顕微鏡装置
【課題】光走査光学系を有する顕微鏡装置で高い分解能の画像を得ることを目的とする。
【解決手段】本発明の顕微鏡装置１は、試料Ｓに照射するレーザ光Ｌを発振する光源と２、レーザ光Ｌの一部を通過させる複数のピンホール６Ｐを有し、レーザ光Ｌを試料Ｓに走査させる走査光学系と、レーザ光Ｌのうちピンホール６Ｐを通過した光に試料Ｓで焦点を結ばせる対物レンズ１２を有し、焦点から発生する戻り光Ｒをピンホール６Ｐに導く顕微鏡光学系と、試料Ｓから発生する戻り光Ｒを検出するカメラ１６と、走査光学系を走査することによって走査光学系に形成される戻り光Ｒの像を、カメラ１６に対して相対移動させる相対移動機構１１と、を備えている。
【解決手段】本発明の顕微鏡装置１は、試料Ｓに照射するレーザ光Ｌを発振する光源と２、レーザ光Ｌの一部を通過させる複数のピンホール６Ｐを有し、レーザ光Ｌを試料Ｓに走査させる走査光学系と、レーザ光Ｌのうちピンホール６Ｐを通過した光に試料Ｓで焦点を結ばせる対物レンズ１２を有し、焦点から発生する戻り光Ｒをピンホール６Ｐに導く顕微鏡光学系と、試料Ｓから発生する戻り光Ｒを検出するカメラ１６と、走査光学系を走査することによって走査光学系に形成される戻り光Ｒの像を、カメラ１６に対して相対移動させる相対移動機構１１と、を備えている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に励起光を照射して、試料の画像を観察する顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡装置として蛍光顕微鏡が用いられている。蛍光顕微鏡は、試料に蛍光色素や蛍光タンパクを導入して、レーザ光を励起光として照射し、試料を蛍光させる。そして、この蛍光を観察することにより、試料の画像を取得する。顕微鏡装置では、高い分解能を得ることが求められるが、画素ずらしを行うことで、擬似的に観察画像の解像度を向上させている技術が特許文献１に開示されている。
【０００３】
また、ピンホールディスクとマイクロレンズディスクとを用いて高速に励起光を試料に走査させるニポウディスク方式の共焦点顕微鏡が特許文献２に開示されている。ピンホールディスクには多数のピンホールを配列し、マイクロレンズディスクには多数のマイクロレンズを配列し、ピンホールディスクとマイクロレンズディスクとを回転させることで、励起光を試料に高速に走査させることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２５３６２号公報
【特許文献２】特開２０１１−２２３２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１の顕微鏡（顕微鏡システム）は、顕微鏡光学系（マイクロスコープ）と顕微鏡画像撮像装置（撮像装置）とにより構成されている。そして、画素ずらしを行うための平行平板ガラスを顕微鏡光学系の内部に設けるようにして、平行平板ガラスの傾きを前後左右に変化させることで、結像画像の位置を結像素子上で前後左右にずらすようにしている。
【０００６】
一方、特許文献２の顕微鏡では、顕微鏡光学系およびカメラ（撮像素子）だけではなく、走査系光学系を有している。走査光学系はピンホールディスクおよびマイクロレンズディスクを有して構成しており、顕微鏡光学系とカメラとの間に設けられている。つまり、特許文献１の顕微鏡とは異なり、顕微鏡光学系とカメラと走査光学系との３者により構成されている。
【０００７】
特許文献１の顕微鏡は顕微鏡光学系と撮像装置との２者の光学系を調整することにより、画素ずらしを実現している。これにより、擬似的に観察画像の解像度を向上させることができる。ただし、特許文献２のようなニポウディスク方式の共焦点顕微鏡のように、顕微鏡光学系とカメラと走査光学系との３者の光学系により実現される場合には、単に画素ずらしの技術を適用することができない。
【０００８】
そこで、本発明は、光走査光学系を有する顕微鏡装置で高い分解能の画像を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、試料に照射する励起光を発振する光源と、前記励起光の一部を通過させる複数の開口部を有し、前記励起光を前記試料に走査させる走査光学系と、前記励起光のうち前記開口部を通過した光に前記試料で焦点を結ばせる対物レンズを有し、前記焦点から発生する蛍光を前記開口部に導く顕微鏡光学系と、前記試料から発生する蛍光を検出する検出部と、前記走査光学系を走査することによって前記走査光学系に形成される前記蛍光の像を、前記検出部に対して相対移動させる相対移動機構と、を備えたことを特徴とする。
【００１０】
この顕微鏡装置によれば、相対移動機構が走査光学系に形成される戻り光（蛍光）の像を検出部に対して相対移動させている。戻り光の像を相対移動することで、検出部において画素ずらしを行うことができる。これにより、走査光学系を有する顕微鏡で高い分解能の画像を得ることができる。
【００１１】
また、前記走査光学系は、前記開口部として複数のピンホールを有するピンホールディスクと、このピンホールを回転させる回転部とを有し、この回転部が前記ピンホールディスクを回転することにより前記焦点を前記試料で走査し、前記ピンホールディスク面に前記試料の蛍光の像を形成し、前記ピンホール上の蛍光像を伝達するリレー光学系によってリレーされた前記蛍光の像を検出する前記検出部としての撮像素子を備えていることを特徴とする。
【００１２】
ピンホールディスクを回転させることにより、試料の光軸方向に直交する方向に焦点を走査することができる。走査されたときの戻り光の像はピンホールを通過し、リレー光学系によりリレーされて撮像素子で走査される。これにより、試料の断面情報を得ることができる。
【００１３】
また、前記相対移動機構は、前記対物レンズと前記ピンホールディスクとの間に配置された撮影レンズを光軸方向に直交する方向に移動することにより、前記ピンホールディスクに形成される前記蛍光の像を前記撮像素子に対して相対移動させることを特徴とする。
【００１４】
撮影レンズを光軸方向に直交する方向に移動することにより、ピンホールディスクに形成される戻り光の像を撮像素子に対して相対移動させることができる。
【００１５】
また、前記蛍光の波長をλ、前記対物レンズの開口数をＮＡ、前記撮影レンズの移動ピッチをｓとしたときに、ｓ≦（１／２）×０．６１×（λ／ＮＡ）となるように前記相対移動機構が前記撮影レンズを移動させることを特徴とする。
【００１６】
撮影レンズの移動ピッチｓを前記の式のように設定することで、走査光学系を有する顕微鏡で光学分解能の限界値を得るような高い分解能の画像を得ることができるようになる。
【００１７】
また、前記相対移動機構が動作する高解像度モードと前記相対移動機構が動作しない高速モードとを切り替える制御部を備えたことを特徴とする。
【００１８】
画素ずらしを行う高解像度モードは高い解像度を得ることができるが、処理に時間がかかる。高い解像度が必要でない場合には、画素ずらしを行わない高速モードを選択することで、処理の高速化を実現することができる。
【００１９】
また、前記相対移動機構は、前記リレー光学系を光軸方向に直交する方向に移動することにより、前記ピンホールディスクに形成される像を前記撮像素子に対して相対移動させることを特徴とする。
【００２０】
リレー光学系を光軸方向に直交する方向に移動することによっても、ピンホールディスクに形成される像を撮像素子に対ｓｈ智恵相対移動させることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、相対移動機構が走査光学系に形成される戻り光の像を検出部に対して相対移動させている。このため、戻り光の像を相対移動することで、検出部において画素ずらしを行うことができる。これにより、走査光学系を有する顕微鏡で高い分解能の画像を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施形態の顕微鏡装置の構成図である。
【図２】ピンホールディスクおよびマイクロレンズディスクの構成図である。
【図３】ピンホールおよび走査ピッチを説明する図である。
【図４】撮影レンズの移動前後の焦点を説明する図である。
【図５】撮影レンズを移動したときの撮像素子の像を説明する図である。
【図６】画素の再配置を行ったときの図である。
【図７】変形例１の顕微鏡装置の構成図である。
