飼料添加剤及び飼料
【課題】鳥類及び哺乳類、特に家畜の疾病を予防又は治療するための安全かつ簡便な手段を提供する。特に、グラム陽性細菌によって引き起こされる家畜の感染症を予防又は治療するための手段を提供する。
【解決手段】マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）及び／又はラムノリピッド（ＲＬ）を、鳥類又は哺乳類に摂取させる。
【解決手段】マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）及び／又はラムノリピッド（ＲＬ）を、鳥類又は哺乳類に摂取させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖脂質を含有する飼料添加剤、飼料及びこれらを用いた鳥類及び哺乳類の飼育方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
家畜の感染症は、家畜の体重を減少させたり、様々な病状を引き起したりするなど、その商品価値を著しく低下させる。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）は、ウシ、ヒツジ、ヤギの乳房炎、皮下腫瘍、膿血症、馬の発疹、豚、鶏の関節炎、皮膚炎、敗血症の原因菌である。また、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）は、豚の髄膜炎、敗血症、心内膜炎、関節炎の原因菌であり、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）はウシの鼓張症の原因菌である。
【０００３】
抗生物質を家畜飼料に少量添加することにより家畜の成長が促進されることが１９４０年代に発見され、それ以来、家畜の成長を促進したり、疾病を予防したりする手段として、家畜の飼料に抗生物質を添加することが広く行われてきた。抗生物質は、家畜の病原菌感染の予防、代謝の改善、腸内の有害菌の増殖抑制の作用を示し、結果として疾病を予防し、成長を促進すると考えられているが、詳細は依然不明である。その一方で、飼料に抗生物質を混ぜることは、結果的に抗生物質を外環境に広くばら撒くこととなり、畜産界においても抗生物質耐性菌の出現が問題となっている。例えば、代表的な抗生物質耐性菌であるＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））は、馬などの家畜でも発見されていることが報告されている。
このような背景下、近年では、抗生物質の飼料への添加が厳しく規制されるようになってきている。例えば、欧州では２００６年までに抗生物質の飼料が全面禁止され、日本でも使用できる抗生物質の数が段階的に減ってきている。また、このような動きと相まって、生産者からは抗生物質の代替物についての要望が大きくなっている。
【０００４】
このような抗生物質の代替の流れを受け、一部では、乳酸菌が生産するナイシン、バチルス菌が生産するイツリンなどのポリペプチド類を抗生物質の代わりに使用する動きも出てきている。また、乳化剤として缶コーヒーなどに添加されている糖脂質であるショ糖エステル類がバチルス菌等に対する抗菌作用を期待されて添加されている。
【０００５】
一方、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）やラムノリピッドに代表される糖脂質には、界面活性作用をはじめとするさまざまな性質があり、以下に述べるような多様な用途への展開が図られている。例えば、ＭＥＬを含むリポソームを用いて、遺伝子の導入効率を向上させる技術（特許文献１）、ＭＥＬを用いて薬剤耐性等の遺伝子を含むリポソームの形成を阻害し、薬剤耐性菌等の発生を減少させる方法（特許文献２）、ＭＥＬを抗炎症剤及び抗アレルギー剤の有効成分として用いる技術（特許文献３）等が知られている。また、ラムノリピッドを用いて天然繊維の吸水性を向上させる技術（特許文献４）、ラムノリピッドを用いて有害使用性有機化合物を含む非処理物から前記有機化合物を分離する技術（特許文献５）、ラムノリピッドを用いて高密度冷熱蓄熱輸送用の氷スラリーを調製することにより、氷の凝集及び合一を防止する技術（特許文献６）等が知られている。なお、ＭＥＬやラムノリピッドの抗菌性は一部報告されているが（非特許文献１、非特許文献２）、家畜の感染症を引き起こす細菌に対する抗菌性については、未だ検討されておらず、ＭＥＬやラムノリピッドを畜産分野で適用した例はない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１７４７２７号公報
【特許文献２】特開２００６−１５８３８７号公報
【特許文献３】特開２００５−６８０１５号公報
【特許文献４】特開２００２−１０５８５４号公報
【特許文献５】特開２００１−３２７８０３号公報
【特許文献６】特開２００１−１３１５３８号公報
【非特許文献１】Fat. Sci. Technol., 91, 363-366, 1989
【非特許文献２】Biotechnol., 29, 91-96, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、鳥類及び哺乳類、特に家畜の疾病を予防又は治療するための安全かつ簡便な手段を提供することを課題とする。本発明は、特に、グラム陽性細菌によって引き起こされる家畜の感染症を予防又は治療するための手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）及びラムノリピッド（ＲＬ）等の糖脂質が、家畜の感染症を引き起こすグラム陽性細菌に対して、抗菌活性を有することを見出し、発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）マンノシルエリスリトールリピッド及び／又はラムノリピッドを含有する鳥類又は哺乳類用の飼料添加剤。
（２）家畜用であることを特徴とする、（１）に記載の飼料添加剤。
（３）マンノシルエリスリトールリピッドが、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する酵母から得られることを特徴とする、（１）又は（２）の何れか一に記載の飼料添加剤。（４）ラムノリピッドが、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する細菌から得られることを特徴とする、（１）〜（３）の何れか一に記載の飼料添加剤。
（５）疾病の予防又は治療用であることを特徴とする、（１）〜（４）の何れか一に記載の飼料添加剤。
（６）前記疾病がグラム陽性細菌により引き起こされる感染症であることを特徴とする、（５）に記載の飼料添加剤。
（７）グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属又はストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する細菌である（６）に記載の飼料添加剤。
（８）グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィノコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）又はストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）である（７）に記載の飼料添加剤。
（９）（１）〜（８）の何れか一に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
