非アルコール性脂肪肝障害の検査方法
【課題】非アルコール性脂肪肝障害を予測するための検査方法を提供する。
【解決手段】iNOS遺伝子上の、特定の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて非アルコール性脂肪肝障害を検査する方法。特定の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する非アルコール性脂肪肝障害検査用プローブ。特定の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる非アルコール性脂肪肝障害検査用プライマー。
【解決手段】iNOS遺伝子上の、特定の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて非アルコール性脂肪肝障害を検査する方法。特定の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する非アルコール性脂肪肝障害検査用プローブ。特定の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる非アルコール性脂肪肝障害検査用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は非アルコール性脂肪肝障害の検査方法およびそれに使用するプローブやプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪肝障害（ＮＡＦＬＤ）は、現在、重要な健康問題のひとつとして認識されている。ＮＡＦＬＤは、単純性脂肪肝から非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に至るまでの幅広い症状を有する。ＮＡＦＬＤは自覚症状がなく、判定が困難である。ＮＡＦＬＤは種々の臨床面（ＡＬＴの上昇、肥満及び２型糖尿病の存在）に基づいて推測されるが、これらの臨床面はＮＡＦＬＤの診断及び予測を確立するには十分ではない。現在のところ、ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨの間の境界も肝臓の生検によってのみ判定でき、それ以外の検査方法によっては予測することはできない。そして、肝臓への過剰な脂肪の蓄積は先進国の人口の２０−３０％に観察され、人口の約１−３％が肝臓への過剰な脂肪の蓄積、すなわち脂肪肝からＮＡＳＨへと進展する。
ＮＡＦＬＤの進行には、環境要因と同様に遺伝的要因が重要であると考えられている（非特許文献１〜４）。しかしながら、遺伝学的な研究報告は僅かしかない。
【０００３】
誘導型NO合成酵素（inducible nitric oxide synthase: iNOS）は炎症やストレスによ
って誘導され、フリーラジカルである一酸化窒素を合成し、様々な病態に関与している。iNOSが重度のＮＡＳＨ患者において高発現しているという報告（非特許文献５）や、iNOSのノックアウトマウスが高脂肪食による肝線維化を受けやすいという報告がある（非特許文献６）。また、iNOSの選択的阻害剤がラットの肝硬変モデルにおいて線維化を抑制したという報告もある（非特許文献７）。
しかしながら、iNOS遺伝子の一塩基多型がＮＡＦＬＤと関連するという報告はない。
【非特許文献１】Namikawa C, Shu-Ping Z, Vyselaar JR, Nozaki Y, Nemoto Y, et al. Polymorphisms of microsomal triglyceride transfer protein gene and manganese superoxide dismutase gene in non-alcoholic steatohepatitis. J Hepatol. 2004;40:781-6
【非特許文献２】Gambino R, Cassader M, Pagano G, Durazzo M, Musso G. Polymorphism in microsomal triglyceride transfer protein: a link between liver disease and atherogenic postprandial lipid profile in NASH? Hepatology. 2007;45:1097-107.
【非特許文献３】Tokushige K, Takakura M, Tsuchiya-Matsushita N, Taniai M, Hashimoto E, et al. Influence of TNF gene polymorphisms in Japanese patients with NASH and simple steatosis. J Hepatol. 2007;46:1104-10.
【非特許文献４】Merriman RB, Aouizerat BE, Bass NM. Genetic influences in nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Gastroenterol. 2006;40:S30-3.
