非アルコール性脂肪性肝炎に有効な経口摂取用組成物
【課題】ＮＡＳＨの予防及び／又は治療に有用な経口摂取用組成物及びその製造方法を提供する。
【解決手段】ヒドロキシルラジカル消去活性が８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであることを特徴とする官能的に優れた品質を有する未成熟パパイア果実発酵物を非アルコール性脂肪性肝炎の予防・治療用経口摂取用組成物として利用する。該組成物を少なくとも１重量以上含む経口摂取用組成物は有効な効果を奏する。
【解決手段】ヒドロキシルラジカル消去活性が８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであることを特徴とする官能的に優れた品質を有する未成熟パパイア果実発酵物を非アルコール性脂肪性肝炎の予防・治療用経口摂取用組成物として利用する。該組成物を少なくとも１重量以上含む経口摂取用組成物は有効な効果を奏する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は,非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ, 以降「ＮＡＳＨ」と呼称する）の予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪肝に炎症が加わり,それが持続すると肝硬変まで進行することがある。この病態は非飲酒歴者においてもアルコール性脂肪性肝炎に類似した病状を示すことから,ＮＡＳＨの診断名を与えられ,高血圧,糖尿病,高脂血症と並び新しい生活習慣病として近年俄に注目されているところである。
【０００３】
食生活の欧米化すなわち高脂肪含量の食生活や運動不足による肥満人口の増加と生活習慣病患者の増加に伴い,脂肪肝患者，ＮＡＳＨ患者も増加することが想定される。ゆえに,新たに開発されるＮＡＳＨ治療薬や重症化抑制薬及び／又はＮＡＳＨ発症リスク低減機能食品や重症化リスク低減機能食品の開発及び／又はＮＡＳＨ治療方法や重症化予防法の確立が望まれる。
【０００４】
ヒトにおけるＮＡＳＨは血液生化学的特徴及び／又は病理組織学的特徴により診断できる。未知の機能性素材評価のためのＮＡＳＨ病態モデル実験動物の作出は,例えばラットを用いた時,該実験動物の血中酸素分圧を低水準に維持することにより達成できる。
【０００５】
ＮＡＳＨ病態モデル実験動物と酸化ストレスの関連解明の詳細は下記非特許文献１に準拠している。即ち,上記ＮＡＳＨ病態モデル実験動物としてラットを用いた時,該実験動物肝臓ミトコンドリアにおけるヒドロキシルラジカル産生は亢進している。このことは,例えば,肝臓ミトコンドリアにおけるヒドロキシルラジカル消去活性を亢進することによるＮＡＳＨの予防,改善・治療への可能性を示唆している。
【０００６】
一般に,活性酸素種（ＲＯＳ）と疾病との関係は広く認知されており,ガン,白内障,神経疾患,腎疾患の他,アレルギー,糖尿病などのいわゆる生活習慣病にも係っている。ＲＯＳが関係するこれらの疾病に対しては抗酸化物質の有効性が認められている。
【０００７】
また,ヒトＮＡＳＨ病態に即した該病態モデル実験動物としてラットを用いた時,肝臓ミトコンドリアからの活性酸素ラジカル産生の亢進が認められることから,ＮＡＳＨと酸化ストレスの関係が強く示唆されている（非特許文献１参照）。
【０００８】
一方,パパイア（学名：Ｃａｒｉｃａ Ｐａｐａｙａ Ｌｉｎｎ）はトロピカルフルーツとして食用に供されるだけでなく,パパインとして知られるタンパク質加水分解酵素を含むことから,食品,化粧品,及び医薬品への配合成分として様々な分野で広く利用されてきた。
【０００９】
その保健機能性は該製品のＲＯＳ消去活性,特に,ヒドロキシルラジカル消去活性に基づく可能性が示唆されている（非特許文献２参照）。
【００１０】
未成熟パパイア果実発酵物製品は一般に抗酸化作用を有し,各種疾病に有効であることが知られている。例えば,てんかん,健忘症,アルツハイマー病などの疾病への有効性,皮膚,大腸粘膜の免疫性を高め,アレルギー性炎症を抑制する可能性が示唆されている（非特許文献３参照）。
【００１１】
また,パパイアの発酵処理加工物の食品（特許文献１〜４）及び洗剤・クリーニング分野（特許文献５）での利用が考えられるようになり,一部実用化されている。
【００１２】
しかしながら,高い保健機能性を有する未成熟パパイア果実発酵物が機能性発揮に必要とするラジカル消去活性のレベルは知られておらず,また,活性酸素種の関係する生活習慣病に対する該発酵物の具体的な用途は確立されていない現状である。
【００１３】
かかる背景下,高いヒドロキシルラジカル消去活性を有する未成熟パパイア果実発酵物の生活習慣病への利用方法の確立,特に,ＮＡＳＨへの利用方法確立が期待されていた。
【００１４】
【特許文献１】特開２００１−１２０２２４号公報
【００１５】
【特許文献２】特開２００３−０２４００９号公報
【００１６】
【特許文献３】特開２００４−２６７０２６号公報
【００１７】
【特許文献４】特開２００６−０７５０８６号公報
【００１８】
【特許文献５】特開２００１−１５２１８８号公報
【００１９】
【非特許文献１】ＴＡＫＡＹＡＭＡ Ｆ． ｅｔ ａｌ: Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉ．,１００（１），ｐｐ．１６４（２００６）．
【００２０】
【非特許文献２】ＩＭＡＯ Ｋ．ｅｔ ａｌ: ＫＩＳＯ ＴＯ ＲＩＮＳＨＯ,３１（８），ｐｐ．２８３３−２８３９（１９９７）．
【００２１】
【非特許文献３】ＩＭＡＯ Ｋ．ｅｔ ａｌ: Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，４５（１），ｐｐ．１１−２３（１９９８）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は,上記事情に鑑みてなされたもので,その目的はＮＡＳＨの予防及び／又は治療に有用な経口摂取用組成物及びその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を重ね,〔１〕高いヒドロキシルラジカル消去活性を有する未成熟パパイア果実発酵物及びその製造技術の確立,〔２〕未成熟パパイア果実発酵物を含むパパイア加工食品の開発,〔３〕未成熟パパイア果実発酵物のヒドロキシルラジカル消去活性とＮＡＳＨの関連解明,に基づき本発明に至った。
【００２４】
第１に,本発明はＮＡＳＨの予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物であって,未成熟パパイア果実発酵物からなる経口摂取用組成物を提供することを特徴とする。
【００２５】
第２に,本発明はＮＡＳＨの予防及び／又は治療のため,未成熟パパイア果実発酵物を少なくとも１．０重量％含有する経口摂取用組成物を提供することを特徴とする。
【００２６】
第３に,前記未成熟パパイア果実発酵物は,ヒドロキシルラジカル消去活性が８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであるとともに,官能的に優れた品質を有することを特徴とする。
【００２７】
また,本発明において,ヒドロキシルラジカル消去活性は以下の様に定義される。
【００２８】
未成熟パパイア果実発酵物のヒドロキシルラジカル消去能の評価は電子スピン共鳴分光（ＥＳＲ）−スピントラッピング法にて実施する。ＥＳＲ装置はＸ−Ｂａｎｄ ＥＳＲ装置（日本電子株式会社製ＲＸ型）にデジタル高速掃引ユニット（ラジカルリサーチ社）を組み込み改良したラジカル検出装置にＥＳＲ装置用ＷＩＮ−ＲＡＤシステムＲＤＡ−０３Ｗ ＥＳＲデータアナライザー（ラジカルリサーチ社）を接続したシステムから構成される。スピントラップ剤として,５，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ（ＤＭＰＯ,ラボテック社）又は２−（５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−２λ５−［１，３，２］ｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｉｎａｎ−２−ｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ １−ｏｘｉｄｅ （ＣＹＰＭＰＯ,ラジカルリサーチ社）を用いる。
【００２９】
ＥＳＲ測定条件は,掃引磁場領域;ＤＭＰＯの場合,３３６．５±５ｍＴ（ＣＹＰＭＰＯの場合,３３１．５±１０ｍＴ）,磁場変調Ｆｉｅｌｄ Ｍｏｄ ; ０．０７９,Ｔｉｍｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ; ０．１０秒,掃引時間; ＤＭＰＯの場合,１分（ＣＹＰＭＰＯの場合,４分）,出力;８．０ｍＷで行い,結果はＤＭＰＯ又はＣＹＰＭＰＯによりトラップされたスピンアダクトの相対強度として示される。
【００３０】
本発明においては,ヒドロキシルラジカル消去活性は試料（未成熟パパイア果実発酵物）を含まない対照ＥＳＲ測定時の信号相対強度を５０％減弱させる未成熟パパイア果実発酵物製品の濃度をＩＣ５０値（μｇ／ｍｌ,最終濃度）として定義してある。
【００３１】
または,上記ヒドロキシルラジカル消去活性に相当する,即ち,同一のラジカル消去活性を発揮するＴｒｏｌｏｘ（（±）−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２，５，７，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ,アルドリッチ社）の濃度を求め,未成熟パパイア果実発酵物製品のＩＣ５０値（μｇ／ｍｌ，最終濃度）に相当する単位（μｍｏｌ Ｔｒｏｌｏｘ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ）として示してある。換言すると,Ｔｒｏｌｏｘをヒドロキシルラジカル消去活性評価のための標品として用い,試料（未成熟パパイア果実発酵物）のヒドロキシルラジカル消去活性に相当するＴｒｏｌｏｘの化学当量を求めることにより評価を行う。