【図８】変形例２の撮像素子の像の変化を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。図１は実施形態の顕微鏡装置１を示している。顕微鏡装置１は試料Ｓを観察対象としており、光源２とファイバ３とコリメートレンズ４とマイクロレンズディスク５とピンホールディスク６と連結ドラム７とモータ８ダイクロイックミラー９と撮影レンズ１０と相対移動機構１１と対物レンズ１２と前側リレーレンズ１３と蛍光フィルタ１４と後側リレーレンズ１５とカメラ１６と制御部１７とモニタ１８とを備えて構成している。
【００２４】
光源２は励起光としてレーザ光Ｌを発振する。ファイバ３は光ファイバであり、レーザ光Ｌを導光する。ファイバ３の出射側にはコリメートレンズ４が配置されており、ファイバ３から出射されたレーザ光Ｌはコリメートレンズ４で平行光になる。コリメートレンズ４の前方にはマイクロレンズディスク５が配置されている。
【００２５】
図２に示すように、マイクロレンズディスク５は螺旋状に多数のマイクロレンズ５Ｍを配列した回転ディスクである。また、ピンホールディスク６はマイクロレンズ５Ｍと同じパターンで多数のピンホール６Ｐを配列した回転ディスクである。ピンホール６Ｐは観察対象である試料Ｓの焦点の範囲内の光のみを通過させる開口部である。マイクロレンズ５Ｍは対応するピンホール６Ｐにレーザ光Ｌを集光させる機能を有している。
【００２６】
マイクロレンズディスク５とピンホールディスク６とは連結ドラム７により連結されており、連結ドラム７はモータ８に接続されている。モータ８により回転力が付与されることで、マイクロレンズディスク５とピンホールディスク６とが一体的に回転する。連結ドラム７とモータ８とにより回転部が構成される。
【００２７】
マイクロレンズディスク５とピンホールディスク６とはそれぞれ走査光学系（走査板）を構成する。走査光学系により、試料Ｓの水平面（ＸＹ平面）にレーザ光Ｌが走査される。これにより、試料Ｓの所定領域の断層像を取得することができる。
【００２８】
図１および図２に示すように、マイクロレンズディスク５とピンホールディスク６との間にはダイクロイックミラー９を設けている。ダイクロイックミラー９は光源２が発振するレーザ光Ｌの波長を透過し、試料Ｓの蛍光の波長を反射する特性を有する光学素子である。
【００２９】
ピンホール６Ｐをレーザ光Ｌが透過した位置に撮影レンズ（チューブレンズ）１０が配置されている。この撮影レンズ１０によりレーザ光Ｌは平行光になる。撮影レンズ１０にはレーザ光Ｌの光軸方向（Ｚ方向）に対して直交する方向に撮影レンズ１０を微小に移動させる相対移動機構１１が取り付けられている。
【００３０】
相対移動機構１１としては撮影レンズ１０を光軸方向に対して直交する方向に撮影レンズ１０を移動させる機構であればよく、例えば撮影レンズ１０をクランプするホルダを駆動するアクチュエータ等を適用することができる。
【００３１】
撮影レンズ１０により平行光になったレーザ光Ｌの光路に対物レンズ１２が配置されている。この対物レンズ１２によりレーザ光Ｌは観察対象である試料Ｓに焦点Ｆを結ぶ。撮影レンズ１０と対物レンズ１２とにより顕微鏡光学系が構成される。
【００３２】
ダイクロイックミラー９で反射した蛍光（戻り光Ｒ）の光路に前側リレーレンズ１３が配置されており、この前側リレーレンズ１３により戻り光Ｒは平行光になる。戻り光Ｒの光路に蛍光フィルタ１４が配置されている。蛍光フィルタ１４は試料Ｓの蛍光波長成分のみを透過させる。また、戻り光Ｒの光路には後側リレーレンズ１５が配置されている。後側リレーレンズ１５により平行光の戻り光Ｒはカメラ１６の撮像素子１６Ｃに焦点を結ぶ。
【００３３】
制御部１７はカメラ１６に接続されたコンピュータであり、カメラ１６から出力される電気信号に基づいて所定の演算処理を行う。これにより、試料Ｓの画像が生成される。生成された画像はモニタ１８に表示される。制御部１７は光源２とモータ８と相対移動機構１１とカメラ１６とを制御している。
【００３４】
次に動作について説明する。制御部１７は光源２から試料Ｓを励起させる波長を持つレーザ光Ｌを発振させる。このレーザ光Ｌは励起光となる。レーザ光Ｌはファイバ３に集光されており、ファイバ３の他端から広がりをもって発せられる。そして、レーザ光Ｌはコリメートレンズ４により平行光に変換される。平行光となったレーザ光Ｌはマイクロレンズディスク５の各マイクロレンズ５Ｍに照射される。
【００３５】
図２に示すように、マイクロレンズディスク５の個々のマイクロレンズ５Ｍにより集光されたレーザ光Ｌはダイクロイックミラー９を透過する。これは、ダイクロイックミラー９がレーザ光Ｌを透過する光学特性を有しているためである。そして、レーザ光Ｌはマイクロレンズ５Ｍに対応するピンホール６Ｐで焦点を結ぶ。
【００３６】
ピンホール６Ｐを通過したレーザ光Ｌは撮影レンズ１０によって、ピンホール６Ｐの位置に対応する傾きを有する平行光に変換される。この平行光となったレーザ光Ｌは対物レンズ１２に入射して、その傾きに応じて焦点面の対応する位置に焦点Ｆを結像する。従って、試料Ｓに入射されるレーザ光Ｌはその傾きに応じた焦点Ｆを結ぶ。図１では光軸中心の光線を実線で示し、光軸からずれた光線を破線で示している。
【００３７】
試料Ｓにはレーザ光Ｌにより励起される蛍光色素や蛍光タンパク等が導入されている。よって、レーザ光Ｌが試料Ｓで焦点Ｆを結ぶことにより、蛍光を発生する。この蛍光が戻り光Ｒとなる。戻り光Ｒは対物レンズ１２、撮影レンズ１０、ピンホール６Ｐのようにレーザ光Ｌと同じ光路を通って、ダイクロイックミラー９に入射する。
【００３８】
ダイクロイックミラー９は試料Ｓの蛍光の波長の光を反射する特性を有している。よって、戻り光Ｒは反射する。そして、この戻り光Ｒは前側リレーレンズ１３に入射する。ピンホール６Ｐを通過した戻り光Ｒの像は前側リレーレンズ１３、後側リレーレンズ１５の作用でカメラ１６の撮像素子１６Ｃに等倍で結像する。このとき、戻り光Ｒは蛍光フィルタ１４の作用により、蛍光成分のみが選択的に透過されており、蛍光成分以外は除去されている。
【００３９】
このときに、制御部１７はモータ８を回転させるように制御する。これにより、走査光学系であるマイクロレンズディスク５とピンホールディスク６とが一体的に回転する。図２に示すように、ピンホール６Ｐを通過する光が試料Ｓの対応する焦点面で走査され、個々の戻り光Ｒは再びピンホール６Ｐを通過する。そして、ダイクロイックミラー９で反射してカメラ１６の撮像素子１６Ｃを走査される。
【００４０】
これにより、試料Ｓの焦点面の情報がカメラ１６に投影されて試料Ｓの観察が可能になる。また、このときに焦点面以外の光はピンホール６Ｐを殆ど通過しないためカメラ１６に到達しない。従って、カメラ１６で取得する画像は試料Ｓの焦点の範囲内の光のみの画像となり、つまり共焦点画像となる。換言すれば、顕微鏡装置１は共焦点顕微鏡となる。
【００４１】
そして、モータ８がマイクロレンズディスク５およびピンホールディスク６を回転させることで、レーザ光Ｌを試料Ｓに高速に走査させることができる。これにより、試料Ｓの断層を高速に走査させることができ、所定の断層の画像を高速に生成することができる。
【００４２】
ここで、制御部１７は相対移動機構１１を制御して、撮影レンズ１０をレーザ光Ｌの光軸方向に直交する方向に相対的に移動させる。これにより、ピンホールディスク６（走査光学系）に形成される戻り光Ｒ（蛍光）の像をカメラ（検出部）１６に対して相対的に移動させている。
【００４３】
相対移動機構１１が撮影レンズ１０を移動させる移動ピッチｓは、戻り光Ｒの波長をλ、対物レンズ１２の開口数をＮＡとしたときに、「ｓ≦（１／２）×０．６１×（λ／ＮＡ）」となるようにする。これは、光学分解能の限界値をσとしたときに「σ＝０．６１×（λ／ＮＡ）」であり、光学分解能の限界値の情報を得るためのサンプリングピッチｓが「ｓ≦（１／２）×σ」となるためである。
【００４４】
ここで、対物レンズ１２の倍率が２０倍、開口数ＮＡが０．７５、戻り光Ｒの波長λが５５０ｎｍであるとする。この場合、光学分解能の限界値σはσ＝０．４５μｍとなる。ただし、対物レンズ１２の倍率が２０倍になっているため、限界値σはσ＝９（＝０．４５×２０）μｍにカメラ１６の撮像素子１６Ｃに拡大投影される。つまり、光学分解能の限界値σはσ＝９μｍとなる。
【００４５】
一方、図３は、試料Ｓにおける焦点Ｆが走査される走査ピッチＰ１を示している。この図に示すように、破線方向（Ｘ方向）には焦点Ｆが連続しているため、極めて高い分解能で走査を行うことができる。ただし、この方向と直交する方向のピッチ（走査ピッチＰ１）には限界がある。ここでは、この走査ピッチＰ１が７μｍであるとする。また、カメラ１６の撮像素子１６Ｃの画素サイズも７μｍであるとする。
【００４６】
