５０の下流に生成され、その後にＸｂａＩ部位が続いた。このタンパク質は分泌されることができ、ＧＰ
（Ｒ）（ｄＴＭ）と称される。
ＶＲＣ６１１０
ＶＲＣ６１１０（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｒ）（ｄＴＭ））。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（レストンサブタイプ）を発現するアデノウイルスシャトルベクター。ＰＣＲを用いることで、停止コドンがＧＰ（レストン）のａ．ａ．６５１の下流に生成され、その後にＸｂａＩ部位が続いた。結果として得られる組換えアデノウイルスは、ＧＰ（Ｒ）（ｄＴＭ）と呼ばれる６５１ａ．ａ．分泌糖タンパク質を発現する。
ＶＲＣ６２００
ＶＲＣ６２００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｓ））。スーダンサブタイプのエボラ糖タンパク質を発現する主鎖ｐＶＲ１０１２（＃４５０）。配向は、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩである。
ＶＲＣ６２０１
ＶＲＣ６２０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（Ｓ））。１０１２主鎖へのＳｆｉ部位の付加を伴う以外は６２００と同一であり、その他の説明はない。
ＶＲＣ６２０２
ＶＲＣ６２０２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｓ）デルタＴＭ）。この突然変異体においては、ＧＰ（Ｓ）のＴＭ領域がトランケートされた。停止コドン（ＴＧＡ）がＢｓｐＭＩ部位（ｘｘｘ）の下流に付加された。このタンパク質は分泌され、三量体を形成しない。
ＶＲＣ６３００
ＶＲＣ６３００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（ＩＣ））。象牙海岸サブタイプのエボラ糖タンパク質を発現する主鎖ｐＶＲ１０１２（＃４５０）。配向は、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩである。
ＶＲＣ６３０１
ＶＲＣ６３０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＧＰ（ＩＣ））。１０１２主鎖へのＳｆｉ部位の付加を伴う以外は６３００と同一であるが、その他の説明はない。
ＶＲＣ６３０２
ＶＲＣ６３０２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（ＩＣ）デルタＴＭ）。この突然変異体においては、ＧＰ（ＩＣ）のＴＭ領域がトランケートされた。停止コドン（ＴＧＡ）がＢｓｐＭＩ部位の下流に付加された。このタンパク質は分泌され、三量体を形成しない。
ＶＲＣ６３０３
ＶＲＣ６３０３（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（ＩＣ）（ｄＴＭ））。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（象牙海岸サブタイプ）を発現するｐＶＲ２０００ベースのベクター。ＰＣＲを用いることで、停止コドンがＧＰ（Ｒ）のａ．ａ．６５０の下流に生成され、その後にＢｇｌＩＩ部位が続いた。本ベクターは、６５０ａ．ａ．分泌糖タンパク質（ａ．ａ．１〜ａ．ａ．６５０）を発現する。
ＶＲＣ６３１０
ＶＲＣ６３１０（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（ＩＣ）（ｄＴＭ））。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（サブタイプ象牙海岸）を発現するアデノウイルスシャトルベクター。ＰＣＲを用いることで、停止コドンがＧＰ（ＩＣ）のａ．ａ．６５１の下流に生成された。結果として得られる組換えアデノウイルスは、ＧＰ（ＩＣ）（ｄＴＭ）と呼ばれる６５１ａ．ａ．分泌糖タンパク質を発現する。
ＶＲＣ６３５１
ＶＲＣ６３５１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ｓＧＰ（ＩＣ））。その他の説明なし。
ＶＲＣ６４００
ＶＲＣ６４００（ｐＶＲ１０１２−ＮＰ）。象牙海岸サブタイプのエボラ核タンパク質を発現する主鎖ｐＶＲ１０１２（＃４５０）。
ＶＲＣ６４０１
ＶＲＣ６４０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＮＰ）。１０１２主鎖へのＳｆｉ部位の付加を伴う以外は６４００と同一であり、その他の説明はない。
ＶＲＣ６５００
ＶＲＣ６５００（ｐＶＲ１０１２−ＶＰ３５）。主鎖はｐＶＲ１０１２（＃４５０）である。挿入物は、ｐＧＥＭ ３Ｚｆ（＋）ＶＰ３５（＃１２１３）からクローン化されたエボラからのＶＰ３５である。
ＶＲＣ６６００
ＶＲＣ６６００（ｐＡＤ／ＣＭＶ−ＧＰ（ｄＴＭ）（Ｚ−ＣＩＴＥ−Ｓ））。その他の説明なし。
ＶＲＣ６６０１
ＶＲＣ６６０１（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｓ））。その他の説明なし。
ＶＲＣ６６０２
ＶＲＣ６６０２（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｓ）（ｄＴＭ））。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（スーダンサブタイプ）を発現するアデノウイルスシャトルベクター。停止コドンがＧＰ（Ｓ）のａ．ａ．６５０の下流に融合された。結果として得られる組換えアデノウイルスは、ＧＰ（Ｓ）（ｄＴＭ）と呼ばれる６５４ａ．ａ．分泌糖タンパク質を発現する。