【００３２】
このことにより,ＥＳＲ機種の違い,手法の違い,試薬類純度の違いなどによるデータのバラツキを最小限に留め,データに客観性,定量性を与えることが可能となる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば,ＮＡＳＨの予防及び／又は治療に未成熟パパイア果実発酵物からなる経口摂取用組成物を用いることにより,ＮＡＳＨの予防及び／又は治療に有用な経口摂取組成物の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明の経口摂取組成物に使用する未成熟パパイア果実発酵物の製造方法は,野生の未成熟パパイアのスライス品とブドウ糖とを混合してなる第１の混合物を静置し,次いでこの第１の混合物を濾過することにより第１の濾液と第１の残渣に分画し,この第１の残渣にブドウ糖を混合し第２の混合物とした後静置し,この第２の混合物を濾過することにより第２の濾液を取得するとともに,第１の濾液と第２の濾液とを混合してなる第３の混合液を製造し,次いでこの第３の混合液中のブドウ糖濃度を４０乃至６０％に調製することにより製造される第１の中間原料に対し,乳酸菌とアミラーゼと味噌用酵素とを混合した後発酵せしめて発酵物を製造する工程と,この発酵物にブドウ糖を添加した後乾燥させ,その後粉砕してなる第２の中間原料を製造する工程と,この第２の中間原料を,６ヶ月以上静置熟成させる工程とからなる。
【００３５】
また,本発明に基づく製品はヒドロキシルラジカル消去活性が８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであるとともに官能的に優れた品質を有する未成熟パパイア果実発酵物を使用することを特徴とする。
【００３６】
ここで,「野生の未成熟パパイア」とは,原種に近い野生種のパパイアであって,かつ未だ熟していない外皮が青色のパパイア果実を意味し,店舗,スーパーなどで目にする品種改良されたパパイアとは異なり,大きさは人の拳ほどであり,種がぎっしりと詰まっているものである。
【００３７】
野生の未成熟パパイア果実は白色の種子を有する特徴を有しており,黒色の種子を有する成熟パパイア果実とは異なるものである。
【００３８】
また,一般に,栽培された未成熟パパイア果実よりも野生の未成熟パパイア果実の方がヒドロキシルラジカル消去活性が高く,かつ,保健機能性が高いため,本発明においては野生の未成熟パパイア果実を用いることを特徴としている。
【００３９】
即ち,野性の未成熟パパイアを採取し,へたの部分と底部の花落ちをカットし,皮付きのまま種ごと輪切りにした後,容器内にてつぶして練り上げる（マッシュする）。このものにブドウ糖を添加し,４乃至１０日間熟成させ,該熟成物を濾過し,第1の濾液と第1の残渣を得る。
【００４０】
第１の残渣とブドウ糖の混合物を静置後,濾過により第２の濾液を取得し,第１の濾液と第２の濾液の混合物にブドウ糖を添加し,該混合液中の最終的なブドウ糖濃度を４０乃至６０重量％に調製し,この物を未成熟パパイア果実発酵物の中間原料とする。
【００４１】
上記中間原料に乳酸菌,味噌用酵素及びアミラーゼを添加し,混合し,発酵せしめ,該発酵物にブドウ糖を添加した後乾燥させ,該乾燥物を粉砕して粉末状となし,６ヶ月以上静置熟成させることにより,製品であるヒドロキシルラジカル消去活性が８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであることを特徴とする官能的に優れた品質を有する粉末状の未成熟パパイア果実発酵物を得ることが出来る。本製品は官能評価的に優れた品質を有し,保健機能性素材として有用な生理活性を保持している。
【００４２】
本発明においては原料として野生の未成熟パパイア果実を用いることが重要である。仮に,パパイアの成熟果実を原料として用いた時は,製造工程中に品質劣化を生じやすく,また,最終的に得られた発酵物の品質は官能評価的に未成熟パパイア果実を用いた時よりも劣り,更に,保健機能性素材として期待される生理活性を充分には保持していない。
【００４３】
本発明において用いる乳酸菌には特に制限はないが,ストレプトコッカス属,ペディオコッカス属,ラクトバチルス属などが好ましく,ストレプトコッカス属の乳酸菌が特に好ましい。このものは,例えば,食品グレードの市販品として入手可能な原料である。
【００４４】
本発明において用いるアミラーゼはデンプンの加水分解酵素の総称であり,食品製造に利用可能な品質条件を有している限り,特には制限はない。このものは,例えば,食品グレードの市販品として入手して利用可能な原料であり,該酵素の特性,活性単位等の品質と,目的とする製品の品質条件,製造条件に応じて,使用方法を適宜調整できる。
【００４５】
本発明において,味噌用酵素とは,酒,味噌,醤油などの製造に用いられるコウジカビ属コウジカビ,アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の菌体,分泌物などを意味する。上述の「中間原料に対し,乳酸菌とアミラーゼと味噌用酵素とを混合した後発酵せしめて発酵物を製造する工程」において,該味噌用酵素を適量,添加混合することが出来る。このものは,例えば,食品グレードの市販品として入手可能な原料であり,該酵素の特性,活性単位等の品質と,目的とする製品の品質条件,製造条件に応じて,使用方法を適宜調整できる。
【００４６】
本発明において用いる乳酸菌,アミラーゼ,味噌用酵素の使用量に,特に制限はないが,それぞれの品質,コスト上の要求に応じて都度適量を定めることが出来る。また,目的とする製品の品質によって,これらの原料の使用量,使用方法は調整可能である。
【００４７】
上記条件下における有効摂取量,摂取方法,摂取期間に係らず,本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物は食品なので,本発明においては摂取量,摂取方法,摂取期間には特段の上限及び下限,又はその他の条件などは設定していない。従って,大量に短期間摂取する場合,少量に長期間摂取する場合,他の保健機能性素材と共に摂取する場合など各種のケースが想定されるが,このこと自体によっては本発明は制限されない。
【００４８】
本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物は乳白色粉末状であるが,摂取を容易とするため造粒による顆粒化,粉砕による微粉末化,打錠による錠剤化など剤形の変更,また,着色料,フレーバー添加など別途に任意の混合物を添加することは妨げられない。
【００４９】
本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物はそのままでも摂取可能であるが,他の食品と混合して摂取することが出来る。該未成熟パパイア果実発酵物の他の食品への添加量は,食品に対して１．０重量％以上,望ましくは３．０重量％以上,更に望ましくは５．０重量％以上の時,官能評価上,食品として好ましい状態となり,ＮＡＳＨに対する実質的な予防改善効果を発揮することが出来る。食品への添加量には上限はなく,１００重量％未成熟パパイア果実発酵物を含む食品を用いても差し支えない。混合する食品は粉末状,液状,ペースト状など様々な状態が可能であるが,本発明においてはこれらの状態の制限は受けない。
【００５０】
従って,未成熟パパイア果実発酵物製品の他の食品への混合量,摂取方法はコスト,官能評価を含む品質的要件,ＮＡＳＨの予防及び／又は治療のために要求される機能,例えば,病態の種類,程度,摂取開始時期,摂取予定期間,併用素材その他の内容によって異なるため,一律には制限されない。
【００５１】
未成熟パパイア果実発酵物のラジカル消去活性に基づくＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療用組成物として利用するに当たり,ヒドロキシルラジカル消去能はＥＳＲで測定した時,８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇとすることにより有効に目的を達成できる。
【００５２】
なお,未成熟パパイア果実発酵物のラジカル消去活性に基づくＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療用組成物として利用するに当たり,ヒドロキシルラジカル消去能の大きさは,ＥＳＲで測定した時,ＩＣ５０値としてＴｒｏｌｏｘを超えない範囲であることが望ましい。これはＴｒｏｌｏｘ以上のヒドロキシルラジカル消去能を有する食品を無制限に摂取した場合の生体への影響を予測できないことによる。本発明においては,ヒドロキシルラジカル消去能の上限は天然物として安全性が担保されている緑茶抽出物粉末と同等レベルに設計されている。
【００５３】
以上説明したように,本発明においては高いラジカル消去能を有する未成熟パパイア果実発酵物を使用し,経口摂取用組成物として用いることによりＮＡＳＨの有効な予防方法及び／又は治療方法を提供する。
【００５４】
以下,実施例によって本発明をさらに説明する。但し,下記の実施例は発明を例示するためのものであり,本発明をいかなる意味においても限定するものではない。
【００５５】
＜実施例１＞
１）未成熟パパイア果実発酵物中間原料の製造例
野生の未成熟パパイア果実１００Ｋｇを採取し,異物除去のため水洗後,ヘタ部分及び果実の底部を除き,スライス品８５Ｋｇを得た。
【００５６】
スライス品にブドウ糖２０Ｋｇを添加し,良く混和し,４日間静置熟成させ,該混合物を濾過し,果汁液である濾液１と残渣１を得た。
