非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素ならびに該酵素を用いる糖質の製造方法
【課題】 中温域に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素ならびに斯かる酵素を用いる糖質の製造方法の提供を課題とする。
【解決手段】 中温域に至適温度を有する新規な非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素ならびに、斯かる非還元性糖質生成酵素及び／又は斯かるトレハロース遊離酵素を還元性澱粉部分分解物に作用させて非還元性糖質を生成させる工程と、該工程で生成した非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質を採取する工程とを含む糖質の製造方法の提供により解決する。
【解決手段】 中温域に至適温度を有する新規な非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素ならびに、斯かる非還元性糖質生成酵素及び／又は斯かるトレハロース遊離酵素を還元性澱粉部分分解物に作用させて非還元性糖質を生成させる工程と、該工程で生成した非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質を採取する工程とを含む糖質の製造方法の提供により解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素ならびに該酵素を用いる糖質の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
トレハロースは２分子のグルコースが還元性基同士で結合してなる二糖類であり、自然界においては、細菌、真菌、藻類、昆虫、甲殻類などに広く分布している。トレハロースは、還元性を示さず、且つ、水分保持作用を有する有用性の高い糖質として古くより知られ、食品、化粧品、医薬品をはじめとする広範な分野での用途が期待されてきた。しかしながらトレハロースは、その効率的な製造方法がかつては確立されていなかったために、その期待の大きさに反して利用の範囲は極めて限られていた。このことから、斯界においては、トレハロースが安価に供給されることが待ち望まれていた。
【０００３】
先に、本発明者らは、鋭意研究の結果、斯かる要望に応える提案のひとつとして、澱粉原料から酵素的にトレハロースを生成させるトレハロースの製造方法を確立した。この方法は、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用を有する非還元性糖質生成酵素と、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間を特異的に加水分解する作用を有するトレハロース遊離酵素とを、還元性澱粉部分分解物に作用させることを特徴とする。これらの酵素ならびに当該酵素を用いるトレハロースを含む糖質の製造方法は、同じ特許出願人による特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８及び特許文献９に開示されている。斯くしてトレハロースの安価な供給への道が拓かれた。
【０００４】
更に、この研究の過程で、斯かる非還元性糖質生成酵素が、従来の還元性澱粉部分分解物の抱える問題点を解消し得る新規な非還元性糖質の製造にも有用であるという独自の知見も見出された。各種デキストリンや各種マルトオリゴ糖などの還元性澱粉部分分解物は、甘味料やエネルギー用糖源などとして有用である一方、その還元力故に反応性に富み、アミノ酸や蛋白質との共存下では褐変しやすく、品質が劣化しやすいことが問題となっていた。斯かる問題を解消し得る唯一の方法として、還元性澱粉部分分解物を高圧水素添加法などにより糖アルコールに変換する方法が知られていた。然るに、斯かる方法の実施には多量の熱量が必要な上、水素を使用することから、安全面を考慮に入れた設備を必要とし、結果として、多大な費用と労力を要することにつながっている。これに対し、上記の非還元性糖質生成酵素は、上記でも示したように、還元性澱粉部分分解物に作用して、末端部にトレハロース構造を有する非還元性の糖質を生成する作用を有しており、この作用は酵素作用故に温和な条件下で進行するものである。この作用を利用して、本発明者らは、当該酵素を用いる、従来の還元性澱粉部分分解物における問題点を解消し得る新規な非還元性糖質の効率的な製造方法の確立にも至った。以上によってトレハロースならびに非還元性糖質の用途開発が各方面で盛んになり、その結果、斯かる糖質の用途が多様化するとともに、その需要は諸種の分野において現在急速に伸びつつある。
【０００５】
このような状況下、トレハロースならびにトレハロース構造を有する非還元性糖質の製造のさらなる効率化への期待が斯界では高まっている。斯かる期待に応える方策のひとつは、様々な至適条件を有する非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素を確立し、製造に使用可能な酵素の幅広い給源を提供することにある。これによって、目的とする糖質の製造に併用される他の酵素の至適条件や製造設備、製造する糖質の最終用途などによって要求される製造条件に応じて、多種の酵素の中から最適のものを選択することができ、より効率的な糖質の製造が可能なものとなる。然るに、現在までに開示された非還元性糖質生成酵素は、その至適温度に基づいて分類すると、約４０℃以下という比較的低温域に至適温度を有する酵素群と、約６０℃以上という比較的高温域に至適温度を有する酵素群とに分けられる。また、現在までに開示されたトレハロース遊離酵素は、同様に分類すると、約４５℃以下という比較的低温域に至適温度を有する酵素群と、約６０℃以上という比較的高温域に至適温度を有する酵素群とに分けられる。これに対して、例えば、５０℃付近というような中温域に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素についてはいずれも未だ開示がない。
【０００６】
澱粉原料からの糖質の製造に用いられる糖質関連酵素において、主要なある種の酵素群は中温域に至適温度を有している。これらの酵素は、上記トレハロースならびに非還元性糖質の製造においても必要とされる場合がある。然るに、中温域に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素は未だ確立されていないために、これら両酵素のいずれか一方又は双方とともに、上記の如き糖質関連酵素を併用する糖質の製造は、未だ充分に効率的と言えるものが確立されてはいない。また、糖質の製造設備や糖質の最終用途によっては、製造における酵素反応の温度として中温域が要求される場合がある。このような場面に対応し得る、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を用いる効率的な糖質の製造方法も未だ確立されていると言える状況にはない。以上のことから、斯界においては、中温域に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素が確立され、斯かる酵素を用いる、非還元性糖質を含む糖質の製造方法が確立されることが待ち望まれている。
【０００７】
【特許文献１】特開平７−１４３８７６号公報
【特許文献２】特開平７−２１３２８３号公報
【特許文献３】特開平７−３２２８８３号公報
【特許文献４】特開平７−２９８８８０号公報
【特許文献５】特開平８−６６１８７号公報
【特許文献６】特開平８−６６１８８号公報
【特許文献７】特開平８−７３５０４号公報
【特許文献８】特開平８−８４５８６号公報
【特許文献９】特開平８−３３６３８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
斯かる状況に鑑み、この発明の第一の課題は、中温域に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素を提供することにある。
【０００９】
この発明の第二の課題は、斯かる非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡを提供することにある。
【００１０】
この発明の第三の課題は、斯かる非還元性糖質生成酵素の製造方法を提供することにある。
【００１１】
この発明の第四の課題は、中温域に至適温度を有するトレハロース遊離酵素を提供することにある。
【００１２】
この発明の第五の課題は、斯かるトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡを提供することにある。
【００１３】
この発明の第六の課題は、斯かるトレハロース遊離酵素の製造方法を提供することにある。
【００１４】
この発明の第七の課題は、斯かる非還元性糖質生成酵素及び／又は斯かるトレハロース遊離酵素の産生能を有する微生物を提供することにある。
【００１５】
この発明の第八の課題は、斯かる非還元性糖質生成酵素及び／又は斯かるトレハロース遊離酵素を用いる、非還元性糖質を含む糖質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記の課題を解決し得る酵素を産生する微生物を土壌より広く検索した。その結果、兵庫県赤穂市の土壌から新たに分離した微生物が上記課題を解決し得る酵素を産生することを見出した。当該微生物より目的とする非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素をそれぞれ単離し、それらの性質を決定したところ、単離されたこれらの酵素は、いずれも中温域に至適温度を有することが確認された。一方、当該微生物を同定したところ、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物であることが確認され、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４と命名された。なお、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４は、平成１０年８月６日付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号、通商産業省工業技術院生命工業技術研究所、特許微生物寄託センターに、微生物受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０を付して受託された。
【００１７】
本発明者らは、さらに鋭意研究を続け、上記で確認された酵素をコードするＤＮＡをアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）より単離し、その塩基配列を解読して、当該酵素のアミノ酸配列を決定した。また、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）ならびに、先に得たＤＮＡを常法にしたがい微生物に導入して得た形質転換体は、いずれも所望量の酵素を産生し得ることが確認された。斯くして得られる両酵素は、いずれも、トレハロースならびにトレハロース構造有する非還元性糖質を含む糖質の中温域での製造に有利に用い得るものであることも確認された。この発明は以上の知見に基づき完成されたものである。
【００１８】
すなわち、この発明は、前記第一の課題を、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成し、中温域に至適温度を有する新規な非還元性糖質生成酵素により解決するものである。
【００１９】
この発明は、前記第二の課題を、斯かる非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００２０】
この発明は、前記第三の課題を、斯かる非還元性糖質生成酵素の産生能を有する微生物を培養し、産生した非還元性糖質生成酵素を培養物から採取することを特徴とする非還元性糖質生成酵素の製造方法により解決するものである。
【００２１】
この発明は、前記第四の課題を、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間を特異的に加水分解し、中温域に至適温度を有する新規なトレハロース遊離酵素により解決するものである。
【００２２】
この発明は、前記第五の課題を、斯かるトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００２３】
この発明は、前記第六の課題を、斯かるトレハロース遊離酵素の産生能を有する微生物を培養し、産生した非還元性糖質生成酵素を培養物から採取することを特徴とするトレハロース遊離酵素の製造方法により解決するものである。
【００２４】
この発明は、前記第七の課題を、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株から選ばれる微生物により解決するものである。
【００２５】
この発明は、前記第八の課題を、当該非還元性糖質生成酵素及び／又は当該トレハロース遊離酵素を還元性澱粉部分分解物に作用させて非還元性糖質を生成させる工程と、該工程で生成した非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質を採取する工程とを含んでなる糖質の製造方法により解決するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素は中温域に至適温度を有していることから、トレハロースをはじめとするトレハロース構造を有する非還元性糖質の中温域・酸性域での製造に有利に用いることができる。とりわけ、中温域・酸性域に至適条件を有する他の糖質関連酵素との併用により糖質を製造する際には、目的の糖質を極めて効率的に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
この発明は、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素ならびに該酵素のいずれか一方又は双方を用いる糖質の製造方法に関するものである。本明細書でいう非還元性糖質生成酵素とは、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用を有する酵素を意味する。本明細書でいうトレハロース遊離酵素とは、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間を特異的に加水分解する作用を有する酵素を意味する。本明細書でいう中温域とは、酵素反応による澱粉原料からの糖質の製造において通常用いられる反応温度における中間域を意味する。因みに、斯かる製造においては、多くの場合、約１０℃乃至約１００℃又はその前後の範囲の種々の反応温度が用いられる。この発明の非還元性糖質生成酵素とは、非還元性糖質生成酵素としての作用を有し、中温域、望ましくは、４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有する酵素、より望ましくは、斯かる至適温度に加え、酸性域に至適ｐＨを有する酵素を意味する。この発明のトレハロース遊離酵素とは、トレハロース遊離酵素としての作用を有し、中温域、望ましくは、４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有する酵素、より望ましくは、斯かる至適温度に加え、酸性域に至適ｐＨを有する酵素を意味する。以上の如きこの発明の非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素はその出所・由来により限定されるものではない。
【００２８】
非還元性糖質生成酵素の活性は以下のようにして測定する。すなわち、基質として１．２５％（ｗ／ｖ）マルトペンタオースを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）４ｍｌに、酵素液１ｍｌを加え５０℃で６０分間保持して反応させた後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させ、その反応液を脱イオン水で正確に１０倍希釈し、その希釈液の還元力をソモギー・ネルソン法で測定する。対照として、予め１００℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素液を用いて同様に測定する。この発明においては、この測定方法を用いて、１分間に１μｍｏｌのマルトペンタオースに相当する還元力を減少させる酵素量を１単位と定義する。また、本明細書でいう当該酵素の至適温度は、この測定方法に準じて求められる。すなわち、反応温度を５０℃を含む適宜の各種温度に設定して、一定量の当該酵素を用いて、この測定方法に準じて種々の温度条件下で反応させ、引き続き、この測定方法にしたがい各反応系における還元力の減少量を求める。そして、求められた還元力の減少量を相互に比較し、最大の値を示した反応系の反応温度が当該酵素の至適温度と求められる。
【００２９】
トレハロース遊離酵素の活性は以下のようにして測定する。すなわち、基質として１．２５％（ｗ／ｖ）マルトトリオシルトレハロース（別名、α−マルトテトラオシル α−Ｄ−グルコシド）を含む２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）４ｍｌに、酵素液１ｍｌを加え５０℃で３０分間保持して反応させた後、ソモギー銅液を加え反応を停止させ、還元力をソモギー・ネルソン法で測定する。対照として、予め１００℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素液を用いて同様に測定する。この発明においては、この測定方法を用いて、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元力を増加させる酵素量を１単位と定義する。また、本明細書でいう当該酵素の至適温度は、この測定方法に準じて求められる。すなわち、反応温度を５０℃を含む適宜の各種温度に設定して、一定量の当該酵素を用いて、この測定方法に準じて種々の温度条件下で反応させ、引き続き、この測定方法にしたがい各反応系における還元力の増加量を求める。そして、求められた還元力の増加量を相互に比較し、最大の値を示した反応系の反応温度が当該酵素の至適温度と求められる。
【００３０】
この発明の非還元性糖質生成酵素を、そのアミノ酸配列に基づいて説明すると、当該酵素は、全体としては配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を、部分アミノ酸配列としては、配列表における配列番号２乃至６に示すアミノ酸配列を含有する場合がある。この発明の非還元性糖質生成酵素には、以上のアミノ酸配列をそっくりそのまま含有する酵素に加えて、斯かるアミノ酸配列から選ばれるいずれかの配列の一部を含有するものであっても、それが非還元性糖質生成酵素としての作用を有し、且つ、上述の如き至適温度を有している限り包含される。斯かるアミノ酸配列の一部を含有する当該酵素のアミノ酸配列としては、斯かるアミノ酸配列において、この発明の非還元性糖質生成酵素としての性質の発現に関わる部分アミノ酸配列ないしはアミノ酸残基を保持しつつ、それ以外の部分の１箇所又は２箇所以上にアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を導入してなるアミノ酸配列を挙げることができる。ここでいうアミノ酸の置換を導入してなるアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列を構成する全アミノ酸の、望ましくは３０％未満、より望ましくは２０％未満のアミノ酸を、それぞれ性質や構造の類似する他のアミノ酸で置換してなるものが挙げられる。互いに性質や構造の類似するアミノ酸のグループとしては、例えば、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸、塩基性アミノ酸であるリジンとアルギニンとヒスチジン、アミド型アミノ酸であるアスパラギンとグルタミン、ヒドロキシアミノ酸であるセリンとトレオニン、分岐アミノ酸であるバリンとロイシンとイソロイシン、などが挙げられる。また、配列番号１乃至６に示すアミノ酸配列から選ばれるいずれかの配列の一部を含有する当該酵素のアミノ酸配列の別の例としては、配列番号１のアミノ酸配列の蛋白質がとる立体構造と実質的に同等の立体構造をとり得る、配列番号１のアミノ酸配列にアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を導入してなるアミノ酸配列を挙げることができる。蛋白質の立体構造は、例えば、目的とするアミノ酸配列と関連するアミノ酸配列を有し立体構造が判明している蛋白質を慣用の蛋白質立体構造データベースから検索し、検索された立体構造を参照して、立体構造の視覚化のための慣用のソフトウエアを用いて予測することができる。以上のようなこの発明の非還元性糖質生成酵素のアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して、通常５７％以上、望ましくは７０％以上、より望ましくは８０％以上の相同性を示す。
【００３１】
この発明の非還元性糖質生成酵素は、上述のように、特定の出所・由来に限定されるものではないが、当該酵素の具体例として、例えば、微生物由来のものを挙げることができる。斯かる微生物の具体例としてはアルスロバクター属に属する細菌、より具体的には、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株が挙げられる。当該変異株は、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタン・スルフォネート、紫外線、トランスポゾンなどの慣用の変異源で常法にしたがい処理して生成する変異株を、中温域、通常は、４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素の産生能を指標として検索することにより得ることができる。アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）由来の当該酵素は、通常、配列表における配列番号１乃至６に示すアミノ酸配列を含有する。アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）の変異株を含むアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）以外の微生物由来の当該酵素は、通常、配列表における配列番号１乃至６のいずれかに示すアミノ酸配列の一部又は全てを含有する。当該酵素の別の具体例としては、非還元性糖質生成酵素としての作用を有し、中温域、通常は、４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有する組換え型蛋白質が挙げられる。斯かる組換え型蛋白質は、後述のように、この発明の非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡに通常の遺伝子工学的手法を適用して得ることができる。組換え型蛋白質としての当該酵素は、通常、配列表における配列番号１乃至６のいずれかに示すアミノ酸配列の一部又は全てを含有する。
【００３２】
以上の如きこの発明の非還元性糖質生成酵素は、下記の性質を有する場合がある。
（１）作用
グルコース重合度３以上の還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。
（２）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と略記する。）により、約７５，０００±１０，０００ダルトン。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約４．５±０．５。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、約５０℃付近。
（５）至適ｐＨ
５０℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．０付近。
（６）温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、約５５℃付近まで安定。
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ約５．０乃至約１０．０の範囲で安定。
この発明の非還元性糖質生成酵素は、後記に詳述する、この発明による当該酵素の製造方法によって所望量を得ることができる。
【００３３】
この発明は、この発明の非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡを提供するものでもあり、斯かるＤＮＡは、組換え型蛋白質としての当該酵素の製造に極めて有用である。本発明による当該ＤＮＡは、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡ全般を包含するものであり、その出所・由来は問わない。斯かるＤＮＡの具体例としては、例えば、配列表における配列番号７に示す塩基配列又は斯かる塩基配列に相補的な塩基配列の一部又は全てを含有するＤＮＡを挙げることができる。配列表における配列番号７に示す塩基配列の全てを有するＤＮＡは、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする。配列表における配列番号７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡとは、それにコードされる蛋白質における、この発明の非還元性糖質生成酵素としての性質の発現に関わるアミノ酸配列ないしはアミノ酸残基に対応する塩基を保持しつつ、それ以外の部分における１箇所又は２箇所以上に塩基の置換、付加及び／又は欠失を導入してなる塩基配列のいずれかを含有するＤＮＡを意味する。本発明による当該ＤＮＡには、それがコードするアミノ酸配列を変更することなく、遺伝子の縮重に基づいて塩基の１又は複数を他の塩基で置換した塩基配列を有するＤＮＡも当然ながら包含される。また、この発明による当該ＤＮＡには、当該非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列に、それ以外の塩基配列、例えば、開始コドン、終止コドン、シャイン・ダルガノ配列などのリボゾーム結合配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、適宜の制限酵素による認識配列、プロモーターやエンハンサーなど遺伝子の発現を調節する塩基配列、ターミネーター等、組換え型蛋白質の産生のために遺伝子工学分野で慣用される諸種の塩基配列から選ばれる１又は複数を連結してなる塩基配列を含有するＤＮＡも包含される。例えば、配列表における配列番号８に示す塩基配列の一部又は全てはリボゾーム結合配列として機能するので、斯る塩基配列をこの発明の非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列の上流に連結してなるＤＮＡは、組換え型蛋白質としての当該酵素の製造に有用である。
【００３４】
本発明による、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡは、上述のように、特定の出所・由来に限定されるものではない。当該ＤＮＡは、当該非還元性糖質生成酵素のアミノ酸配列、例えば、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部をコードし得る塩基配列を含有するＤＮＡとのハイブリダイゼーションに基づいて、諸種の給源からのＤＮＡを検索して得ることができる。斯かる給源の具体例としては、例えば、アルスロバクター属に属する細菌、より望ましくは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株を含む当該非還元性糖質生成酵素の産生能を有する微生物が挙げられる。斯かる検索には、例えば、遺伝子ライブラリーのスクリーニング法や、ＰＣＲ法、さらにはこれらの変法など、斯界においてＤＮＡの検索ないしはクローン化に通常用いられる方法が適宜適用される。検索の結果、所期のハイブリダイゼーションが確認されたＤＮＡを常法にしたがって採取すれば、当該ＤＮＡは得ることができる。斯くして得られる当該ＤＮＡは、通常、配列表における配列番号７に示す塩基配列の一部又は全てを含有する。例えば、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）からは、通常、配列表における配列番号７に示す塩基配列の全てを含有するＤＮＡが得られる。配列表における配列番号７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）以外の、本発明の非還元性糖質生成酵素の産生能を有する微生物を給源として得られるＤＮＡを同様にして検索することにより得ることができる。また、配列表における配列番号７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡは、慣用の突然変異導入法から選ばれる１又は複数の方法により、以上の如きＤＮＡの１箇所又は２箇所以上に塩基の置換、付加及び／又は欠失を導入して得られるＤＮＡより、この発明の非還元性糖質生成酵素としての性質を有する酵素をコードするＤＮＡを選択することによっても得ることができる。また、当該ＤＮＡは、当該非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列、例えば、配列表における配列番号７に示す塩基配列に基づいて、通常の化学合成を適用することによっても得ることができる。いずれにしても、この発明によるＤＮＡは、一旦入手されれば、ＰＣＲ法や、自律複製可能なベクターを用いる方法などを適用することにより、所望のレベルにまで容易に増幅することができる。
【００３５】
この発明による、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡが自律複製可能なベクターに挿入された、組換えＤＮＡとしての形態のものをも包含する。斯かる組換えＤＮＡは、上述のように一旦目的とするＤＮＡが入手できれば、通常一般の遺伝子工学的技術により比較的容易に調製することができる。この発明で用いるベクターは適宜の宿主内で自律複製する性質を有するものであれば何を用いてもよく、斯かるベクターの具体例としては、例えば、大腸菌を宿主として用いる、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３及びλｇｔ・λＣ等、枯草菌を宿主として用いる、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５等、２種類以上の微生物を宿主として用いる、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を挙げることができる。斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体的には、上述のようにして得られる当該ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断した後、当該ＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。ＤＮＡの切断に塩基配列に特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＫｐｎＩ、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、当該ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。連結には、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜の宿主において無限に複製可能である。
【００３６】
この発明による、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡは、さらに、当該ＤＮＡが適宜の宿主に導入された、形質転換体としての形態のものをも包含する。斯かる形質転換体は、通常、上述のようにして得られるＤＮＡないしは組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入して形質転換することにより容易に得ることができる。宿主としては、当該組換えＤＮＡにおけるベクターに応じて選択される、斯界において慣用される微生物や、植物、動物由来の細胞を用いることができる。宿主微生物としては、例えば、大腸菌、枯草菌、アルスロバクター属の微生物をはじめとする細菌の他、放線菌、酵母、真菌などはいずれも有利に用いることができる。宿主微生物にこの発明によるＤＮＡを導入するには、例えば、公知のコンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。なお、この発明による形質転換体において、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡは、宿主の染色体から独立した状態にあっても、斯かる染色体に組み込まれた状態にあってもよい。宿主の染色体に組み込まれた当該ＤＮＡは、宿主内で安定して保持されるという特徴があり、組換え型蛋白質の製造に有利な場合がある。
【００３７】
この発明の非還元性糖質生成酵素は、当該非還元性糖質生成酵素の産生能を有する微生物を培養し、産生された非還元性糖質生成酵素を培養物から採取することを特徴とする、この発明による非還元性糖質生成酵素の製造方法によって所望量を得ることができる。斯かる製造方法で用いる微生物は、当該非還元性糖質生成酵素の産生能を有するものであれば何を用いてもよく、その種類は問わない。斯かる微生物の具体例としては、例えば、アルスロバクター属に属する細菌、より望ましくは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株をはじめとする微生物や、当該非還元性糖質生成酵素をコードするこの発明によるＤＮＡを適宜の宿主微生物に導入して得られる形質転換体を挙げることができる。
【００３８】
この発明による非還元性糖質生成酵素の製造方法における培養で用いる栄養培地は、当該微生物が生育でき、当該非還元性糖質生成酵素を産生し得るものであればよく、特定の組成の培地に限定されるものではない。当該培地は、通常、炭素源及び窒素源を含有し、必要に応じて無機成分が添加される。炭素源としては、当該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、デキストリン、澱粉、澱粉部分分解物、グルコースなどの糖質、糖蜜及び酵母エキス等の糖含有物のほか、グルコン酸やコハク酸などの有機酸はいずれも有用である。炭素源の濃度は、その種類に応じて適宜選択されるが、通常、３０％（ｗ／ｖ）以下、より望ましくは、１５％（ｗ／ｖ）以下の条件が適用される。窒素源は、通常、アンモニウム塩や硝酸塩などの無機窒素化合物の他、尿素や、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物から適宜選択される。無機成分としては、例えば、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、燐酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などから適宜選ばれる塩類が必要に応じて用いられる。
【００３９】
この発明による当該非還元性糖質生成酵素の製造方法における培養条件は、使用する微生物に応じて、それぞれの微生物の生育に適した条件が適宜に選択される。例えば、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）などのアルスロバクター属に属する微生物を使用する場合、培養温度は通常、２０乃至５０℃、望ましくは、２５乃至３７℃、培養ｐＨは通常ｐＨ４乃至１０、望ましくは、ｐＨ５乃至９、培養時間は１０乃至１５０時間から選ばれ、好気条件下で培養される。一方、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡを宿主微生物に導入してなる形質転換体を使用する場合、宿主の微生物種やベクターの種類にもよるが、培養温度は通常、２０乃至６５℃、培養ｐＨは通常、ｐＨ２乃至９、培養時間は通常、１乃至６日間から選ばれ、好気条件下で培養される。斯くして得られる培養物は、通常、主としてその菌体画分に当該酵素を含有する。一方、枯草菌などを宿主として得た形質転換体を培養する場合には、形質転換に用いるベクターの種類によっては、斯かる培養物は、主としてその上清画分に当該酵素を含有する場合もある。以上のようにして得られる培養物における当該酵素の含量は、用いる微生物の種類や培養条件などにもよるが、通常、培養物１ｍｌ当たりに換算すると０．０１乃至１，０００単位である。
【００４０】
以上のようにして得られる培養物から、この発明の非還元性糖質生成酵素を採取する。培養物からの当該酵素の採取の方法は問わないが、例えば、当該酵素活性が主として認められる菌体又は培養上清のいずれかの画分を分離して採取し、さらに必要に応じて、採取した画分を適宜の精製手段に供して、当該非還元性糖質生成酵素を含有する精製された画分を採取する。培養物における菌体と培養上清との分離には、通常の固液分離手段、例えば、遠心分離のほか、プレコートフィルターや平膜、中空糸膜などを用いる濾過などはいずれも有利に適用できる。斯くして分離される菌体含有画分及び培養上清から所望の画分を採取する。採取する画分が菌体含有画分である場合、斯かる菌体を破砕して菌体破砕物としたり、さらには、菌体破砕物からその可溶性画分を上記の固液分離手段によって、その可溶性画分としての菌体抽出液及び菌体不溶性画分に分離し、所望のいずれかの画分を採取することも随意である。菌体不溶性画分は、更に必要に応じて、常法により可溶化して用いることもできる。菌体の破砕には、通常の、超音波処理、界面活性剤処理、リゾチームやグルカナーゼなどの細胞壁破壊酵素による処理、機械的磨砕、機械的圧力の負荷などは、いずれも有利に適用できる。また、菌体の破砕には、培養物そのものを直接これらの菌体の破砕方法のいずれかで処理し、上述の固液分離手段のいずれかを適用して液体画分を採取して菌体抽出液を得ることも有利に実施できる。
【００４１】
以上のようにして得られる画分から当該非還元性糖質生成酵素をさらに精製するには、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動などの糖質関連酵素を精製するための斯界における慣用の方法が適用され、必要に応じてこれらは適宜組合せて適用される。斯様な方法によって分離される画分の中から、非還元性糖質生成酵素の活性測定に基づき、所期の活性を示した画分を回収すれば、所望のレベルにまで精製された当該酵素を採取することができる。例えば、下記に詳述する実施例に記載の方法によれば、当該酵素は電気泳動的に均質な状態にまで精製することができる。以上のようにして、この発明の製造方法によってこの発明の非還元性糖質生成酵素は、培養物、培養上清画分、菌体含有画分、菌体破砕物、菌体抽出液、菌体不溶性画分とその可溶化物、部分精製酵素含有画分、精製酵素含有画分などとして得られる。当該画分は、さらにトレハロース遊離酵素を含有する場合がある。なお、以上のようにして得られるこの発明の非還元性糖質生成酵素は、常法にしたがい固定化して用いることも随意である。斯かる固定化の方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが挙げられる。以上のようにして得られる当該非還元性糖質生成酵素は、いずれも、後述するこの発明の糖質の製造方法を含む各種糖質の製造において有利に用いることができる。とりわけ、当該非還元性糖質生成酵素は、中温域に至適温度を有す上、望ましくは、酸性域に至適ｐＨを有しているので、後述するこの発明のトレハロース遊離酵素の他、酸性域に至適ｐＨを有する澱粉枝切り酵素、中温域で良好な活性を示すシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼなどとの併用による糖質の製造に極めて有用である。
【００４２】
次に、この発明のトレハロース遊離酵素を、そのアミノ酸配列に基づいて説明すると、当該酵素は、全体としては配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列を、部分アミノ酸配列としては、配列表における配列番号１０乃至１６に示すアミノ酸配列を含有する場合がある。この発明のトレハロース遊離酵素には、以上のアミノ酸配列をそっくりそのまま含有する酵素に加えて、斯かるアミノ酸配列から選ばれるいずれかの配列の一部を含有するものであっても、それがトレハロース遊離酵素としての作用を有し、且つ、上述の如き至適温度を有している限り包含される。斯かるアミノ酸配列の一部を含有する当該酵素の具体例としては、斯かるアミノ酸配列において、この発明のトレハロース遊離酵素としての性質の発現に関わるアミノ酸配列ないしはアミノ酸残基を保持しつつ、それ以外の部分の１箇所又は２箇所以上にアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を導入してなるアミノ酸配列のいずれかを含有する酵素を挙げることができる。ここでいうアミノ酸の置換を導入してなるアミノ酸配列としては、例えば、配列番号９に示すアミノ酸配列を構成する全アミノ酸の、望ましくは３０％未満、より望ましくは２０％未満のアミノ酸を、それぞれ性質や構造の類似する他のアミノ酸で置換してなるものが挙げられる。互いに性質や構造の類似するアミノ酸のグループとしては、例えば、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸、塩基性アミノ酸であるリジンとアルギニンとヒスチジン、アミド型アミノ酸であるアスパラギンとグルタミン、ヒドロキシアミノ酸であるセリンとトレオニン、分岐アミノ酸であるバリンとロイシンとイソロイシン、などが挙げられる。また、配列番号９乃至１６に示すアミノ酸配列から選ばれるいずれかの配列の一部を含有する当該酵素のアミノ酸配列の別の例としては、配列番号９のアミノ酸配列の蛋白質がとる立体構造と実質的に同等の立体構造をとり得る、配列番号９のアミノ酸配列にアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を導入してなるアミノ酸配列を挙げることができる。蛋白質の立体構造は、例えば、目的とするアミノ酸配列と関連するアミノ酸配列を有し立体構造が判明している蛋白質を慣用の蛋白質立体構造データベースから検索し、検索された立体構造を参照して、立体構造の視覚化のための慣用のソフトウエアを用いて予測することができる。以上のようなこの発明のトレハロース遊離酵素のアミノ酸配列は、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して、通常６０％以上、望ましくは７０％以上、より望ましくは８０％以上の相同性を示す。
【００４３】
この発明のトレハロース遊離酵素は、上述のように、特定の出所・由来に限定されるものではないが、当該酵素の具体例として、例えば、微生物由来のものを挙げることができる。斯かる微生物の具体例としてはアルスロバクター属に属する細菌、より具体的には、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株が挙げられる。当該変異株は、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタン・スルフォネート、紫外線、トランスポゾンなどの慣用の変異源で常法にしたがい処理して生成する変異株を、中温域、通常は、４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有するトレハロース遊離酵素の産生能を指標として検索することにより得ることができる。アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）由来の当該酵素は、通常、配列表における配列番号９乃至１６に示すアミノ酸配列を含有する。アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）の変異株を含む、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）以外の微生物由来の当該酵素は、通常、配列表における配列番号９乃至１６のいずれかに示すアミノ酸配列の一部又は全てを含有する。当該酵素の別の具体例としては、トレハロース遊離酵素としての作用を有し、中温域、通常は４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有する組換え型蛋白質が挙げられる。斯かる組換え型蛋白質は、後述のように、この発明のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡに慣用の遺伝子工学的手法を適用して得ることができる。組換え型蛋白質としての当該酵素は、通常、配列表における配列番号９乃至１６のいずれかに示すアミノ酸配列の一部又は全てを含有する。
【００４４】
以上の如きこの発明のトレハロース遊離酵素は、下記の理化学的性質を有する場合がある。
（１）作用
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間の結合を特異的に加水分解する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、約６２，０００±５，０００ダルトン。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約４．７±０．５。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、約５０℃乃至約５５℃付近。
（５）至適ｐＨ
５０℃、３０分間反応で、ｐＨ約６．０付近。
（６）温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、約５０℃付近まで安定。
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ約４．５乃至約１０．０の範囲で安定。
この発明のトレハロース遊離酵素は、後記に詳述する、この発明による当該酵素の製造方法によって所望量を得ることができる。
【００４５】
この発明は、この発明のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡを提供するものでもあり、斯かるＤＮＡは、組換え型蛋白質としての当該酵素の製造に極めて有用である。本発明による当該ＤＮＡは、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡ全般を包含するものであり、その出所・由来は問わない。斯かるＤＮＡの具体例としては、例えば、配列表における配列番号１７に示す塩基配列又は斯かる塩基配列に相補的な塩基配列の一部又は全てを含有するＤＮＡを挙げることができる。配列表における配列番号１７に示す塩基配列の全てを有するＤＮＡは、配列番号９に示すアミノ酸配列をコードする。配列表における配列番号１７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡとは、それにコードされる蛋白質における、この発明のトレハロース遊離酵素としての性質の発現に関わるアミノ酸配列ないしはアミノ酸残基に対応する塩基を保持しつつ、それ以外の部分における１箇所又は２箇所以上に塩基の置換、付加及び／又は欠失を導入してなる塩基配列のいずれかを含有するＤＮＡを意味する。本発明による当該ＤＮＡには、それがコードするアミノ酸配列を変更することなく、遺伝子の縮重に基づいて塩基の１又は複数を他の塩基で置換した塩基配列を有するＤＮＡも当然ながら包含される。また、この発明による当該ＤＮＡには、当該トレハロース遊離酵素をコードする塩基配列に、それ以外の塩基配列、例えば、開始コドン、終止コドン、シャイン・ダルガノ配列などのリボゾーム結合配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、適宜の制限酵素による認識配列、プロモーターやエンハンサーなど遺伝子の発現を調節する塩基配列、ターミネーター等、組換え型蛋白質の産生のために遺伝子工学分野で慣用される諸種の塩基配列から選ばれる１又は複数を連結してなる塩基配列を含有するＤＮＡも包含される。例えば、配列表における配列番号８に示す塩基配列の一部又は全てはリボゾーム結合配列として機能するので、斯る塩基配列をこの発明のトレハロース遊離酵素をコードする塩基配列の上流に連結してなるＤＮＡは、組換え型蛋白質としての当該酵素の製造に有用である。