ＶＲＣ６６０３
ＶＲＣ６６０３（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｚ））。その他の説明なし。
ＶＲＣ６６０４
ＶＲＣ６６０４（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｚ）（ｄＴＭ））。その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにエボラ糖タンパク質（サブタイプザイール）を発現するアデノウイルスシャトルベクター。停止コドンがＧＰ（Ｚ）のａ．ａ．６５１の下流に融合された。結果として得られる組換えアデノウイルスは、ＧＰ（Ｚ）（ｄＴＭ）と呼ばれる６５５ａ．ａ．分泌糖タンパク質を発現する。
ＶＲＣ６７０１
ＶＲＣ６７０１（ｐＶＲ１０１２−マールブルグ）。マールブルグ糖タンパク質（ＧＰ）オープンリーディングフレーム、Ｍｕｓｏｋｅ株。マールブルグをＶＲＣ６７００（Ｘｂａ／ＰｖｕＩＩ）からの主鎖＃４５０（Ｂａｍ（ｂｌｕｎｔ）／ＸｂａＩ）中にクローン化した。
ＶＲＣ６７０２
ＶＲＣ６７０２（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓマールブルグＧＰ（ｄＴＭ））。本ベクターは、その膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにマールブルグウイルス糖タンパク質を発現する。ＰＣＲを用いることで、停止コドンがＧＰ（マールブルグ）のａ．ａ．６５０の下流に生成され、その後にＢｇｌＩＩ部位が続いた。このタンパク質は分泌され、ＧＰ（マールブルグ）（ｄＴＭ）と呼ばれる。
ＶＲＣ６７１０
ＶＲＣ６７１０（ｐＡｄＡｐｔマールブルグＧＰ（ｄＴＭ））。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを伴わずにマールブルグウイルス糖タンパク質を発現するアデノウイルスシャトルベクター（ｐＶＲＣ１２９０）。ＰＣＲを用いることで、ターミネーターコドンがａ．ａ．６５０の下流に生成され、その後にＢｇｌＩＩ部位が続いた。結果として得られる組換えアデノウイルスは６５０ａ．ａ．分泌タンパク質（ａ．ａ．１〜ａ．ａ．６５０）を発現する。
ＶＲＣ６８００
ＶＲＣ６８００（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓラッサＧＰ）。その他の説明なし。
ＶＲＣ６８０１
ＶＲＣ６８０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓラッサＧＰ（ｄＴＭ））。その他の説明なし。
ＶＲＣ６８１０
ＶＲＣ６８１０（ｐＡｄＡｐｔラッサＧＰ）。その他の説明なし。
ＶＲＣ６８１１
ＶＲＣ６８１１（ｐＡｄＡｐｔラッサＧＰ（ｄＴＭ））。その他の説明なし。
【実施例１】
【００９１】
ベクター構築。
エボラ・ザイール糖タンパク質（ＧＰ）、分泌ＧＰ（ＳＧＰ）および核タンパク質（ＮＰ）を発現するＤＮＡベクターの構築は、Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42に記載されている。ＧＰスーダンおよび象牙海岸発現ベクターを同様に構築した。要するに、以下のプライマー：５’ＡＴＣ ＴＴＣ ＡＧＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＣＣＡ ＴＧＧ Ａ３’（スーダンＧＰ遺伝子；ＮｃｏＩ＞ＡＴＧ；配列番号４４）、５’ＧＡＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＴＧ ＣＡＧ３’（スーダンＧＰ遺伝子；Ｃ末端ＧＰ停止；配列番号４５）、５’ＣＴＡ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＡ３’（象牙海岸ＧＰ遺伝子；ＮｃｏＩ＞ＡＴＧ；配列番号４６）、５’ＡＡＡ ＧＴＡ ＴＧＡ ＴＧＣ ＴＡＴ ＡＴＴ ＡＧＴ ＴＣＡ３’（象牙海岸ＧＰ遺伝子；Ｃ末端ＧＰ停止；配列番号４７）を用いて、感染細胞ＲＮＡの、ＲＮＡの逆転写後のポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）産物から、ＧＰオープンリーディングフレームを生成し、ＴＡクローンＰＣＲ２．１スーダンおよびＰＣＲ２．１象牙海岸を得た。ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、スーダン糖タンパク質をプラスミドＰＣ２．１から消化し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）処理して、ｐ１０１２のＸｂａＩ部位にクローン化した（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42）。ＥｃｏＲＩを用いて、象牙海岸ＧＰをプラスミドＰＣ２．１から消化し、クレノウ処理して、ｐ１０１２のＸｂａＩ部位にクローン化した（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42）。
【００９２】