【００５７】
残渣６０Ｋｇに対し,ブドウ糖１０Ｋｇを添加し,混和し,４日間静置熟成させ,該混合物を濾過し,果汁液である濾液２を得た。
【００５８】
濾液１と濾液２を混合し,ブドウ糖２Ｋｇを添加し,良く混和し,目的とする中間原料を４０Ｋｇ得た。
【００５９】
２）未成熟パパイア果実発酵物最終製品の製造例
上記１）で製造された中間原料２０Ｋｇに味噌用酵素０．５Ｋｇを添加し,良く混和し,４０℃にて４８時間発酵せしめた後,ブドウ糖６０Ｋｇを添加し,良く混和した後,１８℃,１ヶ月間乾燥させ,粉砕し,組成物１を得た。
【００６０】
上記１）で製造された中間原料１５Ｋｇに乳酸菌５Ｋｇ及び味噌用酵素０．１Ｋｇを添加し,良く混和し,４０℃にて４８時間発酵せしめた後,ブドウ糖３０Ｋｇを添加し,良く混和した後,１８℃,１ヶ月間乾燥させ,粉砕し,組成物２を得た。
【００６１】
上記２）で製造された中間原料５Ｋｇにアミラーゼ０．１Ｋｇを添加し,良く混和し,４０℃にて４８時間発酵せしめた後,ブドウ糖１０Ｋｇを添加し,良く混和した後,１８℃,１ヶ月間乾燥させ,粉砕し,組成物３を得た。
【００６２】
組成物１,２,３を合わせて混合均質化し,ガスバリヤー製の高いアルミ包材内で６ヶ月以上熟成し,最終製品１００Ｋｇを得た。
【００６３】
本品は水分含量５重量％以下の流動性の高い乳白色粉末で,官能的に優れた味質を有していた。本品のヒドロキシルラジカル消去活性は下記実施例２に記載してある通りである。
【００６４】
＜実施例２＞未成熟パパイア果実発酵物製品及びＴｒｏｌｏｘのヒドロキシルラジカル消去活性の測定
上記のようにして製造された未成熟パパイア果実発酵物によるフリーラジカルおよび活性酸素種消去能は,電子スピン共鳴分光（ＥＳＲ）−スピントラッピング法にて評価した。ＥＳＲ装置はＸ−Ｂａｎｄ ＥＳＲ装置（日本電子株式会社製ＲＸ型）にデジタル高速掃引ユニット（ラジカルリサーチ社）を組込み高感度高速化の改良を施したフリーラジカル検出装置にＥＳＲ装置用ＷＩＮ−ＲＡＤシステムＲＤＡ−０３Ｗ ＥＳＲデータアナライザ（ラジカルリサーチ社）を接続したシステムにて構成されている。スピントラップ剤として,ＣＹＰＭＰＯを用いた。
【００６５】
ＥＳＲ分析に際して,ＥＳＲ装置は,掃引磁場領域: ＤＭＰＯの場合,３３６．５±５ｍＴ（ＣＹＰＭＰＯの場合,３３１．５±１０ｍＴ）,磁場変調Ｆｉｅｌｄ Ｍｏｄ:０．０７９ｍＴ,Ｔｉｍｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ: ０．１０秒,掃引時間: ＤＭＰＯの場合,１分（ＣＹＰＭＰＯの場合,４分）,出力:８．０ｍＷに設定し,測定試料中の活性酸素・フリーラジカル種をＤＭＰＯ又はＣＹＰＭＰＯにより捕捉し形成するスピンアダクトに固有のＥＳＲスペクトルをＥＳＲ分析で検出した。測定試料における活性酸素・フリーラジカル種の量はスピンアダクトによるＥＳＲスペクトルの信号強度により計測できる。遷移金属のマンガン（Ｍｎ）はＥＳＲスペクトルを生じることを利用し,この信号を基準信号とし,活性酸素・フリーラジカル種とＤＭＰＯ又はＣＹＰＭＰＯとのスピンアダクトによるＥＳＲスペクトルのＭｎのＥＳＲスペクトルに対する信号強度の比,すなわちＭｎ信号に対する相対強度で定量的な精度を向上させた。以下に,更に具体的に示す。
【００６６】
ＥＳＲ測定試料溶液は,充分に窒素置換された２００ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中に１００μＭ硫酸第一鉄,１００μＭ ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＤＥＴＡＰＡＣ），５ｍＭ ＣＹＰＭＰＯ,各濃度の試料（未成熟パパイア果実発酵物製品）又は Ｔｒｏｌｏｘ,１００μＭ過酸化水素から成る。予め過酸化水素以外を混和し,最後に過酸化水素を添加し,過酸化水素と鉄イオンとのフェントン反応でヒドロキシルラジカルを発生させる。過酸化水素添加１分後に掃引を開始することで反応時間を一定にし,ヒドロキシルラジカルを一定量発生させ,試料混液中のＣＹＰＭＰＯにより捕捉し,形成するＣＹＰＭＰＯ−ヒドロキシルラジカルのスピンアダクト（ＣＹＰＭＰＯ−ＯＨ）のＥＳＲスペクトルは全８本の信号ピークを持つ。
【００６７】
低磁場から４番目のＥＳＲ信号ピークと,Ｍｎによる６本のＥＳＲ信号中,低磁場側から２番目のＭｎ信号ピークを比較し,ＣＹＰＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号相対強度によりのＥＳＲ試料中のヒドロキシルラジカル量を定量化した。被験素材又はＴｒｏｌｏｘを添加せず実施した対照ＥＳＲ測定で観察されたＣＹＰＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度を１００％とした。試料（未成熟パパイア果実発酵物製品）をＥＳＲ測定溶液に添加し,ＣＹＰＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化（減弱）で,試料（未成熟パパイア果実発酵物製品）のヒドロキシルラジカルに対する消去活性を検討した。その結果,対照ＥＳＲ測定時の相対信号強度を５０％減弱させる未成熟パパイア果実発酵物製品の濃度をＩＣ５０値 （μｇ／ｍｌ）として求めたところ,７０４μｇ／ｍｌ（ＥＳＲ測定試料中濃度）であった。
【００６８】
同様にして,上記のヒドロキシルラジカル消去活性に相当するＴｒｏｌｏｘの相当当量を測定したところ,０．６μｍｏｌ Ｔｒｏｌｏｘ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであった。すなわち,保健機能性を発揮するに足る充分な活性が確認された。
【００６９】
＜実施例３＞未成熟パパイア果実発酵物含有の経口摂取用組成物の製造例
上記２）で得られた製品を０．１重量％,１．０重量％,１０．０重量％添加したクッキー及びオレンジジュースを試作し,１０名の官能評価者により試食,試飲を行った。
【００７０】
その結果,製品１．０重量％,１０．０重量％添加したクッキー及びオレンジジュースに関しては全員が食品又は飲料として摂取可能と評価し,本製品が官能評価的に優れた品質を有することが確認された。しかし,０．１重量％添加品は官能評価的に品質が劣っていると評価された。また,保健機能性を向上させるため,製品そのものの絶対的摂取量を上げる必要性に対し,０．１重量％添加品の利用は現実的ではないと評価された。
【００７１】
＜比較例１＞パパイアの成熟果実を原料として用いた場合の製品品質
成熟したパパイア果実を原料として,上記１）及び上記２）と同様の工程で製造したところ,工程中で雑菌の混入が認められ,最終製品は異味異臭を呈し,官能的に食品として利用することの出来ない品質となった。
【００７２】
＜比較例２＞パパイアの成熟果実を原料として用いた場合の製品品質
成熟したパパイア果実を熱処理（１００℃,１時間）により殺菌処理したものを原料とし,上記１）及び上記２）と同様の工程で製造したところ,上記２）と同様の官能的性質を有する製品が得られた。
【００７３】
本品のヒドロキシルラジカル消去活性は実施例２で得られた未成熟パパイア果実発酵物から得られた製品と比較すると,２分の１以下であり,要求品質を満足させることは出来なかった。
【００７４】
以上,本発明の実施例と比較例１及び２とを比較した結果,未成熟パパイア果実を出発原料として用いることの必然性及び優位性が示された。
【００７５】
＜実施例４＞未成熟パパイア果実発酵物の肝臓ミトコンドリアからのフリーラジカル産生抑制効果
未成熟パパイア果実発酵物によるＮＡＳＨ病態モデル動物の肝臓ミトコンドリアのエネルギー代謝からの活性酸素・フリーラジカルの派生増大に対する是正効果をみるため,下記試験を実施した。
【００７６】
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットを,正常対照群（未処理）,ＮＡＳＨ病態群２群に分けた。ＮＡＳＨ病態モデルは高山らの方法（非特許文献１参照）に準拠して作成した。
【００７７】
各群のラットから,肝臓ミトコンドリアを分画（非特許文献４参照）し,下記測定系（非特許文献５参照）にて各群ミトコンドリアから派生する活性酸素・フリーラジカル種をスピントラップ剤ＤＭＰＯで捕捉し,形成するＤＭＰＯスピンアダクトをＥＳＲ−分光法にて検出した。各群のミトコンドリア画分は０．０３Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４,０．２５Ｍシュクロース,０．１Ｍ塩化カリウムを含む）で縣濁後,直ちに冷凍保存（−８０℃）したものをＥＳＲ分析に供した。
【００７８】
【非特許文献４】Ｅｇａｓｈｉｒａ Ｔ. ｅｔ ａｌ:Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ, １１７, １１５−１１９（２０００）.
【００７９】
【非特許文献５】Ｙｕｄｏｎｇ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ:Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ, ３６（１１）,１４３４−１４４３（２００４）.
【００８０】
未成熟パパイア果実発酵物をミトコンドリアＥＳＲ測定試料に添加し,ＤＭＰＯ−活性酸素・フリーラジカルのアダクトによるＥＳＲスペクトルの信号強度の減弱効果により,ミトコンドリア機能障害による活性酸素・フリーラジカル（ＲＯＳ）派生増大に対する改善効果を検討した（非特許文献６参照）。
【００８１】
【非特許文献６】Ｔａｋａｙａｍａ Ｆ. ｅｔ ａｌ:Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ, ８５, ２２７−２３３（２００１）.