【非特許文献５】Garcia-Monzon C, Martin-Perez E, Iacono OL, Fernandez-Bermejo M, Majano PL, Apolinario A, Larranaga E, Moreno-Otero R. Characterization of pathogenic and prognostic factors of nonalcoholic steatohepetitis associated with obesity. J Hepatol 2000;33:716-724
【非特許文献６】Chen Y, Hozawa S, Sawamura S Sato S, Fukuyama N, Tsuji C, Mine T, Okada Y, Tanino R, Osugi Y, Nakazawa H. Defiency of inducible nitric oxide synthase exacerbates hepatic fibrosis in mice fed high-fat diet. Biochem Biophys Res Commun 2005;326:45-51
【非特許文献７】Kikuchi H, Katsuramaki T, Kukita K, Taketani S, Meguro M, Nagayama M, Isobe M, Mizuguchu T, Hirata K. New straregy for the antifibrotic therapy woth oral administration of FR260330 (a slective inducible nitiric oxide synthase inhibitor) in rat experimental liver cirrhosis. Wound Repair Regen 2007;15:881-888
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＮＡＦＬＤの発症や進行を正確に予測するための検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、iNOS遺伝子上に存在する特定の塩基の一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型がＮＡＦＬＤに関連することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）iNOS遺伝子上の、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて非アルコール性脂肪肝障害を検査する方法。
（２）配列番号１〜４のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する非アルコール性脂肪肝障害検査用プローブ。
（３）配列番号１〜４のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる非アルコール性脂肪肝障害検査用プライマー。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の検査方法により、ＮＡＦＬＤの発症リスクや進行を正確に非侵襲的に予測することができるため、ＮＡＦＬＤを予防したり、進行を抑えたりすることができる。また、iNOS遺伝子の多型は、NAFLDになりやすい素因（SNP)をもっている人にiNOS阻害剤を投与
したとき、NAFLD やNASHを発症、あるいは増悪させるといった副作用のリスク判断にも優れた指標となりうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、inducible nitric oxide synthase（iNOS）遺伝子上に存在する
塩基の一塩基多型（SNP；single nucleotide polymorphism）または該塩基と連鎖不平衡
にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析に基づいてＮＡＦＬＤを検査する方法である。ＮＡＦＬＤとは、感染性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、α1−抗トリプシン欠損症、ウィルソン病、薬剤性肝炎またはアルコ
ール性肝炎の患者、及び大量飲酒者以外において、例えば、Sanyal AJ. AGA technical review on nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterol. 2002:123:1705-25の基準によって診断される病態をいう。なお、本発明において、「検査」とは将来、ＮＡＦＬＤになるかどうかを予測するための検査、及びＮＡＦＬＤの程度が悪化する（例えば、ＮＡＳＨに進行する）かどうかを予測するための検査を含む。
【０００９】
iNOS遺伝子としては、ヒトiNOS遺伝子が好ましく、例えば、GenBank Accession No. NM_000625に登録された配列を有する遺伝子を挙げることができる。ただし、該遺伝子は人
種の違いなどによって１又は複数の塩基に置換や欠失等が存在する可能性があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。
【００１０】
ＮＡＦＬＤに関連するiNOS遺伝子の一塩基多型は、以下に示すSNP-1〜SNP-4が挙げられる。
【００１１】
【表１】
【００１２】
表１において、例えば、SNP-1はGenBank Accession No. NT_010799.14の827748番目の
塩基におけるシトシン（C）／チミン（T）の多型を意味し、この塩基がTである場合はＮ
ＡＦＬＤになる確率が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、SNP-1がTT＞TC＞CCの順でＮＡＦＬＤになる確率が高い。SNP-1はiNOS遺伝子のイントロン２１に存在するSNPである。dbSNPはNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。
その他のＳＮＰについても同様であるが、いずれについても右側の塩基がＮＡＦＬＤになりやすい塩基である（例えば、SNP-2の場合、T/CのうちCの場合がＮＡＦＬＤになりや
すく、SNP-3の場合、A/GのうちGの場合がＮＡＦＬＤになりやすく、SNP-4の場合、C/Tの
うちTの場合がＮＡＦＬＤになりやすい）。
なお、SNP-1〜SNP-4について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１〜４に示した。それぞれ６１番目の塩基が多型を有する。
これらの塩基に相当する塩基を本発明においては解析する。ここで、「相当する」とは、ヒトiNOS遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。
【００１３】
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べることによって、ＮＡＦＬＤを検査することができる。検査するＳＮＰの数は、一種類でもよいし、複数（ハプロタイプ解析）でもよい。なお、SNP-1がCであれば他のＳＮＰも左側の塩基（SNP-2＝T、SNP-3＝A、SNP-4＝C）であるというように、上記SNPのタイプは互いに相関するため、一箇所のみを解析することによって