ＡＤＶ−ＧＰを作製するために、ＧＰ（Ｚ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＧＥＭ−３Ｚｆ（−）−ＧＰから消化して、クレノウ処理し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ／Ｋｌｅ／ＣＩＰ処理ｐＲｃ／ＣＭＶプラスミド中に挿入した。その結果生じたプラスミド（ＰＲＣ／ＣＭＶ−ＧＰ（Ｚ））をＮｒｕＩ／ＤｒａＩＩＩで消化し、クレノウ処理した。ＣＭＶエンハンサー、ＧＰ（Ｚ）ＤＮＡおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含有するＮｒｕＩ／ＤｒａＩＩＩ／Ｋｌｅ断片を、アデノウイルスシャトルプラスミドｐＡｄＢｇＩＩＩのＢｇｌＩＩ部位に挿入した（Ohno, T. et al. 1994 Science 265: 781-784）。第一世代ｄｌ３０９ベースＡｄ５ベクターであるアデノウイルスは、Ｅ１に欠失を含み、ベクターを複製欠陥体およびＥ３における部分欠失／置換体にさせたが、これは、それぞれ１４．７ｋＤ、１４．５ｋＤおよび１０．４ｋＤの相対分子量を有するＥ３タンパク質に関するコード配列を崩壊する。ザイールＧＰを発現する組換えアデノウイルスＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ）を、以前に報告された方法（Aoki, K. et al. 1999 Mol Med 5: 224-231）にしたがって作製した。投与されるアデノウイルスの用量、１０10プラーク形成単位（ＰＦＵ）／動物（約３×１０9ＰＦＵ／ｋｇ）は、ヒト遺伝子療法試験において安全に用いられる範囲内である。
【００９３】
動物試験および安全性。
Covance (Princeton, NJ)から入手した３歳、体重２〜３ｋｇの８匹のカニクイマカクザル（cynomolgus macaques）（Macaca fascicularis）を、免疫感作および攻撃誘発実験のために用いた。血液検体を得るため、そしてワクチンを投与するために、ケタマインでサルを麻酔した。「実験室動物の管理および使用のための指針（Guide for the Care and
Use of Laboratory Animals (DHEW No. NIH 86-23）」に従って、動物を１匹ずつ収容し、定期的エンリッチメントを施した。エボラウイルス攻撃誘発直前から実験終了まで、動物を最大閉じ込め実験室（ＢＳＬ−４）中に保持し、給餌し、毎日検査した。瀕死状態と思われた一動物を安楽死させ、その後、病理検査のために剖検した。さらに、単一無症候性予防接種動物を、病理学的およびウイルス学的分析のために安楽死させた。
【００９４】
マウス免疫感作。
エボラザイールＧＰまたはＮＰを発現するＤＮＡおよびアデノウイルスベクターを、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびプロモーターの制御下で、遺伝子発現を用いて、前記と同様に構築した（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42; Ohno, T. et al. 1994 Science 265: 781-784）。０、１４および２８日目に、１００μｇのＤＮＡ（ｐＧＰまたはｐ１０１２プラスミド対照）または１０8ＰＦＵのアデノウイルス（ＡＤＶ−ＧＰまたはＡＤＶ−ΔＥ１対照ウイルス）を用いて、マウスを筋肉内免疫感作し、２８日目に血液を採取した。４２日目に、ＤＮＡまたはアデノウイルスを用いてマウスに筋肉内追加免疫を施して、力価を５６日目に再び測定した。精製ビリオン由来のエボラウイルス抗原の調製物を被覆し、膜関連タンパク質（ＧＰ、ＶＰ４０およびＶＰ２４）を濃化した９６ウエルプレートを用いて、ＥＬＩＳＡ ＩｇＧ力価を確定した（Ksiazek, T.G. et al. 1992 J Clin Microbiol 30: 947-950）。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体およびＡＢＴＳ／ペルオキシド（基質／指示薬）を用いて、特異的抗原結合を検出した。
【００９５】
マカク（Macaque）ザル免疫感作。
ＤＮＡ免疫感作のために、ＧＰ（ザイール）［ＧＰ（Ｚ）］、ＧＰ（象牙海岸）［ｐＧＰ（ＩＣ）］、ＧＰ（スーダン）［ｐＧＰ（Ｓ）］、ならびに混合物［ｐＧＰ／ＮＰ］として投与されるＮＰ（ザイール）［ＧＰ（Ｚ）］を発現するそれぞれのＤＮＡ（１ｍｇ）を、あるいは空［ｐＧＰ（Ｚ）］対照プラスミド４ｍｇを、動物の三角筋に両側投与した（２ｍｇ／一側）。０および４週目の免疫感作はＩＭ注射により、８週目はＢｉｏｊｅｃｔｏｒにより行った。アデノウイルス追加免疫のために、動物に１０10ＰＦＵのＡＤＶ−ＧＰ（ザイールサブタイプ）またはＡＤＶ−ΔＥ１（空ベクター）を、２用量に分けて三角筋に両側投与した。３２週目に、ハンクス緩衝化塩溶液１ｍｌ中の約６ＰＦＵのエボラウイルス（ザイール１９７６年単離物；マインガ株）を全動物に腹腔内注射した（Kiley,
M.P. et al. 1980 J Gen Virol 49: 333-341）。ウイルスを患者血液から直接単離し、ベロ細胞中での１回継代後に用いた。
【００９６】
対照（プラスミド：ＡＤＶ−ΔＥ１）および免疫感作（ｐＧＰ／ＮＰ：ＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ））サルに関して、上記と同様にＥＬＩＳＡ ＩｇＧ力価を確定した。各被験体に関する希釈の相互終点は、１２週目および２４週目であった。記載どおりに（Ksiazek, T.G. et al. 1992 J Clin Microbiol 30: 947-950）、ＥＬＩＳＡにより血清抗体レベルを測定した。
【００９７】