【００８２】
ＤＭＰＯ,ミトコンドリア及びＮＡＤＨは氷冷,これら以外は予め３７℃に温めておいたものを用いた。アッセイ系は,５ｍＭトリスアミノメタン, ０．２５ｍＭシュクロース, ０．１ｍＭ塩化カリウムを含む緩衝液中（ｐＨ７．４）に,３５μｌミトコンドリア懸濁液（０．５ｍｇタンパクを含む）,９２０ｍＭ ＤＭＰＯ,０．１％ドデシルマルトシド, １０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸カリウム, １０ｍＭ Ｌ（−）-リンゴ酸ナトリウム, ２００ｍＭ コハク酸二ナトリウム, １００μＭ ＮＡＤＨから構成されるよう,試料および試薬溶液を調製し,３７℃, ５分間インキュベーション後,ＥＳＲ分析を行った。
【００８３】
その結果,検出されたＤＭＰＯとヒドロキシルラジカルとのアダクト（ＤＭＰＯ−ＯＨ）に特徴的なｇ値と微細定数を持つＥＳＲスペクトル（ＤＭＰＯ−ＯＨ）の信号強度でミトコンドリアから派生する活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）を計測した。未成熟パパイア果実発酵物をＮＡＳＨ病態ミトコンドリアによるアッセイ系に添加し,ＤＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化で,ＮＡＳＨ病態エネルギー代謝から派生する活性酸素・フリーラジカル種の発生増大への制御能を検討した。その結果,相対信号強度を５０％減弱させる抽出物の濃度をＩＣ５０値（μｇ／ｍｌ）として示してある。
【００８４】
すなわち,正常対象群（未処理）を１．０とした時,ＮＡＳＨ病態群は２．６,ＮＡＳＨ病態群に未成熟パパイア果実発酵物を添加した群は１．２となった。これにより,未成熟パパイア果実発酵物はＮＡＳＨ病態モデル動物の肝臓ミトコンドリアにおけるエネルギー代謝からのラジカル派生を抑制・制御することが実証された。従って,未成熟パパイア果実発酵物は,経口的に摂取することによりＮＡＳＨの予防及び／又は改善・治療に有効であることが示唆された。本結果は,抗酸化作用を有する未成熟パパイア果実発酵物の如き食品成分が,一般に酸化ストレスに起因するとされるＮＡＳＨを含む生活習慣病に有効である、とする理解に根拠を与えるものである。
【００８５】
＜実施例５＞未成熟パパイア果実発酵物のＮＡＳＨへの効果
実験的に調整された脂肪肝担持ラットに対し,酸化ストレス（ＯＳ）を負荷し,生体内低酸素状態を形成させることによりＮＡＳＨの生化学的・病理組織学的特徴を有する病態モデルラットを作出し,このものに対し本発明に使用する実施例１で製造された未成熟パパイア果実発酵物を投与し,該ラットの血液の生化学的特徴変化,肝臓ミトコンドリアにおけるＲＯＳ派生の変化,肝臓組織の病理組織学的変化を観察することにより,ＮＡＳＨに対する本発明に使用する実施例１で製造された未成熟パパイア果実発酵物の有効性評価を行った。
【００８６】
実験動物として,６週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（１８０−２００ｇ／匹）を用いた。脂肪肝作成のため,４週間,自由摂取にてコリン欠乏高脂肪食（ＣＤＨＦ,オリエンタル酵母）を与えた。その後も,病態維持のため実験終了までＣＤＨＦを与えた。
【００８７】
動物はポリプロピレン不透明ケージ（Ｗ２２０×Ｌ３２０×Ｈ１３５,夏目製作所）内で２〜３匹ずつ飼育した。飼育室は,湿度４０〜５０％,室温２０〜２５℃に維持し,１２時間の明暗サイクル（点灯;ＡＭ８：００,消灯；ＰＭ８：００）に設定した。
【００８８】
酸化ストレス（ＯＳ）を付加し生体内低酸素状態を形成させ,ＮＡＳＨ病態を作出するため,上記脂肪肝担持ラットに対し,生理食塩水に溶解させた亜硝酸ナトリウムを３０ｍｇ／Ｋｇ（体重）／日,６週間にわたり腹腔内投与した。投与期間中は２週間ごとに尾静脈から採血し,病態の確認を行い,病態の進行状況に問題がないことを確認した。
【００８９】
ＮＡＳＨに対する未成熟パパイア果実発酵物の有効性評価のため,上記亜硝酸ナトリウム投与群に対し,同時に未成熟パパイア果実発酵物を２ｇ／Ｋｇ（体重）／日,又は６ｇ／Ｋｇ（体重）／日,６週間にわたりゾンデにて強制経口投与した。
【００９０】
投与期間終了後,犠牲死させ,該ラットの血液の生化学的特徴変化,肝臓ミトコンドリアにおける活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）派生の変化,肝臓組織の病理組織学的変化を観察した。
【００９１】
本実施例においては,［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）,［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）,［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）に関し詳述する。なお,各群６匹（ｎ＝６）とした。
【００９２】
血漿中ＡＳＴ,ＡＬＴ値はトランスアミナーゼＣII−テストワコー（和光純薬工業株式会社）にて測定した。血漿中ヒアルロン酸値はヒアルロン酸測定キット（生化学工業株式会社）にて測定した。
【００９３】
肝臓ミトコンドリア由来活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）派生の検出は以下の手順で行った。
【００９４】
肝臓試料は,下大静脈より１．１５％塩化カリウム溶液（５ｍＭベンズアミジン含む）にて灌流後採取した。肝臓組織１ｇに対しトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４,０．２５Ｍシュクロース,０．１Ｍ塩化カリウム含む）と共にホモジェナイズし,このものの３,０００×ｇ（１０分間,４℃）上清を９,０００×ｇ（２０分間,４℃）にて遠心分離し,沈殿物をトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４,０．２５Ｍシュクロース,０．１Ｍ塩化カリウム含む）にて２回遠心洗浄しミトコンドリア画分とした。該画分１４．２８ｍｇに対し,１ｍｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４,０．２５Ｍシュクロース,０．１Ｍ塩化カリウム含む）で希釈し試料溶液とした。この濃度はミトコンドリアのタンパク量に換算すると,５００μｇ／ｍｌに相当する。
【００９５】
活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）派生量計測のため,上記肝臓ミトコンドリア溶液３５μｌ,０．１％ｄｏｄｅｃｙｌ ｍａｌｔｏｓｉｄｅ,５ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｔｅ，５ｍＭ ｍａｌａｔｅ,２００ｍＭ ｓｕｃｃｉｎａｔｅを含む溶液２５μl,４．６Ｍ ＤＭＰＯ溶液２０μl,２ｍＭ ＮＡＤＨ溶液２０μl,合計１００μlを３７℃,５分間インキュベーションした。インキュベーション後,直ちにＥＳＲ装置（ＪＥＳ−ＲＥＩＸ／ＨＲ,日本電子株式会社）にて常温で測定した。
【００９６】
測定に当たり,予めｃａｖｉｔｙ内に挿入したＭｎＯのＭｎ２＋によるＥＳＲスペクトル信号強度に対するＤＭＰＯスピンアダクト(ＤＭＰＯ−ＯＨ)によるＥＳＲスペクトル信号の強度すなわち相対強度を算出し定量化した。即ち,ＥＳＲ信号強度（ＤＭＰＯ−ＯＨ／Ｍｎ）で算定した。
【００９７】
統計学的処理として,全ての結果は平均値±標準誤差で示した。得られたデータは一元配置分散分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ,ＡＮＯＶＡ）後,Ｔｕｒｋｅｙの多重比較検定法を用いて統計学的処理を行った。２群間の比較にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用い,危険率５％以下を有意差有りと判定した。
【００９８】
投与期間終了後,犠牲死させ,該ラットの血液の生化学的特徴変化,肝臓ミトコンドリアにおけるＲＯＳ産生変化,肝臓組織の病理組織学的変化を観察した結果を以下に示す。
【００９９】
未成熟パパイア果実発酵物を投与しなかった［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）における投与前と投与期間終了後における生化学的測定結果は以下の通りであった。
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は２３±２ ＩＵ／Ｌ から１２７±１４ ＩＵ／Ｌに上昇,
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は１１±２ ＩＵ／Ｌ から２３±３ ＩＵ／Ｌに上昇,
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍｌ）は９２±１２ｍｇ／ｍｌから ２１０±１９ｍｇ／ｍｌに上昇,
上記結果から,酸化ストレスに伴うＮＡＳＨ症状が発現していることが認められた。
【０１００】
上記［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）に対し,実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ（体重）を投与した［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）における投与前と投与期間終了後における生化学的測定結果は以下の通りであった。
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は２２±２ ＩＵ／Ｌ から１０２±２１ Ｕ／Ｌに上昇,
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は１２±２ ＩＵ／Ｌ から２０±３ ＩＵ／Ｌに上昇,
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍｌ）は１０５±１６ｍｇ／ｍｌから１７０±１１ｍｇ／ｍｌに上昇,
上記結果から,酸化ストレスに伴うＮＡＳＨ症状が未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ（体重）投与により改善される傾向が認められた。
【０１０１】
上記［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）に対し,実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ（体重）を投与した［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）における投与前と投与期間終了後における生化学的測定結果は以下の通りであった。
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は２１±３ ＩＵ／Ｌから８０±１０ ＩＵ／Ｌに上昇,
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は２２±３ ＩＵ／Ｌ から１６±２ ＩＵ／Ｌに低下,
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍｌ）は１１１±１５ｍｇ／ｍｌから１６０±９ｍｇ／ｍｌに上昇,
上記結果から,酸化ストレスに伴うＮＡＳＨ症状が未成熟パパイア果実発酵２００ｍｇ／Ｋｇ（体重）投与により改善される傾向が認められた。
【０１０２】
肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ産生値（シグナル相対強度）に関し下記結果が得られた。
酸化ストレス（ＯＳ）付加前のシグナル相対強度０．６±０．１に対し,［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は１．０±０．１,［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）は０．８±０．１,［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）は０．５±０．１であった。本結果から,ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ産生が実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【０１０３】