光学分解能の限界値σはσ＝９μｍであり、この限界値σにおけるサンプリングピッチｓは「ｓ≦（１／２）×σ＝４．５μｍ」である。従って、走査ピッチＰ１も画素サイズも７μｍであり、サンプリングピッチｓ（＝４．５μｍ）には達していないため、光学分解能の限界値の情報が得られていないことになる。これにより、高い分解能の画像が得られないことになる。
【００４７】
そこで、相対移動機構１１を用いて撮影レンズ１０を微小移動させる。撮影レンズ１０の移動量はサンプリングピッチｓの移動量であり、つまり「ｓ≦（１／２）×０．６１×（λ／ＮＡ）」である。前記の例では、「ｓ≦４．５μｍ」を充足すればよいが、ここでは、この範囲のうち撮像素子１６Ｃの画素サイズの半分とする。つまり、「ｓ＝３．５μｍ」とする。
【００４８】
相対移動機構１１は撮影レンズ１０を戻り光Ｒの光軸に直交する方向に移動させる。戻り光Ｒの光軸に直交する方向は平面であり、この平面には相互に直交する２方向（ＸＹ方向）がある。走査ピッチＰ１と画素サイズとの両者がサンプリングピッチｓに達していない場合には、相対移動機構１１は撮影レンズ１０をＸＹ方向の２方向に移動させる。一方、何れ一方がサンプリングピッチｓに達していない場合には、相対移動機構１１は撮影レンズ１０をＸＹ方向の何れか１方向に移動させる。
【００４９】
ここでは、走査ピッチＰ１も画素サイズもサンプリングピッチｓに達していないため、相対移動機構１１は撮影レンズ１０をＸＹ方向の２方向に移動させる。図４はピンホールディスク６と撮影レンズ１０との関係を示している。同図において、実線は撮影レンズ１０をＸ方向に移動する前の状態を示しており、破線はＸ方向に移動した後の状態を示している。
【００５０】
移動前において、撮影レンズ１０の焦点はピンホールディスク６の点２１にある。この点２１にピンホール６Ｐが位置した場合、焦点から発せられたレーザ光Ｌは光軸に平行となり対物レンズ１２に集光される。また、戻り光Ｒも同様の光路を通る。このときに、相対移動機構１１は、撮影レンズ１０をＸ方向にサンプリングピッチｓ（つまり、３．５μｍ：図４ではＸ１）だけ移動させる。
【００５１】
撮影レンズ１０をＸ方向に移動させることにより、撮影レンズ１０の焦点は点２２に変化する。点２２にピンホール６Ｐが位置した場合、この焦点から発せられたレーザ光Ｌは光軸に平行となり対物レンズ１２に集光される。また、戻り光Ｒも同様の光路を通る。これらの撮影レンズ１０を通過したレーザ光Ｌはどちらも光軸に平行な光であるため、対物レンズ１２を通過後はどちらも同じ点に集光される。
【００５２】
つまり、撮影レンズ１０をＸ方向にサンプリングピッチｓの分だけ移動させることにより、点２１で観察されていた情報は点２２に移動する。同様に、ピンホールディスク６の他の点もそれぞれサンプリングピッチｓの分だけＸ方向に移動するため、撮影レンズ１０を移動することにより、ピンホールディスク６に投影される像もＸ方向に移動する。
【００５３】
この像は前側リレーレンズ１３、後側リレーレンズ１５の作用でカメラ１６の撮像素子１６Ｃに等倍に結像される。よって、撮影レンズ１０を移動することによりピンホールディスク６に形成される像がＸ方向に移動されるが、この像の移動は撮像素子１６Ｃにおいても移動する。ここで、撮像素子１６Ｃに対して像がＸ方向に移動するということは、撮像素子１６Ｃを像に対して相対的に−Ｘ方向に移動したことを意味する。すなわち、撮像素子１６Ｃで観察される視野は移動前の視野よりも−Ｘ方向にサンプリングピッチｓだけ移動した視野を撮影する。
【００５４】
図４では１方向（Ｘ方向）だけの移動になっているが、前述したように、撮影レンズ１０はＸＹの２方向に移動するため、撮像素子１６Ｃにおいて戻り光Ｒの像はＸＹの２方向に移動される。
【００５５】
ここで、撮像素子１６Ｃについて説明する。図５（ａ）は撮像素子１６Ｃのうち４つの画素Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１を示している。これらの画素サイズは７μｍであり、光学分解能の限界値を得るためのサンプリングピッチｓ（＝４．５μｍ）には達していない。まず、この状態で１枚の画像化を行う。
【００５６】
次に、制御部１７が相対移動機構１１を制御して、撮影レンズ１０を戻り光Ｒの光軸（Ｚ方向）に直交する方向（ＸＹ方向）の何れかにサンプリングピッチｓ以下の分だけ移動させる。前述したように、画素サイズの半分（＝３．５μｍ）だけ移動させる。ここでは、まず−Ｙ方向に撮影レンズを３．５μｍ移動させる。これによって撮影される視野はＹ方向に３．５μｍ移動される。
【００５７】
図５（ｂ）の破線は移動前、実線は移動後の画像を示している。つまり、Ｙ方向に３．５μｍ分だけずれた画像が取得される。次に、図５（ｂ）の状態から、相対移動機構１１は、撮影レンズ１０を−Ｘ方向（Ｙ方向と直交）に３．５μｍ移動させる。これにより、図５（ｃ）に示すように、最初の状態（図中の破線の状態）からＸ方向に３．５μｍ、Ｙ方向に３．５μｍずれた画像が取得される。そして、相対移動機構１１は、図５（ｃ）の状態から、撮影レンズ１０をＹ方向に３．５μｍ移動させる。これにより、図５（ｄ）に示すように、最初の状態（図中の破線の状態）からＸ方向に３．５μｍずれた画像が取得される。
【００５８】
制御部１７は、相対移動機構１１を制御して、ＸＹ方向にそれぞれ３．５μｍずつずらしたときの画像を取得し、合計４枚の画像を取得する。制御部１７は取得した４枚の画像に基づいて、画素情報の再配置を行う。これにより、図６のように、擬似的に１６画素により構成された画素情報を得る。
【００５９】
ただし、各画素サイズはもともと粗くなっており、例えばＣ１の画素情報には周辺の画素情報（Ａ３、Ｂ４、Ｂ３、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｄ３、Ｄ２）の情報も含まれている。制御部１７は所定の演算を行うコンピュータであり、差分処理や微分処理等の画像処理を行うことで、擬似的に観察画像の解像度を向上させる。これらの処理を全画素について行うことで、高解像度の画像を生成する。
【００６０】
以上説明したように、相対移動機構１１が撮影レンズ１０を移動させている。相対移動機構１１はピンホールディスク６に形成される戻り光Ｒの像を撮像素子１６Ｃに対して相対移動させており、これにより対物レンズ１２を有する顕微鏡光学系とカメラ１６とピンホールディスク６を有する走査光学系との３者を有して構成する顕微鏡装置において、光学分解能の限界値に達する高い分解能の画像取得を行うことができる。
【００６１】
以上において、図５（ａ）〜（ｄ）に示すように、１つの画素を４分割するように撮影レンズ１０を移動させている。つまり、Ｘ方向およびＹ方向にそれぞれ２分割するように撮影レンズ１０を移動するようにしているが、画素の分割数は任意に設定してもよい。例えば、３×３の９つに設定して、９回の画像取得を行うようにしてもよい。
【００６２】
また、相対移動機構１１が撮影レンズ１０を移動させることにより、ピンホールディスク６に形成される戻り光Ｒの像を撮像素子１６Ｃに対して相対移動させているが、カメラ１６自身を移動させるようにしてもよい。ただし、一般に生物の蛍光観察に用いる高感度撮影カメラは冷却機構の搭載等で重量が大きいため、カメラ１６を移動させるより、本実施形態のように撮影レンズ１０を移動させる方が望ましい。
【００６３】
また、平行平板ガラスを用いて、傾きを前後左右に変化させることで、結像画像の位置を前後左右にずらすようにしてもよい。ただし、平行平板ガラスを用いると、傾きを距離に変化させるため、その対応関係を正確に維持することが難しい。また、傾きを距離に変換させるための演算を行うのが難しい。このため、単に撮影レンズ１０をＸＹ方向に移動させる本実施形態の方が、撮影レンズ１０の移動距離がそのままカメラ１６における像の移動距離になるため、正確且つ簡単になる。
【００６４】
また、制御部１７は高解像度モードと高速モードとを有するようにしてもよい。高解像度モードは、前述したように相対移動機構１１が撮影レンズ１０を移動して、そのときの画像を取得する。そして、制御部１７が画像情報の再配置を行うことで、高分解能の画像を得ている。
【００６５】
この高解像度モードのときには、相対移動機構１１が撮影レンズ１０の移動を行い、制御部１７が画像情報の再配置の演算処理を行うために、所定の時間を要する。つまり、高い分解能の画像を得るために、処理は遅延化する。
【００６６】
例えば、記録用のために高分解能の画像を得る場合には制御部１７に高分解能モードを設定する。これにより、相対移動機構１１を制御して、高分解能の画像を得る。一方、それほど高分解能の画像を得る必要がない場合、例えば通常観察を行うような場合には、制御部１７に高速モードを設定する。