（１０）（９）に記載の飼料を、鳥類又は哺乳類に摂取させることを特徴とする、鳥類又は哺乳類の飼育方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の飼料添加剤を飼料に混合し、鳥類又は哺乳類に摂取させることにより、疾病を予防又は治療することができる。具体的には、グラム陽性細菌による感染症を予防又は治療することができる。本発明の飼料添加剤を含有する飼料は、鶏、豚、牛などの家畜の飼育に好適に用いることができる。また、本発明の飼料添加剤は、生分解性が高く、生体及び環境に対する安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の飼料添加剤は、家畜の疾病予防及び／又は治療効果を有する糖脂質、特にマン
ノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）及び／又はラムノリピッド（ＲＬ）を含有することを特徴とする。
【００１２】
ＭＥＬは、糖脂質型のバイオサーファクタントの一種で、マンノース、エリスリトール及び脂肪酸が結合した構造を有しており、下記一般式（１）で表される。
【００１３】
【化１】
【００１４】
一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、炭素数３〜２５の脂肪族アシル基である。特に、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、炭素数５〜１４の脂肪族アシル基であることが好ましい。また、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、炭素数５〜１３の脂肪族アシル基であってもよい。これらの脂肪族アシル基は、直鎖状であっても分岐状であってもよく、飽和であっても不飽和であってもよい。また、Ｒ3及びＲ4は、一方がアセチル基であり、他方が水素であるか、両方がアセチル基である。
なお、Ｒ3及びＲ4が共にアセチル基であるものはＭＥＬ−Ａ、Ｒ3が水素であり、Ｒ4がアセチル基であるものはＭＥＬ−Ｂ、Ｒ3がアセチル基であり、Ｒ4が水素であるものはＭＥＬ−Ｃと呼ばれる。
また、本発明の飼料添加剤におけるＭＥＬは、一種のみであっても、複数種の混合物であってもよい。
【００１５】
本発明において用いるＭＥＬは、菌類、特に酵母類などの微生物を培養して得ることができる。例えば、シュードザイマ（Pseudozyma）属、カンジダ（Candida）属、クルツマノミセス(Kurtzmanomyces)属に属する酵母等を用いることができる。また、Shizonella melanogrammaを用いることもできる。この中でも、シュードザイマ属に属する酵母を用いることが好ましい。シュードザイマ属に属する酵母としては、Pseudozyma aphidis、Pseudozyma antarctica等が挙げられる。具体的には、例えば、Pseudozyma aphidis ＮＢＲＣ
１０１８２菌株、Peudozyma Antarctica ＮＢＲＣ １０２６０菌株、Peudozyma Antarctica ＮＢＲＣ １０７３６菌株を用いることができる。
ＮＢＲＣ １０１８２菌株、ＮＢＲＣ １０２６０菌株、ＮＢＲＣ １０７３６菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に登録されている株である。
また、ＭＥＬは、合成したものや市販品を用いることもできる。
【００１６】
ラムノリピッドは、糖脂質型のバイオサーファクタントの一種で、ラムノースと脂肪酸が結合した構造を有している。本発明において用いるラムノリピッドは特に制限されないが、例えば下記一般式（２）又は一般式（３）で表される構造を有するものを用いることができる。
【００１７】
【化２】
【００１８】
一般式（２）において、Ｒ5は、水素原子、−ＣＨ2−〔ＣＨ（ＯＨ）〕m−ＣＨ2（ＯＨ）、−（ＸＯ）nＨ、若しくは炭素数１〜３６のアルキル基、アルケニル基又は脂肪族アシル基を示す。ここで、アルキル基、アルケニル基は直鎖状であっても分岐状であってもよく、脂肪族アシル基は直鎖状であっても分岐状であってもよく、飽和であっても不飽和であってもよい。また、ｍは０〜８の整数であり、Ｘはエチレン、プロピレン及びブチレンの少なくとも一種を示し、ｎは１〜１０００の整数である。Ｒ6は、水素原子又は２−デセノイル基である。Ｒ5とＲ6は独立している。
【００１９】
【化３】
【００２０】
一般式（３）において、Ｒ7は、水素原子、−ＣＨ2−〔ＣＨ（ＯＨ）〕m−ＣＨ2（ＯＨ）、−（ＸＯ）nＨ、若しくは炭素数１〜３６のアルキル基、アルケニル基又は脂肪族アシル基を示す。ここで、アルキル基、アルケニル基は直鎖状であっても分岐状であってもよく、脂肪族アシル基は直鎖状であっても分岐状であってもよく、飽和であっても不飽和であってもよい。また、ｍは０〜８の整数であり、Ｘはエチレン、プロピレン及びブチレンの少なくとも一種を示し、ｎは１〜１０００の整数である。Ｒ8は、水素原子又は２−デセノイル基である。Ｒ7とＲ8は独立している。
また、本発明の飼料添加剤におけるラムノリピッドは、一種のみであっても、複数種の混合物であってもよい。
【００２１】
本発明において用いるラムノリピッドは、細菌を培養して得ることができる。例えば、
シュードモナス（Pseudomonas）属、バークホルデリア（Burkholderia）属に属する細菌等を用いることができる。この中でも、シュードモナス属に属する細菌を用いることが好ましい。シュードモナス属に属する細菌としては、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas chlororaphis等が挙げられるが、Pseudomonas sp. を用いることもできる。バークホルデリア属に属する細菌としては、Burkholderia pseudomalle等が挙げられる。この中でも、特にPseudomonas aeruginosaを用いることが好ましい。具体的には、例えばPseudomonas aeruginosa ＮＢＲＣ ３９２４菌株、Pseudomonas sp. ＤＳＭ ２８７４菌株等を用いることができる。
ＮＢＲＣ ３９２４菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に登録されている菌株である。
ＤＳＭ ２８７４菌株は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）に登録されている菌株である。
また、ラムノリピッドは、合成したものや市販品を用いることもできる。
【００２２】
上述した微生物を用いてＭＥＬ及びラムノリピッドを生産させるためには、以下のような方法を用いることができる。
ＭＥＬを生産させるためには、天然油脂類、脂肪酸、アルコール、ケトン類、炭化水素類、ｎ−アルカン等の原料のうち、用いる微生物に適した原料を選択し、その微生物の培養に通常用いられる培養温度を用いて培養すればよい。原料として好ましいのは、天然油脂類であり、例えば、大豆油、ひまわり油、ココナッツ油、綿実油、コーン油、パーム油等を用いることができ、この中でも特に大豆油が好ましく用いられる。
また、ラムノリピッドを生産させるためには、天然油脂類、脂肪酸、アルコール、ケトン類、炭化水素類、ｎ−アルカン、糖類等の原料のうち、用いる微生物に適した原料を選択し、その微生物の培養に通常用いられる培養温度を用いて培養すればよい。このような方法として、例えば、特開平１０−７５７９６号公報に記載の方法を用いることができる。
何れの場合も、培養方法は特に制限されず、静置培養、往復動式振とう培養、回転動式振とう培養、ジャーファーメンター培養などによる液体培養法や固体培養法を用いることができる。
【００２３】
Pseudozyma属に属する酵母を用いて、ＭＥＬを生産する場合には、通常Pseudozyma属に属する酵母の培養に用いられる培地に、大豆油等の天然油脂類を添加し、２０℃〜３５℃で培養すればよい。
また、Pseudomonas属に属する細菌を用いて、ラムノリピッドを生産する場合には、通常Pseudomonas属に属する細菌の培養に用いられる培地に、大豆油等の天然油脂類、グルコース等の糖類、エタノール等のアルコール類を添加し、２０〜４０℃で培養すればよい。
【００２４】