【００４６】
本発明による、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡは、上述のように、特定の出所・由来に限定されるものではない。当該ＤＮＡは、当該トレハロース遊離酵素のアミノ酸配列、例えば、配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列の少なくとも一部をコードし得る塩基配列を含有するＤＮＡとのハイブリダイゼーションに基づいて、諸種の給源からのＤＮＡを検索して得ることができる。斯かる給源の具体例としては、例えば、アルスロバクター属に属する細菌、より望ましくは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株を含む当該トレハロース遊離酵素の産生能を有する微生物が挙げられる。斯かる検索には、例えば、遺伝子ライブラリーのスクリーニング法や、ＰＣＲ法、さらにはこれらの変法など、斯界においてＤＮＡの検索ないしはクローン化に通常用いられる方法が適宜適用される。検索の結果、所期のハイブリダイゼーションが確認されたＤＮＡを常法にしたがって採取すれば、当該ＤＮＡは得ることができる。斯くして得られる当該ＤＮＡは、通常、配列表における配列番号１７に示す塩基配列の一部又は全てを含有する。例えば、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）からは、通常、配列表における配列番号１７に示す塩基配列の全てを含有するＤＮＡが得られる。配列表における配列番号１７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）以外の、本発明のトレハロース遊離酵素の産生能を有する微生物を給源として得られるＤＮＡを同様にして検索することにより得ることができる。また、配列表における配列番号１７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡは、慣用の突然変異導入法から選ばれる１又は複数の方法により、以上の如きＤＮＡの１箇所又は２箇所以上に塩基の置換、付加及び／又は欠失を導入して生成されるＤＮＡより、この発明のトレハロース遊離酵素としての性質を有する酵素をコードするＤＮＡを選択することによっても得ることができる。また、当該ＤＮＡは、当該トレハロース遊離酵素をコードする塩基配列、例えば、配列表における配列番号１７に示す塩基配列に基づいて、通常の化学合成を適用することによっても得ることができる。いずれにしても、この発明によるＤＮＡは、一旦入手されれば、ＰＣＲ法や、自律複製可能なベクターを用いる方法などを適用することにより、所望のレベルにまで容易に増幅することができる。
【００４７】
この発明による、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡが自律複製可能なベクターに挿入された、組換えＤＮＡとしての形態のものをも包含する。斯かる組換えＤＮＡは、上述のように一旦目的とするＤＮＡが入手できれば、通常一般の遺伝子工学的技術により比較的容易に調製することができる。この発明で用いるベクターは適宜の宿主内で自律複製する性質を有するものであれば何を用いてもよく、斯かるベクターの具体例としては、例えば、大腸菌を宿主として用いる、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３及びλｇｔ・λＣ等、枯草菌を宿主として用いる、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５等、２種類以上の微生物を宿主として用いる、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を挙げることができる。斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体的には、上述のようにして得られる当該ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断した後、当該ＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。ＤＮＡの切断に塩基配列に特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＫｐｎＩ、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、当該ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。連結には、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜の宿主において無限に複製可能である。
【００４８】
この発明による、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡは、さらに、当該ＤＮＡが適宜の宿主に導入された、形質転換体としての形態のものをも包含する。斯かる形質転換体は、通常、上述のようにして得られるＤＮＡないしは組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入して形質転換することにより容易に得ることができる。宿主としては、当該組換えＤＮＡにおけるベクターに応じて選択される、斯界において慣用される微生物を用いることができる。斯かる宿主微生物としては、例えば、大腸菌、枯草菌、アルスロバクター属の微生物をはじめとする細菌の他、放線菌、酵母、真菌などはいずれも有利に用いることができる。斯かる宿主にこの発明によるＤＮＡを導入するには、例えば、公知のコンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。この発明による形質転換体において、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡは、宿主微生物の染色体と独立した状態にあっても、斯かる染色体に組み込まれた状態にあってもよい。宿主微生物の染色体に組み込まれた当該ＤＮＡは、宿主内で安定して保持されるという特徴があり、組換え型蛋白質の製造に有利な場合がある。
【００４９】
なお、以上ならびに先述の、組換えＤＮＡ及び形質転換体を含むこの発明によるＤＮＡを得るための個々の方法や、斯かるＤＮＡを用いる組換え型蛋白質の産生の方法はいずれも斯界において慣用となっている。例えば、ジェイ・サムブルックら、『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版（１９８９年）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行には、所期のＤＮＡの取得や、取得したＤＮＡの物質生産への利用のための方法が種々詳述されている。また、例えば、特許第２５７６９７０号明細書には、目的とする遺伝子を欠損させた細菌を宿主として用いる形質転換ＤＮＡの安定化方法が、特開昭６３−１５７９８７号公報には、枯草菌で効率的に所期のＤＮＡを発現させるベクターが、特表平５−５０２１６２号公報には、細菌染色体への所期のＤＮＡへの安定な組み込みの方法が、特表平８−５０６７３１号公報には澱粉分解酵素の遺伝子工学的手法を用いる効率的な産生方法が、特表平９−５００５４３号公報や特表平１０−５０００２４号公報には組換え型蛋白質の効率的な産生のための真菌を用いる宿主−ベクター系がそれぞれ開示されている。この発明においては、以上の如き斯界における慣用の方法はいずれも有利に適用できる。
【００５０】
ところで、斯界においては、所望のＤＮＡが上述のようにして得られている場合、斯かるＤＮＡを適宜の動植物体に導入してなる、いわゆる、トランスジェニック動物やトランスジェニック植物を得ることは慣用となっている。この発明の非還元性糖質生成酵素ないしはトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡにおける、適宜の宿主に導入された形態のＤＮＡには、斯かるトランスジェニック動物ないしトランスジェニック植物も包含される。トランスジェニック動物を得るには、概略としては、先ず、当該酵素をコードするＤＮＡを、必要に応じてプロモーターやエンハンサーなど所望の他のＤＮＡとともに、宿主動物の種に応じて選択される適宜のベクターに組み込み、斯かる組換えＤＮＡをマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法や当該ＤＮＡを含有する組換えウイルスの感染などの方法により、宿主として用いる動物の受精卵や胚性幹細胞に導入する。宿主動物としては、マウス、ラット、ハムスターなど実験動物として汎用される齧歯類のほか、山羊、羊、ブタ、牛などの家畜として常用される哺乳動物も飼育の容易さの点で有用である。次に、このようにして得られる、当該ＤＮＡの導入された細胞を、斯かる細胞と同種の偽妊娠雌動物の卵管内又は子宮内に移植する。その後、自然分娩や帝王切開などにより生まれる新生児の中から、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法などを適用して当該酵素をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック動物を選択すればよい。斯くしてトランスジェニック動物としての形態のこの発明のＤＮＡは得ることができる。なお、トランスジェニック動物に関しては、例えば、村松正實、岡山博人、山本雅編集、『実験医学別冊 新 遺伝子工学ハンドブック』、１９９６年、羊土社発行、２６９乃至２８３頁に、その手法が詳述されている。一方、トランスジェニック植物を得るには、例えば、先ず、植物への感染性を有するアグロバクテリウム属微生物のプラスミドをベクターとして用いて、斯かるベクターに、当該酵素をコードするＤＮＡを組込み、得られる組換えＤＮＡを植物体や植物のプロトプラストに導入したり、重金属の微粒子を当該酵素をコードする塩基配列を含むＤＮＡでコートし、斯かる微粒子をパーティクルガンを用いて植物体や植物のプロトプラストに直接注入する。宿主植物としては種々のものを用いることができるが、通常、ジャガイモ、大豆、小麦、大麦、米、トウモロコシ、トマト、レタス、アルファルファ、リンゴ、桃、メロンなどの食用の植物が用いられる。斯くして得られる植物体ないしは植物のプロトプラストに、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法を適用して所期のＤＮＡを含むものを選択し、プロトプラストの場合にはそれを植物体として再生させれば、トランスジェニック植物としての形態のこの発明のＤＮＡは得ることができる。なお、トランスジェニック植物に関しては、ジェーン・ケイ・セトロウ編集、『ジェネティック・エンジニアリング』、第１６巻、１９９４年、プレナム・プレス発行、９３乃至１１３頁に、その手法が種々概説されている。以上の如きトランスジェニック動物ないしはトランスジェニック植物の形態のこの発明のＤＮＡは、この発明の非還元性糖質生成酵素及び／又はトレハロース遊離酵素の給源として、また、トレハロース又はトレハロース構造有する非還元性糖質を含有する食用の動植物として利用することができる。
【００５１】
この発明のトレハロース遊離酵素は、当該トレハロース遊離酵素の産生能を有する微生物を栄養培地に培養し、産生されたトレハロース遊離酵素を培養物から採取することを特徴とする、この発明によるトレハロース遊離酵素の製造方法によって所望量を得ることができる。斯かる製造方法で用いる微生物は、当該トレハロース遊離酵素の産生能を有するものであればいずれでもよく、その種類は問わない。斯かる微生物の具体例としては、例えば、アルスロバクター属に属する細菌、より望ましくは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株等の微生物や、当該トレハロース遊離酵素をコードするこの発明によるＤＮＡを適宜の宿主微生物に導入して得られる形質転換体を挙げることができる。
【００５２】
この発明によるトレハロース遊離酵素の製造方法で用いる栄養培地は、当該微生物が生育でき、当該トレハロース遊離酵素を産生し得るものであればいずれでもよく、特定の組成の培地に限定されるものではない。当該培地は、通常、炭素源及び窒素源を含有し、必要に応じて無機成分が添加される。炭素源としては、当該微生物が資化できるものであればよく、例えば、デキストリン、澱粉、澱粉部分分解物、グルコースなどの糖質、糖蜜及び酵母エキス等の糖含有物のほか、グルコン酸やコハク酸などの有機酸はいずれも有用である。炭素源の濃度は、その種類に応じて適宜選択されるが、通常、３０％（ｗ／ｖ）以下、より望ましくは、１５％（ｗ／ｖ）以下の条件が適用される。窒素源は、通常、アンモニウム塩や硝酸塩などの無機窒素化合物の他、尿素や、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物から適宜選択される。無機成分としては、例えば、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、燐酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などから適宜選ばれる塩類が必要に応じて用いられる。
【００５３】
この発明による当該トレハロース遊離酵素の製造方法における培養条件は、使用する微生物に応じて、それぞれの微生物の生育に適した条件が適宜に選択される。例えば、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）などのアルスロバクター属に属する微生物を使用する場合、培養温度は通常、２０乃至５０℃、望ましくは、２５乃至３７℃、培養ｐＨは通常ｐＨ４乃至１０、望ましくは、ｐＨ５乃至９、培養時間は１０乃至１５０時間から選ばれ、好気条件下で培養される。一方、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡを宿主微生物に導入してなる形質転換体を使用する場合、宿主の微生物種やベクターの種類にもよるが、培養温度は通常、２０乃至６５℃、培養ｐＨは通常、ｐＨ２乃至９、培養時間は通常、１乃至６日間から選ばれ、好気条件下で培養される。斯くして得られる培養物は、通常、主としてその菌体画分に当該酵素を含有する。一方、枯草菌などを宿主として得た形質転換体を培養する場合には、形質転換に用いるベクターの種類によっては、斯かる培養物は、主としてその上清画分に当該酵素を含有する場合もある。以上のようにして得られる培養物における当該酵素の含量は、用いる微生物の種類や培養条件などにもよるが、通常、培養物１ｍｌ当たりに換算すると０．０１乃至３，０００単位である。
【００５４】
以上のようにして得られる培養物から、この発明のトレハロース遊離酵素を採取する。培養物からの当該酵素の採取の方法は問わないが、例えば、当該酵素活性が主として認められる菌体又は培養上清のいずれかの画分を分離して採取し、さらに必要に応じて、採取した画分を適宜の精製手段に供して、当該トレハロース遊離酵素を含有する精製された画分を採取する。培養物における菌体と培養上清との分離には、通常の固液分離手段、例えば、遠心分離のほか、プレコートフィルターや平膜、中空糸膜などを用いる濾過などはいずれも有利に適用できる。斯くして分離される菌体含有画分及び培養上清から所望の画分を採取する。採取する画分が菌体含有画分である場合、斯かる菌体を破砕して菌体破砕物としたり、さらには、菌体破砕物からその可溶性画分を上記の固液分離手段によって、その可溶性画分としての菌体抽出液及び菌体不溶性画分に分離し、所望のいずれかの画分を採取することも随意である。菌体不溶性画分は、更に必要に応じて、常法により可溶化して用いることもできる。菌体の破砕には、通常の、超音波処理、界面活性剤処理、リゾチームやグルカナーゼなどの細胞壁破壊酵素による処理、機械的磨砕、機械的圧力の負荷などは、いずれも有利に適用できる。また、菌体の破砕には、培養物そのものを直接これらの菌体の破砕方法のいずれかで処理し、上述の固液分離手段のいずれかを適用して液体画分を採取して菌体抽出液を得ることも有利に実施できる。
【００５５】
以上のようにして得られる画分から当該トレハロース遊離酵素をさらに精製するには、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動などの糖質関連酵素を精製するための斯界における慣用の方法が適用され、必要に応じてこれらは適宜組合せて適用される。斯様な方法によって分離される画分の中から、トレハロース遊離酵素の活性測定に基づき、所期の活性を示した画分を回収すれば、所望のレベルにまで精製された当該酵素を採取することができる。例えば、下記に詳述する実施例に記載の方法によれば、当該酵素は電気泳動的に均質な状態にまで精製することができる。以上のようにして、この発明の製造方法によってこの発明のトレハロース遊離酵素は、培養物、培養上清画分、菌体含有画分、菌体破砕物、菌体抽出液、菌体不溶性画分とその可溶化物、部分精製酵素含有画分、精製酵素含有画分などとして得られる。当該画分は、さらに非還元性糖質生成酵素を含有する場合がある。なお、以上のようにして得られるこの発明のトレハロース遊離酵素は、常法にしたがい固定化して用いることも随意である。斯かる固定化の方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが挙げられる。以上のようにして得られる当該トレハロース遊離酵素は、いずれも、後述するこの発明の糖質の製造方法を含む各種糖質の製造において有利に用いることができる。とりわけ、当該トレハロース遊離酵素は、中温域に至適温度を有す上、望ましくは、酸性域に至適ｐＨを有しているので、後述するこの発明のトレハロース遊離酵素の他、酸性域に至適ｐＨを有する澱粉枝切り酵素、中温域で良好な活性を示すシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼなどとの併用による糖質の製造に極めて有用である。
【００５６】
この発明は、以上に説明したこの発明の酵素を用いる、非還元性糖質を含む糖質の製造方法を提供するものでもある。この発明の糖質の製造方法は、当該非還元性糖質生成酵素及び／又は当該トレハロース遊離酵素を還元性澱粉部分分解物に作用させて非還元性糖質を生成させる工程と、該工程で生成した非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質を採取する工程を含んでなる。斯かる糖質の製造方法においては、この発明以外の非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素、さらには他の糖質関連酵素から選ばれる１又は複数を併用することを妨げない。斯かる糖質の製造方法で用いる還元性澱粉部分分解物は、その給源や調製方法によって限定されるものではない。この発明でいう非還元性糖質とは、トレハロースをはじめとするトレハロース構造有する非還元性糖質全般を意味する。
【００５７】
この発明の糖質の製造方法で使用する還元性澱粉部分分解物は、例えば、澱粉又は澱粉質を公知の方法で液化して得ることができる。斯かる澱粉は、とうもろこし澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉であっても、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱粉であってもよい。斯かる澱粉の液化は、通常、澱粉を水に懸濁した澱粉乳、望ましくは、濃度１０％（ｗ／ｗ）以上、より望ましくは、約２０乃至５０％（ｗ／ｗ）の澱粉乳とし、これを機械的処理、酸処理又は酵素処理することにより行われる。液化の程度は比較的低いものが適しており、望ましくは、デキストロース・エクイバレント（以下、「ＤＥ」という。）１５未満、より望ましくは、ＤＥ１０未満のものが好適である。酸で液化する場合には、塩酸、燐酸、蓚酸などを用い、その後、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、炭酸ナトリウムなどで所望のｐＨに中和して利用すればよい。酵素で液化する場合には、α−アミラーゼ、とりわけ、耐熱性の液化型α−アミラーゼの使用が適している。また、斯かる澱粉の液化物に、さらに、α−アミラーゼ、マルトトリオース生成アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ、澱粉枝切り酵素などの糖質関連酵素などをさらに作用させて得られる反応産物を還元性澱粉部分分解物として用いることも随意である。なお、これら澱粉関連酵素の酵素学的性質は、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレイテッド・エンザイムズ』、アミラーゼ研究会編、パーガモン・プレス発行（１９８８年）、１８乃至８１頁、１２５乃至１４２頁に詳述されている。
【００５８】
このようにして得られる還元性澱粉部分分解物に、当該非還元性糖質生成酵素及び／又は当該トレハロース遊離酵素と、必要に応じて、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼやプルラナーゼなどの澱粉枝切り酵素、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−フラクトフラノシダーゼをはじめとする糖質関連酵素から選ばれる１又は複数の酵素とを作用させる。酵素を作用させるにあたっては、用いる酵素が作用し得る条件、通常、ｐＨ４乃至１０、温度２０乃至７０℃、望ましくは、ｐＨ５乃至７、温度３０乃至６０℃から適宜選ばれる条件が採用される。とりわけ、４０℃を越え且つ６０℃未満若しくは４５℃を越え６０℃未満の中温域で、弱酸性乃至酸性の条件下で反応を行うと、より効率的に非還元製糖質を生成せしめることができる。還元性澱粉部分分解物にこれらの酵素を作用させる順序は問わず、いずれかの酵素を先に作用させ、他の酵素を後に作用させることも、用いる複数の酵素を同時に作用させることも随意である。
【００５９】
酵素の使用量は、酵素の作用条件・作用時間や、非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質の最終用途などに応じて適宜選ばれる。通常、還元性澱粉部分分解物の固形分１ｇ当たり、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素の場合、いずれも、約０．０１乃至約１００単位、澱粉枝切り酵素の場合、約１乃至約１０，０００単位、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの場合、約０．０５乃至約５００単位から選ばれる。斯かる酵素作用により得られる反応液は、通常、非還元性糖質としてトレハロース、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロースを含有する。当該製造方法において、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素とともに澱粉枝切り酵素及びシクロマルトデキストリン・グルカノトランフェラーゼを併用する場合、トレハロース及びトレハロース構造有する非還元性糖質のうちの比較的低分子のものが多量に生成されるという特徴がある。
【００６０】
斯くして得られる反応液から非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質を採取する。斯かる工程には、糖質の製造に慣用される方法が適宜適用される。具体的には、例えば、斯かる反応液を濾過、遠心分離などして不要物を除去した後、活性炭を用いる脱色ならびにＨ型・ＯＨ型イオン交換樹脂を用いる脱塩などにより精製し、さらに濃縮して、シラップ状製品として採取する。必要に応じてさらに精製し、高純度の非還元性糖質製品として採取することも随意である。さらなる精製には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを用いる分画、アルコール及びアセトンなどの有機溶媒を用いる分別沈澱、適度な分離性能を有する膜を用いる分離、さらには、酵母での発酵処理、アルカリ処理などにより残存している還元性糖質の分解除去などの方法を１種又は２種以上組み合わせて適用することができる。とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去し、含量を向上させた非還元性糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００６１】
このようにして得られる非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質を、必要により、アミラーゼ、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどや、又はα−グルコシダーゼで分解し、甘味性、還元力などを調整したり、粘性を低下させたりすることも、また、同じ特許出願人による特開平８−７３４８２号公報に開示された方法に準じて、水素添加して残存する還元性糖質を糖アルコールにして還元力を消滅せしめることなどの更なる加工処理を施すことも随意である。とりわけ、当該非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質に対して、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼを作用させることにより容易にトレハロースを製造することができる。即ち、これらの非還元性又は低還元性糖質にグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼを作用させてトレハロースとグルコースとの混合溶液とし、これを、前述の精製方法、例えば、イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーなどにより、グルコースを除去し、トレハロース高含有画分を採取する。これを精製、濃縮して、シラップ状製品を得ることも、更に濃縮して過飽和にし、晶出させて含水結晶又は無水結晶としてのトレハロースを得ることも有利に実施できる。
【００６２】
トレハロース含水結晶を製造するには、例えば、純度約６０％（ｗ／ｗ）以上、固形分濃度約６５乃至９０％（ｗ／ｗ）のトレハロース高含有液を助晶缶にとり、必要に応じて、０．１乃至２０％（ｗ／ｖ）の種晶共存下で、温度９５℃以下、望ましくは１０乃至９０℃の範囲で、攪拌しつつ徐冷し、トレハロース含水結晶を含有するマスキットを製造する。また、減圧濃縮しながら晶析させる連続晶析法を採用することも有利に実施できる。マスキットからトレハロース含水結晶又はこれを含有する含蜜結晶を製造する方法は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すればよい。
【００６３】
分蜜方法の場合には、通常、マスキットをバスケット型遠心分離機にかけ、トレハロース含水結晶と蜜（母液）とを分離し、必要により、該結晶に少量の冷水をスプレーして洗浄することも容易な方法であり、より高純度のトレハロース含水結晶を製造するのに好適である。噴霧乾燥方法の場合には、通常、固形分濃度７０乃至８５％（ｗ／ｗ）、晶出率２０乃至６０％程度のマスキットを高圧ポンプでノズルから噴霧し、結晶粉末が溶解しない温度、例えば、６０乃至１００℃の熱風で乾燥し、次いで３０乃至６０℃の温風で約１乃至２０時間熟成すれば非吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造できる。また、ブロック粉砕方法の場合には、通常、水分１０乃至２０％（ｗ／ｗ）、晶出率１０乃至６０％程度のマスキットを約０．１乃至３日間静置して全体をブロック状に晶出固化させ、これを粉砕又は切削などの方法によって粉末化し乾燥すれば、非吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造できる。
【００６４】
また、無水結晶トレハロースを製造するには、上記のようにして得られる含水結晶トレハロースを、例えば、７０℃乃至１６０℃の範囲の温度で常圧乾燥又は減圧乾燥、より望ましくは、８０℃乃至１００℃の範囲の温度で減圧乾燥するか、あるいは、水分１０％未満の高濃度トレハロース高含有溶液を助晶缶にとり、種晶共存下で５０乃至１６０℃、望ましくは８０乃至１４０℃の範囲で攪拌しつつ無水結晶トレハロースを含有するマスキットを製造し、これを比較的高温乾燥条件下で、例えば、ブロック粉砕、流動造粒、噴霧乾燥などの方法で晶出、粉末化して製造される。
【００６５】
このようにして製造される非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質は、還元性が低く安定であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することもなく、混合した他の素材を損なうことも少ない。また、還元力が低いにもかかわらず低粘度であり、平均グルコース重合度が低いものの場合には、良質で上品な甘味を有している。このようにして得られる糖質は、例えば、同じ特許出願人による特許文献５、特許文献６、特開平８−７３４８２号公報、特開平８−７３５０６号公報、特許文献７、特開平８−３３６３６３号公報、特開平９−９９８６号公報、特開平９−１５４４９３号公報、特開平９−２５２７１９号公報、特開平１０−６６５４０号公報、特開平１０−１６８０９３号公報、特願平９−２３６４４１号明細書、特願平９−２５６２１９号明細書、特願平９−２６８２０２明細書、特願平９−２７４９６２号明細書、特願平９−３２０５１９号明細書、特願平９−３３８２９４号明細書、特願平１０−５５７１０号明細書、特願平１０−６７６２８号明細書、特願平１０−１３４５５３号明細書及び特願平１０−２１４３７５号明細書などに開示されているように、食品分野、化粧品分野及び医薬品分野などにおいて有利に利用することができる。
【００６６】
次に、実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００６７】
＜非還元性糖質生成酵素及び／又はトレハロース遊離酵素を産生する微生物＞
中温域に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素及び／又はトレハロース遊離酵素を産生する微生物を土壌より広く検索したところ、兵庫県赤穂市の土壌から分離した微生物の１株が、目的とする酵素を産生し得るものであると認められた。そこで、この微生物を『微生物の分類と同定』、（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準拠して同定試験に供した。同定試験の結果を以下にまとめた。
【００６８】
細胞形態に関する試験結果を以下に示す。
（１）肉汁寒天培養、３７℃
通常０．４乃至０．５×０．８乃至１．２μｍの桿菌。単独。多形性あり。運動性なし。無胞子。非抗酸性。グラム陽性。
（２）ＥＹＧ寒天培養、３７℃
桿菌−球菌の生育サイクルを示す。
【００６９】
培養的性質に関する試験結果を以下に示す。
（１）肉汁寒天平板培養、３７℃
形状： 円形 大きさは２日間で１乃至２ｍｍ
周縁： 全縁
隆起： 凸状
光沢： 湿光
表面： 平滑
色調： 半透明、クリーム色
（２）肉汁寒天斜面培養、３７℃
生育度： 良好
形状： 糸状
（３）酵母エキス・ペプトン寒天斜面培養、３７℃
生育度： 良好
形状： 糸状
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化しない。
【００７０】
生理学的性質に関する試験結果を以下に示す。
（１）メチルレッド試験： 陰性
（２）ＶＰ試験： 陽性
（３）インドールの生成： 陰性
（４）硫化水素の生成： 陰性
（５）澱粉の加水分解： 陽性
（６）ゼラチンの液化： 陰性
（７）クエン酸の利用： 陽性
（８）無機窒素源の利用： アンモニウム塩は利用しない。硝酸塩は利用する。
（９）色素の生成： なし
（１０）ウレアーゼ： 陰性
（１１）オキシダーゼ： 陰性
（１２）カタラーゼ： 陽性
（１３）生育の範囲： ｐＨ４．５乃至８．０。温度２０乃至５０℃。最適温度３０乃至４５℃。
（１４）酸素に対する態度： 好気性
（１５）炭素源の利用性：
Ｌ−アラビノース： 利用しない
Ｄ−グルコース： 利用する
Ｄ−フラクトース： 利用しない
Ｄ−ガラクトース： 利用しない
Ｌ−ラムノース： 利用しない
Ｄ−キシロース： 利用しない
Ｄ−マンノース： 利用する
ラフィノース： 利用しない
トレハロース： 利用しない
スクロース： 利用しない
マルトース： 利用しない
ラクトース： 利用しない
Ｄ−ズルシトール： 利用しない
Ｄ−マンニトール： 利用しない
グルコン酸： 利用する
こはく酸： 利用する
ニコチン酸： 利用しない
Ｌ−マレイン酸： 利用する
酢酸： 利用する
乳酸： 利用する
（１６）糖からの酸生成：
Ｌ−アラビノース： 僅かに生成する
Ｄ−グルコース： 僅かに生成する
Ｄ−フラクトース： 生成しない
Ｄ−ガラクトース： 僅かに生成する
Ｌ−ラムノース： 僅かに生成する
Ｄ−キシロース： 僅かに生成する
グリセロール： 僅かに生成する
ラフィノース： 生成しない
トレハロース： 僅かに生成する
スクロース： 僅かに生成する
マルトース： 僅かに生成する
ラクトース： 生成しない
（１７）アミノ酸の利用： Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニンいずれも利用しない。
（１８）アミノ酸の脱炭酸： Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニンいずれも脱炭酸しない。
（１９）ＤＮａｓｅ： 陰性
（２０）細胞壁のＮ−アシル型： アセチル
（２１）細胞壁の主要ジアミノ酸： リジン
（２２）ＤＮＡのＧ−Ｃ含量： ７１．２％
【００７１】
以上の菌学的性質を、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー』、第２巻（１９８４年）を参考にして、公知の菌株とその異同を検討した。その結果、上記微生物は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物であることが判明した。本発明者等は、上記微生物を新規微生物アルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｓ３４と命名した。なお、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４は、平成１０年８月６日付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省工業技術院生命工業技術研究所、特許微生物寄託センターに、微生物受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０を付して受託された。
【００７２】
引き続き、上記微生物アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）と、米国の微生物寄託機関『アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）』に寄託されている、アルスロバクター属に属する微生物のタイプ株とのＤＮＡの相同性を、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー』、第１巻（１９８４年）に記載のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法に準じて調べた。すなわち、先ず、後記表１に示す１２種のタイプ株をそれぞれ常法にしたがって培養し、培養物から菌体を採取した。また、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を後記実施例２−１における種培養の方法で培養し、培養物から菌体を採取した。常法にしたがって、それぞれの菌体からＤＮＡを採取し、その２μｇずつを制限酵素ＰｓｔＩで消化した。これら消化物をアマシャム製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』上に個々にスポットした後、常法にしたがい、アルカリ処理の後、中和、乾燥させて、ＤＮＡを該ナイロン膜上に固定した。続いて、先に得た、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）由来のＤＮＡを１μｇとり、これを、制限酵素ＰｓｔＩで消化した。該消化物を、アマシャム製［α−32Ｐ］ｄＣＴＰとファルマシア製ＤＮＡ標識キット『レディー・トゥー・ゴー、ＤＮＡラベリング・キット』とを用いて放射性同位元素で標識し、プローブを得た。このプローブと、先に準備した、ＤＮＡを固定したナイロン膜とを、２０ｍｌのアマシャム製ハイブリダイゼーション用緩衝液『ラピッド・ハイブリダイゼーション・バッファー』中で、６５℃で振盪しつつ、２時間ハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーション後のナイロン膜を常法にしたがって洗浄し、乾燥させた後、常法にしたがいオートラジオグラフィーに供した。オートラジオグラフィーで認められたハイブリダイゼーションのシグナルを、ファルマシア製画像解析システム『イメージ・マスター』を用いて解析し、それぞれのシグナルの強度を数値化した。得られた数値に基づいて、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）由来のＤＮＡのスポットにおけるシグナルの強度を１００とした場合の、タイプ株由来のＤＮＡのスポットにおけるシグナルの相対強度（％）を算出し、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）とそれぞれのタイプ株とのＤＮＡの相同性を示す指標とした。結果を表１に示す。
【００７３】
【表１】
【００７４】
表１に示すように、ハイブリダイゼーションのシグナルの相対強度（％）は、アルスロバクター・ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒａｍｏｓｕｓ）のタイプ株（ＡＴＣＣ １３７２７）由来のＤＮＡのスポットにおいて９８．６％という高値を示した。このことから、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）は、本実施例で用いた１２種のタイプ株のうちでは、アルスロバクター・ラモサス（ＡＴＣＣ １３７２７）と最も高いＤＮＡの相同性を有していることが判明した。以上実施例１に示した結果は、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）がアルスロバクター・ラモサス（ＡＴＣＣ １３７２７）と近縁の新規微生物であることを示している。
【実施例２】
【００７５】
＜非還元性糖質生成酵素＞
【００７６】
＜実施例２−１：酵素の産生＞
１．０％（ｗ／ｖ）デキストリン（松谷化学工業株式会社製、商品名『パインデックス＃４』）、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス０．１、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸一ナトリウム０．１、０．０６％（ｗ／ｖ）燐酸二カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム及び水からなる培地をｐＨ７．０に調整した。５００ｍｌ容三角フラスコにこの培地を約１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃で２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を接種し、温度３７℃、２６０ｒｐｍの撹拌条件下で４８時間培養したものを種培養物とした。
【００７７】
容量３０ｌのファーメンターに、０．０５％（ｗ／ｖ）消泡剤（信越化学工業株式会社製、商品名『ＫＭ−７５』）を含むこと以外は種培養の場合と同組成の培地約２０ｌを入れて殺菌、冷却して温度３７℃とした後、種培養物を培地に対して１％（ｖ／ｖ）の割合で接種し、温度３７℃、ｐＨ５．５乃至７．５に保ちつつ、約７２時間通気攪拌培養した。
【００７８】
得られた培養物の一部を採り、遠心分離して菌体と上清液とに分離した。この菌体を超音波で破砕し遠心分離して上清を回収して菌体抽出液を得た。培養上清と菌体抽出液それぞれの非還元性糖質生成酵素活性を測定したところ、培養上清には当該酵素活性が僅かであったのに対して、菌体抽出液には当該酵素活性が培養物１ｍｌ当たりに換算して約０．１単位認められた。
【００７９】
＜実施例２−２：酵素の精製＞
実施例２−１の方法にしたがって得た培養物約８０ｌを、８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより、湿重量で約８００ｇの菌体を得た。その菌体を２ｌの１０Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し超音波ホモジナイザー（株式会社エスエムテー製、『モデルＵＨ−６００』）で処理した。処理液を、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、その上清約２ｌを回収した。この上清液に飽和度０．７になるように硫安を加え溶解させ、４℃、２４時間放置した後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、硫安塩析物を回収した。得られた硫安塩析物を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して４８時間透析し、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不溶物を除去した。この透析内液約１ｌを、約１．３ｌの陰イオン交換樹脂（三菱化学株式会社製、商品名『セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲル』）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、通液に伴い０Ｍから０．６Ｍまで直線的に濃度が上昇する食塩を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分の非還元性糖質生成酵素活性を測定した。その結果、約０．２Ｍの食塩を含む緩衝液でカラムから溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。
【００８０】
合一した溶液に硫安を濃度１Ｍになるように加え４℃で１２時間放置した後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清を疎水性ゲル（東ソー株式会社製、商品名『ブチルトヨパール６５０Ｍゲル』）を用いる疎水性カラムクロマトグラフィーに供した。ゲル量は約３００ｍｌ、ゲルは使用に先立って、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した。溶出は、通液に伴い１Ｍから０Ｍまで直線的に濃度が下降する硫安を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分の非還元性糖質生成酵素活性を測定した。その結果、約０．７５Ｍの硫安で溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。
【００８１】
合一した溶液を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析内液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清を回収し、約４０ｍｌの陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社製、商品名『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓゲル』）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、通液に伴い０Ｍから０．２Ｍまで直線的に濃度が上昇する食塩水溶液で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分の非還元性糖質生成酵素活性を測定した。その結果、約０．１５Ｍ食塩で溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。合一した液を、引き続き、約３８０ｍｌの『ウルトロゲルＡｃＡ４４ゲル』（フランス、セプラコル社製）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーに供し、顕著な当該酵素活性の認められた画分を回収した。以上の、精製の各工程における非還元性糖質生成酵素の酵素活性量、比活性、収率を表２に示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
上記のゲル瀘過クロマトグラフィーで溶出され回収した溶液を、常法にしたがい、７．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動法に供したところ、単一の蛋白質バンドが確認された。この結果は、上記で得た、ゲル濾過クロマトグラフィーからの溶出物が、電気泳動的に均質な状態にまで精製された、非還元性糖質生成酵素の精製標品であることを意味している。
【００８４】
＜実施例２−３：酵素の性質＞
【００８５】
＜実施例２−３（ａ）：作用＞
基質として、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、またはマルトヘプタオースの２０％水溶液を調製し、それぞれに実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を基質固形分１ｇ当たり２単位の割合で加え、５０℃、ｐＨ６．０で４８時間反応させた。反応産物を脱塩した後、『ＭＣＩゲル ＣＫ０４ＳＳカラム』（三菱化学株式会社製）２本を直列につないだカラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」という。）で分析し、各反応産物中の糖質の組成比を求めた。ＨＰＬＣにおいて、カラムはカラムオーブン『ＣＯ−８０２０』（東ソー株式会社製造）を用いて８５℃に保持し、移動相として水を流速０．４ｍｌ／分で通液し、溶出物を示差屈折計『ＲＩ−８０２０』（東ソー株式会社製造）で分析した。結果を表３に示す。
【００８６】
【表３】
【００８７】
表３の結果から明らかなように、それぞれの反応産物は、残存する基質と新たに生成した非還元性糖質α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロース（表３においては、それぞれ、グルコシルトレハロース、マルトシルトレハロース、マルトトリオシルトレハロース、マルトテトラオシルトレハロース又はマルトペンタオシルトレハロースと表示した。）とからなり、それ以外の糖質はほとんど検出されなかった。各反応産物における非還元性糖質の組成比をその生成率として評価すると、グルコース重合度３のα−グルコシルトレハロースは比較的低いものの、グルコース重合度４以上のα−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース、α−マルトペンタオシルトレハロースはいずれも約８５％以上という高い生成率であることが判明した。なお、グルコース及びマルトースからの非還元性糖質の生成は確認されなかった。
【００８８】
＜実施例２−３（ｂ）：分子量＞
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を、分子量マーカー（日本バイオ・ラド・ラボラトリーズ株式会社製）と並行して、１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いる、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後、分子量マーカーの泳動位置と比較した結果、当該酵素の分子量は約７５，０００±１０，０００ダルトンであった。
【００８９】
＜実施例２−３（ｃ）：等電点＞
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を、両性電解質『アンフォライン』（スウエーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）を２％（ｗ／ｖ）の濃度で含有するポリアクリルアミドゲルを用いる等電点電気泳動法に供した。泳動後、ゲルのｐＨを測定した結果、当該酵素の等電点は約４．５±０．５であった。