【００６７】
これにより、制御部１７は相対移動機構１１を動作させず、画像情報の再配置も行わない。従って、高い分解能の画像を得ることはできないものの、処理の高速化を実現できる。よって、制御部１７に高解像度モードと高速モードとの何れかを設定可能にしていることで、目的に応じて適宜のモードを使用することができる。
【００６８】
次に、変形例１について説明する。図７は変形例１の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１では、相対移動機構１１は撮影レンズ１０ではなく、後側リレーレンズ１５を戻り光Ｒの光路に対して直交する方向に移動させている。その他の構成は前述した実施形態と同じである。
【００６９】
ただし、対物レンズ１２の倍率は４０倍、ＮＡは０．９５、戻り光Ｒの波長（つまり、蛍光波長）λは５５０ｎｍであるとする。これにより、光学分解能の限界値σは「σ＝０．３５μｍ」となる。対物レンズ１２の倍率は４０倍であるため、撮像素子１６Ｃに拡大投影されて、限界値σは「σ＝１４μｍ＝０．３５×４０」となる。このときの、光学分解能の限界値を得るためのサンプリングピッチｓは、前述した式を用いて「ｓ≦（１／２）×σ＝７μｍ」となる。
【００７０】
ここで、ピンホールディスク６の走査ピッチＰ１がＰ１＝７μｍであるものとし、撮像素子１６Ｃの画素サイズが１４μｍであるとする。従って、走査ピッチＰ１はサンプリングピッチｓの式を満たしているため、光学分解能の限界値の情報を得ることができる。一方、画素サイズは光学分解能の限界値の情報を取得することができない。
【００７１】
そこで、相対移動機構１１はピンホールディスク６に形成される戻り光Ｒの像を撮像素子１６Ｃに対して１方向に移動させる。実施形態で説明したように撮影レンズ１０を移動させてもよいが、本変形例１では後側リレーレンズ１６を移動させている。これによっても、ピンホールディスク６に形成される戻り光Ｒの像を撮像素子１６Ｃに対して相対的に移動させることができる。
【００７２】
本変形例１では、画素サイズが比較的大きな１４μｍの撮像素子１６Ｃを使用している。一般に画素サイズが大きな撮像素子１６Ｃを有するカメラ１６は高感度であるため、高速な現象を捕捉するのに好適である。また、励起光の光量を減少させることができるため、生細胞に与える影響を減らすことができる等の多くのメリットを有する。
【００７３】
従って、画素サイズが大きい場合には、本変形例１のように、後側リレーレンズ１６（勿論、撮影レンズ１０でもよい）を戻り光Ｒの光軸に直交する方向に移動させることにより、画素ずらしを行う。これにより、顕微鏡光学系とカメラと走査光学系との３者を有する顕微鏡装置で高い分解能を有する画像を生成することができる。
【００７４】
また、リレーレンズの倍率を等倍から変更してピンホール６Ｐでの画像を縮小投影した場合等に画素サイズが相対的に大きくことが考えられるが、そのような場合にも本変形例を適用することができる。
【００７５】
なお、本変形例１では後側リレーレンズ１５に相対移動機構１１を取り付けて移動させているが、前側リレーレンズ１３に相対移動機構１１を取り付けて戻り光Ｒの光路に対して直交する方向に移動させるようにしてもよい。
【００７６】
次に、変形例２について説明する。本変形例２では、実施形態と同じく、対物レンズ１２の倍率が２０倍、開口数ＮＡが０．７５、戻り光Ｒの波長λが５５０ｎｍであるとする。よって、光学分解能の限界値σはσ＝０．４５μｍとなり、対物レンズ１２の倍率が２０倍であるため、限界値σはσ＝９μｍとなる。このため、光学分解能の限界値を得るためのサンプリングピッチｓは「ｓ≦４．５μｍ」となる。
【００７７】
一方、本変形例２では、ピンホールディスク６の走査ピッチＰ１はＰ１＝７μｍ、撮像素子１６Ｃの画素サイズは３．５μｍであるとする。従って、画素サイズはサンプリングピッチｓに達しているが、走査ピッチＰ１はサンプリングピッチｓに達していない。また、ピンホールディスク６は連続的に回転しているため、図３のＸ方向には高い分解能で走査を行っている。
【００７８】
図８（ａ）〜（ｃ）は１６画素の撮像素子１６Ｃを示している。なお、ピンホールディスク６の走査ピッチは粗いため、例えばＡ行とＢ行とには殆ど同じ画像情報が伝達されている。また、同様にＣ行とＤ行とには殆ど同じ画像情報が伝達されている。
【００７９】
まず、図８（ａ）の状態の画像を取得する。次に、相対移動機構１１は撮影レンズ１０を光軸方向に直交する−Ｙ方向にサンプリングピッチｓの分（３．５μｍとする）だけ移動させることにより、図８（ｂ）の状態の画像を取得する。
【００８０】
図８（ｂ）の状態の画像は、撮像素子１６ＣをＹ方向に３．５μｍだけ移動させた画像と等価である。これをＥ行、Ｆ行、Ｇ行、Ｈ行で示す。なお、ピンホールディスク６の走査ピッチは粗いため、例えばＥ行とＦ行とには殆ど同じ画像情報が伝達されている。また、同様にＧ行とＨ行とには殆ど同じ画像情報が伝達されている。
【００８１】
そして、制御部１７は、図８（ａ）および（ｂ）の画像に基づいて、差分や微分といった演算を行い、画像の再配置を行う。これにより、図８（ｃ）のような高分解能の画像が得られる。この処理を全ての画素について行うことで、試料Ｓの高分解能の画像を得ることができる。
【００８２】
従って、本変形例２のように、画素サイズはサンプリングピッチｓに達しているものの、走査ピッチＰ１がサンプリングピッチｓに達していない場合には、撮影レンズ１０を１方向に移動させることで、画素ずらしを行い、高解像度の画像を得ることができる。撮影レンズ１０の移動は、ピンホールディスク６に形成される戻り光Ｒの像をカメラ１６に対して相対移動させているため、顕微鏡光学系とカメラと走査光学系との３者を有する顕微鏡装置で高い分解能の画像を得ることができるようになる。
【符号の説明】
【００８３】
１ 顕微鏡装置
２ 光源
５ マイクロレンズディスク
５Ｍ マイクロレンズ
６ ピンホールディスク
６Ｐ ピンホール
７ 連結ドラム
８ モータ
１０ 撮影レンズ
１１ 相対移動機構
１２ 対物レンズ
１３ 前側リレーレンズ
１５ 後側リレーレンズ
１６ カメラ
１６Ｃ 撮像素子
１７ 制御部
Ｆ 焦点
Ｌ レーザ光
Ｒ 戻り光
Ｓ 試料
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に励起光を照射して、試料の画像を観察する顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡装置として蛍光顕微鏡が用いられている。蛍光顕微鏡は、試料に蛍光色素や蛍光タンパクを導入して、レーザ光を励起光として照射し、試料を蛍光させる。そして、この蛍光を観察することにより、試料の画像を取得する。顕微鏡装置では、高い分解能を得ることが求められるが、画素ずらしを行うことで、擬似的に観察画像の解像度を向上させている技術が特許文献１に開示されている。
【０００３】
また、ピンホールディスクとマイクロレンズディスクとを用いて高速に励起光を試料に走査させるニポウディスク方式の共焦点顕微鏡が特許文献２に開示されている。ピンホールディスクには多数のピンホールを配列し、マイクロレンズディスクには多数のマイクロレンズを配列し、ピンホールディスクとマイクロレンズディスクとを回転させることで、励起光を試料に高速に走査させることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２５３６２号公報
【特許文献２】特開２０１１−２２３２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１の顕微鏡（顕微鏡システム）は、顕微鏡光学系（マイクロスコープ）と顕微鏡画像撮像装置（撮像装置）とにより構成されている。そして、画素ずらしを行うための平行平板ガラスを顕微鏡光学系の内部に設けるようにして、平行平板ガラスの傾きを前後左右に変化させることで、結像画像の位置を結像素子上で前後左右にずらすようにしている。
【０００６】
一方、特許文献２の顕微鏡では、顕微鏡光学系およびカメラ（撮像素子）だけではなく、走査系光学系を有している。走査光学系はピンホールディスクおよびマイクロレンズディスクを有して構成しており、顕微鏡光学系とカメラとの間に設けられている。つまり、特許文献１の顕微鏡とは異なり、顕微鏡光学系とカメラと走査光学系との３者により構成されている。
【０００７】