また、微生物を用いてＭＥＬ及び／又はラムノリピッドを生産する場合は、培養物を精製し、ＭＥＬ及び／又はラムノリピッドの精製品を用いてもよいし、培養物を遠心分離し、ＭＥＬ及び／又はラムノリピッドを含む分画を用いてもよい。また、培養物をそのまま用いてもよく、例えば、培養液や固体培養物を乾燥・粉砕したものなどを用いることができる。
【００２５】
本発明の飼料添加剤は、ＭＥＬ及びラムノリピッドの何れかを含んでいてもよく、これらの両方を含んでいてもよい。また、ＭＥＬ及び／又はラムノリピッドの含有量は、特に制限されないが、効果を十分に得る観点からは、１質量％以上であることが好ましい。
【００２６】
また、本発明の飼料添加剤は、ＭＥＬ及び／又はラムノリピッドの他に、鳥類又は哺乳類の疾病を予防又は治療に有効な成分、栄養補助成分、保存安定性を高める成分等の任意
成分をさらに含むものであってもよい。このような任意成分としては、例えば、エンテロコッカス類、バチルス類、ビフィズス菌類等の生菌剤；アミラーゼ、リパーゼ等の酵素；Ｌ−アスコルビン酸、塩化コリン、イノシトール、葉酸等のビタミン；塩化カリウム、クエン酸鉄、酸化マグネシウム、リン酸塩類等のミネラル、ＤＬ−アラニン、ＤＬ−メチオニン、塩酸Ｌ−リジン等のアミノ酸；フマル酸、酪酸、乳酸、酢酸及びそれらの塩類等の有機酸；エトキシキン、ジブチルヒドロキシトルエン等の抗酸化剤；プロピオン酸カルシウム等の防カビ剤；ＣＭＣ、カゼインナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム等の粘結剤；グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等の乳化剤；アスタキサンチン、カンタキサンチン等の色素；各種エステル、エーテル、ケトン類等の着香料が挙げられる。
【００２７】
本発明の飼料添加剤の剤形は特に制限されず、例えば粉末、液体、錠剤など任意の形態とすることができる。本発明の飼料添加剤は、ＭＥＬ及び／又はラムノリピッド、並びに必要に応じて任意成分を混合し、製剤化することにより製造することができる。
【００２８】
また、ＭＥＬ及びラムノリピッドは、鳥類又は哺乳類の疾病を引き起こす細菌に対して抗菌活性を示すことから、本発明の飼料添加剤は、これらの細菌によって引き起こされる鳥類又は哺乳類の疾病を予防又は治療するために用いることができる。
本発明の飼料添加剤は、特にグラム陽性細菌により引き起こされる感染症の予防又は治療に好適に用いることができる。
このようなグラム陽性細菌としては、例えば、Micrococcus、Staphylococcus、Streptococcus、Planococcus、Stomatococcus、Enterococcus、Peptococcus、Peptostreptococcus、Ruminococcus、Leuconostoc、Pediococcus、Aerococcus、Gemella、Coprococcus、Sarcina、Bacillus、Clostridium、Lactobacillus、Listeria、Erysipelothrix、Corynebacterium、Rhodococcus、Propionibacterium、Eubacterium、Actinomyces、Bifidobacterium、Mycobacterium、Nocardia、Dermatophilus等の属に属する細菌が挙げられる。
本発明の飼料添加剤は、特に、スタフィロコッカス属又はストレプトコッカス属に属する細菌、具体的にはStaphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Streptococcus suis、Streptococcus bovis等により引き起こされる疾病の予防又は治療に好適に用いることができる。
【００２９】
本発明の飼料添加剤は、鳥類又は哺乳類の飼料、ペットフード、ペット用サプリメント（以下、飼料という。）に用いられる他の飼料成分と混合して、鳥類又は哺乳類用の飼料とすることができる。飼料の種類や成分は、特に制限されない。また、本発明の飼料には、飼料添加剤に添加することができる、上記任意成分を加えて調製してもよい。また、本発明の飼料は、鳥類又は哺乳類の疾病を予防又は治療するための飼料とすることもできる。
【００３０】
本発明の飼料におけるＭＥＬ及び／又はラムノリピッドの含有量は、与える動物の種類、健康状態、飼料の種類、飼料成分、年齢、性別、体重等により適宜調節され、特に制限されないが、乾物質量当たり１〜１００００質量ｐｐｍ、好ましくは１０〜１０００質量ｐｐｍであることが好ましい。
【００３１】
本発明の飼料は、飼料添加剤をそのまま飼料成分に添加し、混合して製造することができる。この際、粉末状、固形状の飼料添加剤を用いる場合は、混合を容易にするために飼料添加剤を液状又はゲル状の形態にしてもよい。この場合は、水、大豆油、菜種油、コーン油などの植物油、液体動物油、ポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物を液体担体として用いることができる。また、飼料中におけるＭＥＬ及び／又はラムノリピッドの均一性を保つために、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、カゼインナトリウム、アラビアゴム、グアーガム、タマ
リンド種子多糖類などの水溶性多糖類を配合することも好ましい。
【００３２】
本発明の飼料を摂取させる動物の種類は、鳥類又は哺乳類である。例えば、家畜や犬、猫などのペットに用いることができる。本発明の飼料は、この中でも家畜、特に鶏、豚、牛の飼育に好適である。摂取させる飼料の量は、動物の種類、体重、年齢、性別、健康状態、飼料の成分などにより適宜調節することができる。
飼料を摂取させる方法及び飼育する方法は、動物の種類に応じて、通常用いられる方法をとることができる。
【実施例】
【００３３】
＜１＞ＭＥＬの生産
（ａ）シュードザイマ属酵母の培養
（前培養）
ポテトデキストロース培地１０ｍｌを試験管に入れ、シリコン栓をした。オートクレーブ滅菌後、Pseudozyma aphidis ＮＢＲＣ １０１８２を植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。
（本培養）
イオン交換水、大豆油 ８％、ＮａＮＯ3 ０．２％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．０２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％、yeast extract ０．１％からなる培地５０ｍｌを５００ｍｌErlenmeyer フラスコに入れ、シリコン栓をしてオートクレーブにて滅菌した。そこに、前培養で得たＮＢＲＣ １０１８２の前培養液を加え、３０℃／２２０ｒｐｍにて７日間振とう培養を行った。
【００３４】
（ｂ）ＭＥＬの抽出・精製
（抽出）
本培養で得た培養液５０ｍｌを分液ロートにとり、等量の酢酸エチルで二回抽出を行い、酢酸エチル層を合わせて溶媒を留去した。その後、メタノール２５ｍｌに溶解し、５０ｍｌのヘキサンで二回洗浄した後、メタノールを留去して、ＭＥＬの粗精製物を得た（後述のアンスロン反応より、純度６９％）。
（精製）
上記粗精製物１ｇを少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムにて分画した。クロロホルム ５００ｍｌ、クロロホルム／酢酸エチル＝４／１ ５００ｍｌ、アセトン ５００ｍｌ、メタノール ５００ｍｌを順次流して分画した。
各画分を薄層クロマトグラフィーにて展開し（展開溶媒ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／水＝６５／１５／２）、下記文献１）に記述された、各種ＭＥＬのＲｆ値（Ｒｆ＝０．５２、０．５８、０．６３、０．７７）を示す画分を選別し、これらの画分をまとめて標準サンプルとした。