も十分正確なＮＡＦＬＤの予測を行うことができる。なお、iNOS遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５の関係を満たす塩基をいう。
【００１４】
iNOS遺伝子の一塩基多型の解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、細胞、毛髪等の体毛、爪などが挙げられる。一塩基多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００１５】
iNOS遺伝子の一塩基多型の解析は、通常の一塩基多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解
析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００１７】
また、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによっても解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００１８】
また、多型を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによっ
てどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １９９２ Ｊａｎ １； １２（１）： １３９−１４６．）が挙げられる。具体的には、まず、iNOS遺伝子の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００１９】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料をＰＣＲで増幅し、それを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００２０】
ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
【００２１】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、ＮＡＦＬＤを検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、iNOS遺伝子における上記多型部位を含み、ハイブリダイズの有無によって多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１５塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは１５〜３５塩基、より好ましくは２０〜３５塩基である。このようなプローブとして、配列番号１１や配列番号１２のプローブ（SNP-３）、配列番号１３や配列番号１４のプローブ（SNP-４）などが例示される。SNP-1およびSNP-2についても配列番号１および２に基づいて設計できる。
【００２２】
また、プライマーとしては、iNOS遺伝子における上記多型部位を増幅するためのPCRに
用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１５〜５０塩基が好ましく、２０〜３５塩基がより好ましい。このようなプライマーは、例えば、配列番号１〜４において、多型部位の上流または下流の位置に設定することができる。
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記多型塩基の５’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記多型塩基の３’
側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示さ
れる。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記多
型塩基を含む配列を有し、上記多型塩基を３’側に含むプライマーや、上記多型塩基を含む配列の相補配列を有し、上記多型塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメ
ラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２４】
材料と方法
被検者
１１５人の日本人ＮＡＦＬＤ患者（６５人のＮＡＳＨと５０人の単純性脂肪肝）と、４３５人の健常な対照被検者は横浜市立大学病院において募集された。
全ての対照被検者は正常な肝機能を有し、ウィルス性肝炎の感染がなく、アルコール依存症ではないことが確認された。対照被検者は、ＢＭＩ＜２５ｋｇ／ｍ2であり、空腹時
血糖（＜１１０ｍｇ／ｄｌ）、中性脂肪（＜１５０ｍｇ／ｄｌ）、ＨＤＬコレステロール（＞４０ｍｇ／ｄｌ）は正常であり、最高血圧（＜１３０ｍｍＨｇ）および最低血圧（＜８５ｍｍＨｇ）も正常であった。
一方、１１５人全ての患者は、肝生検によってＮＡＦＬＤと確認された。すなわち、肝生検組織は、ヘマトキシリン−エオジン、レチクリン、及びマッソントリクローム染色により染色され、二人の病理学者によって調べられた。ＮＡＦＬＤの診断のための組織学的基準は、細胞の縁への核の移動を伴う、肝細胞の大滴性脂肪化の存在であり（Sanyal AJ.
AGA technical review on nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterol. 2002:123:1705-25）、この基準によってＮＡＦＬＤと診断された。５％を超える肝細胞に大滴性脂肪化が認められた場合、その患者を単純性脂肪肝かあるいはＮＡＳＨに分類した。ＮＡＳＨの診断の基準は、肝細胞の大滴性脂肪化に加え、小葉内炎症、zone３における肝細胞の風船様腫大（あるいは風船様膨化ともいう）、中心静脈周囲繊維化、肝細胞周囲の繊維化の存在である（Matteoni CA, Younossi ZM, Gramlich T, Boparai N, Liu YC, et al. Nonalcoholic fatty liver disease: a spectrum of clinical and pathological severity. Gastroenterology. 1999;116:1413-1419.；Teli MR, James OF, Burt AD, Bennett MK, Day CP. The natural history of nonalcoholic fatty liver: a follow-up study. Hepatology. 1995;22:1714-1719.）。
なお、以下の疾病の患者は本研究からは除外した：感染性肝炎（Ｂ型およびＣ型肝炎、エプスタイン−バーウイルス感染症）、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、α1−抗トリプシン欠損症、ウィルソン病、薬剤
性肝炎、アルコール性肝炎、及び大量飲酒者（現在もしくは過去の１日当りアルコール消費量が２０ｇを超える者）。
被検者としたいずれのＮＡＦＬＤ患者にも、肝代償不全の臨床的所見（肝性脳症、腹水、静脈瘤出血、または正常上限値の２倍を超える血清ビリルビン濃度等）は認められなかった。
全ての被検者から、本研究への参加に先立って書面によるインフォームド・コンセントを得た。研究のプロトコルは、１９７５年のヘルシンキ宣言の倫理指針に準拠しており、横浜市立病院および理化学研究所の研究委員会の承認を得たものである。