４、８および２０週目、並びに２４週目の免疫感作の１〜３日前に、対照（プラスミド：ＡＤＶ−ΔＥ１）または免疫感作（ｐＧＰ／ＮＰ：ＡＤＶ−ＧＰ（Ｚ））動物から血液を採取した。血液をパーコール勾配上で分離して、富リンパ球集団を得た。記載どおりに（Xu, L. et al. 1998 Nat Med 4: 37-42）エボラ分泌糖タンパク質（ＳＧＰ）または空プラスミドでトランスフェクトされた細胞からの上清を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで５日間、リンパ球を刺激し、3Ｈ−チミジン取り込みにより増殖を測定した。増殖指数は、ＳＧＰを投与したウエル中の増殖を、対照上清を投与したウエル中の増殖で割ることによって算定された。
【００９８】
マカクザルにおけるウイルス検出。
サル血漿の連続希釈液からＶＰ４０タンパク質を捕捉することにより、記載どおりに（Ksiazek, T.G. et al. 1992 J Clin Microbiol 30: 947-950）、循環エボラウイルス抗原の存在を検出した。抗ＶＰ４０ｍＡｂを被覆した９６ウエルプレートを用いて、抗原を捕捉し、検出はウサギ抗エボラウイルス血清を用いた。
【実施例２】
【００９９】
エボラＧＰ（ザイール）およびＮＰ（ザイール）のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：
ＧＰ（ザイール）、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ８７６６６；ＮＰ（ザイール）、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００２５４９から入手し、一方、ＧＰ（スーダン／Ｇｕｌｕ）は、ＣＤＣから入手した。次に、哺乳類の好ましいコドンを用いて、アミノ酸配列をＤＮＡ配列に逆翻訳した。２５ｂｐ重複を有する連続７５ｂｐオリゴ体を調製して、全遺伝子を網羅した。次にＰＣＲを用いて、好ましいコドンを含有する無傷哺乳類遺伝子中にオリゴ体をアセンブルした。設計において、ＧＰ（ザイール）（ａ．ａ．６４８〜６７６）およびＧＰ（スーダン／Ｇｕｌｕ）（ａ．ａ．６４８〜６７６）の予測膜貫通ドメインの前に、この領域がこれらの合成的作製遺伝子から排除されるよう、停止コドンを導入した。欠失も、両構築物中の４ａ．ａ．細胞質領域の損失をもたらした。エボラＧＰ（ザイール）配列の最終シーケンシングは、実験室ＧＰ配列からの１０の多岐アミノ酸を明示した。これを本発明者らの動物試験に用い、部位特異的突然変異誘発により、これらを補正した。ＸｂａＩ／ＳａｌＩにより、ｐ１０１２ｘ／ｓ中にこれらの挿入物をクローン化した。
【０１００】
ＣＭＶ／Ｒ−ＧＰ（Ｓ／Ｇ）（ΔＴＭ）／ｈの構築
エボラＧＰ（スーダン／Ｇｕｌｕ）遺伝子から欠失されたコドン修飾膜貫通ドメインを、ＳａｌＩ／ＫｐｎＩを用いてｐ１０１２（ｘ／ｓ）−ＧＰ（Ｓ／Ｇ）（ΔＴＭ）／ｈから切り出し、ＳａｌＩ／ＫｐｎＩ消化ＣＭＶ／Ｒ／ＭＣＳプラスミド中に挿入した。
【０１０１】
ＣＭＶ／Ｒ ＧＰ（Ｚ）（ΔＴＭ）／ｈの構築
エボラＧＰ（ザイール）遺伝子から欠失されたコドン修飾膜貫通ドメインを、ｐ１０１２ｘ／ｓ−ＧＰ（Ｚ）（ｄＴＭ）／ｈ ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ部位から切り出し、ＣＭＶ／ＲプラスミドのＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ部位にクローン化した。
【０１０２】
ＣＭＶ／ＲエボラＮＰの構築
ザイールサブタイプのエボラ核タンパク質を発現するＶＲＣ６４００（ｐＶＲ１０１２−ＮＰ）からのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ断片を切り出し、ＣＭＶ／ＲプラスミドのＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ部位にクローン化した。
【実施例３】
【０１０３】
改良型非ウイルス哺乳類発現ベクター
本発明は、現在使用されているベクターよりも高レベルのタンパク質発現を発生させる改良型哺乳類発現ベクターを提供する。
【０１０４】
最初に、各々異なるエンハンサーを含有する３つの新規のベクターを開発し、試験した。ＲＳＶエンハンサー、マウスユビキチンエンハンサー（ｍＵＢＢ）およびＣＭＶエンハンサー（Xu et al. 1998 Nat Med 4: 37-42）を各々、ＨＴＬＶ−１Ｒ領域と組合せて（Takebe et al. 1988 Mol Cell Biol 8: 466-472）、別個のベクターを作製した。これら３つのベクターを、ＣＭＶ翻訳エンハンサーおよびイントロンと組合せたＣＭＶエンハンサーを含有する主鎖（ＣＭＶｉｎｔ）（これは現時点で最も有効なベクターである）と比較した場合、ＣＭＶ／Ｒを含有するベクターを用いた発現は、ＣＭＶ／ｉｎｔと比較して５〜１０倍増大されることをｉｎ ｖｉｔｒｏデータは示し、そして免疫学的試験は、ＣＭＶｉｎｔと比較して有意に高いＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答の誘導を示した。この新規のベクターを用いた場合、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方の応答が顕著に高くなった。他の２つのベクターはいずれも、同程度の結果を生じなかった。
【０１０５】