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため,公知の手法に基づきヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行い,大滴脂肪の沈着状態を観察し下記結果を得た。
１）［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は多くの大滴性の脂肪滴および大きな肝細胞配列の乱れ有り。
２）［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）は中程度の大滴性の脂肪滴および中程度の肝細胞配列の乱れ有り。
３）［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）は小程度大滴性の脂肪滴および小程度の肝細胞配列の乱れ有り。
本結果から,ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓組織における大滴性の脂肪滴増大および肝細胞配列の乱れ増大が実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【０１０４】
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため,公知の手法に基づきマッソン・トリクローム染色により膠原線維を染色し,線維化状態を観察し下記結果を得た。
１）［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は門脈域から中心静脈域の架橋形成が生じ偽小葉形成が認められた（Ｆ３〜Ｆ４）。
２）［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）は軽度の門脈域から中心静脈域の架橋形成が認められた（Ｆ２〜Ｆ３）。
３）［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）は門脈域と中心静脈周囲に繊維化が認められるが,架橋形成は認められない（Ｆ２）。
本結果から,ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓組織における架橋形成および繊維化増大が実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【０１０５】
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため,公知の手法に基づきベルリン・ブルー染色により鉄イオンを染色し,鉄イオン沈着状態を観察し下記結果を得た。
１）［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は門脈域から中心静脈域に大きな鉄の沈着が認められた。
２）［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）は門脈域から中心静脈域に軽度の鉄の沈着が認められた。
３）［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）は鉄の沈着は殆んど認められなかった。
本結果から,ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓組織における鉄の沈着増大が実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【０１０６】
以上の結果から,抗酸化治療の有効な代表的生活習慣病の一つであるＮＡＳＨモデル実験動物に対する本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物の有効性が確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は,非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ, 以降「ＮＡＳＨ」と呼称する）の予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪肝に炎症が加わり,それが持続すると肝硬変まで進行することがある。この病態は非飲酒歴者においてもアルコール性脂肪性肝炎に類似した病状を示すことから,ＮＡＳＨの診断名を与えられ,高血圧,糖尿病,高脂血症と並び新しい生活習慣病として近年俄に注目されているところである。
【０００３】
食生活の欧米化すなわち高脂肪含量の食生活や運動不足による肥満人口の増加と生活習慣病患者の増加に伴い,脂肪肝患者，ＮＡＳＨ患者も増加することが想定される。ゆえに,新たに開発されるＮＡＳＨ治療薬や重症化抑制薬及び／又はＮＡＳＨ発症リスク低減機能食品や重症化リスク低減機能食品の開発及び／又はＮＡＳＨ治療方法や重症化予防法の確立が望まれる。
【０００４】
ヒトにおけるＮＡＳＨは血液生化学的特徴及び／又は病理組織学的特徴により診断できる。未知の機能性素材評価のためのＮＡＳＨ病態モデル実験動物の作出は,例えばラットを用いた時,該実験動物の血中酸素分圧を低水準に維持することにより達成できる。
【０００５】
ＮＡＳＨ病態モデル実験動物と酸化ストレスの関連解明の詳細は下記非特許文献１に準拠している。即ち,上記ＮＡＳＨ病態モデル実験動物としてラットを用いた時,該実験動物肝臓ミトコンドリアにおけるヒドロキシルラジカル産生は亢進している。このことは,例えば,肝臓ミトコンドリアにおけるヒドロキシルラジカル消去活性を亢進することによるＮＡＳＨの予防,改善・治療への可能性を示唆している。
【０００６】
一般に,活性酸素種（ＲＯＳ）と疾病との関係は広く認知されており,ガン,白内障,神経疾患,腎疾患の他,アレルギー,糖尿病などのいわゆる生活習慣病にも係っている。ＲＯＳが関係するこれらの疾病に対しては抗酸化物質の有効性が認められている。
【０００７】
また,ヒトＮＡＳＨ病態に即した該病態モデル実験動物としてラットを用いた時,肝臓ミトコンドリアからの活性酸素ラジカル産生の亢進が認められることから,ＮＡＳＨと酸化ストレスの関係が強く示唆されている（非特許文献１参照）。
【０００８】
一方,パパイア（学名：Ｃａｒｉｃａ Ｐａｐａｙａ Ｌｉｎｎ）はトロピカルフルーツとして食用に供されるだけでなく,パパインとして知られるタンパク質加水分解酵素を含むことから,食品,化粧品,及び医薬品への配合成分として様々な分野で広く利用されてきた。
【０００９】
その保健機能性は該製品のＲＯＳ消去活性,特に,ヒドロキシルラジカル消去活性に基づく可能性が示唆されている（非特許文献２参照）。
【００１０】
未成熟パパイア果実発酵物製品は一般に抗酸化作用を有し,各種疾病に有効であることが知られている。例えば,てんかん,健忘症,アルツハイマー病などの疾病への有効性,皮膚,大腸粘膜の免疫性を高め,アレルギー性炎症を抑制する可能性が示唆されている（非特許文献３参照）。
【００１１】
また,パパイアの発酵処理加工物の食品（特許文献１〜４）及び洗剤・クリーニング分野（特許文献５）での利用が考えられるようになり,一部実用化されている。
【００１２】
しかしながら,高い保健機能性を有する未成熟パパイア果実発酵物が機能性発揮に必要とするラジカル消去活性のレベルは知られておらず,また,活性酸素種の関係する生活習慣病に対する該発酵物の具体的な用途は確立されていない現状である。
【００１３】
かかる背景下,高いヒドロキシルラジカル消去活性を有する未成熟パパイア果実発酵物の生活習慣病への利用方法の確立,特に,ＮＡＳＨへの利用方法確立が期待されていた。
【００１４】
【特許文献１】特開２００１−１２０２２４号公報
【００１５】
【特許文献２】特開２００３−０２４００９号公報
【００１６】
【特許文献３】特開２００４−２６７０２６号公報
【００１７】
【特許文献４】特開２００６−０７５０８６号公報
【００１８】
【特許文献５】特開２００１−１５２１８８号公報
【００１９】
【非特許文献１】ＴＡＫＡＹＡＭＡ Ｆ． ｅｔ ａｌ: Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉ．,１００（１），ｐｐ．１６４（２００６）．
【００２０】
【非特許文献２】ＩＭＡＯ Ｋ．ｅｔ ａｌ: ＫＩＳＯ ＴＯ ＲＩＮＳＨＯ,３１（８），ｐｐ．２８３３−２８３９（１９９７）．
【００２１】
【非特許文献３】ＩＭＡＯ Ｋ．ｅｔ ａｌ: Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，４５（１），ｐｐ．１１−２３（１９９８）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は,上記事情に鑑みてなされたもので,その目的はＮＡＳＨの予防及び／又は治療に有用な経口摂取用組成物及びその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を重ね,〔１〕高いヒドロキシルラジカル消去活性を有する未成熟パパイア果実発酵物及びその製造技術の確立,〔２〕未成熟パパイア果実発酵物を含むパパイア加工食品の開発,〔３〕未成熟パパイア果実発酵物のヒドロキシルラジカル消去活性とＮＡＳＨの関連解明,に基づき本発明に至った。
【００２４】
第１に,本発明はＮＡＳＨの予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物であって,未成熟パパイア果実発酵物からなる経口摂取用組成物を提供することを特徴とする。
【００２５】
第２に,本発明はＮＡＳＨの予防及び／又は治療のため,未成熟パパイア果実発酵物を少なくとも１．０重量％含有する経口摂取用組成物を提供することを特徴とする。
【００２６】
第３に,前記未成熟パパイア果実発酵物は,ヒドロキシルラジカル消去活性が８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであるとともに,官能的に優れた品質を有することを特徴とする。
【００２７】
また,本発明において,ヒドロキシルラジカル消去活性は以下の様に定義される。
【００２８】
未成熟パパイア果実発酵物のヒドロキシルラジカル消去能の評価は電子スピン共鳴分光（ＥＳＲ）−スピントラッピング法にて実施する。ＥＳＲ装置はＸ−Ｂａｎｄ ＥＳＲ装置（日本電子株式会社製ＲＸ型）にデジタル高速掃引ユニット（ラジカルリサーチ社）を組み込み改良したラジカル検出装置にＥＳＲ装置用ＷＩＮ−ＲＡＤシステムＲＤＡ−０３Ｗ ＥＳＲデータアナライザー（ラジカルリサーチ社）を接続したシステムから構成される。スピントラップ剤として,５，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ（ＤＭＰＯ,ラボテック社）又は２−（５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−２λ５−［１，３，２］ｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｉｎａｎ−２−ｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ １−ｏｘｉｄｅ （ＣＹＰＭＰＯ,ラジカルリサーチ社）を用いる。
【００２９】
ＥＳＲ測定条件は,掃引磁場領域;ＤＭＰＯの場合,３３６．５±５ｍＴ（ＣＹＰＭＰＯの場合,３３１．５±１０ｍＴ）,磁場変調Ｆｉｅｌｄ Ｍｏｄ ; ０．０７９,Ｔｉｍｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ; ０．１０秒,掃引時間; ＤＭＰＯの場合,１分（ＣＹＰＭＰＯの場合,４分）,出力;８．０ｍＷで行い,結果はＤＭＰＯ又はＣＹＰＭＰＯによりトラップされたスピンアダクトの相対強度として示される。
【００３０】
本発明においては,ヒドロキシルラジカル消去活性は試料（未成熟パパイア果実発酵物）を含まない対照ＥＳＲ測定時の信号相対強度を５０％減弱させる未成熟パパイア果実発酵物製品の濃度をＩＣ５０値（μｇ／ｍｌ,最終濃度）として定義してある。
【００３１】
または,上記ヒドロキシルラジカル消去活性に相当する,即ち,同一のラジカル消去活性を発揮するＴｒｏｌｏｘ（（±）−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２，５，７，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ,アルドリッチ社）の濃度を求め,未成熟パパイア果実発酵物製品のＩＣ５０値（μｇ／ｍｌ，最終濃度）に相当する単位（μｍｏｌ Ｔｒｏｌｏｘ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ）として示してある。換言すると,Ｔｒｏｌｏｘをヒドロキシルラジカル消去活性評価のための標品として用い,試料（未成熟パパイア果実発酵物）のヒドロキシルラジカル消去活性に相当するＴｒｏｌｏｘの化学当量を求めることにより評価を行う。