１）Agric. Biol. Chem., 54 (1) 31-36, 1990
（純度測定：アンスロン反応）
酢酸エチルにより適度な濃度に希釈した粗精製物を試験管に入れ、溶媒を留去した。そこにアンスロン試薬（０．２％アンスロン７５％硫酸液）５ｍｌを加え、沸騰水中で１０分間反応させ、６２０ｎｍの吸収を測定した。標準サンプルとの比較により、粗精製物の純度算出を行った。
【００３５】
＜２＞ラムノリピッドの生産
（ａ）シュードモナス属菌の培養
（前培養）
ペプトン培地１０ｍｌを試験管に入れ、シリコン栓をした。オートクレーブ滅菌後、Pseudomonas aeruginosa ＮＢＲＣ ３９２４を植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。
（本培養）
イオン交換水、ＣａＣＯ3 ０．２％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、yeast extract ０．５％、Soy flour ０．５％からなる培地５０ｍｌを５００ｍｌErlenmeyerフラスコに入れ、シリコン栓をしてオートクレーブにて滅菌した。そこに、フィルター滅菌したエタノール１ｍｌ及び前培養で得たＮＢＲＣ ３９２４の前培養液を加え、二日ごとにフィルター滅菌したエタノール０．７５ｍｌを加え、２８℃／２２０ｒｐｍにて８日間振とう培養を行った。
【００３６】
（ｂ）ラムノリピッドの抽出・精製
（抽出）
本培養で得た培養液５０ｍｌを分液ロートにとり、メタノール／クロロホルム＝１／１で二回抽出を行い、有機層を合わせて溶媒を留去し、ラムノリピッドの粗精製物を得た（後述のアンスロン反応より、純度５５％）。
（精製）
上記本培養で得た培養液４５０ｍｌをｐＨ３に調製し、遠心分離により菌体を除去した。上清を、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）で前処理したＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｍを詰めたカラムに通し、その後０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）にてカラム洗浄した。ＮａＣｌ濃度０〜０．４Ｍ（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０））の範囲でグラジエントをかけ、２．３ｍｌ／ｍｉｎでカラムに通し、ゲルに捕捉されているラムノリピッドを溶出させて分画した。
各画分を薄層クロマトグラフィーにて展開し（展開溶媒ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／水＝６５／２５／４）、下記文献２）に記述された、各種ラムノリピッドのＲｆ値（Ｒｆ＝０．３２、０．５２）を示す画分を選別し、メタノール／クロロホルム＝１／１で抽出して、これらの画分をまとめて溶媒を留去して標準サンプルとした。
2）Biotechnology Letters, 54 (12) 1213-1215, 1997
（純度測定：アンスロン反応）
メタノールにより適度な濃度に希釈した粗精製物を試験管に入れ、溶媒を留去した。そこにアンスロン試薬（０．２％アンスロン７５％硫酸液）５ｍｌを加え、沸騰水中で１０分間反応させ、６２０ｎｍの吸収を測定した。標準サンプルとの比較により、粗精製物の純度算出を行った。
【００３７】
＜３＞抗菌性の評価
下記の要領で、ＭＥＬ、ラムノリピッドについて、表１に示す各種細菌の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。
各種細菌の前培養は、感受性測定用ブイヨン培地（日水）を用いて行った。培養液の菌濃度を生理食塩水にて約１．０×１０5〜１０6ＣＦＵ／ｍｌとなるように調製したのち、測定培地に各種細菌を接種した。測定培地としては、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Bacillus subtilisについては感受性測定用培地（日水）を用い、Streptococcus suis、Streptococcus bovisについては血液寒天培地（ハートインフージョン培地：日水、綿羊無菌脱繊維血液：コージンバイオ）を用いた。培養は、Staphylococcus aureus及びStaphylococcus epidermidis、Bacillus subtilisについては好気培養、Streptococcus suis、Streptococcus bovisについては５％炭酸ガス培養にて、いずれも３７℃、約２０時間行った。培養終了後、ＭＩＣを測定した。
ＭＥＬは、＜１＞で得たＭＥＬの粗精製物（純度６９％）を、ラムノリピッドは、＜２＞で得たラムノリピッドの粗精製物（純度５５％）を使用した。また、比較のために、ショ糖エステル（Sucrose monodecanoate:シグマアルドリッチジャパン品）、マンノース（和光純薬工業品）、ラムノース（シグマアルドリッチジャパン品）についてもＭＩＣを測定した。
結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
ＭＥＬ及びラムノリピッドは、同じ糖脂質のSucrose monodecanoateと比較して、Staphylococcus、Streptococcus、Bacillus属の細菌に対して数〜数十倍高い抗菌活性を示した。一方、糖脂質の構成体であるマンノース及びラムノースは抗菌活性を示さなかった。
これより、ＭＥＬ及びラムノリピッドを鳥類や哺乳類に摂取させて飼育することにより、上記各種細菌により引き起こされる疾病を予防又は治療する効果が期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖脂質を含有する飼料添加剤、飼料及びこれらを用いた鳥類及び哺乳類の飼育方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
家畜の感染症は、家畜の体重を減少させたり、様々な病状を引き起したりするなど、その商品価値を著しく低下させる。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）は、ウシ、ヒツジ、ヤギの乳房炎、皮下腫瘍、膿血症、馬の発疹、豚、鶏の関節炎、皮膚炎、敗血症の原因菌である。また、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）は、豚の髄膜炎、敗血症、心内膜炎、関節炎の原因菌であり、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）はウシの鼓張症の原因菌である。
【０００３】
抗生物質を家畜飼料に少量添加することにより家畜の成長が促進されることが１９４０年代に発見され、それ以来、家畜の成長を促進したり、疾病を予防したりする手段として、家畜の飼料に抗生物質を添加することが広く行われてきた。抗生物質は、家畜の病原菌感染の予防、代謝の改善、腸内の有害菌の増殖抑制の作用を示し、結果として疾病を予防し、成長を促進すると考えられているが、詳細は依然不明である。その一方で、飼料に抗生物質を混ぜることは、結果的に抗生物質を外環境に広くばら撒くこととなり、畜産界においても抗生物質耐性菌の出現が問題となっている。例えば、代表的な抗生物質耐性菌であるＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））は、馬などの家畜でも発見されていることが報告されている。
このような背景下、近年では、抗生物質の飼料への添加が厳しく規制されるようになってきている。例えば、欧州では２００６年までに抗生物質の飼料が全面禁止され、日本でも使用できる抗生物質の数が段階的に減ってきている。また、このような動きと相まって、生産者からは抗生物質の代替物についての要望が大きくなっている。
【０００４】
このような抗生物質の代替の流れを受け、一部では、乳酸菌が生産するナイシン、バチルス菌が生産するイツリンなどのポリペプチド類を抗生物質の代わりに使用する動きも出てきている。また、乳化剤として缶コーヒーなどに添加されている糖脂質であるショ糖エステル類がバチルス菌等に対する抗菌作用を期待されて添加されている。
【０００５】
一方、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）やラムノリピッドに代表される糖脂質には、界面活性作用をはじめとするさまざまな性質があり、以下に述べるような多様な用途への展開が図られている。例えば、ＭＥＬを含むリポソームを用いて、遺伝子の導入効率を向上させる技術（特許文献１）、ＭＥＬを用いて薬剤耐性等の遺伝子を含むリポソームの形成を阻害し、薬剤耐性菌等の発生を減少させる方法（特許文献２）、ＭＥＬを抗炎症剤及び抗アレルギー剤の有効成分として用いる技術（特許文献３）等が知られている。また、ラムノリピッドを用いて天然繊維の吸水性を向上させる技術（特許文献４）、ラムノリピッドを用いて有害使用性有機化合物を含む非処理物から前記有機化合物を分離する技術（特許文献５）、ラムノリピッドを用いて高密度冷熱蓄熱輸送用の氷スラリーを調製することにより、氷の凝集及び合一を防止する技術（特許文献６）等が知られている。なお、ＭＥＬやラムノリピッドの抗菌性は一部報告されているが（非特許文献１、非特許文献２）、家畜の感染症を引き起こす細菌に対する抗菌性については、未だ検討されておらず、ＭＥＬやラムノリピッドを畜産分野で適用した例はない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１７４７２７号公報
【特許文献２】特開２００６−１５８３８７号公報
【特許文献３】特開２００５−６８０１５号公報
【特許文献４】特開２００２−１０５８５４号公報
【特許文献５】特開２００１−３２７８０３号公報
【特許文献６】特開２００１−１３１５３８号公報
【非特許文献１】Fat. Sci. Technol., 91, 363-366, 1989
【非特許文献２】Biotechnol., 29, 91-96, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、鳥類及び哺乳類、特に家畜の疾病を予防又は治療するための安全かつ簡便な手段を提供することを課題とする。本発明は、特に、グラム陽性細菌によって引き起こされる家畜の感染症を予防又は治療するための手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）及びラムノリピッド（ＲＬ）等の糖脂質が、家畜の感染症を引き起こすグラム陽性細菌に対して、抗菌活性を有することを見出し、発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）マンノシルエリスリトールリピッド及び／又はラムノリピッドを含有する鳥類又は哺乳類用の飼料添加剤。
（２）家畜用であることを特徴とする、（１）に記載の飼料添加剤。
（３）マンノシルエリスリトールリピッドが、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する酵母から得られることを特徴とする、（１）又は（２）の何れか一に記載の飼料添加剤。（４）ラムノリピッドが、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する細菌から得られることを特徴とする、（１）〜（３）の何れか一に記載の飼料添加剤。
（５）疾病の予防又は治療用であることを特徴とする、（１）〜（４）の何れか一に記載の飼料添加剤。
（６）前記疾病がグラム陽性細菌により引き起こされる感染症であることを特徴とする、（５）に記載の飼料添加剤。
（７）グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属又はストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する細菌である（６）に記載の飼料添加剤。
（８）グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィノコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）又はストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）である（７）に記載の飼料添加剤。
（９）（１）〜（８）の何れか一に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
（１０）（９）に記載の飼料を、鳥類又は哺乳類に摂取させることを特徴とする、鳥類又は哺乳類の飼育方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の飼料添加剤を飼料に混合し、鳥類又は哺乳類に摂取させることにより、疾病を予防又は治療することができる。具体的には、グラム陽性細菌による感染症を予防又は治療することができる。本発明の飼料添加剤を含有する飼料は、鶏、豚、牛などの家畜の飼育に好適に用いることができる。また、本発明の飼料添加剤は、生分解性が高く、生体及び環境に対する安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の飼料添加剤は、家畜の疾病予防及び／又は治療効果を有する糖脂質、特にマン
ノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）及び／又はラムノリピッド（ＲＬ）を含有することを特徴とする。
【００１２】
ＭＥＬは、糖脂質型のバイオサーファクタントの一種で、マンノース、エリスリトール及び脂肪酸が結合した構造を有しており、下記一般式（１）で表される。
【００１３】
【化１】
【００１４】
一般式（１）において、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、炭素数３〜２５の脂肪族アシル基である。特に、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、炭素数５〜１４の脂肪族アシル基であることが好ましい。また、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、炭素数５〜１３の脂肪族アシル基であってもよい。これらの脂肪族アシル基は、直鎖状であっても分岐状であってもよく、飽和であっても不飽和であってもよい。また、Ｒ3及びＲ4は、一方がアセチル基であり、他方が水素であるか、両方がアセチル基である。
なお、Ｒ3及びＲ4が共にアセチル基であるものはＭＥＬ−Ａ、Ｒ3が水素であり、Ｒ4がアセチル基であるものはＭＥＬ−Ｂ、Ｒ3がアセチル基であり、Ｒ4が水素であるものはＭＥＬ−Ｃと呼ばれる。
また、本発明の飼料添加剤におけるＭＥＬは、一種のみであっても、複数種の混合物であってもよい。
【００１５】
本発明において用いるＭＥＬは、菌類、特に酵母類などの微生物を培養して得ることができる。例えば、シュードザイマ（Pseudozyma）属、カンジダ（Candida）属、クルツマノミセス(Kurtzmanomyces)属に属する酵母等を用いることができる。また、Shizonella melanogrammaを用いることもできる。この中でも、シュードザイマ属に属する酵母を用いることが好ましい。シュードザイマ属に属する酵母としては、Pseudozyma aphidis、Pseudozyma antarctica等が挙げられる。具体的には、例えば、Pseudozyma aphidis ＮＢＲＣ
１０１８２菌株、Peudozyma Antarctica ＮＢＲＣ １０２６０菌株、Peudozyma Antarctica ＮＢＲＣ １０７３６菌株を用いることができる。