本発現ベクターは、それが特異的エンハンサー／プロモーターと組合せて特異的翻訳エンハンサーを用いることにより、ＤＮＡワクチンに関する高レベルの発現および免疫原性強化を付与するという点で独特である。ヒトにおけるこれらのワクチンの効力が充分でなく、遺伝子的改良により、この技術をヒトに使用可能にするための重要なプラットホームとして役立ち得るため、これは特に重要である。発現ベクターカセットは、他の遺伝子ベ
ースのワクチンにも同様に、または真核生物発現ベクターからの組換えタンパク質の生産のためにも用いられ得る。本発明は、広範な種々の疾患（例えばＨＩＶおよびその他のウイルス疾患および癌）のための遺伝子ワクチンの製造および遺伝子療法に有用である。
【０１０６】
図５０ 修飾ＣＭＶ発現ベクター、ＣＭＶ／Ｒの発現増強
リン酸カルシウムを用いて、０．５ｕｇの対応するプラスミドを有する６ウエル組織培養皿中で、
（Ａ）ベクター単独（レーン１）、ＣＭＶｉｎｔ−ｇｐ−１４５（ｄＣＦＩ）（レーン２）、ＣＭＶ／Ｒ−ｇｐ１４５（ｄＣＦＩ）（レーン３）、または
（Ｂ）ｍＵＢＢ−ｇｐ１４５（ｄＣＦＩ）（レーン４）、ｍＵＢＢ／Ｒ−ｇｐ１４５（ｄＣＦＩ）（レーン５）
を用いて、マウス線維芽細胞３Ｔ３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を収穫し、溶解緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、ミニ完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche））中で溶解した。各試料の総タンパク質１０μｇを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて４〜１５％勾配ゲル上で分離し、その後、タンパク質を移して、ウエスタンブロット分析した。ヒトＨＩＶ−ＩｇＧ（１：５０００）を一次抗体として用いて、ＨＲＰ−接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００）を二次抗体として用いた。ＥＣＬウエスタンブロット現像系を用いて、膜を現像した。矢印は、ＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１４５（ΔＣＦＩ）ポリタンパク質に関する特異的帯域を示す。
【０１０７】
図５１ マウスにおける修飾ＣＭＶ発現ベクター、ＣＭＶ／Ｒの免疫原性増強
各群のマウス５匹を、０、２および６週目に、５０μｇの指定プラスミドＤＮＡで免疫感作した。最後の注射後１０日目に、各マウスから脾臓細胞を収穫し、対照ペプチドのプール（１５ｍｅｒ）またはＨＩＶ Ｅｎｖペプチドのプール（１５ｍｅｒ）を用いて６時間刺激した。ＰＥ−抗マウスＣＤ３、ＰｅｒＣＰ−抗マウスＣＤ４、ＡＰＣ−抗マウスＣＤ８、ＦＩＴＣ−抗マウスＩＦＮ−γおよびＦＩＴＣ−抗マウスＴＮＦ−αを含有する抗体のカクテルを用いて、刺激脾臓細胞を染色した。フローサイトメトリーにより試料を分析した。ＣＤ３／ＣＤ４／ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−αおよびＣＤ３／ＣＤ８／ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α陽性細胞数を、ＦｌｏＪｏソフトウエア（Treestar）を用いて測定した。
【０１０８】
ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、Ｒ領域（ＨＴＶＬ−１）、ＣＭＶ ＩＥスプライシング受容体配列
【０１０９】
【表５】
【０１１０】
１〜７４１：ＣＭＶエンハンサー／プロモーター
７４２〜９７２：ＨＴＬＶ−１ Ｒ領域
９７３〜１０９５：ＣＭＶ／ＩＥスプライシング受容体
【０１１１】
本発明を明確にし、理解させるために、多少詳細に説明してきたが、本発明の真の範囲を逸脱しない限り、形態および詳細における種々の変更が成され得ると当業者は理解するであろう。図面、表および添付物、ならびに上記で言及した特許、出願および出版物は全て、参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ＶＲＣ６０００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２】ＶＲＣ６００１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＧＰ（Ｚ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３】ＶＲＣ６００２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＭＵＣ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４】ＶＲＣ６００３（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＭＵＣデルタＦＵＲ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図５】ＶＲＣ６００４（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図６】ＶＲＣ６００５（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＣ末端Ａ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図７】ＶＲＣ６００６（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＣ末端Ｂ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図８】ＶＲＣ６００７（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＧＰ２デルタＦＵＳ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図９】ＶＲＣ６００８（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＴＭ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１０】ＶＲＣ６０５２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｚ）デルタＳＧＰ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１１】ＶＲＣ６１０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（Ｒ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１２】ＶＲＣ６１１０（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｒ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１３】ＶＲＣ６２００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｓ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１４】ＶＲＣ６２０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（Ｓ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１５】ＶＲＣ６２０２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（Ｓ）デルタＴＭ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１６】ＶＲＣ６３００（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（ＩＣ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１７】ＶＲＣ６３０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＧＰ（ＩＣ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１８】ＶＲＣ６３０２（ｐＶＲ１０１２−ＧＰ（ＩＣ）デルタＴＭ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図１９】ＶＲＣ６３０３（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓエボラＧＰ（ＩＣ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２０】ＶＲＣ６３１０（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（ＩＣ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２１】ＶＲＣ６３５１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＳＧＰ（ＩＣ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２２】ＶＲＣ６４００（ｐＶＲ１０１２−ＮＰ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２３】ＶＲＣ６４０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓ−ＮＰ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２４】ＶＲＣ６５００（ｐＶＲ１０１２−ＶＰ３５）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２５】ＶＲＣ６６００（ｐＡＤ／ＣＭＶ−ＧＰ（ｄＴＭ）（Ｚ−ＣＩＴＥ−Ｓ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２６】ＶＲＣ６６０１（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｓ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２７】ＶＲＣ６６０２（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｓ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２８】ＶＲＣ６６０３（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｚ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図２９】ＶＲＣ６６０４（ｐＡｄＡｐｔエボラＧＰ（Ｚ）（