【００９０】
＜実施例２−３（ｄ）：至適温度及び至適ｐＨ＞
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を用いて、当該酵素活性に対する温度の影響及びｐＨの影響を調べた。温度の影響を調べる際には、適宜の各温度で反応させたこと以外は活性測定法にしたがって操作した。ｐＨの影響を調べる際には、適宜の２０ｍＭ緩衝液を用いて適宜の各ｐＨ条件下で反応させたこと以外は活性測定法にしたがって操作した。それぞれの操作において、各反応系に認められた基質の還元力の減少量の相対値（％）を算出し、相対酵素活性（％）とした。結果を図１（温度の影響）及び図２（ｐＨの影響）に示す。図１で横軸は反応温度を、図２で横軸は反応ｐＨをそれぞれ示す。図１に示されるように、当該酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で、約５０℃付近であった。図２に示されるように、当該酵素の至適ｐＨは、５０℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．０付近であった。
【００９１】
＜実施例２−３（ｅ）：温度安定性及びｐＨ安定性＞
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を用いて、当該酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、当該酵素の精製標品を２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、適宜の各温度に６０分間保持し、水冷した後、希釈液に残存する酵素活性を活性測定法にしたがい調べた。ｐＨ安定性は、当該酵素の精製標品を適宜の各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液で希釈し、４℃で２４時間保持した後、ｐＨを６に調整し、希釈液に残存する酵素活性を活性測定法に従って調べた。結果を図３（温度安定性）及び図４（ｐＨ安定性）に示す。図３で横軸は酵素の保持温度を、図４で横軸は酵素の保持ｐＨをそれぞれ示す。図３に示されるように、当該酵素は約５５℃付近まで安定であった。図４に示されるように、当該酵素は、ｐＨ約５．０乃至約１０．０の範囲で安定であった。
【００９２】
以上の結果は、実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素が、中温域に至適温度を有するこの発明の非還元性糖質生成酵素であることを示している。
【００９３】
＜実施例２−４：部分アミノ酸配列＞
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品の一部を蒸留水に対して透析した後、蛋白量として約８０μｇをＮ末端アミノ酸配列分析用の試料とした。Ｎ末端アミノ酸配列は、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（米国、アプライドバイオシステムズ社製造）を用い、Ｎ末端から２０残基まで分析した。得られた配列は、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列であった。
【００９４】
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して透析した後、限外濾過膜（東ソー株式会社製、商品名『ウルトラセント−３０』）を用い、常法にしたがい操作して、濃度約１ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。この濃縮液（０．２ｍｌ）に１０μｇのトリプシン試薬（和光純薬株式会社販売、商品名『ＴＰＣＫ−トリプシン』）を加え、３０℃、２２時間反応させて当該酵素を消化し、ペプチドを生成させた。反応産物を、『マイクロボンダスフェアー Ｃ１８カラム』（直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）を用いる逆相ＨＰＬＣに供し、ペプチドを分離した。温度は室温で行った。溶出は、通液に伴い６０分間で２４％（ｖ／ｖ）から４８％（ｖ／ｖ）まで直線的に濃度が上昇するアセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液で、流速０．９ｍｌ／分で行った。カラムから溶出されたペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した２個のペプチド、『Ｓ５』（保持時間約２３分）及び『Ｓ８』（保持時間約３０分）を分取し、それぞれを真空乾燥した後、５０μｌの０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液に溶解した。これらのペプチド溶液をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ２０残基までアミノ酸配列を分析した。ペプチド『Ｓ５』からは、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列が、またペプチド『Ｓ８』からは、配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列が得られた。
【実施例３】
【００９５】
＜非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡ＞
【００９６】
＜実施例３−１：遺伝子ライブラリーの作製と検索＞
培養温度を２７℃とし、培養時間を２４時間としたこと以外は実施例２−１と同様にして、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離し、適量のトリス−ＥＤＴＡ−食塩緩衝液（以下、「ＴＥＳ緩衝液」いう。）（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを当該菌体浮遊液の体積に対し０．０５％（ｗ／ｖ）の割合で加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。この処理物を−８０℃で１時間保持して凍結させた後、ここに、予めＴＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温しておいたＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加えて充分に撹拌し、さらに氷冷後遠心分離して形成された上層を採取した。この上層に、２倍容の冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）の適量に溶解後、７．５μｇのリボヌクレアーゼ及び１２５μｇのプロテアーゼを加え、３７℃で１時間インキュベートした。ここに、クロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて撹拌後、静置して形成される上層を採取し、この上層に冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取した。沈澱を冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで濯ぎ真空乾燥して、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡは、濃度約１ｍｇ／ｍｌとなるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００９７】
上記で得たＤＮＡ溶液を５０μｌとり、ここに制限酵素ＫｐｎＩを約５０単位加え、３７℃で１時間インキュベートしてＤＮＡを消化した。消化したＤＮＡの３μｇと、予め制限酵素ＫｐｎＩで消化しておいたストラタジーン・クローニング・システムズ製プラスミドベクター『ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』０．３μｇとを、宝酒造製『ＤＮＡライゲーション・キット』を用いて、添付の説明書にしたがって操作して連結した。通常のコンピテントセル法にしたがって、この連結産物でストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』株１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。
【００９８】
作製した遺伝子ライブラリーを、常法により調製した、１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、７５ｍｇ／ｌ アンピシリンナトリウム塩及び５０ｍｇ／ｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約５，０００個を、常法にしたがって、アマシャム製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』上に固定した。別途、実施例２−４の方法で明らかにした、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列における第１乃至８番目までのアミノ酸配列に基づき、配列表における配列番号１８に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−32Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブを得た。このプローブを用いて、先に得たナイロン膜上に固定されたコロニーを、通常のコロニー・ハイブリダイゼーション法に従って検索した。ハイブリダイゼーションは、適量のプローブを添加したハイブリダイゼーション液（６×ＳＳＣ、５×デンハルト液及び１００ｍｇ／ｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む）中で、６５℃で１６時間実施した。ハイブリダイゼーションを終えた上記ナイロン膜は、６×ＳＳＣで６５℃で３０分間洗浄した後、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで６５℃で２時間さらに洗浄した。洗浄後のナイロン膜を常法にしたがいオートラジオグラフィーに供して認められたシグナルに基づき、プローブと顕著なハイブリダイゼーションを示したコロニーを選択した。選択した形質転換体を『ＧＹ１』と命名した。
【００９９】
＜実施例３−２：塩基配列の解読＞
この形質転換体『ＧＹ１』を常法にしたがい、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。当該組換えＤＮＡを『ｐＧＹ１』と命名した。組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』を、上記プローブを用いて通常のサザン分析法により分析し、分析結果に基づき制限酵素地図を作成した。作成した制限酵素地図を図５に示す。図５に示すように、組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』は、図中太線で示されるアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）由来の約５，５００塩基対からなる塩基配列を含有し、そして、斯かる組換えＤＮＡは、制限酵素ＥｃｏＲＩによる２箇所の認識部位の間の約４，０００塩基対からなる領域に、図中太線の領域内の黒色矢印で示すように、当該非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列を含有することが判明した。そこで、組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』を制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に消化した後、通常のアガロースゲル電気泳動法を用いて、約４，０００塩基対のＤＮＡ断片を分離精製した。このＤＮＡ断片と、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで消化しておいたストラタジーン・クローニング・システムズ製プラスミドベクター『ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』とを、通常のライゲーション法で連結した。引き続き常法にしたがって、連結産物でストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』株を形質転換した。このようにして得られた形質転換体より常法にしたがい組換えＤＮＡを抽出し、上記の約４，０００塩基対のＤＮＡ断片を含有することを常法にしたがって確認し、『ｐＧＹ２』と命名した。また、ここで得た、組換えＤＮＡ『ｐＧＹ２』が導入されてなる形質転換体を『ＧＹ２』と命名した。
【０１００】
組換えＤＮＡ『ｐＧＹ２』の塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）に由来する、配列表における配列番号１９に示す、３２５２塩基対からなる塩基配列を含有していた。この塩基配列は、配列番号１９に併記したアミノ酸配列をコードし得るものであった。このアミノ酸配列と、実施例２−４の方法で確認された本発明の非還元性糖質生成酵素の部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号４乃至６に示すアミノ酸配列とを比較した。その結果、配列表における配列番号４、５及び６に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１９に併記したアミノ酸配列における第２乃至２１番目、６１９乃至６３８番目及び第９８乃至１１７番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、実施例２で得た本発明の非還元性糖質生成酵素が、配列表における配列番号１９に併記したアミノ酸配列における第２乃至７５７番目のアミノ酸からなる配列、すなわち、配列番号１に示すアミノ酸配列を有することを示している。また、以上のことは、当該酵素はアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）においては、配列表における配列番号１９に示す塩基配列における第７４６乃至３０１３番目の塩基からなる配列、すなわち、配列番号７に示す塩基配列によりコードされていることをも示している。以上に示した組換えＤＮＡ『ｐＧＹ２』の構造は図６にまとめている。
【０１０１】
実施例２の方法で得られるこの発明の非還元性糖質生成酵素の、上記で明らかにしたアミノ酸配列と、非還元性糖質生成酵素としての作用を有する公知の他の酵素のアミノ酸配列とを、ディー・ジェイ・リップマンら、『サイエンス』、２２７巻、１４３５乃至１４４１頁（１９８５年）に記載の方法にしたがって、市販のソフトウェア（商品名『ジェネティクス−マック（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ）、バージョン８』、ソフトウエア開発株式会社販売）を用いて比較し、それぞれ相同性（％）を求めた。公知の酵素として、特許文献３に開示されたアルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｑ３６由来のもの、特許文献３に開示されたリゾビウム・スピーシーズ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）Ｍ−１１由来のもの、特許文献８に開示されたスルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＡＴＣＣ３３９０９由来のもの及び、再公表特許ＷＯ９５／３４６４２号公報に開示されたスルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＫＭ１由来のものを用いた。以上の公知の酵素は上記公報に記載のとおり、いずれも中温域以外に至適温度を有するものである。なお、以上の公知の酵素のアミノ酸配列は、米国国立予防衛生研究所作成のＤＮＡデータベース『ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）』から、それぞれのアクセション番号『Ｄ６３３４３』、『Ｄ６４１２８』、『Ｄ７８００１』及び、『Ｄ８３２４５』により入手することもできる。求められた相同性を表４に示す。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
表４に示すように、実施例２によるこの発明の非還元性糖質生成酵素は、中温域以外に至適温度を有する公知の酵素のうちではリゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来の酵素と最も高い５６．９％というアミノ酸配列の相同性を示した。この結果は、この発明の非還元性糖質生成酵素が、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して５７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を通常は含有することを意味している。また、アミノ酸配列の比較結果から、実施例２による当該酵素と上記の４種類の公知の酵素は、配列表における配列番号２乃び３に示すアミノ酸配列を共通して含有していることが判明した。実施例２による当該酵素は、配列表における配列番号１のアミノ酸配列における第８４乃至８９番目及び第２７７乃至２８２番目のアミノ酸からなる部分に見られるとおり、配列番号２乃び３のアミノ酸配列を部分アミノ酸配列として含有している。上記で比較の対象とした４種類の酵素も、いずれも、それぞれ対応する部分にこれらの部分アミノ酸配列を含有している。実施例２による当該酵素ならびに比較の対象とした酵素がいずれも共通して還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用を有していることから、上記で見出された配列表における配列番号２及び３に示す部分アミノ酸配列が斯かる作用の発現に関わっていることが示唆された。したがってこの結果は、この発明の非還元性糖質生成酵素が、配列表における配列番号２及び３に示すアミノ酸配列を含有するとともに中温域に至適温度を有することにより特徴づけられることを示している。
【０１０４】
＜実施例３−３：ＤＮＡを導入してなる形質転換体＞
配列表における配列番号７に示す塩基酸配列における５′末端及び３′末端の配列に基づいて、それぞれ、配列表における配列番号２０及び２１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを常法にしたがい化学合成した。センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、これらのオリゴヌクレオチドをそれぞれ８５ｎｇと、鋳型として、実施例３−２の方法で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＹ２』を１００ｎｇとを反応管で混合し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ試薬（宝酒造製、商品名『Ｐｙｒｏｂｅｓｔ』）１．２５単位、同試薬に添付された緩衝液５μｌとｄＮＴＰ混合液４μｌをさらに加え、滅菌蒸留水で全量を５０μｌとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの温度制御は、９５℃１分間の後、９８℃２０秒間、７０℃３０秒間及び７２℃４分間を２５サイクル、最後に、７２℃１０分間とした。ＰＣＲ産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収して、約２，３００塩基対のＤＮＡを得た。このＤＮＡと、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、宝酒造製『ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ』を用いて平滑化しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』とを混合し、通常のライゲーション法により連結した。引き続き、連結産物を常法にしたがって操作して、上記約２，３００塩基対のＤＮＡが挿入された組換えＤＮＡを得た。得られた組換えＤＮＡを通常のジデオキシ法により解読したところ、当該組換えＤＮＡは、配列表の配列番号７に示す塩基配列における５′末端及び３′末端に、それぞれ、５′−ＡＴＧ−３′及び５′−ＴＧＡ−３′で示される塩基配列が付加された塩基配列を含有していた。当該組換えＤＮＡを『ｐＧＹ３』と命名した。以上に示した組換えＤＮＡ『ｐＧＹ３』の構造は図７にまとめている。
【０１０５】
組換えＤＮＡ『ｐＧＹ３』を、常法にしたがい予めコンピテント化しておいた大腸菌ＬＥ３９２株（ＡＴＣＣ ３３５７２）に導入して形質転換体を得た。斯かる形質転換体より、通常のアルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡが『ｐＧＹ３』であることを常法にしたがって確認し、当該形質転換体を『ＧＹ３』と命名した。斯くして、この発明の非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡを導入してなる形質転換体を得た。
【０１０６】
＜実施例３−４：ＤＮＡを導入してなる形質転換体＞
ファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』におけるプロモーターの３′末端側下流の塩基配列にもとづいて、配列表における配列番号２２及び２３に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを常法にしたがって合成し、それぞれの５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて燐酸化した。燐酸化した該オリゴヌクレオチドを常法にしたがいアニーリングさせた後、これと、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』とを通常のライゲーション法により連結した。常法にしたがい、連結産物を大腸菌株に導入し、斯る大腸菌株を培養後、培養物から通常のアルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは、プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』と同様の構造を有する一方、そのプロモーターの下流に、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ及びＰｓｔＩによる認識配列をこの順序で含有していた。斯くして得たＤＮＡをプラスミドベクター『ｐＫＫ４』と命名した。
【０１０７】
配列表における配列番号７に示す塩基配列における５′末端及び３′末端部分の配列に基づいて化学合成した、配列番号２４及び２５に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いたこと以外は実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収して、約２，３００塩基対のＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＳｐｅＩで切断した後、これと、制限酵素ＸｂａＩ及びＳｐｅＩであらかじめ切断しておいた上記プラスミドベクター『ｐＫＫ４』とを通常のライゲーション法により連結した。連結産物を常法にしたがって操作して、配列表における配列番号７に示す塩基配列を含有する組換えＤＮＡを得た。斯くして得た組換えＤＮＡを『ｐＫＧＹ１』と命名した。
【０１０８】
引き続いて、ロバート・エム・ホートンらが、『メソッズ・イン・エンザイモロジー』、第２１７巻、２７０乃至２７９頁（１９９３年）に報告している、２段階のＰＣＲを適用する『オーバーラップ・エクステンション法』により、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＹ１』における配列番号７の塩基配列の５′末端上流部分の塩基配列を改変した。先ず、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、プラスミドベクター『ｐＫＫ４』の塩基配列に基づいて常法にしたがい化学合成した、配列表における配列番号２６及び２７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、鋳型として、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＹ１』をそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第１段ＰＣＲ−Ａ」という）。これと並行して、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号７の塩基配列に基づいてそれぞれ常法にしたがい化学合成した、配列表における配列番号２８及び２９に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、鋳型として、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＹ１』をそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第１段ＰＣＲ−Ｂ」という）。第１段ＰＣＲ−Ａの産物としてのＤＮＡを常法にしたがって回収し、約３９０塩基対のＤＮＡを得た。第１段ＰＣＲ−Ｂの産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収して、約９３０塩基対のＤＮＡを得た。
【０１０９】
鋳型として、第１段ＰＣＲ−Ａ及び第１段ＰＣＲ−Ｂの産物として得たＤＮＡの混合物を、センスプライマーとして、第１段ＰＣＲ−Ａで用いた配列表における配列番号２６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号７に示す塩基配列に基づき常法にしたがい化学合成した、配列表における配列番号３０に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第２段ＰＣＲ−Ａ」という）。このＰＣＲの産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収し、約１，３００塩基対のＤＮＡを得た。
【０１１０】
第２段ＰＣＲ−Ａの産物として得たＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩで切断し、生成した約６５０塩基対のＤＮＡを常法にしたがい回収した。一方、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＹ１』を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩで切断し、生成した約６，３００塩基対のＤＮＡを常法にしたがい回収した。これらのＤＮＡを通常のライゲーション法により連結し、連結産物を常法にしたがい操作して、第２段ＰＣＲ−Ａの産物由来の約６５０塩基対のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡを得た。通常のジデオキシ法によりＤＮＡを解読したところ、得られた組換えＤＮＡは、５′末端から３′末端に向けて、配列表における配列番号８に示す塩基配列、５′−ＡＴＧ−３′で表される塩基配列、配列表における配列番号７に示す塩基配列及び、５′−ＴＧＡ−３′で表される塩基配列が、この順序で連結された塩基配列を含有していた。斯くして得た組換えＤＮＡを『ｐＧＹ４』と命名した。なお、組換えＤＮＡ『ｐＧＹ４』の構造は、配列表における配列番号８に示す塩基配列を含有すること以外は、実施例３−３の方法で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＹ３』の構造と実質的に同一である。
【０１１１】
組換えＤＮＡ『ｐＧＹ４』を、宝酒造製の大腸菌コンピテント細胞『ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ』に常法にしたがい導入して形質転換体を得た。斯る形質転換体より通常のアルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡが『ｐＧＹ４』であることを常法にしたがって確認し、当該形質転換体を『ＧＹ４』と命名した。斯くして、この発明の非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡを導入してなる形質転換体を得た。
【実施例４】
【０１１２】
＜非還元性糖質生成酵素の製造＞
【０１１３】
＜実施例４−１：アルスロバクター属微生物を用いる酵素の製造＞
アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を、実施例２−１の方法に準じて、ファーメンターで約７２時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて菌体を濃縮して約８ｌの菌体懸濁液を回収し、更に、その菌体懸濁液を高圧菌体破砕装置（大日本製薬株式会社製、『ミニラボ』）で処理し、含まれる菌体を破砕した。処理液を遠心分離し、約８．５ｌの遠心上清を得た。上清中の非還元性糖質生成酵素活性を測定したところ、培養物１ｍｌ当たりに換算すると、約０．１単位の当該酵素活性が認められた。この上清に飽和度約０．７になるように硫安を加えて硫安塩析し、遠心分離で沈殿物を回収し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析した。得られた透析内液を、イオン交換樹脂量を約２ｌとしたこと以外は、実施例２−２に記載の陰イオン交換樹脂（三菱化学株式会社製、商品名『セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲル』）を用いる方法に準じてイオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、非還元性糖質生成酵素活性画分を回収した。回収した画分を１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、その透析内液を遠心分離して形成された上清を回収した。回収した上清を、ゲル量を約３００ｍｌとしたこと以外は、実施例２−２に記載の疎水性ゲル（東ソー株式会社製、商品名『ブチルトヨパール６５０Ｍゲル』）を用いる方法に準じて疎水性カラムクロマトグラフィーに供し、非還元性糖質生成酵素活性画分を回収した。回収した酵素の至適温度が４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くして、約２，６００単位のこの発明の非還元性糖質生成酵素を得た。
【０１１４】
＜実施例４−２：形質転換体を用いる酵素の製造＞
１６ｇ／ｌ ポリペプトン、１０ｇ／ｌ 酵母エキス及び５ｇ／ｌ 塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実施例３−２の方法で得た形質転換体『ＧＹ２』を接種し、３７℃で約２０時間通気撹拌培養したものを種培養物とした。次に１０ｌ容ファーメンタに、種培養に用いたのと同一組成の培地を種培養の場合に準じて７ｌ調製し、種培養物を７０ｍｌ接種し、約２０時間通気撹拌培養した。得られた培養物から、常法にしたがい、遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波処理して菌体を破砕し、さらに遠心分離により不溶物を除去し、上清を回収して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析内液を回収し、回収した液が非還元性糖質生成酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明の非還元性糖質生成酵素を得た。本実施例における培養においては、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約０．２単位の当該酵素が産生されていた。
【０１１５】
対照として、ストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』株を、アンピシリンを含まないこと以外は上記と同一の組成の培地を用い、上記と同一の条件で培養し、さらに上記と同様に菌体抽出液を得、透析した。得られた透析内液には、非還元性糖質生成酵素活性は認められなかった。このことは、形質転換体『ＧＹ２』がこの発明の非還元性糖質生成酵素の製造に有用であることを示している。
【０１１６】
＜実施例４−３：形質転換体を用いる酵素の製造＞
実施例３−３の方法で得た形質転換体『ＧＹ３』を、１％（ｗ／ｖ）マルトース、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、１％（ｗ／ｖ）『ミースト ＰＩＧ』（アサヒビール食品株式会社製）、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸一水素カリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を用いたこと以外は実施例４−２と同様にして培養した。得られた培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の非還元性糖質生成酵素活性を測定したところ、当該酵素は、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約１５単位産生されていた。この上清を実施例２−２に記載の方法にしたがって精製し、この精製標品が非還元性糖質生成酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明の非還元性糖質生成酵素を得た。
【０１１７】
＜実施例４−４：形質転換体を用いる酵素の製造＞
実施例３−４の方法で得た形質転換体『ＧＹ４』を、２％（ｗ／ｖ）マルトース、４％（ｗ／ｖ）ペプトン、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．１％燐酸二水素ナトリウム、２００μｇ／ｍｌアンピシリン及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を用いたこと以外は実施例４−２と同様にして培養した。得られた培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の非還元性糖質生成酵素活性を測定したところ、当該酵素は、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約６０単位産生されていた。この上清を実施例２−２に記載の方法にしたがって精製し、この精製標品が非還元性糖質生成酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明の非還元性糖質生成酵素を得た。
【実施例５】
【０１１８】
＜トレハロース遊離酵素＞
【０１１９】
＜実施例５−１：酵素の産生＞
実施例２−１の方法にしたがって、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）をファーメンターで培養した。引き続き、実施例２−２の方法にしたがって、得られた培養物の一部を採り、菌体と上清液に分離した後、菌体抽出液を得た。この培養上清と菌体抽出液のトレハロース遊離酵素活性を測定したところ、培養上清には当該酵素活性が僅かであるのに対して、菌体抽出液には当該酵素活性が、培養物１ｍｌ当たりに換算して約０．３単位確認された。
【０１２０】
＜実施例５−２：酵素の精製＞
実施例２−１の方法にしたがって得た培養物約８０ｌを、８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより、湿重量で約８００ｇの菌体を得た。その菌体を２ｌの１０Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し超音波ホモジナイザー（株式会社エスエムテー製、『モデルＵＨ−６００』）で処理した。処理液を、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、その上清約２ｌを回収した。この上清液に飽和度０．７になるように硫安を加え溶解させ、４℃、２４時間放置した後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、硫安塩析物を回収した。得られた硫安塩析物を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して４８時間透析し、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不溶物を除去した。この透析内液約１ｌを、約１．３ｌの陰イオン交換樹脂（三菱化学株式会社製、商品名『セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲル』）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、通液に伴い０Ｍから０．６Ｍまで直線的に濃度が上昇する食塩を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分のトレハロース遊離酵素活性を測定した。その結果、約０．２Ｍの食塩を含む緩衝液でカラムから溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。
【０１２１】
合一した溶液に硫安を濃度１Ｍになるように加えて４℃で１２時間放置した後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清を疎水性ゲル（東ソー株式会社製、商品名『ブチルトヨパール６５０Ｍゲル』）を用いる疎水性カラムクロマトグラフィーに供した。ゲル量は約３００ｍｌとした。ゲルは使用に先立って、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した。溶出は、通液に伴い１Ｍから０Ｍまで直線的に濃度が下降する硫安水溶液で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分のトレハロース遊離酵素活性を測定した。その結果、約０．５Ｍの硫安を含む緩衝液で溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。
【０１２２】
合一した溶液を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析内液を、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清を回収し、約４０ｍｌの陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社製、商品名『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓゲル』）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、通液に伴い０Ｍから０．２Ｍまで直線的に濃度が上昇する食塩水溶液で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分のトレハロース遊離酵素活性を測定した。その結果、約０．１５Ｍの食塩で溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。合一した液を引き続き、約３８０ｍｌの『ウルトロゲルＡｃＡ４４ゲル』（フランス、セプラコル社製）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーに供し、顕著な当該酵素活性の認められた画分を回収した。以上の、精製の各工程におけるトレハロース遊離酵素の酵素活性量、比活性、収率を表５に示す。
【０１２３】
【表５】
【０１２４】
上記のゲル濾過クロマトグラフィーで溶出され回収した溶液を、常法にしたがい、７．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一の蛋白質バンドが確認された。この結果は、上記で得た、ゲル濾過クロマトグラフィーからの溶出物が、電気泳動的に均質な状態にまで精製された、トレハロース遊離酵素の精製標品であることを示している。
【０１２５】
＜実施例５−３：酵素の性質＞
【０１２６】
＜実施例５−３（ａ）：作用＞
後記実施例８−３の方法で得た、トレハロース構造有する非還元性糖質としてのα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース、α−マルトペンタオシルトレハロース及び、還元性糖質としてのマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースのいずれか１種の糖質を固形分濃度２％（ｗ／ｖ）となるよう水に溶解させて基質水溶液を調製した。それぞれの基質水溶液に、実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品を基質固形分１ｇ当たり２単位の割合で加え、５０℃、ｐＨ６．０で４８時間反応させた。反応産物を実施例２−３（ａ）の方法に準じて脱塩した後ＨＰＬＣで分析し、各反応産物中の糖質の組成比を求めた。結果を表６に示す。なお、表６においては、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロースは、それぞれ、グルコシルトレハロース、マルトシルトレハロース、マルトトリオシルトレハロース、マルトテトラオシルトレハロース及びマルトペンタオシルトレハロースと表示した。
【０１２７】
【表６】
【０１２８】
表６の結果から明らかなように、実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質のトレハロース部分とグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解し、トレハロースとグルコース重合度１以上の還元性糖質とを生成した。一方、マルトトリオース以下のマルトオリゴ糖は、トレハロース遊離酵素によって全く作用をうけなかった。
【０１２９】
＜実施例５−３（ｂ）：分子量＞
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品を、分子量マーカー（日本バイオ・ラド・ラボラトリーズ株式会社製）と並行して、１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いる、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後、分子量マーカーの泳動位置と比較した結果、当該酵素の分子量は約６２，０００±５，０００ダルトンであった。
【０１３０】
＜実施例５−３（ｃ）：等電点＞
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品を、常法にしたがい、両性電解質『アンフォライン』（スウエーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）を２％（ｗ／ｖ）の濃度で含有するポリアクリルアミドゲルを用いる等電点電気泳動に供した。泳動後、ゲルのｐＨを測定した結果、当該酵素の等電点は約４．７±０．５であった。
【０１３１】
＜実施例５−３（ｄ）：至適温度及び至適ｐＨ＞
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品を用いて、当該酵素活性に対する温度の影響及びｐＨの影響を調べた。温度の影響を調べる際には、適宜の各温度で反応させたこと以外は活性測定法にしたがって操作した。ｐＨの影響を調べる際には、適宜の２０ｍＭ緩衝液を用いて適宜の各ｐＨ条件下で反応させたこと以外は活性測定法にしたがって操作した。それぞれの操作において、各反応系に認められた還元力の増加量の相対値（％）を算出し、相対酵素活性（％）とした。結果を図８（温度の影響）及び図９（ｐＨの影響）に示す。図８で横軸は反応温度を、図９で横軸は反応ｐＨをそれぞれ示す。図８に示されるように、当該酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で、約５０℃乃至約５５℃付近であった。図９に示されるように、当該酵素の至適ｐＨは、５０℃、３０分間反応でｐＨ約６．０付近であった。
【０１３２】
＜実施例５−３（ｅ）：温度安定性及びｐＨ安定性＞
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品を用いて、当該酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、当該酵素の精製標品を２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、適宜の各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定して調べた。ｐＨ安定性は、当該酵素の精製標品を適宜の各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液で希釈し、４℃で２４時間保持した後、ｐＨを６に調整し、残存する酵素活性を測定して調べた。結果を図１０（温度安定性）及び図１１（ｐＨ安定性）に示す。図１０で横軸は酵素の保持温度を、図１１で横軸は酵素の保持ｐＨをそれぞれ示す。図１０に示されるように、当該酵素は約５０℃付近まで安定であった。図１１に示されるように、当該酵素は、ｐＨ約４．５乃至約１０．０の範囲で安定であった。
【０１３３】
以上の結果は、実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素が、中温域に至適温度を有するこの発明のトレハロース遊離酵素であることを示している。
【０１３４】
＜実施例５−４：部分アミノ酸配列＞
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品の一部を蒸留水に対して透析した後、蛋白量として約８０μｇをＮ末端アミノ酸配列分析用の試料とした。Ｎ末端アミノ酸配列は、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（米国、アプライドバイオシステムズ社製造）を用い、Ｎ末端から２０残基まで分析した。得られた配列は、配列表における配列番号１４に示すアミノ酸配列であった。
【０１３５】
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して透析した後、限外濾過膜（東ソー株式会社製、商品名『ウルトラセント−３０』）を用い、常法にしたがい操作して、濃度約１ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。この濃縮液（０．２ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドペプチダーゼ試薬（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させて当該酵素を消化し、ペプチドを生成させた。反応産物を、『ノバパックＣ１８カラム』（直径４．５ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）を用いる逆相ＨＰＬＣに供し、ペプチドを分離した。温度は室温で行った。溶出は、通液に伴い６０分間で２４％（ｖ／ｖ）から４８％（ｖ／ｖ）まで直線的に濃度が上昇するアセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液で、流速０．９ｍｌ／分で行った。カラムから溶出されたペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した２個のペプチド、『ＲＴ１８』（保持時間約１８分）及び『ＲＴ３３』（保持時間約３３分）を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液に溶解した。これらのペプチド溶液をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ２０残基までアミノ酸配列を分析した。ペプチド『ＲＴ１８』からは、配列表における配列番号１５に示すアミノ酸配列が、またペプチド『ＲＴ３３』からは、配列表における配列番号１６に示すアミノ酸配列が得られた。