【００２５】
臨床および実験室評価
静脈血サンプルは、一晩絶食（１２時間）後の被検者から採取し、血清中のアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、グルコース、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、免疫反応性インスリン、総コレステロール、および
中性脂肪を測定した。全ての実験の生化学的パラメータは自動化分析器で測定した。
【００２６】
ＤＮＡの調製およびＳＮＰのジェノタイピング
ゲノムＤＮＡは、それぞれの血液サンプルからGenomix（Talent SRL, Trieste, Italy
）を用いて調製した。iNOS内でのＳＮＰｓは、ＩＭＳ−ＪＳＴ（医科学研究所−科学技術振興機構）のＳＮＰデータベースから選択した。マイナーアレル頻度が０．１を超え、観測された遺伝子多型（例えばTT、CT、CC）の頻度がハーディ・ワインベルグ平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）から大きく外れなかった１０のＳＮＰｓを選択した（Ｐ＞０．００１）。これらのＳＮＰｓに対してインベーダープローブ（Third Wave Technologies, Madison, WI）を合成し、以前に報告した多重ＰＣＲとインベーダーアッセイの組合せにより、患者及び対照におけるＳＮＰｓをジェノタイピングした（Ohnishi Y, Tanaka T, Ozaki K, Yamada R, Suzuki H, Nakamura Y. A high-throughput SNP typing system for genome-wide association studies. J Hum Genet 2001;46:471-477）。
【００２７】
統計分析
それぞれのＮＡＦＬＤ患者−対照の比較については、χ2テストを用い、３つの異なる
モードにおいて、遺伝子型またはアレルの頻度をＮＡＦＬＤ患者と対照の間で比較した。第１のモード（アレル頻度モード）では、２×２分割表を用いて、ＮＡＦＬＤ患者と対照の間でアレル頻度を比較した。第２のモード（劣性モード）では、２×２分割表を用いて、アレル１に関してホモ接合性である被検者の頻度をその他の被検者と比較し、第３のモード（優性モード）では、２×２分割表を用いて、アレル１を有する被検者（アレル１のホモ接合性及びヘテロ接合性）の頻度をその他の被検者と比較した。オッズ比およびその９５％信頼区間（ＣＩ）はウルフ法（Woolf's method）によって算出した。ハーディ・ワインベルグ平衡は、χ2テストを用いて評価した。ハプロタイプブロックはハプロビュー
３．２（Haploview 3.2）を用いて決定した（Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2005;21:263-265.）。臨床データは平均±標準偏差（ＳＤ）で表した。ＮＡＦＬＤ患者群
と対照群の間の臨床的パラメータは、スチューデントｔテストによって比較した。
【００２８】
結果
ＮＡＦＬＤ患者−対照相関解析
ＮＡＦＬＤ患者群および対照群の臨床データを表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
ＩＭＳ−ＪＳＴのＳＮＰデータベースから、０．１を超えるマイナーアレル頻度を持つiNOS遺伝子内の１０のＳＮＰｓ（rs3794756、rs2255929、rs2297510、rs2297511、rs2297512、rs1060822、rs2297516、rs2248814、rs2297520、rs3794764）を選択し、ＮＡＦＬＤとの相関を調べた。その結果、１０のＳＮＰｓのうち、4つのＳＮＰｓ（rs2297510、rs2297511、rs2297512、rs1060822）に有意な相関がみられ、これらは、劣性モデルにおいて
最も低いＰ値を示した（Ｐ＝０．０００８、表３）。ＯＲ（９５％信頼区間）は劣性モデルにおいて０．７０（０．５１−０．９７）であり、従って、メジャーアレルがＮＡＦＬＤ発症に対して保護的であることがわかった。
なお、rs3794756、rs2255929、rs2297516、rs2248814、rs2297520、rs3794764について、それぞれ、ＳＮＰｓとその前後６０ｂｐを含む配列をそれぞれ、配列番号５〜１０に示す。
【００３１】
【表３】
【００３２】
さらに、rs2297510及びrs1060822について詳細に検討した（表４）。
ＮＡＦＬＤ群をＮＡＳＨおよび単純性脂肪肝（simple stearosis）に分け、rs2297510
及びrs1060822を用いてＮＡＦＬＤ患者−対照相関解析を実施した。rs2297510及びrs1060822におけるアレル１ホモザイゴートの頻度は、ＮＡＳＨ被検者では対照被検者と比較し
て有意に低かった。ＮＡＳＨ患者のアレル１ホモザイゴートの頻度を単純性脂肪肝の被検者と比較した場合には、これらのグループ間での頻度は有意なものではなかった。従って、rs2297510及びrs1060822はＮＡＳＨ及び単純性脂肪肝を合わせたＮＡＦＬＤと有意に相
関していた。
【００３３】
【表４】
【００３４】
また、連鎖不均衡分析により、上記４つのSNPｓ（rs2297510、rs2297511、rs2297512、rs1060822）は絶対的な連鎖不平衡（ｒ2＝１）にあることがわかった（表５）。
【００３５】
【表５】
【００３６】
考察
ＮＡＦＬＤ表現型は、無症状から肝不全の合併症及び肝細胞癌を伴う肝硬変にわたるまで様々である。現在のところ、肝臓の生検がＮＡＦＬＤの診断及び予測を評価し得る唯一の方法である。今回、我々はiNOS遺伝子の多型がＮＡＦＬＤに関連していることを発見し
た。これらの多型はＮＡＦＬＤの診断及び／又は予測の有用な手段となると考えられた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は非アルコール性脂肪肝障害の検査方法およびそれに使用するプローブやプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪肝障害（ＮＡＦＬＤ）は、現在、重要な健康問題のひとつとして認識されている。ＮＡＦＬＤは、単純性脂肪肝から非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に至るまでの幅広い症状を有する。ＮＡＦＬＤは自覚症状がなく、判定が困難である。ＮＡＦＬＤは種々の臨床面（ＡＬＴの上昇、肥満及び２型糖尿病の存在）に基づいて推測されるが、これらの臨床面はＮＡＦＬＤの診断及び予測を確立するには十分ではない。現在のところ、ＮＡＦＬＤとＮＡＳＨの間の境界も肝臓の生検によってのみ判定でき、それ以外の検査方法によっては予測することはできない。そして、肝臓への過剰な脂肪の蓄積は先進国の人口の２０−３０％に観察され、人口の約１−３％が肝臓への過剰な脂肪の蓄積、すなわち脂肪肝からＮＡＳＨへと進展する。
ＮＡＦＬＤの進行には、環境要因と同様に遺伝的要因が重要であると考えられている（非特許文献１〜４）。しかしながら、遺伝学的な研究報告は僅かしかない。
【０００３】
誘導型NO合成酵素（inducible nitric oxide synthase: iNOS）は炎症やストレスによ