ＮＢＲＣ １０１８２菌株、ＮＢＲＣ １０２６０菌株、ＮＢＲＣ １０７３６菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に登録されている株である。
また、ＭＥＬは、合成したものや市販品を用いることもできる。
【００１６】
ラムノリピッドは、糖脂質型のバイオサーファクタントの一種で、ラムノースと脂肪酸が結合した構造を有している。本発明において用いるラムノリピッドは特に制限されないが、例えば下記一般式（２）又は一般式（３）で表される構造を有するものを用いることができる。
【００１７】
【化２】
【００１８】
一般式（２）において、Ｒ5は、水素原子、−ＣＨ2−〔ＣＨ（ＯＨ）〕m−ＣＨ2（ＯＨ）、−（ＸＯ）nＨ、若しくは炭素数１〜３６のアルキル基、アルケニル基又は脂肪族アシル基を示す。ここで、アルキル基、アルケニル基は直鎖状であっても分岐状であってもよく、脂肪族アシル基は直鎖状であっても分岐状であってもよく、飽和であっても不飽和であってもよい。また、ｍは０〜８の整数であり、Ｘはエチレン、プロピレン及びブチレンの少なくとも一種を示し、ｎは１〜１０００の整数である。Ｒ6は、水素原子又は２−デセノイル基である。Ｒ5とＲ6は独立している。
【００１９】
【化３】
【００２０】
一般式（３）において、Ｒ7は、水素原子、−ＣＨ2−〔ＣＨ（ＯＨ）〕m−ＣＨ2（ＯＨ）、−（ＸＯ）nＨ、若しくは炭素数１〜３６のアルキル基、アルケニル基又は脂肪族アシル基を示す。ここで、アルキル基、アルケニル基は直鎖状であっても分岐状であってもよく、脂肪族アシル基は直鎖状であっても分岐状であってもよく、飽和であっても不飽和であってもよい。また、ｍは０〜８の整数であり、Ｘはエチレン、プロピレン及びブチレンの少なくとも一種を示し、ｎは１〜１０００の整数である。Ｒ8は、水素原子又は２−デセノイル基である。Ｒ7とＲ8は独立している。
また、本発明の飼料添加剤におけるラムノリピッドは、一種のみであっても、複数種の混合物であってもよい。
【００２１】
本発明において用いるラムノリピッドは、細菌を培養して得ることができる。例えば、
シュードモナス（Pseudomonas）属、バークホルデリア（Burkholderia）属に属する細菌等を用いることができる。この中でも、シュードモナス属に属する細菌を用いることが好ましい。シュードモナス属に属する細菌としては、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas chlororaphis等が挙げられるが、Pseudomonas sp. を用いることもできる。バークホルデリア属に属する細菌としては、Burkholderia pseudomalle等が挙げられる。この中でも、特にPseudomonas aeruginosaを用いることが好ましい。具体的には、例えばPseudomonas aeruginosa ＮＢＲＣ ３９２４菌株、Pseudomonas sp. ＤＳＭ ２８７４菌株等を用いることができる。
ＮＢＲＣ ３９２４菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に登録されている菌株である。
ＤＳＭ ２８７４菌株は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）に登録されている菌株である。
また、ラムノリピッドは、合成したものや市販品を用いることもできる。
【００２２】
上述した微生物を用いてＭＥＬ及びラムノリピッドを生産させるためには、以下のような方法を用いることができる。
ＭＥＬを生産させるためには、天然油脂類、脂肪酸、アルコール、ケトン類、炭化水素類、ｎ−アルカン等の原料のうち、用いる微生物に適した原料を選択し、その微生物の培養に通常用いられる培養温度を用いて培養すればよい。原料として好ましいのは、天然油脂類であり、例えば、大豆油、ひまわり油、ココナッツ油、綿実油、コーン油、パーム油等を用いることができ、この中でも特に大豆油が好ましく用いられる。
また、ラムノリピッドを生産させるためには、天然油脂類、脂肪酸、アルコール、ケトン類、炭化水素類、ｎ−アルカン、糖類等の原料のうち、用いる微生物に適した原料を選択し、その微生物の培養に通常用いられる培養温度を用いて培養すればよい。このような方法として、例えば、特開平１０−７５７９６号公報に記載の方法を用いることができる。
何れの場合も、培養方法は特に制限されず、静置培養、往復動式振とう培養、回転動式振とう培養、ジャーファーメンター培養などによる液体培養法や固体培養法を用いることができる。
【００２３】
Pseudozyma属に属する酵母を用いて、ＭＥＬを生産する場合には、通常Pseudozyma属に属する酵母の培養に用いられる培地に、大豆油等の天然油脂類を添加し、２０℃〜３５℃で培養すればよい。
また、Pseudomonas属に属する細菌を用いて、ラムノリピッドを生産する場合には、通常Pseudomonas属に属する細菌の培養に用いられる培地に、大豆油等の天然油脂類、グルコース等の糖類、エタノール等のアルコール類を添加し、２０〜４０℃で培養すればよい。
【００２４】
また、微生物を用いてＭＥＬ及び／又はラムノリピッドを生産する場合は、培養物を精製し、ＭＥＬ及び／又はラムノリピッドの精製品を用いてもよいし、培養物を遠心分離し、ＭＥＬ及び／又はラムノリピッドを含む分画を用いてもよい。また、培養物をそのまま用いてもよく、例えば、培養液や固体培養物を乾燥・粉砕したものなどを用いることができる。
【００２５】
本発明の飼料添加剤は、ＭＥＬ及びラムノリピッドの何れかを含んでいてもよく、これらの両方を含んでいてもよい。また、ＭＥＬ及び／又はラムノリピッドの含有量は、特に制限されないが、効果を十分に得る観点からは、１質量％以上であることが好ましい。
【００２６】
また、本発明の飼料添加剤は、ＭＥＬ及び／又はラムノリピッドの他に、鳥類又は哺乳類の疾病を予防又は治療に有効な成分、栄養補助成分、保存安定性を高める成分等の任意
成分をさらに含むものであってもよい。このような任意成分としては、例えば、エンテロコッカス類、バチルス類、ビフィズス菌類等の生菌剤；アミラーゼ、リパーゼ等の酵素；Ｌ−アスコルビン酸、塩化コリン、イノシトール、葉酸等のビタミン；塩化カリウム、クエン酸鉄、酸化マグネシウム、リン酸塩類等のミネラル、ＤＬ−アラニン、ＤＬ−メチオニン、塩酸Ｌ−リジン等のアミノ酸；フマル酸、酪酸、乳酸、酢酸及びそれらの塩類等の有機酸；エトキシキン、ジブチルヒドロキシトルエン等の抗酸化剤；プロピオン酸カルシウム等の防カビ剤；ＣＭＣ、カゼインナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム等の粘結剤；グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等の乳化剤；アスタキサンチン、カンタキサンチン等の色素；各種エステル、エーテル、ケトン類等の着香料が挙げられる。
【００２７】
本発明の飼料添加剤の剤形は特に制限されず、例えば粉末、液体、錠剤など任意の形態とすることができる。本発明の飼料添加剤は、ＭＥＬ及び／又はラムノリピッド、並びに必要に応じて任意成分を混合し、製剤化することにより製造することができる。
【００２８】
また、ＭＥＬ及びラムノリピッドは、鳥類又は哺乳類の疾病を引き起こす細菌に対して抗菌活性を示すことから、本発明の飼料添加剤は、これらの細菌によって引き起こされる鳥類又は哺乳類の疾病を予防又は治療するために用いることができる。
本発明の飼料添加剤は、特にグラム陽性細菌により引き起こされる感染症の予防又は治療に好適に用いることができる。