【実施例６】
【０１３６】
＜トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡ＞
【０１３７】
＜実施例６−１：遺伝子ライブラリーの作製と検索＞
実施例３−１の方法にしたがって、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）の遺伝子ライブラリーを作製した。引き続き、この遺伝子ライブラリーを、プローブとしてこの発明のトレハロース遊離酵素をコードし得る塩基配列のオリゴヌクレオチドを下記のとおり調製して用いたこと以外は実施例３−１に記載の条件でコロニーハイブリダイゼーション法を実施して検索した。プローブは、実施例５−４で明らかにした、配列表の配列番号１５に示すアミノ酸配列における第１２乃至２０番目のアミノ酸からなる配列に基づいて化学合成した、配列表における配列番号３１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、常法にしたがい［γ−32Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識して調製した。斯かるプローブと顕著なハイブリダイゼーションを示した形質転換体を選択した。
【０１３８】
実施例３−２の方法にしたがって、上記で選択した形質転換体より組換えＤＮＡを抽出し、本実施例におけるプローブを用いて通常のサザン分析法により分析した。分析の結果に基づき作成した制限酵素地図は、図５に示した実施例３−１乃至３−２で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』の場合と一致した。そして、図５に示されるように、本実施例による組換えＤＮＡは、図中斜線矢印で示される、この発明のトレハロース遊離酵素をコードする塩基配列を、制限酵素ＰｓｔＩ及びＫｐｎＩによる認識部位の間の約２，２００塩基対からなる領域内に含有していることが判明した。そこで、以下、組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』を用いて、この発明のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の解読を進めた。
【０１３９】
＜実施例６−２：塩基配列の解読＞
実施例３−２の方法で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』を、常法にしたがい、制限酵素ＰｓｔＩで完全に消化した。消化産物を、通常のアガロースゲル電気泳動法を用いて、生成された約３，３００塩基対のＤＮＡ断片を除去し、生成された約５，２００塩基対のＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を常法にしたがって連結反応に供し、常法にしたがって連結産物でストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌株『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』株を形質転換した。得られた形質転換体より常法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡが、この発明のトレハロース遊離酵素をコードする塩基配列を含む約２，２００塩基対からなる領域を含有することを常法により確認し、『ｐＧＺ２』と命名した。ここで得た、組換えＤＮＡ『ｐＧＺ２』が導入されてなる形質転換体を『ＧＺ２』と命名した。
【０１４０】
組換えＤＮＡ『ｐＧＺ２』の塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）に由来する、配列表における配列番号３２に示す、２，２１８塩基対からなる塩基配列を含有していた。この塩基配列は、配列番号３２に併記したアミノ酸配列をコードし得るものであった。このアミノ酸配列と、実施例５−４で確認されたこの発明のトレハロース遊離酵素の部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号１４乃至１６のアミノ酸配列とを比較した。その結果、配列表における配列番号１４、１５及び１６に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３２に併記したアミノ酸配列における第１乃至２０番目、第２９８乃至３１７番目及び第３１乃至５０番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、実施例５で得たこの発明のトレハロース遊離酵素が、配列表における配列番号３２に併記したアミノ酸配列、すなわち、配列番号９に示すアミノ酸配列を有することを示している。また、以上のことは、当該酵素は、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）においては、配列表における配列番号３２に示す塩基配列における第４７７乃至２，２０１番目の塩基からなる配列、すなわち、配列番号１７に示す塩基配列によりコードされていることをも示している。以上に示した組換えＤＮＡ『ｐＧＺ２』の構造は図１２にまとめている。
【０１４１】
実施例５の方法で得られるこの発明のトレハロース遊離酵素の、上記で明らかにしたアミノ酸配列と、トレハロース遊離酵素としての作用を有する公知の他の酵素のアミノ酸配列とを、実施例３−２に準じて比較し、それぞれ相同性（％）を求めた。公知の酵素として、特許文献４に開示されたアルスロバクター・スピーシーズＱ３６由来のもの、特許文献４に開示されたリゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来のもの、特許文献９に開示されたスルフォロバス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ３３９０９由来のもの及び、再公表特許ＷＯ９５／３４６４２号公報に開示されたスルフォロバス・ソルファタリカスＫＭ１由来のものを用いた。以上の公知の酵素は上記公報に記載のとおり、いずれも中温域以外に至適温度を有するものである。なお、以上の公知の酵素のアミノ酸配列は、米国国立予防衛生研究所作成のＤＮＡデータベース『ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）』から、それぞれのアクセション番号『Ｄ６３３４３』、『Ｄ６４１３０』、『Ｄ７８００１』及び『Ｄ８３２４５』により入手することもできる。求められた相同性を表７に示す。
【０１４２】
【表７】
【０１４３】
表７に示すように、実施例５によるこの発明のトレハロース遊離酵素は、中温域以外に至適温度を有する公知の酵素のうちではアルスロバクター・スピーシーズＱ３６由来の酵素と最も高い５９．９％というアミノ酸配列の相同性を示した。この結果は、この発明のトレハロース遊離酵素が、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を通常は含有することを意味している。また、アミノ酸配列の比較結果から、実施例５による当該酵素と上記の４種類の公知の酵素は、配列表における配列番号１０乃び１３に示すアミノ酸配列を共通して含有していることが判明した。実施例５による当該酵素は、配列表における配列番号９のアミノ酸配列における第１４８乃至１５３番目、第１８５乃至１９０番目、第２４８乃至２５４番目及び第２８５乃至２９１番目のアミノ酸からなる部分に見られるとおり、配列番号１０乃至１３のアミノ酸配列を部分アミノ酸配列として含有している。上記で比較の対象とした４種類の酵素も、いずれも、それぞれ対応する部分にこれらの部分アミノ酸配列を含有している。実施例５による当該酵素ならびに比較の対象とした酵素がいずれも共通して、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間を特異的に加水分解する作用を有していることから、上記で見出された配列表における配列番号１０及び１３に示す部分アミノ酸配列が斯かる作用の発現に関わっていることが示唆された。したがってこの結果は、この発明のトレハロース遊離酵素が、配列表における配列番号１０及び１３に示すアミノ酸配列を含有するとともに中温域に至適温度を有することにより特徴づけられることを示している。
【０１４４】
＜実施例６−３：ＤＮＡを導入してなる形質転換体＞
配列表における配列番号１７に示す塩基配列における５′末端及び３′末端の配列に基づいて、それぞれ、配列表における配列番号３３及び３４に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを常法にしたがい化学合成した。センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、これらのオリゴヌクレオチドそれぞれ８５ｎｇと、鋳型として、実施例６−２の方法で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＺ２』１００ｎｇとを反応管で混合し、他の試薬の添加量は実施例３−３に準じてＰＣＲを行った。ＰＣＲの温度制御は、９５℃１分間の後、９８℃２０秒間、７０℃３０秒間及び７２℃４分間を２５サイクル、最後に７２℃１０分間とした。ＰＣＲ産物におけるＤＮＡを常法にしたがい回収して、約１，７００塩基対のＤＮＡを得た。このＤＮＡと、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、宝酒造製『ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ』を用いて平滑化しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２３３−３』とを混合し、通常のライゲーション法により連結した。引き続き、連結産物を常法にしたがって操作して、上記の約１，７００塩基対のＤＮＡが挿入された組換えＤＮＡを得た。得られた組換えＤＮＡを通常のジデオキシ法により解読したところ、当該組換えＤＮＡは、配列表の配列番号１７に示す塩基配列における３′末端に５′−ＴＧＡ−３′で示される塩基配列が付加された塩基配列を含有していた。当該組換えＤＮＡを『ｐＧＺ３』と命名した。以上に示した組換えＤＮＡ『ｐＧＺ３』の構造は図１３にまとめている。
【０１４５】
組換えＤＮＡ『ｐＧＺ３』を、常法にしたがい予めコンピテント化しておいた大腸菌ＬＥ３９２株（ＡＴＣＣ ３３５７２）に導入して形質転換体を得た。斯かる形質転換体より、通常のアルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡが『ｐＧＺ３』であることを常法にしたがって確認し、当該形質転換体を『ＧＺ３』と命名した。斯くして、この発明のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡを導入してなる形質転換体を得た。
【０１４６】
＜実施例６−４：ＤＮＡを導入してなる形質転換体＞
配列表における配列番号１７に示す塩基配列における５′末端及び３′末端部分の配列に基づいて化学合成した、配列番号３５及び３６に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いたこと以外は実施例６−３と同様にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収して、約１，７００塩基対のＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＳｐｅＩで切断した後、これと、制限酵素ＸｂａＩ及びＳｐｅＩであらかじめ切断しておいた、実施例３−４の方法で得たプラスミドベクター『ｐＫＫ４』とを、通常のライゲーション法により連結した。連結産物を常法にしたがって操作して、配列表における配列番号１７に示す塩基配列を含有する組換えＤＮＡを得た。斯くして得た組換えＤＮＡを『ｐＫＧＺ１』と命名した。
【０１４７】
引き続き、実施例３−４と同様に、『オーバーラップ・エクステンション法』により上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＺ１』における配列番号１７の塩基配列の５′末端上流部分の塩基配列を改変した。先ず、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、プラスミドベクター『ｐＫＫ４』の塩基配列に基づいて常法にしたがい化学合成した、配列表における配列番号２６及び３７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、鋳型として、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＺ１』をそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第１段ＰＣＲ−Ｃ」という）。これと並行して、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号１７の塩基配列に基づいてそれぞれ常法にしたがい化学合成した、配列表における配列番号３８及び３９に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、鋳型として、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＺ１』をそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第１段ＰＣＲ−Ｄ」という）。第１段ＰＣＲ−Ｃの産物としてのＤＮＡを常法にしたがって回収し、約３９０塩基対のＤＮＡを得た。第１段ＰＣＲ−Ｄの産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収して、約５９０塩基対のＤＮＡを得た。
【０１４８】
鋳型として、第１段ＰＣＲ−Ｃ及び第１段ＰＣＲ−Ｄの産物として得たＤＮＡの混合物を、センスプライマーとして、第１段ＰＣＲ−Ｃで用いた配列表における配列番号２６に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、第１段ＰＣＲ−Ｄで用いた配列表における配列番号３９に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第２段ＰＣＲ−Ｂ」という）。このＰＣＲの産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収し、約９５０塩基対のＤＮＡを得た。
【０１４９】
第２段ＰＣＲ−Ｂの産物として得たＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、生成した約２７０塩基対のＤＮＡを常法にしたがい回収した。一方、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＺ１』を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、生成した約６，１００塩基対のＤＮＡを常法にしたがい回収した。これらのＤＮＡを通常のライゲーション法により連結し、連結産物を常法にしたがい操作して、第２段ＰＣＲ−Ｂの産物由来の約２７０塩基対のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡを得た。通常のジデオキシ法によりＤＮＡを解読したところ、得られた組換えＤＮＡは、５′末端から３′末端に向けて、配列表における配列番号８に示す塩基配列、配列表における配列番号１７に示す塩基配列及び、５′−ＴＧＡ−３′で表される塩基配列がこの順序で連結された塩基配列を含有していた。斯くして得た組換えＤＮＡを『ｐＧＺ４』と命名した。なお、組換えＤＮＡ『ｐＧＺ４』の構造は、配列表における配列番号８に示す塩基配列を含有すること以外は、実施例６−３の方法で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＺ３』の構造と実質的に同一である。
【０１５０】
組換えＤＮＡ『ｐＧＺ４』を、宝酒造製の大腸菌コンピテント細胞『ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ』に常法にしたがい導入して形質転換体を得た。斯る形質転換体より通常のアルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡが『ｐＧＺ４』であることを常法にしたがって確認し、当該形質転換体を『ＧＺ４』と命名した。斯くして、この発明のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡを導入してなる形質転換体を得た。
【実施例７】
【０１５１】
＜トレハロース遊離酵素の製造＞
【０１５２】
＜実施例７−１：アルスロバクター属微生物を用いる酵素の製造＞
アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を、実施例２−１の方法にしたがって、ファーメンターで約７２時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて菌体を濃縮して約８ｌの菌体懸濁液を回収し、更に、その菌体懸濁液を高圧菌体破砕装置（大日本製薬株式会社製、『ミニラボ』）で処理して菌体を破砕し、菌体破砕物を得た。この菌体破砕物を遠心分離し、形成された上清約８．５ｌを回収し、菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液のトレハロース遊離酵素活性を測定したところ、培養物１ｍｌ当たりに換算すると、約０．３単位の当該酵素活性が認められた。この菌体抽出液に飽和度約０．７になるように硫安を加えて硫安塩析し、遠心分離で沈殿物を回収し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析した。得られた透析内液を、イオン交換樹脂量を約２ｌとしたこと以外は、実施例５−２に記載の陰イオン交換樹脂（三菱化学株式会社製、商品名『セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲル』）を用いる方法に準じてイオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、トレハロース遊離酵素活性画分を回収した。回収した画分を１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、その透析内液を遠心分離して形成された上清を回収した。回収した上清を、ゲル量を約３５０ｍｌとしたこと以外は、実施例５−２に記載の疎水性ゲル（東ソー株式会社製、商品名『ブチルトヨパール６５０Ｍゲル』）を用いる方法に準じて疎水性カラムクロマトグラフィーに供し、トレハロース遊離酵素活性画分を回収した。回収した酵素が４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域に至適温度を有することと、ｐＨ７未満の酸性域に至適ｐＨを有することを確認した。斯くして、約６，４００単位のこの発明のトレハロース遊離酵素を得た。
【０１５３】
＜実施例７−２：アルスロバクター属微生物を用いる酵素の製造＞
実施例７−１の方法にしたがって、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を培養した。培養物１ｌに対して１００ｍｇのリゾチーム剤（長瀬産業製、商品名『卵白リゾチーム』）を加えた後、通気を停止し、温度・撹拌条件は培養の場合と同じ条件下で培養物を２４時間処理して菌体を破砕した。この菌体破砕物を１０，０００ｒｐｍの連続遠心分離に供して上清を回収し、菌体抽出液を得た。引き続き実施例７−１の方法にしたがって、斯かる菌体抽出液を硫安塩析に供し、塩析物を透析し、透析内液を『セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲル』（三菱化学株式会社製）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供してトレハロース遊離酵素活性画分を回収した。回収した画分は、この発明のトレハロース遊離酵素を約１６，５００単位とともに、この発明の非還元性糖質生成酵素を約５，５００単位含むものであった。斯くして、この発明の非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素を含有する酵素剤を得た。
【０１５４】
＜実施例７−３：形質転換体を用いる酵素の製造＞
１６ｇ／ｌ ポリペプトン、１０ｇ／ｌ 酵母エキス及び５ｇ／ｌ 塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実施例６−２の方法で得た形質転換体『ＧＺ２』を接種し、３７℃で約２０時間通気撹拌培養したものを種培養物とした。次に１０ｌ容ファーメンターに、種培養に用いたのと同一組成の培地を種培養の場合に準じて７ｌ調製し、種培養物を７０ｍｌ接種し、約２０時間通気撹拌培養した。得られた培養物から、常法にしたがい、遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波処理して菌体を破砕し、さらに遠心分離により不溶物を除去し、上清を回収して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析内液を回収し、回収した液がトレハロース遊離酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明のトレハロース遊離酵素を得た。本実施例における培養においては、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約０．５単位の当該酵素が産生されていた。
【０１５５】
対照として、ストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』株を、アンピシリンを含まないこと以外は上記と同一の組成の培地を用い、上記と同一の条件で培養し、さらに上記と同様に菌体抽出液を得、透析した。得られた透析内液には、トレハロース遊離酵素は認められなかった。このことは、形質転換体『ＧＺ２』がこの発明のトレハロース遊離酵素の製造に有用であることを示している。
【０１５６】
＜実施例７−４：形質転換体を用いる酵素の製造＞
実施例６−３の方法で得た形質転換体『ＧＺ３』を、１％（ｗ／ｖ）マルトース、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、１％（ｗ／ｖ）『ミースト ＰＩＧ』（アサヒビール食品株式会社製）、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸一水素カリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を用いたこと以外は実施例７−３と同様にして培養した。得られた培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中のトレハロース遊離酵素活性を測定したところ、当該酵素は、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約７０単位産生されていた。この上清を実施例５−２に記載の方法にしたがって精製し、この精製標品がトレハロース遊離酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明のトレハロース遊離酵素を得た。
【０１５７】
＜実施例７−５：形質転換体を用いる酵素の製造＞
実施例６−４の方法で得た形質転換体『ＧＺ４』を、実施例４−４の方法で培養した。得られた培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中のトレハロース遊離酵素活性を測定したところ、当該酵素は、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約２５０単位産生されていた。この上清を実施例５−２に記載の方法にしたがって精製し、この精製標品がトレハロース遊離酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明のトレハロース遊離酵素を得た。
【実施例８】
【０１５８】
＜糖質の製造＞
【０１５９】
＜実施例８−１：非還元性糖質含有シラップの製造＞
濃度６％（ｗ／ｗ）の馬鈴薯澱粉乳を加熱して糊化した後、ｐＨ４．５、温度５０℃に調整し、澱粉固形分１ｇ当たり２，５００単位のイソアミラーゼ剤（株式会社林原生物化学研究所製）を加えて２０時間反応させた。反応物をｐＨ６．５に調整し、１２０℃で１０分間オートクレーブした後、４０℃まで冷却し、同温度に維持しつつ、これに、澱粉固形分１ｇ当たり１５０単位の液化型α−アミラーゼ剤（ノボ・ノルディスク・インダストリー製、商品名『ターマミール６０Ｌ』）を加えて２０時間反応させた。この反応物を１２０℃で２０分間オートクレーブした後、５３℃まで冷却し、ｐＨ５．７に調整後、同温度に維持しつつ、澱粉固形分１ｇ当たり１単位の実施例４−１の方法で得た非還元性糖質生成酵素を加えて９６時間反応させた。斯くして得た反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過した後、常法により、活性炭を用いる脱色処理及びイオン交換樹脂を用いる脱塩処理により精製し、濃縮して固形分濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシラップ状物を原料澱粉固形分当たり約９０％の収率で得た。
【０１６０】
ＤＥが２４と低く、非還元性糖質としてα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロースを固形分当たりそれぞれ１１．５％、５．７％、２９．５％、３．５％及び２．８％含む本品は、温和で上品な甘味に加えて適度の粘度と保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１６１】
＜実施例８−２：非還元性糖質含有シラップの製造＞
濃度３３％（ｗ／ｗ）のとうもろこし澱粉乳に最終濃度０．１％（ｗ／ｗ）となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．５に調整後、これに、澱粉固形分当たり０．２％（ｗ／ｗ）の液化型α−アミラーゼ剤（ノボ・ノルディスク・インダストリー製、商品名『ターマミール６０Ｌ』）を加えて９５℃で１５分間反応させて澱粉を液化した。この澱粉液化液を１２０℃で１０分間オートクレーブした後、５３℃に冷却し、同温度に維持しつつ、澱粉固形分１ｇ当たり、１単位のシュードモナス・スツッチェリ由来マルトテオラオース生成アミラーゼ剤（株式会社林原生物化学研究所製）及び２単位の実施例４−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素を加えて４８時間反応させた。引き続き反応物に、澱粉固形分１ｇ当たり１５単位のα−アミラーゼ剤（上田化学製、商品名『α−アミラーゼ２Ａ』）を加え、６５℃でさらに２時間反応させた後、１２０℃で１０分間オートクレーブし、次いで冷却した。斯くして得た反応物を濾過した後、常法により、活性炭を用いる脱色処理及びイオン交換樹脂を用いる脱塩処理により精製し、濃縮して固形分濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシラップを原料澱粉固形分当たり約９０％の収率で得た。
【０１６２】
ＤＥが１８．５と低く、非還元性糖質としてα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロースを固形分当たりそれぞれ９．３％、３０．１％、０．９％、０．８％及び０．５％含む本品は、温和で上品な甘味に加えて適度の粘度と保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１６３】
＜実施例８−３：非還元性糖質の製造＞
マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース（いずれも株式会社林原生物化学研究所製）のいずれかの還元性澱粉部分分解物の２０％（ｗ／ｗ）水溶液それぞれに、還元性澱粉部分分解物の固形分１ｇ当たり２単位ずつの実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を加え、５０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させ、それぞれの還元性澱粉部分分解物から、非還元性糖質としてのα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロースを生成させた。これら反応物を、それぞれ、常法に従って、加熱による酵素失活、瀘過、脱色、脱塩、濃縮した後、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（Ｎａ＋型、架橋度４％、東京有機化学工業株式会社製、商品名『ＸＴ−１０１６』）を用いるカラムクロマトグラフィーに供し、反応物中の糖質を分画した。このカラムクロマトグラフィーにおいて、カラム内温度は５５℃、糖液の樹脂に対する負荷量は約５％（ｖ／ｖ）とし、移動相として５５℃の温水をＳＶ０．１３の流速で通液した。カラムからの溶出液の内、固形分重量当たりの上記のいずれかの非還元性糖質の組成比が９５％（ｗ／ｗ）以上の溶出液をそれぞれ採取した。採取したそれぞれの溶出液に水酸化ナトリウムを０．１Ｎになるように加え、１００℃で２時間加熱して残存する還元性糖質を分解した。斯くして得た反応物を、それぞれ、活性炭にて脱色し、Ｈ型及びＯＨ型のイオン交換樹脂で脱塩し、濃縮、真空乾燥の後、粉砕して、純度９９．０％以上のα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロース粉末を得た。
【０１６４】
高純度の非還元性糖質を含み、ＤＥの極めて低いこれらの製品は、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１６５】
＜実施例８−４：非還元性糖質を含む結晶性粉末の製造＞
マルトペンタオース（株式会社林原生物化学研究所製）の２０％（ｗ／ｗ）水溶液を調製した。この水溶液に、マルトペンタオース固形分１ｇ当たり２単位の実施例４−３の方法で得た非還元性糖質生成酵素を加え、５０℃で４８時間反応させた。この反応によりマルトペンタオースの約７５％がα−マルトトリオシルトレハロースに変換された。この反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、瀘過後、常法により、活性炭を用いる脱色処理及びイオン交換樹脂を用いる脱塩処理により精製した。
【０１６６】
その後、６０℃で減圧しながら固形分濃度約７５％（ｗ／ｗ）まで濃縮し、種結晶としてα−マルトトリオシルトレハロース結晶を約０．０１％（ｗ／ｖ）加え、２４時間放置した後、晶出したα−マルトトリオシルトレハロース結晶を遠心分離で回収し、さらに少量の冷水で洗浄した後、常法により乾燥して非還元性糖質含量の高い結晶性粉末を原料固形分当たり約５０％の収率で得た。
【０１６７】
ＤＥが０．２未満と極めて低く、非還元性糖質としてα−マルトトリオシルトレハロースを固形分当たり９９．０％（ｗ／ｗ）以上含む低甘味の本品は、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１６８】
＜実施例８−５：含水結晶トレハロースの製造＞
トウモロコシ澱粉を３０％（ｗ／ｗ）になるように水中に懸濁し、懸濁液に炭酸カルシウムを０．１％（ｗ／ｗ）加えた。ｐＨ６．０に調整後、澱粉固形分当たり０．２％（ｗ／ｗ）の液化型α−アミラーゼ剤（ノボ・ノルディスク・インダストリー製、商品名『ターマミール６０Ｌ』）を加え、９５℃で１５分間反応させて澱粉を糊化・液化した。得られた澱粉液化液を１２０℃で３０分間オートクレーブした後、５１℃に冷却し、ｐＨ５．７に調整後、同温度で維持しつつ、澱粉固形分１ｇ当たり、３００単位のイソアミラーゼ剤（株式会社林原生物化学研究所製）、２単位のシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ剤（株式会社林原生物化学研究所製）、２単位の実施例４−１の方法で得た非還元性糖質生成酵素及び、１０単位の実施例７−１の方法で得たトレハロース遊離酵素を加え、６４時間反応させた。この反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させた後、５０℃に調整し、澱粉固形分１ｇ当たり１０単位のグルコアミラーゼ剤（ナガセ生化学工業製、商品名『グルコチーム』）を加えて２４時間反応させた。斯くして得た反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、瀘過後、常法により、活性炭を用いる脱色処理及びイオン交換樹脂を用いる脱塩処理により精製し、固形分濃度約６０％（ｗ／ｗ）まで濃縮して、固形分当たりトレハロースを８４．１％（ｗ／ｗ）含むシラップを得た。このシラップを減圧下で固形分濃度約８３％（ｗ／ｗ）にまで濃縮し、助晶機にとり、シラップの容量に対して約０．１％（ｗ／ｖ）の含水結晶トレハロースを種晶として加えて約２時間撹拌助晶した。晶出したトレハロースを遠心分離で回収し、少量の水で洗い蜜を除き、４５℃の温風で乾燥させ、純度約９９％のトレハロースの含水結晶を原料澱粉当たり約５０％の収率で得た。
【０１６９】
本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１７０】
＜実施例８−６：無水結晶トレハロースを含む結晶性粉末の製造＞
実施例８−５の方法でトレハロースの含水結晶を調製し、これを、ジャケット付き回転式真空乾燥機を用いて減圧乾燥した。減圧乾燥は、温度９０℃、気圧−３００乃至−３５０ｍｍＨｇの条件で、約７時間行った。減圧乾燥後、温度を常温に、気圧を常圧に戻して、製品を回収し、製品重量当たり無水結晶トレハロースを９０％（ｗ／ｗ）以上含む結晶性粉末を得た。
【０１７１】
無水結晶トレハロースには含水物の水分を吸収し、トレハロース含水結晶に変わる性質がある。無水結晶トレハロース含量の高い本品は、水分を含有している飲食物、化粧品及び医薬品をはじめとする各種組成物ならびにそれら組成物の原料及び中間加工物を脱水又は乾燥するための安全で無害な脱水剤として有用である。また、まろやかで上品な甘味を有する本品は、甘味剤、呈味改善剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品及び医薬品をはじめとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１７２】
＜実施例８−７：トレハロース含有シラップの製造＞
濃度２７％（ｗ／ｗ）のタピオカ澱粉乳に、最終濃度０．１％（ｗ／ｗ）となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ６．０に調整し、これに、澱粉固形分当たり０．２％（ｗ／ｗ）の液化型α−アミラーゼ剤（ノボ・ノルディスク・インダストリー製、商品名『ターマミール６０Ｌ』）を加え、９５℃で１５分間反応させ、澱粉を糊化・液化した。この澱粉液化液を２ｋｇ／ｃｍ2で３０分間オートクレーブした後、５３℃に冷却し、ｐＨ５．７に調整し、同温度に維持しつつ、これに、澱粉固形分１ｇ当たり、５００単位のプルラナーゼ剤（ノボ・ノルディスク・インダストリー製、商品名『プロモザイム２００Ｌ』）、１単位のシュードモナス・スツッチェリ由来のマルトテトラオース生成アミラーゼ剤（株式会社林原生物化学研究所製）及び、約２単位の非還元性糖質生成酵素とともに約６単位のトレハロース遊離酵素を含有する実施例７−２の方法で得た酵素剤を加えて７２時間反応させた。斯くして得た反応物を９７℃で１５分間保った後、冷却し、瀘過して濾液を採取した。この濾液を、常法により、活性炭を用いる脱色処理及びイオン交換樹脂を用いる脱塩処理により精製し、更に濃縮して固形分濃度７０％（ｗ／ｗ）のシラップを、原料固形分当たり約９２％の収率で得た。
【０１７３】
本品は固形分当たりトレハロースを３５．２％、α−グルコシルトレハロースを３．４％、グルコースを１．８％、マルトースを３７．２％、マルトトリオースを９．１％およびマルトテトラオース以上のオリゴ糖を１３．３％含有しており、まろやかで上品な甘味、低い還元性、低い粘度、適度の保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１７４】
＜実施例８−８：無水結晶トレハロースを含む結晶性粉末の製造＞
アミロース（株式会社林原生物化学研究所製、商品名『ＥＸ−Ｉ』）１重量部を水１５重量部に加熱溶解し、温度５３℃、ｐＨ５．７に調整した。これに、アミロース固形分１ｇ当たり、２単位の実施例４−３の方法で得た非還元性糖質生成酵素及び６単位の実施例７−４の方法で得たトレハロース遊離酵素を加え、４８時間反応させた。反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させ、５０℃、ｐＨ５．０に調整後、グルコアミラーゼ剤（ナガセ生化学工業製、商品名『グルコチーム』）をアミロース固形分１ｇ当たり１０単位加え、さらに４０時間反応させた。斯くして得た反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過した後、常法により、活性炭を用いる脱色及びイオン交換樹脂を用いる脱塩により精製し、固形分濃度約６０％（ｗ／ｗ）まで濃縮して固形分当たりトレハロースを８２．１％含むシラップを得た。
【０１７５】
このシラップを実施例８−３と同様にしてカラムクロマトグラフィーに供し、固形分当たりトレハロースを約９８％（ｗ／ｗ）含む画分を採取し、減圧下で加熱しながら固形分濃度約８５％（ｗ／ｗ）まで濃縮してシラップを得た。このシラップに、その容量に対して約２％（ｗ／ｖ）の無水結晶トレハロースを種晶として加え、攪拌しながら１２０℃で５分間混合後、プラスチック製バットに分注し、１００℃で減圧乾燥して結晶化させた。その後、バットからブロック状物を取出し、切削機により粉砕したところ、結晶化率約７０％の無水結晶トレハロースを含む水分含量約０．３％（ｗ／ｗ）の固状物を、原料アミロース固形分当たり約７０％の収率で得た。この固状物を常法にしたがって粉砕し、無水結晶トレハロースを含む結晶性粉末を得た。
【０１７６】
無水結晶トレハロースには含水物の水分を吸収し、トレハロース含水結晶に変わる性質があるので、無水結晶トレハロース含量の高い本品は、水分を含有している飲食物、化粧品及び医薬品をはじめとする各種組成物ならびにそれら組成物の原料及び中間加工物を脱水又は乾燥するための安全で無害な脱水剤として有用である。また、まろやかで上品な甘味を有する本品は、甘味剤、呈味改善剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品及び医薬品をはじめとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１７７】
以上説明したように、この発明は、中温域に至適温度を有し、望ましくは、酸性域に至適ｐＨを有する、新規な非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素の発見に基づくものである。この発明の両酵素は、例えば、斯かる酵素を産生する微生物の培養によりその所望量を得ることができる。また、この発明による両酵素をコードするそれぞれのＤＮＡは、組換え型蛋白質としての両酵素の製造に極めて有用であり、当該ＤＮＡを導入してなる形質転換体を用いる場合にも、この発明の両酵素の所望量を得ることができる。この発明の両酵素は、トレハロースをはじめとするトレハロース構造を有する非還元性糖質の中温域・酸性域での製造に有利に用いることができる。とりわけ、中温域・酸性域に至適条件を有する他の糖質関連酵素との併用により糖質を製造する際には、目的の糖質を極めて効率的に得ることができる。しかも、この発明の両酵素はアミノ酸配列まで明らかにされた酵素であり、飲食物や医薬品への配合使用を前提とする当該非還元性糖質の製造に安心して使用し得る。斯くして得られる非還元性糖質ないしは斯かる非還元性糖質を含む低還元性糖質は、温和で上品な甘味を有し、そして、何よりも、糖質中の還元性基を有しないか又は大幅に低減しているので、着色や変質の懸念なく飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる実益がある。
【０１７８】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な発明であると言える。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の非還元性糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の非還元性糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の非還元性糖質生成酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の非還元性糖質生成酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図５】本発明による組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』の制限酵素地図である。図中太線はアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の塩基配列を示す。太線の領域内の黒色矢印は本発明の非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列を、斜線矢印は本発明のトレハロース遊離酵素をコードする塩基配列をそれぞれ示す。
【図６】本発明による組換えＤＮＡ『ｐＧＹ２』の制限酵素地図である。図中太線はアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の塩基配列を示す。太線の領域内の黒色矢印は本発明の非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列示す。
【図７】本発明による組換えＤＮＡ『ｐＧＹ３』の制限酵素地図である。図中黒色矢印は、本発明の非還元性糖質生成酵素をコードするアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の塩基配列を示す。
【図８】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図９】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１０】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１１】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１２】本発明による組換えＤＮＡ『ｐＧＺ２』の制限酵素地図である。図中太線はアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の塩基配列を示す。太線の領域内の斜線矢印は本発明のトレハロース遊離酵素をコードする塩基配列示す。
【図１３】本発明による組換えＤＮＡ『ｐＧＺ３』の制限酵素地図である。図中斜線矢印は、本発明のトレハロース遊離酵素をコードするアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の塩基配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素ならびに該酵素を用いる糖質の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
トレハロースは２分子のグルコースが還元性基同士で結合してなる二糖類であり、自然界においては、細菌、真菌、藻類、昆虫、甲殻類などに広く分布している。トレハロースは、還元性を示さず、且つ、水分保持作用を有する有用性の高い糖質として古くより知られ、食品、化粧品、医薬品をはじめとする広範な分野での用途が期待されてきた。しかしながらトレハロースは、その効率的な製造方法がかつては確立されていなかったために、その期待の大きさに反して利用の範囲は極めて限られていた。このことから、斯界においては、トレハロースが安価に供給されることが待ち望まれていた。
【０００３】
先に、本発明者らは、鋭意研究の結果、斯かる要望に応える提案のひとつとして、澱粉原料から酵素的にトレハロースを生成させるトレハロースの製造方法を確立した。この方法は、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用を有する非還元性糖質生成酵素と、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間を特異的に加水分解する作用を有するトレハロース遊離酵素とを、還元性澱粉部分分解物に作用させることを特徴とする。これらの酵素ならびに当該酵素を用いるトレハロースを含む糖質の製造方法は、同じ特許出願人による特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８及び特許文献９に開示されている。斯くしてトレハロースの安価な供給への道が拓かれた。
【０００４】
更に、この研究の過程で、斯かる非還元性糖質生成酵素が、従来の還元性澱粉部分分解物の抱える問題点を解消し得る新規な非還元性糖質の製造にも有用であるという独自の知見も見出された。各種デキストリンや各種マルトオリゴ糖などの還元性澱粉部分分解物は、甘味料やエネルギー用糖源などとして有用である一方、その還元力故に反応性に富み、アミノ酸や蛋白質との共存下では褐変しやすく、品質が劣化しやすいことが問題となっていた。斯かる問題を解消し得る唯一の方法として、還元性澱粉部分分解物を高圧水素添加法などにより糖アルコールに変換する方法が知られていた。然るに、斯かる方法の実施には多量の熱量が必要な上、水素を使用することから、安全面を考慮に入れた設備を必要とし、結果として、多大な費用と労力を要することにつながっている。これに対し、上記の非還元性糖質生成酵素は、上記でも示したように、還元性澱粉部分分解物に作用して、末端部にトレハロース構造を有する非還元性の糖質を生成する作用を有しており、この作用は酵素作用故に温和な条件下で進行するものである。この作用を利用して、本発明者らは、当該酵素を用いる、従来の還元性澱粉部分分解物における問題点を解消し得る新規な非還元性糖質の効率的な製造方法の確立にも至った。以上によってトレハロースならびに非還元性糖質の用途開発が各方面で盛んになり、その結果、斯かる糖質の用途が多様化するとともに、その需要は諸種の分野において現在急速に伸びつつある。
【０００５】
このような状況下、トレハロースならびにトレハロース構造を有する非還元性糖質の製造のさらなる効率化への期待が斯界では高まっている。斯かる期待に応える方策のひとつは、様々な至適条件を有する非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素を確立し、製造に使用可能な酵素の幅広い給源を提供することにある。これによって、目的とする糖質の製造に併用される他の酵素の至適条件や製造設備、製造する糖質の最終用途などによって要求される製造条件に応じて、多種の酵素の中から最適のものを選択することができ、より効率的な糖質の製造が可能なものとなる。然るに、現在までに開示された非還元性糖質生成酵素は、その至適温度に基づいて分類すると、約４０℃以下という比較的低温域に至適温度を有する酵素群と、約６０℃以上という比較的高温域に至適温度を有する酵素群とに分けられる。また、現在までに開示されたトレハロース遊離酵素は、同様に分類すると、約４５℃以下という比較的低温域に至適温度を有する酵素群と、約６０℃以上という比較的高温域に至適温度を有する酵素群とに分けられる。これに対して、例えば、５０℃付近というような中温域に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素についてはいずれも未だ開示がない。
【０００６】