って誘導され、フリーラジカルである一酸化窒素を合成し、様々な病態に関与している。iNOSが重度のＮＡＳＨ患者において高発現しているという報告（非特許文献５）や、iNOSのノックアウトマウスが高脂肪食による肝線維化を受けやすいという報告がある（非特許文献６）。また、iNOSの選択的阻害剤がラットの肝硬変モデルにおいて線維化を抑制したという報告もある（非特許文献７）。
しかしながら、iNOS遺伝子の一塩基多型がＮＡＦＬＤと関連するという報告はない。
【非特許文献１】Namikawa C, Shu-Ping Z, Vyselaar JR, Nozaki Y, Nemoto Y, et al. Polymorphisms of microsomal triglyceride transfer protein gene and manganese superoxide dismutase gene in non-alcoholic steatohepatitis. J Hepatol. 2004;40:781-6
【非特許文献２】Gambino R, Cassader M, Pagano G, Durazzo M, Musso G. Polymorphism in microsomal triglyceride transfer protein: a link between liver disease and atherogenic postprandial lipid profile in NASH? Hepatology. 2007;45:1097-107.
【非特許文献３】Tokushige K, Takakura M, Tsuchiya-Matsushita N, Taniai M, Hashimoto E, et al. Influence of TNF gene polymorphisms in Japanese patients with NASH and simple steatosis. J Hepatol. 2007;46:1104-10.
【非特許文献４】Merriman RB, Aouizerat BE, Bass NM. Genetic influences in nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Gastroenterol. 2006;40:S30-3.
【非特許文献５】Garcia-Monzon C, Martin-Perez E, Iacono OL, Fernandez-Bermejo M, Majano PL, Apolinario A, Larranaga E, Moreno-Otero R. Characterization of pathogenic and prognostic factors of nonalcoholic steatohepetitis associated with obesity. J Hepatol 2000;33:716-724
【非特許文献６】Chen Y, Hozawa S, Sawamura S Sato S, Fukuyama N, Tsuji C, Mine T, Okada Y, Tanino R, Osugi Y, Nakazawa H. Defiency of inducible nitric oxide synthase exacerbates hepatic fibrosis in mice fed high-fat diet. Biochem Biophys Res Commun 2005;326:45-51
【非特許文献７】Kikuchi H, Katsuramaki T, Kukita K, Taketani S, Meguro M, Nagayama M, Isobe M, Mizuguchu T, Hirata K. New straregy for the antifibrotic therapy woth oral administration of FR260330 (a slective inducible nitiric oxide synthase inhibitor) in rat experimental liver cirrhosis. Wound Repair Regen 2007;15:881-888
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＮＡＦＬＤの発症や進行を正確に予測するための検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、iNOS遺伝子上に存在する特定の塩基の一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型がＮＡＦＬＤに関連することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）iNOS遺伝子上の、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて非アルコール性脂肪肝障害を検査する方法。
（２）配列番号１〜４のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する非アルコール性脂肪肝障害検査用プローブ。
（３）配列番号１〜４のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる非アルコール性脂肪肝障害検査用プライマー。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の検査方法により、ＮＡＦＬＤの発症リスクや進行を正確に非侵襲的に予測することができるため、ＮＡＦＬＤを予防したり、進行を抑えたりすることができる。また、iNOS遺伝子の多型は、NAFLDになりやすい素因（SNP)をもっている人にiNOS阻害剤を投与
したとき、NAFLD やNASHを発症、あるいは増悪させるといった副作用のリスク判断にも優れた指標となりうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、inducible nitric oxide synthase（iNOS）遺伝子上に存在する
塩基の一塩基多型（SNP；single nucleotide polymorphism）または該塩基と連鎖不平衡
にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析に基づいてＮＡＦＬＤを検査する方法である。ＮＡＦＬＤとは、感染性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、α1−抗トリプシン欠損症、ウィルソン病、薬剤性肝炎またはアルコ
ール性肝炎の患者、及び大量飲酒者以外において、例えば、Sanyal AJ. AGA technical review on nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterol. 2002:123:1705-25の基準によって診断される病態をいう。なお、本発明において、「検査」とは将来、ＮＡＦＬＤになるかどうかを予測するための検査、及びＮＡＦＬＤの程度が悪化する（例えば、ＮＡＳＨに進行する）かどうかを予測するための検査を含む。
【０００９】
iNOS遺伝子としては、ヒトiNOS遺伝子が好ましく、例えば、GenBank Accession No. NM_000625に登録された配列を有する遺伝子を挙げることができる。ただし、該遺伝子は人
種の違いなどによって１又は複数の塩基に置換や欠失等が存在する可能性があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。