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３０】ＶＲＣ６７０１（ｐＶＲ１０１２−マールブルグ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３１】ＶＲＣ６７０２（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓマールブルグＧＰ（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３２】ＶＲＣ６７１０（ｐＡｄＡｐｔマールブルグＧＰ（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３３】ＶＲＣ６８００（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓラッサＧＰ）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３４】ＶＲＣ６８０１（ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓラッサＧＰ（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３５】ＶＲＣ６８１０（ｐＡｄＡｐｔラッサＧＰ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３６】ＶＲＣ６８１１（ｐＡｄＡｐｔラッサＧＰ（ｄＴＭ））構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３７】ＣＭＶ／ＲエボラＧＰ（Ｚ）デルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３８】ｐＶＲ１０１２エボラＧＰ（Ｚ，Ｐ８７６６６）デルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図３９】ＣＭＶ／ＲエボラＧＰ（Ｓ／Ｇｕｌｕ）デルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４０】ＣＭＶ／ＲエボラＧＰ（Ｓ，Ｑ６６７９８）デルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４１】ＶＲＣ６８０２、ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓラッサデルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４２】ＶＲＣ６７０３、ｐＶＲ１０１２ｘ／ｓマールブルグデルタＴＭ／ｈ（最適化されたコドン）構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４３】ＣＭＶ／ＲエボラＮＰ構築物地図を示す（表２のエボラ／マールブルグ／ラッサプラスミドおよび組換えアデノウイルス参照）。
【図４４】重要な構造的特徴を示すエボラウイルス（１９７６年に単離されたザイール種）の、分泌糖タンパク質（ＳＧＰ）分子および糖タンパク質（ＧＰ）分子の概略図である。ＳＧＰおよびＧＰの白色Ｎ末端領域は同一（共有）配列に対応するが、一方、黒色Ｃ末端は、ＧＰまたはＳＧＰ分子に独特の配列を同定する。ＳＧＰおよびＧＰの両方に関する共通シグナラーゼ切断部位、ならびにＧＰ０（ＧＰの非切断形態）（↓）に関するフリン切断部位は、Ｎ末端シーケンシングにより確定された。システイン残基（Ｓ）、予測Ｎ連結グリコシル化部位（Ｙ形突出部）、予測融合ペプチド、七価基反復配列および膜貫通アンカー配列も示されている。エボラウイルスでは、これらの構造の位置は保存され、それらの配列は非常に類似しており、あるいはＮ連結グリコシル化部位の場合には、ＧＰの中央領域で少なくとも濃縮される。シグナラーゼ切断部位は配列番号４８であり、フリン切断部位は配列番号４９であり、融合ペプチドは配列番号５０である。
【図４５】構造ＧＰの概略図である。非確定ジスルフィド結合（クエスチョンマークで示されている）により連結されたＧＰ１−ＧＰ２へテロ二量体の予測配向が示される。示されている分子内ジスルフィド結合は、レトロウイルスの糖タンパク質構造との類似性に基づいた従来の予測から得られる。アミノ酸配列のその他の特徴に関しては、図４４を参照されたい。
【図４６】エボラウイルスの糖タンパク質による細胞変性作用の誘導および細胞変性の分子決定因子のマッピングを示す。
【図４７】異なるＤＮＡ／アデノウイルス初期免疫−追加免疫の組合せにより生成されるエボラ特異的抗体応答を示す。データは、マウスの各群に関する相互終点希釈の平均および標準偏差を表すエラーバーグラフである。
【図４８】カニクイマカクザルのＤＮＡ−アデノウイルス免疫感作を示す。 Ａ）ＤＮＡおよび／またはアデノウイルス注射、ならびにエボラウイルスのザイールサブタイプの野生型マインガ（Mayinga）株を用いた攻撃誘発に関する免疫感作スケジュール。 Ｂ）血清中のエボラ特異的抗体のＥＬＩＳＡ力価。血清を、１２週目（中白棒）および２４週での免疫感作の２日前（中黒棒）に採取した。 Ｃ）免疫感作後のエボラ分泌糖タンパク質（ＳＧＰ）に対するリンパ増殖性応答。バーは、各被験体に関する４つの血液試料全ての平均増殖倍数度（fold-proliferation）を示す。誘導のベースラインレベルが実験間で変化したため、標準偏差は示されていない。しかしながら、８匹の動物全てからのＰＢＭＣを各時点に関して同一実験内でアッセイし、図に示される平均は任意の単一時点に関して得られた結果の代表である。 Ｄ）リンパ球サブセットの枯渇後のバルクＰＢＭＣ中のエボラＳＧＰに対するリンパ増殖性応答。２４週目のＰＢＭＣを、指示抗体で被覆されたＤｙｎａｌ磁気ビーズで処理して、ＣＤ４+またはＣＤ８+細胞サブセットを枯渇させた。枯渇後に残存する細胞を、細胞数入力のために正規化し、実施例に記載したように刺激した。結果を、２つの対照（被験体２および３）サルおよび２つの予防接種（被験体６および７）サルに関して示す。