澱粉原料からの糖質の製造に用いられる糖質関連酵素において、主要なある種の酵素群は中温域に至適温度を有している。これらの酵素は、上記トレハロースならびに非還元性糖質の製造においても必要とされる場合がある。然るに、中温域に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素は未だ確立されていないために、これら両酵素のいずれか一方又は双方とともに、上記の如き糖質関連酵素を併用する糖質の製造は、未だ充分に効率的と言えるものが確立されてはいない。また、糖質の製造設備や糖質の最終用途によっては、製造における酵素反応の温度として中温域が要求される場合がある。このような場面に対応し得る、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を用いる効率的な糖質の製造方法も未だ確立されていると言える状況にはない。以上のことから、斯界においては、中温域に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素が確立され、斯かる酵素を用いる、非還元性糖質を含む糖質の製造方法が確立されることが待ち望まれている。
【０００７】
【特許文献１】特開平７−１４３８７６号公報
【特許文献２】特開平７−２１３２８３号公報
【特許文献３】特開平７−３２２８８３号公報
【特許文献４】特開平７−２９８８８０号公報
【特許文献５】特開平８−６６１８７号公報
【特許文献６】特開平８−６６１８８号公報
【特許文献７】特開平８−７３５０４号公報
【特許文献８】特開平８−８４５８６号公報
【特許文献９】特開平８−３３６３８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
斯かる状況に鑑み、この発明の第一の課題は、中温域に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素を提供することにある。
【０００９】
この発明の第二の課題は、斯かる非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡを提供することにある。
【００１０】
この発明の第三の課題は、斯かる非還元性糖質生成酵素の製造方法を提供することにある。
【００１１】
この発明の第四の課題は、中温域に至適温度を有するトレハロース遊離酵素を提供することにある。
【００１２】
この発明の第五の課題は、斯かるトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡを提供することにある。
【００１３】
この発明の第六の課題は、斯かるトレハロース遊離酵素の製造方法を提供することにある。
【００１４】
この発明の第七の課題は、斯かる非還元性糖質生成酵素及び／又は斯かるトレハロース遊離酵素の産生能を有する微生物を提供することにある。
【００１５】
この発明の第八の課題は、斯かる非還元性糖質生成酵素及び／又は斯かるトレハロース遊離酵素を用いる、非還元性糖質を含む糖質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記の課題を解決し得る酵素を産生する微生物を土壌より広く検索した。その結果、兵庫県赤穂市の土壌から新たに分離した微生物が上記課題を解決し得る酵素を産生することを見出した。当該微生物より目的とする非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素をそれぞれ単離し、それらの性質を決定したところ、単離されたこれらの酵素は、いずれも中温域に至適温度を有することが確認された。一方、当該微生物を同定したところ、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物であることが確認され、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４と命名された。なお、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４は、平成１０年８月６日付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号、通商産業省工業技術院生命工業技術研究所、特許微生物寄託センターに、微生物受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０を付して受託された。
【００１７】
本発明者らは、さらに鋭意研究を続け、上記で確認された酵素をコードするＤＮＡをアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）より単離し、その塩基配列を解読して、当該酵素のアミノ酸配列を決定した。また、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）ならびに、先に得たＤＮＡを常法にしたがい微生物に導入して得た形質転換体は、いずれも所望量の酵素を産生し得ることが確認された。斯くして得られる両酵素は、いずれも、トレハロースならびにトレハロース構造有する非還元性糖質を含む糖質の中温域での製造に有利に用い得るものであることも確認された。この発明は以上の知見に基づき完成されたものである。
【００１８】
すなわち、この発明は、前記第一の課題を、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成し、中温域に至適温度を有する新規な非還元性糖質生成酵素により解決するものである。
【００１９】
この発明は、前記第二の課題を、斯かる非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００２０】
この発明は、前記第三の課題を、斯かる非還元性糖質生成酵素の産生能を有する微生物を培養し、産生した非還元性糖質生成酵素を培養物から採取することを特徴とする非還元性糖質生成酵素の製造方法により解決するものである。
【００２１】
この発明は、前記第四の課題を、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間を特異的に加水分解し、中温域に至適温度を有する新規なトレハロース遊離酵素により解決するものである。
【００２２】
この発明は、前記第五の課題を、斯かるトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００２３】
この発明は、前記第六の課題を、斯かるトレハロース遊離酵素の産生能を有する微生物を培養し、産生した非還元性糖質生成酵素を培養物から採取することを特徴とするトレハロース遊離酵素の製造方法により解決するものである。
【００２４】
この発明は、前記第七の課題を、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株から選ばれる微生物により解決するものである。
【００２５】
この発明は、前記第八の課題を、当該非還元性糖質生成酵素及び／又は当該トレハロース遊離酵素を還元性澱粉部分分解物に作用させて非還元性糖質を生成させる工程と、該工程で生成した非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質を採取する工程とを含んでなる糖質の製造方法により解決するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素は中温域に至適温度を有していることから、トレハロースをはじめとするトレハロース構造を有する非還元性糖質の中温域・酸性域での製造に有利に用いることができる。とりわけ、中温域・酸性域に至適条件を有する他の糖質関連酵素との併用により糖質を製造する際には、目的の糖質を極めて効率的に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
この発明は、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素ならびに該酵素のいずれか一方又は双方を用いる糖質の製造方法に関するものである。本明細書でいう非還元性糖質生成酵素とは、還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用を有する酵素を意味する。本明細書でいうトレハロース遊離酵素とは、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間を特異的に加水分解する作用を有する酵素を意味する。本明細書でいう中温域とは、酵素反応による澱粉原料からの糖質の製造において通常用いられる反応温度における中間域を意味する。因みに、斯かる製造においては、多くの場合、約１０℃乃至約１００℃又はその前後の範囲の種々の反応温度が用いられる。この発明の非還元性糖質生成酵素とは、非還元性糖質生成酵素としての作用を有し、中温域、望ましくは、４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有する酵素、より望ましくは、斯かる至適温度に加え、酸性域に至適ｐＨを有する酵素を意味する。この発明のトレハロース遊離酵素とは、トレハロース遊離酵素としての作用を有し、中温域、望ましくは、４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有する酵素、より望ましくは、斯かる至適温度に加え、酸性域に至適ｐＨを有する酵素を意味する。以上の如きこの発明の非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素はその出所・由来により限定されるものではない。
【００２８】
非還元性糖質生成酵素の活性は以下のようにして測定する。すなわち、基質として１．２５％（ｗ／ｖ）マルトペンタオースを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）４ｍｌに、酵素液１ｍｌを加え５０℃で６０分間保持して反応させた後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させ、その反応液を脱イオン水で正確に１０倍希釈し、その希釈液の還元力をソモギー・ネルソン法で測定する。対照として、予め１００℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素液を用いて同様に測定する。この発明においては、この測定方法を用いて、１分間に１μｍｏｌのマルトペンタオースに相当する還元力を減少させる酵素量を１単位と定義する。また、本明細書でいう当該酵素の至適温度は、この測定方法に準じて求められる。すなわち、反応温度を５０℃を含む適宜の各種温度に設定して、一定量の当該酵素を用いて、この測定方法に準じて種々の温度条件下で反応させ、引き続き、この測定方法にしたがい各反応系における還元力の減少量を求める。そして、求められた還元力の減少量を相互に比較し、最大の値を示した反応系の反応温度が当該酵素の至適温度と求められる。
【００２９】
トレハロース遊離酵素の活性は以下のようにして測定する。すなわち、基質として１．２５％（ｗ／ｖ）マルトトリオシルトレハロース（別名、α−マルトテトラオシル α−Ｄ−グルコシド）を含む２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．０）４ｍｌに、酵素液１ｍｌを加え５０℃で３０分間保持して反応させた後、ソモギー銅液を加え反応を停止させ、還元力をソモギー・ネルソン法で測定する。対照として、予め１００℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素液を用いて同様に測定する。この発明においては、この測定方法を用いて、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元力を増加させる酵素量を１単位と定義する。また、本明細書でいう当該酵素の至適温度は、この測定方法に準じて求められる。すなわち、反応温度を５０℃を含む適宜の各種温度に設定して、一定量の当該酵素を用いて、この測定方法に準じて種々の温度条件下で反応させ、引き続き、この測定方法にしたがい各反応系における還元力の増加量を求める。そして、求められた還元力の増加量を相互に比較し、最大の値を示した反応系の反応温度が当該酵素の至適温度と求められる。
【００３０】
この発明の非還元性糖質生成酵素を、そのアミノ酸配列に基づいて説明すると、当該酵素は、全体としては配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を、部分アミノ酸配列としては、配列表における配列番号２乃至６に示すアミノ酸配列を含有する場合がある。この発明の非還元性糖質生成酵素には、以上のアミノ酸配列をそっくりそのまま含有する酵素に加えて、斯かるアミノ酸配列から選ばれるいずれかの配列の一部を含有するものであっても、それが非還元性糖質生成酵素としての作用を有し、且つ、上述の如き至適温度を有している限り包含される。斯かるアミノ酸配列の一部を含有する当該酵素のアミノ酸配列としては、斯かるアミノ酸配列において、この発明の非還元性糖質生成酵素としての性質の発現に関わる部分アミノ酸配列ないしはアミノ酸残基を保持しつつ、それ以外の部分の１箇所又は２箇所以上にアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を導入してなるアミノ酸配列を挙げることができる。ここでいうアミノ酸の置換を導入してなるアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列を構成する全アミノ酸の、望ましくは３０％未満、より望ましくは２０％未満のアミノ酸を、それぞれ性質や構造の類似する他のアミノ酸で置換してなるものが挙げられる。互いに性質や構造の類似するアミノ酸のグループとしては、例えば、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸、塩基性アミノ酸であるリジンとアルギニンとヒスチジン、アミド型アミノ酸であるアスパラギンとグルタミン、ヒドロキシアミノ酸であるセリンとトレオニン、分岐アミノ酸であるバリンとロイシンとイソロイシン、などが挙げられる。また、配列番号１乃至６に示すアミノ酸配列から選ばれるいずれかの配列の一部を含有する当該酵素のアミノ酸配列の別の例としては、配列番号１のアミノ酸配列の蛋白質がとる立体構造と実質的に同等の立体構造をとり得る、配列番号１のアミノ酸配列にアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を導入してなるアミノ酸配列を挙げることができる。蛋白質の立体構造は、例えば、目的とするアミノ酸配列と関連するアミノ酸配列を有し立体構造が判明している蛋白質を慣用の蛋白質立体構造データベースから検索し、検索された立体構造を参照して、立体構造の視覚化のための慣用のソフトウエアを用いて予測することができる。以上のようなこの発明の非還元性糖質生成酵素のアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して、通常５７％以上、望ましくは７０％以上、より望ましくは８０％以上の相同性を示す。
【００３１】
この発明の非還元性糖質生成酵素は、上述のように、特定の出所・由来に限定されるものではないが、当該酵素の具体例として、例えば、微生物由来のものを挙げることができる。斯かる微生物の具体例としてはアルスロバクター属に属する細菌、より具体的には、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株が挙げられる。当該変異株は、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタン・スルフォネート、紫外線、トランスポゾンなどの慣用の変異源で常法にしたがい処理して生成する変異株を、中温域、通常は、４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素の産生能を指標として検索することにより得ることができる。アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）由来の当該酵素は、通常、配列表における配列番号１乃至６に示すアミノ酸配列を含有する。アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）の変異株を含むアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）以外の微生物由来の当該酵素は、通常、配列表における配列番号１乃至６のいずれかに示すアミノ酸配列の一部又は全てを含有する。当該酵素の別の具体例としては、非還元性糖質生成酵素としての作用を有し、中温域、通常は、４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有する組換え型蛋白質が挙げられる。斯かる組換え型蛋白質は、後述のように、この発明の非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡに通常の遺伝子工学的手法を適用して得ることができる。組換え型蛋白質としての当該酵素は、通常、配列表における配列番号１乃至６のいずれかに示すアミノ酸配列の一部又は全てを含有する。
【００３２】
以上の如きこの発明の非還元性糖質生成酵素は、下記の性質を有する場合がある。
（１）作用
グルコース重合度３以上の還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。
（２）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」と略記する。）により、約７５，０００±１０，０００ダルトン。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約４．５±０．５。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、約５０℃付近。
（５）至適ｐＨ
５０℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．０付近。
（６）温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、約５５℃付近まで安定。
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ約５．０乃至約１０．０の範囲で安定。
この発明の非還元性糖質生成酵素は、後記に詳述する、この発明による当該酵素の製造方法によって所望量を得ることができる。
【００３３】
この発明は、この発明の非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡを提供するものでもあり、斯かるＤＮＡは、組換え型蛋白質としての当該酵素の製造に極めて有用である。本発明による当該ＤＮＡは、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡ全般を包含するものであり、その出所・由来は問わない。斯かるＤＮＡの具体例としては、例えば、配列表における配列番号７に示す塩基配列又は斯かる塩基配列に相補的な塩基配列の一部又は全てを含有するＤＮＡを挙げることができる。配列表における配列番号７に示す塩基配列の全てを有するＤＮＡは、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする。配列表における配列番号７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡとは、それにコードされる蛋白質における、この発明の非還元性糖質生成酵素としての性質の発現に関わるアミノ酸配列ないしはアミノ酸残基に対応する塩基を保持しつつ、それ以外の部分における１箇所又は２箇所以上に塩基の置換、付加及び／又は欠失を導入してなる塩基配列のいずれかを含有するＤＮＡを意味する。本発明による当該ＤＮＡには、それがコードするアミノ酸配列を変更することなく、遺伝子の縮重に基づいて塩基の１又は複数を他の塩基で置換した塩基配列を有するＤＮＡも当然ながら包含される。また、この発明による当該ＤＮＡには、当該非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列に、それ以外の塩基配列、例えば、開始コドン、終止コドン、シャイン・ダルガノ配列などのリボゾーム結合配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、適宜の制限酵素による認識配列、プロモーターやエンハンサーなど遺伝子の発現を調節する塩基配列、ターミネーター等、組換え型蛋白質の産生のために遺伝子工学分野で慣用される諸種の塩基配列から選ばれる１又は複数を連結してなる塩基配列を含有するＤＮＡも包含される。例えば、配列表における配列番号８に示す塩基配列の一部又は全てはリボゾーム結合配列として機能するので、斯る塩基配列をこの発明の非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列の上流に連結してなるＤＮＡは、組換え型蛋白質としての当該酵素の製造に有用である。
【００３４】
本発明による、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡは、上述のように、特定の出所・由来に限定されるものではない。当該ＤＮＡは、当該非還元性糖質生成酵素のアミノ酸配列、例えば、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部をコードし得る塩基配列を含有するＤＮＡとのハイブリダイゼーションに基づいて、諸種の給源からのＤＮＡを検索して得ることができる。斯かる給源の具体例としては、例えば、アルスロバクター属に属する細菌、より望ましくは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株を含む当該非還元性糖質生成酵素の産生能を有する微生物が挙げられる。斯かる検索には、例えば、遺伝子ライブラリーのスクリーニング法や、ＰＣＲ法、さらにはこれらの変法など、斯界においてＤＮＡの検索ないしはクローン化に通常用いられる方法が適宜適用される。検索の結果、所期のハイブリダイゼーションが確認されたＤＮＡを常法にしたがって採取すれば、当該ＤＮＡは得ることができる。斯くして得られる当該ＤＮＡは、通常、配列表における配列番号７に示す塩基配列の一部又は全てを含有する。例えば、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）からは、通常、配列表における配列番号７に示す塩基配列の全てを含有するＤＮＡが得られる。配列表における配列番号７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）以外の、本発明の非還元性糖質生成酵素の産生能を有する微生物を給源として得られるＤＮＡを同様にして検索することにより得ることができる。また、配列表における配列番号７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡは、慣用の突然変異導入法から選ばれる１又は複数の方法により、以上の如きＤＮＡの１箇所又は２箇所以上に塩基の置換、付加及び／又は欠失を導入して得られるＤＮＡより、この発明の非還元性糖質生成酵素としての性質を有する酵素をコードするＤＮＡを選択することによっても得ることができる。また、当該ＤＮＡは、当該非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列、例えば、配列表における配列番号７に示す塩基配列に基づいて、通常の化学合成を適用することによっても得ることができる。いずれにしても、この発明によるＤＮＡは、一旦入手されれば、ＰＣＲ法や、自律複製可能なベクターを用いる方法などを適用することにより、所望のレベルにまで容易に増幅することができる。
【００３５】
この発明による、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡが自律複製可能なベクターに挿入された、組換えＤＮＡとしての形態のものをも包含する。斯かる組換えＤＮＡは、上述のように一旦目的とするＤＮＡが入手できれば、通常一般の遺伝子工学的技術により比較的容易に調製することができる。この発明で用いるベクターは適宜の宿主内で自律複製する性質を有するものであれば何を用いてもよく、斯かるベクターの具体例としては、例えば、大腸菌を宿主として用いる、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３及びλｇｔ・λＣ等、枯草菌を宿主として用いる、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５等、２種類以上の微生物を宿主として用いる、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を挙げることができる。斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体的には、上述のようにして得られる当該ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断した後、当該ＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。ＤＮＡの切断に塩基配列に特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＫｐｎＩ、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、当該ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。連結には、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜の宿主において無限に複製可能である。
【００３６】
この発明による、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡは、さらに、当該ＤＮＡが適宜の宿主に導入された、形質転換体としての形態のものをも包含する。斯かる形質転換体は、通常、上述のようにして得られるＤＮＡないしは組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入して形質転換することにより容易に得ることができる。宿主としては、当該組換えＤＮＡにおけるベクターに応じて選択される、斯界において慣用される微生物や、植物、動物由来の細胞を用いることができる。宿主微生物としては、例えば、大腸菌、枯草菌、アルスロバクター属の微生物をはじめとする細菌の他、放線菌、酵母、真菌などはいずれも有利に用いることができる。宿主微生物にこの発明によるＤＮＡを導入するには、例えば、公知のコンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。なお、この発明による形質転換体において、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡは、宿主の染色体から独立した状態にあっても、斯かる染色体に組み込まれた状態にあってもよい。宿主の染色体に組み込まれた当該ＤＮＡは、宿主内で安定して保持されるという特徴があり、組換え型蛋白質の製造に有利な場合がある。
【００３７】
この発明の非還元性糖質生成酵素は、当該非還元性糖質生成酵素の産生能を有する微生物を培養し、産生された非還元性糖質生成酵素を培養物から採取することを特徴とする、この発明による非還元性糖質生成酵素の製造方法によって所望量を得ることができる。斯かる製造方法で用いる微生物は、当該非還元性糖質生成酵素の産生能を有するものであれば何を用いてもよく、その種類は問わない。斯かる微生物の具体例としては、例えば、アルスロバクター属に属する細菌、より望ましくは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株をはじめとする微生物や、当該非還元性糖質生成酵素をコードするこの発明によるＤＮＡを適宜の宿主微生物に導入して得られる形質転換体を挙げることができる。
【００３８】
この発明による非還元性糖質生成酵素の製造方法における培養で用いる栄養培地は、当該微生物が生育でき、当該非還元性糖質生成酵素を産生し得るものであればよく、特定の組成の培地に限定されるものではない。当該培地は、通常、炭素源及び窒素源を含有し、必要に応じて無機成分が添加される。炭素源としては、当該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、デキストリン、澱粉、澱粉部分分解物、グルコースなどの糖質、糖蜜及び酵母エキス等の糖含有物のほか、グルコン酸やコハク酸などの有機酸はいずれも有用である。炭素源の濃度は、その種類に応じて適宜選択されるが、通常、３０％（ｗ／ｖ）以下、より望ましくは、１５％（ｗ／ｖ）以下の条件が適用される。窒素源は、通常、アンモニウム塩や硝酸塩などの無機窒素化合物の他、尿素や、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物から適宜選択される。無機成分としては、例えば、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、燐酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などから適宜選ばれる塩類が必要に応じて用いられる。
【００３９】
この発明による当該非還元性糖質生成酵素の製造方法における培養条件は、使用する微生物に応じて、それぞれの微生物の生育に適した条件が適宜に選択される。例えば、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）などのアルスロバクター属に属する微生物を使用する場合、培養温度は通常、２０乃至５０℃、望ましくは、２５乃至３７℃、培養ｐＨは通常ｐＨ４乃至１０、望ましくは、ｐＨ５乃至９、培養時間は１０乃至１５０時間から選ばれ、好気条件下で培養される。一方、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡを宿主微生物に導入してなる形質転換体を使用する場合、宿主の微生物種やベクターの種類にもよるが、培養温度は通常、２０乃至６５℃、培養ｐＨは通常、ｐＨ２乃至９、培養時間は通常、１乃至６日間から選ばれ、好気条件下で培養される。斯くして得られる培養物は、通常、主としてその菌体画分に当該酵素を含有する。一方、枯草菌などを宿主として得た形質転換体を培養する場合には、形質転換に用いるベクターの種類によっては、斯かる培養物は、主としてその上清画分に当該酵素を含有する場合もある。以上のようにして得られる培養物における当該酵素の含量は、用いる微生物の種類や培養条件などにもよるが、通常、培養物１ｍｌ当たりに換算すると０．０１乃至１，０００単位である。
【００４０】
以上のようにして得られる培養物から、この発明の非還元性糖質生成酵素を採取する。培養物からの当該酵素の採取の方法は問わないが、例えば、当該酵素活性が主として認められる菌体又は培養上清のいずれかの画分を分離して採取し、さらに必要に応じて、採取した画分を適宜の精製手段に供して、当該非還元性糖質生成酵素を含有する精製された画分を採取する。培養物における菌体と培養上清との分離には、通常の固液分離手段、例えば、遠心分離のほか、プレコートフィルターや平膜、中空糸膜などを用いる濾過などはいずれも有利に適用できる。斯くして分離される菌体含有画分及び培養上清から所望の画分を採取する。採取する画分が菌体含有画分である場合、斯かる菌体を破砕して菌体破砕物としたり、さらには、菌体破砕物からその可溶性画分を上記の固液分離手段によって、その可溶性画分としての菌体抽出液及び菌体不溶性画分に分離し、所望のいずれかの画分を採取することも随意である。菌体不溶性画分は、更に必要に応じて、常法により可溶化して用いることもできる。菌体の破砕には、通常の、超音波処理、界面活性剤処理、リゾチームやグルカナーゼなどの細胞壁破壊酵素による処理、機械的磨砕、機械的圧力の負荷などは、いずれも有利に適用できる。また、菌体の破砕には、培養物そのものを直接これらの菌体の破砕方法のいずれかで処理し、上述の固液分離手段のいずれかを適用して液体画分を採取して菌体抽出液を得ることも有利に実施できる。
【００４１】
以上のようにして得られる画分から当該非還元性糖質生成酵素をさらに精製するには、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動などの糖質関連酵素を精製するための斯界における慣用の方法が適用され、必要に応じてこれらは適宜組合せて適用される。斯様な方法によって分離される画分の中から、非還元性糖質生成酵素の活性測定に基づき、所期の活性を示した画分を回収すれば、所望のレベルにまで精製された当該酵素を採取することができる。例えば、下記に詳述する実施例に記載の方法によれば、当該酵素は電気泳動的に均質な状態にまで精製することができる。以上のようにして、この発明の製造方法によってこの発明の非還元性糖質生成酵素は、培養物、培養上清画分、菌体含有画分、菌体破砕物、菌体抽出液、菌体不溶性画分とその可溶化物、部分精製酵素含有画分、精製酵素含有画分などとして得られる。当該画分は、さらにトレハロース遊離酵素を含有する場合がある。なお、以上のようにして得られるこの発明の非還元性糖質生成酵素は、常法にしたがい固定化して用いることも随意である。斯かる固定化の方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが挙げられる。以上のようにして得られる当該非還元性糖質生成酵素は、いずれも、後述するこの発明の糖質の製造方法を含む各種糖質の製造において有利に用いることができる。とりわけ、当該非還元性糖質生成酵素は、中温域に至適温度を有す上、望ましくは、酸性域に至適ｐＨを有しているので、後述するこの発明のトレハロース遊離酵素の他、酸性域に至適ｐＨを有する澱粉枝切り酵素、中温域で良好な活性を示すシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼなどとの併用による糖質の製造に極めて有用である。
【００４２】
次に、この発明のトレハロース遊離酵素を、そのアミノ酸配列に基づいて説明すると、当該酵素は、全体としては配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列を、部分アミノ酸配列としては、配列表における配列番号１０乃至１６に示すアミノ酸配列を含有する場合がある。この発明のトレハロース遊離酵素には、以上のアミノ酸配列をそっくりそのまま含有する酵素に加えて、斯かるアミノ酸配列から選ばれるいずれかの配列の一部を含有するものであっても、それがトレハロース遊離酵素としての作用を有し、且つ、上述の如き至適温度を有している限り包含される。斯かるアミノ酸配列の一部を含有する当該酵素の具体例としては、斯かるアミノ酸配列において、この発明のトレハロース遊離酵素としての性質の発現に関わるアミノ酸配列ないしはアミノ酸残基を保持しつつ、それ以外の部分の１箇所又は２箇所以上にアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を導入してなるアミノ酸配列のいずれかを含有する酵素を挙げることができる。ここでいうアミノ酸の置換を導入してなるアミノ酸配列としては、例えば、配列番号９に示すアミノ酸配列を構成する全アミノ酸の、望ましくは３０％未満、より望ましくは２０％未満のアミノ酸を、それぞれ性質や構造の類似する他のアミノ酸で置換してなるものが挙げられる。互いに性質や構造の類似するアミノ酸のグループとしては、例えば、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸、塩基性アミノ酸であるリジンとアルギニンとヒスチジン、アミド型アミノ酸であるアスパラギンとグルタミン、ヒドロキシアミノ酸であるセリンとトレオニン、分岐アミノ酸であるバリンとロイシンとイソロイシン、などが挙げられる。また、配列番号９乃至１６に示すアミノ酸配列から選ばれるいずれかの配列の一部を含有する当該酵素のアミノ酸配列の別の例としては、配列番号９のアミノ酸配列の蛋白質がとる立体構造と実質的に同等の立体構造をとり得る、配列番号９のアミノ酸配列にアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を導入してなるアミノ酸配列を挙げることができる。蛋白質の立体構造は、例えば、目的とするアミノ酸配列と関連するアミノ酸配列を有し立体構造が判明している蛋白質を慣用の蛋白質立体構造データベースから検索し、検索された立体構造を参照して、立体構造の視覚化のための慣用のソフトウエアを用いて予測することができる。以上のようなこの発明のトレハロース遊離酵素のアミノ酸配列は、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して、通常６０％以上、望ましくは７０％以上、より望ましくは８０％以上の相同性を示す。
【００４３】
この発明のトレハロース遊離酵素は、上述のように、特定の出所・由来に限定されるものではないが、当該酵素の具体例として、例えば、微生物由来のものを挙げることができる。斯かる微生物の具体例としてはアルスロバクター属に属する細菌、より具体的には、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株が挙げられる。当該変異株は、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタン・スルフォネート、紫外線、トランスポゾンなどの慣用の変異源で常法にしたがい処理して生成する変異株を、中温域、通常は、４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有するトレハロース遊離酵素の産生能を指標として検索することにより得ることができる。アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）由来の当該酵素は、通常、配列表における配列番号９乃至１６に示すアミノ酸配列を含有する。アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）の変異株を含む、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）以外の微生物由来の当該酵素は、通常、配列表における配列番号９乃至１６のいずれかに示すアミノ酸配列の一部又は全てを含有する。当該酵素の別の具体例としては、トレハロース遊離酵素としての作用を有し、中温域、通常は４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲に至適温度を有する組換え型蛋白質が挙げられる。斯かる組換え型蛋白質は、後述のように、この発明のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡに慣用の遺伝子工学的手法を適用して得ることができる。組換え型蛋白質としての当該酵素は、通常、配列表における配列番号９乃至１６のいずれかに示すアミノ酸配列の一部又は全てを含有する。
【００４４】
以上の如きこの発明のトレハロース遊離酵素は、下記の理化学的性質を有する場合がある。
（１）作用
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間の結合を特異的に加水分解する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、約６２，０００±５，０００ダルトン。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約４．７±０．５。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、約５０℃乃至約５５℃付近。
（５）至適ｐＨ
５０℃、３０分間反応で、ｐＨ約６．０付近。
（６）温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、約５０℃付近まで安定。
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ約４．５乃至約１０．０の範囲で安定。
この発明のトレハロース遊離酵素は、後記に詳述する、この発明による当該酵素の製造方法によって所望量を得ることができる。
【００４５】
この発明は、この発明のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡを提供するものでもあり、斯かるＤＮＡは、組換え型蛋白質としての当該酵素の製造に極めて有用である。本発明による当該ＤＮＡは、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡ全般を包含するものであり、その出所・由来は問わない。斯かるＤＮＡの具体例としては、例えば、配列表における配列番号１７に示す塩基配列又は斯かる塩基配列に相補的な塩基配列の一部又は全てを含有するＤＮＡを挙げることができる。配列表における配列番号１７に示す塩基配列の全てを有するＤＮＡは、配列番号９に示すアミノ酸配列をコードする。配列表における配列番号１７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡとは、それにコードされる蛋白質における、この発明のトレハロース遊離酵素としての性質の発現に関わるアミノ酸配列ないしはアミノ酸残基に対応する塩基を保持しつつ、それ以外の部分における１箇所又は２箇所以上に塩基の置換、付加及び／又は欠失を導入してなる塩基配列のいずれかを含有するＤＮＡを意味する。本発明による当該ＤＮＡには、それがコードするアミノ酸配列を変更することなく、遺伝子の縮重に基づいて塩基の１又は複数を他の塩基で置換した塩基配列を有するＤＮＡも当然ながら包含される。また、この発明による当該ＤＮＡには、当該トレハロース遊離酵素をコードする塩基配列に、それ以外の塩基配列、例えば、開始コドン、終止コドン、シャイン・ダルガノ配列などのリボゾーム結合配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、適宜の制限酵素による認識配列、プロモーターやエンハンサーなど遺伝子の発現を調節する塩基配列、ターミネーター等、組換え型蛋白質の産生のために遺伝子工学分野で慣用される諸種の塩基配列から選ばれる１又は複数を連結してなる塩基配列を含有するＤＮＡも包含される。例えば、配列表における配列番号８に示す塩基配列の一部又は全てはリボゾーム結合配列として機能するので、斯る塩基配列をこの発明のトレハロース遊離酵素をコードする塩基配列の上流に連結してなるＤＮＡは、組換え型蛋白質としての当該酵素の製造に有用である。
【００４６】
本発明による、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡは、上述のように、特定の出所・由来に限定されるものではない。当該ＤＮＡは、当該トレハロース遊離酵素のアミノ酸配列、例えば、配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列の少なくとも一部をコードし得る塩基配列を含有するＤＮＡとのハイブリダイゼーションに基づいて、諸種の給源からのＤＮＡを検索して得ることができる。斯かる給源の具体例としては、例えば、アルスロバクター属に属する細菌、より望ましくは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株を含む当該トレハロース遊離酵素の産生能を有する微生物が挙げられる。斯かる検索には、例えば、遺伝子ライブラリーのスクリーニング法や、ＰＣＲ法、さらにはこれらの変法など、斯界においてＤＮＡの検索ないしはクローン化に通常用いられる方法が適宜適用される。検索の結果、所期のハイブリダイゼーションが確認されたＤＮＡを常法にしたがって採取すれば、当該ＤＮＡは得ることができる。斯くして得られる当該ＤＮＡは、通常、配列表における配列番号１７に示す塩基配列の一部又は全てを含有する。例えば、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）からは、通常、配列表における配列番号１７に示す塩基配列の全てを含有するＤＮＡが得られる。配列表における配列番号１７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）以外の、本発明のトレハロース遊離酵素の産生能を有する微生物を給源として得られるＤＮＡを同様にして検索することにより得ることができる。また、配列表における配列番号１７に示す塩基配列の一部を含有するＤＮＡは、慣用の突然変異導入法から選ばれる１又は複数の方法により、以上の如きＤＮＡの１箇所又は２箇所以上に塩基の置換、付加及び／又は欠失を導入して生成されるＤＮＡより、この発明のトレハロース遊離酵素としての性質を有する酵素をコードするＤＮＡを選択することによっても得ることができる。また、当該ＤＮＡは、当該トレハロース遊離酵素をコードする塩基配列、例えば、配列表における配列番号１７に示す塩基配列に基づいて、通常の化学合成を適用することによっても得ることができる。いずれにしても、この発明によるＤＮＡは、一旦入手されれば、ＰＣＲ法や、自律複製可能なベクターを用いる方法などを適用することにより、所望のレベルにまで容易に増幅することができる。
【００４７】
この発明による、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡが自律複製可能なベクターに挿入された、組換えＤＮＡとしての形態のものをも包含する。斯かる組換えＤＮＡは、上述のように一旦目的とするＤＮＡが入手できれば、通常一般の遺伝子工学的技術により比較的容易に調製することができる。この発明で用いるベクターは適宜の宿主内で自律複製する性質を有するものであれば何を用いてもよく、斯かるベクターの具体例としては、例えば、大腸菌を宿主として用いる、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３及びλｇｔ・λＣ等、枯草菌を宿主として用いる、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５等、２種類以上の微生物を宿主として用いる、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を挙げることができる。斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体的には、上述のようにして得られる当該ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断した後、当該ＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。ＤＮＡの切断に塩基配列に特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＫｐｎＩ、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、当該ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。連結には、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜の宿主において無限に複製可能である。
【００４８】
この発明による、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡは、さらに、当該ＤＮＡが適宜の宿主に導入された、形質転換体としての形態のものをも包含する。斯かる形質転換体は、通常、上述のようにして得られるＤＮＡないしは組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入して形質転換することにより容易に得ることができる。宿主としては、当該組換えＤＮＡにおけるベクターに応じて選択される、斯界において慣用される微生物を用いることができる。斯かる宿主微生物としては、例えば、大腸菌、枯草菌、アルスロバクター属の微生物をはじめとする細菌の他、放線菌、酵母、真菌などはいずれも有利に用いることができる。斯かる宿主にこの発明によるＤＮＡを導入するには、例えば、公知のコンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。この発明による形質転換体において、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡは、宿主微生物の染色体と独立した状態にあっても、斯かる染色体に組み込まれた状態にあってもよい。宿主微生物の染色体に組み込まれた当該ＤＮＡは、宿主内で安定して保持されるという特徴があり、組換え型蛋白質の製造に有利な場合がある。