【００１０】
ＮＡＦＬＤに関連するiNOS遺伝子の一塩基多型は、以下に示すSNP-1〜SNP-4が挙げられる。
【００１１】
【表１】
【００１２】
表１において、例えば、SNP-1はGenBank Accession No. NT_010799.14の827748番目の
塩基におけるシトシン（C）／チミン（T）の多型を意味し、この塩基がTである場合はＮ
ＡＦＬＤになる確率が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、SNP-1がTT＞TC＞CCの順でＮＡＦＬＤになる確率が高い。SNP-1はiNOS遺伝子のイントロン２１に存在するSNPである。dbSNPはNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。
その他のＳＮＰについても同様であるが、いずれについても右側の塩基がＮＡＦＬＤになりやすい塩基である（例えば、SNP-2の場合、T/CのうちCの場合がＮＡＦＬＤになりや
すく、SNP-3の場合、A/GのうちGの場合がＮＡＦＬＤになりやすく、SNP-4の場合、C/Tの
うちTの場合がＮＡＦＬＤになりやすい）。
なお、SNP-1〜SNP-4について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１〜４に示した。それぞれ６１番目の塩基が多型を有する。
これらの塩基に相当する塩基を本発明においては解析する。ここで、「相当する」とは、ヒトiNOS遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。
【００１３】
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べることによって、ＮＡＦＬＤを検査することができる。検査するＳＮＰの数は、一種類でもよいし、複数（ハプロタイプ解析）でもよい。なお、SNP-1がCであれば他のＳＮＰも左側の塩基（SNP-2＝T、SNP-3＝A、SNP-4＝C）であるというように、上記SNPのタイプは互いに相関するため、一箇所のみを解析することによって
も十分正確なＮＡＦＬＤの予測を行うことができる。なお、iNOS遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５の関係を満たす塩基をいう。
【００１４】
iNOS遺伝子の一塩基多型の解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、細胞、毛髪等の体毛、爪などが挙げられる。一塩基多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００１５】
iNOS遺伝子の一塩基多型の解析は、通常の一塩基多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解
析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００１７】
また、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによっても解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００１８】
また、多型を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによっ
てどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １９９２ Ｊａｎ １； １２（１）： １３９−１４６．）が挙げられる。具体的には、まず、iNOS遺伝子の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００１９】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料をＰＣＲで増幅し、それを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００２０】
ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
【００２１】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、ＮＡＦＬＤを検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、iNOS遺伝子における上記多型部位を含み、ハイブリダイズの有無によって多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１５塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは１５〜３５塩基、より好ましくは２０〜３５塩基である。このようなプローブとして、配列番号１１や配列番号１２のプローブ（SNP-３）、配列番号１３や配列番号１４のプローブ（SNP-４）などが例示される。SNP-1およびSNP-2についても配列番号１および２に基づいて設計できる。
【００２２】
また、プライマーとしては、iNOS遺伝子における上記多型部位を増幅するためのPCRに
用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１５〜５０塩基が好ましく、２０〜３５塩基がより好ましい。このようなプライマーは、例えば、配列番号１〜４において、多型部位の上流または下流の位置に設定することができる。
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記多型塩基の５’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記多型塩基の３’
側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示さ
れる。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記多
型塩基を含む配列を有し、上記多型塩基を３’側に含むプライマーや、上記多型塩基を含む配列の相補配列を有し、上記多型塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメ
ラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２４】
材料と方法
被検者
１１５人の日本人ＮＡＦＬＤ患者（６５人のＮＡＳＨと５０人の単純性脂肪肝）と、４３５人の健常な対照被検者は横浜市立大学病院において募集された。
全ての対照被検者は正常な肝機能を有し、ウィルス性肝炎の感染がなく、アルコール依存症ではないことが確認された。対照被検者は、ＢＭＩ＜２５ｋｇ／ｍ2であり、空腹時
血糖（＜１１０ｍｇ／ｄｌ）、中性脂肪（＜１５０ｍｇ／ｄｌ）、ＨＤＬコレステロール（＞４０ｍｇ／ｄｌ）は正常であり、最高血圧（＜１３０ｍｍＨｇ）および最低血圧（＜８５ｍｍＨｇ）も正常であった。
一方、１１５人全ての患者は、肝生検によってＮＡＦＬＤと確認された。すなわち、肝生検組織は、ヘマトキシリン−エオジン、レチクリン、及びマッソントリクローム染色により染色され、二人の病理学者によって調べられた。ＮＡＦＬＤの診断のための組織学的基準は、細胞の縁への核の移動を伴う、肝細胞の大滴性脂肪化の存在であり（Sanyal AJ.