【図４９】ＤＮＡ−アデノウイルス免疫感作後のエボラウイルスによる致死的攻撃誘発に対するカニクイマカクザルの防御を示す。 Ａ、Ｂ）エボラウイルスによる攻撃誘発後のサルにおける肝臓酵素レベル。ピッコロ（Piccolo）（登録商標）分析器（Abaxis, Inc., Sunnyvale, CA）用の一般化学１２試薬ディスクを用いた標準推奨手法により、非ヒト霊長類血清中の肝臓酵素（アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ））レベルを測定した。４つの免疫感作（中黒記号）および４つの対照（中白記号）サルに関する結果を示す。 Ｃ）エボラウイルス感染後のサルにおける血漿ウイルス血症。十字印は対照動物における死亡時を表す（５日目（被験体１）および６日目（被験体２および４））。一の対照動物（被験体３）は、７日目に瀕死状態になったので、安楽死させられた。感染に対して耐性であった一の予防接種動物（被験体５）を、組織の組織学的実験のために１０日目に安楽死させた。１７日まで、検出可能なウイルス血症を有した動物はなく、観察期間中（６ヶ月）、無ウイルス血症であった。データは、各サルに関する血清の相互終点希釈である。４つの免疫感作（中黒記号）サルおよび４つの対照（中白記号）サルに関する結果を示す。
【図５０】修飾ＣＭＶ発現ベクター、ＣＭＶ／Ｒの発現増強を示す。
【図５１】マウスにおける修飾ＣＭＶ発現ベクター、ＣＭＶ／Ｒの免疫原性増強を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５２の塩基配列、又は該塩基配列と少なくとも９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する塩基配列であって発現を指示する塩基配列を含む、発現ベクター。
【請求項２】
前記同一性が少なくとも９５％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記同一性が少なくとも９６％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記同一性が少なくとも９７％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記同一性が少なくとも９８％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記同一性が少なくとも９９％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記同一性が１００％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１】
配列番号５２の塩基配列、又は該塩基配列と少なくとも９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する塩基配列であって発現を指示する塩基配列を含む、発現ベクター。
【請求項２】
前記同一性が少なくとも９５％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記同一性が少なくとも９６％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記同一性が少なくとも９７％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記同一性が少なくとも９８％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記同一性が少なくとも９９％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記同一性が１００％である、請求項１に記載の発現ベクター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【公開番号】特開２００６−８１５４９（Ｐ２００６−８１５４９Ａ）
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２８０１３１（Ｐ２００５−２８０１３１）
【出願日】平成１７年９月２７日（２００５．９．２７）
【分割の表示】特願２００３−５３１９６８（Ｐ２００３−５３１９６８）の分割
【原出願日】平成１４年９月２４日（２００２．９．２４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
【出願人】（３００００８９８８）アメリカ合衆国 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２７日（２００５．９．２７）
【分割の表示】特願２００３−５３１９６８（Ｐ２００３−５３１９６８）の分割
【原出願日】平成１４年９月２４日（２００２．９．２４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
【出願人】（３００００８９８８）アメリカ合衆国 (4)
【Ｆターム（参考）】
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