【００４９】
なお、以上ならびに先述の、組換えＤＮＡ及び形質転換体を含むこの発明によるＤＮＡを得るための個々の方法や、斯かるＤＮＡを用いる組換え型蛋白質の産生の方法はいずれも斯界において慣用となっている。例えば、ジェイ・サムブルックら、『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版（１９８９年）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行には、所期のＤＮＡの取得や、取得したＤＮＡの物質生産への利用のための方法が種々詳述されている。また、例えば、特許第２５７６９７０号明細書には、目的とする遺伝子を欠損させた細菌を宿主として用いる形質転換ＤＮＡの安定化方法が、特開昭６３−１５７９８７号公報には、枯草菌で効率的に所期のＤＮＡを発現させるベクターが、特表平５−５０２１６２号公報には、細菌染色体への所期のＤＮＡへの安定な組み込みの方法が、特表平８−５０６７３１号公報には澱粉分解酵素の遺伝子工学的手法を用いる効率的な産生方法が、特表平９−５００５４３号公報や特表平１０−５０００２４号公報には組換え型蛋白質の効率的な産生のための真菌を用いる宿主−ベクター系がそれぞれ開示されている。この発明においては、以上の如き斯界における慣用の方法はいずれも有利に適用できる。
【００５０】
ところで、斯界においては、所望のＤＮＡが上述のようにして得られている場合、斯かるＤＮＡを適宜の動植物体に導入してなる、いわゆる、トランスジェニック動物やトランスジェニック植物を得ることは慣用となっている。この発明の非還元性糖質生成酵素ないしはトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡにおける、適宜の宿主に導入された形態のＤＮＡには、斯かるトランスジェニック動物ないしトランスジェニック植物も包含される。トランスジェニック動物を得るには、概略としては、先ず、当該酵素をコードするＤＮＡを、必要に応じてプロモーターやエンハンサーなど所望の他のＤＮＡとともに、宿主動物の種に応じて選択される適宜のベクターに組み込み、斯かる組換えＤＮＡをマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法や当該ＤＮＡを含有する組換えウイルスの感染などの方法により、宿主として用いる動物の受精卵や胚性幹細胞に導入する。宿主動物としては、マウス、ラット、ハムスターなど実験動物として汎用される齧歯類のほか、山羊、羊、ブタ、牛などの家畜として常用される哺乳動物も飼育の容易さの点で有用である。次に、このようにして得られる、当該ＤＮＡの導入された細胞を、斯かる細胞と同種の偽妊娠雌動物の卵管内又は子宮内に移植する。その後、自然分娩や帝王切開などにより生まれる新生児の中から、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法などを適用して当該酵素をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック動物を選択すればよい。斯くしてトランスジェニック動物としての形態のこの発明のＤＮＡは得ることができる。なお、トランスジェニック動物に関しては、例えば、村松正實、岡山博人、山本雅編集、『実験医学別冊 新 遺伝子工学ハンドブック』、１９９６年、羊土社発行、２６９乃至２８３頁に、その手法が詳述されている。一方、トランスジェニック植物を得るには、例えば、先ず、植物への感染性を有するアグロバクテリウム属微生物のプラスミドをベクターとして用いて、斯かるベクターに、当該酵素をコードするＤＮＡを組込み、得られる組換えＤＮＡを植物体や植物のプロトプラストに導入したり、重金属の微粒子を当該酵素をコードする塩基配列を含むＤＮＡでコートし、斯かる微粒子をパーティクルガンを用いて植物体や植物のプロトプラストに直接注入する。宿主植物としては種々のものを用いることができるが、通常、ジャガイモ、大豆、小麦、大麦、米、トウモロコシ、トマト、レタス、アルファルファ、リンゴ、桃、メロンなどの食用の植物が用いられる。斯くして得られる植物体ないしは植物のプロトプラストに、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法を適用して所期のＤＮＡを含むものを選択し、プロトプラストの場合にはそれを植物体として再生させれば、トランスジェニック植物としての形態のこの発明のＤＮＡは得ることができる。なお、トランスジェニック植物に関しては、ジェーン・ケイ・セトロウ編集、『ジェネティック・エンジニアリング』、第１６巻、１９９４年、プレナム・プレス発行、９３乃至１１３頁に、その手法が種々概説されている。以上の如きトランスジェニック動物ないしはトランスジェニック植物の形態のこの発明のＤＮＡは、この発明の非還元性糖質生成酵素及び／又はトレハロース遊離酵素の給源として、また、トレハロース又はトレハロース構造有する非還元性糖質を含有する食用の動植物として利用することができる。
【００５１】
この発明のトレハロース遊離酵素は、当該トレハロース遊離酵素の産生能を有する微生物を栄養培地に培養し、産生されたトレハロース遊離酵素を培養物から採取することを特徴とする、この発明によるトレハロース遊離酵素の製造方法によって所望量を得ることができる。斯かる製造方法で用いる微生物は、当該トレハロース遊離酵素の産生能を有するものであればいずれでもよく、その種類は問わない。斯かる微生物の具体例としては、例えば、アルスロバクター属に属する細菌、より望ましくは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）及びその変異株等の微生物や、当該トレハロース遊離酵素をコードするこの発明によるＤＮＡを適宜の宿主微生物に導入して得られる形質転換体を挙げることができる。
【００５２】
この発明によるトレハロース遊離酵素の製造方法で用いる栄養培地は、当該微生物が生育でき、当該トレハロース遊離酵素を産生し得るものであればいずれでもよく、特定の組成の培地に限定されるものではない。当該培地は、通常、炭素源及び窒素源を含有し、必要に応じて無機成分が添加される。炭素源としては、当該微生物が資化できるものであればよく、例えば、デキストリン、澱粉、澱粉部分分解物、グルコースなどの糖質、糖蜜及び酵母エキス等の糖含有物のほか、グルコン酸やコハク酸などの有機酸はいずれも有用である。炭素源の濃度は、その種類に応じて適宜選択されるが、通常、３０％（ｗ／ｖ）以下、より望ましくは、１５％（ｗ／ｖ）以下の条件が適用される。窒素源は、通常、アンモニウム塩や硝酸塩などの無機窒素化合物の他、尿素や、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物から適宜選択される。無機成分としては、例えば、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、燐酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などから適宜選ばれる塩類が必要に応じて用いられる。
【００５３】
この発明による当該トレハロース遊離酵素の製造方法における培養条件は、使用する微生物に応じて、それぞれの微生物の生育に適した条件が適宜に選択される。例えば、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）などのアルスロバクター属に属する微生物を使用する場合、培養温度は通常、２０乃至５０℃、望ましくは、２５乃至３７℃、培養ｐＨは通常ｐＨ４乃至１０、望ましくは、ｐＨ５乃至９、培養時間は１０乃至１５０時間から選ばれ、好気条件下で培養される。一方、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡを宿主微生物に導入してなる形質転換体を使用する場合、宿主の微生物種やベクターの種類にもよるが、培養温度は通常、２０乃至６５℃、培養ｐＨは通常、ｐＨ２乃至９、培養時間は通常、１乃至６日間から選ばれ、好気条件下で培養される。斯くして得られる培養物は、通常、主としてその菌体画分に当該酵素を含有する。一方、枯草菌などを宿主として得た形質転換体を培養する場合には、形質転換に用いるベクターの種類によっては、斯かる培養物は、主としてその上清画分に当該酵素を含有する場合もある。以上のようにして得られる培養物における当該酵素の含量は、用いる微生物の種類や培養条件などにもよるが、通常、培養物１ｍｌ当たりに換算すると０．０１乃至３，０００単位である。
【００５４】
以上のようにして得られる培養物から、この発明のトレハロース遊離酵素を採取する。培養物からの当該酵素の採取の方法は問わないが、例えば、当該酵素活性が主として認められる菌体又は培養上清のいずれかの画分を分離して採取し、さらに必要に応じて、採取した画分を適宜の精製手段に供して、当該トレハロース遊離酵素を含有する精製された画分を採取する。培養物における菌体と培養上清との分離には、通常の固液分離手段、例えば、遠心分離のほか、プレコートフィルターや平膜、中空糸膜などを用いる濾過などはいずれも有利に適用できる。斯くして分離される菌体含有画分及び培養上清から所望の画分を採取する。採取する画分が菌体含有画分である場合、斯かる菌体を破砕して菌体破砕物としたり、さらには、菌体破砕物からその可溶性画分を上記の固液分離手段によって、その可溶性画分としての菌体抽出液及び菌体不溶性画分に分離し、所望のいずれかの画分を採取することも随意である。菌体不溶性画分は、更に必要に応じて、常法により可溶化して用いることもできる。菌体の破砕には、通常の、超音波処理、界面活性剤処理、リゾチームやグルカナーゼなどの細胞壁破壊酵素による処理、機械的磨砕、機械的圧力の負荷などは、いずれも有利に適用できる。また、菌体の破砕には、培養物そのものを直接これらの菌体の破砕方法のいずれかで処理し、上述の固液分離手段のいずれかを適用して液体画分を採取して菌体抽出液を得ることも有利に実施できる。
【００５５】
以上のようにして得られる画分から当該トレハロース遊離酵素をさらに精製するには、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動などの糖質関連酵素を精製するための斯界における慣用の方法が適用され、必要に応じてこれらは適宜組合せて適用される。斯様な方法によって分離される画分の中から、トレハロース遊離酵素の活性測定に基づき、所期の活性を示した画分を回収すれば、所望のレベルにまで精製された当該酵素を採取することができる。例えば、下記に詳述する実施例に記載の方法によれば、当該酵素は電気泳動的に均質な状態にまで精製することができる。以上のようにして、この発明の製造方法によってこの発明のトレハロース遊離酵素は、培養物、培養上清画分、菌体含有画分、菌体破砕物、菌体抽出液、菌体不溶性画分とその可溶化物、部分精製酵素含有画分、精製酵素含有画分などとして得られる。当該画分は、さらに非還元性糖質生成酵素を含有する場合がある。なお、以上のようにして得られるこの発明のトレハロース遊離酵素は、常法にしたがい固定化して用いることも随意である。斯かる固定化の方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが挙げられる。以上のようにして得られる当該トレハロース遊離酵素は、いずれも、後述するこの発明の糖質の製造方法を含む各種糖質の製造において有利に用いることができる。とりわけ、当該トレハロース遊離酵素は、中温域に至適温度を有す上、望ましくは、酸性域に至適ｐＨを有しているので、後述するこの発明のトレハロース遊離酵素の他、酸性域に至適ｐＨを有する澱粉枝切り酵素、中温域で良好な活性を示すシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼなどとの併用による糖質の製造に極めて有用である。
【００５６】
この発明は、以上に説明したこの発明の酵素を用いる、非還元性糖質を含む糖質の製造方法を提供するものでもある。この発明の糖質の製造方法は、当該非還元性糖質生成酵素及び／又は当該トレハロース遊離酵素を還元性澱粉部分分解物に作用させて非還元性糖質を生成させる工程と、該工程で生成した非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質を採取する工程を含んでなる。斯かる糖質の製造方法においては、この発明以外の非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素、さらには他の糖質関連酵素から選ばれる１又は複数を併用することを妨げない。斯かる糖質の製造方法で用いる還元性澱粉部分分解物は、その給源や調製方法によって限定されるものではない。この発明でいう非還元性糖質とは、トレハロースをはじめとするトレハロース構造有する非還元性糖質全般を意味する。
【００５７】
この発明の糖質の製造方法で使用する還元性澱粉部分分解物は、例えば、澱粉又は澱粉質を公知の方法で液化して得ることができる。斯かる澱粉は、とうもろこし澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉であっても、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱粉であってもよい。斯かる澱粉の液化は、通常、澱粉を水に懸濁した澱粉乳、望ましくは、濃度１０％（ｗ／ｗ）以上、より望ましくは、約２０乃至５０％（ｗ／ｗ）の澱粉乳とし、これを機械的処理、酸処理又は酵素処理することにより行われる。液化の程度は比較的低いものが適しており、望ましくは、デキストロース・エクイバレント（以下、「ＤＥ」という。）１５未満、より望ましくは、ＤＥ１０未満のものが好適である。酸で液化する場合には、塩酸、燐酸、蓚酸などを用い、その後、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、炭酸ナトリウムなどで所望のｐＨに中和して利用すればよい。酵素で液化する場合には、α−アミラーゼ、とりわけ、耐熱性の液化型α−アミラーゼの使用が適している。また、斯かる澱粉の液化物に、さらに、α−アミラーゼ、マルトトリオース生成アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ、澱粉枝切り酵素などの糖質関連酵素などをさらに作用させて得られる反応産物を還元性澱粉部分分解物として用いることも随意である。なお、これら澱粉関連酵素の酵素学的性質は、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレイテッド・エンザイムズ』、アミラーゼ研究会編、パーガモン・プレス発行（１９８８年）、１８乃至８１頁、１２５乃至１４２頁に詳述されている。
【００５８】
このようにして得られる還元性澱粉部分分解物に、当該非還元性糖質生成酵素及び／又は当該トレハロース遊離酵素と、必要に応じて、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼやプルラナーゼなどの澱粉枝切り酵素、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−フラクトフラノシダーゼをはじめとする糖質関連酵素から選ばれる１又は複数の酵素とを作用させる。酵素を作用させるにあたっては、用いる酵素が作用し得る条件、通常、ｐＨ４乃至１０、温度２０乃至７０℃、望ましくは、ｐＨ５乃至７、温度３０乃至６０℃から適宜選ばれる条件が採用される。とりわけ、４０℃を越え且つ６０℃未満若しくは４５℃を越え６０℃未満の中温域で、弱酸性乃至酸性の条件下で反応を行うと、より効率的に非還元製糖質を生成せしめることができる。還元性澱粉部分分解物にこれらの酵素を作用させる順序は問わず、いずれかの酵素を先に作用させ、他の酵素を後に作用させることも、用いる複数の酵素を同時に作用させることも随意である。
【００５９】
酵素の使用量は、酵素の作用条件・作用時間や、非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質の最終用途などに応じて適宜選ばれる。通常、還元性澱粉部分分解物の固形分１ｇ当たり、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素の場合、いずれも、約０．０１乃至約１００単位、澱粉枝切り酵素の場合、約１乃至約１０，０００単位、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの場合、約０．０５乃至約５００単位から選ばれる。斯かる酵素作用により得られる反応液は、通常、非還元性糖質としてトレハロース、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロースを含有する。当該製造方法において、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素とともに澱粉枝切り酵素及びシクロマルトデキストリン・グルカノトランフェラーゼを併用する場合、トレハロース及びトレハロース構造有する非還元性糖質のうちの比較的低分子のものが多量に生成されるという特徴がある。
【００６０】
斯くして得られる反応液から非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質を採取する。斯かる工程には、糖質の製造に慣用される方法が適宜適用される。具体的には、例えば、斯かる反応液を濾過、遠心分離などして不要物を除去した後、活性炭を用いる脱色ならびにＨ型・ＯＨ型イオン交換樹脂を用いる脱塩などにより精製し、さらに濃縮して、シラップ状製品として採取する。必要に応じてさらに精製し、高純度の非還元性糖質製品として採取することも随意である。さらなる精製には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを用いる分画、アルコール及びアセトンなどの有機溶媒を用いる分別沈澱、適度な分離性能を有する膜を用いる分離、さらには、酵母での発酵処理、アルカリ処理などにより残存している還元性糖質の分解除去などの方法を１種又は２種以上組み合わせて適用することができる。とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去し、含量を向上させた非還元性糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００６１】
このようにして得られる非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質を、必要により、アミラーゼ、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどや、又はα−グルコシダーゼで分解し、甘味性、還元力などを調整したり、粘性を低下させたりすることも、また、同じ特許出願人による特開平８−７３４８２号公報に開示された方法に準じて、水素添加して残存する還元性糖質を糖アルコールにして還元力を消滅せしめることなどの更なる加工処理を施すことも随意である。とりわけ、当該非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質に対して、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼを作用させることにより容易にトレハロースを製造することができる。即ち、これらの非還元性又は低還元性糖質にグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼを作用させてトレハロースとグルコースとの混合溶液とし、これを、前述の精製方法、例えば、イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーなどにより、グルコースを除去し、トレハロース高含有画分を採取する。これを精製、濃縮して、シラップ状製品を得ることも、更に濃縮して過飽和にし、晶出させて含水結晶又は無水結晶としてのトレハロースを得ることも有利に実施できる。
【００６２】
トレハロース含水結晶を製造するには、例えば、純度約６０％（ｗ／ｗ）以上、固形分濃度約６５乃至９０％（ｗ／ｗ）のトレハロース高含有液を助晶缶にとり、必要に応じて、０．１乃至２０％（ｗ／ｖ）の種晶共存下で、温度９５℃以下、望ましくは１０乃至９０℃の範囲で、攪拌しつつ徐冷し、トレハロース含水結晶を含有するマスキットを製造する。また、減圧濃縮しながら晶析させる連続晶析法を採用することも有利に実施できる。マスキットからトレハロース含水結晶又はこれを含有する含蜜結晶を製造する方法は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すればよい。
【００６３】
分蜜方法の場合には、通常、マスキットをバスケット型遠心分離機にかけ、トレハロース含水結晶と蜜（母液）とを分離し、必要により、該結晶に少量の冷水をスプレーして洗浄することも容易な方法であり、より高純度のトレハロース含水結晶を製造するのに好適である。噴霧乾燥方法の場合には、通常、固形分濃度７０乃至８５％（ｗ／ｗ）、晶出率２０乃至６０％程度のマスキットを高圧ポンプでノズルから噴霧し、結晶粉末が溶解しない温度、例えば、６０乃至１００℃の熱風で乾燥し、次いで３０乃至６０℃の温風で約１乃至２０時間熟成すれば非吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造できる。また、ブロック粉砕方法の場合には、通常、水分１０乃至２０％（ｗ／ｗ）、晶出率１０乃至６０％程度のマスキットを約０．１乃至３日間静置して全体をブロック状に晶出固化させ、これを粉砕又は切削などの方法によって粉末化し乾燥すれば、非吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造できる。
【００６４】
また、無水結晶トレハロースを製造するには、上記のようにして得られる含水結晶トレハロースを、例えば、７０℃乃至１６０℃の範囲の温度で常圧乾燥又は減圧乾燥、より望ましくは、８０℃乃至１００℃の範囲の温度で減圧乾燥するか、あるいは、水分１０％未満の高濃度トレハロース高含有溶液を助晶缶にとり、種晶共存下で５０乃至１６０℃、望ましくは８０乃至１４０℃の範囲で攪拌しつつ無水結晶トレハロースを含有するマスキットを製造し、これを比較的高温乾燥条件下で、例えば、ブロック粉砕、流動造粒、噴霧乾燥などの方法で晶出、粉末化して製造される。
【００６５】
このようにして製造される非還元性糖質又はこれを含む低還元性糖質は、還元性が低く安定であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸を有する物質と混合、加工しても、褐変することも、異臭を発生することもなく、混合した他の素材を損なうことも少ない。また、還元力が低いにもかかわらず低粘度であり、平均グルコース重合度が低いものの場合には、良質で上品な甘味を有している。このようにして得られる糖質は、例えば、同じ特許出願人による特許文献５、特許文献６、特開平８−７３４８２号公報、特開平８−７３５０６号公報、特許文献７、特開平８−３３６３６３号公報、特開平９−９９８６号公報、特開平９−１５４４９３号公報、特開平９−２５２７１９号公報、特開平１０−６６５４０号公報、特開平１０−１６８０９３号公報、特願平９−２３６４４１号明細書、特願平９−２５６２１９号明細書、特願平９−２６８２０２明細書、特願平９−２７４９６２号明細書、特願平９−３２０５１９号明細書、特願平９−３３８２９４号明細書、特願平１０−５５７１０号明細書、特願平１０−６７６２８号明細書、特願平１０−１３４５５３号明細書及び特願平１０−２１４３７５号明細書などに開示されているように、食品分野、化粧品分野及び医薬品分野などにおいて有利に利用することができる。
【００６６】
次に、実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００６７】
＜非還元性糖質生成酵素及び／又はトレハロース遊離酵素を産生する微生物＞
中温域に至適温度を有する非還元性糖質生成酵素及び／又はトレハロース遊離酵素を産生する微生物を土壌より広く検索したところ、兵庫県赤穂市の土壌から分離した微生物の１株が、目的とする酵素を産生し得るものであると認められた。そこで、この微生物を『微生物の分類と同定』、（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準拠して同定試験に供した。同定試験の結果を以下にまとめた。
【００６８】
細胞形態に関する試験結果を以下に示す。
（１）肉汁寒天培養、３７℃
通常０．４乃至０．５×０．８乃至１．２μｍの桿菌。単独。多形性あり。運動性なし。無胞子。非抗酸性。グラム陽性。
（２）ＥＹＧ寒天培養、３７℃
桿菌−球菌の生育サイクルを示す。
【００６９】
培養的性質に関する試験結果を以下に示す。
（１）肉汁寒天平板培養、３７℃
形状： 円形 大きさは２日間で１乃至２ｍｍ
周縁： 全縁
隆起： 凸状
光沢： 湿光
表面： 平滑
色調： 半透明、クリーム色
（２）肉汁寒天斜面培養、３７℃
生育度： 良好
形状： 糸状
（３）酵母エキス・ペプトン寒天斜面培養、３７℃
生育度： 良好
形状： 糸状
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃
液化しない。
【００７０】
生理学的性質に関する試験結果を以下に示す。
（１）メチルレッド試験： 陰性
（２）ＶＰ試験： 陽性
（３）インドールの生成： 陰性
（４）硫化水素の生成： 陰性
（５）澱粉の加水分解： 陽性
（６）ゼラチンの液化： 陰性
（７）クエン酸の利用： 陽性
（８）無機窒素源の利用： アンモニウム塩は利用しない。硝酸塩は利用する。
（９）色素の生成： なし
（１０）ウレアーゼ： 陰性
（１１）オキシダーゼ： 陰性
（１２）カタラーゼ： 陽性
（１３）生育の範囲： ｐＨ４．５乃至８．０。温度２０乃至５０℃。最適温度３０乃至４５℃。
（１４）酸素に対する態度： 好気性
（１５）炭素源の利用性：
Ｌ−アラビノース： 利用しない
Ｄ−グルコース： 利用する
Ｄ−フラクトース： 利用しない
Ｄ−ガラクトース： 利用しない
Ｌ−ラムノース： 利用しない
Ｄ−キシロース： 利用しない
Ｄ−マンノース： 利用する
ラフィノース： 利用しない
トレハロース： 利用しない
スクロース： 利用しない
マルトース： 利用しない
ラクトース： 利用しない
Ｄ−ズルシトール： 利用しない
Ｄ−マンニトール： 利用しない
グルコン酸： 利用する
こはく酸： 利用する
ニコチン酸： 利用しない
Ｌ−マレイン酸： 利用する
酢酸： 利用する
乳酸： 利用する
（１６）糖からの酸生成：
Ｌ−アラビノース： 僅かに生成する
Ｄ−グルコース： 僅かに生成する
Ｄ−フラクトース： 生成しない
Ｄ−ガラクトース： 僅かに生成する
Ｌ−ラムノース： 僅かに生成する
Ｄ−キシロース： 僅かに生成する
グリセロール： 僅かに生成する
ラフィノース： 生成しない
トレハロース： 僅かに生成する
スクロース： 僅かに生成する
マルトース： 僅かに生成する
ラクトース： 生成しない
（１７）アミノ酸の利用： Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニンいずれも利用しない。
（１８）アミノ酸の脱炭酸： Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニンいずれも脱炭酸しない。
（１９）ＤＮａｓｅ： 陰性
（２０）細胞壁のＮ−アシル型： アセチル
（２１）細胞壁の主要ジアミノ酸： リジン
（２２）ＤＮＡのＧ−Ｃ含量： ７１．２％
【００７１】
以上の菌学的性質を、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー』、第２巻（１９８４年）を参考にして、公知の菌株とその異同を検討した。その結果、上記微生物は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物であることが判明した。本発明者等は、上記微生物を新規微生物アルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｓ３４と命名した。なお、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４は、平成１０年８月６日付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省工業技術院生命工業技術研究所、特許微生物寄託センターに、微生物受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０を付して受託された。
【００７２】
引き続き、上記微生物アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）と、米国の微生物寄託機関『アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）』に寄託されている、アルスロバクター属に属する微生物のタイプ株とのＤＮＡの相同性を、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー』、第１巻（１９８４年）に記載のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法に準じて調べた。すなわち、先ず、後記表１に示す１２種のタイプ株をそれぞれ常法にしたがって培養し、培養物から菌体を採取した。また、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を後記実施例２−１における種培養の方法で培養し、培養物から菌体を採取した。常法にしたがって、それぞれの菌体からＤＮＡを採取し、その２μｇずつを制限酵素ＰｓｔＩで消化した。これら消化物をアマシャム製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』上に個々にスポットした後、常法にしたがい、アルカリ処理の後、中和、乾燥させて、ＤＮＡを該ナイロン膜上に固定した。続いて、先に得た、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）由来のＤＮＡを１μｇとり、これを、制限酵素ＰｓｔＩで消化した。該消化物を、アマシャム製［α−32Ｐ］ｄＣＴＰとファルマシア製ＤＮＡ標識キット『レディー・トゥー・ゴー、ＤＮＡラベリング・キット』とを用いて放射性同位元素で標識し、プローブを得た。このプローブと、先に準備した、ＤＮＡを固定したナイロン膜とを、２０ｍｌのアマシャム製ハイブリダイゼーション用緩衝液『ラピッド・ハイブリダイゼーション・バッファー』中で、６５℃で振盪しつつ、２時間ハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーション後のナイロン膜を常法にしたがって洗浄し、乾燥させた後、常法にしたがいオートラジオグラフィーに供した。オートラジオグラフィーで認められたハイブリダイゼーションのシグナルを、ファルマシア製画像解析システム『イメージ・マスター』を用いて解析し、それぞれのシグナルの強度を数値化した。得られた数値に基づいて、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）由来のＤＮＡのスポットにおけるシグナルの強度を１００とした場合の、タイプ株由来のＤＮＡのスポットにおけるシグナルの相対強度（％）を算出し、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）とそれぞれのタイプ株とのＤＮＡの相同性を示す指標とした。結果を表１に示す。
【００７３】
【表１】
【００７４】
表１に示すように、ハイブリダイゼーションのシグナルの相対強度（％）は、アルスロバクター・ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒａｍｏｓｕｓ）のタイプ株（ＡＴＣＣ １３７２７）由来のＤＮＡのスポットにおいて９８．６％という高値を示した。このことから、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）は、本実施例で用いた１２種のタイプ株のうちでは、アルスロバクター・ラモサス（ＡＴＣＣ １３７２７）と最も高いＤＮＡの相同性を有していることが判明した。以上実施例１に示した結果は、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）がアルスロバクター・ラモサス（ＡＴＣＣ １３７２７）と近縁の新規微生物であることを示している。
【実施例２】
【００７５】
＜非還元性糖質生成酵素＞
【００７６】
＜実施例２−１：酵素の産生＞
１．０％（ｗ／ｖ）デキストリン（松谷化学工業株式会社製、商品名『パインデックス＃４』）、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス０．１、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸一ナトリウム０．１、０．０６％（ｗ／ｖ）燐酸二カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム及び水からなる培地をｐＨ７．０に調整した。５００ｍｌ容三角フラスコにこの培地を約１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃で２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を接種し、温度３７℃、２６０ｒｐｍの撹拌条件下で４８時間培養したものを種培養物とした。
【００７７】
容量３０ｌのファーメンターに、０．０５％（ｗ／ｖ）消泡剤（信越化学工業株式会社製、商品名『ＫＭ−７５』）を含むこと以外は種培養の場合と同組成の培地約２０ｌを入れて殺菌、冷却して温度３７℃とした後、種培養物を培地に対して１％（ｖ／ｖ）の割合で接種し、温度３７℃、ｐＨ５．５乃至７．５に保ちつつ、約７２時間通気攪拌培養した。
【００７８】
得られた培養物の一部を採り、遠心分離して菌体と上清液とに分離した。この菌体を超音波で破砕し遠心分離して上清を回収して菌体抽出液を得た。培養上清と菌体抽出液それぞれの非還元性糖質生成酵素活性を測定したところ、培養上清には当該酵素活性が僅かであったのに対して、菌体抽出液には当該酵素活性が培養物１ｍｌ当たりに換算して約０．１単位認められた。
【００７９】
＜実施例２−２：酵素の精製＞
実施例２−１の方法にしたがって得た培養物約８０ｌを、８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより、湿重量で約８００ｇの菌体を得た。その菌体を２ｌの１０Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し超音波ホモジナイザー（株式会社エスエムテー製、『モデルＵＨ−６００』）で処理した。処理液を、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、その上清約２ｌを回収した。この上清液に飽和度０．７になるように硫安を加え溶解させ、４℃、２４時間放置した後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、硫安塩析物を回収した。得られた硫安塩析物を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して４８時間透析し、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不溶物を除去した。この透析内液約１ｌを、約１．３ｌの陰イオン交換樹脂（三菱化学株式会社製、商品名『セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲル』）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、通液に伴い０Ｍから０．６Ｍまで直線的に濃度が上昇する食塩を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分の非還元性糖質生成酵素活性を測定した。その結果、約０．２Ｍの食塩を含む緩衝液でカラムから溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。
【００８０】
合一した溶液に硫安を濃度１Ｍになるように加え４℃で１２時間放置した後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清を疎水性ゲル（東ソー株式会社製、商品名『ブチルトヨパール６５０Ｍゲル』）を用いる疎水性カラムクロマトグラフィーに供した。ゲル量は約３００ｍｌ、ゲルは使用に先立って、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した。溶出は、通液に伴い１Ｍから０Ｍまで直線的に濃度が下降する硫安を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分の非還元性糖質生成酵素活性を測定した。その結果、約０．７５Ｍの硫安で溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。
【００８１】
合一した溶液を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析内液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清を回収し、約４０ｍｌの陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社製、商品名『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓゲル』）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、通液に伴い０Ｍから０．２Ｍまで直線的に濃度が上昇する食塩水溶液で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分の非還元性糖質生成酵素活性を測定した。その結果、約０．１５Ｍ食塩で溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。合一した液を、引き続き、約３８０ｍｌの『ウルトロゲルＡｃＡ４４ゲル』（フランス、セプラコル社製）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーに供し、顕著な当該酵素活性の認められた画分を回収した。以上の、精製の各工程における非還元性糖質生成酵素の酵素活性量、比活性、収率を表２に示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
上記のゲル瀘過クロマトグラフィーで溶出され回収した溶液を、常法にしたがい、７．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動法に供したところ、単一の蛋白質バンドが確認された。この結果は、上記で得た、ゲル濾過クロマトグラフィーからの溶出物が、電気泳動的に均質な状態にまで精製された、非還元性糖質生成酵素の精製標品であることを意味している。
【００８４】
＜実施例２−３：酵素の性質＞
【００８５】
＜実施例２−３（ａ）：作用＞
基質として、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、またはマルトヘプタオースの２０％水溶液を調製し、それぞれに実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を基質固形分１ｇ当たり２単位の割合で加え、５０℃、ｐＨ６．０で４８時間反応させた。反応産物を脱塩した後、『ＭＣＩゲル ＣＫ０４ＳＳカラム』（三菱化学株式会社製）２本を直列につないだカラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」という。）で分析し、各反応産物中の糖質の組成比を求めた。ＨＰＬＣにおいて、カラムはカラムオーブン『ＣＯ−８０２０』（東ソー株式会社製造）を用いて８５℃に保持し、移動相として水を流速０．４ｍｌ／分で通液し、溶出物を示差屈折計『ＲＩ−８０２０』（東ソー株式会社製造）で分析した。結果を表３に示す。
【００８６】
【表３】
【００８７】
表３の結果から明らかなように、それぞれの反応産物は、残存する基質と新たに生成した非還元性糖質α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロース（表３においては、それぞれ、グルコシルトレハロース、マルトシルトレハロース、マルトトリオシルトレハロース、マルトテトラオシルトレハロース又はマルトペンタオシルトレハロースと表示した。）とからなり、それ以外の糖質はほとんど検出されなかった。各反応産物における非還元性糖質の組成比をその生成率として評価すると、グルコース重合度３のα−グルコシルトレハロースは比較的低いものの、グルコース重合度４以上のα−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース、α−マルトペンタオシルトレハロースはいずれも約８５％以上という高い生成率であることが判明した。なお、グルコース及びマルトースからの非還元性糖質の生成は確認されなかった。
【００８８】
＜実施例２−３（ｂ）：分子量＞
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を、分子量マーカー（日本バイオ・ラド・ラボラトリーズ株式会社製）と並行して、１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いる、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後、分子量マーカーの泳動位置と比較した結果、当該酵素の分子量は約７５，０００±１０，０００ダルトンであった。
【００８９】
＜実施例２−３（ｃ）：等電点＞
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を、両性電解質『アンフォライン』（スウエーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）を２％（ｗ／ｖ）の濃度で含有するポリアクリルアミドゲルを用いる等電点電気泳動法に供した。泳動後、ゲルのｐＨを測定した結果、当該酵素の等電点は約４．５±０．５であった。
【００９０】
＜実施例２−３（ｄ）：至適温度及び至適ｐＨ＞
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を用いて、当該酵素活性に対する温度の影響及びｐＨの影響を調べた。温度の影響を調べる際には、適宜の各温度で反応させたこと以外は活性測定法にしたがって操作した。ｐＨの影響を調べる際には、適宜の２０ｍＭ緩衝液を用いて適宜の各ｐＨ条件下で反応させたこと以外は活性測定法にしたがって操作した。それぞれの操作において、各反応系に認められた基質の還元力の減少量の相対値（％）を算出し、相対酵素活性（％）とした。結果を図１（温度の影響）及び図２（ｐＨの影響）に示す。図１で横軸は反応温度を、図２で横軸は反応ｐＨをそれぞれ示す。図１に示されるように、当該酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、６０分間反応で、約５０℃付近であった。図２に示されるように、当該酵素の至適ｐＨは、５０℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．０付近であった。
【００９１】
＜実施例２−３（ｅ）：温度安定性及びｐＨ安定性＞
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を用いて、当該酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、当該酵素の精製標品を２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、適宜の各温度に６０分間保持し、水冷した後、希釈液に残存する酵素活性を活性測定法にしたがい調べた。ｐＨ安定性は、当該酵素の精製標品を適宜の各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液で希釈し、４℃で２４時間保持した後、ｐＨを６に調整し、希釈液に残存する酵素活性を活性測定法に従って調べた。結果を図３（温度安定性）及び図４（ｐＨ安定性）に示す。図３で横軸は酵素の保持温度を、図４で横軸は酵素の保持ｐＨをそれぞれ示す。図３に示されるように、当該酵素は約５５℃付近まで安定であった。図４に示されるように、当該酵素は、ｐＨ約５．０乃至約１０．０の範囲で安定であった。
【００９２】
以上の結果は、実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素が、中温域に至適温度を有するこの発明の非還元性糖質生成酵素であることを示している。
【００９３】
＜実施例２−４：部分アミノ酸配列＞
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品の一部を蒸留水に対して透析した後、蛋白量として約８０μｇをＮ末端アミノ酸配列分析用の試料とした。Ｎ末端アミノ酸配列は、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（米国、アプライドバイオシステムズ社製造）を用い、Ｎ末端から２０残基まで分析した。得られた配列は、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列であった。
【００９４】
実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して透析した後、限外濾過膜（東ソー株式会社製、商品名『ウルトラセント−３０』）を用い、常法にしたがい操作して、濃度約１ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。この濃縮液（０．２ｍｌ）に１０μｇのトリプシン試薬（和光純薬株式会社販売、商品名『ＴＰＣＫ−トリプシン』）を加え、３０℃、２２時間反応させて当該酵素を消化し、ペプチドを生成させた。反応産物を、『マイクロボンダスフェアー Ｃ１８カラム』（直径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）を用いる逆相ＨＰＬＣに供し、ペプチドを分離した。温度は室温で行った。溶出は、通液に伴い６０分間で２４％（ｖ／ｖ）から４８％（ｖ／ｖ）まで直線的に濃度が上昇するアセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液で、流速０．９ｍｌ／分で行った。カラムから溶出されたペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した２個のペプチド、『Ｓ５』（保持時間約２３分）及び『Ｓ８』（保持時間約３０分）を分取し、それぞれを真空乾燥した後、５０μｌの０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液に溶解した。これらのペプチド溶液をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ２０残基までアミノ酸配列を分析した。ペプチド『Ｓ５』からは、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列が、またペプチド『Ｓ８』からは、配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列が得られた。
【実施例３】
【００９５】
＜非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡ＞
【００９６】
＜実施例３−１：遺伝子ライブラリーの作製と検索＞