このようなグラム陽性細菌としては、例えば、Micrococcus、Staphylococcus、Streptococcus、Planococcus、Stomatococcus、Enterococcus、Peptococcus、Peptostreptococcus、Ruminococcus、Leuconostoc、Pediococcus、Aerococcus、Gemella、Coprococcus、Sarcina、Bacillus、Clostridium、Lactobacillus、Listeria、Erysipelothrix、Corynebacterium、Rhodococcus、Propionibacterium、Eubacterium、Actinomyces、Bifidobacterium、Mycobacterium、Nocardia、Dermatophilus等の属に属する細菌が挙げられる。
本発明の飼料添加剤は、特に、スタフィロコッカス属又はストレプトコッカス属に属する細菌、具体的にはStaphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Streptococcus suis、Streptococcus bovis等により引き起こされる疾病の予防又は治療に好適に用いることができる。
【００２９】
本発明の飼料添加剤は、鳥類又は哺乳類の飼料、ペットフード、ペット用サプリメント（以下、飼料という。）に用いられる他の飼料成分と混合して、鳥類又は哺乳類用の飼料とすることができる。飼料の種類や成分は、特に制限されない。また、本発明の飼料には、飼料添加剤に添加することができる、上記任意成分を加えて調製してもよい。また、本発明の飼料は、鳥類又は哺乳類の疾病を予防又は治療するための飼料とすることもできる。
【００３０】
本発明の飼料におけるＭＥＬ及び／又はラムノリピッドの含有量は、与える動物の種類、健康状態、飼料の種類、飼料成分、年齢、性別、体重等により適宜調節され、特に制限されないが、乾物質量当たり１〜１００００質量ｐｐｍ、好ましくは１０〜１０００質量ｐｐｍであることが好ましい。
【００３１】
本発明の飼料は、飼料添加剤をそのまま飼料成分に添加し、混合して製造することができる。この際、粉末状、固形状の飼料添加剤を用いる場合は、混合を容易にするために飼料添加剤を液状又はゲル状の形態にしてもよい。この場合は、水、大豆油、菜種油、コーン油などの植物油、液体動物油、ポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物を液体担体として用いることができる。また、飼料中におけるＭＥＬ及び／又はラムノリピッドの均一性を保つために、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、カゼインナトリウム、アラビアゴム、グアーガム、タマ
リンド種子多糖類などの水溶性多糖類を配合することも好ましい。
【００３２】
本発明の飼料を摂取させる動物の種類は、鳥類又は哺乳類である。例えば、家畜や犬、猫などのペットに用いることができる。本発明の飼料は、この中でも家畜、特に鶏、豚、牛の飼育に好適である。摂取させる飼料の量は、動物の種類、体重、年齢、性別、健康状態、飼料の成分などにより適宜調節することができる。
飼料を摂取させる方法及び飼育する方法は、動物の種類に応じて、通常用いられる方法をとることができる。
【実施例】
【００３３】
＜１＞ＭＥＬの生産
（ａ）シュードザイマ属酵母の培養
（前培養）
ポテトデキストロース培地１０ｍｌを試験管に入れ、シリコン栓をした。オートクレーブ滅菌後、Pseudozyma aphidis ＮＢＲＣ １０１８２を植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。
（本培養）
イオン交換水、大豆油 ８％、ＮａＮＯ3 ０．２％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．０２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％、yeast extract ０．１％からなる培地５０ｍｌを５００ｍｌErlenmeyer フラスコに入れ、シリコン栓をしてオートクレーブにて滅菌した。そこに、前培養で得たＮＢＲＣ １０１８２の前培養液を加え、３０℃／２２０ｒｐｍにて７日間振とう培養を行った。
【００３４】
（ｂ）ＭＥＬの抽出・精製
（抽出）
本培養で得た培養液５０ｍｌを分液ロートにとり、等量の酢酸エチルで二回抽出を行い、酢酸エチル層を合わせて溶媒を留去した。その後、メタノール２５ｍｌに溶解し、５０ｍｌのヘキサンで二回洗浄した後、メタノールを留去して、ＭＥＬの粗精製物を得た（後述のアンスロン反応より、純度６９％）。
（精製）
上記粗精製物１ｇを少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムにて分画した。クロロホルム ５００ｍｌ、クロロホルム／酢酸エチル＝４／１ ５００ｍｌ、アセトン ５００ｍｌ、メタノール ５００ｍｌを順次流して分画した。
各画分を薄層クロマトグラフィーにて展開し（展開溶媒ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／水＝６５／１５／２）、下記文献１）に記述された、各種ＭＥＬのＲｆ値（Ｒｆ＝０．５２、０．５８、０．６３、０．７７）を示す画分を選別し、これらの画分をまとめて標準サンプルとした。
１）Agric. Biol. Chem., 54 (1) 31-36, 1990
（純度測定：アンスロン反応）
酢酸エチルにより適度な濃度に希釈した粗精製物を試験管に入れ、溶媒を留去した。そこにアンスロン試薬（０．２％アンスロン７５％硫酸液）５ｍｌを加え、沸騰水中で１０分間反応させ、６２０ｎｍの吸収を測定した。標準サンプルとの比較により、粗精製物の純度算出を行った。
【００３５】
＜２＞ラムノリピッドの生産
（ａ）シュードモナス属菌の培養
（前培養）
ペプトン培地１０ｍｌを試験管に入れ、シリコン栓をした。オートクレーブ滅菌後、Pseudomonas aeruginosa ＮＢＲＣ ３９２４を植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。
（本培養）
イオン交換水、ＣａＣＯ3 ０．２％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、yeast extract ０．５％、Soy flour ０．５％からなる培地５０ｍｌを５００ｍｌErlenmeyerフラスコに入れ、シリコン栓をしてオートクレーブにて滅菌した。そこに、フィルター滅菌したエタノール１ｍｌ及び前培養で得たＮＢＲＣ ３９２４の前培養液を加え、二日ごとにフィルター滅菌したエタノール０．７５ｍｌを加え、２８℃／２２０ｒｐｍにて８日間振とう培養を行った。
【００３６】
（ｂ）ラムノリピッドの抽出・精製
（抽出）
本培養で得た培養液５０ｍｌを分液ロートにとり、メタノール／クロロホルム＝１／１で二回抽出を行い、有機層を合わせて溶媒を留去し、ラムノリピッドの粗精製物を得た（後述のアンスロン反応より、純度５５％）。
（精製）
上記本培養で得た培養液４５０ｍｌをｐＨ３に調製し、遠心分離により菌体を除去した。上清を、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）で前処理したＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｍを詰めたカラムに通し、その後０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）にてカラム洗浄した。ＮａＣｌ濃度０〜０．４Ｍ（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０））の範囲でグラジエントをかけ、２．３ｍｌ／ｍｉｎでカラムに通し、ゲルに捕捉されているラムノリピッドを溶出させて分画した。
各画分を薄層クロマトグラフィーにて展開し（展開溶媒ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／水＝６５／２５／４）、下記文献２）に記述された、各種ラムノリピッドのＲｆ値（Ｒｆ＝０．３２、０．５２）を示す画分を選別し、メタノール／クロロホルム＝１／１で抽出して、これらの画分をまとめて溶媒を留去して標準サンプルとした。