特許文献１の顕微鏡は顕微鏡光学系と撮像装置との２者の光学系を調整することにより、画素ずらしを実現している。これにより、擬似的に観察画像の解像度を向上させることができる。ただし、特許文献２のようなニポウディスク方式の共焦点顕微鏡のように、顕微鏡光学系とカメラと走査光学系との３者の光学系により実現される場合には、単に画素ずらしの技術を適用することができない。
【０００８】
そこで、本発明は、光走査光学系を有する顕微鏡装置で高い分解能の画像を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、試料に照射する励起光を発振する光源と、前記励起光の一部を通過させる複数の開口部を有し、前記励起光を前記試料に走査させる走査光学系と、前記励起光のうち前記開口部を通過した光に前記試料で焦点を結ばせる対物レンズを有し、前記焦点から発生する蛍光を前記開口部に導く顕微鏡光学系と、前記試料から発生する蛍光を検出する検出部と、前記走査光学系を走査することによって前記走査光学系に形成される前記蛍光の像を、前記検出部に対して相対移動させる相対移動機構と、を備えたことを特徴とする。
【００１０】
この顕微鏡装置によれば、相対移動機構が走査光学系に形成される戻り光（蛍光）の像を検出部に対して相対移動させている。戻り光の像を相対移動することで、検出部において画素ずらしを行うことができる。これにより、走査光学系を有する顕微鏡で高い分解能の画像を得ることができる。
【００１１】
また、前記走査光学系は、前記開口部として複数のピンホールを有するピンホールディスクと、このピンホールを回転させる回転部とを有し、この回転部が前記ピンホールディスクを回転することにより前記焦点を前記試料で走査し、前記ピンホールディスク面に前記試料の蛍光の像を形成し、前記ピンホール上の蛍光像を伝達するリレー光学系によってリレーされた前記蛍光の像を検出する前記検出部としての撮像素子を備えていることを特徴とする。
【００１２】
ピンホールディスクを回転させることにより、試料の光軸方向に直交する方向に焦点を走査することができる。走査されたときの戻り光の像はピンホールを通過し、リレー光学系によりリレーされて撮像素子で走査される。これにより、試料の断面情報を得ることができる。
【００１３】
また、前記相対移動機構は、前記対物レンズと前記ピンホールディスクとの間に配置された撮影レンズを光軸方向に直交する方向に移動することにより、前記ピンホールディスクに形成される前記蛍光の像を前記撮像素子に対して相対移動させることを特徴とする。
【００１４】
撮影レンズを光軸方向に直交する方向に移動することにより、ピンホールディスクに形成される戻り光の像を撮像素子に対して相対移動させることができる。
【００１５】
また、前記蛍光の波長をλ、前記対物レンズの開口数をＮＡ、前記撮影レンズの移動ピッチをｓとしたときに、ｓ≦（１／２）×０．６１×（λ／ＮＡ）となるように前記相対移動機構が前記撮影レンズを移動させることを特徴とする。
【００１６】
撮影レンズの移動ピッチｓを前記の式のように設定することで、走査光学系を有する顕微鏡で光学分解能の限界値を得るような高い分解能の画像を得ることができるようになる。
【００１７】
また、前記相対移動機構が動作する高解像度モードと前記相対移動機構が動作しない高速モードとを切り替える制御部を備えたことを特徴とする。
【００１８】
画素ずらしを行う高解像度モードは高い解像度を得ることができるが、処理に時間がかかる。高い解像度が必要でない場合には、画素ずらしを行わない高速モードを選択することで、処理の高速化を実現することができる。
【００１９】
また、前記相対移動機構は、前記リレー光学系を光軸方向に直交する方向に移動することにより、前記ピンホールディスクに形成される像を前記撮像素子に対して相対移動させることを特徴とする。
【００２０】
リレー光学系を光軸方向に直交する方向に移動することによっても、ピンホールディスクに形成される像を撮像素子に対ｓｈ智恵相対移動させることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、相対移動機構が走査光学系に形成される戻り光の像を検出部に対して相対移動させている。このため、戻り光の像を相対移動することで、検出部において画素ずらしを行うことができる。これにより、走査光学系を有する顕微鏡で高い分解能の画像を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施形態の顕微鏡装置の構成図である。
【図２】ピンホールディスクおよびマイクロレンズディスクの構成図である。
【図３】ピンホールおよび走査ピッチを説明する図である。
【図４】撮影レンズの移動前後の焦点を説明する図である。
【図５】撮影レンズを移動したときの撮像素子の像を説明する図である。
【図６】画素の再配置を行ったときの図である。
【図７】変形例１の顕微鏡装置の構成図である。
【図８】変形例２の撮像素子の像の変化を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。図１は実施形態の顕微鏡装置１を示している。顕微鏡装置１は試料Ｓを観察対象としており、光源２とファイバ３とコリメートレンズ４とマイクロレンズディスク５とピンホールディスク６と連結ドラム７とモータ８ダイクロイックミラー９と撮影レンズ１０と相対移動機構１１と対物レンズ１２と前側リレーレンズ１３と蛍光フィルタ１４と後側リレーレンズ１５とカメラ１６と制御部１７とモニタ１８とを備えて構成している。
【００２４】
光源２は励起光としてレーザ光Ｌを発振する。ファイバ３は光ファイバであり、レーザ光Ｌを導光する。ファイバ３の出射側にはコリメートレンズ４が配置されており、ファイバ３から出射されたレーザ光Ｌはコリメートレンズ４で平行光になる。コリメートレンズ４の前方にはマイクロレンズディスク５が配置されている。
【００２５】
図２に示すように、マイクロレンズディスク５は螺旋状に多数のマイクロレンズ５Ｍを配列した回転ディスクである。また、ピンホールディスク６はマイクロレンズ５Ｍと同じパターンで多数のピンホール６Ｐを配列した回転ディスクである。ピンホール６Ｐは観察対象である試料Ｓの焦点の範囲内の光のみを通過させる開口部である。マイクロレンズ５Ｍは対応するピンホール６Ｐにレーザ光Ｌを集光させる機能を有している。
【００２６】
マイクロレンズディスク５とピンホールディスク６とは連結ドラム７により連結されており、連結ドラム７はモータ８に接続されている。モータ８により回転力が付与されることで、マイクロレンズディスク５とピンホールディスク６とが一体的に回転する。連結ドラム７とモータ８とにより回転部が構成される。
【００２７】
マイクロレンズディスク５とピンホールディスク６とはそれぞれ走査光学系（走査板）を構成する。走査光学系により、試料Ｓの水平面（ＸＹ平面）にレーザ光Ｌが走査される。これにより、試料Ｓの所定領域の断層像を取得することができる。
【００２８】
図１および図２に示すように、マイクロレンズディスク５とピンホールディスク６との間にはダイクロイックミラー９を設けている。ダイクロイックミラー９は光源２が発振するレーザ光Ｌの波長を透過し、試料Ｓの蛍光の波長を反射する特性を有する光学素子である。
【００２９】
ピンホール６Ｐをレーザ光Ｌが透過した位置に撮影レンズ（チューブレンズ）１０が配置されている。この撮影レンズ１０によりレーザ光Ｌは平行光になる。撮影レンズ１０にはレーザ光Ｌの光軸方向（Ｚ方向）に対して直交する方向に撮影レンズ１０を微小に移動させる相対移動機構１１が取り付けられている。
【００３０】
相対移動機構１１としては撮影レンズ１０を光軸方向に対して直交する方向に撮影レンズ１０を移動させる機構であればよく、例えば撮影レンズ１０をクランプするホルダを駆動するアクチュエータ等を適用することができる。
【００３１】
撮影レンズ１０により平行光になったレーザ光Ｌの光路に対物レンズ１２が配置されている。この対物レンズ１２によりレーザ光Ｌは観察対象である試料Ｓに焦点Ｆを結ぶ。撮影レンズ１０と対物レンズ１２とにより顕微鏡光学系が構成される。
【００３２】
ダイクロイックミラー９で反射した蛍光（戻り光Ｒ）の光路に前側リレーレンズ１３が配置されており、この前側リレーレンズ１３により戻り光Ｒは平行光になる。戻り光Ｒの光路に蛍光フィルタ１４が配置されている。蛍光フィルタ１４は試料Ｓの蛍光波長成分のみを透過させる。また、戻り光Ｒの光路には後側リレーレンズ１５が配置されている。後側リレーレンズ１５により平行光の戻り光Ｒはカメラ１６の撮像素子１６Ｃに焦点を結ぶ。
【００３３】