培養温度を２７℃とし、培養時間を２４時間としたこと以外は実施例２−１と同様にして、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離し、適量のトリス−ＥＤＴＡ−食塩緩衝液（以下、「ＴＥＳ緩衝液」いう。）（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを当該菌体浮遊液の体積に対し０．０５％（ｗ／ｖ）の割合で加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。この処理物を−８０℃で１時間保持して凍結させた後、ここに、予めＴＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温しておいたＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加えて充分に撹拌し、さらに氷冷後遠心分離して形成された上層を採取した。この上層に、２倍容の冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）の適量に溶解後、７．５μｇのリボヌクレアーゼ及び１２５μｇのプロテアーゼを加え、３７℃で１時間インキュベートした。ここに、クロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて撹拌後、静置して形成される上層を採取し、この上層に冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取した。沈澱を冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで濯ぎ真空乾燥して、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡは、濃度約１ｍｇ／ｍｌとなるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００９７】
上記で得たＤＮＡ溶液を５０μｌとり、ここに制限酵素ＫｐｎＩを約５０単位加え、３７℃で１時間インキュベートしてＤＮＡを消化した。消化したＤＮＡの３μｇと、予め制限酵素ＫｐｎＩで消化しておいたストラタジーン・クローニング・システムズ製プラスミドベクター『ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』０．３μｇとを、宝酒造製『ＤＮＡライゲーション・キット』を用いて、添付の説明書にしたがって操作して連結した。通常のコンピテントセル法にしたがって、この連結産物でストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』株１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。
【００９８】
作製した遺伝子ライブラリーを、常法により調製した、１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、７５ｍｇ／ｌ アンピシリンナトリウム塩及び５０ｍｇ／ｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約５，０００個を、常法にしたがって、アマシャム製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』上に固定した。別途、実施例２−４の方法で明らかにした、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列における第１乃至８番目までのアミノ酸配列に基づき、配列表における配列番号１８に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−32Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブを得た。このプローブを用いて、先に得たナイロン膜上に固定されたコロニーを、通常のコロニー・ハイブリダイゼーション法に従って検索した。ハイブリダイゼーションは、適量のプローブを添加したハイブリダイゼーション液（６×ＳＳＣ、５×デンハルト液及び１００ｍｇ／ｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む）中で、６５℃で１６時間実施した。ハイブリダイゼーションを終えた上記ナイロン膜は、６×ＳＳＣで６５℃で３０分間洗浄した後、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで６５℃で２時間さらに洗浄した。洗浄後のナイロン膜を常法にしたがいオートラジオグラフィーに供して認められたシグナルに基づき、プローブと顕著なハイブリダイゼーションを示したコロニーを選択した。選択した形質転換体を『ＧＹ１』と命名した。
【００９９】
＜実施例３−２：塩基配列の解読＞
この形質転換体『ＧＹ１』を常法にしたがい、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。当該組換えＤＮＡを『ｐＧＹ１』と命名した。組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』を、上記プローブを用いて通常のサザン分析法により分析し、分析結果に基づき制限酵素地図を作成した。作成した制限酵素地図を図５に示す。図５に示すように、組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』は、図中太線で示されるアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）由来の約５，５００塩基対からなる塩基配列を含有し、そして、斯かる組換えＤＮＡは、制限酵素ＥｃｏＲＩによる２箇所の認識部位の間の約４，０００塩基対からなる領域に、図中太線の領域内の黒色矢印で示すように、当該非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列を含有することが判明した。そこで、組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』を制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に消化した後、通常のアガロースゲル電気泳動法を用いて、約４，０００塩基対のＤＮＡ断片を分離精製した。このＤＮＡ断片と、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで消化しておいたストラタジーン・クローニング・システムズ製プラスミドベクター『ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』とを、通常のライゲーション法で連結した。引き続き常法にしたがって、連結産物でストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』株を形質転換した。このようにして得られた形質転換体より常法にしたがい組換えＤＮＡを抽出し、上記の約４，０００塩基対のＤＮＡ断片を含有することを常法にしたがって確認し、『ｐＧＹ２』と命名した。また、ここで得た、組換えＤＮＡ『ｐＧＹ２』が導入されてなる形質転換体を『ＧＹ２』と命名した。
【０１００】
組換えＤＮＡ『ｐＧＹ２』の塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）に由来する、配列表における配列番号１９に示す、３２５２塩基対からなる塩基配列を含有していた。この塩基配列は、配列番号１９に併記したアミノ酸配列をコードし得るものであった。このアミノ酸配列と、実施例２−４の方法で確認された本発明の非還元性糖質生成酵素の部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号４乃至６に示すアミノ酸配列とを比較した。その結果、配列表における配列番号４、５及び６に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１９に併記したアミノ酸配列における第２乃至２１番目、６１９乃至６３８番目及び第９８乃至１１７番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、実施例２で得た本発明の非還元性糖質生成酵素が、配列表における配列番号１９に併記したアミノ酸配列における第２乃至７５７番目のアミノ酸からなる配列、すなわち、配列番号１に示すアミノ酸配列を有することを示している。また、以上のことは、当該酵素はアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）においては、配列表における配列番号１９に示す塩基配列における第７４６乃至３０１３番目の塩基からなる配列、すなわち、配列番号７に示す塩基配列によりコードされていることをも示している。以上に示した組換えＤＮＡ『ｐＧＹ２』の構造は図６にまとめている。
【０１０１】
実施例２の方法で得られるこの発明の非還元性糖質生成酵素の、上記で明らかにしたアミノ酸配列と、非還元性糖質生成酵素としての作用を有する公知の他の酵素のアミノ酸配列とを、ディー・ジェイ・リップマンら、『サイエンス』、２２７巻、１４３５乃至１４４１頁（１９８５年）に記載の方法にしたがって、市販のソフトウェア（商品名『ジェネティクス−マック（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ）、バージョン８』、ソフトウエア開発株式会社販売）を用いて比較し、それぞれ相同性（％）を求めた。公知の酵素として、特許文献３に開示されたアルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｑ３６由来のもの、特許文献３に開示されたリゾビウム・スピーシーズ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）Ｍ−１１由来のもの、特許文献８に開示されたスルフォロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ＡＴＣＣ３３９０９由来のもの及び、再公表特許ＷＯ９５／３４６４２号公報に開示されたスルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＫＭ１由来のものを用いた。以上の公知の酵素は上記公報に記載のとおり、いずれも中温域以外に至適温度を有するものである。なお、以上の公知の酵素のアミノ酸配列は、米国国立予防衛生研究所作成のＤＮＡデータベース『ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）』から、それぞれのアクセション番号『Ｄ６３３４３』、『Ｄ６４１２８』、『Ｄ７８００１』及び、『Ｄ８３２４５』により入手することもできる。求められた相同性を表４に示す。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
表４に示すように、実施例２によるこの発明の非還元性糖質生成酵素は、中温域以外に至適温度を有する公知の酵素のうちではリゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来の酵素と最も高い５６．９％というアミノ酸配列の相同性を示した。この結果は、この発明の非還元性糖質生成酵素が、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して５７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を通常は含有することを意味している。また、アミノ酸配列の比較結果から、実施例２による当該酵素と上記の４種類の公知の酵素は、配列表における配列番号２乃び３に示すアミノ酸配列を共通して含有していることが判明した。実施例２による当該酵素は、配列表における配列番号１のアミノ酸配列における第８４乃至８９番目及び第２７７乃至２８２番目のアミノ酸からなる部分に見られるとおり、配列番号２乃び３のアミノ酸配列を部分アミノ酸配列として含有している。上記で比較の対象とした４種類の酵素も、いずれも、それぞれ対応する部分にこれらの部分アミノ酸配列を含有している。実施例２による当該酵素ならびに比較の対象とした酵素がいずれも共通して還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用を有していることから、上記で見出された配列表における配列番号２及び３に示す部分アミノ酸配列が斯かる作用の発現に関わっていることが示唆された。したがってこの結果は、この発明の非還元性糖質生成酵素が、配列表における配列番号２及び３に示すアミノ酸配列を含有するとともに中温域に至適温度を有することにより特徴づけられることを示している。
【０１０４】
＜実施例３−３：ＤＮＡを導入してなる形質転換体＞
配列表における配列番号７に示す塩基酸配列における５′末端及び３′末端の配列に基づいて、それぞれ、配列表における配列番号２０及び２１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを常法にしたがい化学合成した。センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、これらのオリゴヌクレオチドをそれぞれ８５ｎｇと、鋳型として、実施例３−２の方法で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＹ２』を１００ｎｇとを反応管で混合し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ試薬（宝酒造製、商品名『Ｐｙｒｏｂｅｓｔ』）１．２５単位、同試薬に添付された緩衝液５μｌとｄＮＴＰ混合液４μｌをさらに加え、滅菌蒸留水で全量を５０μｌとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの温度制御は、９５℃１分間の後、９８℃２０秒間、７０℃３０秒間及び７２℃４分間を２５サイクル、最後に、７２℃１０分間とした。ＰＣＲ産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収して、約２，３００塩基対のＤＮＡを得た。このＤＮＡと、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、宝酒造製『ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ』を用いて平滑化しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』とを混合し、通常のライゲーション法により連結した。引き続き、連結産物を常法にしたがって操作して、上記約２，３００塩基対のＤＮＡが挿入された組換えＤＮＡを得た。得られた組換えＤＮＡを通常のジデオキシ法により解読したところ、当該組換えＤＮＡは、配列表の配列番号７に示す塩基配列における５′末端及び３′末端に、それぞれ、５′−ＡＴＧ−３′及び５′−ＴＧＡ−３′で示される塩基配列が付加された塩基配列を含有していた。当該組換えＤＮＡを『ｐＧＹ３』と命名した。以上に示した組換えＤＮＡ『ｐＧＹ３』の構造は図７にまとめている。
【０１０５】
組換えＤＮＡ『ｐＧＹ３』を、常法にしたがい予めコンピテント化しておいた大腸菌ＬＥ３９２株（ＡＴＣＣ ３３５７２）に導入して形質転換体を得た。斯かる形質転換体より、通常のアルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡが『ｐＧＹ３』であることを常法にしたがって確認し、当該形質転換体を『ＧＹ３』と命名した。斯くして、この発明の非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡを導入してなる形質転換体を得た。
【０１０６】
＜実施例３−４：ＤＮＡを導入してなる形質転換体＞
ファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』におけるプロモーターの３′末端側下流の塩基配列にもとづいて、配列表における配列番号２２及び２３に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを常法にしたがって合成し、それぞれの５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて燐酸化した。燐酸化した該オリゴヌクレオチドを常法にしたがいアニーリングさせた後、これと、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』とを通常のライゲーション法により連結した。常法にしたがい、連結産物を大腸菌株に導入し、斯る大腸菌株を培養後、培養物から通常のアルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは、プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』と同様の構造を有する一方、そのプロモーターの下流に、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ及びＰｓｔＩによる認識配列をこの順序で含有していた。斯くして得たＤＮＡをプラスミドベクター『ｐＫＫ４』と命名した。
【０１０７】
配列表における配列番号７に示す塩基配列における５′末端及び３′末端部分の配列に基づいて化学合成した、配列番号２４及び２５に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いたこと以外は実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収して、約２，３００塩基対のＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＳｐｅＩで切断した後、これと、制限酵素ＸｂａＩ及びＳｐｅＩであらかじめ切断しておいた上記プラスミドベクター『ｐＫＫ４』とを通常のライゲーション法により連結した。連結産物を常法にしたがって操作して、配列表における配列番号７に示す塩基配列を含有する組換えＤＮＡを得た。斯くして得た組換えＤＮＡを『ｐＫＧＹ１』と命名した。
【０１０８】
引き続いて、ロバート・エム・ホートンらが、『メソッズ・イン・エンザイモロジー』、第２１７巻、２７０乃至２７９頁（１９９３年）に報告している、２段階のＰＣＲを適用する『オーバーラップ・エクステンション法』により、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＹ１』における配列番号７の塩基配列の５′末端上流部分の塩基配列を改変した。先ず、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、プラスミドベクター『ｐＫＫ４』の塩基配列に基づいて常法にしたがい化学合成した、配列表における配列番号２６及び２７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、鋳型として、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＹ１』をそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第１段ＰＣＲ−Ａ」という）。これと並行して、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号７の塩基配列に基づいてそれぞれ常法にしたがい化学合成した、配列表における配列番号２８及び２９に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、鋳型として、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＹ１』をそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第１段ＰＣＲ−Ｂ」という）。第１段ＰＣＲ−Ａの産物としてのＤＮＡを常法にしたがって回収し、約３９０塩基対のＤＮＡを得た。第１段ＰＣＲ−Ｂの産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収して、約９３０塩基対のＤＮＡを得た。
【０１０９】
鋳型として、第１段ＰＣＲ−Ａ及び第１段ＰＣＲ−Ｂの産物として得たＤＮＡの混合物を、センスプライマーとして、第１段ＰＣＲ−Ａで用いた配列表における配列番号２６の塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号７に示す塩基配列に基づき常法にしたがい化学合成した、配列表における配列番号３０に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第２段ＰＣＲ−Ａ」という）。このＰＣＲの産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収し、約１，３００塩基対のＤＮＡを得た。
【０１１０】
第２段ＰＣＲ−Ａの産物として得たＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩで切断し、生成した約６５０塩基対のＤＮＡを常法にしたがい回収した。一方、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＹ１』を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩで切断し、生成した約６，３００塩基対のＤＮＡを常法にしたがい回収した。これらのＤＮＡを通常のライゲーション法により連結し、連結産物を常法にしたがい操作して、第２段ＰＣＲ−Ａの産物由来の約６５０塩基対のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡを得た。通常のジデオキシ法によりＤＮＡを解読したところ、得られた組換えＤＮＡは、５′末端から３′末端に向けて、配列表における配列番号８に示す塩基配列、５′−ＡＴＧ−３′で表される塩基配列、配列表における配列番号７に示す塩基配列及び、５′−ＴＧＡ−３′で表される塩基配列が、この順序で連結された塩基配列を含有していた。斯くして得た組換えＤＮＡを『ｐＧＹ４』と命名した。なお、組換えＤＮＡ『ｐＧＹ４』の構造は、配列表における配列番号８に示す塩基配列を含有すること以外は、実施例３−３の方法で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＹ３』の構造と実質的に同一である。
【０１１１】
組換えＤＮＡ『ｐＧＹ４』を、宝酒造製の大腸菌コンピテント細胞『ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ』に常法にしたがい導入して形質転換体を得た。斯る形質転換体より通常のアルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡが『ｐＧＹ４』であることを常法にしたがって確認し、当該形質転換体を『ＧＹ４』と命名した。斯くして、この発明の非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡを導入してなる形質転換体を得た。
【実施例４】
【０１１２】
＜非還元性糖質生成酵素の製造＞
【０１１３】
＜実施例４−１：アルスロバクター属微生物を用いる酵素の製造＞
アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を、実施例２−１の方法に準じて、ファーメンターで約７２時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて菌体を濃縮して約８ｌの菌体懸濁液を回収し、更に、その菌体懸濁液を高圧菌体破砕装置（大日本製薬株式会社製、『ミニラボ』）で処理し、含まれる菌体を破砕した。処理液を遠心分離し、約８．５ｌの遠心上清を得た。上清中の非還元性糖質生成酵素活性を測定したところ、培養物１ｍｌ当たりに換算すると、約０．１単位の当該酵素活性が認められた。この上清に飽和度約０．７になるように硫安を加えて硫安塩析し、遠心分離で沈殿物を回収し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析した。得られた透析内液を、イオン交換樹脂量を約２ｌとしたこと以外は、実施例２−２に記載の陰イオン交換樹脂（三菱化学株式会社製、商品名『セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲル』）を用いる方法に準じてイオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、非還元性糖質生成酵素活性画分を回収した。回収した画分を１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、その透析内液を遠心分離して形成された上清を回収した。回収した上清を、ゲル量を約３００ｍｌとしたこと以外は、実施例２−２に記載の疎水性ゲル（東ソー株式会社製、商品名『ブチルトヨパール６５０Ｍゲル』）を用いる方法に準じて疎水性カラムクロマトグラフィーに供し、非還元性糖質生成酵素活性画分を回収した。回収した酵素の至適温度が４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くして、約２，６００単位のこの発明の非還元性糖質生成酵素を得た。
【０１１４】
＜実施例４−２：形質転換体を用いる酵素の製造＞
１６ｇ／ｌ ポリペプトン、１０ｇ／ｌ 酵母エキス及び５ｇ／ｌ 塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実施例３−２の方法で得た形質転換体『ＧＹ２』を接種し、３７℃で約２０時間通気撹拌培養したものを種培養物とした。次に１０ｌ容ファーメンタに、種培養に用いたのと同一組成の培地を種培養の場合に準じて７ｌ調製し、種培養物を７０ｍｌ接種し、約２０時間通気撹拌培養した。得られた培養物から、常法にしたがい、遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波処理して菌体を破砕し、さらに遠心分離により不溶物を除去し、上清を回収して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析内液を回収し、回収した液が非還元性糖質生成酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明の非還元性糖質生成酵素を得た。本実施例における培養においては、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約０．２単位の当該酵素が産生されていた。
【０１１５】
対照として、ストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』株を、アンピシリンを含まないこと以外は上記と同一の組成の培地を用い、上記と同一の条件で培養し、さらに上記と同様に菌体抽出液を得、透析した。得られた透析内液には、非還元性糖質生成酵素活性は認められなかった。このことは、形質転換体『ＧＹ２』がこの発明の非還元性糖質生成酵素の製造に有用であることを示している。
【０１１６】
＜実施例４−３：形質転換体を用いる酵素の製造＞
実施例３−３の方法で得た形質転換体『ＧＹ３』を、１％（ｗ／ｖ）マルトース、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、１％（ｗ／ｖ）『ミースト ＰＩＧ』（アサヒビール食品株式会社製）、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸一水素カリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を用いたこと以外は実施例４−２と同様にして培養した。得られた培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の非還元性糖質生成酵素活性を測定したところ、当該酵素は、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約１５単位産生されていた。この上清を実施例２−２に記載の方法にしたがって精製し、この精製標品が非還元性糖質生成酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明の非還元性糖質生成酵素を得た。
【０１１７】
＜実施例４−４：形質転換体を用いる酵素の製造＞
実施例３−４の方法で得た形質転換体『ＧＹ４』を、２％（ｗ／ｖ）マルトース、４％（ｗ／ｖ）ペプトン、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．１％燐酸二水素ナトリウム、２００μｇ／ｍｌアンピシリン及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を用いたこと以外は実施例４−２と同様にして培養した。得られた培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の非還元性糖質生成酵素活性を測定したところ、当該酵素は、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約６０単位産生されていた。この上清を実施例２−２に記載の方法にしたがって精製し、この精製標品が非還元性糖質生成酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４０℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明の非還元性糖質生成酵素を得た。
【実施例５】
【０１１８】
＜トレハロース遊離酵素＞
【０１１９】
＜実施例５−１：酵素の産生＞
実施例２−１の方法にしたがって、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）をファーメンターで培養した。引き続き、実施例２−２の方法にしたがって、得られた培養物の一部を採り、菌体と上清液に分離した後、菌体抽出液を得た。この培養上清と菌体抽出液のトレハロース遊離酵素活性を測定したところ、培養上清には当該酵素活性が僅かであるのに対して、菌体抽出液には当該酵素活性が、培養物１ｍｌ当たりに換算して約０．３単位確認された。
【０１２０】
＜実施例５−２：酵素の精製＞
実施例２−１の方法にしたがって得た培養物約８０ｌを、８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより、湿重量で約８００ｇの菌体を得た。その菌体を２ｌの１０Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し超音波ホモジナイザー（株式会社エスエムテー製、『モデルＵＨ−６００』）で処理した。処理液を、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、その上清約２ｌを回収した。この上清液に飽和度０．７になるように硫安を加え溶解させ、４℃、２４時間放置した後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、硫安塩析物を回収した。得られた硫安塩析物を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して４８時間透析し、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不溶物を除去した。この透析内液約１ｌを、約１．３ｌの陰イオン交換樹脂（三菱化学株式会社製、商品名『セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲル』）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、通液に伴い０Ｍから０．６Ｍまで直線的に濃度が上昇する食塩を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分のトレハロース遊離酵素活性を測定した。その結果、約０．２Ｍの食塩を含む緩衝液でカラムから溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。
【０１２１】
合一した溶液に硫安を濃度１Ｍになるように加えて４℃で１２時間放置した後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清を疎水性ゲル（東ソー株式会社製、商品名『ブチルトヨパール６５０Ｍゲル』）を用いる疎水性カラムクロマトグラフィーに供した。ゲル量は約３００ｍｌとした。ゲルは使用に先立って、１Ｍ硫安を含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した。溶出は、通液に伴い１Ｍから０Ｍまで直線的に濃度が下降する硫安水溶液で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分のトレハロース遊離酵素活性を測定した。その結果、約０．５Ｍの硫安を含む緩衝液で溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。
【０１２２】
合一した溶液を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析内液を、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清を回収し、約４０ｍｌの陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社製、商品名『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓゲル』）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、通液に伴い０Ｍから０．２Ｍまで直線的に濃度が上昇する食塩水溶液で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分のトレハロース遊離酵素活性を測定した。その結果、約０．１５Ｍの食塩で溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。合一した液を引き続き、約３８０ｍｌの『ウルトロゲルＡｃＡ４４ゲル』（フランス、セプラコル社製）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーに供し、顕著な当該酵素活性の認められた画分を回収した。以上の、精製の各工程におけるトレハロース遊離酵素の酵素活性量、比活性、収率を表５に示す。
【０１２３】
【表５】
【０１２４】
上記のゲル濾過クロマトグラフィーで溶出され回収した溶液を、常法にしたがい、７．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一の蛋白質バンドが確認された。この結果は、上記で得た、ゲル濾過クロマトグラフィーからの溶出物が、電気泳動的に均質な状態にまで精製された、トレハロース遊離酵素の精製標品であることを示している。
【０１２５】
＜実施例５−３：酵素の性質＞
【０１２６】
＜実施例５−３（ａ）：作用＞
後記実施例８−３の方法で得た、トレハロース構造有する非還元性糖質としてのα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース、α−マルトペンタオシルトレハロース及び、還元性糖質としてのマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースのいずれか１種の糖質を固形分濃度２％（ｗ／ｖ）となるよう水に溶解させて基質水溶液を調製した。それぞれの基質水溶液に、実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品を基質固形分１ｇ当たり２単位の割合で加え、５０℃、ｐＨ６．０で４８時間反応させた。反応産物を実施例２−３（ａ）の方法に準じて脱塩した後ＨＰＬＣで分析し、各反応産物中の糖質の組成比を求めた。結果を表６に示す。なお、表６においては、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロースは、それぞれ、グルコシルトレハロース、マルトシルトレハロース、マルトトリオシルトレハロース、マルトテトラオシルトレハロース及びマルトペンタオシルトレハロースと表示した。
【０１２７】
【表６】
【０１２８】
表６の結果から明らかなように、実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質のトレハロース部分とグリコシル部分との間の結合を特異的に加水分解し、トレハロースとグルコース重合度１以上の還元性糖質とを生成した。一方、マルトトリオース以下のマルトオリゴ糖は、トレハロース遊離酵素によって全く作用をうけなかった。
【０１２９】
＜実施例５−３（ｂ）：分子量＞
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品を、分子量マーカー（日本バイオ・ラド・ラボラトリーズ株式会社製）と並行して、１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いる、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後、分子量マーカーの泳動位置と比較した結果、当該酵素の分子量は約６２，０００±５，０００ダルトンであった。
【０１３０】
＜実施例５−３（ｃ）：等電点＞
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品を、常法にしたがい、両性電解質『アンフォライン』（スウエーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）を２％（ｗ／ｖ）の濃度で含有するポリアクリルアミドゲルを用いる等電点電気泳動に供した。泳動後、ゲルのｐＨを測定した結果、当該酵素の等電点は約４．７±０．５であった。
【０１３１】
＜実施例５−３（ｄ）：至適温度及び至適ｐＨ＞
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品を用いて、当該酵素活性に対する温度の影響及びｐＨの影響を調べた。温度の影響を調べる際には、適宜の各温度で反応させたこと以外は活性測定法にしたがって操作した。ｐＨの影響を調べる際には、適宜の２０ｍＭ緩衝液を用いて適宜の各ｐＨ条件下で反応させたこと以外は活性測定法にしたがって操作した。それぞれの操作において、各反応系に認められた還元力の増加量の相対値（％）を算出し、相対酵素活性（％）とした。結果を図８（温度の影響）及び図９（ｐＨの影響）に示す。図８で横軸は反応温度を、図９で横軸は反応ｐＨをそれぞれ示す。図８に示されるように、当該酵素の至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応で、約５０℃乃至約５５℃付近であった。図９に示されるように、当該酵素の至適ｐＨは、５０℃、３０分間反応でｐＨ約６．０付近であった。
【０１３２】
＜実施例５−３（ｅ）：温度安定性及びｐＨ安定性＞
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品を用いて、当該酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、当該酵素の精製標品を２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、適宜の各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定して調べた。ｐＨ安定性は、当該酵素の精製標品を適宜の各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液で希釈し、４℃で２４時間保持した後、ｐＨを６に調整し、残存する酵素活性を測定して調べた。結果を図１０（温度安定性）及び図１１（ｐＨ安定性）に示す。図１０で横軸は酵素の保持温度を、図１１で横軸は酵素の保持ｐＨをそれぞれ示す。図１０に示されるように、当該酵素は約５０℃付近まで安定であった。図１１に示されるように、当該酵素は、ｐＨ約４．５乃至約１０．０の範囲で安定であった。
【０１３３】
以上の結果は、実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素が、中温域に至適温度を有するこの発明のトレハロース遊離酵素であることを示している。
【０１３４】
＜実施例５−４：部分アミノ酸配列＞
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品の一部を蒸留水に対して透析した後、蛋白量として約８０μｇをＮ末端アミノ酸配列分析用の試料とした。Ｎ末端アミノ酸配列は、『プロテインシーケンサー モデル４７３Ａ』（米国、アプライドバイオシステムズ社製造）を用い、Ｎ末端から２０残基まで分析した。得られた配列は、配列表における配列番号１４に示すアミノ酸配列であった。
【０１３５】
実施例５−２の方法で得たトレハロース遊離酵素の精製標品の一部を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して透析した後、限外濾過膜（東ソー株式会社製、商品名『ウルトラセント−３０』）を用い、常法にしたがい操作して、濃度約１ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。この濃縮液（０．２ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドペプチダーゼ試薬（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させて当該酵素を消化し、ペプチドを生成させた。反応産物を、『ノバパックＣ１８カラム』（直径４．５ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製）を用いる逆相ＨＰＬＣに供し、ペプチドを分離した。温度は室温で行った。溶出は、通液に伴い６０分間で２４％（ｖ／ｖ）から４８％（ｖ／ｖ）まで直線的に濃度が上昇するアセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液で、流速０．９ｍｌ／分で行った。カラムから溶出されたペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した２個のペプチド、『ＲＴ１８』（保持時間約１８分）及び『ＲＴ３３』（保持時間約３３分）を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含む５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液に溶解した。これらのペプチド溶液をプロテインシーケンサーに供し、それぞれ２０残基までアミノ酸配列を分析した。ペプチド『ＲＴ１８』からは、配列表における配列番号１５に示すアミノ酸配列が、またペプチド『ＲＴ３３』からは、配列表における配列番号１６に示すアミノ酸配列が得られた。
【実施例６】
【０１３６】
＜トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡ＞
【０１３７】
＜実施例６−１：遺伝子ライブラリーの作製と検索＞
実施例３−１の方法にしたがって、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）の遺伝子ライブラリーを作製した。引き続き、この遺伝子ライブラリーを、プローブとしてこの発明のトレハロース遊離酵素をコードし得る塩基配列のオリゴヌクレオチドを下記のとおり調製して用いたこと以外は実施例３−１に記載の条件でコロニーハイブリダイゼーション法を実施して検索した。プローブは、実施例５−４で明らかにした、配列表の配列番号１５に示すアミノ酸配列における第１２乃至２０番目のアミノ酸からなる配列に基づいて化学合成した、配列表における配列番号３１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、常法にしたがい［γ−32Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識して調製した。斯かるプローブと顕著なハイブリダイゼーションを示した形質転換体を選択した。
【０１３８】
実施例３−２の方法にしたがって、上記で選択した形質転換体より組換えＤＮＡを抽出し、本実施例におけるプローブを用いて通常のサザン分析法により分析した。分析の結果に基づき作成した制限酵素地図は、図５に示した実施例３−１乃至３−２で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』の場合と一致した。そして、図５に示されるように、本実施例による組換えＤＮＡは、図中斜線矢印で示される、この発明のトレハロース遊離酵素をコードする塩基配列を、制限酵素ＰｓｔＩ及びＫｐｎＩによる認識部位の間の約２，２００塩基対からなる領域内に含有していることが判明した。そこで、以下、組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』を用いて、この発明のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の解読を進めた。
【０１３９】
＜実施例６−２：塩基配列の解読＞
実施例３−２の方法で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』を、常法にしたがい、制限酵素ＰｓｔＩで完全に消化した。消化産物を、通常のアガロースゲル電気泳動法を用いて、生成された約３，３００塩基対のＤＮＡ断片を除去し、生成された約５，２００塩基対のＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を常法にしたがって連結反応に供し、常法にしたがって連結産物でストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌株『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』株を形質転換した。得られた形質転換体より常法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡが、この発明のトレハロース遊離酵素をコードする塩基配列を含む約２，２００塩基対からなる領域を含有することを常法により確認し、『ｐＧＺ２』と命名した。ここで得た、組換えＤＮＡ『ｐＧＺ２』が導入されてなる形質転換体を『ＧＺ２』と命名した。
【０１４０】
組換えＤＮＡ『ｐＧＺ２』の塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）に由来する、配列表における配列番号３２に示す、２，２１８塩基対からなる塩基配列を含有していた。この塩基配列は、配列番号３２に併記したアミノ酸配列をコードし得るものであった。このアミノ酸配列と、実施例５−４で確認されたこの発明のトレハロース遊離酵素の部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号１４乃至１６のアミノ酸配列とを比較した。その結果、配列表における配列番号１４、１５及び１６に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３２に併記したアミノ酸配列における第１乃至２０番目、第２９８乃至３１７番目及び第３１乃至５０番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、実施例５で得たこの発明のトレハロース遊離酵素が、配列表における配列番号３２に併記したアミノ酸配列、すなわち、配列番号９に示すアミノ酸配列を有することを示している。また、以上のことは、当該酵素は、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）においては、配列表における配列番号３２に示す塩基配列における第４７７乃至２，２０１番目の塩基からなる配列、すなわち、配列番号１７に示す塩基配列によりコードされていることをも示している。以上に示した組換えＤＮＡ『ｐＧＺ２』の構造は図１２にまとめている。
【０１４１】