2）Biotechnology Letters, 54 (12) 1213-1215, 1997
（純度測定：アンスロン反応）
メタノールにより適度な濃度に希釈した粗精製物を試験管に入れ、溶媒を留去した。そこにアンスロン試薬（０．２％アンスロン７５％硫酸液）５ｍｌを加え、沸騰水中で１０分間反応させ、６２０ｎｍの吸収を測定した。標準サンプルとの比較により、粗精製物の純度算出を行った。
【００３７】
＜３＞抗菌性の評価
下記の要領で、ＭＥＬ、ラムノリピッドについて、表１に示す各種細菌の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。
各種細菌の前培養は、感受性測定用ブイヨン培地（日水）を用いて行った。培養液の菌濃度を生理食塩水にて約１．０×１０5〜１０6ＣＦＵ／ｍｌとなるように調製したのち、測定培地に各種細菌を接種した。測定培地としては、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Bacillus subtilisについては感受性測定用培地（日水）を用い、Streptococcus suis、Streptococcus bovisについては血液寒天培地（ハートインフージョン培地：日水、綿羊無菌脱繊維血液：コージンバイオ）を用いた。培養は、Staphylococcus aureus及びStaphylococcus epidermidis、Bacillus subtilisについては好気培養、Streptococcus suis、Streptococcus bovisについては５％炭酸ガス培養にて、いずれも３７℃、約２０時間行った。培養終了後、ＭＩＣを測定した。
ＭＥＬは、＜１＞で得たＭＥＬの粗精製物（純度６９％）を、ラムノリピッドは、＜２＞で得たラムノリピッドの粗精製物（純度５５％）を使用した。また、比較のために、ショ糖エステル（Sucrose monodecanoate:シグマアルドリッチジャパン品）、マンノース（和光純薬工業品）、ラムノース（シグマアルドリッチジャパン品）についてもＭＩＣを測定した。
結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
ＭＥＬ及びラムノリピッドは、同じ糖脂質のSucrose monodecanoateと比較して、Staphylococcus、Streptococcus、Bacillus属の細菌に対して数〜数十倍高い抗菌活性を示した。一方、糖脂質の構成体であるマンノース及びラムノースは抗菌活性を示さなかった。
これより、ＭＥＬ及びラムノリピッドを鳥類や哺乳類に摂取させて飼育することにより、上記各種細菌により引き起こされる疾病を予防又は治療する効果が期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノシルエリスリトールリピッド及び／又はラムノリピッドを含有する鳥類又は哺乳類用の飼料添加剤。
【請求項２】
家畜用であることを特徴とする、請求項１に記載の飼料添加剤。
【請求項３】
マンノシルエリスリトールリピッドが、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する酵母から得られることを特徴とする、請求項１又は２に記載の飼料添加剤。
【請求項４】
ラムノリピッドが、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する細菌から得られることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の飼料添加剤。
【請求項５】
疾病の予防又は治療用であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載の飼料添加剤。
【請求項６】
前記疾病がグラム陽性細菌により引き起こされる感染症であることを特徴とする、請求項５に記載の飼料添加剤。
【請求項７】
グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属又はストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する細菌である請求項６に記載の飼料添加剤。
【請求項８】
グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィノコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）又はストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）である請求項７に記載の飼料添加剤。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
【請求項１０】
請求項９に記載の飼料を、鳥類又は哺乳類に摂取させることを特徴とする、鳥類又は哺乳類の飼育方法。
【請求項１】
マンノシルエリスリトールリピッド及び／又はラムノリピッドを含有する鳥類又は哺乳類用の飼料添加剤。
【請求項２】
家畜用であることを特徴とする、請求項１に記載の飼料添加剤。
【請求項３】
マンノシルエリスリトールリピッドが、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する酵母から得られることを特徴とする、請求項１又は２に記載の飼料添加剤。
【請求項４】
ラムノリピッドが、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する細菌から得られることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の飼料添加剤。
【請求項５】
疾病の予防又は治療用であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載の飼料添加剤。
【請求項６】
前記疾病がグラム陽性細菌により引き起こされる感染症であることを特徴とする、請求項５に記載の飼料添加剤。
【請求項７】
グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属又はストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する細菌である請求項６に記載の飼料添加剤。
【請求項８】
グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィノコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）又はストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）である請求項７に記載の飼料添加剤。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の飼料添加剤を含む、飼料。
【請求項１０】
請求項９に記載の飼料を、鳥類又は哺乳類に摂取させることを特徴とする、鳥類又は哺乳類の飼育方法。
【公開番号】特開２００８−１１８９８３（Ｐ２００８−１１８９８３Ａ）
【公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６３６０５（Ｐ２００７−２６３６０５）
【出願日】平成１９年１０月９日（２００７．１０．９）
【出願人】（０００１８３６４６）出光興産株式会社 (2,069)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月９日（２００７．１０．９）
【出願人】（０００１８３６４６）出光興産株式会社 (2,069)
【Ｆターム（参考）】
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