【００３２】
このことにより,ＥＳＲ機種の違い,手法の違い,試薬類純度の違いなどによるデータのバラツキを最小限に留め,データに客観性,定量性を与えることが可能となる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば,ＮＡＳＨの予防及び／又は治療に未成熟パパイア果実発酵物からなる経口摂取用組成物を用いることにより,ＮＡＳＨの予防及び／又は治療に有用な経口摂取組成物の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明の経口摂取組成物に使用する未成熟パパイア果実発酵物の製造方法は,野生の未成熟パパイアのスライス品とブドウ糖とを混合してなる第１の混合物を静置し,次いでこの第１の混合物を濾過することにより第１の濾液と第１の残渣に分画し,この第１の残渣にブドウ糖を混合し第２の混合物とした後静置し,この第２の混合物を濾過することにより第２の濾液を取得するとともに,第１の濾液と第２の濾液とを混合してなる第３の混合液を製造し,次いでこの第３の混合液中のブドウ糖濃度を４０乃至６０％に調製することにより製造される第１の中間原料に対し,乳酸菌とアミラーゼと味噌用酵素とを混合した後発酵せしめて発酵物を製造する工程と,この発酵物にブドウ糖を添加した後乾燥させ,その後粉砕してなる第２の中間原料を製造する工程と,この第２の中間原料を,６ヶ月以上静置熟成させる工程とからなる。
【００３５】
また,本発明に基づく製品はヒドロキシルラジカル消去活性が８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであるとともに官能的に優れた品質を有する未成熟パパイア果実発酵物を使用することを特徴とする。
【００３６】
ここで,「野生の未成熟パパイア」とは,原種に近い野生種のパパイアであって,かつ未だ熟していない外皮が青色のパパイア果実を意味し,店舗,スーパーなどで目にする品種改良されたパパイアとは異なり,大きさは人の拳ほどであり,種がぎっしりと詰まっているものである。
【００３７】
野生の未成熟パパイア果実は白色の種子を有する特徴を有しており,黒色の種子を有する成熟パパイア果実とは異なるものである。
【００３８】
また,一般に,栽培された未成熟パパイア果実よりも野生の未成熟パパイア果実の方がヒドロキシルラジカル消去活性が高く,かつ,保健機能性が高いため,本発明においては野生の未成熟パパイア果実を用いることを特徴としている。
【００３９】
即ち,野性の未成熟パパイアを採取し,へたの部分と底部の花落ちをカットし,皮付きのまま種ごと輪切りにした後,容器内にてつぶして練り上げる（マッシュする）。このものにブドウ糖を添加し,４乃至１０日間熟成させ,該熟成物を濾過し,第1の濾液と第1の残渣を得る。
【００４０】
第１の残渣とブドウ糖の混合物を静置後,濾過により第２の濾液を取得し,第１の濾液と第２の濾液の混合物にブドウ糖を添加し,該混合液中の最終的なブドウ糖濃度を４０乃至６０重量％に調製し,この物を未成熟パパイア果実発酵物の中間原料とする。
【００４１】
上記中間原料に乳酸菌,味噌用酵素及びアミラーゼを添加し,混合し,発酵せしめ,該発酵物にブドウ糖を添加した後乾燥させ,該乾燥物を粉砕して粉末状となし,６ヶ月以上静置熟成させることにより,製品であるヒドロキシルラジカル消去活性が８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであることを特徴とする官能的に優れた品質を有する粉末状の未成熟パパイア果実発酵物を得ることが出来る。本製品は官能評価的に優れた品質を有し,保健機能性素材として有用な生理活性を保持している。
【００４２】
本発明においては原料として野生の未成熟パパイア果実を用いることが重要である。仮に,パパイアの成熟果実を原料として用いた時は,製造工程中に品質劣化を生じやすく,また,最終的に得られた発酵物の品質は官能評価的に未成熟パパイア果実を用いた時よりも劣り,更に,保健機能性素材として期待される生理活性を充分には保持していない。
【００４３】
本発明において用いる乳酸菌には特に制限はないが,ストレプトコッカス属,ペディオコッカス属,ラクトバチルス属などが好ましく,ストレプトコッカス属の乳酸菌が特に好ましい。このものは,例えば,食品グレードの市販品として入手可能な原料である。
【００４４】
本発明において用いるアミラーゼはデンプンの加水分解酵素の総称であり,食品製造に利用可能な品質条件を有している限り,特には制限はない。このものは,例えば,食品グレードの市販品として入手して利用可能な原料であり,該酵素の特性,活性単位等の品質と,目的とする製品の品質条件,製造条件に応じて,使用方法を適宜調整できる。
【００４５】
本発明において,味噌用酵素とは,酒,味噌,醤油などの製造に用いられるコウジカビ属コウジカビ,アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の菌体,分泌物などを意味する。上述の「中間原料に対し,乳酸菌とアミラーゼと味噌用酵素とを混合した後発酵せしめて発酵物を製造する工程」において,該味噌用酵素を適量,添加混合することが出来る。このものは,例えば,食品グレードの市販品として入手可能な原料であり,該酵素の特性,活性単位等の品質と,目的とする製品の品質条件,製造条件に応じて,使用方法を適宜調整できる。
【００４６】
本発明において用いる乳酸菌,アミラーゼ,味噌用酵素の使用量に,特に制限はないが,それぞれの品質,コスト上の要求に応じて都度適量を定めることが出来る。また,目的とする製品の品質によって,これらの原料の使用量,使用方法は調整可能である。
【００４７】
上記条件下における有効摂取量,摂取方法,摂取期間に係らず,本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物は食品なので,本発明においては摂取量,摂取方法,摂取期間には特段の上限及び下限,又はその他の条件などは設定していない。従って,大量に短期間摂取する場合,少量に長期間摂取する場合,他の保健機能性素材と共に摂取する場合など各種のケースが想定されるが,このこと自体によっては本発明は制限されない。
【００４８】
本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物は乳白色粉末状であるが,摂取を容易とするため造粒による顆粒化,粉砕による微粉末化,打錠による錠剤化など剤形の変更,また,着色料,フレーバー添加など別途に任意の混合物を添加することは妨げられない。
【００４９】
本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物はそのままでも摂取可能であるが,他の食品と混合して摂取することが出来る。該未成熟パパイア果実発酵物の他の食品への添加量は,食品に対して１．０重量％以上,望ましくは３．０重量％以上,更に望ましくは５．０重量％以上の時,官能評価上,食品として好ましい状態となり,ＮＡＳＨに対する実質的な予防改善効果を発揮することが出来る。食品への添加量には上限はなく,１００重量％未成熟パパイア果実発酵物を含む食品を用いても差し支えない。混合する食品は粉末状,液状,ペースト状など様々な状態が可能であるが,本発明においてはこれらの状態の制限は受けない。
【００５０】
従って,未成熟パパイア果実発酵物製品の他の食品への混合量,摂取方法はコスト,官能評価を含む品質的要件,ＮＡＳＨの予防及び／又は治療のために要求される機能,例えば,病態の種類,程度,摂取開始時期,摂取予定期間,併用素材その他の内容によって異なるため,一律には制限されない。
【００５１】
未成熟パパイア果実発酵物のラジカル消去活性に基づくＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療用組成物として利用するに当たり,ヒドロキシルラジカル消去能はＥＳＲで測定した時,８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇとすることにより有効に目的を達成できる。
【００５２】
なお,未成熟パパイア果実発酵物のラジカル消去活性に基づくＮＡＳＨ病態の予防及び／又は改善・治療用組成物として利用するに当たり,ヒドロキシルラジカル消去能の大きさは,ＥＳＲで測定した時,ＩＣ５０値としてＴｒｏｌｏｘを超えない範囲であることが望ましい。これはＴｒｏｌｏｘ以上のヒドロキシルラジカル消去能を有する食品を無制限に摂取した場合の生体への影響を予測できないことによる。本発明においては,ヒドロキシルラジカル消去能の上限は天然物として安全性が担保されている緑茶抽出物粉末と同等レベルに設計されている。
【００５３】
以上説明したように,本発明においては高いラジカル消去能を有する未成熟パパイア果実発酵物を使用し,経口摂取用組成物として用いることによりＮＡＳＨの有効な予防方法及び／又は治療方法を提供する。
【００５４】
以下,実施例によって本発明をさらに説明する。但し,下記の実施例は発明を例示するためのものであり,本発明をいかなる意味においても限定するものではない。
【００５５】
＜実施例１＞
１）未成熟パパイア果実発酵物中間原料の製造例
野生の未成熟パパイア果実１００Ｋｇを採取し,異物除去のため水洗後,ヘタ部分及び果実の底部を除き,スライス品８５Ｋｇを得た。
【００５６】
スライス品にブドウ糖２０Ｋｇを添加し,良く混和し,４日間静置熟成させ,該混合物を濾過し,果汁液である濾液１と残渣１を得た。
【００５７】
残渣６０Ｋｇに対し,ブドウ糖１０Ｋｇを添加し,混和し,４日間静置熟成させ,該混合物を濾過し,果汁液である濾液２を得た。
【００５８】
濾液１と濾液２を混合し,ブドウ糖２Ｋｇを添加し,良く混和し,目的とする中間原料を４０Ｋｇ得た。
【００５９】
２）未成熟パパイア果実発酵物最終製品の製造例
上記１）で製造された中間原料２０Ｋｇに味噌用酵素０．５Ｋｇを添加し,良く混和し,４０℃にて４８時間発酵せしめた後,ブドウ糖６０Ｋｇを添加し,良く混和した後,１８℃,１ヶ月間乾燥させ,粉砕し,組成物１を得た。
【００６０】
上記１）で製造された中間原料１５Ｋｇに乳酸菌５Ｋｇ及び味噌用酵素０．１Ｋｇを添加し,良く混和し,４０℃にて４８時間発酵せしめた後,ブドウ糖３０Ｋｇを添加し,良く混和した後,１８℃,１ヶ月間乾燥させ,粉砕し,組成物２を得た。
【００６１】
上記２）で製造された中間原料５Ｋｇにアミラーゼ０．１Ｋｇを添加し,良く混和し,４０℃にて４８時間発酵せしめた後,ブドウ糖１０Ｋｇを添加し,良く混和した後,１８℃,１ヶ月間乾燥させ,粉砕し,組成物３を得た。
【００６２】
組成物１,２,３を合わせて混合均質化し,ガスバリヤー製の高いアルミ包材内で６ヶ月以上熟成し,最終製品１００Ｋｇを得た。
【００６３】
本品は水分含量５重量％以下の流動性の高い乳白色粉末で,官能的に優れた味質を有していた。本品のヒドロキシルラジカル消去活性は下記実施例２に記載してある通りである。
【００６４】
＜実施例２＞未成熟パパイア果実発酵物製品及びＴｒｏｌｏｘのヒドロキシルラジカル消去活性の測定
上記のようにして製造された未成熟パパイア果実発酵物によるフリーラジカルおよび活性酸素種消去能は,電子スピン共鳴分光（ＥＳＲ）−スピントラッピング法にて評価した。ＥＳＲ装置はＸ−Ｂａｎｄ ＥＳＲ装置（日本電子株式会社製ＲＸ型）にデジタル高速掃引ユニット（ラジカルリサーチ社）を組込み高感度高速化の改良を施したフリーラジカル検出装置にＥＳＲ装置用ＷＩＮ−ＲＡＤシステムＲＤＡ−０３Ｗ ＥＳＲデータアナライザ（ラジカルリサーチ社）を接続したシステムにて構成されている。スピントラップ剤として,ＣＹＰＭＰＯを用いた。
【００６５】
ＥＳＲ分析に際して,ＥＳＲ装置は,掃引磁場領域: ＤＭＰＯの場合,３３６．５±５ｍＴ（ＣＹＰＭＰＯの場合,３３１．５±１０ｍＴ）,磁場変調Ｆｉｅｌｄ Ｍｏｄ:０．０７９ｍＴ,Ｔｉｍｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ: ０．１０秒,掃引時間: ＤＭＰＯの場合,１分（ＣＹＰＭＰＯの場合,４分）,出力:８．０ｍＷに設定し,測定試料中の活性酸素・フリーラジカル種をＤＭＰＯ又はＣＹＰＭＰＯにより捕捉し形成するスピンアダクトに固有のＥＳＲスペクトルをＥＳＲ分析で検出した。測定試料における活性酸素・フリーラジカル種の量はスピンアダクトによるＥＳＲスペクトルの信号強度により計測できる。遷移金属のマンガン（Ｍｎ）はＥＳＲスペクトルを生じることを利用し,この信号を基準信号とし,活性酸素・フリーラジカル種とＤＭＰＯ又はＣＹＰＭＰＯとのスピンアダクトによるＥＳＲスペクトルのＭｎのＥＳＲスペクトルに対する信号強度の比,すなわちＭｎ信号に対する相対強度で定量的な精度を向上させた。以下に,更に具体的に示す。