AGA technical review on nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterol. 2002:123:1705-25）、この基準によってＮＡＦＬＤと診断された。５％を超える肝細胞に大滴性脂肪化が認められた場合、その患者を単純性脂肪肝かあるいはＮＡＳＨに分類した。ＮＡＳＨの診断の基準は、肝細胞の大滴性脂肪化に加え、小葉内炎症、zone３における肝細胞の風船様腫大（あるいは風船様膨化ともいう）、中心静脈周囲繊維化、肝細胞周囲の繊維化の存在である（Matteoni CA, Younossi ZM, Gramlich T, Boparai N, Liu YC, et al. Nonalcoholic fatty liver disease: a spectrum of clinical and pathological severity. Gastroenterology. 1999;116:1413-1419.；Teli MR, James OF, Burt AD, Bennett MK, Day CP. The natural history of nonalcoholic fatty liver: a follow-up study. Hepatology. 1995;22:1714-1719.）。
なお、以下の疾病の患者は本研究からは除外した：感染性肝炎（Ｂ型およびＣ型肝炎、エプスタイン−バーウイルス感染症）、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、α1−抗トリプシン欠損症、ウィルソン病、薬剤
性肝炎、アルコール性肝炎、及び大量飲酒者（現在もしくは過去の１日当りアルコール消費量が２０ｇを超える者）。
被検者としたいずれのＮＡＦＬＤ患者にも、肝代償不全の臨床的所見（肝性脳症、腹水、静脈瘤出血、または正常上限値の２倍を超える血清ビリルビン濃度等）は認められなかった。
全ての被検者から、本研究への参加に先立って書面によるインフォームド・コンセントを得た。研究のプロトコルは、１９７５年のヘルシンキ宣言の倫理指針に準拠しており、横浜市立病院および理化学研究所の研究委員会の承認を得たものである。
【００２５】
臨床および実験室評価
静脈血サンプルは、一晩絶食（１２時間）後の被検者から採取し、血清中のアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、グルコース、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、免疫反応性インスリン、総コレステロール、および
中性脂肪を測定した。全ての実験の生化学的パラメータは自動化分析器で測定した。
【００２６】
ＤＮＡの調製およびＳＮＰのジェノタイピング
ゲノムＤＮＡは、それぞれの血液サンプルからGenomix（Talent SRL, Trieste, Italy
）を用いて調製した。iNOS内でのＳＮＰｓは、ＩＭＳ−ＪＳＴ（医科学研究所−科学技術振興機構）のＳＮＰデータベースから選択した。マイナーアレル頻度が０．１を超え、観測された遺伝子多型（例えばTT、CT、CC）の頻度がハーディ・ワインベルグ平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）から大きく外れなかった１０のＳＮＰｓを選択した（Ｐ＞０．００１）。これらのＳＮＰｓに対してインベーダープローブ（Third Wave Technologies, Madison, WI）を合成し、以前に報告した多重ＰＣＲとインベーダーアッセイの組合せにより、患者及び対照におけるＳＮＰｓをジェノタイピングした（Ohnishi Y, Tanaka T, Ozaki K, Yamada R, Suzuki H, Nakamura Y. A high-throughput SNP typing system for genome-wide association studies. J Hum Genet 2001;46:471-477）。
【００２７】
統計分析
それぞれのＮＡＦＬＤ患者−対照の比較については、χ2テストを用い、３つの異なる
モードにおいて、遺伝子型またはアレルの頻度をＮＡＦＬＤ患者と対照の間で比較した。第１のモード（アレル頻度モード）では、２×２分割表を用いて、ＮＡＦＬＤ患者と対照の間でアレル頻度を比較した。第２のモード（劣性モード）では、２×２分割表を用いて、アレル１に関してホモ接合性である被検者の頻度をその他の被検者と比較し、第３のモード（優性モード）では、２×２分割表を用いて、アレル１を有する被検者（アレル１のホモ接合性及びヘテロ接合性）の頻度をその他の被検者と比較した。オッズ比およびその９５％信頼区間（ＣＩ）はウルフ法（Woolf's method）によって算出した。ハーディ・ワインベルグ平衡は、χ2テストを用いて評価した。ハプロタイプブロックはハプロビュー
３．２（Haploview 3.2）を用いて決定した（Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2005;21:263-265.）。臨床データは平均±標準偏差（ＳＤ）で表した。ＮＡＦＬＤ患者群
と対照群の間の臨床的パラメータは、スチューデントｔテストによって比較した。