制御部１７はカメラ１６に接続されたコンピュータであり、カメラ１６から出力される電気信号に基づいて所定の演算処理を行う。これにより、試料Ｓの画像が生成される。生成された画像はモニタ１８に表示される。制御部１７は光源２とモータ８と相対移動機構１１とカメラ１６とを制御している。
【００３４】
次に動作について説明する。制御部１７は光源２から試料Ｓを励起させる波長を持つレーザ光Ｌを発振させる。このレーザ光Ｌは励起光となる。レーザ光Ｌはファイバ３に集光されており、ファイバ３の他端から広がりをもって発せられる。そして、レーザ光Ｌはコリメートレンズ４により平行光に変換される。平行光となったレーザ光Ｌはマイクロレンズディスク５の各マイクロレンズ５Ｍに照射される。
【００３５】
図２に示すように、マイクロレンズディスク５の個々のマイクロレンズ５Ｍにより集光されたレーザ光Ｌはダイクロイックミラー９を透過する。これは、ダイクロイックミラー９がレーザ光Ｌを透過する光学特性を有しているためである。そして、レーザ光Ｌはマイクロレンズ５Ｍに対応するピンホール６Ｐで焦点を結ぶ。
【００３６】
ピンホール６Ｐを通過したレーザ光Ｌは撮影レンズ１０によって、ピンホール６Ｐの位置に対応する傾きを有する平行光に変換される。この平行光となったレーザ光Ｌは対物レンズ１２に入射して、その傾きに応じて焦点面の対応する位置に焦点Ｆを結像する。従って、試料Ｓに入射されるレーザ光Ｌはその傾きに応じた焦点Ｆを結ぶ。図１では光軸中心の光線を実線で示し、光軸からずれた光線を破線で示している。
【００３７】
試料Ｓにはレーザ光Ｌにより励起される蛍光色素や蛍光タンパク等が導入されている。よって、レーザ光Ｌが試料Ｓで焦点Ｆを結ぶことにより、蛍光を発生する。この蛍光が戻り光Ｒとなる。戻り光Ｒは対物レンズ１２、撮影レンズ１０、ピンホール６Ｐのようにレーザ光Ｌと同じ光路を通って、ダイクロイックミラー９に入射する。
【００３８】
ダイクロイックミラー９は試料Ｓの蛍光の波長の光を反射する特性を有している。よって、戻り光Ｒは反射する。そして、この戻り光Ｒは前側リレーレンズ１３に入射する。ピンホール６Ｐを通過した戻り光Ｒの像は前側リレーレンズ１３、後側リレーレンズ１５の作用でカメラ１６の撮像素子１６Ｃに等倍で結像する。このとき、戻り光Ｒは蛍光フィルタ１４の作用により、蛍光成分のみが選択的に透過されており、蛍光成分以外は除去されている。
【００３９】
このときに、制御部１７はモータ８を回転させるように制御する。これにより、走査光学系であるマイクロレンズディスク５とピンホールディスク６とが一体的に回転する。図２に示すように、ピンホール６Ｐを通過する光が試料Ｓの対応する焦点面で走査され、個々の戻り光Ｒは再びピンホール６Ｐを通過する。そして、ダイクロイックミラー９で反射してカメラ１６の撮像素子１６Ｃを走査される。
【００４０】
これにより、試料Ｓの焦点面の情報がカメラ１６に投影されて試料Ｓの観察が可能になる。また、このときに焦点面以外の光はピンホール６Ｐを殆ど通過しないためカメラ１６に到達しない。従って、カメラ１６で取得する画像は試料Ｓの焦点の範囲内の光のみの画像となり、つまり共焦点画像となる。換言すれば、顕微鏡装置１は共焦点顕微鏡となる。
【００４１】
そして、モータ８がマイクロレンズディスク５およびピンホールディスク６を回転させることで、レーザ光Ｌを試料Ｓに高速に走査させることができる。これにより、試料Ｓの断層を高速に走査させることができ、所定の断層の画像を高速に生成することができる。
【００４２】
ここで、制御部１７は相対移動機構１１を制御して、撮影レンズ１０をレーザ光Ｌの光軸方向に直交する方向に相対的に移動させる。これにより、ピンホールディスク６（走査光学系）に形成される戻り光Ｒ（蛍光）の像をカメラ（検出部）１６に対して相対的に移動させている。
【００４３】
相対移動機構１１が撮影レンズ１０を移動させる移動ピッチｓは、戻り光Ｒの波長をλ、対物レンズ１２の開口数をＮＡとしたときに、「ｓ≦（１／２）×０．６１×（λ／ＮＡ）」となるようにする。これは、光学分解能の限界値をσとしたときに「σ＝０．６１×（λ／ＮＡ）」であり、光学分解能の限界値の情報を得るためのサンプリングピッチｓが「ｓ≦（１／２）×σ」となるためである。
【００４４】
ここで、対物レンズ１２の倍率が２０倍、開口数ＮＡが０．７５、戻り光Ｒの波長λが５５０ｎｍであるとする。この場合、光学分解能の限界値σはσ＝０．４５μｍとなる。ただし、対物レンズ１２の倍率が２０倍になっているため、限界値σはσ＝９（＝０．４５×２０）μｍにカメラ１６の撮像素子１６Ｃに拡大投影される。つまり、光学分解能の限界値σはσ＝９μｍとなる。
【００４５】
一方、図３は、試料Ｓにおける焦点Ｆが走査される走査ピッチＰ１を示している。この図に示すように、破線方向（Ｘ方向）には焦点Ｆが連続しているため、極めて高い分解能で走査を行うことができる。ただし、この方向と直交する方向のピッチ（走査ピッチＰ１）には限界がある。ここでは、この走査ピッチＰ１が７μｍであるとする。また、カメラ１６の撮像素子１６Ｃの画素サイズも７μｍであるとする。
【００４６】
光学分解能の限界値σはσ＝９μｍであり、この限界値σにおけるサンプリングピッチｓは「ｓ≦（１／２）×σ＝４．５μｍ」である。従って、走査ピッチＰ１も画素サイズも７μｍであり、サンプリングピッチｓ（＝４．５μｍ）には達していないため、光学分解能の限界値の情報が得られていないことになる。これにより、高い分解能の画像が得られないことになる。
【００４７】
そこで、相対移動機構１１を用いて撮影レンズ１０を微小移動させる。撮影レンズ１０の移動量はサンプリングピッチｓの移動量であり、つまり「ｓ≦（１／２）×０．６１×（λ／ＮＡ）」である。前記の例では、「ｓ≦４．５μｍ」を充足すればよいが、ここでは、この範囲のうち撮像素子１６Ｃの画素サイズの半分とする。つまり、「ｓ＝３．５μｍ」とする。
【００４８】
相対移動機構１１は撮影レンズ１０を戻り光Ｒの光軸に直交する方向に移動させる。戻り光Ｒの光軸に直交する方向は平面であり、この平面には相互に直交する２方向（ＸＹ方向）がある。走査ピッチＰ１と画素サイズとの両者がサンプリングピッチｓに達していない場合には、相対移動機構１１は撮影レンズ１０をＸＹ方向の２方向に移動させる。一方、何れ一方がサンプリングピッチｓに達していない場合には、相対移動機構１１は撮影レンズ１０をＸＹ方向の何れか１方向に移動させる。
【００４９】
ここでは、走査ピッチＰ１も画素サイズもサンプリングピッチｓに達していないため、相対移動機構１１は撮影レンズ１０をＸＹ方向の２方向に移動させる。図４はピンホールディスク６と撮影レンズ１０との関係を示している。同図において、実線は撮影レンズ１０をＸ方向に移動する前の状態を示しており、破線はＸ方向に移動した後の状態を示している。
【００５０】
移動前において、撮影レンズ１０の焦点はピンホールディスク６の点２１にある。この点２１にピンホール６Ｐが位置した場合、焦点から発せられたレーザ光Ｌは光軸に平行となり対物レンズ１２に集光される。また、戻り光Ｒも同様の光路を通る。このときに、相対移動機構１１は、撮影レンズ１０をＸ方向にサンプリングピッチｓ（つまり、３．５μｍ：図４ではＸ１）だけ移動させる。
【００５１】
撮影レンズ１０をＸ方向に移動させることにより、撮影レンズ１０の焦点は点２２に変化する。点２２にピンホール６Ｐが位置した場合、この焦点から発せられたレーザ光Ｌは光軸に平行となり対物レンズ１２に集光される。また、戻り光Ｒも同様の光路を通る。これらの撮影レンズ１０を通過したレーザ光Ｌはどちらも光軸に平行な光であるため、対物レンズ１２を通過後はどちらも同じ点に集光される。
【００５２】
つまり、撮影レンズ１０をＸ方向にサンプリングピッチｓの分だけ移動させることにより、点２１で観察されていた情報は点２２に移動する。同様に、ピンホールディスク６の他の点もそれぞれサンプリングピッチｓの分だけＸ方向に移動するため、撮影レンズ１０を移動することにより、ピンホールディスク６に投影される像もＸ方向に移動する。
【００５３】
この像は前側リレーレンズ１３、後側リレーレンズ１５の作用でカメラ１６の撮像素子１６Ｃに等倍に結像される。よって、撮影レンズ１０を移動することによりピンホールディスク６に形成される像がＸ方向に移動されるが、この像の移動は撮像素子１６Ｃにおいても移動する。ここで、撮像素子１６Ｃに対して像がＸ方向に移動するということは、撮像素子１６Ｃを像に対して相対的に−Ｘ方向に移動したことを意味する。すなわち、撮像素子１６Ｃで観察される視野は移動前の視野よりも−Ｘ方向にサンプリングピッチｓだけ移動した視野を撮影する。
【００５４】