実施例５の方法で得られるこの発明のトレハロース遊離酵素の、上記で明らかにしたアミノ酸配列と、トレハロース遊離酵素としての作用を有する公知の他の酵素のアミノ酸配列とを、実施例３−２に準じて比較し、それぞれ相同性（％）を求めた。公知の酵素として、特許文献４に開示されたアルスロバクター・スピーシーズＱ３６由来のもの、特許文献４に開示されたリゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来のもの、特許文献９に開示されたスルフォロバス・アシドカルダリウスＡＴＣＣ３３９０９由来のもの及び、再公表特許ＷＯ９５／３４６４２号公報に開示されたスルフォロバス・ソルファタリカスＫＭ１由来のものを用いた。以上の公知の酵素は上記公報に記載のとおり、いずれも中温域以外に至適温度を有するものである。なお、以上の公知の酵素のアミノ酸配列は、米国国立予防衛生研究所作成のＤＮＡデータベース『ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）』から、それぞれのアクセション番号『Ｄ６３３４３』、『Ｄ６４１３０』、『Ｄ７８００１』及び『Ｄ８３２４５』により入手することもできる。求められた相同性を表７に示す。
【０１４２】
【表７】
【０１４３】
表７に示すように、実施例５によるこの発明のトレハロース遊離酵素は、中温域以外に至適温度を有する公知の酵素のうちではアルスロバクター・スピーシーズＱ３６由来の酵素と最も高い５９．９％というアミノ酸配列の相同性を示した。この結果は、この発明のトレハロース遊離酵素が、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を通常は含有することを意味している。また、アミノ酸配列の比較結果から、実施例５による当該酵素と上記の４種類の公知の酵素は、配列表における配列番号１０乃び１３に示すアミノ酸配列を共通して含有していることが判明した。実施例５による当該酵素は、配列表における配列番号９のアミノ酸配列における第１４８乃至１５３番目、第１８５乃至１９０番目、第２４８乃至２５４番目及び第２８５乃至２９１番目のアミノ酸からなる部分に見られるとおり、配列番号１０乃至１３のアミノ酸配列を部分アミノ酸配列として含有している。上記で比較の対象とした４種類の酵素も、いずれも、それぞれ対応する部分にこれらの部分アミノ酸配列を含有している。実施例５による当該酵素ならびに比較の対象とした酵素がいずれも共通して、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間を特異的に加水分解する作用を有していることから、上記で見出された配列表における配列番号１０及び１３に示す部分アミノ酸配列が斯かる作用の発現に関わっていることが示唆された。したがってこの結果は、この発明のトレハロース遊離酵素が、配列表における配列番号１０及び１３に示すアミノ酸配列を含有するとともに中温域に至適温度を有することにより特徴づけられることを示している。
【０１４４】
＜実施例６−３：ＤＮＡを導入してなる形質転換体＞
配列表における配列番号１７に示す塩基配列における５′末端及び３′末端の配列に基づいて、それぞれ、配列表における配列番号３３及び３４に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを常法にしたがい化学合成した。センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、これらのオリゴヌクレオチドそれぞれ８５ｎｇと、鋳型として、実施例６−２の方法で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＺ２』１００ｎｇとを反応管で混合し、他の試薬の添加量は実施例３−３に準じてＰＣＲを行った。ＰＣＲの温度制御は、９５℃１分間の後、９８℃２０秒間、７０℃３０秒間及び７２℃４分間を２５サイクル、最後に７２℃１０分間とした。ＰＣＲ産物におけるＤＮＡを常法にしたがい回収して、約１，７００塩基対のＤＮＡを得た。このＤＮＡと、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、宝酒造製『ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ』を用いて平滑化しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２３３−３』とを混合し、通常のライゲーション法により連結した。引き続き、連結産物を常法にしたがって操作して、上記の約１，７００塩基対のＤＮＡが挿入された組換えＤＮＡを得た。得られた組換えＤＮＡを通常のジデオキシ法により解読したところ、当該組換えＤＮＡは、配列表の配列番号１７に示す塩基配列における３′末端に５′−ＴＧＡ−３′で示される塩基配列が付加された塩基配列を含有していた。当該組換えＤＮＡを『ｐＧＺ３』と命名した。以上に示した組換えＤＮＡ『ｐＧＺ３』の構造は図１３にまとめている。
【０１４５】
組換えＤＮＡ『ｐＧＺ３』を、常法にしたがい予めコンピテント化しておいた大腸菌ＬＥ３９２株（ＡＴＣＣ ３３５７２）に導入して形質転換体を得た。斯かる形質転換体より、通常のアルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡが『ｐＧＺ３』であることを常法にしたがって確認し、当該形質転換体を『ＧＺ３』と命名した。斯くして、この発明のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡを導入してなる形質転換体を得た。
【０１４６】
＜実施例６−４：ＤＮＡを導入してなる形質転換体＞
配列表における配列番号１７に示す塩基配列における５′末端及び３′末端部分の配列に基づいて化学合成した、配列番号３５及び３６に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いたこと以外は実施例６−３と同様にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収して、約１，７００塩基対のＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＳｐｅＩで切断した後、これと、制限酵素ＸｂａＩ及びＳｐｅＩであらかじめ切断しておいた、実施例３−４の方法で得たプラスミドベクター『ｐＫＫ４』とを、通常のライゲーション法により連結した。連結産物を常法にしたがって操作して、配列表における配列番号１７に示す塩基配列を含有する組換えＤＮＡを得た。斯くして得た組換えＤＮＡを『ｐＫＧＺ１』と命名した。
【０１４７】
引き続き、実施例３−４と同様に、『オーバーラップ・エクステンション法』により上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＺ１』における配列番号１７の塩基配列の５′末端上流部分の塩基配列を改変した。先ず、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、プラスミドベクター『ｐＫＫ４』の塩基配列に基づいて常法にしたがい化学合成した、配列表における配列番号２６及び３７に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、鋳型として、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＺ１』をそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第１段ＰＣＲ−Ｃ」という）。これと並行して、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、配列表における配列番号１７の塩基配列に基づいてそれぞれ常法にしたがい化学合成した、配列表における配列番号３８及び３９に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、鋳型として、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＺ１』をそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第１段ＰＣＲ−Ｄ」という）。第１段ＰＣＲ−Ｃの産物としてのＤＮＡを常法にしたがって回収し、約３９０塩基対のＤＮＡを得た。第１段ＰＣＲ−Ｄの産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収して、約５９０塩基対のＤＮＡを得た。
【０１４８】
鋳型として、第１段ＰＣＲ−Ｃ及び第１段ＰＣＲ−Ｄの産物として得たＤＮＡの混合物を、センスプライマーとして、第１段ＰＣＲ−Ｃで用いた配列表における配列番号２６に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを、また、アンチセンスプライマーとして、第１段ＰＣＲ−Ｄで用いた配列表における配列番号３９に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いたこと以外は、実施例３−３と同様にしてＰＣＲを行った（「第２段ＰＣＲ−Ｂ」という）。このＰＣＲの産物としてのＤＮＡを常法にしたがい回収し、約９５０塩基対のＤＮＡを得た。
【０１４９】
第２段ＰＣＲ−Ｂの産物として得たＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、生成した約２７０塩基対のＤＮＡを常法にしたがい回収した。一方、上記で得た組換えＤＮＡ『ｐＫＧＺ１』を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、生成した約６，１００塩基対のＤＮＡを常法にしたがい回収した。これらのＤＮＡを通常のライゲーション法により連結し、連結産物を常法にしたがい操作して、第２段ＰＣＲ−Ｂの産物由来の約２７０塩基対のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡを得た。通常のジデオキシ法によりＤＮＡを解読したところ、得られた組換えＤＮＡは、５′末端から３′末端に向けて、配列表における配列番号８に示す塩基配列、配列表における配列番号１７に示す塩基配列及び、５′−ＴＧＡ−３′で表される塩基配列がこの順序で連結された塩基配列を含有していた。斯くして得た組換えＤＮＡを『ｐＧＺ４』と命名した。なお、組換えＤＮＡ『ｐＧＺ４』の構造は、配列表における配列番号８に示す塩基配列を含有すること以外は、実施例６−３の方法で得た組換えＤＮＡ『ｐＧＺ３』の構造と実質的に同一である。
【０１５０】
組換えＤＮＡ『ｐＧＺ４』を、宝酒造製の大腸菌コンピテント細胞『ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ』に常法にしたがい導入して形質転換体を得た。斯る形質転換体より通常のアルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡが『ｐＧＺ４』であることを常法にしたがって確認し、当該形質転換体を『ＧＺ４』と命名した。斯くして、この発明のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡを導入してなる形質転換体を得た。
【実施例７】
【０１５１】
＜トレハロース遊離酵素の製造＞
【０１５２】
＜実施例７−１：アルスロバクター属微生物を用いる酵素の製造＞
アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を、実施例２−１の方法にしたがって、ファーメンターで約７２時間培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて菌体を濃縮して約８ｌの菌体懸濁液を回収し、更に、その菌体懸濁液を高圧菌体破砕装置（大日本製薬株式会社製、『ミニラボ』）で処理して菌体を破砕し、菌体破砕物を得た。この菌体破砕物を遠心分離し、形成された上清約８．５ｌを回収し、菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液のトレハロース遊離酵素活性を測定したところ、培養物１ｍｌ当たりに換算すると、約０．３単位の当該酵素活性が認められた。この菌体抽出液に飽和度約０．７になるように硫安を加えて硫安塩析し、遠心分離で沈殿物を回収し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析した。得られた透析内液を、イオン交換樹脂量を約２ｌとしたこと以外は、実施例５−２に記載の陰イオン交換樹脂（三菱化学株式会社製、商品名『セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲル』）を用いる方法に準じてイオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、トレハロース遊離酵素活性画分を回収した。回収した画分を１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、その透析内液を遠心分離して形成された上清を回収した。回収した上清を、ゲル量を約３５０ｍｌとしたこと以外は、実施例５−２に記載の疎水性ゲル（東ソー株式会社製、商品名『ブチルトヨパール６５０Ｍゲル』）を用いる方法に準じて疎水性カラムクロマトグラフィーに供し、トレハロース遊離酵素活性画分を回収した。回収した酵素が４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域に至適温度を有することと、ｐＨ７未満の酸性域に至適ｐＨを有することを確認した。斯くして、約６，４００単位のこの発明のトレハロース遊離酵素を得た。
【０１５３】
＜実施例７−２：アルスロバクター属微生物を用いる酵素の製造＞
実施例７−１の方法にしたがって、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）を培養した。培養物１ｌに対して１００ｍｇのリゾチーム剤（長瀬産業製、商品名『卵白リゾチーム』）を加えた後、通気を停止し、温度・撹拌条件は培養の場合と同じ条件下で培養物を２４時間処理して菌体を破砕した。この菌体破砕物を１０，０００ｒｐｍの連続遠心分離に供して上清を回収し、菌体抽出液を得た。引き続き実施例７−１の方法にしたがって、斯かる菌体抽出液を硫安塩析に供し、塩析物を透析し、透析内液を『セパビーズＦＰ−ＤＡ１３ゲル』（三菱化学株式会社製）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供してトレハロース遊離酵素活性画分を回収した。回収した画分は、この発明のトレハロース遊離酵素を約１６，５００単位とともに、この発明の非還元性糖質生成酵素を約５，５００単位含むものであった。斯くして、この発明の非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素を含有する酵素剤を得た。
【０１５４】
＜実施例７−３：形質転換体を用いる酵素の製造＞
１６ｇ／ｌ ポリペプトン、１０ｇ／ｌ 酵母エキス及び５ｇ／ｌ 塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実施例６−２の方法で得た形質転換体『ＧＺ２』を接種し、３７℃で約２０時間通気撹拌培養したものを種培養物とした。次に１０ｌ容ファーメンターに、種培養に用いたのと同一組成の培地を種培養の場合に準じて７ｌ調製し、種培養物を７０ｍｌ接種し、約２０時間通気撹拌培養した。得られた培養物から、常法にしたがい、遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波処理して菌体を破砕し、さらに遠心分離により不溶物を除去し、上清を回収して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析内液を回収し、回収した液がトレハロース遊離酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明のトレハロース遊離酵素を得た。本実施例における培養においては、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約０．５単位の当該酵素が産生されていた。
【０１５５】
対照として、ストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌『ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』株を、アンピシリンを含まないこと以外は上記と同一の組成の培地を用い、上記と同一の条件で培養し、さらに上記と同様に菌体抽出液を得、透析した。得られた透析内液には、トレハロース遊離酵素は認められなかった。このことは、形質転換体『ＧＺ２』がこの発明のトレハロース遊離酵素の製造に有用であることを示している。
【０１５６】
＜実施例７−４：形質転換体を用いる酵素の製造＞
実施例６−３の方法で得た形質転換体『ＧＺ３』を、１％（ｗ／ｖ）マルトース、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、１％（ｗ／ｖ）『ミースト ＰＩＧ』（アサヒビール食品株式会社製）、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸一水素カリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を用いたこと以外は実施例７−３と同様にして培養した。得られた培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中のトレハロース遊離酵素活性を測定したところ、当該酵素は、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約７０単位産生されていた。この上清を実施例５−２に記載の方法にしたがって精製し、この精製標品がトレハロース遊離酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明のトレハロース遊離酵素を得た。
【０１５７】
＜実施例７−５：形質転換体を用いる酵素の製造＞
実施例６−４の方法で得た形質転換体『ＧＺ４』を、実施例４−４の方法で培養した。得られた培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中のトレハロース遊離酵素活性を測定したところ、当該酵素は、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約２５０単位産生されていた。この上清を実施例５−２に記載の方法にしたがって精製し、この精製標品がトレハロース遊離酵素活性を示し、当該酵素の至適温度が４５℃を越え且つ６０℃未満の範囲の中温域にあること及び、至適ｐＨがｐＨ７未満の酸性域にあることを確認した。斯くしてこの発明のトレハロース遊離酵素を得た。
【実施例８】
【０１５８】
＜糖質の製造＞
【０１５９】
＜実施例８−１：非還元性糖質含有シラップの製造＞
濃度６％（ｗ／ｗ）の馬鈴薯澱粉乳を加熱して糊化した後、ｐＨ４．５、温度５０℃に調整し、澱粉固形分１ｇ当たり２，５００単位のイソアミラーゼ剤（株式会社林原生物化学研究所製）を加えて２０時間反応させた。反応物をｐＨ６．５に調整し、１２０℃で１０分間オートクレーブした後、４０℃まで冷却し、同温度に維持しつつ、これに、澱粉固形分１ｇ当たり１５０単位の液化型α−アミラーゼ剤（ノボ・ノルディスク・インダストリー製、商品名『ターマミール６０Ｌ』）を加えて２０時間反応させた。この反応物を１２０℃で２０分間オートクレーブした後、５３℃まで冷却し、ｐＨ５．７に調整後、同温度に維持しつつ、澱粉固形分１ｇ当たり１単位の実施例４−１の方法で得た非還元性糖質生成酵素を加えて９６時間反応させた。斯くして得た反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過した後、常法により、活性炭を用いる脱色処理及びイオン交換樹脂を用いる脱塩処理により精製し、濃縮して固形分濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシラップ状物を原料澱粉固形分当たり約９０％の収率で得た。
【０１６０】
ＤＥが２４と低く、非還元性糖質としてα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロースを固形分当たりそれぞれ１１．５％、５．７％、２９．５％、３．５％及び２．８％含む本品は、温和で上品な甘味に加えて適度の粘度と保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１６１】
＜実施例８−２：非還元性糖質含有シラップの製造＞
濃度３３％（ｗ／ｗ）のとうもろこし澱粉乳に最終濃度０．１％（ｗ／ｗ）となるように炭酸カルシウムを加え、ｐＨ６．５に調整後、これに、澱粉固形分当たり０．２％（ｗ／ｗ）の液化型α−アミラーゼ剤（ノボ・ノルディスク・インダストリー製、商品名『ターマミール６０Ｌ』）を加えて９５℃で１５分間反応させて澱粉を液化した。この澱粉液化液を１２０℃で１０分間オートクレーブした後、５３℃に冷却し、同温度に維持しつつ、澱粉固形分１ｇ当たり、１単位のシュードモナス・スツッチェリ由来マルトテオラオース生成アミラーゼ剤（株式会社林原生物化学研究所製）及び２単位の実施例４−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素を加えて４８時間反応させた。引き続き反応物に、澱粉固形分１ｇ当たり１５単位のα−アミラーゼ剤（上田化学製、商品名『α−アミラーゼ２Ａ』）を加え、６５℃でさらに２時間反応させた後、１２０℃で１０分間オートクレーブし、次いで冷却した。斯くして得た反応物を濾過した後、常法により、活性炭を用いる脱色処理及びイオン交換樹脂を用いる脱塩処理により精製し、濃縮して固形分濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシラップを原料澱粉固形分当たり約９０％の収率で得た。
【０１６２】
ＤＥが１８．５と低く、非還元性糖質としてα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロースを固形分当たりそれぞれ９．３％、３０．１％、０．９％、０．８％及び０．５％含む本品は、温和で上品な甘味に加えて適度の粘度と保湿性を有しており、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１６３】
＜実施例８−３：非還元性糖質の製造＞
マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース（いずれも株式会社林原生物化学研究所製）のいずれかの還元性澱粉部分分解物の２０％（ｗ／ｗ）水溶液それぞれに、還元性澱粉部分分解物の固形分１ｇ当たり２単位ずつの実施例２−２の方法で得た非還元性糖質生成酵素の精製標品を加え、５０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させ、それぞれの還元性澱粉部分分解物から、非還元性糖質としてのα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロースを生成させた。これら反応物を、それぞれ、常法に従って、加熱による酵素失活、瀘過、脱色、脱塩、濃縮した後、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（Ｎａ＋型、架橋度４％、東京有機化学工業株式会社製、商品名『ＸＴ−１０１６』）を用いるカラムクロマトグラフィーに供し、反応物中の糖質を分画した。このカラムクロマトグラフィーにおいて、カラム内温度は５５℃、糖液の樹脂に対する負荷量は約５％（ｖ／ｖ）とし、移動相として５５℃の温水をＳＶ０．１３の流速で通液した。カラムからの溶出液の内、固形分重量当たりの上記のいずれかの非還元性糖質の組成比が９５％（ｗ／ｗ）以上の溶出液をそれぞれ採取した。採取したそれぞれの溶出液に水酸化ナトリウムを０．１Ｎになるように加え、１００℃で２時間加熱して残存する還元性糖質を分解した。斯くして得た反応物を、それぞれ、活性炭にて脱色し、Ｈ型及びＯＨ型のイオン交換樹脂で脱塩し、濃縮、真空乾燥の後、粉砕して、純度９９．０％以上のα−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース及びα−マルトペンタオシルトレハロース粉末を得た。
【０１６４】
高純度の非還元性糖質を含み、ＤＥの極めて低いこれらの製品は、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１６５】
＜実施例８−４：非還元性糖質を含む結晶性粉末の製造＞
マルトペンタオース（株式会社林原生物化学研究所製）の２０％（ｗ／ｗ）水溶液を調製した。この水溶液に、マルトペンタオース固形分１ｇ当たり２単位の実施例４−３の方法で得た非還元性糖質生成酵素を加え、５０℃で４８時間反応させた。この反応によりマルトペンタオースの約７５％がα−マルトトリオシルトレハロースに変換された。この反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、瀘過後、常法により、活性炭を用いる脱色処理及びイオン交換樹脂を用いる脱塩処理により精製した。
【０１６６】
その後、６０℃で減圧しながら固形分濃度約７５％（ｗ／ｗ）まで濃縮し、種結晶としてα−マルトトリオシルトレハロース結晶を約０．０１％（ｗ／ｖ）加え、２４時間放置した後、晶出したα−マルトトリオシルトレハロース結晶を遠心分離で回収し、さらに少量の冷水で洗浄した後、常法により乾燥して非還元性糖質含量の高い結晶性粉末を原料固形分当たり約５０％の収率で得た。
【０１６７】
ＤＥが０．２未満と極めて低く、非還元性糖質としてα−マルトトリオシルトレハロースを固形分当たり９９．０％（ｗ／ｗ）以上含む低甘味の本品は、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１６８】
＜実施例８−５：含水結晶トレハロースの製造＞
トウモロコシ澱粉を３０％（ｗ／ｗ）になるように水中に懸濁し、懸濁液に炭酸カルシウムを０．１％（ｗ／ｗ）加えた。ｐＨ６．０に調整後、澱粉固形分当たり０．２％（ｗ／ｗ）の液化型α−アミラーゼ剤（ノボ・ノルディスク・インダストリー製、商品名『ターマミール６０Ｌ』）を加え、９５℃で１５分間反応させて澱粉を糊化・液化した。得られた澱粉液化液を１２０℃で３０分間オートクレーブした後、５１℃に冷却し、ｐＨ５．７に調整後、同温度で維持しつつ、澱粉固形分１ｇ当たり、３００単位のイソアミラーゼ剤（株式会社林原生物化学研究所製）、２単位のシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ剤（株式会社林原生物化学研究所製）、２単位の実施例４−１の方法で得た非還元性糖質生成酵素及び、１０単位の実施例７−１の方法で得たトレハロース遊離酵素を加え、６４時間反応させた。この反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させた後、５０℃に調整し、澱粉固形分１ｇ当たり１０単位のグルコアミラーゼ剤（ナガセ生化学工業製、商品名『グルコチーム』）を加えて２４時間反応させた。斯くして得た反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、瀘過後、常法により、活性炭を用いる脱色処理及びイオン交換樹脂を用いる脱塩処理により精製し、固形分濃度約６０％（ｗ／ｗ）まで濃縮して、固形分当たりトレハロースを８４．１％（ｗ／ｗ）含むシラップを得た。このシラップを減圧下で固形分濃度約８３％（ｗ／ｗ）にまで濃縮し、助晶機にとり、シラップの容量に対して約０．１％（ｗ／ｖ）の含水結晶トレハロースを種晶として加えて約２時間撹拌助晶した。晶出したトレハロースを遠心分離で回収し、少量の水で洗い蜜を除き、４５℃の温風で乾燥させ、純度約９９％のトレハロースの含水結晶を原料澱粉当たり約５０％の収率で得た。
【０１６９】
本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１７０】
＜実施例８−６：無水結晶トレハロースを含む結晶性粉末の製造＞
実施例８−５の方法でトレハロースの含水結晶を調製し、これを、ジャケット付き回転式真空乾燥機を用いて減圧乾燥した。減圧乾燥は、温度９０℃、気圧−３００乃至−３５０ｍｍＨｇの条件で、約７時間行った。減圧乾燥後、温度を常温に、気圧を常圧に戻して、製品を回収し、製品重量当たり無水結晶トレハロースを９０％（ｗ／ｗ）以上含む結晶性粉末を得た。
【０１７１】
無水結晶トレハロースには含水物の水分を吸収し、トレハロース含水結晶に変わる性質がある。無水結晶トレハロース含量の高い本品は、水分を含有している飲食物、化粧品及び医薬品をはじめとする各種組成物ならびにそれら組成物の原料及び中間加工物を脱水又は乾燥するための安全で無害な脱水剤として有用である。また、まろやかで上品な甘味を有する本品は、甘味剤、呈味改善剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品及び医薬品をはじめとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【０１７２】
＜実施例８−７：トレハロース含有シラップの製造＞
濃度２７％（ｗ／ｗ）のタピオカ澱粉乳に、最終濃度０．１％（ｗ／ｗ）となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ６．０に調整し、これに、澱粉固形分当たり０．２％（ｗ／ｗ）の液化型α−アミラーゼ剤（ノボ・ノルディスク・インダストリー製、商品名『ターマミール６０Ｌ』）を加え、９５℃で１５分間反応させ、澱粉を糊化・液化した。この澱粉液化液を２ｋｇ／ｃｍ2で３０分間オートクレーブした後、５３℃に冷却し、ｐＨ５．７に調整し、同温度に維持しつつ、これに、澱粉固形分１ｇ当たり、５００単位のプルラナーゼ剤（ノボ・ノルディスク・インダストリー製、商品名『プロモザイム２００Ｌ』）、１単位のシュードモナス・スツッチェリ由来のマルトテトラオース生成アミラーゼ剤（株式会社林原生物化学研究所製）及び、約２単位の非還元性糖質生成酵素とともに約６単位のトレハロース遊離酵素を含有する実施例７−２の方法で得た酵素剤を加えて７２時間反応させた。斯くして得た反応物を９７℃で１５分間保った後、冷却し、瀘過して濾液を採取した。この濾液を、常法により、活性炭を用いる脱色処理及びイオン交換樹脂を用いる脱塩処理により精製し、更に濃縮して固形分濃度７０％（ｗ／ｗ）のシラップを、原料固形分当たり約９２％の収率で得た。
【０１７３】
本品は固形分当たりトレハロースを３５．２％、α−グルコシルトレハロースを３．４％、グルコースを１．８％、マルトースを３７．２％、マルトトリオースを９．１％およびマルトテトラオース以上のオリゴ糖を１３．３％含有しており、まろやかで上品な甘味、低い還元性、低い粘度、適度の保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１７４】
＜実施例８−８：無水結晶トレハロースを含む結晶性粉末の製造＞
アミロース（株式会社林原生物化学研究所製、商品名『ＥＸ−Ｉ』）１重量部を水１５重量部に加熱溶解し、温度５３℃、ｐＨ５．７に調整した。これに、アミロース固形分１ｇ当たり、２単位の実施例４−３の方法で得た非還元性糖質生成酵素及び６単位の実施例７−４の方法で得たトレハロース遊離酵素を加え、４８時間反応させた。反応物を９７℃で３０分間加熱して酵素を失活させ、５０℃、ｐＨ５．０に調整後、グルコアミラーゼ剤（ナガセ生化学工業製、商品名『グルコチーム』）をアミロース固形分１ｇ当たり１０単位加え、さらに４０時間反応させた。斯くして得た反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過した後、常法により、活性炭を用いる脱色及びイオン交換樹脂を用いる脱塩により精製し、固形分濃度約６０％（ｗ／ｗ）まで濃縮して固形分当たりトレハロースを８２．１％含むシラップを得た。
【０１７５】
このシラップを実施例８−３と同様にしてカラムクロマトグラフィーに供し、固形分当たりトレハロースを約９８％（ｗ／ｗ）含む画分を採取し、減圧下で加熱しながら固形分濃度約８５％（ｗ／ｗ）まで濃縮してシラップを得た。このシラップに、その容量に対して約２％（ｗ／ｖ）の無水結晶トレハロースを種晶として加え、攪拌しながら１２０℃で５分間混合後、プラスチック製バットに分注し、１００℃で減圧乾燥して結晶化させた。その後、バットからブロック状物を取出し、切削機により粉砕したところ、結晶化率約７０％の無水結晶トレハロースを含む水分含量約０．３％（ｗ／ｗ）の固状物を、原料アミロース固形分当たり約７０％の収率で得た。この固状物を常法にしたがって粉砕し、無水結晶トレハロースを含む結晶性粉末を得た。
【０１７６】
無水結晶トレハロースには含水物の水分を吸収し、トレハロース含水結晶に変わる性質があるので、無水結晶トレハロース含量の高い本品は、水分を含有している飲食物、化粧品及び医薬品をはじめとする各種組成物ならびにそれら組成物の原料及び中間加工物を脱水又は乾燥するための安全で無害な脱水剤として有用である。また、まろやかで上品な甘味を有する本品は、甘味剤、呈味改善剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品及び医薬品をはじめとする組成物一般に有利に配合使用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１７７】
以上説明したように、この発明は、中温域に至適温度を有し、望ましくは、酸性域に至適ｐＨを有する、新規な非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素の発見に基づくものである。この発明の両酵素は、例えば、斯かる酵素を産生する微生物の培養によりその所望量を得ることができる。また、この発明による両酵素をコードするそれぞれのＤＮＡは、組換え型蛋白質としての両酵素の製造に極めて有用であり、当該ＤＮＡを導入してなる形質転換体を用いる場合にも、この発明の両酵素の所望量を得ることができる。この発明の両酵素は、トレハロースをはじめとするトレハロース構造を有する非還元性糖質の中温域・酸性域での製造に有利に用いることができる。とりわけ、中温域・酸性域に至適条件を有する他の糖質関連酵素との併用により糖質を製造する際には、目的の糖質を極めて効率的に得ることができる。しかも、この発明の両酵素はアミノ酸配列まで明らかにされた酵素であり、飲食物や医薬品への配合使用を前提とする当該非還元性糖質の製造に安心して使用し得る。斯くして得られる非還元性糖質ないしは斯かる非還元性糖質を含む低還元性糖質は、温和で上品な甘味を有し、そして、何よりも、糖質中の還元性基を有しないか又は大幅に低減しているので、着色や変質の懸念なく飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる実益がある。
【０１７８】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な発明であると言える。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の非還元性糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の非還元性糖質生成酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の非還元性糖質生成酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の非還元性糖質生成酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図５】本発明による組換えＤＮＡ『ｐＧＹ１』の制限酵素地図である。図中太線はアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の塩基配列を示す。太線の領域内の黒色矢印は本発明の非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列を、斜線矢印は本発明のトレハロース遊離酵素をコードする塩基配列をそれぞれ示す。
【図６】本発明による組換えＤＮＡ『ｐＧＹ２』の制限酵素地図である。図中太線はアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の塩基配列を示す。太線の領域内の黒色矢印は本発明の非還元性糖質生成酵素をコードする塩基配列示す。
【図７】本発明による組換えＤＮＡ『ｐＧＹ３』の制限酵素地図である。図中黒色矢印は、本発明の非還元性糖質生成酵素をコードするアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の塩基配列を示す。
【図８】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図９】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来のトレハロース遊離酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１０】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１１】本発明のアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来のトレハロース遊離酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１２】本発明による組換えＤＮＡ『ｐＧＺ２』の制限酵素地図である。図中太線はアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の塩基配列を示す。太線の領域内の斜線矢印は本発明のトレハロース遊離酵素をコードする塩基配列示す。
【図１３】本発明による組換えＤＮＡ『ｐＧＺ３』の制限酵素地図である。図中斜線矢印は、本発明のトレハロース遊離酵素をコードするアルスロバクター・スピーシーズＳ３４由来の塩基配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するトレハロース遊離酵素。
（１）作用
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間の結合を特異的に加水分解する。
（２）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６２，０００±５，０００ダルトン。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ４．７±０．５。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、５０℃乃至５５℃。
（５）至適ｐＨ
５０℃、３０分間反応で、ｐＨ６．０。
（６）温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、５０℃まで安定。
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ４．５乃至１０．０の範囲で安定。
【請求項２】
配列表における配列番号１０乃至１６に示すアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含有する請求項１記載のトレハロース遊離酵素。
【請求項３】
配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列を含有する請求項１又は２記載のトレハロース遊離酵素。
【請求項４】
配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列において、所期の酵素作用を変えることなく１箇所又は２箇所以上にアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を導入してなるアミノ酸配列を含有する請求項１又は２記載のトレハロース遊離酵素。
【請求項５】
アルスロバクター属に属する細菌由来である請求項１乃至４のいずれかに記載のトレハロース遊離酵素。
【請求項６】
アルスロバクター属に属する細菌がアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（工業技術院生命工学工業技術研究所、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）である請求項５記載のトレハロース遊離酵素。
【請求項７】
請求項３又は４記載のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
配列表における配列番号１７に示す塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列を含有する請求項７記載のＤＮＡ。
【請求項９】
配列表における配列番号８に示す塩基配列をさらに含有する請求項７又は８記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
遺伝子の縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変更することなく、塩基の１又は２以上を他の塩基で置換した請求項７乃至９のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項７乃至１０のいずれかに記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなる組換えＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項１３】
請求項１乃至６のいずれかに記載のトレハロース遊離酵素の生産能を有する微生物を培養して培養物中に該酵素を産生せしめる工程と、該培養物から該酵素を採取する工程を含んでなる請求項１乃至６のいずれかに記載のトレハロース遊離酵素の製造方法。
【請求項１４】
微生物がアルスロバクター属に属する細菌であるか、又は、請求項１２記載の形質転換体である請求項１３記載のトレハロース遊離酵素の製造方法。
【請求項１５】
アルスロバクター属に属する細菌がアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（工業技術院生命工学工業技術院、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）である請求項１４記載のトレハロース遊離酵素の製造方法。
【請求項１６】
培養物を細胞壁破壊酵素で処理し、該処理を施した培養物から該酵素を採取する請求項１３乃至１５のいずれかに記載のトレハロース遊離酵素の製造方法。
【請求項１７】
産生したトレハロース遊離酵素を透析、塩析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動から選ばれる１種又は２種以上の精製方法により採取する請求項１３乃至１６のいずれかに記載のトレハロース遊離酵素の製造方法。
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するトレハロース遊離酵素。
（１）作用
末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質におけるトレハロース部分とそれ以外の部分との間の結合を特異的に加水分解する。
（２）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６２，０００±５，０００ダルトン。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ４．７±０．５。
（４）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応で、５０℃乃至５５℃。
（５）至適ｐＨ
５０℃、３０分間反応で、ｐＨ６．０。
（６）温度安定性
ｐＨ７．０、６０分間保持で、５０℃まで安定。
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持で、ｐＨ４．５乃至１０．０の範囲で安定。
【請求項２】
配列表における配列番号１０乃至１６に示すアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含有する請求項１記載のトレハロース遊離酵素。
【請求項３】
配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列を含有する請求項１又は２記載のトレハロース遊離酵素。
【請求項４】
配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列において、所期の酵素作用を変えることなく１箇所又は２箇所以上にアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を導入してなるアミノ酸配列を含有する請求項１又は２記載のトレハロース遊離酵素。
【請求項５】
アルスロバクター属に属する細菌由来である請求項１乃至４のいずれかに記載のトレハロース遊離酵素。
【請求項６】
アルスロバクター属に属する細菌がアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（工業技術院生命工学工業技術研究所、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）である請求項５記載のトレハロース遊離酵素。
【請求項７】
請求項３又は４記載のトレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
配列表における配列番号１７に示す塩基配列又は当該塩基配列に相補的な塩基配列を含有する請求項７記載のＤＮＡ。
【請求項９】
配列表における配列番号８に示す塩基配列をさらに含有する請求項７又は８記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
遺伝子の縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変更することなく、塩基の１又は２以上を他の塩基で置換した請求項７乃至９のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項７乃至１０のいずれかに記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなる組換えＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項１３】
請求項１乃至６のいずれかに記載のトレハロース遊離酵素の生産能を有する微生物を培養して培養物中に該酵素を産生せしめる工程と、該培養物から該酵素を採取する工程を含んでなる請求項１乃至６のいずれかに記載のトレハロース遊離酵素の製造方法。
【請求項１４】
微生物がアルスロバクター属に属する細菌であるか、又は、請求項１２記載の形質転換体である請求項１３記載のトレハロース遊離酵素の製造方法。
【請求項１５】
アルスロバクター属に属する細菌がアルスロバクター・スピーシーズＳ３４（工業技術院生命工学工業技術院、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４５０）である請求項１４記載のトレハロース遊離酵素の製造方法。
【請求項１６】
培養物を細胞壁破壊酵素で処理し、該処理を施した培養物から該酵素を採取する請求項１３乃至１５のいずれかに記載のトレハロース遊離酵素の製造方法。
【請求項１７】
産生したトレハロース遊離酵素を透析、塩析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動から選ばれる１種又は２種以上の精製方法により採取する請求項１３乃至１６のいずれかに記載のトレハロース遊離酵素の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００７−８９５９３（Ｐ２００７−８９５９３Ａ）
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３５３１１２（Ｐ２００６−３５３１１２）
【出願日】平成１８年１２月２７日（２００６．１２．２７）
【分割の表示】特願平１１−１６９３１の分割
【原出願日】平成１１年１月２６日（１９９９．１．２６）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２７日（２００６．１２．２７）
【分割の表示】特願平１１−１６９３１の分割
【原出願日】平成１１年１月２６日（１９９９．１．２６）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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