【００２８】
結果
ＮＡＦＬＤ患者−対照相関解析
ＮＡＦＬＤ患者群および対照群の臨床データを表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
ＩＭＳ−ＪＳＴのＳＮＰデータベースから、０．１を超えるマイナーアレル頻度を持つiNOS遺伝子内の１０のＳＮＰｓ（rs3794756、rs2255929、rs2297510、rs2297511、rs2297512、rs1060822、rs2297516、rs2248814、rs2297520、rs3794764）を選択し、ＮＡＦＬＤとの相関を調べた。その結果、１０のＳＮＰｓのうち、4つのＳＮＰｓ（rs2297510、rs2297511、rs2297512、rs1060822）に有意な相関がみられ、これらは、劣性モデルにおいて
最も低いＰ値を示した（Ｐ＝０．０００８、表３）。ＯＲ（９５％信頼区間）は劣性モデルにおいて０．７０（０．５１−０．９７）であり、従って、メジャーアレルがＮＡＦＬＤ発症に対して保護的であることがわかった。
なお、rs3794756、rs2255929、rs2297516、rs2248814、rs2297520、rs3794764について、それぞれ、ＳＮＰｓとその前後６０ｂｐを含む配列をそれぞれ、配列番号５〜１０に示す。
【００３１】
【表３】
【００３２】
さらに、rs2297510及びrs1060822について詳細に検討した（表４）。
ＮＡＦＬＤ群をＮＡＳＨおよび単純性脂肪肝（simple stearosis）に分け、rs2297510
及びrs1060822を用いてＮＡＦＬＤ患者−対照相関解析を実施した。rs2297510及びrs1060822におけるアレル１ホモザイゴートの頻度は、ＮＡＳＨ被検者では対照被検者と比較し
て有意に低かった。ＮＡＳＨ患者のアレル１ホモザイゴートの頻度を単純性脂肪肝の被検者と比較した場合には、これらのグループ間での頻度は有意なものではなかった。従って、rs2297510及びrs1060822はＮＡＳＨ及び単純性脂肪肝を合わせたＮＡＦＬＤと有意に相
関していた。
【００３３】
【表４】
【００３４】
また、連鎖不均衡分析により、上記４つのSNPｓ（rs2297510、rs2297511、rs2297512、rs1060822）は絶対的な連鎖不平衡（ｒ2＝１）にあることがわかった（表５）。
【００３５】
【表５】
【００３６】
考察
ＮＡＦＬＤ表現型は、無症状から肝不全の合併症及び肝細胞癌を伴う肝硬変にわたるまで様々である。現在のところ、肝臓の生検がＮＡＦＬＤの診断及び予測を評価し得る唯一の方法である。今回、我々はiNOS遺伝子の多型がＮＡＦＬＤに関連していることを発見し
た。これらの多型はＮＡＦＬＤの診断及び／又は予測の有用な手段となると考えられた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
iNOS遺伝子上の、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて非アルコール性脂肪肝障害を検査する方法。
【請求項２】
配列番号１〜４のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する非アルコール性脂肪肝障害検査用プローブ。
【請求項３】
配列番号１〜４のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる非アルコール性脂肪肝障害検査用プライマー。
【請求項１】
iNOS遺伝子上の、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基における一塩基多型または該塩基と連鎖不平衡にある塩基の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて非アルコール性脂肪肝障害を検査する方法。
【請求項２】
配列番号１〜４のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する非アルコール性脂肪肝障害検査用プローブ。
【請求項３】
配列番号１〜４のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる非アルコール性脂肪肝障害検査用プライマー。
【公開番号】特開２０１０−２２２９３（Ｐ２０１０−２２２９３Ａ）
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１８８５６０（Ｐ２００８−１８８５６０）
【出願日】平成２０年７月２２日（２００８．７．２２）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０５１５５５２８）公立大学法人横浜市立大学 (101)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２２日（２００８．７．２２）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０５１５５５２８）公立大学法人横浜市立大学 (101)
【Ｆターム（参考）】
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