図４では１方向（Ｘ方向）だけの移動になっているが、前述したように、撮影レンズ１０はＸＹの２方向に移動するため、撮像素子１６Ｃにおいて戻り光Ｒの像はＸＹの２方向に移動される。
【００５５】
ここで、撮像素子１６Ｃについて説明する。図５（ａ）は撮像素子１６Ｃのうち４つの画素Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１を示している。これらの画素サイズは７μｍであり、光学分解能の限界値を得るためのサンプリングピッチｓ（＝４．５μｍ）には達していない。まず、この状態で１枚の画像化を行う。
【００５６】
次に、制御部１７が相対移動機構１１を制御して、撮影レンズ１０を戻り光Ｒの光軸（Ｚ方向）に直交する方向（ＸＹ方向）の何れかにサンプリングピッチｓ以下の分だけ移動させる。前述したように、画素サイズの半分（＝３．５μｍ）だけ移動させる。ここでは、まず−Ｙ方向に撮影レンズを３．５μｍ移動させる。これによって撮影される視野はＹ方向に３．５μｍ移動される。
【００５７】
図５（ｂ）の破線は移動前、実線は移動後の画像を示している。つまり、Ｙ方向に３．５μｍ分だけずれた画像が取得される。次に、図５（ｂ）の状態から、相対移動機構１１は、撮影レンズ１０を−Ｘ方向（Ｙ方向と直交）に３．５μｍ移動させる。これにより、図５（ｃ）に示すように、最初の状態（図中の破線の状態）からＸ方向に３．５μｍ、Ｙ方向に３．５μｍずれた画像が取得される。そして、相対移動機構１１は、図５（ｃ）の状態から、撮影レンズ１０をＹ方向に３．５μｍ移動させる。これにより、図５（ｄ）に示すように、最初の状態（図中の破線の状態）からＸ方向に３．５μｍずれた画像が取得される。
【００５８】
制御部１７は、相対移動機構１１を制御して、ＸＹ方向にそれぞれ３．５μｍずつずらしたときの画像を取得し、合計４枚の画像を取得する。制御部１７は取得した４枚の画像に基づいて、画素情報の再配置を行う。これにより、図６のように、擬似的に１６画素により構成された画素情報を得る。
【００５９】
ただし、各画素サイズはもともと粗くなっており、例えばＣ１の画素情報には周辺の画素情報（Ａ３、Ｂ４、Ｂ３、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｄ３、Ｄ２）の情報も含まれている。制御部１７は所定の演算を行うコンピュータであり、差分処理や微分処理等の画像処理を行うことで、擬似的に観察画像の解像度を向上させる。これらの処理を全画素について行うことで、高解像度の画像を生成する。
【００６０】
以上説明したように、相対移動機構１１が撮影レンズ１０を移動させている。相対移動機構１１はピンホールディスク６に形成される戻り光Ｒの像を撮像素子１６Ｃに対して相対移動させており、これにより対物レンズ１２を有する顕微鏡光学系とカメラ１６とピンホールディスク６を有する走査光学系との３者を有して構成する顕微鏡装置において、光学分解能の限界値に達する高い分解能の画像取得を行うことができる。
【００６１】
以上において、図５（ａ）〜（ｄ）に示すように、１つの画素を４分割するように撮影レンズ１０を移動させている。つまり、Ｘ方向およびＹ方向にそれぞれ２分割するように撮影レンズ１０を移動するようにしているが、画素の分割数は任意に設定してもよい。例えば、３×３の９つに設定して、９回の画像取得を行うようにしてもよい。
【００６２】
また、相対移動機構１１が撮影レンズ１０を移動させることにより、ピンホールディスク６に形成される戻り光Ｒの像を撮像素子１６Ｃに対して相対移動させているが、カメラ１６自身を移動させるようにしてもよい。ただし、一般に生物の蛍光観察に用いる高感度撮影カメラは冷却機構の搭載等で重量が大きいため、カメラ１６を移動させるより、本実施形態のように撮影レンズ１０を移動させる方が望ましい。
【００６３】
また、平行平板ガラスを用いて、傾きを前後左右に変化させることで、結像画像の位置を前後左右にずらすようにしてもよい。ただし、平行平板ガラスを用いると、傾きを距離に変化させるため、その対応関係を正確に維持することが難しい。また、傾きを距離に変換させるための演算を行うのが難しい。このため、単に撮影レンズ１０をＸＹ方向に移動させる本実施形態の方が、撮影レンズ１０の移動距離がそのままカメラ１６における像の移動距離になるため、正確且つ簡単になる。
【００６４】
また、制御部１７は高解像度モードと高速モードとを有するようにしてもよい。高解像度モードは、前述したように相対移動機構１１が撮影レンズ１０を移動して、そのときの画像を取得する。そして、制御部１７が画像情報の再配置を行うことで、高分解能の画像を得ている。
【００６５】
この高解像度モードのときには、相対移動機構１１が撮影レンズ１０の移動を行い、制御部１７が画像情報の再配置の演算処理を行うために、所定の時間を要する。つまり、高い分解能の画像を得るために、処理は遅延化する。
【００６６】
例えば、記録用のために高分解能の画像を得る場合には制御部１７に高分解能モードを設定する。これにより、相対移動機構１１を制御して、高分解能の画像を得る。一方、それほど高分解能の画像を得る必要がない場合、例えば通常観察を行うような場合には、制御部１７に高速モードを設定する。
【００６７】
これにより、制御部１７は相対移動機構１１を動作させず、画像情報の再配置も行わない。従って、高い分解能の画像を得ることはできないものの、処理の高速化を実現できる。よって、制御部１７に高解像度モードと高速モードとの何れかを設定可能にしていることで、目的に応じて適宜のモードを使用することができる。
【００６８】
次に、変形例１について説明する。図７は変形例１の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１では、相対移動機構１１は撮影レンズ１０ではなく、後側リレーレンズ１５を戻り光Ｒの光路に対して直交する方向に移動させている。その他の構成は前述した実施形態と同じである。
【００６９】
ただし、対物レンズ１２の倍率は４０倍、ＮＡは０．９５、戻り光Ｒの波長（つまり、蛍光波長）λは５５０ｎｍであるとする。これにより、光学分解能の限界値σは「σ＝０．３５μｍ」となる。対物レンズ１２の倍率は４０倍であるため、撮像素子１６Ｃに拡大投影されて、限界値σは「σ＝１４μｍ＝０．３５×４０」となる。このときの、光学分解能の限界値を得るためのサンプリングピッチｓは、前述した式を用いて「ｓ≦（１／２）×σ＝７μｍ」となる。
【００７０】
ここで、ピンホールディスク６の走査ピッチＰ１がＰ１＝７μｍであるものとし、撮像素子１６Ｃの画素サイズが１４μｍであるとする。従って、走査ピッチＰ１はサンプリングピッチｓの式を満たしているため、光学分解能の限界値の情報を得ることができる。一方、画素サイズは光学分解能の限界値の情報を取得することができない。
【００７１】
そこで、相対移動機構１１はピンホールディスク６に形成される戻り光Ｒの像を撮像素子１６Ｃに対して１方向に移動させる。実施形態で説明したように撮影レンズ１０を移動させてもよいが、本変形例１では後側リレーレンズ１６を移動させている。これによっても、ピンホールディスク６に形成される戻り光Ｒの像を撮像素子１６Ｃに対して相対的に移動させることができる。
【００７２】
本変形例１では、画素サイズが比較的大きな１４μｍの撮像素子１６Ｃを使用している。一般に画素サイズが大きな撮像素子１６Ｃを有するカメラ１６は高感度であるため、高速な現象を捕捉するのに好適である。また、励起光の光量を減少させることができるため、生細胞に与える影響を減らすことができる等の多くのメリットを有する。
【００７３】
従って、画素サイズが大きい場合には、本変形例１のように、後側リレーレンズ１６（勿論、撮影レンズ１０でもよい）を戻り光Ｒの光軸に直交する方向に移動させることにより、画素ずらしを行う。これにより、顕微鏡光学系とカメラと走査光学系との３者を有する顕微鏡装置で高い分解能を有する画像を生成することができる。
【００７４】
また、リレーレンズの倍率を等倍から変更してピンホール６Ｐでの画像を縮小投影した場合等に画素サイズが相対的に大きくことが考えられるが、そのような場合にも本変形例を適用することができる。
【００７５】
なお、本変形例１では後側リレーレンズ１５に相対移動機構１１を取り付けて移動させているが、前側リレーレンズ１３に相対移動機構１１を取り付けて戻り光Ｒの光路に対して直交する方向に移動させるようにしてもよい。
【００７６】
次に、変形例２について説明する。本変形例２では、実施形態と同じく、対物レンズ１２の倍率が２０倍、開口数ＮＡが０．７５、戻り光Ｒの波長λが５５０ｎｍであるとする。よって、光学分解能の限界値σはσ＝０．４５μｍとなり、対物レンズ１２の倍率が２０倍であるため、限界値σはσ＝９μｍとなる。このため、光学分解能の限界値を得るためのサンプリングピッチｓは「ｓ≦４．５μｍ」となる。