【００６６】
ＥＳＲ測定試料溶液は,充分に窒素置換された２００ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中に１００μＭ硫酸第一鉄,１００μＭ ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａ−ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＤＥＴＡＰＡＣ），５ｍＭ ＣＹＰＭＰＯ,各濃度の試料（未成熟パパイア果実発酵物製品）又は Ｔｒｏｌｏｘ,１００μＭ過酸化水素から成る。予め過酸化水素以外を混和し,最後に過酸化水素を添加し,過酸化水素と鉄イオンとのフェントン反応でヒドロキシルラジカルを発生させる。過酸化水素添加１分後に掃引を開始することで反応時間を一定にし,ヒドロキシルラジカルを一定量発生させ,試料混液中のＣＹＰＭＰＯにより捕捉し,形成するＣＹＰＭＰＯ−ヒドロキシルラジカルのスピンアダクト（ＣＹＰＭＰＯ−ＯＨ）のＥＳＲスペクトルは全８本の信号ピークを持つ。
【００６７】
低磁場から４番目のＥＳＲ信号ピークと,Ｍｎによる６本のＥＳＲ信号中,低磁場側から２番目のＭｎ信号ピークを比較し,ＣＹＰＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号相対強度によりのＥＳＲ試料中のヒドロキシルラジカル量を定量化した。被験素材又はＴｒｏｌｏｘを添加せず実施した対照ＥＳＲ測定で観察されたＣＹＰＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度を１００％とした。試料（未成熟パパイア果実発酵物製品）をＥＳＲ測定溶液に添加し,ＣＹＰＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化（減弱）で,試料（未成熟パパイア果実発酵物製品）のヒドロキシルラジカルに対する消去活性を検討した。その結果,対照ＥＳＲ測定時の相対信号強度を５０％減弱させる未成熟パパイア果実発酵物製品の濃度をＩＣ５０値 （μｇ／ｍｌ）として求めたところ,７０４μｇ／ｍｌ（ＥＳＲ測定試料中濃度）であった。
【００６８】
同様にして,上記のヒドロキシルラジカル消去活性に相当するＴｒｏｌｏｘの相当当量を測定したところ,０．６μｍｏｌ Ｔｒｏｌｏｘ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであった。すなわち,保健機能性を発揮するに足る充分な活性が確認された。
【００６９】
＜実施例３＞未成熟パパイア果実発酵物含有の経口摂取用組成物の製造例
上記２）で得られた製品を０．１重量％,１．０重量％,１０．０重量％添加したクッキー及びオレンジジュースを試作し,１０名の官能評価者により試食,試飲を行った。
【００７０】
その結果,製品１．０重量％,１０．０重量％添加したクッキー及びオレンジジュースに関しては全員が食品又は飲料として摂取可能と評価し,本製品が官能評価的に優れた品質を有することが確認された。しかし,０．１重量％添加品は官能評価的に品質が劣っていると評価された。また,保健機能性を向上させるため,製品そのものの絶対的摂取量を上げる必要性に対し,０．１重量％添加品の利用は現実的ではないと評価された。
【００７１】
＜比較例１＞パパイアの成熟果実を原料として用いた場合の製品品質
成熟したパパイア果実を原料として,上記１）及び上記２）と同様の工程で製造したところ,工程中で雑菌の混入が認められ,最終製品は異味異臭を呈し,官能的に食品として利用することの出来ない品質となった。
【００７２】
＜比較例２＞パパイアの成熟果実を原料として用いた場合の製品品質
成熟したパパイア果実を熱処理（１００℃,１時間）により殺菌処理したものを原料とし,上記１）及び上記２）と同様の工程で製造したところ,上記２）と同様の官能的性質を有する製品が得られた。
【００７３】
本品のヒドロキシルラジカル消去活性は実施例２で得られた未成熟パパイア果実発酵物から得られた製品と比較すると,２分の１以下であり,要求品質を満足させることは出来なかった。
【００７４】
以上,本発明の実施例と比較例１及び２とを比較した結果,未成熟パパイア果実を出発原料として用いることの必然性及び優位性が示された。
【００７５】
＜実施例４＞未成熟パパイア果実発酵物の肝臓ミトコンドリアからのフリーラジカル産生抑制効果
未成熟パパイア果実発酵物によるＮＡＳＨ病態モデル動物の肝臓ミトコンドリアのエネルギー代謝からの活性酸素・フリーラジカルの派生増大に対する是正効果をみるため,下記試験を実施した。
【００７６】
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットを,正常対照群（未処理）,ＮＡＳＨ病態群２群に分けた。ＮＡＳＨ病態モデルは高山らの方法（非特許文献１参照）に準拠して作成した。
【００７７】
各群のラットから,肝臓ミトコンドリアを分画（非特許文献４参照）し,下記測定系（非特許文献５参照）にて各群ミトコンドリアから派生する活性酸素・フリーラジカル種をスピントラップ剤ＤＭＰＯで捕捉し,形成するＤＭＰＯスピンアダクトをＥＳＲ−分光法にて検出した。各群のミトコンドリア画分は０．０３Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４,０．２５Ｍシュクロース,０．１Ｍ塩化カリウムを含む）で縣濁後,直ちに冷凍保存（−８０℃）したものをＥＳＲ分析に供した。
【００７８】
【非特許文献４】Ｅｇａｓｈｉｒａ Ｔ. ｅｔ ａｌ:Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ, １１７, １１５−１１９（２０００）.
【００７９】
【非特許文献５】Ｙｕｄｏｎｇ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ:Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ, ３６（１１）,１４３４−１４４３（２００４）.
【００８０】
未成熟パパイア果実発酵物をミトコンドリアＥＳＲ測定試料に添加し,ＤＭＰＯ−活性酸素・フリーラジカルのアダクトによるＥＳＲスペクトルの信号強度の減弱効果により,ミトコンドリア機能障害による活性酸素・フリーラジカル（ＲＯＳ）派生増大に対する改善効果を検討した（非特許文献６参照）。
【００８１】
【非特許文献６】Ｔａｋａｙａｍａ Ｆ. ｅｔ ａｌ:Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ, ８５, ２２７−２３３（２００１）.
【００８２】
ＤＭＰＯ,ミトコンドリア及びＮＡＤＨは氷冷,これら以外は予め３７℃に温めておいたものを用いた。アッセイ系は,５ｍＭトリスアミノメタン, ０．２５ｍＭシュクロース, ０．１ｍＭ塩化カリウムを含む緩衝液中（ｐＨ７．４）に,３５μｌミトコンドリア懸濁液（０．５ｍｇタンパクを含む）,９２０ｍＭ ＤＭＰＯ,０．１％ドデシルマルトシド, １０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸カリウム, １０ｍＭ Ｌ（−）-リンゴ酸ナトリウム, ２００ｍＭ コハク酸二ナトリウム, １００μＭ ＮＡＤＨから構成されるよう,試料および試薬溶液を調製し,３７℃, ５分間インキュベーション後,ＥＳＲ分析を行った。
【００８３】
その結果,検出されたＤＭＰＯとヒドロキシルラジカルとのアダクト（ＤＭＰＯ−ＯＨ）に特徴的なｇ値と微細定数を持つＥＳＲスペクトル（ＤＭＰＯ−ＯＨ）の信号強度でミトコンドリアから派生する活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）を計測した。未成熟パパイア果実発酵物をＮＡＳＨ病態ミトコンドリアによるアッセイ系に添加し,ＤＭＰＯ−ＯＨ／ＭｎのＥＳＲ信号の相対強度の変化で,ＮＡＳＨ病態エネルギー代謝から派生する活性酸素・フリーラジカル種の発生増大への制御能を検討した。その結果,相対信号強度を５０％減弱させる抽出物の濃度をＩＣ５０値（μｇ／ｍｌ）として示してある。
【００８４】
すなわち,正常対象群（未処理）を１．０とした時,ＮＡＳＨ病態群は２．６,ＮＡＳＨ病態群に未成熟パパイア果実発酵物を添加した群は１．２となった。これにより,未成熟パパイア果実発酵物はＮＡＳＨ病態モデル動物の肝臓ミトコンドリアにおけるエネルギー代謝からのラジカル派生を抑制・制御することが実証された。従って,未成熟パパイア果実発酵物は,経口的に摂取することによりＮＡＳＨの予防及び／又は改善・治療に有効であることが示唆された。本結果は,抗酸化作用を有する未成熟パパイア果実発酵物の如き食品成分が,一般に酸化ストレスに起因するとされるＮＡＳＨを含む生活習慣病に有効である、とする理解に根拠を与えるものである。
【００８５】
＜実施例５＞未成熟パパイア果実発酵物のＮＡＳＨへの効果
実験的に調整された脂肪肝担持ラットに対し,酸化ストレス（ＯＳ）を負荷し,生体内低酸素状態を形成させることによりＮＡＳＨの生化学的・病理組織学的特徴を有する病態モデルラットを作出し,このものに対し本発明に使用する実施例１で製造された未成熟パパイア果実発酵物を投与し,該ラットの血液の生化学的特徴変化,肝臓ミトコンドリアにおけるＲＯＳ派生の変化,肝臓組織の病理組織学的変化を観察することにより,ＮＡＳＨに対する本発明に使用する実施例１で製造された未成熟パパイア果実発酵物の有効性評価を行った。
【００８６】
実験動物として,６週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（１８０−２００ｇ／匹）を用いた。脂肪肝作成のため,４週間,自由摂取にてコリン欠乏高脂肪食（ＣＤＨＦ,オリエンタル酵母）を与えた。その後も,病態維持のため実験終了までＣＤＨＦを与えた。
【００８７】
動物はポリプロピレン不透明ケージ（Ｗ２２０×Ｌ３２０×Ｈ１３５,夏目製作所）内で２〜３匹ずつ飼育した。飼育室は,湿度４０〜５０％,室温２０〜２５℃に維持し,１２時間の明暗サイクル（点灯;ＡＭ８：００,消灯；ＰＭ８：００）に設定した。
【００８８】
酸化ストレス（ＯＳ）を付加し生体内低酸素状態を形成させ,ＮＡＳＨ病態を作出するため,上記脂肪肝担持ラットに対し,生理食塩水に溶解させた亜硝酸ナトリウムを３０ｍｇ／Ｋｇ（体重）／日,６週間にわたり腹腔内投与した。投与期間中は２週間ごとに尾静脈から採血し,病態の確認を行い,病態の進行状況に問題がないことを確認した。
【００８９】
ＮＡＳＨに対する未成熟パパイア果実発酵物の有効性評価のため,上記亜硝酸ナトリウム投与群に対し,同時に未成熟パパイア果実発酵物を２ｇ／Ｋｇ（体重）／日,又は６ｇ／Ｋｇ（体重）／日,６週間にわたりゾンデにて強制経口投与した。
【００９０】
投与期間終了後,犠牲死させ,該ラットの血液の生化学的特徴変化,肝臓ミトコンドリアにおける活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）派生の変化,肝臓組織の病理組織学的変化を観察した。
【００９１】
本実施例においては,［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）,［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）,［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）に関し詳述する。なお,各群６匹（ｎ＝６）とした。
【００９２】
血漿中ＡＳＴ,ＡＬＴ値はトランスアミナーゼＣII−テストワコー（和光純薬工業株式会社）にて測定した。血漿中ヒアルロン酸値はヒアルロン酸測定キット（生化学工業株式会社）にて測定した。
【００９３】
肝臓ミトコンドリア由来活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）派生の検出は以下の手順で行った。
【００９４】
肝臓試料は,下大静脈より１．１５％塩化カリウム溶液（５ｍＭベンズアミジン含む）にて灌流後採取した。肝臓組織１ｇに対しトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４,０．２５Ｍシュクロース,０．１Ｍ塩化カリウム含む）と共にホモジェナイズし,このものの３,０００×ｇ（１０分間,４℃）上清を９,０００×ｇ（２０分間,４℃）にて遠心分離し,沈殿物をトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４,０．２５Ｍシュクロース,０．１Ｍ塩化カリウム含む）にて２回遠心洗浄しミトコンドリア画分とした。該画分１４．２８ｍｇに対し,１ｍｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４,０．２５Ｍシュクロース,０．１Ｍ塩化カリウム含む）で希釈し試料溶液とした。この濃度はミトコンドリアのタンパク量に換算すると,５００μｇ／ｍｌに相当する。
【００９５】
活性酸素・フリーラジカル種（ＲＯＳ）派生量計測のため,上記肝臓ミトコンドリア溶液３５μｌ,０．１％ｄｏｄｅｃｙｌ ｍａｌｔｏｓｉｄｅ,５ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｔｅ，５ｍＭ ｍａｌａｔｅ,２００ｍＭ ｓｕｃｃｉｎａｔｅを含む溶液２５μl,４．６Ｍ ＤＭＰＯ溶液２０μl,２ｍＭ ＮＡＤＨ溶液２０μl,合計１００μlを３７℃,５分間インキュベーションした。インキュベーション後,直ちにＥＳＲ装置（ＪＥＳ−ＲＥＩＸ／ＨＲ,日本電子株式会社）にて常温で測定した。
【００９６】
測定に当たり,予めｃａｖｉｔｙ内に挿入したＭｎＯのＭｎ２＋によるＥＳＲスペクトル信号強度に対するＤＭＰＯスピンアダクト(ＤＭＰＯ−ＯＨ)によるＥＳＲスペクトル信号の強度すなわち相対強度を算出し定量化した。即ち,ＥＳＲ信号強度（ＤＭＰＯ−ＯＨ／Ｍｎ）で算定した。
【００９７】
統計学的処理として,全ての結果は平均値±標準誤差で示した。得られたデータは一元配置分散分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ,ＡＮＯＶＡ）後,Ｔｕｒｋｅｙの多重比較検定法を用いて統計学的処理を行った。２群間の比較にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用い,危険率５％以下を有意差有りと判定した。
【００９８】
投与期間終了後,犠牲死させ,該ラットの血液の生化学的特徴変化,肝臓ミトコンドリアにおけるＲＯＳ産生変化,肝臓組織の病理組織学的変化を観察した結果を以下に示す。
【００９９】
未成熟パパイア果実発酵物を投与しなかった［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）における投与前と投与期間終了後における生化学的測定結果は以下の通りであった。
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は２３±２ ＩＵ／Ｌ から１２７±１４ ＩＵ／Ｌに上昇,
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は１１±２ ＩＵ／Ｌ から２３±３ ＩＵ／Ｌに上昇,
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍｌ）は９２±１２ｍｇ／ｍｌから ２１０±１９ｍｇ／ｍｌに上昇,
上記結果から,酸化ストレスに伴うＮＡＳＨ症状が発現していることが認められた。
【０１００】
上記［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）に対し,実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ（体重）を投与した［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）における投与前と投与期間終了後における生化学的測定結果は以下の通りであった。
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は２２±２ ＩＵ／Ｌ から１０２±２１ Ｕ／Ｌに上昇,
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は１２±２ ＩＵ／Ｌ から２０±３ ＩＵ／Ｌに上昇,
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍｌ）は１０５±１６ｍｇ／ｍｌから１７０±１１ｍｇ／ｍｌに上昇,
上記結果から,酸化ストレスに伴うＮＡＳＨ症状が未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ（体重）投与により改善される傾向が認められた。
【０１０１】
上記［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）に対し,実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ（体重）を投与した［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）における投与前と投与期間終了後における生化学的測定結果は以下の通りであった。
１）血漿中ＡＳＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は２１±３ ＩＵ／Ｌから８０±１０ ＩＵ／Ｌに上昇,
２）血漿中ＡＬＴ値（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は２２±３ ＩＵ／Ｌ から１６±２ ＩＵ／Ｌに低下,
３）血漿中ヒアルロン酸値（ｍｇ／ｍｌ）は１１１±１５ｍｇ／ｍｌから１６０±９ｍｇ／ｍｌに上昇,
上記結果から,酸化ストレスに伴うＮＡＳＨ症状が未成熟パパイア果実発酵２００ｍｇ／Ｋｇ（体重）投与により改善される傾向が認められた。
【０１０２】
肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ産生値（シグナル相対強度）に関し下記結果が得られた。
酸化ストレス（ＯＳ）付加前のシグナル相対強度０．６±０．１に対し,［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は１．０±０．１,［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）は０．８±０．１,［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）は０．５±０．１であった。本結果から,ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓ミトコンドリア由来ＲＯＳ産生が実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【０１０３】
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため,公知の手法に基づきヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行い,大滴脂肪の沈着状態を観察し下記結果を得た。
１）［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は多くの大滴性の脂肪滴および大きな肝細胞配列の乱れ有り。
２）［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）は中程度の大滴性の脂肪滴および中程度の肝細胞配列の乱れ有り。
３）［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）は小程度大滴性の脂肪滴および小程度の肝細胞配列の乱れ有り。
本結果から,ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓組織における大滴性の脂肪滴増大および肝細胞配列の乱れ増大が実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【０１０４】
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため,公知の手法に基づきマッソン・トリクローム染色により膠原線維を染色し,線維化状態を観察し下記結果を得た。
１）［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は門脈域から中心静脈域の架橋形成が生じ偽小葉形成が認められた（Ｆ３〜Ｆ４）。
２）［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）は軽度の門脈域から中心静脈域の架橋形成が認められた（Ｆ２〜Ｆ３）。
３）［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）は門脈域と中心静脈周囲に繊維化が認められるが,架橋形成は認められない（Ｆ２）。
本結果から,ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓組織における架橋形成および繊維化増大が実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【０１０５】
肝臓組織の病理組織学的変化を確認するため,公知の手法に基づきベルリン・ブルー染色により鉄イオンを染色し,鉄イオン沈着状態を観察し下記結果を得た。
１）［１］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ）は門脈域から中心静脈域に大きな鉄の沈着が認められた。
２）［２］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物２ｇ／Ｋｇ）は門脈域から中心静脈域に軽度の鉄の沈着が認められた。
３）［３］群（ＣＤＨＦ＋ＯＳ＋未成熟パパイア果実発酵物６ｇ／Ｋｇ）は鉄の沈着は殆んど認められなかった。
本結果から,ＮＡＳＨの進行に伴って増大する肝臓組織における鉄の沈着増大が実施例１にて調整した本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物投与により濃度依存的に抑制される傾向が認められた。
【０１０６】
以上の結果から,抗酸化治療の有効な代表的生活習慣病の一つであるＮＡＳＨモデル実験動物に対する本発明に使用する未成熟パパイア果実発酵物の有効性が確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物であって,未成熟パパイア果実発酵物からなることを特徴とする経口摂取用組成物。
【請求項２】
前記未成熟パパイア果実発酵物は,少なくとも１．０重量％含有されていることを特徴とする請求項１に記載の経口摂取用組成物。
【請求項３】
前記未成熟パパイア果実発酵物は,ヒドロキシルラジカル消去活性が８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであるとともに,官能的に優れた品質を有することを特徴とする請求項１記載の経口摂取用組成物。
【請求項１】
非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物であって,未成熟パパイア果実発酵物からなることを特徴とする経口摂取用組成物。
【請求項２】
前記未成熟パパイア果実発酵物は,少なくとも１．０重量％含有されていることを特徴とする請求項１に記載の経口摂取用組成物。
【請求項３】
前記未成熟パパイア果実発酵物は,ヒドロキシルラジカル消去活性が８０μｇ／ｍｌ乃至２，０００μｇ／ｍｌ（ＩＣ５０）,又はＴｒｏｌｏｘ換算で０．２μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇ乃至５．０μｍｏｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｇであるとともに,官能的に優れた品質を有することを特徴とする請求項１記載の経口摂取用組成物。
【公開番号】特開２００９−１０２２４７（Ｐ２００９−１０２２４７Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７４１７９（Ｐ２００７−２７４１７９）
【出願日】平成１９年１０月２２日（２００７．１０．２２）
【出願人】（５０００９９３８６）株式会社済度 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２２日（２００７．１０．２２）
【出願人】（５０００９９３８６）株式会社済度 (6)
【Ｆターム（参考）】
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