【００７７】
一方、本変形例２では、ピンホールディスク６の走査ピッチＰ１はＰ１＝７μｍ、撮像素子１６Ｃの画素サイズは３．５μｍであるとする。従って、画素サイズはサンプリングピッチｓに達しているが、走査ピッチＰ１はサンプリングピッチｓに達していない。また、ピンホールディスク６は連続的に回転しているため、図３のＸ方向には高い分解能で走査を行っている。
【００７８】
図８（ａ）〜（ｃ）は１６画素の撮像素子１６Ｃを示している。なお、ピンホールディスク６の走査ピッチは粗いため、例えばＡ行とＢ行とには殆ど同じ画像情報が伝達されている。また、同様にＣ行とＤ行とには殆ど同じ画像情報が伝達されている。
【００７９】
まず、図８（ａ）の状態の画像を取得する。次に、相対移動機構１１は撮影レンズ１０を光軸方向に直交する−Ｙ方向にサンプリングピッチｓの分（３．５μｍとする）だけ移動させることにより、図８（ｂ）の状態の画像を取得する。
【００８０】
図８（ｂ）の状態の画像は、撮像素子１６ＣをＹ方向に３．５μｍだけ移動させた画像と等価である。これをＥ行、Ｆ行、Ｇ行、Ｈ行で示す。なお、ピンホールディスク６の走査ピッチは粗いため、例えばＥ行とＦ行とには殆ど同じ画像情報が伝達されている。また、同様にＧ行とＨ行とには殆ど同じ画像情報が伝達されている。
【００８１】
そして、制御部１７は、図８（ａ）および（ｂ）の画像に基づいて、差分や微分といった演算を行い、画像の再配置を行う。これにより、図８（ｃ）のような高分解能の画像が得られる。この処理を全ての画素について行うことで、試料Ｓの高分解能の画像を得ることができる。
【００８２】
従って、本変形例２のように、画素サイズはサンプリングピッチｓに達しているものの、走査ピッチＰ１がサンプリングピッチｓに達していない場合には、撮影レンズ１０を１方向に移動させることで、画素ずらしを行い、高解像度の画像を得ることができる。撮影レンズ１０の移動は、ピンホールディスク６に形成される戻り光Ｒの像をカメラ１６に対して相対移動させているため、顕微鏡光学系とカメラと走査光学系との３者を有する顕微鏡装置で高い分解能の画像を得ることができるようになる。
【符号の説明】
【００８３】
１ 顕微鏡装置
２ 光源
５ マイクロレンズディスク
５Ｍ マイクロレンズ
６ ピンホールディスク
６Ｐ ピンホール
７ 連結ドラム
８ モータ
１０ 撮影レンズ
１１ 相対移動機構
１２ 対物レンズ
１３ 前側リレーレンズ
１５ 後側リレーレンズ
１６ カメラ
１６Ｃ 撮像素子
１７ 制御部
Ｆ 焦点
Ｌ レーザ光
Ｒ 戻り光
Ｓ 試料
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に照射する励起光を発振する光源と、
前記励起光の一部を通過させる複数の開口部を有し、前記励起光を前記試料に走査させる走査光学系と、
前記励起光のうち前記開口部を通過した光に前記試料で焦点を結ばせる対物レンズを有し、前記焦点から発生する蛍光を前記開口部に導く顕微鏡光学系と、
前記試料から発生する蛍光を検出する検出部と、
前記走査光学系を走査することによって前記走査光学系に形成される前記蛍光の像を、前記検出部に対して相対移動させる相対移動機構と、
を備えたことを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記走査光学系は、前記開口部として複数のピンホールを有するピンホールディスクと、このピンホールを回転させる回転部とを有し、この回転部が前記ピンホールディスクを回転することにより前記焦点を前記試料で走査し、前記ピンホールディスク面に前記試料の蛍光の像を形成し、
前記ピンホール上の蛍光像を伝達するリレー光学系によってリレーされた前記蛍光の像を検出する前記検出部としての撮像素子を備えていること
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記相対移動機構は、前記対物レンズと前記ピンホールディスクとの間に配置された撮影レンズを光軸方向に直交する方向に移動することにより、前記ピンホールディスクに形成される前記蛍光の像を前記撮像素子に対して相対移動させること
を特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記蛍光の波長をλ、前記対物レンズの開口数をＮＡ、前記撮影レンズの移動ピッチをｓとしたときに、
ｓ≦（１／２）×０．６１×（λ／ＮＡ）
となるように前記相対移動機構が前記撮影レンズを移動させること
を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記相対移動機構が動作する高解像度モードと前記相対移動機構が動作しない高速モードとを切り替える制御部を備えたこと
を特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記相対移動機構は、前記リレー光学系を光軸方向に直交する方向に移動することにより、前記ピンホールディスクに形成される像を前記撮像素子に対して相対移動させること
を特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
【請求項１】
試料に照射する励起光を発振する光源と、
前記励起光の一部を通過させる複数の開口部を有し、前記励起光を前記試料に走査させる走査光学系と、
前記励起光のうち前記開口部を通過した光に前記試料で焦点を結ばせる対物レンズを有し、前記焦点から発生する蛍光を前記開口部に導く顕微鏡光学系と、
前記試料から発生する蛍光を検出する検出部と、
前記走査光学系を走査することによって前記走査光学系に形成される前記蛍光の像を、前記検出部に対して相対移動させる相対移動機構と、
を備えたことを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記走査光学系は、前記開口部として複数のピンホールを有するピンホールディスクと、このピンホールを回転させる回転部とを有し、この回転部が前記ピンホールディスクを回転することにより前記焦点を前記試料で走査し、前記ピンホールディスク面に前記試料の蛍光の像を形成し、
前記ピンホール上の蛍光像を伝達するリレー光学系によってリレーされた前記蛍光の像を検出する前記検出部としての撮像素子を備えていること
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記相対移動機構は、前記対物レンズと前記ピンホールディスクとの間に配置された撮影レンズを光軸方向に直交する方向に移動することにより、前記ピンホールディスクに形成される前記蛍光の像を前記撮像素子に対して相対移動させること
を特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記蛍光の波長をλ、前記対物レンズの開口数をＮＡ、前記撮影レンズの移動ピッチをｓとしたときに、
ｓ≦（１／２）×０．６１×（λ／ＮＡ）
となるように前記相対移動機構が前記撮影レンズを移動させること
を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記相対移動機構が動作する高解像度モードと前記相対移動機構が動作しない高速モードとを切り替える制御部を備えたこと
を特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記相対移動機構は、前記リレー光学系を光軸方向に直交する方向に移動することにより、前記ピンホールディスクに形成される像を前記撮像素子に対して相対移動させること
を特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１３−５４１０２（Ｐ２０１３−５４１０２Ａ）
【公開日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９０６１９（Ｐ２０１１−１９０６１９）
【出願日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（０００００６５０７）横河電機株式会社 (4,443)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（０００００６５０７）横河電機株式会社 (4,443)
【Ｆターム（参考）】
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